纤维素酶范文

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关键词：木质纤维素；纤维素酶；纤维素酶解

DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.10.185

1 引言

木质纤维素原料来源十分广泛，是储量丰富的可再生资源[1]。据统计，全球每年生产该类物质约200×109吨，其中有90%以上是木质纤维素类物质，而它们当中有8～20×109仍具有潜在的可利用性[2]。包括农业废弃物（秸秆、蔗渣等）如何处理，对环境压力以及可再生能源的利用具有现实意义。因此，在生物燃料、生物基化学品、分子材料、食品等领域这些廉价及丰富的木质纤维素，都具有广泛的应用空间。

纤维素的结构单位时D-葡萄糖，其分子式为：（C6H10O5）n，式中n为葡萄糖基数目，称为聚合度。经长期研究，已证实天然纤维素中D-葡萄糖基以吡喃环的形式存在，并且相互以β-1，4糖苷键构成分子链，因为这对吡喃式D-葡萄糖具有最低的能态，这也是其二聚物（纤维二糖）及共衍生物的真正形式。由于葡萄糖上带有多个羟基，因此纤维素分子间容易形成氢键，进而使得链与链之间氢键紧密连接易于聚集成结晶性的原纤结构。如图1所见，大量氢键网状结构中存在着相对规则的结晶区，其阻碍了纤维素分子的进一步利用，故纤维素水解前需进行预处理，破坏它的氢键及结晶区，以便更好地水解纤维素，从而增加它的酶可及面积。

2 纤维素酶作用机理

纤维素酶是指能够水解纤维素β-1，4-糖苷键，进而生成葡萄糖的一类酶的总称，它是由几种酶共同协同作用，而不是单一的酶，其中主要包括外切葡聚糖酶（CBH，C1）、内切葡聚糖酶（EG，Cx）和β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖酶）。长期的研究表明，结晶纤维素的彻底降解至少需要这3组纤维素酶的协同作用，如图2所示，Cx能容易地降解接近类型的纤维素或衍生物，Cx只有和C1组分结合时才可以利用晶形式的纤维素。C1酶首先作用于结晶纤维素表面，使其形成结晶构的纤维素键断开，长链分子末端游离，从而其转化成可被Cx酶作用的形式，Cx酶水解非结晶或纤维素、可溶性纤维素转化为纤维二糖，最后由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖、三水解为葡萄糖。

3 单一纤维素组分作用机理

（1）内切葡聚糖酶（EG或Cx）。Cx酶作用于纤维素的β-1，4葡萄糖苷键，随机切割，产生大量纤维素的还原性末端。测定Cx酶活力方法较多，通用的方法是利用羧甲基纤维素钠（CMC）作为底物测其酶活，由于它是一种高聚合度的可溶性纤维素衍生物，还原性所占比例较少，纤维素酶易于作用β-1，4葡萄糖苷键。

（2）外切葡聚糖酶（CBH，C1）。C1酶是指切割有Cx酶所产生的纤维素分子还原性末端，能够是纤维素长链释放出葡萄糖及小分子的寡糖。

有研究表明，已知外切葡聚糖酶具有2个独立的活性结构域：其一是指具有催化纤维素功能的结构域CD，其二是指具有结合纤维素功能的结合于CBD，二者由高度糖基化链相连接。查阅大量文献指出，C1对纤维素结晶区破坏作用极大，能够产生纤维二糖。其原因是首先是利用CBD把C1吸附在纤维素结晶区表面，其次再由单根葡聚糖链（纤维素）快速准确地进入CD中带底物结合和催化部位的“隧道”，纤维二糖被准确地从葡聚糖链上切割下来并被释放出来的同时，C1分子沿着葡聚糖链向前滑动2个葡萄糖单位[3]。

（3）β-葡萄糖苷酶（CB，纤维二糖）。CB酶又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够作用于结合在末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，水解生成部分β-D-葡萄糖以及相应的配基。在水相系统中，CB酶能水解纤维二糖及一些聚合度小于6的纤维糊精为葡萄糖，随着聚合度的增加，水解效果显著下降。

4 总结

木质纤维素广泛的来源，如农业废弃物、餐厨垃圾以及部分工业残余物等，可通过预处理和水解发酵转化为能源物质。在此基础上，需要在理论研究做出深入解释，以便更好的应用于实践。

参考文献：

[1]Sánchez J & Cardona CA. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology 2008（99）：5270-5295.

[2]Lin Y & Tanaka S.Ethanol fermentation from biomass resources：current state and prospects.Applied Microbiology & Biotechnology 2006（69）：627-642.

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关键词 米曲霉；固态发酵；纤维素酶活

中图分类号 S147.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）08-0197-02

Abstract The culture conditions affected the production of cellulose enzyme by Aspergillus oryzae，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，water content，culture temperature，culture time，etc.The results showed that when the carbon source was bran，nitrogen source was powder of bean cake，initial pH value was 6.5，moisture content was 50%，culture temperature was 30 ℃，training time was 60 h，the cellulose enzyme activity produced by Aspergillus oryzae was the highest.

Key words Aspergillus oryzae；solid-state fermentation；cellulose enzyme activity

我国农作物秸秆的利用率普遍很低，多数作物秸秆都作焚烧处理，对环境的污染很大。作物秸秆中含有丰富的有机质、氮、磷、钾等作物生长所需的营养元素，如果能得到合理的利用，将会为人类带来巨大的收益。作物秸秆的处理方式有物理、化学、生物方法，其中生物降解具有污染少、能耗低等优点[1]。作物秸秆中含有丰富的纤维素，纤维素在纤维素酶的作用下可以水解生成单糖被作物和微生物利用，但纤维素不易被降解，几十年来，人们对于纤维素的预处理及酶水解过程进行了大量研究，其中纤维素酶的使用大大提高了纤维素的降解率[2]。

米曲霉属半知菌亚门丝孢纲丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种。米曲霉（Aspergillus oryzae）是纤维素酶的主要生产菌种之一。工业用米曲霉菌种所产的酶系较多、酶系组成较复杂[3]，国内对该菌株的相关研究并不多，对其酶系在工业发酵过程中受到的影响因素及其作用机理并不十分了解，从而导致在工业生产过程中不能够十分精确地控制米曲霉的产酶过程，限制了这一传统的食用菌株在工业应用领域的进一步拓展[4]。本试验对米曲霉M1102产纤维素酶在固体发酵过程中所受的影响及活性变化进行了研究，以期为米曲霉产纤维素酶的工业化生产提供相关的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌种。米曲霉菌株M1102，来自中国菌种保藏中心。

1.1.2 培养基与主要试剂。斜面培养基：土豆培养基（PDA）；液体种子培养基：豆饼粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖10 g/L，MgSO4 0.3 g/L，K2HPO4 0.3 g/L，调节pH值至7.0；营养盐溶液：NaCl 2 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、CaCO3 0.5 g/L、MgSO4 0.5 g/L，调节 pH值至7.0；固体培养基：木质纤维素培养基；主要试剂：麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖、豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素。

1.1.3 仪器设备。酒精灯、接种环、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、pH测定仪、紫外分光光度计、水浴锅、恒温培养箱、电子天平、控温摇床。

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法。一是米曲霉种子液制备：将米曲霉接种于PDA斜面上进行活化，用接种环挑取一环接种于250 mL三角瓶的种子液中，装液量为50 mL，30 ℃，180 r/min，培养24 h。二是固体培养：在250 mL三角瓶中加入10 g风干后过筛的木质纤维原料和5 mL营养盐溶液，拌匀，121 ℃灭菌30 min，冷却后将种子液以3%的接种量接种于固体培养基中，32 ℃下培养60 h，测定其产纤维素酶活[5]。粗酶液的制备：每1g固态培养物加入磷酸缓冲溶液5.0 mL（pH值 7.2），室温下浸提1 h，10 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 培养条件的优化。一是碳源对纤维素酶活的影响：分别用3%含量的麸皮、稻壳粉、玉米粉、玉米芯粉、葡萄糖、蔗糖作为培养基的碳源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定其纤维素酶含量[6]。二是氮源对纤维素酶活的影响：分别以2%的豆饼粉、干酪素、蛋白胨、硫酸铵、尿素作为培养基的氮源，其他成分同初始培养基，培养结束后测定培养基中纤维素酶含量[6]。三是发酵条件优化：采用优化后的最佳发酵培养基，在固定其他发酵条件的基础上，逐一对发酵培养的初始pH值、培养基含水量、培养时间、发酵温度等培养条件进行优化。

1.2.3 纤维素酶活的测定方法。采用GB-羧甲基纤维素法（CMC法）。

2 结果与分析

2.1 培养基碳源对纤维素酶活力的影响

酶诱导物和酶蛋白质前体同时对纤维素酶的合成有调控作用，酶诱导物一般为可利用的碳源，纤维素作为酶诱导物对纤维素酶的产生有重要作用。从图1可以看出，在培养基其他基础营养成分不变的前提下，改变碳源含量后，米曲霉产纤维素酶活发生显著变化，其中碳源为麸皮时纤维素酶活最高；稻壳粉和玉米芯粉次之，为最高酶活的72%和68%；玉米粉和蔗糖为最高酶活的60%和37%；碳源为葡萄糖时纤维素酶活最低，仅为最高酶活的30%。当碳源中纤维素含量丰富时，米曲霉产纤维素酶活力高，这是由于纤维素作为酶诱导物能刺激纤维素酶的产生，将其分解为可利用的单糖，而葡萄糖和蔗糖作为碳源时，米曲霉能直接利用其作为碳源，所以抑制了纤维素酶的产生。

2.2 培养基氮源对纤维素酶活力影响

氮源是酶蛋白质前体的主要来源，因此氮源的类型和性质同样会影响纤维素酶的合成和分泌。选择不同氮源作为单一氮源进行发酵试验，来考察其对米曲霉产酶的影响。

从图2可以看出，在试验选用的5种有机和无机氮源中，以豆饼粉作为氮源时米曲霉所产纤维素酶活性最高；干酪素和蛋白胨次之，纤维素酶活是豆饼粉作为单一氮源时活性的96%和81%；当分别以硫酸铵和尿素为单一氮源时，米曲霉所产纤维素酶活性仅为最高酶活性的70%和68%。由此表明，有机氮源对纤维素酶活的影响大于无机氮源，这可能与有机氮源中营养成分含量多元化有关。

2.3 培养基初始pH值对纤维素酶活力的影响

微生物在生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，导致培养基pH值发生变化，而培养基初始pH值不仅影响微生物的生长繁殖，且对其产酶情况有显著的影响。在优化培养基碳氮源基础上，调节初始pH值为4.0～9.0来考察米曲霉产酶活性的变化。从图3 可以看出，米曲霉产生纤维素酶的最佳初始pH 值为6.0～7.5，当培养基初始pH值为5.5，米曲霉仍能产生相对于最高活性 72%的纤维素酶；而当培养基初始pH值调至8.0 时，米曲霉产生纤维素酶活性则迅速下降至最高酶活性的34%。试验表明米曲霉产纤维素酶的pH值适应范围较宽，但过酸或过碱的环境不利于纤维素酶的生产。这可能是由于过酸或过碱的环境不利于米曲霉生长或破坏了纤维素酶活力。

2.4 培养基含水量对纤维素酶活力的影响

水分是微生物生长代谢的重要物质，在固体发酵中，水分对微生物活性有重要影响。从图4可以看出，随着培养基中含水量的增加，米曲霉产纤维素酶活呈现先增高后降低的趋势，当培养基含水量为50%时，纤维素酶活最高。所以含水量过高或过低都会抑制米曲霉生长，这可能是由于低水分使米曲霉培养基中的营养物质溶解性降低，抑制了米曲霉生长；当水分含量过高时，培养基过于黏稠，破坏了培养基的多孔结构，降低了其透气性，而米曲霉是耗氧微生物，低氧环境不利于其生长。

2.5 培养温度对纤维素酶活力的影响

微生物最适宜的温度范围一般为16～30 ℃，最高温度在37～43 ℃，温度过高或过低均不利于米曲霉生长。从图5可以看出，在30～35 ℃时，纤维素酶活最高，温度过低或过高都会降低纤维素酶活。这是由于，当温度过低时，米曲霉生

长缓慢导致产生纤维素酶少，而且低温环境会降低酶活力；当温度过高时，米曲霉会由于高温而出现老化现象，抑制了纤维素酶产生，并且高温容易使纤维素酶失活。

2.6 培养时间对纤维素酶活力的影响

微生物处于不同的生长期时，其相应的生长代谢机理也不同。从图6可以看出，随着培养时间的延长，米曲霉产纤维素酶活呈先升高后降低的趋势。当培养至60 h时，纤维素

酶活最高。这是由于培养初期米曲霉处于繁殖阶段，产生孢子数量有限，故分泌的纤维素酶少；而在培养后期，由于米曲霉出现老化，导致纤维素酶分泌量减少。

3 结论

本试验研究了米曲霉菌株M1102在不同固体发酵条件下产纤维素酶的变化。结果表明：当碳源为麸皮，氮源为豆饼粉，初始pH值为6.5，含水量为50%，培养温度为30 ℃，培养时间为60 h时，米曲霉产纤维素酶活力最高。为了深入了解米曲霉固体发酵产纤维素酶的影响因素，还需要对纤维素酶的生产条件和作用机理做更深一步的研究。

4 参考文献

[1] 袁喜庆.秸秆生物降解技术的效应[J].现代农业科技，2011（4）：261.

[2] 汤鸣强，郑 挺，曾小芳，等.酿造酱油米曲霉产中性蛋白酶提取与酶学性质研究[J].中国调味品，2008（348）：38-40.

[3] 高晓梅，李杨，刘晓辉，等.固态发酵法生产大豆多肽的初步研究[J].山东农业科学，2014（7）：78-81.

[4] 孙春华，燕磊，常维山，等.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报，2007，20（5）：986-990.

篇3

1.1葡萄糖内切酶

该酶作用于纤维素分子内的非结晶区，随机水解β-1，4-糖甘键，截短长链纤维素分子，产生许多带有非还原性末端的小分子纤维素，但不能单独作用于结晶的纤维素。同时它也能水解小分子的纤维寡糖。

1.2葡萄糖外切酶

这类酶作用于纤维素分子的末端，依次切下纤维素分子中的纤维二糖，可作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。

1.3β-葡萄糖苷酶

也称纤维二糖酶，是一种可将纤维二糖、纤维三糖和纤维六糖等水解为葡萄糖的非专一性酶；在水解过程中低聚糖对外切酶和内切酶的产物产生抑制作用，这种酶的存在可以显著降低抑制作用，提高水解效率。

2食品工业纤维素酶的来源

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、动物体、微生物（细菌、放线菌、真菌、酵母）等都能产生纤维素酶。由于动物体和放线菌的纤维素酶产量极低，所以很少研究。细菌所产生的酶是胞内酶，或者吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，提取纯化的难度大。而且产量也不高，主要是中性和碱性的葡萄糖内切酶。因其多数对结晶纤维素没有活性，所以主要用于棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，在食品工业中应用也较少[4]。目前，报道较多的是真菌，其产生的纤维素酶通常是胞外酶，酶一般被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法就可较容易地得到无细胞酶制品。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，其中木霉纤维素酶产量高、酶系全，故而被广泛应用，尤其是里氏木霉、绿色木霉的研究较多。

2.1产纤维素酶里氏木霉的研究进展

由于里氏木霉产纤维素酶量高、稳定性好、适应性强，便于生产和管理，因此具有突出的研究和利用价值。目前，在菌株选育上普遍采用人工诱变和基因工程改造两种方案获得高效分解纤维素的菌株。诱变的方法一般是传统的物理诱变(紫外线)和化学诱变(亚硝基胍)。IKEM等以里氏木霉ATCC66589为出发菌株，经紫外线诱变，获得两株突变菌株M2-1和M3-1。其滤纸酶活分别达到257U和281U。张素敏等利用紫外线诱变里氏木霉T306，得到突变菌株的CMCA活力达到64.2U/mL[5]。在化学诱变剂中，烷化剂可与巯基、氨基和羧基等直接反应，故更易诱发基因突变。DURANDH等用亚硝基胍诱变里氏木霉QM9414，得到一株稳定性较好的突变菌株CL847，FPA酶活最高达到5.2U/mL，较出发菌株提高了4倍[6]。也有紫外线与亚硝酸钠、亚硝基胍等化学试剂复合诱变的研究，取得了较好的效果。这些研究对里氏木霉高产纤维素酶菌株的选育及其工业化应用具有显著意义。基因工程改造可以从不同产纤维素酶菌株中筛选出比活力高、酶学性质稳定的基因重组在一起并高效表达，具有定向性，是选育出高产纤维素酶菌株的有效途径。目前已成功在里氏木霉中克隆表达的基因有纤维二糖酶基因、celEn、pBGL1、af211、Neg[7]。

2.2产纤维素酶绿色木霉的研究进展

绿色木霉酶活较大，是目前公认较好的纤维素酶生产菌。目前的研究主要集中于绿色木霉产纤维素酶生产工艺的研究。陈莉等采用固态发酵方法研究了不同条件对其产纤维素酶活的影响。得出绿色木霉固态产酶发酵的最优条件是培养温度30℃，培养时间5d，接种量5%，含水量250%。在实际发酵过程中，不同的酶组分达到最大酶活的时间也有不同，例如FPA酶活在发酵2d后达到最高值,Cx酶活在发酵3d后达到最高值。以蛋白胨为唯一氮源时，纤维素酶活力最高，以尿素为唯一氮源时，纤维素酶活力最低。绿色木霉分泌的酶系偏酸性,发酵液初始pH值为4.5时，FPA酶活和Cx酶活都出现最高值。因此在实际应用中也可以根据需要来调整不同酶组分的含量，以及合适的氮源，适宜的pH值等[8-9]。黄发等人对绿色木霉产β-葡聚糖酶的工艺条件研究也得出了类似的结果[10]。

3纤维素酶在食品工业的应用

3.1在果蔬加工中的应用

在果蔬的加工过程中,为了使得植物组织快速软化和膨润,常常采用加热蒸煮或酸碱处理等方法。这样一来就使得蔬菜、果实的香味和维生素等损失很大。通过使用纤维素酶来进行蔬菜的软化可以避免这一缺点。除此以外,通过采用纤维素酶对蔬菜和果实进行分解,可以使加工的果酱口感增加;还可以用纤维素酶来分解蘑菇,制造一种很好的调味料;在糖果品加工工艺中也可以采用纤维素酶来缩短砂糖进入果实当中的时间，以更快地达到浸透效果[11]。朱莉莉等研究了羊栖菜汁浸提工艺条件,通过研究最适范围各个单因素发现，在复合酶酶解提取羊栖菜汁的最佳浸提方案中,添加纤维素酶与果胶酶配比3:2可以大大提高浸提率[12]。

3.2在大豆加工中的应用

纤维素酶用于对大豆的处理,可以促使其大豆快速脱皮,与此同时,由于纤维素酶可以破坏其细胞壁,从而使得包含在细胞中的油脂和蛋白质完全的分离开来,导致大豆和豆饼中提取优质的水溶性蛋白质和油脂的得率明显增加，不但降低了生产成本，而且还显著地缩短了生产时间,更是提高了生产产品的品质。

3.3在茶叶加工中的应用

随着茶饮料工业的快速发展，茶水饮料生产的方式渐渐地由最初饮料厂的全程生产方式向由原料厂商只是生产茶浓缩汁这一方式过度,这就使得我国的茶叶浓缩汁、速溶茶等生产发展快速。随着近现代生物技术的快速发展,外源的生物酶在茶叶提取、加工中得到充分的应用。酶法提取的原理为利用其纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等水解酶分解茶叶的细胞壁,使得细胞结构破坏,导致茶叶中的有效成分快速扩散与浸出,有利于提高固形物的溶出和浸提率。在茶叶提取生产的过程中，纤维素酶可以提升其可溶性糖类的含量以及水浸出物得率，并且还可以促进氨基酸、茶多酚、咖啡碱等物质的溶出，有利于释放出芳香性物质，有显著的增香效果[13]。

4纤维素酶在酿造、发酵工业中的应用

4.1在酱油、食醋酿造中的应用

酱油酿造主要是利用蛋白酶及淀粉酶等酶类对原料进行相应的酶解，而在该过程中如果添加使用纤维素酶，就可以使大豆等原料的细胞膜软化、膨胀等细胞破坏作用更加明显，使得包藏在细胞中的碳水化合物、蛋白质等顺利释放，从而缩短酿造时间，并且可以显著提高产率及品质，使酱油中的还原糖和色度明显增加，风味得到明显改善[14]。在食醋酿造过程中，通过纤维素酶与糖化酶混合使用，可以显著提升原料利用率及出品率。郝建新等以绿原酸为评价指标，进行了添加纤维素酶发酵醋的工艺研究。结果发现，利用纤维素酶等酶后，得到的发酵醋色泽澄清，并具备醋特有的香气，口感也很柔和，而且具有比较好的体外抗氧化的效果[15]。

4.2在啤酒加工过程中的应用

把纤维素酶利用在啤酒工业的麦芽生产当中，可以增加麦粒等的溶解性，减少糖化液中R-葡萄糖的含量，明显提高过滤性能。张麟等对啤酒糟进行了研究，发现预处理过程中添加纤维素酶水解比只用机械处理得到的可溶性糖含量有明显提高[16]。

4.3在饮料中的应用

冯丹等用新鲜的豆渣为原材料，利用纤维素酶对原料进行酶解，可以获得其水溶性膳食纤维等提取液，添加辅料可混合调配成一类酸甜适口，体系均一，滋味纯正，并且具有一定保健功能的膳食纤维类饮料。且研究发现其具有较好的稳定性[17]。

4.4在酒精发酵中的应用

通过在原料中添加纤维素酶来酿酒，可以增加出酒量，节约粮食20%左右，而且酿出的酒酒味醇香，杂醇油含量低。尤其是白酒当中，添加纤维素酶以后，可以同时将淀粉和纤维素转化为可发酵性的糖，再经过酵母分解而全部转化为酒精，提高出酒率且酒的品质纯正。在实际生产中应用纤维素酶，不仅可以提高发酵产率，而且能够显著缩短发酵时间[1]。此外，利用纤维素酶水解木质素生产乙醇用于化工、能源等方面对于目前的全球资源短缺现状的缓解也具有重要意义。

5纤维素酶在纤维废渣回收利用方面的应用

利用其纤维素酶或微生物,把农副产品、城市废料中的纤维素进一步转化成为酒精、葡萄糖和单细胞蛋白质等产品,这对于开辟食品工业的原材料来源、提供新型能源和变废为宝等方面具有十分重要的价值和意义。例如纤维素酶应用于动物饲料的添加剂、纺织、造纸、医药保健、石油开采、新型能源、环保等领域都具有很大的潜力。

6展望

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关键词：木聚糖酶（DSB）；甘露聚糖酶ManA；毕赤酵母（Pichia pastoris）；共表达

中图分类号：Q19 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）10-1971-02

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.10.043

Co-expression of Two Hemicellulases in Pichia pastoris

YANG Qing1，ZHANG Li1，ZHANG Hua-shan2，XIONG Hai-rong1

（1.College of Life Science，South-central University for Nationalities，Wuhan430074，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract：Based on the directional modification of xylanase（DSB） and mannan（ManA） synthase genes in our laboratory，the co-expression of these two hemicellulases was successfully achieved in a Pichia cell by different integration sites and resistance markers. And the recombinant strain GS115/DSB-ManA was obtained. The thermal stability test showed that the DSB and ManA produced by the co-expressed strain had high thermal stability. The successful expression of the two enzymes of the recombinant strain laid a foundation for the research and production of the complex enzyme preparation.

Key words：xylanase （DSB）； mannanase （ManA）； Pichia pastoris； co-expression

β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）和β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）均属于半纤维素酶，分别水解半纤维素中的β-1，4-木糖苷键和β-1，4-甘露糖苷键。木聚糖为半纤维素中最丰富的一类[1]，在木聚糖酶的作用下可被降解为国际市场上急需的低聚木糖和木糖。甘露聚糖作为半纤维素第二大组分[2]，广泛存在于木材以及植物的块茎和种子中。

随着对半纤维素酶的深入研究，其应用领域也在不断的扩展，并拥有一个广泛的工业酶应用市场，包括食品和饲料、咖啡萃取、生物乙醇生产、杀黏菌剂、制药、纺织、洗涤、造纸、石油、天然气工业及生物技术等领域[3，4]。工业生产中，不仅需要高活力的酶，还需要酶在酸性环境、碱性环境或高温条件下保持稳定的酶学特性[5]，同时也希望减低生产成本而提高效益。本试验研究了木聚糖酶与甘露聚糖酶的共表达，实现了这两种酶在毕赤酵母中的稳定共表达，使工业生产中有效地减少生产成本及相关处理环节。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种与质粒 大肠杆菌Top10细胞、表达载体pAO815hr为中南民族大学生命科学学院实验室保藏与构建。毕赤酵母GS115和表达载体pPICZαA为中国农业科学院饲料研究所惠赠。

1.1.2 工具酶及试剂限制性内切酶 T4 DNA连接酶等工具酶和DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；燕麦木聚糖和角豆胶购自Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract购自于Oxoid公司；无氨基酵母氮源（YNB）、D-sorbitol、Agar购自Biosharp公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 培养基和抗生素 毕赤酵母抗性选择平板YPDSZ（含终浓度100 μg/mL Zeocin），毕赤酵母组氨酸缺陷型选择平板MD，毕赤酵母生长/诱导培养基BMGY/BMMY，大肠杆菌生长培养基LB/LBL，毕赤酵母生长培养基YPD等培养基配方见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。氨苄青霉素（Ampicillin Sodium Salt）购自Biosharp公司；博来霉素（Zeocin）购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 木聚糖酶DSB与甘露聚糖酶ManA重组表达质粒的构建及筛选 采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切木聚糖酶DSB基因和表达载体pAO815hr，连接后转化，涂布于含有氨苄青霉素的LB固体平板上；同样用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切甘露聚糖酶ManA基因和表达载体pPICZαA，连接后转化，涂布于含有博来霉素的LB固体平板上。菌落PCR验证后双酶切鉴定筛选出阳性克隆菌株DSB-pAO815hr-Top10和ManA-pPICZαA-Top10。

1.2.2 木聚糖酶与甘露聚糖酶共表达重组菌的构建及筛选

1）GS115/pAO815hr-DSB重组菌的构建及筛选。采用SalⅠ线性化重组质粒DSB-pAO815hr，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，挑取100个该共表达重组菌的单菌落使用BMGY/BMMY诱导产酶，使用DNS法[6]检测酶活力，依据酶活力高低筛选出酶活力较高的重组菌株GS115/pAO815hr-DSB。

2）共表达重组菌GS115/DSB-ManA的构建及筛选。采用SacⅠ线性化重组质粒ManA-pPICZαA，电击转化GS115/pAO815hr-DSB感受态细胞[7]，按上述方法筛选出共表达重组菌株GS115/DSB-ManA。

1.2.3 GS115/DSB-ManA产甘露聚糖酶与木聚糖酶热稳定性的检测 将发酵上清液在不同温度下准确处理30 min，迅速置于冰上冷却，分别在DSB最适温度（75 ℃）与 pH（6.5）下与木聚糖底物反应和在ManA最适温度（75 ℃）与 pH（6.0）下与角豆胶底物反应，使用分光光度计检测OD540 nm，以每种酶最高酶活力为100%，计算各酶在其他温度处理后的相对残余酶活力，每组试验均重复3次，取平均值作为最终结果。

1.2.4 SDS-PAGE电泳 发酵结束后，取GS115/DSB-ManA与两种酶单一表达菌株的上清液进行SDS-PAGE电泳分析，具体操作方法参考《分子克隆实验指南》第二版。

2 结果与分析

2.1 木聚糖酶（DSB）与甘露聚糖酶（ManA）重组表达质粒的构建

将DSB基因片段连接到pAO815hr上，获得表达质粒pAO815hr-DSB；将ManA基因片段连接到pPICZαA上，获得表达质粒pPICZαA-ManA，物理图谱如图1所示，双酶切验证以上重组质粒构建成功。

2.2 热稳定性分析

如图2所示，GS115/DSB-ManA中木聚糖酶在45～70 ℃下处理30 min能够保持85%以上相对酶活力，但经过70 ℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为明显；甘露聚糖酶在45～75 ℃下处理30 min后仍能保持90%以上相对酶活力，但经过75 ℃以上温度处理后，相对酶活力降低较为显著。

2.3 SDS-PAGE分析

结果（图3）表明，GS115/DSB-ManA发酵上清液中出现两条电泳条带，分别与单一表达DSB和ManA发酵上清液对比。GS115/DSB-ManA能够同时表达出两种半纤维素酶蛋白，且产物杂、蛋白的分泌量偏低。GS115/DSB-ManA分泌木聚糖酶蛋白较分泌甘露聚糖酶蛋白量高。

3 讨论

目前木聚糖酶与甘露聚糖酶已成功应用于工业农业生产的诸多领域，且通常是木聚糖酶和甘露聚糖酶联合使用从而达到协同增效。pPIC9K和 pPICZαA质粒同属于毕赤酵母分泌型表达质粒，本试验通过不同的整合位点和抗性标记实现了DSB和ManA在同一宿主中的整合与筛选，成功构建了共表达菌株GS115/DSB-ManA，实现了目标酶的共同生产，同时检测出其分泌的两种半纤维素酶有较高的热稳定性，为进一步工业化生产复合酶奠定了基础。

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篇5

关键词：阿拉伯/木糖苷酶；木聚糖酶；pET-20b（+）；多功能半纤维素酶；克隆；表达

中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）17-4205-03

Cloning and Expression of a Trifunctional Hemicellulase Using pET-20b in Escherichia coli

PENG Jing-jing

（College of Biology and Enology， Taishan University， Taian 271021， Shandong， China）

Abstract： The structure gene from Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 encoding arabinosidase-xylosidase XarB gene was amplified and ligated into pET-20b（+）， resulting in pET-20b-xarB. The structure gene from Thermomyces lanuginosus DSM 5826 encoding xylanase（XynA） was amplified and ligated into pET-20b-xarB， resulting in pET-20b-xarB-xynA. The trifunctional enzyme （XarB-XynA） was obtained after expression pET-20b-xarB-xynA in Escherichia coli JM109（DE3）. SDS-PAGE analysis showed that the molecular mass of the expressed recombinant XarB-XynA was about 108 kDa， the same as the predicted size.

Key words： arabinosidase-xylosidase； xylanase； pET-20b（+）；XarB-XynA； cloning； expression

农业废弃物是指农业生产和农副产品加工后的剩余物，主要包括农作物或果树的秸秆或枝条、果实外壳、玉米芯、甘蔗渣等，其主要化学成分是纤维素、半纤维素、木质素等，是亟待开发的重要可再生资源。我国每年秸秆产量达6亿t左右，目前大部分秸秆用于燃烧或者被废弃[1]。秸秆中半纤维素的含量占总干重的25%～50%，其化学结构较纤维素复杂，其彻底降解的产物主要是木糖和少量阿拉伯糖、葡萄糖醛酸，可以用作基本碳源生产有机酸、氨基酸、单细胞蛋白、糖醇、工业酶类溶剂或燃剂。

来自嗜热厌氧乙醇菌（Thermoanaerobacter ethanolicus，JW200）的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物进行测试，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分别为每毫克蛋白质180和1 000 U，高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶的活性[2]。疏棉状嗜热丝孢菌（T. lanuginosus DSM 5826）所产生的木聚糖酶A（XynA）属于G/11家族，具有较好的热稳定性，在高温和碱性条件下有效且稳定，没有纤维素活性，具有工业化应用前景，且研究发现，该木聚糖酶优先降解高聚合度的木聚糖链，产物是不同聚合度的低聚木糖，不产生木单糖，这对于生产低聚木糖具有很好的应用价值[3]。同时使用多种克隆的特异水解某一多糖结构的水解酶来降解木聚糖，清洁高效，但工序复杂，成本高。在不改变酶自身优良性质的条件下，如果将有关的水解酶融合串联成一个具有多种水解酶活性的多功能酶，或通过融合标签回收重复利用酶，来提高融合酶的综合效率，这将大大简化工序并降低成本[4-6]。

本研究采用带有T7强启动子的pET系列表达载体，将嗜热厌氧乙醇菌的双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）进行基因融合，得到多功能酶的融合表达质粒pET-20b-xarB-xynA。通过蛋白质工程构建多功能半纤维素酶（XarB-XynA）来促进生物转化，为酶法降解半纤维素的工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株：E. coli DH10B、E. coli JM109（DE3）（购自Promega公司）。

Luria-Bertani（LB）培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L。固体培养基添加终浓度为2%的琼脂粉。

含有双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的重组质粒pHsh-xarB、含有疏棉状嗜热丝孢菌 （T. lanuginosus DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因的质粒pHsh-xynA2由本实验早期构建并保存。质粒pET-20b（+） （购自Novagen 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因组提取 DNA 操作采用分子克隆技术标准方法进行。质粒转化采用电转化方法进行，质粒和PCR产物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit（Qiagen USA）进行纯化。

1.2.2 基因克隆 根据GenBank中嗜热厌氧乙醇菌（JW200）双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）的基因序列（GenBank登录号AF135015）设计引物xarB-N和xarB-C。xarB-N ： 5’- CCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGCCATTATATTTAGAT-3’，下划线为 XbaⅠ酶切位点。xarB-C：5’- CCCGATATC TTTATTCTCTACCCTTACTTCC -3’，下划线为 EcoR V酶切位点。以提取的重组质粒pHsh-xarB为模板， 利用相应的上下游引物扩增双活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB，为提高所扩增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶对模板进行扩增。具体方法见参考文献[2，3]。所得质粒命名为pET-20b-xarB，双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

根据GenBank中疏棉状嗜热丝孢菌（DSM 5826）木聚糖酶A（XynA）基因序列（GenBank 登录号U35436）以及本试验优化的pHsh-XynA2的木聚糖酶A（XynA）基因序列，以重组质粒pHsh-xynA2为模板，设计引物xynA-N和xynA-C。xynA-N： 5’-CCCGATATCATGCAGACTACCCCGA-3’，下划线为EcoR V酶切位点。xynA-C：5’-CCGCTCGAGGCCAACGTCAGCAACA-3’，下划线为为 XhoⅠ酶切位点。

以pHsh-xynA2为模板，利用相应的上下游引物扩增基因xynA，为提高所扩增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶对模板进行扩增。具体方法见参考文献[2，3]。PCR扩增产物电泳检测正确后纯化，将pET-20b-xarB质粒和PCR扩增纯化后的DN段分别用EcoR V和XhoⅠ双酶切，割胶回收DN段和载体酶切产物，乙醇沉淀浓缩，16 ℃下连接6～12 h。连接液转化至E.coli DH10B，挑取阳性克隆，提取质粒用EcoR V和XhoⅠ内切酶酶切验证，得到重组质粒pET-20b-xarB-xynA，双酶切验证正确的质粒送上海美吉生物技术公司测序。

1.2.3 重组蛋白的表达与纯化 重组质粒pET-20b-xarB-xynA电转化到宿主细胞E. coli JM109 （DE3）中，挑取重组单菌落接种于含100 μg/mL的氨苄青霉素的 LB 培养液中培养，至OD600 nm为0.6～0.8，加IPTG至浓度为0.8 mmol/L，继续培养6 h后，离心收集菌体。用50 mmol/L pH为7.5的 Tris-HCl 缓冲液洗涤细胞2次，并用相同缓冲液重悬细胞，置于冰水浴中用超声波破碎仪破碎细胞， 超声条件为50 Hz×15 s×8， 细胞碎片于12 000 r/min 离心10 min，去除上清液即为粗酶液。将粗酶液在60 ℃热处理30 min后，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min去除变性蛋白。

2 结果与分析

2.1 重组质粒pET-20b-xarB的构建

根据GenBank中嗜热厌氧乙醇菌（JW200）双活性阿拉伯/木糖苷酶基因xarB的序列，以重组质粒pHsh-xarB为模板，用引物xarB-N和xarB-C进行PCR扩增，结果如图1A所示，扩增出来的片段与基因实际大小2 355 bp是相符的。

PCR产物验证正确后过柱纯化，并用XbaⅠ和EcoR V进行双酶切，酶切后的pET-20b（+）质粒进行连接，得到重组质粒pET-20b-xarB。重组质粒经EcoR V单酶切后释放出6 000 bp大小的条带，经XbaⅠ和EcoR V双酶切后，释放出2 300 bp大小的条带，与基因大小一致，同时在3 700 bp处有一条带和pET-20b（+）载体酶切后条带大小一致，结果如图1B所示，测序结果表明基因xarB序列与公布的序列完全一致。

2.2 重组质粒pET-20b-xarB-xynA的构建

以重组质粒pHsh-xynA2为模板，以xynA-N和xynA-C为引物进行PCR扩增，将纯化后的DN段与pET-20b-xarB分别用EcoR V和XhoⅠ进行

双酶切，连接后挑选阳性克隆，得到重组质粒pET-20b-xarB-xynA。重组质粒经XhoⅠ单酶切后释放出6 600 bp大小的条带，经XbaⅠ和XhoⅠ双酶切后，释放出2 955 bp大小的条带，与基因（xarB+xynA）大小一致，同时在3 700 bp处有一条带和pET-20b（+）载体酶切后条带大小一致，酶切结果如图2所示。

2.3 重组多功能半纤维素酶的表达及检测

将重组质粒pET-20b-xarB-xynA电转化到宿主细胞E. coli JM109（DE3）中，挑取重组单菌落接种于含100 g/mL 的氨苄青霉素的 LB 培养液中培养至OD600 nm为0.6～0.8，加IPTG至浓度为0.8 mmol/L，继续培养6 h 后，离心收集菌体。以pET-20b（+）转化产物为对照，SDS-PAGE分析结果表明，重组菌均能产生约108 kDa的特异条带，结果如图3所示，与预期的蛋白质相对分子量大小一致。

3 讨论

虽然已有多种木聚糖酶被提纯或基因克隆，并且这些酶在底物特异性热稳定性及酶反应的底物范围等性能方面都各有优势，但是相对于半纤维素结构及其降解的复杂特点，仅靠自然菌种所产酶的单一优良性质仍不能实现农业废弃物的高效利用，也不能满足工业生产的需要。重组酶XarB这个双重活性的酶可与木聚糖酶协同作用彻底降解阿拉伯木聚糖，是工业酶制剂的理想酶源，从而为构建多功能半纤维素融合酶提供一个很好的酶材料。

本研究将来源于嗜热厌氧乙醇菌双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和来源于疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A（XynA）同时构建到pET-20b（+）上，得到融合酶表达质粒pET-20b-xarB-xynA，并且在大肠杆菌里面成功表达。双活性阿拉伯/木糖苷酶（XarB）和木聚糖酶（XynA）融合后所得的杂合酶在降解农业废弃物方面有着明显的优势，将有助于提高农业废弃物的降解效率。

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篇6

关键词： 褐色高温单孢菌 纤维素酶 固定化

一、前言

在化工资源贮藏量不断减少的今天，通过可再生纤维素资源的生物转化生产葡萄糖和乙醇已成为当前研究的热点[1]-[2]。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，其最大的潜在用途是把纤维素类物质酶法水解成葡萄糖。迄今为止，已有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道[3]-[4]，但其中多数以真菌如黑曲霉（Aspergillusniger）和木霉（Trichodermareesei）等为研究对象。由细菌、放线菌所产生的中性纤维素酶和碱性纤维素酶，在洗涤剂工业中的应用已引起人们的高度重视[5]-[6]。有关褐色高温单孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）产纤维素酶的性质，黎海彬等[7]-[8]已做了研究，但对该酶的固定化未见有报道。本研究对发酵的粗酶液进行了纯化，再制备成固定化酶，然后对其最适反应温度、pH值、耐热性及米氏常数等进行了研究，望能为其在工业、农业、轻工业等方面的应用提供一定的理论依据。

二、材料和方法

1.实验材料

（1）菌种

褐色高温单孢菌PE-211（Thermomonospora fusca PE-211）[7]。

（2）试剂

分离介质SephadexG-100（德国Phamacia）；羧甲基纤维素钠（美国Sigma）；牛血清白蛋白为进口分装；其余均为国产分析纯或化学纯。

（3）仪器

高速冷冻离心机（美国贝克曼公司）；紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）；核酸蛋白检测仪、梯度仪、恒流泵、自动部分收集仪（上海沪西分析仪器厂）等。

（4）摇瓶产酶培养基

在Hagerdal Medium[3]中加入质量分数为1.0%的微晶纤维素作为碳源。

2.实验方法

（1）蛋白质含量测定

采用Folin-酚法测定蛋白质含量[9]，以牛血清白蛋白（BSA）做标准曲线。

（2）SDS-PAGE[10]

采用垂直板式不连续系统电泳，分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%，用0.25%（W/V）考马斯亮蓝G-250染色。

（3）壳聚糖的制备[11]-[12]

将虾皮洗净，然后去掉残余的虾肉，用3～4倍量体积的4%的稀盐酸和10%的NaOH反复处理4～5次，每次8～10h，用水洗至中性。所得的白色几丁质加入50%的NaOH，于80℃～100℃下保温处理6～7h后，再水洗至中性，晒干粉碎，过40目筛即得。

（4）粗酶的制备[8]

在装有100ml产酶培养基的500mL三角瓶中接入10ml种子液，于55℃、200r/min下培养24～48h，取培养液以4000r/min的速度离心20min，所得上清液即为粗酶液。

（5）粗酶液的纯化

①硫酸铵沉淀和透析。取粗酶液，加入硫酸铵至30%饱和度，在4℃，10000r/min下离心10min，收集沉淀物，再溶于少量磷酸缓冲液中，透析除盐，制得经硫酸铵沉淀的纯化酶液。

②葡聚糖凝胶层析。葡聚糖凝胶SephadexG-100经充分溶胀后上柱，柱子经0.10mol/L的pH6.0的磷酸缓冲液充分平衡后上样，每6min收集一管，分别测定各管的纤维素酶活。

（6）纤维素酶的固定化[13]-[14]

取一定量的壳聚糖于6%的戊二醛中搅拌2.5h，4℃过夜，然后洗去残余的戊二醛，在交联后的壳聚糖中加入纤维素酶液，室温下搅拌2.0h，于4℃静置过夜，再洗去游离酶，即得固定化酶。

（7）纤维素酶（CMCase）活力的测定及定义[15]

酶活力的测定以羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）作底物，经纤维素酶水解后生成还原糖，然后用DNS（二硝基水杨酸）法测定还原糖的含量，由还原糖的量来求得酶活力的大小。

取0.5ml适当稀释的酶液，与1.5ml质量分数为0.7%的CMC-Na溶液混合，在65℃下反应30min，取出加入3mlDNS显色液，然后煮沸5min，停止反应，冷却，于分光光度计上530nm处比色（空白试验中除酶液事先灭活外，其余条件不变）。

一个酶活单位被定义为在1min内转化底物产生1μmol还原糖（按葡萄糖计）所需的酶量。

（8）固定化酶的动力学

分别在不同的pH及温度下，测定其对酶反应速度的影响，并在不同的底物浓度下测定固定化酶的米氏常数K和V。

三、结果

1.硫酸铵沉淀

发酵粗酶液经离心去除菌体和残渣后，在其上清液中缓慢加入硫酸铵至30%的饱和度，4℃过夜，离心、去除杂蛋白。于上清液中缓慢补加入硫酸铵至80%饱和度，4℃过夜，离心收集沉淀，沉淀物溶于柠檬酸缓冲液中。透析检查无铵离子后，计算其收率为65.73%。

2.第一次SephadexG-100柱层析

经硫酸铵盐析后的透析液加到平衡好的SephadexG-100柱上，再用同样的缓冲液洗脱，洗脱曲线为三个峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ、峰Ⅲ），经检测主要的纤维素酶活力包括在峰Ⅲ中，但SDS-PAGE结果表明还有杂蛋白存在，其纯化倍数为30.87，结果见表1。

3.第二次SephadexG-100柱层析

将第一次洗脱峰Ⅲ合并，进行第二轮SephadexG-100柱层析，纤维素酶活都包括在峰Ⅲ中，SDS-PAGE结果表明酶的纯度很高。将具有纤维素酶活的峰Ⅲ合并，测定每一步纯化操作中的蛋白浓度和酶活力，计算比活力，结果见表1。结果表明，经过SephadexG-100柱纯化后，酶的比活力为54.15IU/mg，提纯倍数为47.50。

4.不同酶量对固定化酶活力的影响

取7份1.5g壳聚糖与戊二醛的交联物，分别加入2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml的酶液，固定化后测定其酶活力，结果见图1。

5.固定化纤维素酶的最适pH

取一定量的固定化酶，分别在pH为5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0下测定其酶活力，结果发现固定化酶在pH为8.5时，酶的活力最高，如图2所示。

6.固定化纤维素酶的最适温度

取一定量的固定化酶，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃下测定其酶活，结果发现固定化酶在温度为70℃时，酶的活力最高。

7.固定化纤维素酶的耐热性实验

取10份固定化酶和原酶，分别置于70℃的水浴中，每间隔10min取出一管，按上述方法测定其酶活力，连续进行100min，结果如图4所示。

8.固定化酶的米氏常数

用等量的固定化酶与不同的底物浓度于65℃下反应15min，测定其吸收值，用双倒数作图法作图，测定酶的米氏常数和最大反应速度，结果见表2。由双倒数作图可知，以CMC-Na为底物，固定化纤维素酶的Km为7.19mg/ml，Vmax为0.132mg/ml·min，而原酶液的Km为7.27mg/ml。

四、讨论

图1结果表明，随着加入酶量的增加，其酶活力随着增大，但当加入的酶量增加到一定程度时，酶活力增加变得缓慢，这可能是由于在酶的固定化过程中，一定量交联后的载体，其活性基团是一定的，结合位点未被饱和之前，固定化酶的活力会随加入酶量的增加而增大，一旦结合位点被饱和后，再增加加入的酶量却不能增加酶活力。

如图2所示，原酶的最适pH值为9.0，可能由于壳聚糖是阳离子型载体，因而固定化酶的最适pH值比原酶要低。

如图3所示，而且固定化酶的热稳定性较原酶高，在60℃～80℃时酶活力都较高。这表明纤维素酶经固定化后，对热的稳定性明显提高。

图4的结果表明，褐色高温单孢菌纤维素酶的耐热性很强，保温100min后，固定化酶的酶活基本保持不变，而且固定化酶比原酶具有较高的热稳定性，由此可以看出，固定化酶的适应性更强，可广泛应用于工业、农业、轻工业等各个方面。

表2结果表明该纤维素酶在固定化后，其米氏常数略有减小，说明纤维素酶经固定化后，与底物的亲和力有所增加。

五、结语

褐色高温单孢菌PE-211纤维素酶经硫酸铵盐析和SephadexG-100柱纯化后，粗酶液被纯化47.5倍，比活力为54.15IU/mg。酶动力学研究表明，固定化酶的最适pH为8.5，最适温度为70℃，且固定化酶在60℃～80℃活力较高；该酶的耐热性强，而固定化酶的热稳定性比原酶强；以羧甲基纤维素钠为底物，固定化酶的K为7.19mg/ml，V为0.132mg/ml·min。

有关褐色高温单孢菌PE-211固定化纤维素酶在解决能源危机及可再生资源利用等方面有待进一步研究。

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篇7

先锋霉素是头孢类抗菌素，于70年代进入医院。它的抗菌范围很广，最初用于治疗金黄色葡萄球菌感染，良好的疗效使之初露锋芒。到了80年代，可以口服的先锋4号(头孢氨苄)和先锋6号(头孢拉定)先后用于临床。于是它被广泛使用，处处充当抗菌的“先锋”，简直大红大紫起来。

实际上，先锋霉素是个“大家族”。这个家族共有三代成员：第一代：头孢噻吩(先锋1号)、头抱噻啶(2号)、头抱氨苄(4号)、头抱唑啉(5号)、头抱拉定(6号)、头孢硫咪(8号)；第二代：头孢孟多、头抱呋新；第三代：头抱噻肟、头孢哌酮(先锋必)、头孢三嗪、头抱他啶。

临床上应用的品种比以上介绍的还要多，但主要作用同第一代品种大同小异。第一代头抱菌素主要适用于革兰氏阳性菌。特别是耐药的金黄色葡萄球菌；第二代头孢菌素的抗菌范围较第一代，对革兰氏阴性杆菌的效果比第一代好，而对阳性菌的效果不如第一代；第三代头抱菌素的抗菌范围更广，对阴性杆菌的作用更强。尤其是可作为绿脓杆菌的克星来使用，但对球菌的作用不如第一代、第二代。弄清了头抱菌素每一代成员和它们不同的作用。在使用时才可以“量材录用”而不致滥用。

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中图分类号:R965.3

文献标识码：A

【摘要】 目的：研究紫草素的提取工艺。方法 用纤维素酶酶解紫草，丙酮液浸提，紫外分光光度法测定其吸收度。采用L9（34）正交设计法进行实验设计。结果 最佳提取工艺: 在pH值5， 1‰的纤维素酶条件下，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。结论 工艺合理、可行，质量可控。

关键词：紫草素 紫草 酶解法 正交试验

Study on Extracting Technigue of Shikonin from Arnebia Euchroma Johnst Optimized by orthogonal design

ABSTRACT:Aim To study a optimum preperation method of Shikonin by extraction from Arnebia Euchroma Johnst.Method Skikonin was extracted by acetone from enzyme decomposed mixture ，determination the absorption in UV .The test are arranged by orthogonal desige with L9（34）. Result The best prepering process is: pH 5，and consistency of the enzymeis 1‰，the enzyme decomposed temperature is 35℃,reaction times 12h, by acetone extraction 3 times .Conclusion The experiment results showed that the preperation method is possible and the quality of the product can be controled.

[Key words]: Arnebia Euchroma Johnst; Skikonin; enzyme ; orthogonal desige

紫草为紫草科植物新疆紫草Arnebia euchroma(Royle) Johnst, 紫草Lithos permumerythrorbizon Sieb et Zucc, 或内蒙紫草Amebia guttata Bunge的干燥根[1],具有凉血、活血、解毒、透疹之功能。而从紫草的根中所提取的紫草色素（萘醌系色素），是一种天然食用色素，还可用于印染、制药、化妆品等工业，近期研究发现其有显著的抗癌作用[2]，有着广阔的研究和开发前景。

大部分中药材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内[3]。纤维素则是?-D-葡萄糖键以1，4-?-葡萄糖苷键连接，用纤维素酶酶解可破坏-D-葡萄糖苷键，从而破坏其细胞壁，进而有利于有效成分的提取[4，5]。根据这一原理，选用纤维素酶酶解紫草，并用丙酮提取紫草色素，紫外分光光度法测定其吸收度，采用正交试验，选择酶解温度、酶解时间、酶解时所需pH值、酶的浓度四个因素，每个因素三个水平，用L9（34）正交表进行实验设计（表1），得出最佳酶解条件。这对提高中药材的利用率，减少浪费，减少药渣的处理和降低生产成本都具有较大的现实意义。

1、实验材料及仪器

1.1 材料：纤维素酶Cellulase(FEINBIOCHEMICA GMBH&CO.广东省药品检验所提供)

紫草干燥的紫色根状物（深圳市医药公司提供）

丙酮（化学试剂CP.级）

1.2 仪器：电子天平AE240 （METTLER）

电热恒温水浴锅 HH.S11-2 （北京长安科学仪器厂）

紫外分光光度计UV-2201 SPECTRO PHOTOMETER （日本岛津）

2、实验方法

2.1 预试验

取碎紫草1g，加丙酮10ml在室温（28℃，以下相同）下浸提取24h，滤过，残渣继续用等量丙酮浸提直至滤液无色，水浴蒸干紫草加入1‰的纤维素酶及10ml蒸馏水，测得pH7，在45℃条件下水浴酶解24h，滤过，所得紫草残渣水浴蒸干，用丙酮10ml浸提24h，滤过，滤液呈浅紫色。

此试验表明，紫草经酶解后提取可提高其提取率，即纤维素酶酶解紫草提高其有效成分的提取率试验具有可行性。

2.2 酶解

取碎紫草500g，分成10份，每份50g编号1～9，置于1000ml烧杯中，按正交表（表2）各加入适量的纤维素酶和蒸馏水550ml，用HCL溶液或NaOH溶液调节适当的pH值，于不同温度下酶解适当时间后滤过，紫草残渣水溶蒸干，同时做一阴性对照试验（实验号为0）。

2.3 提取

将各试验号干紫草分别转移至2000ml的锥形瓶中，各加入丙酮1000ml，密封摇匀，在室温常压下浸提24h，滤过，滤液取样待测。

2.4 检测

2.4.1 量取4号样品0.2ml，用丙酮稀释50倍，用UV-2201紫外分光光度计扫描，测得其吸收峰两个，波长分别为489.3nm和517.3nm，其中最大吸收波长为517.3nm。

2.4.2 按编号各取样0.2ml，用丙酮稀释50倍，丙酮作空白，在室温及λmax=517.3nm下测其吸收度A值。

3、实验结果

3.1 由A=E*C*L（A为吸收度，E为吸光系数，C为被测物浓度，L为吸收池厚度，E、L为定值，即A与C成正比，A值的大小可反映出浓度即提取率的大小），从表2与阴性试验对比可看出，经纤维素酶酶解后紫草色素的提取率有明显提高，即用酶解法酶解紫草提高紫草素的提取率的方案是可行的。

3.2 通过测定，可以初步确定酶解紫草的最佳酶解条件为A2B1C1D1，即T=35℃，t=12h，C=1‰为最佳酶解条件。

3.3 从各个水平的均数极差R看（R的大小反映对指标影响的大小），因素的主次顺序为D－A－C－B，即C因素为主要因素，其它因素则可根据对成本、时间、收益等的综合考虑选取适当的水平，经考虑，决定A2B1C1D1为最佳酶解方案。

3.4 紫草素的最佳提取工艺为在1‰的纤维素酶条件下，控制pH值为5，在35℃酶解紫草12h ，用丙酮液提取3次。经试验，紫草素的提取率达0.9%以上。

4、讨论

4.1 由于纤维素酶是一组多酶体的复合酶，可以切断纤维素中的1.4－β-葡萄糖苷键，使大分子的纤维素降解成分子量较小的纤维二糖和葡萄糖分子，破坏植物细胞壁，使细胞内含物质得以充分释放，因而可以提高紫草色素的提取率。

4.2 在提取过程中，酶解后的紫草均水浴蒸干后再提取，因紫草素具挥发性，在酶解过程中的紫草，紫草素挥发损失可能多于阴性试验中的紫草，这可能造成实验误差。

4.3 在紫草素的提取过程中，对于如何减少紫草素的耗损还有待于进一步探讨。

参考文献

1 中华人民共和国药典委员会.中国药典(2005年版)一部[S]：238.

2 章永红编著.抗癌中药大全［M］.江苏科学技术出版社，2000：427-430.

3 马田田.纤维素酶用于中药提取的初步研究［J］.中草药，1994，25（3）：123.

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翻开一栋木质的老式建筑的横梁，几只肥硕的白蚁正趴在上面大快朵颐。而不久，这栋年代感十足的建筑，也许就会倾塌在这些白蚁的利嘴之下。

但是，这种在2亿年前的二叠纪就出现的生物，也许不久的将来，能为人类在新能源的探索上帮上大忙。广东省昆虫研究所的研究人员正在进行一项“纤维素乙醇白蚁仿生技术研究”，试图通过复制白蚁的特殊基因，将木质纤维素转化为酒精。而酒精（乙醇）是石油等不可再生资源的最佳替代物，有望在未来成为清洁能源的主力军。

木质纤维素可转化为乙醇

广东省昆虫研究所研究员钟俊鸿告诉记者，木质纤维素是太阳能极为重要的贮存形式。地球上每年光合作用可产生1000多亿吨的植物干物质，其中一半以上是纤维素和半纤维素。另外，人类活动产生的废弃物如农业废物，比如稻草、稻壳、麦秆、玉米芯、棉籽壳、甘蔗渣等；食品加工废物，如果皮、果渣等；木材废物，如木屑、树皮等都含有大量的纤维素。

而我国每年产生木质纤维素生物资源的总量约13.92亿吨。其中，农作物秸秆年产生量约7 亿吨；森林采伐剩余物生物量1.09 亿吨；木材加工产出剩余物约 0.418 亿吨；木材制品抛弃物约 0.60 亿吨；灌木林的生物量约为 1.81 亿吨。但是每年如此多的木质纤维素却被白白地浪费掉了。

目前，我国每年汽车年耗油约8000万吨，只需把每年产生的木质纤维素的一半转化为乙醇，其数量就可以超过我国汽油消费总量的2倍以上。虽然现在利用人工的方法也能制造出酒精，但是由于木质纤维素通常被难以降解的木质素包裹，所以转化效率很低。

白蚁可分解木质纤维素

而这一难题在白蚁面前却不值得一提，钟俊鸿说，就像人以五谷杂粮为食一样，白蚁主要以木质纤维素为食。

白蚁肠道的消化功能比大型食草动物还要高效，它就像一座小型的生物反应器――由研磨器（称为咀嚼组织的下颚和前胃）、反应池（消化道）、酶和微生物区系组成。在白蚁的长期进化过程中，它的消化系统已经演变出一套能够高效降解纤维素的肠道微生物群。在白蚁小小的肠道中，它自身产生的纤维素酶与来自微生物产生的纤维素酶高效配合，成为了消化木质纤维素的利器。在一些热带干旱地区，白蚁能消耗掉超过90%的干木，它就像是森林的清道夫一样，是热带地区木质纤维素的重要降解者。

白蚁能够高效地消化木质纤维素，但是它并不能直接产生出酒精。钟俊鸿说，但是如果将白蚁降解木质素的基因，以及白蚁肠道中微生物降解木质素的基因提取出来，移植到工程菌（采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物）上，那么，这些纤维素消化酶就能将木质纤维素降解成单糖，再经生物发酵就能产生乙醇。

找到能力超强白蚁

而目前的重点就是在种类繁多的白蚁中，找到拥有超强“消化”基因的种类，并将这些基因提取出来，通过生物技术增强效能后，再移植到工程菌的身上。钟俊鸿说，为了找到拥有超强消化基因的白蚁，研究室内常年饲养着种类繁多的白蚁，还在室内饲养了100多个白蚁巢，其中有3个巢的年龄已经超过了19岁。此外，研究所还拥有多达3万件白蚁标本。

通过对白蚁进行基因测序，研究人员慢慢找到了白蚁纤维素酶基因性能超强的白蚁种类。研究小组发现，乳白蚁和散白蚁两个属种的白蚁，它们体内白蚁纤维素酶的活性比其他白蚁种类都要出众。

接下来，研究小组开始研究提高白蚁纤维素酶的活性的方法。因为白蚁虽然具有超强的消化木质纤维素的能力，但是在实际应用时，酶的活性越高，产出的效率也越高。经过反复的试验，研究人员找到了提高酶活的窍门――在适当的温度、湿度以及食物的培育下，白蚁纤维素酶的活性会变得更高。而且通过放射线的照射，这些白蚁纤维素酶的活性还能进一步提高。

篇10

1.“狼烟”的危害。①造成环境污染，危害人体健康。夏收、秋收时节，田间“狼烟四起”，城郊烟雾弥漫，对人类的呼吸道及心血管都会造成很大损害。②降低空气的能见度，影响交通安全。秸秆燃烧起来会生成大量的白色固体烟雾，由于固体极小，所以呈粉末状飘散，极大地降低了高速公路、机场等地方的能见度，影响交通安全。③引起火灾。农田秸秆焚烧时一旦出现大火，火势将很难控制，极容易造成巨大的经济损失。④导致耕地生产力下降。焚烧农田秸秆会使土壤中的微生物死亡，有机质变少、板结，给农业的可持续性发展造成巨大的障碍。

2.“狼烟”屡禁不止的原因。我国《大气污染防治法》早已禁止露天焚烧秸秆，但部分地区人们违法焚烧秸秆的情况仍然屡禁不止，我们通过在苏北的农村调研得知，人们之所以违法焚烧秸秆主要有以下几个原因：①随着农村机械化程度的提高，牲畜的需要量大大减少，秸秆饲料的需求也大幅降低。②近年来农村生活水平有所提高，许多农民采用液化气和电等清洁的生活能源，导致农作物秸秆成为“彻底的废弃物”。③秸秆分布零散、体积蓬松，收集运输成本高，产业化程度不高。④秸秆蜡质层较厚，“秸秆还田”后若没有降雨，入土后无法及时腐烂分解，给后续农作物管理造成障碍。

3.废变宝把醇产。以禁为主的措施不能从根本上解决“狼烟”问题，“狼烟”既是环境污染问题，也是资源浪费的问题。秸秆禁烧工作应当由“以禁为主”转变为“疏禁结合”，为秸秆谋出路才是解决问题的根本办法。

秸秆的主要成分为难以降解的纤维素、半纤维素和木质素。纤维素中的六碳糖和玉米淀粉中含有的葡萄糖一样，可以用传统的酵母发酵成乙醇。而半纤维素中含有的糖主要为五碳糖，传统的酵母无法经济地将其转化为乙醇。纤维素乙醇技术正是利用纤维素质生物原料（如秸秆）生产乙醇燃料，这种燃料可以直接替代汽油等化石燃料，还能避免粮食作物生产的大量损耗，所以说，随着化石资源的逐渐枯竭和环境的日益恶化，大力推广这种可再生能源技术已经成为许多国家发展战略的重要组成部分。

目前限制纤维素质生物原料生产纤维素乙醇的主要障碍是纤维素酶发酵活力较低、成本较高。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶的总称，可催化秸秆发酵产生纤维素乙醇。为了降低酶的生产成本，美国能源局2002年为诺维信和杰能科提供资金，开发新型纤维素酶。2012年作为全球生物燃料生产用酶的最大供应商丹麦诺维信推出最新酶制剂产品Cellic CTec3（纤维素酶），最大限度地提高了纤维素酶的发酵活力，降低了成本，确保工厂以最低的总成本生产纤维素乙醇。

作为新型清洁燃料，纤维素乙醇由于能替代传统的以粮食作物为原料的生物乙醇技术，缓解能源危机、保护环境而已得到世界各国政府、企业及研究机构的关注。自上世纪80年代中期，加拿大就开始资助纤维素乙醇研究和开发，logen公司利用麦秆、玉米秆生产纤维素乙醇。美国对纤维素乙醇项目给予政策及资金上的支持，2007年立法指令“要求到2022年每年必须提供160亿加仑（美制加仑：1加仑=3.785 412 L；英制加仑：1加仑=4.546 092 L）的纤维素乙醇”，2008年“农场法案”更是为纤维单质生物燃料的发展提供了强有力的支持。意大利的M&G集团开发的一体化纤维素乙醇生产技术，在欧洲已建成年产4万吨的纤维素乙醇的工业化示范装置。

我国在“863计划”中将纤维素乙醇列为研究课题。中粮集团生化能源（肇东）公司，系统地研究了玉米秸秆为原料的纤维素乙醇生产工艺，并在2006年4月在黑龙江建成了一套年产500 t的纤维素乙醇试验装置。该试验装置以玉米秸秆为原料，采用丹麦诺维信公司的纤维素酶制剂，成功地生产出纤维素乙醇。山东泽生生物科技有限公司与中国科学院过程工程研究所建立了年产3 000 t的纤维素乙醇示范工程。河南天冠燃料乙醇有限公司以玉米秸秆为原料，生产纤维素乙醇，年产量已达30万吨。