造价师学习计划范文

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篇1

【关键词】 皂苷 抗肿瘤 溶血

【Abstract】 Objective To investigate the antineoplastic activity and blood cell haemolysis test on saponin. Methods The OD405 value of cell was detected after saponin treatment by the acid phosphatase assay (APA). The safety of saponin was examined by haemolysis and blood cell agglutination tests.Results The saponin significantly inhibited proliferation of BEL7402 cells. Apparent difference in OD405 value was detected after BEL7402 cells had been exposed to the saponin for 72 hours compared with control group（P＜0.05）. It was proved that 100μg·ml-1 saponin caused no haemolysis and blood cell agglutination in vitro.Conclusion The saponin I1 has concentrationdependent antineoplastic activity on human hepatocarcinoma cells. The safety of saponin was better in vitro.

【Key words】 saponin，antineoplastic， haemolysis

皂苷是广泛存在于高等植物和某些低等动物中的一类具有广泛药理活性的三萜及甾体的糖缀合物，很多中草药的主要活性成分都是皂苷类化合物。近年来随着分离提取技术的不断发展，多种薯蓣皂苷被分离出来，并不断发现其新的生物活性，特别是在抗肿瘤、免疫调节、干预细胞信号转导、抗炎、降血脂、抗艾滋病等方面的作用引起了人们的重视［1，2］。紫花茄皂苷是根据从紫花茄中分离出的甾体皂苷化学合成的薯蓣皂苷［3］，具有较强的抗肿瘤活性。我们的研究表明紫花茄皂苷可以诱导肝癌细胞凋亡［4］，在肝病用药中很有前途。本研究对紫花茄皂苷进行体外抗肿瘤及溶血性实验，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司。DHanks 液，PBS缓冲液，0.1%EDTA溶液等均按常规配制［5，6］，新生牛血清（黑龙江省同江市江海生物公司），二氧化碳培养箱（Hereus公司)，96孔细胞培养板（Nunc公司），EL311酶标免疫检测仪（BioTek公司），相差倒置显微镜（Olympus）。

1.2 实验动物 新西兰大白兔，雄性，体重2.5 kg，由滨州医学院实验动物中心提供。

1.3 药物及配制 紫花茄皂苷I1由中国科学院生态研究环境中心生物技术室提供。以二甲基亚砜（DMSO）溶解后用生理盐水稀释至100 μg/ml，其中DMSO浓度为0.1％。

1.4 2%红细胞悬液的制备 取10 ml新鲜新西兰兔血，滴入含2500 IU肝素钠的离心管中，加入10 ml生理盐水，摇匀后2 500 r/min离心5 min，倾去上清液，再加生理盐水混合离心，反复洗4 次，最后一遍用巴比妥钠缓冲液洗至上清液呈无色透明，然后将所得红细胞用巴比妥钠缓冲液稀释成红细胞压积百分比为2%的红血细胞混悬液。

1.5 酸性磷酸酶法（acid phosphatase assay， APA）［7］检测细胞存活率 取对数生长期细胞，消化后制成细胞悬液，按1×103/孔的密度接种于96孔板。培养24 h后，实验组加入先用二甲基亚砜（DMSO）溶解、再经RPMI1640培养液稀释至终浓度为1～10 μg·ml-1的皂苷；空白对照组加入RPMI1640培养液；溶剂对照组加入经同样稀释的溶剂，含0.01%～0.1%DMSO。实验中每个浓度设8个平行孔，作用72 h后用APA法经EL311酶联免疫检测仪在405 nm波长处测定吸光度OD值，空白孔调零，实验重复三次，取平均值。

1.6 溶血性实验［8，9］ 在2 %的兔红血细胞混悬液中，分别加入不同体积的100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1，轻轻摇匀置37℃水浴中保温1 h后，2000 r/min离心5 min，每管取上清100 μl，经EL311酶联免疫检测仪于波长405 nm测量吸光度。第6组不加皂苷， 作为空白阴性对照；第7组不加皂苷并用蒸馏水代替巴比妥钠缓冲液，作为充分溶血阳性对照（表1）。空白组调零，每组设3个平行孔，计算吸光度平均值。实验重复三次，取平均值。

根据吸光度平均值按下式计算相对溶血率：

相对溶血率＝OD实验组/ OD阳性对照×100％。 表1 各实验组配比量表

1.7 统计学方法 所得数据以均数±标准差表示，采用SPSS 10.0统计分析软件包分析统计学差异。

2 结果

2.1 紫花茄皂苷的体外抗肿瘤作用 不同浓度的紫花茄皂苷I1作用于BEL7402细胞72 h后，APA法测定结果如表2， 实验表明，加药组从2.0 μg·ml-1起，与对照组的OD405比较，即有显著性差异(P＜0.05)，而且随着皂苷浓度的增加抗肿瘤作用也增加， 呈剂量依赖性。 表2 紫花茄皂苷I1对BEL7402细胞抗肿瘤作用 注：与空白对照比较， *P＜0.05，P＜0.001

2.2 溶血性试验评价 实验结果见表3，不同体积的100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1作用于新鲜兔血后，根据公式计算出1、2、3组的溶血率均小于5%，表明100 μg·ml-1的皂苷Ⅰ1体外溶血实验，不引起红细胞的明显凝集和溶血，安全性较好。

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3 讨论

恶性肿瘤或癌症是目前威胁人类生命和健康的严重疾病之一，与心血管病、糖尿病并称为现代社会的三大杀手，给人类的身心健康带来巨大的损害。寻找有效的抗肿瘤方法具有强烈的社会需求，是多年来世界各国学者面临的重大课题，并已取得大量成果。但目前一个重要的问题是，大部分治疗肿瘤的方法给患者，尤其是晚期患者带来的创伤过大。表3 皂苷Ⅰ1的溶血实验无论是手术还是放、化疗，其痛苦和代价有时不呰于肿瘤本身。大量研究结果表明，植物来源的抗肿瘤药具有种类多、毒副作用小、不良反应少的特点。因此，从植物中寻找高效的抗肿瘤药物已成为一种新的研究思路。

本文利用APA法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标，对紫花茄皂苷进行活性筛选，确定出一些有较好生物活性和稳定性，具有深入研究价值的结构，对其进行深入研究。本实验观察了不同剂量的紫花茄皂苷I1对人肝癌BEL7402细胞的抗肿瘤作用。将BEL7402细胞与不同浓度的紫花茄皂苷共同孵育72h后测定各组吸光度值，结果表明紫花茄皂苷I1能明显抑制体外培养的BEL7402细胞的生长(P＜0.05)， 并呈浓度依赖性。提示皂苷I1对BEL7402细胞具有明显的体外抗肿瘤作用。

采用《中国药典 》2005版中药安全性检查法应用指导原则“溶血与凝聚检查法”，参照国家食品药品监督管理局制定《化学药物刺激性、过敏性和溶 血性研究技术指导原则 》相关内容进行皂苷的体外安全性评价。体外溶血实验显示皂苷不引起兔红血细胞的溶血与凝集，安全性较好，有望成为临床上的抗癌新药。

【参考文献】

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［3］ Gu G， Du Y， Linhardt RJ. Facile synthesis of saponins containing 2，3branched oligosaccharides by using partially protected glycosyl donors［J］. J Org Chem，2004，69(16):54975500.

［4］ 马朋， 顾国峰， 陈希， 等.合成紫花茄皂苷诱导人肝癌BEL7402细胞凋亡［J］.中国肿瘤临床， 2005， 32(9): 481485.

［5］ 薛庆善. 体外培养的原理和技术［M］.北京：科学出版社，2001：53.

［6］ 金冬雁，黎孟枫，译. Sambrook J， Fritch EF， Maniatis T，et al.分子克隆实验指南［M］.第2版. 北京：科学出版社，1998: 888897.

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篇2

【关键词】 全反式维甲酸;三氧化二砷;急性早幼粒细胞白血病

Clinical observalion of the combination of all-trans relinoic acid and arsenic trioxide for the treatment of acute promyelocytic leukemia

DONG Hai-lin,YANG Chang-jian,CHEN Xiao-liang.

【Abstract】 Objective To observe the eficacy and side efect of the all-trans retinoic acid(ATRA)and arsenic trioxide(As2O3)combination in acute promyeloeytic leukemia(APL).Methods Thirty-eight APL patients were treated with the ATRA and As2O3 combination.ATRA was given 25 mg/m2 every day and As2O3 was given 0.16 mg/(kg•d).Doses were adjusted according to adverse effects.Results Thirty-four patients achieved complete remission(CR),the CR rate was 89.5%.The time to achieve CR was(24.4士5.2)d.Two patients died due to intracranial hemorrhage.Conclusion The ATRA and As2O3in the treatment of APL can obtain a higher CR rate and a shorter duration for achieving CR.

【Key words】 Retinoic acid; Arsenic trioxide; Leukemia; Promyelocytic; Acute

2004年6月至2009年3月,我们采用全反式维甲酸(ATRA)联合三氧化二砷(As2O3)治疗38例急性早幼粒细胞白血病(API)患者。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本组38例初治API 患者,男20例,女18例;年龄16~64岁,平均40岁。所有患者均经形态学、细胞化学、细胞遗传学确诊。入院时血常规:WBC 0.4×109~48.52×109/L(平均值7.71×109/L),Hb 22~148 g/L(平均值66 g/L),PLT 2×109~208×109/L(平均值26×109/L)。7例合并出凝血指标(Pr、APIT、DDI、FDP)异常。骨髓象检查:骨髓增生活跃或极度活跃,异常早幼粒细胞占0.346~0.997(平均值0.898),外周白血病细胞占0.02~0.97(平均值0.63)。

1.2 方法 确诊者均予ATRA 25 mg/(m2•d)口服,连用30 d。As2O3 0.16 mg/(kg•d)加入5%葡萄糖液500 ml中静滴,21~28 d为一疗程。观察ATRA相关副反应及完全缓解(CR)时间,CR标准参照张之南主编《血液病诊断及疗效标准》[1]。每2~3 d复查血常规,每周复查肝、肾功能,监测凝血指标。治疗前或疗程中如WBC≥20×109/L,加用小剂量高三尖杉酯碱1 mg/d联合化疗,根据外周WBC变化决定使用时间,一般不超过7 d。治疗开始即预防性应用保肝类药物。ALT和(或)AST在40~120 U/L时As2O3减半,≥120 U/L时停用As2O3,待ALT或AST恢复正常后再用As2O3。若患者出现ATRA综合征且不能耐受,则减少ATRA剂量或停药,待症状减轻或消失后再逐渐加量应用。

1.3 统计学处理 使用SPSS 13.0 统计软件分析,采用χ2检验。

2 结果

2.1 联合治疗APL的总体疗效 ATRA联合As2O3治疗38例APL患者。共34例获得CR,CR率89.5%,获得CR所需时间平均为(24.4±5.2)d,2例在疗程中因并发颅内出血而死亡。

2.2 高WBC和低WBC APL患者的疗效比较 确诊时26(68.4%)WBC0.05)。见表1。

2.3 外周血象变化 33例(86.8%)治疗1~2周时白细胞、血小板开始升高,第15~20天达高峰,第23~34天降至最低水平,其后逐步恢复至正常水平。红细胞数和血红蛋白治疗第14~21天后逐渐升高,第30~35天达正常水平。

2.4 骨髓象变化 治疗前骨髓增生程度均为活跃或极度活跃,治疗结束后,变为减低或活跃;粒红细胞比例接近正常,骨髓白血病细胞比例正常;治疗前全片巨核细胞计数偏低,治疗后恢复正常。

2.5 不良反应 消化系统症状(恶心、呕吐、食欲减退)31例(81.6%)。肝功能损害17例(44.7%),皮肤损害(皮疹、皮肤及口唇干燥)5例(13.2%)。有发热、头痛、肌肉或关节疼痛4例(10.5%),均经对症处理好转。1例在As2O3应用6 d后出现急性肾功能衰竭,遂停用As2O3,予以对症处理,1周后肾功能恢复正常。

3 讨论

急性早幼粒细胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL)是FAB分型中急性非淋巴细胞白血(Acute nonlymphocytic Leukemia,ANLL)的M3亚型,占所有ANLL的10%~15%,具有独特的临床表现,细胞形态学,细胞遗传学和分子生物学特征。ATRA治疗APL的机理为诱导异常早幼粒细胞向成熟阶段细胞转化,而不同于化疗直接杀伤肿瘤细胞。因此可降低DIC的发生率[2]。研究表明砷剂作用机制[3]:干扰细胞代谢及氧化过程、细胞调亡及诱导分化作用、诱导线粒体跨膜电位下降及调亡诱导分子活化,使ADCC发生程序死亡,同时延缓细胞周期,并抑制细胞生长。砷剂的使用可使APL的治疗更进一步,高浓度的As2O3选择性地诱导APL细胞凋亡,低浓度则诱导分化,可弥补ATRA只能诱导细胞分化的不足;而两者对NB4细胞在诱导分化和凋亡方面具有协同作用。另发现,不同浓度As2O3能快速调节和降解PML-RARa[4]。

以往报道,单用ATRA治疗、[5,6]ATRA+化疗和单用As2O3治疗的CR率均为85%~95%,本组CR率与上述疗法比较无显著差异,但获得CR所需时间少于单用ATRA和单用As2O3者。高白细胞综合征、肝功能损害、黏膜干燥是ATRA的主要不良反应,As2O3也有类似不良反应,且肝脏受损更明显,所以二药联合使用后其不良反应是否加重,是众所关心的问题。从本组的治疗结果来看,两药联合使用引起的高白细胞综合征和肝功能异常不良反应并不比单独使用ATRA或As2O3时明显。本组两药联合治疗中加服小剂量高三尖杉酯碱及保肝药物,减少了高白细胞综合征及肝损害的发生,与高松等的研究结果相一致[7]。其他少见的不良反应均不影响正常治疗。故两药的联合使用完全可在初发APL患者中进行。但分子水平缓解状况目前与单用ATRA或As2O3比较并未表现出显著的优势。这可能与病例数尚少,随访时间短有一定关系。因此ATRA联合As2O3的长期疗效仍需做进一步的临床研究。

参考文献

[1] 张之南,沈悌.血液病诊断与疗效标准.科学技术出版社,1998:214-218.

[2] Tallman MS.Gurative steategies in acute promyelocytic leukaemia.Washington DC:Hematology 2003 American Society of Hematology Education Program Book,2003:90-101.

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[5] 刘元肪,沈志祥,陈晓,等.全反式维甲酸联合三氧化二砷治疗初发急性早幼粒细胞白血病的近期疗效观察.中华血液学杂志,2003,24(1):25-27.