神经干细胞范文10篇

【摘要】目的探讨2型重组腺相关病毒（recombinantadeno-associatedvirus2,rAAV-2）载体能否有效地转染NSCs。方法采用含有增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP）报告基因的rAAV-2（rAAV-2/EGFP），以感染复数（multiplicityofinfection,MOI）分别为1×104、1×105、1×106转染体外分离、培养的大鼠胎鼠NSCs，在荧光显微镜下观察EGFP的表达；同时检测子代细胞的活力、增殖倍数、分化情况来评估对其存活、增殖、分化能力的影响；当EGFP表达稳定后，流式细胞仪检测rAAV-2/EGFP对NSCs的转染效率。结果转染10天后各转染组便可观察到NSCs克隆球发出绿色荧光，起始荧光强度不一，随MOI值的增大而增强；各转染组荧光强度随时间的延长而逐渐增强，至转染21天后达高峰并维持，此时流式细胞仪检测rAAV-2对NSCs的转染效率：MOI为1×104、1×105、1×106时转染率分别为25.68%、50.60%、54.72%,荧光指数（FI）分别为4.08、12.72、14.06；转染组和未转染组细胞培养7、14、21天时其细胞活力、增殖倍数、分化差异均无显著性。结论rAAV-2能有效地转染NSCs，所介导的目的基因能高效表达。

【关键词】神经干细胞；2型腺相关病毒；转染；感染复数；绿色荧光蛋白；荧光指数；细胞活力

绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因是一种新的报告基因，由于其表达产物GFP可被直接激发产生荧光，不需要任何底物或辅助因子，较传统的标记基因如β2-半乳糖苷酶基因、荧光素酶基因等更具有明显的优越性；在GFP的基础上进行F64L和S65T的突变从而形成增强型绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP），EGFP增强了GFP的荧光性能，更容易观察、检测［1］。2型腺相关病毒具有与人类疾病无相关性、宿主范围广、可整合入细胞染色体DNA介导外源基因长期表达等优点,是较理想的基因载体［2］。随着神经干细胞（neuralstemcells，NSCs）的分离、培养、纯化及生物学功能研究深入［3～5］，寻找NSCs基因修饰载体及标记分子，已成为研究NSCs在体内、外分化调控和细胞工程基因治疗中枢系统疾病的研究热点。运用基因修饰神经干细胞治疗中枢系统疾病具有细胞修复和转基因治疗的双重优势。理想的基因转移载体是基因修饰的关键。

1材料与方法

1.1病毒载体rAAV-2/EGFP购于863生物领域病毒基因载体研究开发基地、北京本元正阳基因技术股份有限公司，滴度为5×1011v.g/ml。

1.2神经干细胞分离、培养、鉴定［6］按参考文献进行，体外分离胚胎大鼠大脑额叶皮质、悬浮培养，经Nestine鉴定为神经干细胞（见图1），作为实验细胞株。

摘要：干细胞是上世纪生物医学领域的重大发现，是当前生命科学的研究热点，为世人瞩目。神经干细胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有发展前景的重要分支，它具备未分化特性、增殖和自我更新以及分化产生中枢神经系统主要类型细胞的能力。Mckay将NSC的概念概括为：能无限增殖，具有分化为神绍元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。

关键词：神经干细胞临床应用

1NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

2临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

摘要：干细胞是上世纪生物医学领域的重大发现，是当前生命科学的研究热点，为世人瞩目。神经干细胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有发展前景的重要分支，它具备未分化特性、增殖和自我更新以及分化产生中枢神经系统主要类型细胞的能力。Mckay将NSC的概念概括为：能无限增殖，具有分化为神绍元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。

关键词：神经干细胞临床应用

一、NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

二、临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

摘要：干细胞是上世纪生物医学领域的重大发现，是当前生命科学的研究热点，为世人瞩目。神经干细胞(NeuralStemCell，NSC)是其中最有发展前景的重要分支，它具备未分化特性、增殖和自我更新以及分化产生中枢神经系统主要类型细胞的能力。Mckay将NSC的概念概括为：能无限增殖，具有分化为神绍元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并提供大量脑组织细胞的细胞。

关键词：神经干细胞临床应用

1NSC的来源

据来源部位的不同，可分为胚胎来源及成体来源，分别称为胚胎干细胞(EmbryonicStemCell，ESC)及成体干细胞(AdultStemCell，ASC)。ESC来源于胚胎胚泡阶段，即胚胎发育过程中植入于宫壁内之前阶段。ASC来自于成体组织，能在很长一段时间内准确复制自己，进行自我更新，能生长成成体的细胞类型，具有一定形态特征和指定的功能。由于ESC研究与应用面临伦理、宗教、法律、免疫排斥和潜在致瘤性等问题，在实际操作上仍有一定困难。而ASC“可塑性”的发现及相关研究在不同程度上避免了这些问题，是细胞替代治疗和基因组织工程研究的热点之一。

2临床应用

对于神经系统退行性病变及严重损伤，NSC移植有可能替代衰老、变性和死亡的神经细胞，重建神经网络，恢复受损的脑功能。这种治疗方法具有以下的特点：a.NSC在脑中能根据周围环境的诱导而分化成相应的细胞类型，其形态功能与附近原有细胞非常类似。b.免疫源性弱，免疫反应小。c.低毒性，致瘤性弱。

1诊断

对于该病的诊断，由病史、症状、体征等临床特点，提供了第一手重要的诊断依据。目前更为突出的是影像学检查手段的完善、发展，使早期、超早期诊断成为可能。

1.1CT目前，急性脑卒中患者的头颅CT平扫检查是常规影像检查，因其能迅速而敏感地发现脑出血的存在，进行第一步最重要的鉴别诊断。先进的CT设备可在卒中发生数小时内提供诊断信息，最常见的CT改变为大脑中动脉闭塞时的大脑中动脉高密度征，其他的早期缺血改变包括豆状核密度下降、岛带消失、半侧脑沟消失和半侧脑实质密度下降，后两种CT异常提示了梗死面积大、预后不良及进行溶栓治疗的危险性增加［1～3］。近年，随着螺旋CT的发展，CT血管成像及灌注成像为脑梗死的早期诊断提供了更多的帮助。

1.1.1CT血管成像（CTA）CTA为通过静注碘化造影剂后，经螺旋CT扫描进行血管重建成像，其成像质量正在接近常规血管造影。这项技术可以检测颅外颈动脉狭窄程度和斑块形态，还可以可靠地检测颅内血管狭窄、栓子和中等大小或一些更大的动脉瘤。因可较直观地看到脑的血液循环情况，故对脑梗死的早期诊断有重要意义。

1.1.2CT灌注成像CT灌注成像技术，主要通过团注碘对比剂显示毛细血管内对比剂通过时引起的脑组织密度变化状态。在急性脑缺血早期，特别是发病2～4h的超早期，常规CT平扫改变轻微或无异常改变，一旦出现低密度病灶，就被认为是缺血性梗死形成，代表形态结构的破坏。而灌注成像能早期发现灌注异常区，对估计侧支循环和患者的预后极为重要［4，5］。近年来，多层CT灌注成像的时间和空间分辨率高，可快速、准确、无创和三维地评价脑循环内血流动力学变化［4］。

1.2核磁共振（MR）磁共振成像（MRI）是目前最重要的辅助检查之一，在采用T1加权和T2加权成像上，早期在6h后就可出现异常，表现为长T1和长T2信号，T1为低信号，T2为高信号。更为早期的诊断方法为弥散加权像（DWI）和灌注成像（PWI），可以自症状出现数分钟发现异常，最多在发病后1h左右即可出现。

【关键词】Wnt

ExpressionandbiologicalactivityofmouseWnt3ageneinNIH3T3cells

【Abstract】AIM:ToexpressrecombinantmouseWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.METHODS:Therecombinanteukaryoticexpressionplasmid,pSecTag2/HygroBWnt3a,wastransfectedintoNIH3T3cellsbyliposome,thentheexpressedproteinwasdetectedbyWesternBlot.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellswereevaluated.RESULTS:TheWnt3asignalproteinwasstablyexpressedinWnt3a/NIH3T3cells.ThesaturationdensityandthecapabilityofsuppressingapoptosisinWnt3a/NIH3T3cellsweremarkedlyincreased.CONCLOUSION:WesuccessfullyconstructtherecombinantWnt3asignalproteinwithbiologicalactivity.

【Keywords】Wnt3a;eukaryoticexpression;contactinhibition;apoptosis

【摘要】目的：表达具备生物活性的重组小鼠Wnt3a信号蛋白.方法：应用脂质体转染试剂将重组真核表达载体pSecTag2/HygroBWnt3a转染并筛选稳定表达的NIH3T3细胞，WesternBlot鉴定重组Wnt3a蛋白的表达，并对Wnt3a/NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力给予检测.结果：Wnt3a信号蛋白在Wnt3a/NIH3T3细胞中获得稳定表达，Wnt3a信号蛋白能够明显提高NIH3T3细胞的融合密度及抗凋亡能力.结论：在NIH3T3细胞中表达的重组Wnt3a信号蛋白具备生物活性.

【关键词】Wnt3a；真核表达；接触抑制；细胞凋亡

干细胞是一类具有自我复制能力和一定分化潜能的细胞，在一定条件下，它可以分化成多种具有不同功能的细胞。根据干细胞所处的发育阶段及其功能学特性，可将其进一步分为胚胎干细胞和成体干细胞。因此，干细胞在组织工程、再生医学中有着重要的应用价值。目前，牙齿缺损等牙源性疾病在中老年人中发病率较高。牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，DPSC)是牙髓组织中的一类成体干细胞，具有一定的分化潜能和增殖能力，在牙齿再生、牙髓修复方面有着重要的应用价值，特别是随着相关组织工程技术的发展，DPSC具备了成为一种新型种子细胞的潜能〔1〕。

1DPSC的定义和基本生物学性质

成牙本质细胞是一种终末细胞，不具备进一步分化的能力，因此，一般认为成牙本质细胞在遭受损伤后，牙髓内的某些具有分化功能的前体细胞可进一步分化为成牙本质细胞，并分泌相关细胞基质，修复受损组织，这种前体细胞即为DPSC。DPSC具有较强的增殖能力和较高的分化潜能，正是这两种生物学性质，决定了DPSC在牙源组织修复和骨性修复方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞命名为DPSC，研究人员应用酶消化法对成人第三磨牙的牙髓细胞进行培养，并与骨髓间充质干细胞进行比较，结果显示:这两种细胞具有极为相似的免疫学特性，并且，该研究进一步证实DP-SC经体外诱导后，可形成高密度的钙化小结，将DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架复合后移植到小鼠背侧皮下，经过一段时间后，能观察到类似于牙本质-牙髓复合体样的结构。

2DPSC的多向分化潜能

作为一种成体干细胞，DPSC具备多向分化的潜能，这种潜能不仅仅局限在骨性分化方面，研究人员在成脂分化、神经分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生医学研究领域有着重要的指导意义。

2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是关于DPSC定向分化研究较早的一项内容，近些年来，又有了进一步的发展。Mori等〔4〕采用成骨分化培养基进行对DPSC的骨性诱导分化，结果发现，某些典型成骨细胞基因，如:碱性磷酸酶、I型胶原、骨桥蛋白等均大量表达;应用微阵列及RT-PCR技术进一步研究发现，在成骨分化过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受体相关基因(NURR1)均发生表达上调现象，这一机制在成骨分化过程中有着重要的意义。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨诱导过程中，加入血管内皮生长因子，结果显示:这种方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促进了成骨分化的进程。

[论文关键词]牙齿组织工程

[论文摘要]牙齿组织工程学是指利用体外和体内培养的手段从单细胞获得整个牙齿的组织工程手段。其关键之处是获得具有较强生长和分化能力的种子细胞、优选较为适宜的支架材料，以及构建有较强再生能力的细胞-支架复合体。

近年来，随着发育生物学、分子生物学、细胞生物学、干细胞以及生物材料学等领域的新进展组织工程学也取得了长足的发展。所谓的牙齿组织工程学是运用生命科学和工程学的方法、原理和技术，在体外构建有生物活性的组织，植入体内，修复缺损组织，重建功能的一门新兴学科。众所周知，牙齿的发生发育经历有初始发生期、蕾状期、帽状期、钟状期、分化期、分泌期以及牙根的形成等阶段，由上皮和间充质的相互作用完成。即便使用单细胞进行培养，牙齿结构的发生和发育也要经历这些必然阶段。这为牙齿组织工程学的研究奠定了基础。然而组织工程学并不是一项简单的工程，需要各个方面的工作相互协调，相互配合。

一、牙齿组织工程与干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。其可在体外分离、扩增和冷冻保存，在一定的条件下可被诱导分化为不同的细胞或组织。根据发生学来源的不同可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。

随着生物技术及组织工程学的发展，可通过干细胞定向分化技术，培育出特定的组织或器官。其原理是人为干预干细胞的分化方向，使这些细胞按照我们的需要分化成单一的组织或器官。组织工程牙齿的研究常以干细胞、信号分子及生物支架为基础[1-2]，在体外通过组织重组技术及器官培养等方法研究牙齿的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同来源的间充质干细胞（胚胎干细胞和神经干细胞）及成人骨髓干细胞重组后再植入小鼠体内可获得牙齿结构，Young等[4]也通过组织工程的方法制备了齿/骨杂交体，即用猪第三磨牙的牙蕾细胞种植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的视网膜上生长4周后即得牙移植块；同样从猪的骨髓中分离诱导成骨细胞，并种植到PLGA支架上，在透氧的生物反应器系统中培养10天后即得骨移植块；将以上的牙移植块和骨移植块组合在一起重新植入大鼠的视网膜上生长8周后，经过组织学和免疫组化的方法分析发现齿/骨杂交体不仅能产生牙本质、修复牙本质及釉质组织，还能表达骨钙蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型胶原。Kramer等[5]将骨髓间充质干细胞与牙周韧带细胞共培养，发现共培养的骨髓间充质干细胞骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达量明显增加，而骨涎蛋白的表达量明显降低，体现了共培养的骨髓间充质干细胞能够获得牙周韧带细胞的特性，可用于进行牙周组织的修复。这在一定程度上说明了，利用组织工程的方法在体外再生牙齿是可能的[6-7]。且在一定条件下不仅牙髓干细胞能够再生牙齿结构，其他来源的间充质干细胞也能够产生类似牙齿硬组织的结构。

[论文关键词]牙齿组织工程

[论文摘要]牙齿组织工程学是指利用体外和体内培养的手段从单细胞获得整个牙齿的组织工程手段。其关键之处是获得具有较强生长和分化能力的种子细胞、优选较为适宜的支架材料，以及构建有较强再生能力的细胞-支架复合体。

近年来，随着发育生物学、分子生物学、细胞生物学、干细胞以及生物材料学等领域的新进展组织工程学也取得了长足的发展。所谓的牙齿组织工程学是运用生命科学和工程学的方法、原理和技术，在体外构建有生物活性的组织，植入体内，修复缺损组织，重建功能的一门新兴学科。众所周知，牙齿的发生发育经历有初始发生期、蕾状期、帽状期、钟状期、分化期、分泌期以及牙根的形成等阶段，由上皮和间充质的相互作用完成。即便使用单细胞进行培养，牙齿结构的发生和发育也要经历这些必然阶段。这为牙齿组织工程学的研究奠定了基础。然而组织工程学并不是一项简单的工程，需要各个方面的工作相互协调，相互配合。

一、牙齿组织工程与干细胞

干细胞是一类具有自我更新能力的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。其可在体外分离、扩增和冷冻保存，在一定的条件下可被诱导分化为不同的细胞或组织。根据发生学来源的不同可将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。

随着生物技术及组织工程学的发展，可通过干细胞定向分化技术，培育出特定的组织或器官。其原理是人为干预干细胞的分化方向，使这些细胞按照我们的需要分化成单一的组织或器官。组织工程牙齿的研究常以干细胞、信号分子及生物支架为基础[1-2]，在体外通过组织重组技术及器官培养等方法研究牙齿的再生。Sharpe等[3]利用小鼠胚胎牙上皮和不同来源的间充质干细胞（胚胎干细胞和神经干细胞）及成人骨髓干细胞重组后再植入小鼠体内可获得牙齿结构，Young等[4]也通过组织工程的方法制备了齿/骨杂交体，即用猪第三磨牙的牙蕾细胞种植到生物可降解的支架PGA或PLGA上，在成年大鼠的视网膜上生长4周后即得牙移植块；同样从猪的骨髓中分离诱导成骨细胞，并种植到PLGA支架上，在透氧的生物反应器系统中培养10天后即得骨移植块；将以上的牙移植块和骨移植块组合在一起重新植入大鼠的视网膜上生长8周后，经过组织学和免疫组化的方法分析发现齿/骨杂交体不仅能产生牙本质、修复牙本质及釉质组织，还能表达骨钙蛋白、骨涎蛋白以及Ⅲ型胶原。Kramer等[5]将骨髓间充质干细胞与牙周韧带细胞共培养，发现共培养的骨髓间充质干细胞骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达量明显增加，而骨涎蛋白的表达量明显降低，体现了共培养的骨髓间充质干细胞能够获得牙周韧带细胞的特性，可用于进行牙周组织的修复。这在一定程度上说明了，利用组织工程的方法在体外再生牙齿是可能的[6-7]。且在一定条件下不仅牙髓干细胞能够再生牙齿结构，其他来源的间充质干细胞也能够产生类似牙齿硬组织的结构。

【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠

氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。

1材料与方法

1.1新生大鼠海马神经元的分离和培养

技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，D-Hank''''s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量0.25%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。

1.2大鼠海马神经元的鉴定