杆菌范文10篇

【关键词】结核分枝杆菌ImmuneresponsesandprotectiveefficacyinducedinmicebyMycobacteriumtuberculosisMPT64ESAT6fusionprotein【Abstract】AIM:ToevaluatehumoralandcellmediatedimmuneresponsesbyMPT64andESAT6fusionproteinsandtotestprotectiveefficacyagainstMycobacteriumtuberculosis(MTB)challenge.METHODS:BALB/cmicewereimmunized3timesat2weekintervalsubcutaneouslyonthebackwithfusionproteinMPT64ESAT6.Inthespleenlymphocytesofimmunizedmicestimulationindex(SI)wasmeasuredbyMTTmethodandthelevelofsecretedIFNγwasdetectedbyELISA.SomeofvaccinatedBALB/cmicebyfusionproteinswereintravenouslyinfectedwith1×105CFUMTBstrainH37Rv.Fourweekslater，bacterialloadinspleenswasdetermined.RESULTS:ThetiterofseraspecificantibodyinBALB/cmiceimmunizedwithfusionexpressionproteinMPT64ESAT6was1∶1500.TheSIoflymphocytesinfusionproteinimmunizedgroupwas2.23,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup(0.88).TheIFNγlevelinculturesupernatantofspleenlymphocytesfromthemiceimmunizedwithfusionproteinswere(4.28±0.27)μg/L,significantlyhigherthanthatofsalineimmunizedgroup［(0.48±0.17)μg/L,P<0.05］,butlowerthanthatofBacillusCalmetteGuerin(BCG)immunizedgroup［(5.18±0.31)μg/L］.Comparedwithsalineimmunizedmice（bacterialloadwas6.45±0.17）,dramaticreductionswereobservedforMTBreplicationinthespleenfromBALB/cmiceimmunizedwithfusionproteins(bacterialoadwas5.04±0.11)followingasubsequentchallenge,buttheprotectiveefficacyinmiceimmunizedwithMPT64ESAT6wasnotasgoodasthatofBCGimmunizedgroup(bacterialloadwas4.38±0.22).CONCLUSION:MPT64andESAT6fusionproteinscouldbeusedasanovelcomponentofthenewTBvaccine.【Keywords】Mycobacteriumtuberculosis；vaccine；MPT64；ESAT6；fusionexpression【摘要】目的：测定MPT64与ESAT6融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力.方法：将MPT64与ESAT6的融合蛋白皮下免疫小鼠3次，每次间隔2wk，ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度.最后一次免疫完成后4wk，分离部分免疫小鼠脾淋巴细胞，MTT法检测淋巴细胞刺激指数，ELISA检测悬液中IFNγ水平.另一部分免疫的BALB/c小鼠经尾静脉感染MTB毒株H37Rv，4wk后计数脾脏细菌负荷数.结果：MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠血清特异性抗体滴度1∶1500，免疫小鼠后淋巴细胞刺激增殖指数为2.23，而生理盐水免疫组只有0.88；脾淋巴细胞悬液中诱发的IFNγ为（4.28±0.27）μg/L，显著高于生理盐水免疫组［（0.48±0.17）μg/L，P<0.05］，但不及BCG免疫组［（5.18±0.31）μg/L］.与生理盐水免疫组（细菌负荷6.45±0.17）相比较，融合蛋白免疫的小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用，细菌负荷为5.04±0.11，但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷减少甚微（细菌负荷4.38±0.22）.结论：MPT64与ESAT6融合蛋白可作为新型结核疫苗的候选组分.【关键词】结核分枝杆菌；疫苗；MPT64；ESAT6；融合表达0引言ESAT6（Mr6000的早期分泌蛋白）和MPT64是结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）中重要的保护性抗原,编码这两种蛋白的基因只存在于MTB毒株中而卡介苗（BacillusCalmetteGuerin,BCG）中缺失［1］，研究发现重组的MPT64和ESAT6蛋白免疫小鼠后均可有效抵抗MTB感染.本研究在成功获得MPT64与ESAT6融合蛋白的基础上［2］，研究该融合蛋白在小鼠体内诱导的免疫应答水平和对MTB毒株H37Rv攻击的保护力.1材料和方法1.1材料MTB毒株H37Rv由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠；卡介苗疫苗株由兰州生物制品研究所出品（国药准字SF20010035，批号20011201）；鼠IFNγ和ELISA检测试剂盒购自晶美公司；潮霉素（GIBCOBRL公司）.BCG培养增强剂（albumindextrosecatalaseADC）和RPMI1640培养基均购自GIBCO公司.7H9液体培养基购自美国Difco公司；改良罗氏培养基由本室自制，MTB的培养滤液蛋白(culturefiltrateproteins,CFP)由本室制备.羊抗鼠IgGHRP购自华美生物公司.6~8周龄BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供，饲养于第四军医大学动物中心感染实验室.1.2方法1.2.1MTB毒株H37Rv的培养和定量取罗氏培养基中保存的MTB毒株H37Rv接种到7H9培养基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），37℃振摇培养3wk，5000r/min离心10min，收集细菌，保存于-20℃备用.用7H9液体培养基系列稀释浓缩液，接种于罗氏培养基37℃培养2wk，计数浓缩液细菌的CFU.1.2.2BCG的培养和定量取BCG疫苗株接种到7H9液体培养基（含100g/LADC和0.5g/LTween80），相同方法培养、收集BCG，并计数细菌的菌落形成单位（colonyformingunits,CFU）.1.2.3融合蛋白的大量制备取MPT64pProEXHTESAT6阳性克隆［2］，活化后分别接种到1000mLLB培养液中，37℃振摇培养至对数生长期，IPTG诱导，集菌，先进行SDSPAGE，采用Invitrogen的NiNTA纯化试剂盒纯化目的蛋白，分光光度法测定蛋白浓度.1.2.4免疫动物实验随机分为3组，每组10只小鼠，一组用MPT64ESAT6融合蛋白免疫BALB/c小鼠；免疫剂量均为1mg/只，共免疫3次，第一次和第二次免疫加有不完全福氏佐剂，第三次单纯免疫融合蛋白，每次间隔2wk，免疫结束后，收集小鼠血清，用CFP作为抗原，ELISA测定免疫小鼠血清特异性抗体滴度,其余两组分别为BCG和生理盐水对照组.最后一次免疫结束后4wk，进行以下实验：每组取5只小鼠，用于测定淋巴细胞刺激指数(stimulationindex,SI)和IFNγ水平；其余5只用于毒株攻击实验.1.2.5脾脏淋巴细胞的分离与制备将免疫的小鼠断颈处死，无菌取脾脏，置于平皿内200目的钢网上，用注射器针芯研磨，并加入RPMI1640培养液冲洗.将上述细胞悬液转入2倍体积的淋巴细胞分离液，1000r/min离心20min.吸取中间单核细胞层，用RPIM1640液洗涤两次后计数.1.2.6特异性淋巴细胞增殖实验将分离的淋巴细胞浓度调整至5×108/L，在96孔板中用100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液培养，200μL/孔，同时实验组每孔加入25μLMTBCFP（25mg/L溶于PBS，本室制备），对照组不加CFP，调零孔不加脾细胞，37℃50mL/LCO2孵箱培养68h后，每孔加20μLMTT（5g/L，溶于PBS，pH7.2，过滤除菌），继续培养4h后弃上清，加DMSO150μL/孔，振荡10min，测定A490nm值.结果用刺激指数SI=实验组A值/对照组A值表示.1.2.7IFNγ的诱生及含量的测定5×109/L脾细胞在24孔板用含10mL/LFCS的RPMI1640完全培养液中培养，800μL/孔，同时加入MTBCFP100μL/孔，37℃50mL/LCO2孵箱培养72h，收集培养液，5000r/min离心5min，取上清，-20℃冻存备检.参照试剂盒说明（夹心ELISA法）测定各标本所含IFNγ浓度.1.2.8MTB毒株H37Rv的攻击实验最后一次免疫完成后4wk，用MTB毒株H37Rv经尾静脉感染小鼠，剂量为105CFU/只，4[1][2]wk后，断颈处死小鼠，脾脏匀浆，计数细菌CFU.统计学处理：实验数据以x±s表示,统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用LSDt检验,P<0.05有统计学意义.2结果2.1小鼠体内特异性抗体滴度MPT64ESAT6融合蛋白免疫小鼠三次后血清特异性抗体滴度平均值为1∶1500.2.2抗原特异性脾脏淋巴细胞增殖实验分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，在体外用CFP抗原刺激，测定了淋巴细胞的增殖反应，与生理盐水对照组（SI为0.88）相比较融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖明显，SI为2.23，BCG免疫组SI为3.58，高于融合蛋白免疫组.2.3脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平MPT64ESAT6免疫的小鼠的脾淋巴细胞悬液，体外用CFP刺激，其悬液IFNγ含量分别为（4.28±0.27）μg/L，与生理盐水对照组（0.48±0.17)μg/L相比较有明显增加（P<0.05），但不及BCG免疫组［（5.18±0.31）μg/L,P<0.05］（图1）.2.4免疫小鼠对MTB毒株攻击时的抵抗作用免疫完成后4wk，H37Rv经尾静脉感染BALB/c小鼠，4wk后计数脾脏细菌负荷数，与生理盐水免疫组（细菌负荷数6.45±0.17）相比较，融合蛋白MPT64ESAT6免疫的BALB/c小鼠，对攻击感染后抗MTB在脾脏中增殖有显著作用（细菌负荷数分别为5.04±0.11），但与BCG免疫组（细菌负荷数为4.38±0.22）相比较脾脏细菌负荷减少甚微.aP<0.05vs生理盐水.n=5.图1融合蛋白在小鼠脾脏淋巴细胞中诱生的IFNγ水平（略）3讨论卡介苗（BCG）是目前唯一的预防结核病疫苗，但其对成年人结核病的预防效果不稳定，保护力常发生变化（0~80%）［3］，因此，研制全面有效的新疫苗是控制结核病的重要途径.融合亚单位疫苗具有成分明确，使用安全，可减少纯化步骤等优点而受到国内外的重视.目前已知的保护性抗原有MTB早期分泌蛋白Ag85B复合物、ESAT6和MPT64［4］等，选择这几种抗原制备的亚单位疫苗可诱导强烈的特异性免疫应答，并不受先前接触分枝杆菌的影响.单个蛋白构成的亚单位疫苗产生的特异性体液和细胞免疫应答是针对每一组分抗原的，机体获得的免疫保护力有限，因此新型TB疫苗着重于融合多个免疫表位［5］.本研究中将纯化的MPT64与ESAT6融合蛋白，免疫小鼠，特异性抗体滴度可达到1∶1500，显著高于已报道文献［6］中抗体的滴度，融合蛋白免疫三次后，小鼠特异性淋巴细胞增殖指数显著升高，说明淋巴细胞被有效活化.IFNγ常被认为是抵抗MTB感染的一个关键性细胞因子，也是Th1型细胞免疫反应的重要指标，TB的保护性效应与分泌IFNγ的淋巴细胞的产生密切相关.融合蛋白MPT64ESAT6免疫小鼠诱生的IFNγ水平显著高于生理盐水对照组（P<0.05），提示这两种融合基因可能是TB疫苗中理想的候选基因.MTB毒株攻击实验中，与生理盐水组相比较，MPT64ESAT6免疫组使得细菌数由6.45±0.17降为5.04±0.11，有效控制了MTB的感染，但与BCG免疫组相比免疫保护力还是有一定差距.研究发现，单独使用结核杆菌短期培养液中分离纯化的分泌型蛋白免疫动物，只会产生很弱的免疫应答，亚单位疫苗必须配以适宜的佐剂多次接种才能达到效果［7］，在本研究中，采用不完全福氏佐剂具有很强的免疫调节作用，可刺激产生IL2，IFNγ和IL12，是本室较常用的一种免疫策略.MPT64ESAT6融合蛋白诱导的保护力有限，分析原因可能是因为保护性抗原种类不多，难以诱导产生广泛而全面的细胞免疫应答；同时蛋白质在体内的滞留时间短并且其产生的免疫应答的持续时间也较短，需选择合适的剂量［8］，多次免疫才能达到有效的保护水平.【参考文献】［1］KamathAT,FengCG,MacdonaldM,etal.DifferentialprotectiveefficacyofDNAvaccinesexpressingsecretedproteinsofMycobacteriumtuberculosis［J］.InfectImmun,1999,67(4):1702-1707.［2］师长宏,王晓武,生,等.结核分枝杆菌差异蛋白MPT64与ESAT6的融合表达与纯化［J］.第四军医大学学报,2005,26(20):1840-1842.［3］范雄林,徐志凯,李元,等.结核分枝杆菌Ag85B成熟蛋白基因免疫［J］.第四军医大学学报,2001,22(14):1283-1287.［4］DohertyTM,AndersenP.Tuberculosisvaccinedevelopment［J］.CurrOpinPulmMed,2002,8(3):183-187.［5］师长宏,范雄林,徐志凯,等.结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85BESAT6的融合表达及纯化［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,(2):89-92.［6］薛莹,李元,史皆然,等.结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的免疫学特性［J］.第四军医大学学报,2002,23(13):1203-1205.［7］LangermansJA,DohertyTM,VervenneRA,etal.ProtectionofmacaquesagainstMycobacteriumtuberculosisinfectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinofantigen85BandESAT6［J］.Vaccine,2005,23(21):2740-2750.［8］DietrichJ,AagaardC,LeahR,etal.ExchangingESAT6withTB10.4inanAg85Bfusionmoleculebasedtuberculosissubunitvaccine:EfficientprotectionandESAT6basedsensitivemonitoringofvaccineefficacy［J］.JImmunol,2005,174(10):6332-6339

结核病防治知识

肺结核病也叫肺痨，是青年公务员之家，全国公务员共同的天地人容易发生的一种慢性传染病。一年四季都可以发病，15岁到35岁的青少年是结核病的高发峰年龄。因此青年人更应该注意预防。

结核病是结核杆菌引起的一种呼公务员之家，全国公务员共同的天地吸道传染病。多数患者是通过呼吸道感染的。结核杆菌在阴暗潮湿的环境中可以存活几个月。当患有活动期肺结核的病人吐痰后，结核菌就可随干了的痰迹飞散到四周。随时都可以感染健康人。人体除毛发外几乎全身所有组织都可以感染结核病，入肠结核、骨结核、淋巴结核等。由于结核病主要经呼吸道进行传播，因此肺结核的感染率比其他器官高，占人体结核病的首位。患结核病后，病人可有低烧、盗汗、疲乏无力、干咳或痰中带血丝、颜面潮红、身体瘦弱等症。如不及时彻底的治疗，会使病情转为慢性，甚至造成病人死亡。

摘要:猪巴氏杆菌病由多杀性巴氏杆菌感染而引起，主要发生于仔猪和育肥猪，呈世界流行，可通过呼吸道、消化道和血液途径传播。感染猪根据疾病发生的缓急分为慢性型和急性型两种类型，主要表现呼吸道症状和全身症状。从巴氏杆菌病的临床表现、病理剖检和实验室检查方面提供了该病的诊断特征，同时从疫苗的程序性免疫、加强猪舍内环境消毒、减少养殖过程中应激因素对猪群的影响、提升猪场生物安全管理水平和对病猪进行科学治疗的角度阐述了该病的防控方法，以期为广大养猪朋友带来帮助。

关键词:猪;巴氏杆菌;肺疫;诊断;防控

猪巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌感染而引发的一种以全身败血症为特征的急热性传染病，由于病猪大部分表现呼吸道症状，故又称“肺疫”，严重的能导致咽喉部位肿胀，压迫气管使气流进出受阻，民间称其为“锁喉疯”，主要影响仔猪和育肥猪，每年都会给养猪业带来较为严重的经济损失［1］。

1巴氏杆菌

巴氏杆菌是一种革兰氏染色呈阴性的短杆菌，大小为(0．2～0．4)μm×(0．4～1．8)μm，病料中直接抹片分离的病原大部分为单个存在，极少数成双排列，且呈现出两端浓染的特征。该菌表面无鞭毛，恶劣环境中不形成芽孢，不会自主运动，新分离的毒株表面有荚膜，经传代培养后荚膜消失。本菌可在体外进行培养，最佳培养温度为32℃～38℃，需氧或兼性厌氧，最适pH为7．0～7．5，培养时对培养基的营养有一定要求，普通肉汤中生长较差，加入血清或血液后生长速度加快。在绵羊血琼脂平板表面培养24～48h能见到表面光滑、湿润、边缘整齐、形似露珠的菌落，不发生溶血，有荧光，接种至麦康凯琼脂表面则无法生长。

2猪巴氏杆菌病简介

1苏云金芽孢杆菌（Bt）的发现及杀虫机理

1.1苏云金芽孢杆菌（Bt）的发现

1901年日本学者石度繁从患猝倒病的家蚕幼虫中分离到第1个产生晶体的芽孢杆菌。10年后Berliner从德国苏云金地方一家面粉厂染病的地中海粉螟中分离到一个相似的菌株，并正式定名为苏云金芽孢杆菌（Bt）。4年后，一个叫克林诺的科学家发现，在这种细菌的细胞中可以形成方形或菱形的晶体，可惜这个发现并未被重视。直到40年后的1953年，一位叫汉纳的生物学家证明了这种晶体是有毒的蛋白质晶体，才揭示了粉螟死亡的原因。在1920～1930年间，Bt作为微生物杀虫剂主要用来防治玉米螟。1938年第1个商品制剂Sporeine在法国问世，从此拉开了生物杀虫剂的序幕。以后相继发现了对鞘翅目、螨类、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫、动植物寄生线虫、鞭毛虫、变形虫、吸虫、绦虫有毒杀作用的Bt菌株。

进一步的研究发现，Bt是革兰氏阳性菌，另外，它可寄生在一些蛾类和蝶类的幼虫上，甚至是植物表面。

苏云金芽孢杆菌分泌出的由Cry基因编码的、有杀虫活性的δ-毒素（或被称为杀虫晶体蛋白）的蛋白结晶构成了内孢子。Cry蛋白对鳞翅目（如蛾与蝶）、双翅目（如苍蝇、蚊子）和鞘翅目（甲虫）有很大杀伤力。因此，可将苏云金芽孢杆菌发酵生产制成高效生物杀虫剂，或用Cry基因制成防虫害的转基因产品。

1.2苏云金芽孢杆菌（Bt）的杀虫机理

摘要幽门螺杆菌（Hp）作为胃炎、胃十二指溃疡、胃癌、胃淋巴瘤等疾病的重要致病因素已被广泛确认。作为非侵入性细菌，它引起炎症及免疫应答以及进一步的病理损害是重要的致病机理，而Hp菌苗也存在免疫保护和免疫损伤两方面的作用。本文就Hp菌苗与宿主免疫等相关问题作一简要综述，目的在于为完善Hp菌苗的研究提供理论基础。

幽门螺杆菌（Hp）作为慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌、胃淋巴瘤发生发展中的重要致病因素已为大量研究证实，其致病机理包括Hp的尿素酶、蛋白酶、脂酶、磷脂酶A、趋化因子及细胞空泡毒素（VacA）等直接致病，也包括Hp引起宿主的炎症及免疫应答致病[1]。本文主要就Hp菌苗与宿主的免疫应答及相关问题的研究进展作一简要综述。

hp与菌苗研究

Hp感染是世界范围的，而且是终身感染。新近研究显示，口服菌苗可诱导针对Hp感染的保护性免疫，并且菌苗可治愈已存在的HP感染性病变，从而表明用菌苗治疗Hp感染是可行的[2]。用霍乱毒素（CT）B亚单位或大肠杆菌不耐热毒素（LT）作粘膜佐剂的Hp抗原诱导免疫已获成功，即Hp对宿主自然免疫应答的抵抗能被瓦解。成功用作Hp菌苗的抗原有Hp细胞裂解产物、尿素酶、VacA、热休克蛋白和过氧化物酶等。免疫学研究及动物模型也证实口服免疫不仅可以预防而且能治愈Hp感染，并且鼻内及结肠免疫均可引起胃粘膜的免疫保护[3]。新近Ghiara等用重组VacA或细胞毒素相关蛋白（CagA）作抗原，减毒的大肠杆菌LT突变体作为佐剂，成功地根除了小鼠模型中的慢性Hp感染，并证明该治疗性菌苗对Hp再感染有同样有效的免疫防御作用[4]。总之Hp作为非侵入性细菌，定居于胃粘膜表面，可引起机体的免疫及炎症反应。面对机体强大的免疫应答，Hp仍能继续生存并致病，其机理尚不清楚。免疫效应分子必须进入胃粘膜表面，才能中和和杀伤Hp。目前认为该作用与胃分泌液中出现抗Hp特异性分泌型IgA抗体相关。这种抗体也在感染的动物及人体中出现，所以细胞免疫效应在防御或治疗Hp感染中的作用仍需进一步研究。另外，了解Hp逃逸免疫效应分子的机理以及Hp菌苗诱导宿主的免疫保护及免疫损伤的机理，将为更有效的菌苗筛选提供可能。最近报道对Hp感染的易感性与小鼠中主要组织相容性复合体（MHC）位点直接相关，这是否适用于菌苗设计也需进一步研究证实[5]。

hp与宿主免疫

Hp诱导宿主免疫应答的途径，目前认为包括Hp可溶性产物的被动吸收，上皮细胞直接内吞细菌抗原，抗原通过被破坏的胃上皮进入组织激发机体的免疫应答[6]。粘膜对不同Hp免疫应答的差异是决定病变后果的重要因素。其中包括B细胞及相应的IgG、IgM的体液免疫应答，以及在Hp感染相关慢性活动性胃炎病变局部出现T淋巴细胞浸润的细胞免疫应答[1]。

［摘要］目的探讨儿童幽门螺杆菌感染及胃癌的关系。方法内镜下胃黏膜活检取材，应用常规固定，石蜡切片HE，HP染色镜检，1例加染PAS及AE1/AE3，CK8，KP-1，LCA，SMA免疫标记，结合临床进行病理学观察。统计学方法：采用医学统计学PEMS软件包进行χ2检验。结果216例胃黏膜活检病理诊断：轻度慢性浅表性胃炎89例，中度慢性浅表性胃炎92例（1例胃腺癌），重度慢性浅表性胃炎35例，后两组均各有4例为活动性胃炎。190例石蜡切片加印片HP染色：中、重度慢性浅表性胃炎HP阳性检出率明显高于轻度胃炎者（P=0.0281），差异有显著性；而临床诊断与活检病理诊断比较，差异无显著性（P=0.25）；通过特染及酶标确诊胃腺癌合并HP重度感染1例（有便血史2个月患儿）。结论（1）儿童重、中度慢性浅表性胃炎HP阳性检出率明显高于轻度慢性浅表性胃炎，三者比较差异有显著性（P=0.0281）。而且1例中度慢性浅表性胃炎有胃腺癌患儿为HP重度感染，提示HP感染与胃炎程度及胃腺癌确有关系，但三者确切关系有待进一步探讨。（2）活检标本石蜡切片HP染色加新鲜胃黏膜印片HP染色将提高HP阳性检出率，本组提高7%。（3）对有便血患儿应警惕胃癌可能，必要时及早胃镜检查加活检以便及时治疗HP感染及早期预防、早期诊断、早期治疗胃癌。

［关键词］儿童；幽门螺杆菌；胃癌

近年来儿童纤维胃镜开展普及，我院216例胃黏膜活检标本中检出胃腺癌1例，且伴重度幽门螺杆菌（HP）感染。成人HP感染与胃癌关系为近年来研究热点之一，但对儿童胃癌与HP感染关系国内鲜有报道，故本文就我院胃黏膜活检分析，以初探儿童HP感染与胃癌关系，现将资料报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料216例胃黏膜标本均系我院消化科纤维胃镜下活检送检标本，男121例，女95例，年龄最小1岁，最大16岁，平均9.6岁，年龄分布情况，见表1。以8～12岁组共164例为最多（占76%）。表1216例胃镜活检年龄分布（略）

1.2临床表现216例中临床表现为：轻度慢性胃炎174例，上消化道出血17例，十二指肠球炎11例，消化性溃疡12例，便血2例。

【关键词】流感嗜血杆菌;耐药性;耐药机制

目前世界范围的细菌耐药性是近几年医学科学领域中研究的热点问题。流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae,Hi）是小儿呼吸道感染的常见致病菌，对临床常用抗生素的耐药性呈上升趋势，引起了医学界普遍关注。继β内酰胺酶阴性耐氨苄西林Hi（BLNAR）发现之后，世界各地又陆续报道了多重耐药菌株的出现。本文就流感嗜血杆菌的耐药现状及其对常用抗生素的耐药机制作一综述。

1流感嗜血杆菌的一般情况

Hi分型研究的常用方法有生物型、血清型和荚膜型等多种，其中荚膜型/血清型对Hi致病性研究和菌苗研制意义重大。根据该菌细胞壁外荚膜多糖的有无，可将Hi分为有荚膜的可分型和无荚膜的不可分型两类，前者再可根据其荚膜多糖抗原的不同，分为a、b、c、d、e、f六个血清型。

研究表明不同年代、不同地区Hi血清型存在较大地区差异。用直接原位聚合酶链反应（ISPCR）杂交法，20世纪50～60年代Hib的检出率是14.3%，80年代至2002年Hib的检出率是20.5%［1］。陈民钧等［2］用Hib型抗原乳胶凝集试验对北京、上海和广州地区的菌株进行研究，发现三个地区Hib分别占1.8%、32.3%和6.5%。之后报道北京2000年Hib检出率是13.7%［3］，上海2003年是19%［4］。华春珍等［5］对247株Hi血清分型研究中不可分型菌株占61.9%，可分型菌株占38.1%，其中可分型菌株中以d型为主，构成比达90.4%，b型仅1.1%。

在国外，孟加拉国化脓性脑膜炎由Hi引起的占35%，这其中有97.1%为Hib感染［6］。意大利学者报道了1997～1998年分离的Hi菌株中b型占91.2%，f型占0.9%，不可分型占7.9%［7］，1998～1999年分离的Hi菌株均为Hib，2000～2001年在对7例病人标本进行追踪检测，其中有5株为e型［8］。波兰学者从感染的下呼吸道分泌物中分离的Hi菌株中b型占40.3%，e型占38.9%，f型占16.7%，d型占4.1%［9］。

经大量临床病例证实，消化系统的胃黏膜病变、溃疡、胃淋巴增生性病变、慢性胃炎甚至胃癌均与幽门螺杆菌(HP)感染有一定的关系。我国目前处于HP感染高发区，通常HP感染缺乏典型的临床特征，故早期的临床诊断及治疗显得尤为重要。病理诊断HP感染是临床诊断的重要依据，但在常规病理HE切片中不易观察到HP，难以明确病理诊断，因此只能用特殊染色法才能使HP更清晰的显示出来。目前检测HP的方法有10余种，哪些方法最好、如何进行HP染色的质量控制、使染色结果稳定可靠且准确是目前工作中的关键。本文就这些染色法中的关键问题、注意事项以及HP实验操作问题、染色液配制及染色结果观察判断等问题进行探讨。

1材料与方法

1.1材料。选取本院2018-05—08间临床诊断的活动性胃炎胃黏膜活检标本65例。1.2方法。将65例石蜡标本连续切片，制成4μm厚的切片，每例取3张，分别进行硼酸亚甲蓝染色、改良Giemsa染色和硝酸银染色。1.2.1试剂配制①硼酸亚甲蓝染液配制:把1g亚甲蓝和1g硼酸加入100ml蒸馏水中充分混合溶解。②改良Giemsa染液配制:Giemsa染液:Giemsa染液0.75g加甲醇50ml于50度水浴箱中使其充分溶解，其间不断搅拌，冷却后加入50ml甘油;石炭酸复红液:碱性品红50mg溶于95%乙醇100ml，再加入4%苯酚250ml及蒸馏水650m，充分混合即可。③硝酸银液配制:醋酸贮备液:双蒸馏水加1%柠檬酸液，调节PH值为3.6～4.0之间;5%明胶液:明胶5g加醋酸贮备液100ml溶解;③显影液:3%对苯二酚1ml与5%明胶15ml充分混合，显影前5min加入2%硝酸银3ml混合。1.2.2染色步骤①硼酸亚甲蓝染色:切片脱蜡至水，硼酸亚甲蓝染液染色5min，水洗，烘干切片，中性树胶封固。②改良Giemsa染色:组织切片脱腊至水，改良Giemsa染液染色20min后水洗，石炭酸复红液染1min，不洗直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。③硝酸银染色:切片脱蜡至水，醋酸贮备液洗切片，把切片置入1%硝酸银于56℃水浴箱45min，切片取出不经水洗，滴入显影液56℃水浴反应2min，切片立即取出，自来水稍洗，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。1.3结果判定。切片高倍镜下，阳性的幽门螺杆菌形态弯曲，短杆状，分布在胃黏膜凹陷内。硼酸亚甲蓝染色法幽螺杆菌呈蓝色;改良Giemsa染色法幽门螺杆菌呈红色;硝酸银染色法幽门螺杆菌呈棕黑色。

2结果

65例胃黏膜标本中，经硼酸亚甲蓝检出55例HP阳性，阳性率85%(图1);经Giemsa染色49例阳性，阳性率75%(图2);经硝酸银染色检出52例阳性，阳性率80%(图3)。三项染色阳性的数据比较差别显著(P＜0.05)。

3讨论

摘要:目的传统的结核分枝杆菌鉴定方法周期时间长、敏感性较差，往往延误患者的诊断和治疗，随着分子生物学的飞速发展，为了可以快速诊断结核分枝杆菌，本研究利用重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术建立快速的结核分枝杆菌检测方法，为结核病患者的诊断和治疗赢得宝贵时间。方法应用RPA技术对疑似肺结核患者痰标本中的特异性核苷酸片段进行检测，利用卫生统计学检验RPA技术与传统诊断方法有无差异。结果80例疑似肺结核患者的痰标本中检测出70例阳性，有10例排除结核病。80例疑似肺结核患者的痰标本中，RPA技术检测阳性率为87.50%，痰涂片检测阳性率为56.25%，痰培养检测阳性率为75.00%，RPA技术检测阳性率较高，与痰涂片、痰培养比较，差异均有统计学意义(χ2=25.00，P＜0.01;χ2=10.00，P＜0.01)。结论RPA技术的成功建立对结核病的快速诊断有着重要意义。

关键词:重组酶聚合酶扩增;结核分枝杆菌;特异性;诊断;检测

结核病(tuberculosis)是由结核分枝杆菌(Mycobacte-riumtuberculosis，MTB)引起的一种古老的慢性传染病，以肺部感染最为常见［1］。2019年世界卫生组织统计，全球报告结核病患者710万例，与估算的1000万例有所差异，可能与大部分患者未被诊断出来有关［2］，可见结核病的诊断存在一定的难度。肺结核是结核病中具有传染性的一类，临床上对这类患者的诊断主要通过痰涂片法和痰培养法，按照世界卫生组织的统计，临床上的诊断率只有不到70%。由于部分患者未得到及时诊断，使其成为持续的传染源，发病数持续增加。基于此，需改进现有的诊断方法，以提高结核病的诊断率。重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术被称为是可以替代PCR技术的核酸检测技术［3－7］。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域［8－11］。本研究利用RPA技术建立结核分枝杆菌的快速检测方法，现报告如下。

1材料与方法

1.1材料结核分枝杆菌标准株H37Rv由中国疾病预防控制中心提供，该研究涉及的菌株标本和痰标本均来源于邯郸市第六医院;引物与探针(表1)交由上海生工有限公司合成;DNA提取采用江苏硕世公司的磁珠提取试剂盒，RPAMasterMix购自潍坊安普未来生物科技有限公司，培养基选用珠海贝索的酸性罗氏培养基和中性罗氏培养基。1.2仪器西安天隆Real－timePCR仪，江苏硕世全自动核酸提取仪，热电培养箱。1.3方法1.3.1痰涂片镜检抗酸染色［12］，用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2～3滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，加热3～5min，待标本冷却后用水冲洗。3%盐酸酒精脱色30s～1min，用水冲洗。用碱性美兰溶液复染1min，水洗，用吸水纸吸干后用油镜观察。1.3.2分离培养取目标痰液经4%氢氧化钠溶液消化处理15min后，酸性罗氏培养基37℃培养7周，分离得到菌株。1.3.3DNA制备取1ml菌悬液或痰液于1.5ml离心管中，7500rpm离心10min，弃上清，加入180μl溶有溶菌酶的缓冲液BL，充分混匀，低速离心，于37℃水浴温育30min(温浴期间每隔10min颠倒混匀一次)。加入10μl蛋白酶K至样品中，充分混匀，低速离心，56℃水浴温育10min。将消化液全部加入到试剂板AT中的第1、7列中。将加入样本的试剂板AT放置在核酸提取仪中，试剂板AT的缺口朝外。插入八联磁棒套，关上试验仓，按下设置核酸提取程序，并选择运行。1.3.4RPA反应体系每份反应液中含有A反应液29.4μl，上、下游引物(10μmol/μl)各2μl，探针(10μmol/μl)2μl，灭菌水11.5μl，结核分枝杆菌DNA样品2μl，反应液总体系50μl。1.3.5PCR反应条件39℃30s(×1)，39℃10s→39℃20s(×40)。1.3.6结果分析采用SPSS21.0对数据进行整理分析，采用χ2检验对不同检测方法的结果进行统计学分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

摘要：对l例布氏杆茵病患者经密切观察、及时确诊并予以抗感染、营养支持及对症治疗，实施心理护理、疼痛护理、发热护理及健康教育等护理措施．结果患者症状迅速缓解而转往专科医院进一步治疗。提出密切观察病情、早期诊断、精心护理是布氏杆茵病确诊和治疗的关键。

关键词：布氏杆菌病；马尔他热；波浪热；乳制品；家畜；护理

布氏杆菌病(Brucellosis)又称马尔他热(MoltaFever)或波浪热(UndulantFever)，是由布氏杆菌引起的一种人畜共患的地区性流行病。本病的主要传染源是羊，其次是牛和猪。病菌可以从破损的皮肤进入体内，也可随乳制品进入体内。我科2006年收治1例布氏杆菌病患者，经密切观察、及时确诊并给予对症治疗和护理后好转而转入专科医院继续治疗。

一、病例简介

男，21岁，学生。患者于入院前3个月无明显诱因出现低热，体温波动在37．5℃左右，伴流涕、打喷嚏，有轻咳、咳少量白色泡沫样痰，自服阿莫西林、APC、维C银翘片等药物后体温可降至正常，咳嗽、咳痰、流涕症状好转。3～4d后体温复升并波动在37～39℃，伴畏寒、寒战、乏力、腹胀；l周前出现双侧踝、膝关节疼痛，伴右足第1跖趾关节持续性肿痛；3d前出现右上腹压痛。于我院就诊，行腹部B超检查示“脾稍大，肝大，左肾结石或钙化灶，盆腔少量积液”，于2006年5月10日以“发热原因待查”收入院。个人史：出生并久居于山西省，家中养羊，否认疫区居留史及疫水接触史，否认长期放射线、毒物接触史。人院后查体：体温36．8℃，脉搏84次／min，呼吸20次／min，血压100／70mmHg，皮肤温度及湿度增高。左侧颈后可及淋巴结1枚，直径约o．5cm，双侧腹股沟可及淋巴结数枚，最大直径1cm，质韧，活动度可，无压痛。球结膜轻度充血，右侧颜面部稍肿胀。右侧颌下腺略饱满，表面不平，质软。脾肋下约3cm，质软，叩诊肝下界于肋弓下5cm，肝区叩痛阳性，脾区叩痛阳性。脊柱T。。棘突可及压痛及叩击痛。双手细颤。患者入院后仍间断发热，体温最低36．8℃，最高40℃，呈波状热。人院后行骨穿检查提示骨髓增生活跃，中性粒细胞可见中毒颗粒，不除外感染。5月12日患者出现左侧睾丸部位疼痛，逐渐加重并转为双侧，查体：右附睾头、体、尾均肿大，约4cm×2cm×2m，左附睾轻度肿大，压痛(+)，左侧精索静脉曲张，阴囊B超提示：双侧附睾略增大并血流丰富，双侧精索静脉轻度曲张。反复查布氏杆菌凝集试验3次均为阳性，滴度为1：20，血培养结果支持，因而确诊为布氏杆菌感染。给予抗感染(利复星O．2g静脉滴注，每日2次)、营养支持及对症治疗后体温呈下降趋势，5月23日转入传染病医院继续治疗。

二、护理