靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较

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【关键词】RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体

GenesilencingtargetedtotheratAT1receptorsbyefficientshRNAsanditsscreening

【Abstract】AIM:ToinvestigatetheefficacyofshorthairpinRNAs(shRNAs)tomodulatetheexpressionofratangiotensinⅡtype1(AT1)receptorgeneinmammaliancellsandtoexplorethecorrelationsbetweenthefeaturesofefficientshRNAsandshRNAsfunctionality.METHODS:Wegenerated4shRNAsexpressionvectorstargetingagainstratangiotensinⅡreceptors.TheshRNAsweretargetedto4differentregionsofthesamegene.TheratC6gliomacellsweretransfectedwithconstructedpGenesil1shRNAplasmidandscrambledplasmid.TheculturedcellswerecollectedatdifferentphasesforRTPCRandWesternblotanalyses.RESULTS:24hlater,nosignificantreductioninAT1mRNAlevelsatalltreatedgroupscouldbedetected.48hlater,AT1mRNAlevelofPbtreatedgroupdropedto(55.7±7.6)%ofthatincontrolgroup,andreachedtheirlowestpointafter72h(43.7±8.2)%.NosignificantinhibitionofAT1receptormRNAexpressionwasfoundinothergroups(P＞0.05).TheAT1mRNAandproteinlevelsbehavedultimatelysimilarly.Athour24and48,theAT1proteinwas(46.9±4.2)%and(37.0±3.7)%respectivelycomparedtocontrolandamaximumreductionwasobservedafter72hincubation［(28.1±4.0%comparedtocontrols)］.CONCLUSION:Besidessomegeneralrules,webelievethattheloopstructureinthemRNAattheregiontargetedbysiRNAandthebetteraccessibilityofthesiRNAtotargetedmRNAdohaveastrongeffectonsilencing.

【Keywords】RNAi;hypertension;angiotensinⅡreceptor;vector

【摘要】目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系.方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤C6细胞，并在不同时相收集转染的细胞，进行RTPCR和Westernblot检测.结果：转染24h之后，各处理组均未见AT1mRNA水平有明显减少.与对照组相比，Pb组在转染后48h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到（55.7±7.6）%，72h后达到最低点（43.7±8.2）%.其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞0.05).抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似.与对照组相比，Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24h和48h分别减少至（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%，最大减少在转染后72h（28.1±4.0）%.结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原则之外，靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用.

【关键词】RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体

基因干扰（RNAinterference）可以特异性地靶向降解目的基因mRNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默［1］.在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤C6细胞中的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的mRNA，选取并合成了多条编码大鼠AT1RmRNA的短发夹rna（shRNA）的核苷酸单链，退火形成双链结构并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1RshRNA的表达载体之后，转染C6细胞.根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差别，探索筛选有效shRNA的原则.

1材料和方法

1．1材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ购自大连宝生物工程有限公司;T4DNA连接酶及缓冲液购自NewEnglandBiolabs公司;大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞购自中国典型物保藏中心;细胞培养液DMEM购自Hyclone公司;转染试剂Metafectamine购自德国Biotex公司.所有的DNA合成及引物合成服务均由上海博亚生物技术有限公司提供.

1．2方法

1．2．1靶基因AT1RmRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列（序列号NM_030985），利用网上设计软件siRNATargetFinder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且GC含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对照.将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）质粒.

1．2．2细胞培养及转染按2×108/L密度以相同的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%～60%.用Metafectamine转染细胞，按1∶6的比例，根据试剂提供商的转染方案进行转染.

1．2．3RTPCRAT1基因引物序列为：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′,5′CTTTGCTTGGTTACT

CCTTCA3′，内参GAPDH的引物序列为：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′,5′TTAGTGGGGTCT

CGCTCC3′.反应体积25μL包括5μLcDNA，各引物0.25μL，1.5μLMgCl2，0.25μLTaqDNA聚合酶，0.5μLdNTP混合物和5μL10×缓冲液.反应条件:在94℃退火3min之后，94℃15s，55℃15s，72℃15s进行30个循环.毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳.

1．2．4WesternBlot分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获C6细胞.PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞.煮沸溶解液10min后，离心，取上清，弃沉淀物.确定蛋白浓度.电泳分离细胞溶解液，转膜.50g/L脱脂奶封闭后，加入抗AT1抗体（1∶1000）和抗βactin抗体（1∶1500）室温下孵育1.5h，再加入二抗（抗兔HRP抗体）孵育，增强型化学发光显色.

统计学处理：根据RTPCR和WesternBlot分析结果，用图像处理软件ImageTool3.0测灰度值，并与内参照相比得相对值.用SPSS11.5统计软件onewayANOVA进行组间方差分析.显著性水平为P＜0.05.

2结果

2．1不同shRNA表达质粒靶点及二级结构我们选择大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA序列的部分序列,即556~575bp，469~488bp，595~614bp，663~682bp,做为基因沉默靶位（图1）.构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示.

除在3′端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反义链与靶序列互补.其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA.所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因mRNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA则不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应.

2．2AT1shRNA转染后AT1mRNA水平和蛋白表达转染四组阳性质粒24h后，各组AT1mRNA水平无明显减少.在48h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1mRNA表达水平下降到（55.7±7.6）%，72h下降到最低点［仅为对照组的（43.7±8.2）%］.转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤C6细胞其AT1受体mRNA表达水平无明显抑制(P>0.05).结果提示，Pb质粒明显抑制了AT1受体mRNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体mRNA基因作用不显著（图3，4）.将抑制AT1受体mRNA有效的Pb质粒进行WesternBlot分析.在24h和48h，AT1蛋白的表达分别为（46.9±4.2）%和（37.0±3.7）%.与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72h［仅为对照组的（28.1±4.0）%］.结果表明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白水平下降.而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组则并不能减少AT1基因的表达（图5）.所有的结果清楚表明，转染Pb质粒能够抑制AT1基因的表达.

3讨论

肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素Ⅱ具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用.研究证实，血管紧张素Ⅱ参与了动脉硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程.血管紧张素Ⅱ通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生［2］.同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑［3］.本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1mRNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素Ⅱ对AT2的作用，达到血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的［4］.

实验结果表明，我们观测到AT1基因mRNA的表达在早期即有减少，而随着mRNA水平的抑制，相应的蛋白也有所减少.结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达.因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的治疗方法.

目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准［5］.为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级结构及siRNA双链的序列特异性进行了研究.普遍认为［6］，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进行选择，应避开起始密码子的5′或3′端非编码区选择siRNA序列.选择的正义链序列应是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3′突出末端.并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸.决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在mRNA三级结构中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等［7-8］.在比较本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二级结构中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RISC(RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA裂解部位而导致实验失败的原因之一.而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二级结构中的表面位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：①质粒Pa的GC含量偏低可以导致对靶基因mRNA的识别效率的减少;②与RISC杂交效率的下降.除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的局部二级结构比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位.在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中mRNA的结构是否足够松散，允许siRNA与RISC复合体进行靶向裂解.

总之，在进行短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；GC含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5′AA（N19）序列并进行BLAST等一些普遍的规则［9］之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级结构是否松散是有效shRNA合理设计并取得实验成功的最重要的因素.

【参考文献】

［1］FireA,XuS,MontgomeryMK,etal.PotentandspecificgeneticinterferencebydoublestrandedRNAinCaenorhabditiselegans［J］.Nature,1998,391（6669）:806-811.

［2］DinhDT,FraumanAG,JohnstonCI,etal.Angiotensinreceptors:Distribution,signalingandfunction［J］.ClinSci(Lond)，2001,100(5):481-492.

［3］LevyBI.CanAngiotensinIIType2receptorshavedeleteriouseffectsincardiovasculardisease?Implicationsfortherapeuticblockadeofthereninangiotensinsystem［J］.Circulation,2004,109(1):8-13.

［4］EslerM.Thesympatheticsystemandhypertension［J］.AmJHypertensSuppl,2000,13(6):99S-105S.

［5］WadhwaR,KaulSC,MiyagishiM,etal.KnowhowofRNAinterferenceanditsapplicationsinresearchandtherapy［J］.MutatRes,2004,567(1):71-84.

［6］MiyagishiM,HayashiM,parisonofthesuppressiveeffectsofantisenseoligonucleotideandsiRNAsdirectedagainstthesametargetsinmammaliancells［J］.AntisenseNucleicAcidDrugDev,2003,13(1):1-7.

［7］MiyagishiM,TairaK.DevelopmentandapplicationofsiRNAexpressionvector［J］.NucleicAcidsResSuppl,2002,(2):113-114.

［8］HamadaM,OhtsukaT,KawaidaR,etal.EffectsonRNAinterferenceingeneexpression(RNAi)inculturedmammaliancellsofmismatchesandtheintroductionofchemicalmodificationsatthe30endsofsiRNAs［J］.AntisenseNucleicAcidDrugDev,2002,12(5):301-309.

［9］ElbashirSM,HarborthJ,WeberK,etal.AnalysisofgenefunctioninsomaticmammaliancellsusingsmallinterferingRNAs［J］.Methods,2002,26(2):199-213.