心脏缺血再灌注损伤研究论文

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【关键词】再灌注损伤Changesofnitricoxidesynthesisincardiacischemiareperfusioninjury【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionandfunctionofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andinducibleNOS(iNOS)duringischemiareperfusioninjury(IRI)inrathearts.METHODS:IRIwasinducedbyclampingtheleftanteriordescending(LAD)ofcoronaryarteryfor1h,followedbyreperfusion.Nitricoxidesynthase(NOS)activitiesofheartswasassayedatvarioustimepointsandNOSproteinlevelsaswellasNOSmRNAexpressionweredeterminedbyWesternblotandRTPCRmethodsrespectively.RESULTS:eNOSactivity,proteinlevelandmRNAexpressionallincreasedafter26hofIRIanddecreasedafter3dofIRIandthengraduallyreturnedtobasallevelafter21d.iNOSwasexpressedafter12hofIRIandreachedthepeaklevelatday3afterIRIandthendecreasedtobasallevel.CONCLUSION:TheexpressionofiNOSishighwhilethatofeNOSislowduringcardiacischemiareperfusioninjury.ProperregulationofeNOSandiNOSexpressionmaybetherapeuticallyhelpfulintreatingpatientswithcardiacischemiareperfusioninjury.【Keywords】reperfusioninjury;nitricoxidesynthase;heart【摘要】目的：研究大鼠心脏缺血再灌注损伤(IRI)过程中一氧化氮合酶(NOS)的变化规律及其作用.方法：制作SD大鼠心脏IRI动物模型,用同位素法测定正常及IRI心组织的NOS活性；用Western印迹和逆转录PCR法分析eNOS和iNOS在IRI过程中蛋白和基因表达的变化.结果：心脏eNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注2~6h后均增高，3天后降低，21天后逐渐恢复到正常水平.心脏iNOS活性、蛋白和mRNA表达水平，在缺血再灌注12h后开始表达，3天达高峰，然后逐渐降至正常水平.结论：单纯缺血并不引起NOS活性的明显变化,再灌注损伤使NOS的mRNA表达增加,酶的合成增多,活性增高.【关键词】再灌注损伤；一氧化氮合酶；心脏0引言一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(NOS)在心肌缺血再灌注中起着极其重要的作用［1］.一氧化氮合酶(nitricoxidesynthesis,NOS)可分为原生型(cNOS)和诱生型(iNOS).cNOS依存在的部位分为神经型(nNOS)和内皮型(eNOS).心脏组织内的NOS同功酶有两种,即eNOS和iNOS.参与炎性反应及急性排斥反应等病理过程［2］.我们研究eNOS和iNOS在心脏IRI中的变化规律及其作用,为其防治提供理论基础.1材料和方法1.1材料SD大鼠购自华中科技大学同济医学院实验动物中心；iNOSAssayKit购自南京建成生物技术研究所；一抗羊抗大鼠iNOS或eNOSmAb购自武汉博士德公司；HRP标记的兔抗羊IgG二抗购自Sigma公司；Trizol裂解液、Oligo(dT)、TaqDNA聚合酶和逆转录酶(AMVRT)均为美国Gibco公司产品；eNOS和iNOS引物及内参照由上海博亚生物技术公司合成.冠状动脉阻断再灌注模型制备［3］后在不同的再灌注时间点处死大鼠,收集心脏标本,液氮急冻,-70℃保存备用.1.2方法取雄性200～220gSD大鼠120只,随机分为缺血再灌注（IRI）组和假手术（对照,Control）组，每组60只，在再灌注不同时间点（0,0.5,1,2,6,12h和1,3,7,14,21,30d）处死大鼠，每组每个时间点各5只.1.2.1NOS活性的测定IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2g,采用iNOSAssayKit进行测定.心组织NOS活性的测定采用3［H］精氨酸同位素法［4］,心组织在4℃含有1mmol/Lleupeptin,2mmol/Laprotonin,1mmol/Lphenylemthylsulfonylfluoride,1mmol/LDTT,1ml/LTritonX100的30mmol/LHEPES缓冲液中匀浆,反应液为30mmol/LHEPES缓冲液(pH7.4),含1mmol/LCaCl2,100mmol/LNADPH,300mmol/Ltetrahydrobiopterin,1mmol/Ldithiothreitol,以40mmol/LL3H精氨酸(37kBq/反应液)为反应底物,在37℃下反应30min,用200μL含100mmol/LEGTA的终止液终止反应,反应体系过5cm的Dowex离子交换层析柱,加闪烁液后读取放射性记数.蛋白定量用Bradford法,NOS活性用每克蛋白秒fmol（即fkat/g）表示.1.2.2Western印记检测iNOS和eNOS蛋白表达IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2g,以5∶1(V/m)比例置匀浆缓冲液（含50mmol/LTrispH7.5,150mmol/LNaCl,5g/Lαcholatesodium,1g/LSDS,2mmol/LEDTA,10g/LTritonX100,100mL/L甘油，1mmol/LPMSF,2mg/Laprotinin）匀浆破碎组织.匀浆液于4℃10000g离心15min，收集上清液并用dyebinding(BioRad)方法以牛血清清蛋白为标准测定蛋白浓度.取含30mg总蛋白的各组标本匀浆上清液点样进行75g/LSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离Mr135000的iNOS及150000的eNOS蛋白.Mr标准采用预染的彩虹重组蛋白(AmershamInternationalplc,Buckinghamshire,England).电泳后的凝胶通过Western印记装置（BioRad）电转移蛋白质至hybondC膜(AmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,England).转移膜经封闭、与1∶500稀释的iNOS或eNOSmAb4℃孵育过夜、洗涤、与1∶5000稀释的HRP标记的兔抗羊IgG室温孵育1h和第2次洗涤，最后用ECLWestern印记荧光检测系统(AmershamLifeSciences,ArlingtonHeights,IL)显色、曝光于X光底片(Fuji,Tokyo,Japan)和显影、定影.将感光X光片上蛋白条带应用HPIAS2000型图像分析系统(同济千屏影像工程公司生产)扫描测定光密度(OD)定量.1.2.3RTPCR检测iNOS和eNOS的转录IRI组大鼠取左室缺血区心肌0.2g,对照组大鼠取左室相应区心肌0.2g,采用Trizol试剂提取总RNA，以thermoscriptTMRTPCR系统进行逆转录和PCR反应.PCR反应采取等量逆转录cDNA模板，分别以iNOS,eNOS,βactin特异性引物进行PCR反应.扩增iNOS的引物对为：sense：5′TGGCTTGCCCTTGGAAGTTTCTC3′,antisense:5′TCCAGGCCATCTTGGTGGCAAGA3′，预计扩增产物为574bpiNOScDN段，PCR反应条件为95℃5min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃10min.扩增eNOS的引物对为：sense:5′TACGGAGCAGCAAATCCAC3′,antisense:5′CAGGCTGCAGTCCTTTGATC3′，预计扩增产物812bp，PCR反应条件为95℃5min；95℃45s，60℃45s，72℃1.25min，共30个循环；72℃10min.内对照βactin的扩增引物对为：sense:5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′,antisense:5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，预计产物为540bp，PCR反应条件为95℃2min；95℃30s，60℃45s，72℃1min，共30个循环；72℃10min.PCR产物以含0.5mg/L溴乙锭的10g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下观察电泳条带,用BioRad凝胶分析系统分析结果，结果以光密度值（OD）表示.统计学处理:数据均以x±s表示.应用SPSS11.0软件进行方差分析,P<0.05为有显著性差异.2结果2.1心脏IRI时NOS活性的变化单纯缺血1h，心脏NOS活性与对照组相比无明显变化.心脏恢复血供再灌注0.5h后cNOS活性即开始升高,以2～6h最高,与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01)；但12h后却迅速下降,3d时活性最低与对照组相比,差异有显著性意义(P<0.01),以后逐日恢复,21d时心恢复正常.iNOS活性在[1][2]对照组心脏表达微弱,再灌注2h后逐渐升高,12h~3d活性达高峰,与对照组相比差异有显著性意义(P<0.01),以后逐渐下降,7d后基本恢复正常(Tab1).表1心脏IRI后cNOS和iNOS的活性变化（略）2.2Western印迹IRI组再灌注0.5h后心脏eNOS蛋白质表达即开始升高,2h达到高峰,12h后开始减少,3d时为最低,以后逐渐恢复,21d时恢复至对照组水平,与NOS活性变化相一致.对照组心脏检测出iNOS蛋白微量表达,但表达量远低于eNOS,IRI可诱导其表达,在12h后表达逐渐增强,3d时表达最强,随后逐渐减弱,21d时恢复对照组水平,也与iNOS的活性变化相一致(Fig1,Tab2).表2Western印迹法测定心脏IRI后eNOS和iNOS蛋白表达(略)2.3NOSmRNA的基因表达IRI组心脏再灌注早期(0.5～12h)即可诱导eNOSmRNA表达增强,2h达高峰,此后随着损伤程度加重,其表达迅速下降.3d低于对照组,以后逐步恢复,21d已相当对照组水平.在对照组心脏iNOSmRNA表达微弱,再灌注12h后开始增强,3d达高峰,21d恢复正常水平(Fig2,Tab3).以上eNOS和iNOSmRNA的消长变化与蛋白质的表达和酶活力的变化一致.表3大鼠心脏IRI后eNOS和iNOSmRNA半定量结果(略)3讨论eNOS来源的NO具有舒张心血管,抑制白细胞浸润和血小板的凝聚作用［5］，从而对心脏可能起到保护作用.Song等［6］的研究表明,在早期eNOS的过量表达对小鼠骨骼肌的IRI具有保护作用,随着损伤过程的进展,心脏结构和功能的损害不断加重,eNOS表达也相应迅速下降.这可能由于大量心肌细胞坏死和凋亡,导致eNOS的合成减少有关.eNOS的表达随着心脏损伤修复和心功能的恢复逐步恢复.NO在心肌再灌注损伤中加重心肌损害.缺血再灌注情况下,多种细胞因子上调巨噬细胞等内的iNOS的mRNA表达,立即产生大量的iNOS和NO.过量的NO与氧迅速反应生成大量的氧自由基如过氧亚硝酸阴离子(ONOO),后者可进一步反应生成HO-,NO2,NO3-等,其结果是引起和加重心肌缺血再灌注损伤［7］.我们发现，单纯缺血1h对心脏NOS活性无明显影响,再灌注30min后NOS活性即开始升高,2～6h到达高峰,持续到6h，此后迅速下降,24h降低到正常以下,21d时恢复至正常水平.RTPCR分析发现eNOS及iNOSmRNA的变化与其蛋白变化相一致.可见在IRI中,早期eNOS的高表达可能参与了早期心血流的调节,对抑制心血管痉挛、减少炎性细胞的浸润有关；iNOS参与介导了心脏IRI的炎症损伤.可以设想,在器官保存过程中或移植后早期使用iNOS的抑制剂,将会减少急性心肌坏死和凋亡以及急性排斥反应的发生,对IRI起到保护作用,促进心功能的恢复，为临床提供科学的理论依据.【参考文献】［1］张荣庆，徐凯，程何祥，等.卡维地洛对缺氧心肌细胞NO生成的影响［J］.第四军医大学学报，2002；23（22）：2071-2073.ZhangRQ,XuK,ChengHX,etal.Effectsofcarvedilolonnitricoxideproductionbymyocardialcellsduringanoxia［J］.JFourthMilMedUniv,2002；23（22）：2071-2073.［2］许春梅，董卫国，余保平，等.低氧诱导因子1α及诱导型一氧化氮合酶在炎症性肠病中的表达［J］.第四军医大学学报，2004；25（17）：1558-1561.XuCM,DongWG,YuBP,etal.Expressionofhypoxiainduciblefactor1alpha(HIF1α)andinduciblenitricoxidesynthase(iNOS)genesininflammatoryboweldisease［J］.JFourthMilMedUniv,2004；25（17）：1558-1561.［3］SuzukiM,SasakiN,MikiT,etal.RoleofsarcolemmalK(ATP)channelsincardioprotectionagainstischemia/reperfusioninjuryinmice［J］.JClinInvest,2002;109(4):509-516.［4］CheungF,SiowYL,ChenWZ,etal.InhibitoryeffectofGinkgobllobaextractontheexpressionofinduciblenitricoxidesynthaseinendothelialcells［J］.BiochemPharmacol,1999;58(10):1665-1673.［5］OzakiM,KawashimaS,HiraseT,etal.Overexpressionofendothelialnitricoxidesynthaseinendothelialcellsisprotectiveagainstischemiareperfusioninjuryinmouseskeletalmuscle［J］.AmJPathol,2002;160(4):1335-1344.［6］SongW,LuXR,FengQP.Tumornecrosisfactorαinducesapoptosisviainduciblenitricoxidesynthaseinneonatalmousecardiomyocytes［J］.CardiovascRes,2000;45(3):595-602.［7］项红军,赵佐庆,李纪鹏,等.大鼠小肠缺血再灌注后血中NO,SOD浓度及肺中Bax,Bcl2表达的改变［J］.第四军医大学学报，2002；23（21）：1974-1977