抗Stat3多克隆抗体的制备和其在乳腺癌诊断中的应用

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【关键词】信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级

Preparationofpolyclonalantibodyagainststat3anditsapplicationinthediagnosisofbreastcancer

【Abstract】AIM:TopreparerabbitantibodyagainstStat3andanalyzeitsapplicationinthediagnosisofbreastcancer.METHODS:ThemalerabbitswereimmunizedwithrecombinantmouseStat3proteintoprepareantibodyagainstStat3.ThepurityandspecificityoftheantibodywereanalyzedbyWesternBlot.TheexpressionofStat3proteininthe65casesofbreastcancerand30casesofnormalbreasttissuewasdetectedbyimmunohistochemicalstaining.RESULTS:ThetiterofantiStat3antibodyinserumwas>1∶256000(A450=0.40)atthe6thweekaftertheimmunization.BothSDSPAGEandWesternBlotanalysisshowedthattherewasanobviousproteinbandwithMr92000,TheintracytoplasmicexpressionlevelsofStat3proteininthedifferenthistologicalgradingsof65casesofbreastcancershowedsignificantdifference(P<0.05),sodidtheintranuclearexpressionlevels(P<0.05).CONCLUSION:PolyclonalantibodyagainstStat3withhightiterandspecificitycanbepreparedsuccessfully,anditcanbeusedtodetecttheexpressionofStat3proteininbreastcancertissue.

【Keywords】Stat3;antibodies;breastneoplasms;histologicalgrading

【摘要】目的：制备兔抗信号转导与转录激活因子3（Stat3）抗体，分析其在乳腺癌诊断中的价值.方法：应用人工重组小鼠Stat3蛋白，免疫雄性家兔制备抗Stat3抗体；用免疫印迹法分析检测抗Stat3抗体的纯度和特异性；应用免疫组化染色法检测65例乳腺癌和30例正常乳腺组织中Stat3蛋白的表达.结果：用Stat3蛋白免疫家兔被免疫6wk后，其血清中抗Stat3抗体效价>1∶256,000（A450nm=0.40）；SDSPAGE和免疫印迹分析均在分子质量（Mr）92000处有明显的带；65例乳腺癌组织的细胞浆和细胞核中，Stat3蛋白表达量在不同的组织学分级之间有统计学差异(P<0.05).结论：高效价和特异性强的抗Stat3抗体被成功制备.该抗体可用于乳腺癌组织细胞Stat3蛋白表达的检测.

【关键词】信号转导与转录激活因子3；抗体；乳腺肿瘤；组织学分级

0引言

信号转导与转录激活因子3(signaltransducerandactivatoroftranscription;Stat3)是一类脱氧核糖核酸结合蛋白，于细胞浆内有少量表达，细胞核内无表达，是信号转导与转录激活因子家族的重要成员之一.

异常的信号转导使Stat3磷酸化而被持续激活，促进细胞的恶性转化［1］和阻断细胞凋亡［2］.Stat3也可以被多种细胞因子、生长因子、非受体酪氨酸激酶、G蛋白等分子激活，将细胞外信号转导至细胞核，激活基因的转录和表达［3］.Stat3表达的变化与肿瘤的发生密切相关，然而，有关Stat3在乳腺癌诊断中的作用还没有详细报道.我们用本室制备的小鼠重组Stat3蛋白，再制备兔抗Stat3抗体，来分析Stat3蛋白在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达，以及在乳腺癌诊断中的价值.

1材料和方法

1.1材料雄性，新西兰兔，体质量3.0kg(河北医科大学动物中心).福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂为美国GibcoRBL产品.HRP标记的羊抗兔IgG和免疫组化显色试剂盒（购自北京中山生物工程公司）.重组小鼠Stat3蛋白由本室和美国MD公司共同制备（蛋白含量1.63g/L，经SDSPAGE分离显示单一条带，Mr为92000）.30例正常乳腺组织来自良性增生和良性腺病的患者，65例乳腺癌组织来自女性乳腺癌患者，年龄(48±15)岁.这些研究对象经冰冻切片和免疫组化同时证实确诊，病理学分级由病理科提供，常规方法做病理切片.

1.2方法

1.2.1免疫动物将Stat3蛋白（0.336g/L）0.2mL与福氏完全佐剂0.5mL混匀后，注射于家兔腹股沟和后脚掌进行初次免疫.14d将同样量的Stat3蛋白与福氏不完全佐剂0.5mL混匀后进行第二次免疫，注射部位同前.28d取Stat3蛋白（0.25g/L）0.15mL用福氏不完全佐剂0.5mL混匀后，于背部皮下多点注射进行最终免疫.42d处死兔子收集全血.其中于初次免疫前取耳静脉血2mL；第1次免疫后12d，第2次免疫后7d，第3次免疫后9,14d分别抽血3mL用于抗体效价测定.

1.2.2抗体效价的检测用0.05mol/LpH9.5CBS稀释Stat3蛋白，用常规方法包被酶标板，ELISA法检测兔血清中抗Stat3抗体的效价.

1.2.3抗体的纯化用330g/L饱和硫酸胺盐析抗血清，离心沉淀后，用生理盐水透析24h，8h换1次生理盐水，将透析液用DEAE32层析柱进行浓缩，收集洗脱液，测A280nm值.

1.2.4抗体纯度和特异性检测将Stat3蛋白进行SDSPAGE分离（分离胶浓度为120g/L）.电泳后，用考马斯亮蓝R250染液染色确认蛋白条带，将分离胶中的蛋白用电泳转移法转移至PVDF膜，PVDF膜用50g/L脱脂奶粉4℃封闭过夜.洗膜后，与兔抗Stat3抗血清(1∶1000稀释)37℃反应2h；加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5000稀释)，于37℃反应1h，以DAB显色.

1.2.5乳腺组织细胞Stat3表达的检测200309/200403取本院外科65例乳腺癌患者手术切除的乳腺癌组织标本，30例良性增生和良性腺病的乳腺组织进行组织切片.将上述方法制备的兔抗Stat3抗体用PBS做1∶400稀释，按常规SP方法进行乳腺组织免疫组化染色.结果判断标准：按照Laird标准［4］进行，Stat3阳性表达为细胞质呈棕黄色云雾状，细胞核呈棕色颗粒状.每个视野中阳性细胞>50%为强阳性（），5%～50%的为阳性（+），<5%为阴性（-）.Stat3蛋白胞质表达：细胞质呈深棕色云雾状>80%（），细胞质呈棕色云雾状>50%（），细胞质呈棕黄色云雾状>5%～50%（+），细胞质呈淡棕黄色云雾状<5%（-）.Stat3蛋白胞核表达：细胞核呈深棕色颗粒状>80%（），细胞核呈棕色颗粒状>50%（），细胞核呈棕黄色颗粒状>5%～50%（+），细胞核不染色或呈淡棕黄色颗粒状<5%（-）.

统计学处理：免疫组化染色所得结果用SPSS11.5软件分析，统计方法为非参数秩和检验，Spearmans等级相关.P<0.05为有统计学意义.

2结果

2.1兔抗Stat3血清效价基础免疫后2,3,5,6wk分别采取静脉血，间接ELISA法检测抗Stat3抗体的血清效价，分别为1∶6400,1∶32000,1∶240000和>1∶256000(A450nm=0.40).

2.2抗Stat3抗体的特异性和纯度鉴定Stat3蛋白经SDSPAGE分离，用考马斯亮蓝R250染液染色，分离出1条Mr为92000的蛋白条带，大小与Stat3理论值相符（图1中M和1）.将凝胶中的Stat3转移至PVDF膜，用制备好兔抗Stat3抗体进行免疫印迹，也出现Mr为92000左右的带（图1中2），证明此抗体为抗Stat3的特异性抗体.

M:marker;1:Stat3蛋白考马斯亮蓝R250染色；2：Stat3蛋白免疫印迹.

图1兔抗Stat3血清特异性的免疫印迹分析（略）

2.3抗Stat3抗体在乳腺癌诊断中的应用将正常乳腺组织30例和乳腺癌组织65例组织切片进行抗Stat3抗体免疫组化染色（表1，图2），Stat3在正常乳腺组织细胞质中呈淡棕黄色云雾状，胞核不着色.乳腺癌组织在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有统计学差异(P<0.05)；细胞核中Stat3蛋白表达在不同组织学分级乳腺癌组织中也有统计学差异(P<0.05).正常乳腺组织细胞质中可见棕黄色雾状着色，胞核不着色（图3A）；在低分化癌细胞质呈棕色云雾状，胞核呈颗粒状深棕色（图3B）；而高分化癌组织的细胞质呈棕黄色云雾状，胞核着色呈棕色颗粒状（图3C）.

表1不同组织学分级的乳腺癌组织中Stat3的表达（略）

图2Stat3蛋白在乳腺癌细胞质（A）和细胞核（B）中的表达量与组织学分级（略）

A：正常乳腺组织；B：Ⅲ级；C：Ⅱ级.

图3Stat3在不同分级乳腺癌组织中表达SP×400（略）

3讨论

Stat3分子由750～795个氨基酸组成，Mr约为92000.编码Stat3的基因在鼠科动物定位于第11号染色体，在人类定位于第17号染色体q21.Stat3在信号转导与转录激活途径中发挥着重要作用，细胞膜上的细胞因子受体及非细胞因子受体与相应配体相结合后，使胞质内的Jauns激酶（JaunsKinase;JAK）处于适当空间位置而相互磷酸化，然后募集Stat3蛋白到胞质区磷酸化激酶的酪氨酸残基上，以激活该蛋白，活化的Stat3形成同源或异源二聚体迅速转位进入细胞核，与其特异的DNA序列结合，启动下游基因的转录［5］.Stat3持续活化可引起急性髓细胞性白血病、磷状细胞癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞异常增生［6-8］.细胞核内Stat3含量的高低标志着该细胞JAkStat途径的持续激活程度，只有激活的Stat3才能从细胞质转入细胞核，参与基因的表达调控［9］.Berclaz等［10］报道，正常人乳腺上皮细胞、肌上皮细胞、纤维母细胞周围的脂肪性乳腺间质等组织，检测到细胞质有微量Stat3的表达；在乳腺癌组织胞质内和胞核，都有非常强的Stat3表达，比正常乳腺组织高出很多倍.信号转导与转录激活可使下游癌基因获得转录活性并表达，最终有可能形成癌症.因此，信号转导与转录激活是疾病（如肿瘤）形成的一个早期事件，Stat3的激活可能发生在疾病进程的早期，检测Stat3蛋白在细胞质、细胞核中的表达量将可能用于乳腺癌的诊断.

本实验结果显示，乳腺癌组织的细胞质Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，在不同组织学分级的细胞质中Stat3蛋白表达量有显著性差异(P<0.05).乳腺癌组织的细胞核中Stat3蛋白表达量与组织学分级成正相关，Stat3蛋白表达的含量也与组织学分级有显著性差异(P<0.001)，组织学分级越高，细胞分化程度越低，胞核Stat3量越高.当乳腺癌发生时，Stat3的胞浆表达量增高，而胞核Stat3的含量从无到有，即胞核中Stat3蛋白呈阳性，因此Stat3蛋白的过量表达可能在乳腺癌的发生、发展过程中起重要作用.

【参考文献】

［1］BrombergJF,WrzeszczynskaMH,DevganG,etal.Stat3asanoncogene［J］.Cell,1999,98(3):295-303.

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［3］TakedaK,AkiraS.STATfamilyoftranscriptionfactorsincytokinemediatedbiologicalresponses［J］.CytokineGrowthFactorRev,2000,11(3):199-207.

［4］LairdDW,FistourisP,BatistG,etal.Deficiencyofconnexin43gapjunctionsisanindependentmarkerforbreasttumors［J］.CancerRes,1999,59(16):4104-4110.

［5］HoeyT,GrusbyMJ.STATsasmediatorsofcytokineinducedresponses［J］.AdvImmunol,1999,71:145-162.

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［10］BerclazG,AltermattHJ,RohrbachV,etal.EGFRdependentexpressionofSTAT3(butnotSTAT1)inbreastcancer［J］.IntJOncol,2001,19(6):1155-1160.