NMDA和AMPA型谷氨酸受体亚基在成年大鼠前脑室管膜及室管膜下区的分布

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【关键词】谷氨酸受体；nmda受体；ampa受体；室管膜；免疫组织化学

cnLocalizationofNMDAandAMPAtypeglutamatereceptorsinforebrainventricularmembraneandsubventricularzoneofadultrats

【Abstract】AIM:ToinvestigatethedistributionpatternsofNMDAtypeandAMPAtypeglutamatereceptorsubunitsintheforebrainventricularmembraneandsubventricularzoneofadultrats.METHODS:Immunohistochemicalstainingwasappliedtovisualizethelocalizationof5kindsofNMDAandAMPAreceptorsubunitsintheforebrainsectionsofadultrats.RESULTS:TheimmunoreactivitiesforNMDAR1(NR1),NR2C,AMPAreceptorsubunit1(GluR1),GluR2/3,andGluR4weredetectedintheventricularmembraneandsubventricularzone.TheimmunoreactiveproductsforNMDAorAMPAreceptorsubunitswerehomogeneouslylocalizedinthecytoplasmaandcellmembrane.SemiquantitativeanalysisindicatedthatNR1andGluR4immunoreactivecellsweremoreanddistributedmoredenselythanNR2C,GluR1orGluR2/3immunopositiveonesinventricularmembraneandsubventricularzone.CONCLUSION:ThelocalizationofNMDAandAMPAreceptorsubunitsintheventricularmembraneandsubventricularzonesuggeststhatNMDAandAMPAreceptorsmaybeinvolvedinfunctionalmodulationofneurogenesisinaboveregions.

【Keywords】glutamatereceptors;NMDAreceptor;AMPAreceptor;ventricularmembrane;immunohistochemistry

【摘要】目的：观察前脑室管膜及室管膜下区N甲基D天门冬氨酸（NMDA）和使君子酸（AMPA）型谷氨酸受体的分布.方法：应用成年SD大鼠前脑切片免疫组织化学方法，显示NMDA和AMPA受体六种亚基的细胞定位.结果：在室管膜及室管膜下区有NMDA受体亚基NR1，NR2C及AMPA受体亚基GluR1，GluR2/3，GluR4免疫反应阳性产物的分布，免疫阳性产物则均匀地分布在细胞质或细胞膜.半定量分析表明NR1和GluR4阳性细胞的数目和染色密度均高于NR2C，GluR1和GluR2/3阳性细胞.结论：结合以往研究，NMDA和AMPA受体亚基在大鼠前脑室管膜及室管膜下区定位结果提示NMDA和AMPA受体可能参与该区域神经发生等功能活动的调节.

【关键词】谷氨酸受体；NMDA受体；AMPA受体；室管膜；免疫组织化学

0引言

兴奋性氨基酸是参与神经元兴奋性传递、增殖发育、兴奋性毒性等活动的重要递质［1-5］.其兴奋性传递主要由谷氨酸受体来介导，包括N甲基D天门冬氨酸（NmethylDaspartate，NMDA）、使君子酸（alphaamino3hydroxy5methyl4isoxazolepropionicacid，AMPA）和海人藻酸（kainicacid，KA）受体［1-2］.以往对NMDA和AMPA受体在脑内神经元上分布和功能已有许多报道［6-9］，但缺乏对室管膜及室管膜下区分布和功能的研究.资料表明室管膜及室管膜下区是成年动物神经发生活跃的主要区域之一.为此，我们应用免疫组织化学方法［10］，观察NMDA和AMPA受体在大鼠室管膜及室管膜下区的分布，旨在探讨NMDA或AMPA受体参与该区神经发生等功能活动的意义.

1材料和方法

1．1材料正常成年雄性SD大鼠6只，由第四军医大学实验动物中心提供.第一抗体包括小鼠抗NR1抗体(1∶1000)，兔抗NR2C抗体（1∶1000），兔抗GluR1，GluR2/3，GluR4抗体（1∶300）均为Chemicon公司产品；biotin标记的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG(1∶200)，Vector公司产品；ABC复合物(1∶200),Vector公司产品.

1．2方法

1．2．1动物固定与切片动物在戊巴比妥钠(40mg/kg，ip)麻醉下，开胸、经左心室至主动脉插管，用生理盐水约100mL快速冲去血液，随即灌注含40g/L多聚甲醛0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)，灌流30min.注毕立即取出大脑,4℃下后固定4h.然后换入300g/L蔗糖溶液内，4℃下过夜.冰冻连续冠状切片，片厚30μm.切片按顺序分为数套，分别作NMDA受体亚基NR1，NR2C，AMPA受体亚基GluR1，GluR2/3和GluR4免疫组织化学染色和对照染色.

1．2．2免疫组织化学染色参照文献［10］的方法进行，切片于10mmol/LPBS内涮洗,再入含0.3mL/L过氧化氢溶，液内处理30min，用以灭活内源性过氧化物酶.经PBS涮洗后，分别入第一抗体血清（用含2mL/L正常山羊血清和0.1mL/LTritonX100的PBS稀释）内，4℃下孵育48h.然后入biotin标记的羊抗小鼠IgG或羊抗兔IgG(1∶200)溶液，室温下放置4h、入ABC复合物(1∶200,)溶液，室温下孵育2h.每次抗体孵育后均用PBS涮洗，3×10min.最后入DAB/H2O2溶液(0.05~0.01g/L)反应10min.用正常血清溶液代替特异性第一抗体孵育切片，作为免疫染色对照.切片裱于载玻片上，晾干、脱水、透明和封片，在BX60显微镜下进行观察、图像采集和阳性细胞计数分析.

1．2．3半定量数据分析为便于描述前脑室管膜及室管膜下区内NMDA，AMPA受体免疫阳性细胞的数量，将阳性细胞密度分为高（多于10个细胞/高倍视野，表示为）,中（3~10个细胞/高倍视野，表示为）,低（低于3个细胞/高倍视野，表示为+）.

2结果

2．1NMDA和AMPA受体亚基免疫反应产物的定位特征在应用特异性第一抗体孵育的切片上，免疫反应产物呈深棕色，主要定位于细胞胞体及突起上.NMDA受体和AMPA受体亚基NR1，NR2C，GluR1，GluR2/3和GluR4的免疫反应阳性产物呈均匀的棕色分布在细胞质或细胞膜上.在用正常血清取代特异性第一抗体进行孵育的切片上，未发现阳性染色.

2．2NMDA受体亚基在成鼠室管膜及室管膜下区的定位NR1及NR2C阳性产物均匀地分布在细胞质或细胞膜，室管膜及室管膜下区均有免疫阳性细胞存在，NR1的免疫染色强度和阳性细胞的密度均比NR2C大（图1）.A:NR1;B:NR1;C:NR2C;D:NR2C.

2．3AMPA受体在室管膜及室管膜下区的分布GluR1和GluR2/3的免疫阳性产物主要分布在细胞体及其突起内，阳性细胞密度比较稀疏，GluR2/3的染色强度更淡.GluR4分布在室管膜下区的细胞内，染色强度深，阳性胞体密集分布（图2）.

2．4NMDA和AMPA受体分布的半定量分析通过对前脑室管膜及室管膜下区内NMDA，AMPA受体免疫阳性细胞的观察，结果表明免疫阳性细胞密度从高到低依次为：NR1（），GluR4（），GluR2/3（），NR2C（+）和GluR1（+）.

3讨论

前脑室管膜下区与海马齿状回是成体动物脑内神经发生或活跃的主要增殖区，在脑结构功能可塑性和损伤修复中具有重要意义.结合以往资料［1-5,8-9］，本研究显示了成年大鼠前脑室管膜及室管膜下区内存在五种NMDA和AMPA受体免疫阳性细胞的分布，结果提示NMDA和AMPA受体所介导谷氨酸信号参与前脑室管膜及室管膜下区细胞的功能活动，可能是该区域内的神经发生活动的重要调节因素之一.

NMDA受体属于钙离子通透性离子通道，除介导神经细胞间的兴奋性信号传递外，还参与神经发育和可塑性活动，在细胞增殖、迁移、损伤与死亡过程中发挥重要作用［1-6,8,11］.应用NMDA受体的拮抗剂CGP43487后2d即见海马齿状回内BrdU阳性增殖细胞增多，用后7d仍见大量的增殖细胞，并见早期颗粒神经元、放射状胶质细胞的增多［4］.脑缺血可以引起海马CA1区锥状神经元的死亡，在脑缺血的同时给予NMDA受体拮抗剂MK801则可以阻断细胞的死亡［5］.AMPA受体依构成亚基的差异，其受体功能特性具有明显的差别［1,6,12］.GluR1和GluR4为钙离子通透性AMPA受体，GluR2为钙离子非通透性受体［1,7,12］.研究表明AMPA受体也参与兴奋性毒性和细胞增殖过程［2,5,9,13-14］.在受损伤的细胞中GluR2表达增多，而GluR3，4表达减少［13］.AMPA受体的活化可以抑制小脑内少突胶质前体细胞的分裂与增殖，但不改变星形胶质细胞的数量［14］.

另外，我们还发现NMDA或AMPA受体在室管膜及室管膜下区的细胞上与Nestin共存（待发表资料），辐射损伤引起动物室管膜及室管膜下区内神经前体细胞标记物Nestin表达和细胞增殖标记物Ki67染色细胞增加，提示辐射损伤对该区域神经前体细胞的机能或增殖产生明显影响［15］.还有研究证明脑组织或脑室内直接给予NMDA或AMPA能够引起前脑室管膜下区的细胞增殖变化，提示NMDA和AMPA受体可能与该区的神经发生活动有密切关系［8-9］.因此，NMDA和AMPA受体参与成体动物前脑室管膜和室管膜下区的神经发生活动调节、及其在损伤修复中的功能意义，值得进一步研究.

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