结核分枝杆菌研究论文

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【关键词】结核分枝杆菌ImmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedinmicebyMycobacteriumtuberculosisMPT64ESAT6fusionprotein【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsesbyMPT64andESAT6fusionproteinsandtotestprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicewereimmunized3timesat2weekintervalsubcutaneouslyonthebackwithfusionproteinMPT64ESAT6.Inthespleenlymphocytesofimmunizedmicestimulationindex(SI)wasmeasuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγwasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusionproteinswereintravenouslyinfectedwith1×105CFUMTBstrainH37Rv.Fourweekslater，bacterialloadinspleenswasdetermined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedwithfusionexpressionproteinMPT64ESAT6was1∶1500.TheSIoflymphocytesinfusionproteinimmunizedgroupwas2.23,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup(0.88).TheIFNγlevelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceimmunizedwithfusionproteinswere(4.28±0.27)μg/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup［(0.48±0.17)μg/L,P<0.05］,butlowerthanthatofBacillusCalmetteGuerin(BCG)immunizedgroup［(5.18±0.31)μg/L］.Comparedwithsalineimmunizedmice（bacterialloadwas6.45±0.17）,dramaticreductionswereobservedforMTBreplicationinthespleenfromBALB/cmiceimmunizedwithfusionproteins(bacterialoadwas5.04±0.11)followingasubsequentchallenge,buttheprotectiveefficacyinmiceimmunizedwithMPT64ESAT6wasnotasgoodasthatofBCGimmunizedgroup(bacterialloadwas4.38±0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeusedasanovelcomponentofthenewTBvaccine.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusionexpression【摘要】目的：测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法：将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次，每次间隔2wk，ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.最后一次免疫完成后4wk，分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞，MTT法检测淋巴细胞刺激指数，ELISA检测悬液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv，4wk后计数脾脏细菌负荷数.结果：MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶1500，免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23，而生理盐水免疫组只有0.88；脾淋巴细胞悬液中诱发的IFNγ为（4.28±0.27）μg/L，显著高于生理盐水免疫组［（0.48±0.17）μg/L，P<0.05］，但不及BCG免疫组［（5.18±0.31）μg/L］.与生理盐水免疫组（细菌负荷6.45±0.17）相比较，融合蛋白免疫的小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用，细菌负荷为5.04±0.11，但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微（细菌负荷4.38±0.22）.结论：MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.【关键词】结核分枝杆菌；疫苗；MPT64；ESAT6；融合表达0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）中重要的保护性抗原,编码这两种蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGuerin,BCG）中缺失［1］，研究发现重组的MPT64和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗MTB感染.本研究在成功获得MPT64与ESAT6融合蛋白的基础上［2］，研究该融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答水平和对MTB毒株H37Rv攻击的保护力.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠；卡介苗疫苗株由兰州生物制品研究所出品（国药准字SF20010035，批号20011201）；鼠IFNγ和ELISA检测试剂盒购自晶美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培养增强剂（albumindextrosecatalaseADC）和RPMI1640培养基均购自GIBCO公司.7H9液体培养基购自美国Difco公司；改良罗氏培养基由本室自制，MTB的培养滤液蛋白(culturefiltrateproteins,CFP)由本室制备.羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司.6~8周龄BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于第四军医大学动物中心感染实验室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37Rv的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB毒株H37Rv接种到7H9培养基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），37℃振摇培养3wk，5000r/min离心10min，收集细菌，保存于-20℃备用.用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37℃培养2wk，计数浓缩液细菌的CFU.1.2.2BCG的培养和定量取BCG疫苗株接种到7H9液体培养基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）.1.2.3融合蛋白的大量制备取MPT64pProEXHTESAT6阳性克隆［2］，活化后分别接种到1000mLLB培养液中，37℃振摇培养至对数生长期，IPTG诱导，集菌，先进行SDSPAGE，采用Invitrogen的NiNTA纯化试剂盒纯化目的蛋白，分光光度法测定蛋白浓度.1.2.4免疫动物实验随机分为3组，每组10只小鼠，一组用MPT64ESAT6融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫剂量均为1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐剂，第三次单纯免疫融合蛋白，每次间隔2wk，免疫结束后，收集小鼠血清，用CFP作为抗原，ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度,其余两组分别为BCG和生理盐水对照组.最后一次免疫结束后4wk，进行以下实验：每组取5只小鼠，用于测定淋巴细胞刺激指数(stimulationindex,SI)和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻击实验.1.2.5脾脏淋巴细胞的分离与制备将免疫的小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于平皿内200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入RPMI1640培养液冲洗.将上述细胞悬液转入2倍体积的淋巴细胞分离液，1000r/min离心20min.吸取中间单核细胞层，用RPIM1640液洗涤两次后计数.1.2.6特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液培养，200μL/孔，同时实验组每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制备），对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃50mL/LCO2孵箱培养68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，过滤除菌），继续培养4h后弃上清，加DMSO150μL/孔，振荡10min，测定A490nm值.结果用刺激指数SI=实验组A值/对照组A值表示.1.2.7IFNγ的诱生及含量的测定5×109/L脾细胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培养液中培养，800μL/孔，同时加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培养72h，收集培养液，5000r/min离心5min，取上清，-20℃冻存备检.参照试剂盒说明（夹心ELISA法）测定各标本所含IFNγ浓度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻击实验最后一次免疫完成后4wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为105CFU/只，4[1][2]wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，计数细菌CFU.统计学处理：实验数据以x±s表示,统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验,P<0.05有统计学意义.2结果2.1小鼠体内特异性抗体滴度MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠三次后血清特异性抗体滴度平均值为1∶1500.2.2抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用CFP抗原刺激，测定了淋巴细胞的增殖反应，与生理盐水对照组（SI为0.88）相比较融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖明显，SI为2.23，BCG免疫组SI为3.58，高于融合蛋白免疫组.2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平MPT64ESAT6免疫的小鼠的脾淋巴细胞悬液，体外用CFP刺激，其悬液IFNγ含量分别为（4.28±0.27）μg/L，与生理盐水对照组（0.48±0.17)μg/L相比较有明显增加（P<0.05），但不及BCG免疫组［（5.18±0.31）μg/L,P<0.05］（图1）.2.4免疫小鼠对MTB毒株攻击时的抵抗作用免疫完成后4wk，H37Rv经尾静脉感染BALB/c小鼠，4wk后计数脾脏细菌负荷数，与生理盐水免疫组（细菌负荷数6.45±0.17）相比较，融合蛋白MPT64ESAT6免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用（细菌负荷数分别为5.04±0.11），但与BCG免疫组（细菌负荷数为4.38±0.22）相比较脾脏细菌负荷减少甚微.aP<0.05vs生理盐水.n=5.图1融合蛋白在小鼠脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平（略）3讨论卡介苗（BCG）是目前唯一的预防结核病疫苗，但其对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力常发生变化（0~80%）［3］，因此，研制全面有效的新疫苗是控制结核病的重要途径.融合亚单位疫苗具有成分明确，使用安全，可减少纯化步骤等优点而受到国内外的重视.目前已知的保护性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B复合物、ESAT6和MPT64［4］等，选择这几种抗原制备的亚单位疫苗可诱导强烈的特异性免疫应答，并不受先前接触分枝杆菌的影响.单个蛋白构成的亚单位疫苗产生的特异性体液和细胞免疫应答是针对每一组分抗原的，机体获得的免疫保护力有限，因此新型TB疫苗着重于融合多个免疫表位［5］.本研究中将纯化的MPT64与ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特异性抗体滴度可达到1∶1500，显著高于已报道文献［6］中抗体的滴度，融合蛋白免疫三次后，小鼠特异性淋巴细胞增殖指数显著升高，说明淋巴细胞被有效活化.IFNγ常被认为是抵抗MTB感染的一个关键性细胞因子，也是Th1型细胞免疫反应的重要指标，TB的保护性效应与分泌IFNγ的淋巴细胞的产生密切相关.融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠诱生的IFNγ水平显著高于生理盐水对照组（P<0.05），提示这两种融合基因可能是TB疫苗中理想的候选基因.MTB毒株攻击实验中，与生理盐水组相比较，MPT64ESAT6免疫组使得细菌数由6.45±0.17降为5.04±0.11，有效控制了MTB的感染，但与BCG免疫组相比免疫保护力还是有一定差距.研究发现，单独使用结核杆菌短期培养液中分离纯化的分泌型蛋白免疫动物，只会产生很弱的免疫应答，亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂多次接种才能达到效果［7］，在本研究中，采用不完全福氏佐剂具有很强的免疫调节作用，可刺激产生IL2，IFNγ和IL12，是本室较常用的一种免疫策略.MPT64ESAT6融合蛋白诱导的保护力有限，分析原因可能是因为保护性抗原种类不多，难以诱导产生广泛而全面的细胞免疫应答；同时蛋白质在体内的滞留时间短并且其产生的免疫应答的持续时间也较短，需选择合适的剂量［8］，多次免疫才能达到有效的保护水平.【参考文献】［1］KamathAT,FengCG,MacdonaldM,etal.DifferentialprotectiveefficacyofDNAvaccinesexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculosis［J］.InfectImmun,1999,67(4):1702-1707.［2］师长宏,王晓武,生,等.结核分枝杆菌差异蛋白MPT64与ESAT6的融合表达与纯化［J］.第四军医大学学报,2005,26(20):1840-1842.［3］范雄林,徐志凯,李元,等.结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］.第四军医大学学报,2001,22(14):1283-1287.［4］DohertyTM,AndersenP.Tuberculosisvaccinedevelopment［J］.CurrOpinPulmMed,2002,8(3):183-187.［5］师长宏,范雄林,徐志凯,等.结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表达及纯化［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,(2):89-92.［6］薛莹,李元,史皆然,等.结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性［J］.第四军医大学学报,2002,23(13):1203-1205.［7］LangermansJA,DohertyTM,VervenneRA,etal.ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT6［J］.Vaccine,2005,23(21):2740-2750.［8］DietrichJ,AagaardC,LeahR,etal.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmoleculebasedtuberculosissubunitvaccine:EfficientprotectionandESAT6basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy［J］.JImmunol,2005,174(10):6332-6339