聚合物合金法制及性能
时间:2022-12-16 11:17:54
导语:聚合物合金法制及性能一文来源于网友上传,不代表本站观点,若需要原创文章可咨询客服老师,欢迎参考。
本文作者:刘华蔚温伟生孙华燕郑爱萍胡敏陈丽洁工作单位:解放军总医院口腔医学研究所
传统复乳法及聚合物合金法制备NGF缓释微球:(1)传统复乳法:采用复乳-溶剂挥发法(W/O/W)制备缓释微球,300μg的NGF和10mg牛血清白蛋白(BSA)溶于100μl的去离子水中得内水相(W1);PL-GA300mg溶于2ml的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液中形成油相(O),外水相为2%聚乙烯醇溶液10ml(W2)。将W1倒入O中,冰浴超声处理30s得到初乳(W1/O),将初乳倒入W2中,冰浴下高速匀浆30s,得到(W1/O/W2)复乳。将复乳倒入400ml10%的去离子水氯化钠溶液中,室温下磁力搅拌机(上海雷磁),1700r/min搅拌2h,前30min冰浴,后1.5h常温下搅拌,再800r/min搅拌2h挥发残余有机溶剂,收集微球,去离子水洗涤3次,真空冻干,得微球205.8mg,置于4℃保存。(2)聚合物合金法:采用乳化-溶剂挥发法(S/O/W)与聚合物合金法结合制备微球,分为两步。①NGF微粉化。经纯化的NGF溶液300μg,与牛血清白蛋白溶液0.5ml(含BSA10mg)混合后进行冻干处理,预冻温度-50℃,降温速度20℃/min,冻干条件(-20℃,3h;20℃,12h)。混合物冻干后得到均匀分散在BSA基质中的NGF药粉(S)。②NGF微囊化。PLA/PLGA(PLA∶PLGA=1∶3)300mg置于试管内,加入所制NGF冻干粉,加入2ml的CH2Cl2使聚合物溶解形成油相(O)。水相为2%聚乙烯醇溶液10ml(W)。将W加入O中,高速匀浆30s,形成S/O/W乳液,复乳倒入400ml10%的去离子水氯化钠溶液中,室温下磁力搅拌,方法同上,得微球256.7mg,置于4℃保存。2.微球形态及粒径的检测:取少量NGF-PLGA缓释微球放置于贴有双面胶的金属板上,喷金制成扫描电镜标本,扫描电镜下观察其外形。取少量NGF缓释微球溶解于去离子水,在光学显微镜下用测微尺测定200个微球的粒径,每隔5μm粒径为一单元,分别计数每一单元的微球数。以微球个数的百分数为纵坐标(%)、粒径大小为横坐标(μm),绘制微球粒径分布的直方图,测定微球的平均直径及粒径分布。3.微球包封率的测定:(1)建立标准曲线将NGF-ELISA检测试剂盒中的标准品稀释为10、20、40、80、160、320pg/ml的NGF溶液,以不含NGF的空白微球降解液作为空白对照,将酶标仪吸光度调零,绘制标准曲线。(2)萃取法提取微球中的NGF:分别取10mgNGF缓释微球溶于0.5ml的乙酸乙酯中,然后加入2ml的去离子水,在振荡器上充分混匀,萃取乙酸乙酯中的NGF,静置,分取水层,重复3次。合并三次提取液,混匀。(3)微球萃取率的测定:取10mg不含NGF的微球和标准品NGF1μg溶于0.5ml的乙酸乙酯中,然后加入2ml的去离子水,在振荡器上充分混匀,萃取乙酸乙酯中的NGF,静置,分取水层,重复3次,合并三次提取液,混匀。用ELISA法在450nm波长下测定所得溶液的吸光度值,计算NGF含量,算得萃取率。(4)微球包封率的测定:将步骤(2)中萃取液稀释,用ELISA法(检测范围10~400ng/L)在450nm波长下测定所得NGF溶液的吸光度,以空白微球降解液作为空白对照。计算微球中NGF的含量,严格按照说明书操作。微球包封率按以下公式计算:微球中测定的NGF量=微球质量×(4)中测得微球中NGF浓度;微球中理论NGF量=投入的NGF的质量;微球包封率(%)=微球中测定的NGF量/微球中理论NGF量×100%。4.微球的体外释放:准确称取两种微球各3份,50mg微球分别溶于5ml磷酸盐缓冲液(PBS)中(pH7.4),37℃震荡温浴,分别在6h、12h、1d、4d、7d、14d、21d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、90d取出全部稀释液(2000r/min,2min),并补充相应的缓冲液,取出液-20℃保存,每个样品按1∶100和1∶1000稀释,每个浓度的稀释样品做双复孔,ELISA测定NGF浓度,计算每次释药量及累积释药率,并绘制释放曲线。5.微球中NGF活性的检测[6-7]:分别于1d、7d、30d、60d、90d时取微球释放液,通过对PC12细胞突起的计数来检测NGF的活性。将生长良好的PC12细胞接种于预先经鼠尾胶原包被的6孔培养板中,接种密度为2×104/cm2,每孔加入2ml含体积分数为10%马血清和体积分数为5%胎牛血清的DMEM培养基,在37℃、体积分数为5%CO2及饱和湿度条件下培养3h后随机分组,分为NGF组(阳性对照组)、不含NGF的牛血清白蛋白微球组(阴性对照组)、传统复乳法制备的NGF微球组(复乳法组)、合金法制备的NGF微球组(合金法组)。分别以50ng/ml的NGF、牛血清白蛋白微球的缓释液、传统复乳法所制备NGF微球的缓释液、合金法制备的NGF微球缓释液各2ml替换原细胞培养液,继续培养48h后,在倒置显微镜上用随机选取视野,计数100个细胞,并计算每组中长出轴突的细胞(阳性细胞)比例,阳性细胞比例(%)=阳性细胞数/计数细胞数,每组实验重复3次。
数据均以均数±标准差(x珋±s)表示,采用CHISS统计软件对数据进行均数t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果一、NGF缓释微球表观形态观察结果光镜、扫描电镜结果显示两种方法制备的NGF微球均具有光滑的表面且形态规整均匀,近似圆形,大小相近,体外PBS中释放90d后其表面存在大量孔隙,部分降解,见图1,2。二、微球粒径测定结果两种方法制备的微球粒径分布经CHISS软件正态性检验均符合正态分布,传统复乳法组平均粒径(24.68μm),合金法组平均粒径(22.47μm),传统复乳法组制备微球粒径较合金法略小,见图3。三、微球产率、包封率测定结果实验测得标准曲线为y=0.0063x+0.0015,萃取法回收率为(67.6±4.6)%。微球产率=制得微球质量/(BSA质量+NGF+共聚物质量),传统复乳法制备的微球产率为66.3%,包封率为(23.7±2.1)%;合金法组制备微球产率为82.7%。包封率为(49.5±3.4)%,可见合金法组制备微球产率、包封率均明显高于传统复乳法。四、微球的体外释放结果传统复乳法与合金法在第90天时,累积释放率分别为达到(78.6±2.0)%、(91.2±2.2)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。传统复乳法存在着显著突释效应,24h时释放率为(22.3±1.6)%,合金法突释效应较小,24h时释放率为(8.8±0.7)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。微球体外释放曲线见图4。五、微球中NGF活性的检测结果第1、7、30、60、90天的微球缓释液被用来作为体外NGF活性的检测。PC12细胞能在NGF的刺激下发出突起分化为神经元样细胞,见图5。因此可通过计算阳性PC12细胞的比例来考察NGF的活性[8]。见表2。由表2可知,阳性对照、复乳法、合金法组在1d、7d、30d、60d时组间差异无统计学意义;90d时复乳法与合金法组差异有统计学意义(P<0.05),阴性对照组与复乳法组差异无统计学意义。说明60d时复乳法组、合金法组均可分泌活性的NGF,90d时合金法组仍可分泌活性的NGF,复乳法组无活性NGF分泌。讨论随着生物学等相关学科的发展,蛋白质类药物的临床应用日益广泛,目前的主要应用剂型是冻干粉针剂,由于蛋白质的半衰期较短,注射频繁,令很多患者难以接受。缓控释剂型的发展为蛋白质类药物提供了剂型改进方向,缓释微球制剂可较长时间持续释放药物,克服了蛋白质类药物半衰期短,频繁给药的缺点。近年来,微球制剂的研究发展迅速,它是利用高分子材料包封药物形成球状实体,通过高分子材料的缓慢降解而逐步释放药物,从而达到缓释的目的。溶剂挥发法是最常用的蛋白质类微球制备方法,对实验设备要求较低,成球性较好,尤其适合少量微球的制备,成为我们微球制备的首选方法。但其制备过程中有诸多因素对微球的相关性状有着显著的影响,特别是超声及机械搅拌过程中产生的剪切力会严重影响生物大分子药物的生物活性,从而使得多肽蛋白质类药物极易在微球内部聚集形成不溶性沉淀而影响药物的释放[9]。本实验采用传统复乳法及聚合物合金法制备微球。从聚合物专业角度进行定义,“聚合物合金技术”(polymer-alloystechnique)系指一种聚合物相分散在另一种聚合物相中形成固态混合物的技术。研究发现,在特定条件下,两种聚合物在有机溶剂中能自动分离成两种溶液。以PLA和PLGA为例,它们在CH2Cl2中可生成富含PLA相和富含PLGA相。如PLGA与PLA重量比介于1∶2~1∶4时,会产生分散相中富含PLGA,连续相中富含PLA的现象。如将药物与PLGA混合,则乳剂中的分散相往往由药物和PLGA组成,连续相仍富含PLA。上述两种聚合物经溶剂挥发法制得的微球,药物基本都在微球的中心部位,外周囊壁主要成分为PLA。Morita等[10]利用聚合物合金法制备牛重组超氧化物歧化酶(bSOD)微球,采用聚乙二醇作为蛋白质保护剂,结果当PLGA和PLA(重量比1∶4)时,制成微球包封率为87.6%,以接近0级的速率控释药物达4周之久,突释作用仅1.4%,生物活性保存率高达113.1%。药物的体外释放一般符合三段模式:爆发释放,低速率的释放,最后是较高速率的释放。药物从微囊中释放出来是药物扩散与微囊降解的结合,在聚合物降解过程的不同阶段,上述两种机制分别占主导作用。微囊表面的药物和尚未包于囊内的药物晶体释放形成突释效应,众多学者尝试改进制作工艺以降低药物突释率[11]。
本实验采用传统复乳法及聚合物合金法制备的微球均未出现上述的三段模式,所以无双峰现象出现,只表现为最初的突释和继之而来的相对稳定的释放。在体外释放的实验中,传统复乳法及聚合物合金法24h药物的释放率分别为22.3%和8.8%,均存在药物突释现象,但聚合物合金法药物突释效应明显较传统复乳法低。90d时传统复乳法和聚合物合金法累计释放率分别为78.6%、91.2%,聚合物合金法释药更完全。对于蛋白质药物而言,药物的载药量、包封率并不等于具有活性的药物的量,主要由于微囊制备过程中蛋白质分子会遭到不同程度的破坏,破坏程度与制备条件及制备工艺有关,我们制备蛋白质药物微囊的目的就是最大限度地保护药物的活性,所以了解微囊内药物的生物学活性也是必要的。根据实验测定需要,我们采用了PC12细胞方法进行活性测定,NGF可使PC12细胞停止分裂,长出突起,转化成神经元样细胞。本组实验通过测量阳性PC12细胞比例,传统法组在90d时与阴性对照组接近,证明已无活性NGF释出,而合金法组可一直释放活性NGF达90d。本实验采用聚合物合金法制备NGF缓释微球,结果微球大小符合实验要求,较传统复乳法所制备的NGF缓释微球突释效应较少,包封率更高,可一直释放活性NGF达90d。聚合物合金法制备NGF缓释微球对减少突释、提高包封率、保留NGF活性均有重要意义,值得深入研究,具有广泛的应用前景。
- 上一篇:地区经济建设的原则与趋势
- 下一篇:水库工程建设的经济强化