人乳头瘤病毒E6E7基因重组腺病毒的构建及鉴定

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【关键词】人类乳头状瘤病毒,人；腺病毒科

ConstructionandidentificationofrecombinantadenovirusescarryingHPV16e6e7

【Abstract】AIM:Toconstructthereplicationdeficientrecombinantadenovirusescarryinghumanpapillomavirus16（HPV16）E6E7andidentifythevectorwithWesternBlot.METHODS:TheHPV16E6E7genefragmentwasobtainedfromtheplasmidpET32a（+）E6E7byamplificationanddigestion,andtheshuttleplasmidpAdTrackCMVE6E7inwhichtheE6E7wasinsertedintothedownstreamofCMVpromoterwasestablishedbyligation.ThenthelinearizedshuttleplasmidwascotransformedintoBJ5183bacteriawithbackbonevectorAdEasy1toobtaintherecombinantadenoviralplasmidpAdE6E7byhomologousrecombination.TherecombinedadenovirusDNAwastransfectedinto293cellsforpackingandtheamplificationproductofreplicationdeficientAdE6E7viruswaspurifiedbyCsCldensitygradientcentrifugation.TheexpressionofE6E7wasverifiedbyWesternBlotin293cellafterinfectedwithAdE6E7.RESULTS:TherecombinantplasmidpAdE6E7wasestablishedbyhomologousrecombinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.GFPexpressioncouldbeobserved3dafterpackingofthelinearizedpAdE6E7in293cellsand6.9×1010pfu/LtiterofAdE6E7wasobtainedbyCsClgradientpurification.The293cellwasinfectedwiththistiterofAdE6E7viruses,andthentotalproteinin293cellswasextracted.WesternBlotshowedthatE6E7proteinwasexpressedobviously.CONCLUSION:AdE6E7expressingbothGFPandE6E7simultaneouslycanbesimplyandrapidlygeneratedbyusingtheAdEasysystem.

【Keywords】papillomavirus,human;adenoviridae

【摘要】目的：利用AdEasy系统构建人乳头瘤16(HPV16)E6E7基因重组腺病毒，并通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.方法：将质粒pET32a（+）E6E7扩增、酶切获得E6E7片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrackCMV的巨细胞病毒（CMV）启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrackCMVE6E7，线性化后与骨架载体AdEasy1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAdE6E7，经人胚肾293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdE6E7；用包装后的病毒上清再次感染293细胞，提取细胞中的蛋白，通过WesternBlot方法检测E6E7蛋白的表达.结果：连接、重组后通过酶切和测序法筛选出pAdE6E7；经人胚肾293细胞包装，3d后观察到绿色荧光蛋白（GFP）明显表达，氯化铯梯度离心纯化最终获得6.9×1010pfu/L滴度的重组病毒；用该滴度的AdE6E7重新感染人胚肾293细胞3d后，提取细胞蛋白,WesternBlot检测,E6E7有明显表达.结论：利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6E7的重组腺病毒AdE6E7.

【关键词】人类乳头状瘤病毒，人；腺病毒科

0引言

高危型人类乳头瘤状病毒（HPV16,18）与宫颈癌的发病密切相关［1］.HPV编码了多种癌蛋白（E1,E5,E6,E7等）其中以E6,E7为主，他们都能诱导细胞永生化，引起细胞的永生.复制缺陷型重组腺病毒(replicationdeficientrecombinantadenovirus)是目前基因治疗最常用的载体之一［2］，我们利用AdEasy系统构建了外源插入HPV16E6E7片段的复制缺陷性腺病毒AdE6E7，并观察了AdE6E7感染293细胞，为研究HPV16E6E7在女性宫颈癌中的作用提供新的手段.

1材料和方法

1.1材料穿梭质粒pAdTrackCMV，骨架质粒pAdEasy1，仅插入GFP的对照重组腺病毒质粒pAdGFP，大肠杆菌BJ5183由重庆医科大学肝病研究所惠赠；293细胞、E.coli,DH5a由本实验室保存.pET32a（+）E6E7载体已构建成功.PmeⅠ,PacⅠ限制性内切酶购自基因公司；BglⅡ,HindⅢ限制性内切酶、连接试剂盒、DNA小量胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品；LipofectaminTM2000脂质体转染试剂盒购自Roche公司，DMEM培养基及胎牛血清购自Hyclon公司；蛋白Marker购自Tiangene公司；驴抗鼠的E6单克隆抗体购自SantaCruz公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠的E6二抗及DAB显色系统购自北京中山公司.

1.2方法BglⅡ和HindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV和pET32a（+）E6E7，凝胶回收E6E7片段和线性化的pAdTrackCMV，连接（16℃,8h），转化DH5a感受态细菌，在卡那酶素抗性的LB平板上培养过夜，挑选转化的菌落，提取质粒，BglⅡ和HindⅢ双酶切鉴定阳性克隆，同时送上海生物工程公司测序分析.提取pAdtrackCMVE6E7质粒，取1μg用PmeⅠ线性化，胶回收线性化的pAdtrackCMVE6E7质粒，转化到含有腺病毒基因组质粒AdEasy的BJ5183感受态细胞中［3］，在卡那酶素抗性的LB平板上培养16～24h，挑选较小的菌落培养，抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳初筛重组体，再用PacⅠ酶切鉴定.PacⅠ线性化AdE6E7，乙醇、醋酸钠沉淀，700mL/L乙醇漂洗后重新溶解在20μL灭菌的去离子水中.配制A液（质粒DNA4μg+无血清DMEM至250μL）和B液（10μLLipofectaminTM2000以无血清DMEM稀释至250μL），A，B混合，37℃反应2h.PBS漂洗细胞后每孔加入2mL无血清培养液，将混合物轻倾于培养孔中轻轻混合，继续培养8h后更新完全培养基，直至90%以上293细胞出现病变（cytopathiceffect,CPE）.收集上清继续感染293细胞以扩增病毒.用氯化铯密度梯度离心法纯化重组重组腺病毒AdE6E7.收集后的病毒层，0.22μm无菌过滤后小份分装，-80℃保存.Trizol试剂提取重组腺病毒感染293细胞和未感染293细胞的RNA取1μg细胞总RNA进行逆转录反应，总反应体积为50μL,37℃反应1h,95℃5min，灭活逆转录酶.PCR扩增E6E7片段的上游引物PF:5＇cgggatccatggaaaccggttagtataaa3＇，下游引物PR:5＇cgggatcccatggtagattatggtt3＇.反应条件：95℃变性5min,95℃30s,58℃30s,72℃1min，30个循环，72°C延伸10min.RIPA提取AdE6E7感染293细胞和未感染293细胞的总蛋白，变性后做SDSPAGE电泳，转膜，条件为6V恒压，3.5h.驴抗羊的E6单抗、HRP标记的二抗，杂交反应后DAB显色.根据文献［3］用已获得的重组腺病毒感染HEK293细胞，得到扩增的病毒粗提液，将病毒粗提液进行对数稀释，通过终点稀释试验计算病毒滴度.终点稀释实验中滴度计算公式：病毒滴度（pfu/L）=104（x+0.8），x为各行阳性率总和.

2结果

2.1腺病毒穿梭载体pAdtrackCMVE6E7的构建和鉴定用BglⅡ和HindⅢ分别双酶切腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,pET32a（+）E6E7和pAdtrackCMVE6E7质粒（图1），可以获得860bp的E6E7基因和8.9kb的pAdTrackCMV.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackCMV/BglⅡ,HindⅢ;3:pET32E6E7/BglⅡ,HindⅢ;4:pAdTrackCMVE6E7/BglⅡ,HindⅢ;5:Marker:2000.

图1腺病毒穿梭载体pAdtrackCMVE6E7鉴定（略）

2.2E6E7重组腺病毒基因组质粒的构建和鉴定同时将pAdtrackCMVE6E7质粒和pAdtrackCMV空质粒用PmeⅠ线性化后，转化到含有AdEasy1的BJ5183感受态细菌中，与其内的AdEasy1进行同源重组.PacⅠ酶切后，可见4.5kb和23kb处各有1个条带（图2）.

1.3AdEasyE6E7重组腺病毒感染293细胞的鉴定脂质体包裹AdEasyE6E7同源重组腺病毒基因组质粒转染293包装细胞1~2d后，光镜下可观察到空斑形成，细胞变圆、肿胀、脱壁、细胞核变大等病变.荧光显微镜下观察，重组腺病毒感染的293细胞和pAdtrackCMV感染的293细胞，在培养1～2d后有EGFP表达，并逐渐增多.AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，RTPCR检测显示有1条860bp条带，而pAdtrackCMV空载体感染的293细胞的相应位置无特异条带（图3）.AdEasyE6E7重组腺病毒感染的293细胞，用WesternBlot检测显示有1条能与E6单抗特异性结合的蛋白印迹条带，而pAdtrackCMV空载体重组后的腺病毒AdEasyCMV感染的293细胞的相应位置无特异条带（图4）.经终点稀释实验测定得到重组复制缺陷型病毒滴度为6.9×1010pfu/L.

1:Marker:λHindⅢ;2:pAdTrackk14E6E7/BamHⅠ;3:重组后的pAdTrackCMVE6E7/PacⅠ;4:重组后的pAdTrackCMV.

图2PacⅠ酶切鉴定AdEasyE6E7（略）

1:Marker:100bpDNAMarker;2:RTPCR产物:E6E7基因（860bp）;3:RTPCR阴性对照.

图3RTPCR鉴定AdEasyE6E7转染的293细胞中E6E7的表达（略）

1:E6E7;2:NOE6E7.

图4WesternBlot鉴定AdEasyE6E7/AdEasyCMV（略）

3讨论

目前基因治疗中应用最广泛的生物病毒载体有反转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体，其中腺病毒的优于其他载体的特点［4-5］.腺病毒载体可转导非分裂细胞，并在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量，最后腺病毒载体进入细胞内并不整合到宿主细胞基因组，仅瞬间表达，因而安全性较高.已被美国FDA批准作为基因治疗载体应用于临床实验.

我们先将AdEasy1骨架载体转化到用CaCl2制备的BJ5183感受态中，然后再将线性化的pAdtrackCMVE6E7转化进含有AdEasy1的BJ5183制成感受态，同源重组［6-7］.已转化了AdEasy1质粒的BJ5183细胞更方便进行细菌内同源重组，免去了在真核细胞内重组筛选复杂、费时的缺点.为了验证重组腺病毒是否带有目的基因E6E7，进行了如下鉴定：对pAdtrackCMVE6E7质粒酶切和测序，结果证明目的基因E6E7正确插入到穿梭载体；pAdtrackCMVE6E7经PacⅠ酶切后，可见4.5kb和23kb两条带，说明重组成功；构建腺病毒载体的穿梭质粒pAdtrackCMV中的构建元件已插入EGFP表达盒，重组腺病毒转染293细胞后，通过荧光显微镜观察，可见293细胞有绿色荧光蛋白表达，并逐渐出现生长停止和空斑形成，证明AdEasyE6E7已包装入293细胞；通过RTPCR和Westernblot方法证明了AdEasyE6E7转染293细胞后有E6E7核酸和蛋白的表达.这个载体的构建对于进一步研究HPV16E6E7体内、体外基因治疗实验奠定了基础.

【参考文献】

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［3］滑玮，辛晓燕，苏明权，等.修饰hTERT核心启动子靶向转录FCY1的重组腺病毒的构建及鉴定［J］.第四军医大学学报，2003,24（8）:734-737.

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