凝胶渗透色谱范文
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篇1
中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2013）007-131-02
农药，以造福人类，提高农产品的产量走进了我们的世界，但是随着农药的广泛使用，大量食用含有农药残留的食品会导致机体正常生理功能失调，引起病理改变和毒性危害，它对人类健康，生态环境构成了严重的威胁。食品安全问题已经受到各国政府的密切关注，目前，农药残留分析技术已经不能满足当前社会的需求，GPC-GC/MS在线联用技术具备样品处理简单，分析时间快、溶剂使用量少，定性准确等优势，近几年，逐渐受到食品检测工作者的青睐。在线GPC-GC/MS已经用于粮食、蔬菜、水果、坚果等中的多农药残留分析。
1 在线GPC-GC/MS简介
GPC-GC/MS主要包括两部分：凝胶渗透色谱和气相色谱/质谱。GPC主要目的是去除样品基质中可能干扰目标化物检测的大分子油脂、色素等组分。系统流路图如图1，GPC根据尺寸排阻原理先将分子量较大的脂肪和色素等先从色谱柱中洗脱，通过六通阀位置的切换将这些基质干扰物排出系统，之后将所需检测物质导入试样捕集环中，最后导入GC/MS进行分离检测。
图1 系统流路图
2 在线GPC-GC/MS在农药残留分析中的应用概况
2.1 蔬菜、水果中的农药残留测定
苯氧羧酸类农药凭借其高效、内吸、高选择性的特征广泛用于农业生产中，目前在土壤、水体等环境样品及粮谷类农作物中已经测出苯氧羧酸类农药。张帆等建立了水果中的11种苯氧羧酸类农药在线GPC-GC/MS分析方法。该方法在0.02～0.10mg/kg加标范围内，回收率为66%～112%，相对标准偏差为3.4%～11.5%，定量下限为7～10 g/kg。在柑橘样品中11种苯氧羧酸类农药均有检出；香蕉中检测出2，4-D，含量为0.058mg/kg，其他农药成分未检出。欧阳运富等将蔬菜、水果样品经二氯甲烷-丙酮（1：1，v/v）加速溶剂提取，活性炭柱-氨基柱串联净化结合在线GPC-GC/MS分析了22种农药残留，在0.02， 0.05， 0.4mg/kg 3个添加水平下的回收率为70.5%～107.5%，相对标准偏差为2.1%～8.7%。在线GPC-GC/MS把GPC净化和GC-MS分析检测合二为一，自动化除去为除尽的干扰物质，保证了方法的可靠性和有效性，大大的提高了分析的准确度和有效性。薛丽等利用固相萃取-在线GPC-GC/MS测定了梅菜干中18种有机磷和拟除虫菊酯农药残留，该方法的农药回收率均在80%～120%之间，精密度均小于15%。
2.2 坚果中农药残留测定
吴岩，康庆贺等线GPC-GC/MS测定板栗、松子仁中多农药残留分析。板栗经乙腈-水（4：1，v/v）为提取剂，ENVI-18固相萃取柱净化，除去样品中的大量脂肪和甾醇等干扰基质，在经过在线GPC进一步净化，最后经过GC/MS分析。44种有机磷农药中大部分农药的回收率为65%～120%，相对标准偏差小于15%，检出限为0.002～0.05mg/kg。松子仁也用同样的方法进行了处理，与板栗不同的是提取液经Aluminum-N固相萃取柱净化。28种有机氯农药和拟除虫菊酯农药的回收率为70%～120%，相对标准偏差小于15%，检测限为0.002～0.05mg/kg。固相萃取结合在线GPC-GC/MS有效的解决了低水分高脂质样品前处理复杂、基质干扰严重的难题。
2.3 茶叶中农药残留测定
茶叶作为我国对外出口的传统商品，近年来，欧盟等国对进口茶叶的农药残留限量标准日趋严格。因此，茶叶的农药残留检测成为我们面临的共同问题。李军明等利用乙腈萃取、ENVI-carb固相萃取柱净化结合在线GPC-GC/MS测定了普洱茶、绿茶、红茶、乌龙茶中的153种农药残留量。该方法检出限能够满足欧盟等国的限量要求，为茶叶中的多农药残留提供了检测方法。
2.4 粮食作物中农药残留测定
粮食作物作为人们生活的基本食品，粮食安全与人的生活息息相关，各个国家对粮食中的农药残留都设有严格的限量标准。粮食中含有高的脂肪和淀粉，使得粮食中农药残留的测定样品前处理方法较为复杂。近年利用在线GPC-GC/MS测定粮食中的农药残留减少了样品前处理的繁复过程，缩短了分析时间，挺高了工作效率，减少了溶剂的使用。
3 总结
在线GPC-GC/MS在能够有效的去除复杂基质中的干扰物质，降低背景、改善峰形、减小基质效应。简化了样品前处理、提高了检测的重现性、缩短了分析时间、提高了工作效率、减小了有害溶剂的使用，将成为食品检测中的一颗璀璨明星。
参考文献：
[1] 张帆，付善良，施雅梅，等.在线凝胶渗透色谱/气相色谱-质谱联用法测定水果中11种苯氧羧酸类农药[J].分析测试学报，2013，32（1）：79-83.
[2] 欧阳运富，唐宏兵，吴英，等.加速溶剂萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱联用法快速测定蔬菜和水果中多农药残留[J].色谱，2012，30（7）：654-659.
[3] 薛丽，钟艳梅.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱质谱联用测定蔬菜干制品中的 18 种有机磷和拟除虫菊酯残留[J].现代食品科技，2012，28（8）：1088-1090.
[4] 吴岩，康庆贺，高凯扬，等.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱法测定板栗中44种有机磷农药残留[J].分析化学，2009，37（5）：753-757.
[5] 康庆贺，吴岩，高凯扬，等.固相萃取-在线凝胶渗透色谱-气相色谱/质谱法测定松子仁中的28种有机氯农药和拟除虫菊酯农药[J].色谱，2009，27（2）：181-185.
篇2
关键词：凝胶渗透色谱（GPC）；食品安全；应用
中图分类号： TS213.4 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2017.15.053
随着我国经济的发展和生活水平不断提高，人们对于食品安全问题也日益重视。国家对食品安全检测工作也极为重视。食品安全检测工作最重要的就是样品前处理，样品前处理的好坏直接影响到检测结果的正确性。因此，在食品检测中使用正确的前处理方法，可以提高工作效率和检测结果的准确性。
凝胶渗透色谱是最近十几年迅速发展起来的一种样品前处理方法，因其对分子量大的杂质净化效率高，可重复使用，适用范围广，自动化程度高等特点，在食品检测中应用广泛。
凝胶渗透色谱基于体积排阻的分离机理，通过具有分子筛性质的固定相，来分离分子质量不同的物质。凝胶渗透色谱还可以用于分析化学性质相同而体积不同的高分子同系物[1]。
1 凝胶渗透色谱（GPC）在食品检测中的应用研究新进展
1.1 GPC技术在食品检测中的应用研究新进展
GPC技术常用在食品检测中的样品净化，宋鑫等在检测螃蟹中19种有机氯农药残留时应用全自动GPC-SPE联合净化，样品用乙腈提取，凝胶渗透色谱和氨基固相萃取柱联合净化。用Bio-Beads S-X3凝胶为填料的净化柱，以环己烷―乙酸乙酯（1∶1）为流动相，泵流速为4.7 毫升/分钟，检测波长为254纳米。收集9.0分钟和15.5分钟的流出液，并转至SPE净化。在实验中，对经GPC净化的有机氯农药的收集时间进行了优化，在单独使用GPC时样品净化不完全，与SPE联合使用后净化效果和回收率较好[2]。马杰等建立在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜、水果中有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯类农药，GPC 弥补了QuEChERS 方法净化干扰物质不彻底的问题， 从而降低分析背景， 改善峰形， 提高分析结果的准确性 [3]。黄武等在检测大豆中异丙甲草胺残留量时用在线凝胶渗透色谱法，进行前处理，简化了样品前处理过程，且对环境污染较少，具有高效、经济、快速及简便等优点，显著提高前处理效率，减少分析时间，提高农药残留分析的速度和灵敏度[4]。
1.2 GPC技术在食品检测研究中存在的问题
GPC技术在国外已经普遍应用于样品的前处理，但在我国应用领域较少。GPC作为食品检测中的一种全新的样品前处理技术，能分离大分子类干扰杂质，有效地将大分子类物质从复杂的基质中提取出来。GPC技术优势是可大大降低大分子基质干扰，自动化和标准化程度高，且可以自动浓缩和定容，减少了人工带来的误差，显著提高方法的精密度和重现性。
但GPC技术作为一种新兴技术，在实际应用中还存在一些问题，需要在今后的工作中解决。由于GPC柱子内径比较大，连续处理样品的能力较慢，所需要的溶剂量较大。又因为所收集的样品体积大，对于实验室的浓缩装置要求较高，这大大减慢了实验分析的速度。此外，由于不同物质分子大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异，可能会导致样品分离不完全，较大分子量的物质会提前流出不被收集而影响回收率，一些小分子干扰物会夹杂在样品中而影响净化效果。
2 凝胶渗透色谱（GPC）条件的选择
利用GPC技术进行样品前处理时，所需选择及优化的条件主要是色谱柱的选择，流速的选取以及收集时间的选择，溶剂的选取等。孙磊丽等在测定甘草中16种农药残留时选用填料为中性、多孔的聚苯乙烯二乙烯基苯微球体的S-X3玻璃柱作为GPC净化柱，体积比为1∶1的乙酸乙酯―环己烷溶液作为流动相，流速为5毫升/分钟，前7 分钟收集1份样品，之后每1分钟收集1份样品，共收集28份样品溶液，分别进行质谱检测[5]。吕飞等在检测动物源性食品中17种农药残留时，在线凝胶渗透色谱：色谱柱为Shodex CL NpakEV-200 柱；流动相：丙酮―环己烷（ 3∶7，V/V） ，流速0. 1毫升/分钟，柱温40 ℃，进样量10微升，检测波长210纳米，农药残留组分在线收集时间段：4.35 ～ 6.35分钟[6]。
3 展望
凝胶渗透色谱技术作为一种前处理技术已经普遍应用于样品的净化，S着GPC技术的不断优化应用范围越来越大，国外已经研究出很多种成熟的GPC前处理方法。随着国际形势发展，我国也应该对GPC技术进行研究开发。目前有很多研究都将GPC技术与QuEchERS 前处理等联合使用，使得现在的前处理可以联合处理较为复杂的样品，提高了工作效率和准确度。现在的检测仪器的精密度较高，对样品处理较严格，GPC技术与其他前处理技术联合使用可以去除杂质的干扰，对于精密仪器是一种保护。如在线GPC与QuEchERS联合串联质谱检测可以去除样品里的干扰和基质效应，对样品分析更准确。因此，发展和研究凝胶渗透色谱技术在食品检测方面有广阔的发展前景。
参考文献
[1]栾玉静.凝胶渗透色谱在不同样本检验中的应用和进展[J].刑事技术，2014（04）：41-44.
[2]宋鑫，杭学宇，等.检测螃蟹中有机氯类农药残留的全自动GPC-SPE联合净化气相色谱法[J].职业与健康，2016，32（04）：483-486.
[3]马杰.QuEChERS前处理技术与在线凝胶渗透色谱――气相色谱质谱联用法测定蔬菜水果中20种农药残留[J].食品安全质量检测学报，2016，7（01）：21-26.
[4]黄武. 在线凝胶渗透色谱――气相色谱――质谱联用法检测大豆中异丙甲草胺残留量[J].食品安全导刊，2016，64（03）：126-128.
[5]孙磊丽.凝胶渗透色谱―― 气相色谱串联质谱法同时测定甘草中16 种农药残留[J].分析测试学报，2012，31（12）：136-143.
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中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）02-0339-02
[Abstract]Lactoperoxidase has a natural antibacterial activity， which could be widely applied to food and had good antimicrobial antiseptic effect， such as Dairy and meat products， etc. The paper mainly reviewed the separation and pufication technology of lactoperoxidase including ？salting-out method， ultrafiltration method， coupling aqueous two-phase technology and chromatography technology.
乳过氧化物酶（lactoperoxidase，简称LP）是过氧化物酶的一种，是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，常见于哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分泌物中[1]。乳过氧化物酶在食品行业中应用最广泛的是乳制品，还可将其应用到医药和肉制品行业中，具有较好的抑菌防腐效果。本文主要综述了分离乳过氧化物酶的盐析法、双水相萃取技术、膜分离技术以及色谱技术等。
1.盐析法
盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法，其原理是在高浓度的盐溶液条件下，大量盐离子使水分子浓度相对降低，蛋白质水合作用减弱，分子间相互凝聚沉淀析出，由于蛋白质水合作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物理化学常数有关，所以在不同盐析条件下，不同种类的蛋白质发生聚集沉淀析出程度也不同，因而达到分离目的。盐析法具有操作方法简便、无需大型昂贵设备和成本低安全性高等特点，适用范围十分广泛。通常把硫酸钠、硫酸镁、柠檬酸钠、硫酸铵等用作盐析剂，国内有报道用硫酸铵盐析法分离大豆酸沉蛋白、羔羊皱胃酶和多管藻R-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白。盐析法分离乳过氧化物酶还是较新的技术。
2.双水相萃取技术
双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的具有选择性分配系数，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力（如疏水键、氢键和离子键等）的存在和环境之间的相互影响作用，使物质在上相和下相中的分布状态不同（即分布浓度不同），形成双水相体系。提取某一物质，只需选择适宜的双水相体系，控制合适的条件（pH、双水相体系物质含量等），就可以得到适宜的分配系数，从而达到分离提取的目的[1]。与传统的提取方法比较来看，双水相萃取技术所使用的设备便捷、快速、经济，被分离物质在温和条件下进行快速分离，其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质和核酸等生物活性产品的分离提取，并逐步走向工业化生产进程[2]。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点。国内有研究报道双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等，但是没有应用双水相法提取乳过氧化物酶。利用双水相技术，优化提取牛乳中过氧化物酶提取的工艺条件，为双水相技术在乳过氧化物酶提取分离方面应用，提供基本的技术支撑，有很重要意义。
3.膜分离技术
膜分离技术是一项新兴的高新技术，具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、操作简便、无二次污染、分离产物便于回收且分离效果佳等优点，已被广泛应用于工业中的产品分离、纯化等。常见的膜分离技术有微滤膜、超滤膜、纳滤膜、反渗透膜及离子交换膜[13]。膜分离技术已广泛的应用的乳品工业中，主要应用于乳清蛋白分离回收、乳清脱盐、除菌、酪蛋白浓缩、乳蛋白质分级分离等。膜技术主要是陶瓷膜技术分离酪蛋白和乳清蛋白以及超滤膜技术纯化乳过氧化物酶。
4.色谱分离
色谱分离技术又称层析技术分离，是一种用于分离成分复杂混合物中各个组分的有效方法。原理是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具备不同的分配系数，物质在两相体系作相对运动时，会随流动相一起运动，并在固相和流动相间进行多次反复的分配，从而使各物质达到分离纯化的目的。应用于乳过氧化物酶分离的色谱技术可分为离子交换层析、亲和层析、凝胶层析、吸附色谱和分配色谱等技术，此技术比较成熟，详细介绍一下。
4.1 离子交换层析分离技术
离子交换层析中，基质由带有电荷的树脂或纤维素构成，带有负电荷的为阳离子交换剂，反之为阴离子交换剂。离子交换色谱法分离蛋白质组分原理是依据不同蛋白质组分在一定条件的溶液中带有相应的电荷，根据蛋白质带电荷状态不同会与带相反电荷的离子交换剂的结合，按结合力的大小，在洗脱时从弱到强依次被洗脱下来而得以分离。
4.2 离子交换膜色谱提取乳过氧化物酶
Clovis K. Chiu等（1997）使用固定化磺酸根阳离子交换膜从乳清中分离乳过氧化物酶，此法优点是速度更快，相对于离子交换色谱柱，膜分离使用更小的尺寸；缺点是生产越多的目标物就需要越多的膜，增加生产成本，难以大量生产。Kerstin Plate等2006年提出了用带有阳离子的选择性吸附膜Sartobind S从生产酪蛋白所剩下的的乳清中来提取乳过氧化物酶，此法具有生产快的优点，适用于工业上大规模的生产。Linda Voswinkela等2011年提出使用阴阳离子交换膜色谱法（Sartobind Q and S nano），分两个步骤（先过阴离子交换膜未吸附物质再过阳离子交换膜）通过改变不同的缓冲液及pH值和洗脱液浓度从牛乳清中快速分离BSA，β-lactogloulin，ImmunoglobulinG，lactoperoxidase，lactoferrin多种蛋白，此法生产周期短，适用于工业生产。
4.3 免疫亲和层析（affinity chromatography）
将具有高度特异亲和性的二种物质之一以共价键形式结合到固定相，通过利用与固定相键合的物质具有不同程度的亲和性，将具有特异亲和性的物质成分与其他杂质分离的色谱法。1989年Bodil Langbakk等人使用一种免疫亲和色谱（配基结合免疫球蛋白G）从人乳中分离LP，其过程中LP和配基发生结合，利用含有2% SDS、pH 6.8和0.1 mol/L磷酸钠缓冲溶液，将乳过氧化物酶洗脱下来，从而分离纯化出纯度较高的乳过氧化物酶[3]。
4.4 凝胶层析
凝胶层析又称分子筛，按照分离纯化的物质是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，凝胶色谱又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。GFC主要是根据被分离样品中各组分分子质量大小的不同而进行分离洗脱的一项高效的色谱技术。1963年Peter Z首先使用离子交换色谱从牛乳中分离出LP，之后使用凝胶色谱进一步纯化分离得到纯度较高的LP[4]。2011年，Y. Morita等人以牛奶碱性蛋白为原料，将碱性蛋白溶解于磷酸钠缓冲溶液，先使用SP-Sepharose填料平衡分离，并用0-1.5M NaCl进行洗脱，将所得分离物质收集再使用HiLoad 16/60 Superdex 75 pg进一步纯化得到高回收率的乳过氧化物酶。
参考文献：
[1] 徐长波，王巍杰.双水相萃取技术研究进展[J].化学技术与开发，2009，38（5）：40-44.
[2] 范芳.双水相萃取技术的应用进展[J].化学与生物工程，2011，28（7）：16-20.
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【关键词】食品； 农药残留； 分析；前处理
农药残留，是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。食品中农药残留对于人类健康以及环境的危害，已经引起了世界各国的广泛关注，世界各国对农药残留分析方法提出了准确性、灵敏性、便捷性等方面更高的要求，下面是本人对食品中农药残留分析前处理方法的浅谈。
现代农药残留分析方法通常包括样品前处理和测定两部分，样品前处理是核心。样品测定前的净化、浓缩预处理是农药残留分析的关键，目前常用的预处理方法以传统技术居多，这些技术存在许多不足。近年来，新的样品预处理技术不断出现。这些新技术的共同特点是：高效、快速、预处理简单、节省甚至不用溶剂、样品用量少、易于推广等。
1固相萃取（SPE）
固相萃取是一种基于液相色谱分离机制的样品前处理方法。该法利用固体吸附剂将液体样品中的目标物吸附，与样品中的基体和干扰化合物分离，然后用洗脱液洗脱，从而达到分离与净化目标化合物的目的。
在国内外，SPE技术已被广泛用于农药对水污染的检测[2]。Shepherd等[3]用化学键合C18柱萃取水中莠去津，1.5h可处理12个样品，取水样10mL，检测灵敏度可达0.05ng/mL。Holland等用C18柱分离葡萄酒中74种农药，方法快速，重复性好。任晋等成功地应用在线SPE-LC-MS技术分析饮用水中痕量除草剂。[4]固相萃取也是常用的净化手段。刘长武等采用固相萃取代替传统的液）液萃取技术和柱层析前处理技术，使蔬菜、水果中25种有机氯农药迅速得到分离、净化和浓缩。最后采用双柱ECD气相色谱同时定性、定量[5]。
2固相微萃取（SPME）
固相微萃取是80年代末由加拿大Waterloo大学Pawliszyn和Arhturhe教授提出的一种简便、快捷、无溶剂的样品制备与前处理技术。SPME的原理是利用待测物在基体和萃取相间的非均相平衡，使待测组分扩散吸附到石英纤维表面的固定相涂层，待吸附平衡后，再与气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）联用以分离和测定待测组分。SPME与GC联用适于分析挥发性有机物，通过热解析使待测组分与萃取纤维分离。而对于难挥发的有机物可利用SPME与HPLC的联用技术，通过溶剂解析的作用达到分离效果。
SPME的萃取模式可分为三种：直接法，即将石英纤维暴露在样品中，主要用于半挥发性的气体、液体样品萃取；顶空法，将石英纤维放置在样品顶空中，主要用于挥发性固体或废水水样萃取[6]膜方法，将石英纤维放在经过微波萃取及膜处理过的样品中，主要用于难挥发性复杂样品萃取。
3超临界流体萃取（SFE）
SFE技术利用超临界流体（SF）密度大、粘度小、扩散系数大、兼有气体的渗透性和液体的分配作用的性质，将样品中待测物溶解并从基体中分离出来，同时完成萃取和分离两步操作，分离效率高，操作周期短，无环境污染。超临界流体萃取速度快，几乎不用或少量使用有机溶剂。王建华等报道了一种用超临界流体萃取西红柿、草莓、金橘和柠檬等水果中多种残留有机磷的方法【7】。
4凝胶渗透色谱（GPC）
凝胶渗透色谱基于体积排阻的分离机理，不仅可用来分离和测定小分子物质，而且还可以分析具有相同化学性质但分子体积不同的高分子同系物。
GPC是多农药残留分析中一种常用有效的提纯方法，由于具有自动化程度高，较好的净化效率，以及较好的回收率，被广泛用于含类酯的复杂基体组分。栾扬等介绍了一种简便、快速的用于鱼虾及蔬菜中9种有机氯农药残留的提取方法，配合凝胶渗透色谱法进行净化处理，提取效率高，可避免传统方法中易出现的乳化及多重转移【8】。王兆基采用一种较快速、简单的方法测定蔬菜中菊酯类农药残留物。样本中农残经乙酸酯萃取，凝胶渗透色谱及固相提取净化后，用气相色谱一电子捕获检测器测定，对同一批曾施用菊酯类农药的白菜样本进行化验，本法跟美国食物及药品管理局农药残留标准测定方法所得结果非常吻合。
5微波辅助萃取（MAE）
微波辅助萃取（MAE）是1986年匈牙利学者Ganzler等人通过利用微波能萃取土壤、食品、饲料等固体物中的有机物，提出了一种新的少溶剂样品前处理方法。微波萃取技术是一种萃取速度快、试剂用量少、回收率高、灵敏以及易于自动控制的前处理技术。它利用微波加热的特性对物料中目标成分进行选择性萃取。微波萃取是将样品放在聚四氟乙烯材料制成的样品杯中，加入萃取溶剂后将样品杯放入密封好、耐高压又不吸收微波能量的萃取罐中。萃取罐是密封的，当萃取溶剂加热时，由于萃取溶剂的挥发使罐内压力增加，使得萃取溶剂的沸点大大增加，这样就提高了萃取温度。同时，密封条件下萃取溶剂不会损失，也就减少了萃取溶剂的用量。微波加热过程中萃取温度的提高大大提高了萃取效率。
今后农残检测对象和检测目的物都将发生变化，检测方法将向简便、快捷、灵敏度高的方向发展，同时将加大对农药残留降解技术的研究。同时，加快农药残留标准体系建设，已成为我国当前和今后一段时间农药残留标准工作的重点，对保障农产品和食品安全意义重大。
参考文献：
[1]陈燕清，颜流水.食品中农药残留前处理技术进展[J].江西化工.2004（3）
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[4]任晋，黄翠玲，赵国栋.固相萃取-高效液相色谱-质谱联机在线分析水中痕量除草剂[J].分析化学，2001（08）
[5]刘长武，刘凤枝，翟广书.蔬菜水果中25种有机氯农药残留快速检测方法[J].环境科学学 报，2003（04）
[6]贾金平（JiaJP），何翊（HeY），黄骏雄（HuangJX）.化学进展（ProgressinChemistry），1998，10（1）：74―84
篇5
关键词：食品；农药残留；前处理技术
社会上存在的食品大多数是农作物制作而成的，因此农作物自身质量和安全性对食品的安全性起到很重要的决定作用。但是目前我国在进行农作物种植的过程中，为了提升农作物的产量经常使用一些农药，这些农药的使用，势必会造成食品中有部分农药残留，影响食品安全。针对于这一点就需要采取有效的技术手段对食品中农药含量进行有效检测，并根据检测结果提出针对性解决措施。目前社会上采取的食品中农药残留量检测方法主要是样品前处理技术，针对于此就需要对这项技术手段进行全面研究，保证这项技术得到更好的实施。
1 样品前处理技术
1.1 固相萃取
在对食品中农药残留进行有效检测的时候，要想保证检测顺利进行，还需要对其进行固相萃取，保证在这个过程中相应检测试剂能够与目标化合物进行有效结合，借以保证化合物达到分离和富集的目的。在实施固相萃取过程中，涉及的类型主要三种，在这里笔者就对这三种固相萃取类型进行全面分析。第一，正相固相萃取。在选取正相萃取的方法时，对光谱柱中选取的填料物质大多数是极性物质，这种极性物质的使用能够保证食品内部极性物质不会发生流失的现象。第二，反相固相萃取。与正相萃取方法相反，在这个过程中选取的试剂主要是非极性或者弱极性物质，因此在这个过程中萃取出来的化合物大多数是中等极性或者非极性的化合物。第三，离子交换型固相萃取。与前两种方法相比较，这种萃取方法实施的过程中对萃取柱内物质选取往往介于极性和非极性之间，而且相应物质还携带一部分电荷，在进行萃取的过程中可以通过离子交换树脂进行。但是这种方法在实施的过程中还经常会出现抗体和受体制备困难的现象，这就导致其在实际应用的时候经常会受到限制。
1.2 固相微萃取
这项技术手段和固相萃取之间存在的差异，主要在于这项技术本身就是对化合物进行分离的一个过程，其在实施的过程中能够有效解决固相萃取中出现的孔道堵塞问题，对于这项技术来说，其在实施过程中选取的装置类似于普通样品注射器，在整个过程中选取的萃取试剂大多数是石英纤维，这种石英纤维不仅仅能够保证化合物萃取的顺利进行，对保证其自身萃取质量减少萃取时出现的问题都起到不可忽视的作用。对于固相微萃取来说，其在实施的过程中萃取模式主要分为两种，即直接法和顶空法。在对这两种模式进行选取的时候需要对化合物的状态有一个全面的掌握。一般来说如果化合物的状态为半挥发性气体，选取的模式主要是直接法。但是在对化合物进行萃取的过程中相应的化合物除了半挥发性气体之外，还有挥发性固体和水样等，在这个过程中采取的萃取模式主要是顶空法，并且在进行萃取的时候对其自身涉及的待测物和涂层样品等进行有效控制，保证两者之间能够遵循相溶原则，并且能够达到平衡分配的原则。对于固相微萃取方法来说，其与其他萃取方法相比较，在实施萃取时间上还有很大的提升，这种固相微萃取的方式大多数应用在环境、医学和动植物样品分析中，能够有效检测其中农药残留量。
1.3 微波辅助萃取
微波辅助萃取是1986年匈牙利学者通过利用微波能萃取土壤、食品、饲料等固体物中的有机物，提出了一种新的少溶剂样品前处理方法。微波辅助萃取技术是对样品进行微波加热，利用极性分子可迅速吸收微波能量的特性来加热一些具有极性的溶剂达到萃取样品中目标化合物，分离杂质的目的。与传统的振荡提取法相比，微波辅助萃取具有高效、安全快速、试剂用量小和易于自动控制等优点，适用于易挥发物质如农药等的提取，并可同时进行多个样品的提取。微波辅助萃取中溶剂的选择非常重要，直接影响到萃取结果。由于非极性溶剂介电常数小，对微波透明或部分透明无法进行萃取分离。因此在微波萃取时，要求溶剂必须具有一定的极性，对待测组分有较强的溶解能力，对后续测定的干扰较少。此外也应考虑溶剂沸点因素。常用的萃取剂有：甲醇、乙醇、丙酮、乙酸甲苯、二氯乙烷和乙腈等有机溶剂。用苯、正己烷等非极性溶剂萃取时必须加入一定比例的极性有机溶剂。微波辅助萃取的最佳参数除了萃取溶剂外，还包括了萃取设备、萃取温度及时间的选择。
1.4 凝胶渗透色谱技术
凝胶渗透色谱技术是根据溶质（被分离物质）分子量的不同，通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），使物质达到分离。要求载体具有良好的化学惰性、热稳定性、一定的机械强度、不易变形、流动阻力小、不吸附待测物质、分离范围广（取决于载体的孔径分布）等性质。同时分离效果还与载体的粒度大小和填充密度有关。为了扩大分离范围和分离容量，一般选择几种不同孔径的载体混合装柱，或串联装有不同载体的色谱柱，其中载体的粒度越小、越均匀、填充得越紧密越好。良好的溶剂有利于提高待测物质的溶解度，避免操作时因分析对象的改变而更换溶剂。由于凝胶渗透色谱为液体色谱，则要求溶剂的熔点在室以下，而沸点应高于实验温度，且溶剂的粘度小，以减小流动阻力。另外溶剂还必须具备毒性低、易于纯化、化学性质稳定及不腐蚀色谱设备的特点。此外，分离效率除了载体、溶剂的选择以外，还包括合适的温度和溶质的化学性质的影响。与吸附柱色谱等净化技术相比，凝胶渗透色谱技术具有净化容量大、可重复使用、适用范围广、使用自动化装置后净化时间缩短、简便、准确等优点。
2 食品中农药残留前处理技术的发展前景
样品的前处理是农药残留量检测过程中重要的步骤之一，它对保证测定结果的准确性和可靠性，减少对色谱柱和检测仪器的污染，提高检测效率都具有重要的影响。食品中农药的残留量一般在10-6～10-9（W/W）或更低的水平，除了要求检测方法具有相当高的灵敏度和选择性外，也对样品的前处理技术提出了更高的要求。不同的前处理技术有其各自的优缺点和适用范围，在实际工作中，应根据待测样品种类和基质、测定结果要求和检测仪器的不同，并结合实际条件选用合适的样品前处理方法。
3 结束语
综上所述可以了解到在我国对食品进行农药检测过程中，选取的方法有很多，这些方法的相同点都属于样品前处理技术，对于这些技术手段来说，在实施的过程中还需要对相应食品内部化合物成分有一个全面的了解，并根据相应了解选取有效的技术方法进行农药检测，这样不仅仅能够促使检测更加顺利的进行，对于提升检测结果的质量和其他方面都起到不可忽视的作用。另外在对食品中农药残留进行处理的过程中还能够按照这里涉及的检测方法选取有效的解决措施，保证食品的安全性得到全面提升。
参考文献
[1]吕秀娟.浅谈样品的前处理技术[J].新疆畜牧业.2013（12）.
篇6
【摘要】
目的研究麻疯树酚凝胶剂的制备工艺、质量评价及其体外释药性。方法用卡波姆940做基质、氢氧化钠为中和剂制成凝胶剂；使用改良的franz扩散池，进行体外释药实验。结果制备的麻疯树酚，细腻、光洁透明、稳定性好、释放药物快。结论该凝胶剂配方合理，符合《
【关键词】 麻疯树酚 凝胶剂 扩散池 释放速率
abstract：objectiveto study the preparation and quality assessment ,and the drug-releasing properties of gel containing jatropha curcas phenolic.methodscarbopd-940 was used as base,and sodium hydroxide as neutralizer.the drug-releasing experiments in vitro were carried out in improved franz diffuser.resultsthe geiata was homogenous,transparent and stable.the drugs released quickly.conclusionthe formulation of the gelata is reasonable and coincident with the requirement of chinese pharmacopoeia 2005.this gelata is suitable for remedy of herpes simplex virus type 1.
key words：jatropha curcas phenolic; gel; franz diffuser; drug releasing rate
作为提供生物柴油的热点植物——麻疯树，其综合利用已成为研究的一个重点。我们从麻疯树叶中提取了一种酚类物质，经药效学试验证实，对单纯性疱疹病毒有明显的抑制作用，将其制成中药凝胶剂用于阴道疱疹治疗，有一定的新颖性和实用性。
本研究用水溶性高分子材料-卡波姆制备不同浓度麻疯树酚凝胶剂，并通过对外观、ph值、黏度、稳定性、耐热耐寒实验进行了质量评价及体外释药性研究，确定了最佳处方，以期为麻疯树酚阴道给药新剂型的开发提供依据［1，2］。
1 仪器和药品
1.1 仪器bs1105型 电子 天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；kq、50b型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；w-g71型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；hps、3c型酸度计 （上海伟业仪器厂）；ndj-1旋转粘度计（上海天平仪器厂）；立式扩散池（自制）；79hw-1型恒温磁力搅拌器（浙江乐成电器厂）；uv、1900紫外可见分光光度计（北京普析）；美国waters高效液相色谱仪。waters 515泵，waters 2487双波长紫外可见光检测器，rheodyne 7725进样阀及20 μl进样环。大连物化所wdl-95色谱工作站。waters spherisorb ods（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，c18保护柱，流速1 ml/min，柱温室温。上海亚东0.45 μm微孔滤膜，天津津腾0.45um针筒式微孔滤膜滤过器。
1.2 药品
麻疯树酚对照品（本实验室提供）；卡波姆940（美国bfgoodrieh公司）；无水甲醇( 天津市首世化工有限公司)；1，2-丙二醇(沈阳市化学试剂厂)；氢氧化钠(沈阳市化学试剂厂)；分子量为8 000～14 000的透析膜（millipore） 。
2 方法与结果
2.1 处方及制备方法
2.1.1 原料
本实验室提供。
2.1.2 处方
主药100 g，卡波姆940 18g，氢氧化钠适量，配成1 000 g。
2.1.3 凝胶剂的制备
取处方量的卡波姆940溶于重蒸水中溶胀，并放置过夜，加入处方量的主药混合均匀，用氢氧化钠调节ph至5.5～6.0，最后加入重蒸水至1 000 g，罐装，灭菌［3，4］。
2.1.4 空白基质的配制
分别取卡波姆1.8 g于100 ml蒸馏水中溶胀12 h，制成基质浓度为1.8%的不含麻疯树酚的卡波姆凝胶［5，6］。
2.1.5 制备工艺条件的研究采用正交实验法优选制备，因素水平见表1，正交实验数据及 计算 结果见表2。表1 因素水平（略） 表2 收得率l9（34）正交实验数据及计算结果（略）
根据以上正交实验的数据处理，b1>a3>c1，可知当处方配比为丙二醇（0.0%），卡波姆940（1.8%），无水乙醇（0.0%）时，有较好的收得率，并且该处方有满意的外观性状和黏度，所以选择该处方做进一步研究。
2.2 质量评价［7，8］
2.2.1 麻疯树酚凝胶剂的外观评价
筛选出的处方均为黄褐色半固体，质地均匀细腻，稠度适宜，涂展性好，吸收快，符合《中国药典》2005版有关凝胶剂项下的规定。
2.2.2 ph值取处方约10 g加入25 ml蒸馏水，用hps-3c型酸度计精密测定，ph值在5.5～6.0，适合阴道特殊环境使用。
2.2.3 稳定性实验
取本品10 g置于离心管中，以4 000 r/min离心40 min。无分层现象，有较好的稳定性。
2.2.4 耐热耐寒实验取本品适量，装于密闭小瓶中，放于55℃湿箱中恒湿24h，置冰箱0℃中放置24 h。无分层和霉变现象，该处方耐热耐寒。
2.3 体外释药性研究［3］
采用自制的扩散池进行凝胶释药性测定，扩散池置于恒温磁力搅拌器上的恒温水浴中。供应室与接受室间置透析膜，该膜微孔可通过分子量（m）8 000～14 000的分子，麻疯树酚的分子量<1 000，因此该膜仅作为凝胶剂的支撑膜，不影响药物分子通过膜孔的扩散。在膜与供应室之间放置一环形塑料圈，高0.50 cm，直径2.8 cm，内圆面积s=6.154 4 cm2。内圆中紧密地填放凝胶剂。供体池中加入准确称量的制剂2.5 g，接受池中加入40ml蒸馏水，恒温水浴温度为37℃，在持续搅拌下，分别与1，2，3，4，6h取出接受池中溶液0.6 ml（立即补充等体积37℃蒸馏水），并用30%的甲醇液稀释至2 ml，微孔滤膜滤过，作为待测液。
2.3.1 检测波长的选择
取麻疯树酚适量，加30%甲醇振摇溶解，在uv-1900紫外分光光度计上，200～600 nm波长处进行扫描，最大吸收波长为270 nm及274 nm，经预试并结合 文献 报道，选择274nm为检测波长。
2.3.2 测定方法
取已稀释的待测液10 μm进入高效液相色谱柱，根据结果 计算 累计药物释放百分数和单位面积累计药物释放量。其中hplc条件为：流动相30%甲醇；流速1 ml/min；柱温30℃；检测波长274 nm；保留时间30 min。
2.3.3 数据处理
采用随行标准单点比较法计算供试品中麻疯树酚的含量，再按照下式计算出单位面积累积渗透量：
q=vcn+ni=1vicia
式中q为第n次取样时的单位面积累积渗透量，v为接受池的体积，vi为第i次取样的体积（0.6 ml），ci为第n个取样点浓度（μg/ml）。a为扩散渗透面积（cm2）。以q值为纵坐标，时间t为横坐标进行线性回归所得方程为higuchi方程，其斜率即为透皮速率常数j［μg/（cm2·h）］。
2.3.4 体外药物释放度
供体池中加入准确称量的制剂2.5 g，接受池中加入40 ml蒸馏水，恒温水浴温度37℃，在持续搅拌下，分别于1，2，3，4，6 h取出接受池中溶液0.6 ml（立即补充等体积37℃蒸馏水），并用30%的甲醇液稀释至2 ml，用0.45 μm微孔滤膜过滤后，作为待测液。另准确称取麻疯树酚对照品0.1 g，用100 ml 30%的甲醇溶液溶解定容，作为对照品溶液。分别取已稀释的待测溶液和对照品溶液10 μl进入高效液相色谱柱，根据结果计算单位面积累计药物释放量。结果见表3及图1。
2.4 麻疯树酚凝胶剂体外经皮渗透的影响
由表3和图1可见，麻疯树酚凝胶剂的释药曲线呈线性关系。表3 不同处方单位面积累计药物释放量测定结果（略）
3 讨论
不同浓度的卡波姆940和主药混合时，均有不同的黏度和外观，通过比较发现当基质为卡波姆940，且浓度为1.8%时，有满意的性状，且基质具有无毒、无刺激性、更易涂敷分散，与皮肤有良好的耦合性等特点，释药快，又可延长药物的滞留时间，使药效持久，为较理想基质［6］。
耐热耐寒和稳定性实验表明制剂在高温低温下均稳定，因此储藏要求可相对宽松。
通过释药行为的考察，可知累计药物释放百分率与时间的曲线呈线性关系，说明制剂有良好的释放能力。
通过正交实验及其数据分析，确定了最佳处方，该处方的不仅有良好的释药行为，而且就 经济 而言，也是最合理的，为该制剂的开发提供了实验依据。
ph值对凝胶剂的黏度有较大影响，阴道可耐受的ph为5.0～6.0，综合考虑皮肤和凝胶黏度的因素，将ph选定为5.5～6.0，以氢氧化钠为ph调节剂进行调节，有较好的外观和黏度，且对药物无影响［6，8］。
通过正交实验发现无水乙醇作为增溶剂［6］对制剂的收得率影响不大，可以忽略，原因可能是由于麻疯树酚为水溶性物质，较易溶解于水中。
通过正交实验发现丙二醇作为保湿剂［6］对处方的影响较大，浓度越高，影响越大，而且阴道湿度本身较大，所以综合考虑，处方作为阴道用药，不需要进行保湿。
【 参考 文献】
篇7
【关键词】 双氯芬酸钠 水凝胶 辐射 卡波姆凝胶
卡波姆凝胶是良好的经皮给药骨架控释型药物载体，因其药物释放速率较高而日益受到青睐，笔者通过将辐射制备的双氯芬酸钠水凝胶与卡波姆凝胶药物透皮性进行比较，以评价水凝胶作为经皮给药制剂控释型药物载体的可行性。
1 仪器与材料
Agillent 1100高效液相色谱仪，紫外检测器，自动进样器。100.0%双氯芬酸钠对照品。9cm×9cm×0.2cm 双氯芬酸钠透皮吸收剂（自制）。甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 辐射交联双氯芬酸钠水凝胶与双氯芬酸钠卡波姆凝胶的制备
2.1.1 双氯芬酸钠水凝胶的制备 取1个250ml烧杯，称重。精密称取0.25g双氯芬酸钠，加入PEG 1g、PVP 2g，加100g蒸馏水，超声溶解，制备药物浓度为0.25%Labrasol的含量为1.5%的双氯芬酸钠水凝胶。
2.1.2 双氯芬酸钠卡波姆凝胶配制 精确称取双氯芬酸钠0.25g，置于 50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至50ml，摇匀。称取卡波姆1.0g，加入45ml蒸馏水中，放置过夜，溶胀。加入配制的双氯芬酸钠试液，用15%NaOH溶液调节pH为8.0，加蒸馏水至100g，混匀。同时配制无Labrasol和1.5%Labrasol的0.25%双氯芬酸钠卡波姆凝胶。
2.2 体外渗透实验 取人工皮肤样本（半径为1.1cm）6张，将各人工皮肤固定在改良的Franz扩散池接受室与相应的供应室之间（接受室内径为0.95cm），夹子固定（接受室体积为7ml）。将双氯芬酸钠的1.5%Labrasol水凝胶两份（半径0.95cm）分别加于1、2号，无Labrasol卡波姆凝胶两份加于3、4号，1.5%Labrasol卡波姆凝胶两份加于5、6号扩散池与人工皮肤之间，外敷同面积的保鲜膜，防止水分蒸发，夹子固定。在接受液为10%的乙醇、恒温37.5℃、300r/min搅拌条件下，分别于0.5、1、3、7、12、24h从接受池中取样300μl，同时补充同体积的经37.5℃预热的新鲜接受液。样品离心20min（2000r/min），取上清液测定样品中双氯芬酸钠的含量，并计算单位面积累积透过量（Q）。
3 结果
双氯芬酸钠卡波姆凝胶与双氯芬酸钠水凝胶单位面积的药物累积透皮量与时间的折线图见图1。水凝胶与卡波姆凝胶HPLC测定值及单位面积药物累积透皮量（Q）见表1。可以看出含1.5%Labrasol双氯芬酸钠水凝胶前2h的药物累积透皮量分别是不含Labrasol和含1.5%Labrasol双氯芬酸钠卡波姆凝胶的2.93倍和3.14倍，说明双氯芬酸钠水凝胶药物起效较卡波姆凝胶快，并且24h时含1.5%Labrasol双氯芬酸钠水凝胶药物累积透皮量是含1.5%Labrasol卡波姆凝胶的1.39倍，说明水凝胶较卡波姆凝胶可提高药物释放量。将时间与累积透皮量进行回归，求得回归方程，结果见表2。根据直线方程可以求出药物渗透速率和评价药物透皮能力的表观透皮系数（Kp），见表3。辐射制备的双氯芬酸钠水凝胶与无Labrasol和含1.5%Labrasol 双氯芬酸钠卡波姆凝胶的药物表观透皮系数（Kp×105）分别为71.31±8.12、57.27±2.60和38.57±3.80，辐射制备的双氯芬酸钠水凝胶的（Kp）值是无Labrasol和含1.5%Labrasol双氯芬酸钠卡波姆凝胶的1.25和1.85倍。表1 HPLC测定值及累积透皮量 表2 时间与累积透皮量的回归方程表3 渗透速率和表现透皮系数
4 小结
卡波姆是丙烯酸与丙烯基庶糖交联的高分子合成聚合物，分子结构中含56%～68％的羧酸基团，聚丙烯酸的分子内氢键作用很强，卡波姆具有内在特有的交联结构，其良好的粘滞性和亲水凝胶性使其具有较好的控、缓释作用。
造成水凝胶与卡波姆疑胶透皮性差异的原因，是它与两者内在结构不同引起的。实验结果证实双氯芬酸钠水凝胶的药物透皮性也较卡波姆凝胶好，说明这种制剂满足作为透皮吸收制剂的条件。
【参考文献】
1 祁容，何仲贵.智能水凝胶研究进展及其在医药与生物工程中的应用.沈阳药科大学学报，2001，118（16）：447-451.
2 刘兆民，肖慧.HDPE膜预辐射接枝NIPA/AAC环境制备敏感性水凝胶.辐射研究与辐射工艺学报，2004，22（4）：209-212.
篇8
abstract： in this study, we collected sponge sample from zhanjiang offshore sea area, and sponge ingredient were extracted by organic solvent benzine, chloroform, normal butyl alcohol and ethyl acetate, and identified and analyzed with the spectroscopic technique such as gel permeation chromatography (gpc), gas chromatopraphy-mass spectrometry (gc/ms), liquid chromatograph-mass spectrometer (lc-ms). the data indicates that the sponge has many kinds of compound, and affirms five kinds of compound such as hexanedioic acid， bis(2-ethylhexyl) ester，n-hexadecanoic acid，1,3-cyclopentanedione, 2,4-dimethyl-，1,2-dithiolane-3-pentanoic acid, and 26 kinds of compound molecular weights, but also has many kinds of matter also to wait for further analysis.
关键词： 海绵；分离提纯；化学成分
key words： sponge; purification; chemical component
中图分类号：o69文献标识码：a文章编号：1006-4311（2011）04-0199-04
0引言
海绵中含有丰富的生物活性物质。海绵(marine sponge) 是属于动物界、海绵动物门(spongia)的一类低等多细胞海洋生物。从海水、海底沉积土到海洋动植物,以及一些热泉涌、水热狭缝等,包罗万象的生态圈,造就了海绵共附生微生物一个复杂多样的群体,同时,产生了独特的有别于陆地微生物的多种具有生物活性的次级代谢产物。本研究利用海南丰富的海绵资源，从中筛选出化合物，通过色谱、光谱分析技术鉴定其结构特征，并分析其生物活性。有望筛选出结构与活性不同于其他海洋来源的化合物，为进一步开发新的海洋药物提供生物资源，具有非常重要的意义。
1材料方法
1.1 材料样品采集地：湛江近海海域。样品处理：从海水中采摘健康的海绵样品后，分别置于无菌塑料袋中，一般在2h内送回实验室处理，不能及时送回实验室的则放于冰盒内低温短时间保存。
1.2 试剂与仪器
三氯甲烷分析醇广州化学试剂厂产品
正丁醇分析醇广州化学试剂厂产品
乙酸乙酯分析醇广州化学试剂厂产品
石油醚分析醇天津市福晨化学试剂厂产品
10ml移液枪
hp6890/5973msd 气相色谱—质谱联用仪
hplc高效液相仪/氨基酸分析仪（water 2487 dualλ absorbance detector）
agilent 1100-esquire hct液质联用仪
gpc凝胶渗透色谱仪（分子量测试范围：150—270，000）
真空干燥箱dzx—3型（6020b）宁波海曙赛福实验仪器厂
1.3 实验方法
1.3．1 化合物的提取分离海绵用无菌海水浸洗3遍，然后挤干，以去除表面附着物及夹带的海水微生物。用无菌剪刀进行解剖，用2ml 甘油保存。实验时，用5ml 95%工业酒精浸取3次，每次24小时。提取物冷冻干燥成白色粉末后，将浓缩物分散于5ml水中，再用各2ml，1.5ml，1.5ml石油醚分别提取三次，得可溶物5ml，再用极性逐渐增大的三氯甲烷，正丁醇，乙酸已脂以同样的方法提取三次，各得可溶物5ml，提取余相水溶物5ml。
1.3.2 气相—质谱联用仪测定有机相分别取200μl用于气相—质谱连用仪（gc/ms）进行测定分析。色谱条件为： 色谱柱 hp-ffap（30m×0.25mm, 0.25μm）,60°c ，4°c/min150°c， 6°c/min，250°c，进样温度 250°c，载气 he，分流比 80：1，柱流量 1.0μm/min；质谱条件为：ei源，电离电压 70ev，离子源温度 230°c，扫描范围 40-500aum，进气量 1μl。
1.3.3 高效液相色谱测定有机相冷冻干燥后用于高效液相及液质联用仪进行测定分析。高效液相分析仪条件为：分离系统：waters 2695 separations module，色谱柱：waters c－18（3×15mm），柱温：25±5℃，流动相：甲醇，水梯度洗脱，洗脱条件如表1。
检 测 器：waters 2487 dual λ absorbance detector，检测波长： 254nm，进样量：6μl，控制系统：waters empower 软件。供试品溶液配制：正丁醇萃取液中加入800μl甲醇，三氯甲烷提取物、石油醚提取物以及乙酸乙酯提取物中加入1.3ml甲醇，混匀后以12000转的转速离心15min。取上层溶液待分析用。
1.3.4 液质联用仪测定液质联用仪分析条件为：仪器型号为agilent 1100-esquire hct，色谱柱c18，内径4.60*300mm，流动相甲醇+水梯度洗涤，洗脱条件如表2。
对水溶物做凝胶色谱分析，gpc的条件为：示差检测器 waters 1515+2414，两根柱子串联：型号分别是ultrahydrogeltm120和ultrahydrogeltm500，柱温55℃，检测器温度50℃，流动相：水流速：0.6ml/min。
转贴于中国
中国1.3.5 凝胶色谱测定柱子型号：ultrahydrogeltm500、ultrahydrogeltm120（分子量范围100～40万，双柱串联）。填料：葡聚糖。柱温55℃。流动相：纯水。流动相速度：0.6ml/min。waters 泵1515，示差检测器2414；检测器50℃。
2结果分析
2.1 气相—质谱联用仪（gc/ms ）结果及分析①正丁醇提取液分析（图1）。结果显示正丁醇提取液中含有4种化合物： a）出峰时间在36.02处有一个化合物：结构为：hexanedioic acid, bis（2-ethylhexyl） ester，分子量：370.31，分子式：c22h42o4。b)出峰时间在36.90处有一个化合物：结构为：n-hexadecanoic acid，分子量：256.24，分子式：c16h32o2。c)出峰时间在39.68处有一个化合物：结构为：1，3-cyclopentanedione，2，4-dimethyl-，分子量：126.07，分子式：c7h10o2。d)出峰时间在40.73处有一个化合物：结构为：1，2-dithiolane-3-pentanoic acid，分子量：206.04，分子式：c8h14o2s2。②石油醚提取液分析（图2）。结果显示石油醚提取液中含有1种化合物：tetradecanoic acid。分子量：228.21，分子式：c14h28o2。
2.2 高效液相结果及分析:（ 图均已积分）①正丁醇提取液分析（图3）。②石油醚提取液分析（图4）。③三氯甲烷提取液分析（图5）。④乙酸乙酯提取液分析（图6）。
2.3 液质联用仪结果分析①正丁醇提取液分析（图7、8）。分析结果有八个化合物存在，并占有一定含量。其中以6号化合物感应强度最大，且在一级质谱图中可以明显确定其分子量为565.6（ms m/s:566.6（m+）；588.6（m+na），见图9和图10）。和背景化合物比较,可以确定为新的化合物。其他化合物由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。同时，实验中曾改变紫外波长为210进行比较分析，但是最后由于波长210下的色谱和质谱比较重合性较差，所以选择波长外280的实验结果。但波长210下的分析数据可供参考，为以后进一步研究做参考。见图11。②乙酸乙酯提取液分析（图12、13）。分析结果有四个比较明显的化合物存在，并占有一定含量。但化合物由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。它们的质谱图如图14-17。
2.4 凝胶色谱结果及分析（图18-20）分析结果表明：水相中化合物有两大类，分子量大概在10，000左右和小于100的化合物存在，并占有相当大含量。但由于现有条件无法做出更深一步的判断，待以后深入研究。
以下为凝胶色谱的标准图如图21：
分子量分别为：277000、12900、1460、106。
3讨论与小结
本论文的研究工作主要取得以下结果：①以海绵为分离样品，采用多种分离技术分离得到多种化合物。结果表明，石油醚，三氯甲烷，正丁醇，乙酸乙酯分别能提取到有机化合物，而水相中也能得到化合物。②以气相—质谱联用仪分析技术分离得到hexanedioic acid、bis(2-ethylhexyl)ester、n-hexadecanoic acid、1,3-cyclopentanedione、2,4-dimethyl-，1,2-dithiolane-3-pentanoic acid5种化合物。③石油醚，三氯甲烷，正丁醇，乙酸乙酯提取液经高效液相技术分离共得到26种化合物。其中有些物质是重复的，说明很多化合物可能是同时溶于有机相或同时溶于其中某几项。同时也说明有些化合物的性能或结构是非常相似，在一定程度上比较难以分离，需改进技术或改变方法来进行深一步的研究试验。④以液质联用仪分离技术分离得到12个不同分子量的化合物。其中以分子量为565. 6（ms m/s:566.6（m+）；588.6（m+na））的化合物可以确定为新化合物，因为在色谱库和相关文献中都没提及过该分子量的化合物。以后的研究工作将以此化合物为重点进行研究，相信通过更深入的分析鉴定，能确定该化合物的结果和特征。⑤以凝胶色谱分析技术得到溶于水相中的化合物有两大类，分子量大约在10，000da左右和小于100da，两者都有相当高含量。根据现有条件，估计分子量小于100的化合物中可能有海绵中的一些小分子的酸和碱等化合物，当然也可能是实验的误差，使一些甘油未除尽，所以还有点甘油存在；而分子量在10，000左右的化合物很可能是一些不易溶于以上4种有机溶剂的高分子聚合物，当然也有可能是提纯过程中留下的极小部分的细胞碎片。⑥本研究利用该领域还未有人用气质联用仪，液质联用仪技术来互补分析海绵中的有机物成分，通过对有机相和无机相的分析，对海绵中的化合物分离提取是比较全面的。但是由于客观条件的限制，目前的研究结果中仍存在有未确定的化合物，例如水相中分子量在10，000左右的化合物和质谱中有显示而色谱中未能查到的化合物，及质谱中一些含量不高的小峰所代表的化合物作更深入的研究奠定了一定的基础。
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摘要:目的 探讨不同浓度新型促渗剂壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶的透皮吸收影响。方法 采用改良Frans扩散池进行体外透皮吸收实验。流动相:甲醇乙酸水溶液(pH=3.0)(体积比70∶30),紫外检测波长284 nm。结果 壬代环戊双醚含量在2.0%时透皮吸收最好。结论 壬代环戊双醚具有较好的促渗作用,是较好的新型促渗剂。
关键词:壬代环戊双醚;双氯芬酸钠凝胶;透皮吸收;新辅料
经皮给药系统是目前药剂学研究的热点之一[1]。其可维持稳定持久的血浓,避免胃肠道的破坏及肝脏首过效应,毒性和不良反应小,使用方便。然而在治疗量下许多药物难以渗透皮肤,必须使用促渗剂增加药物穿透性和透皮速率。在实际应用中,常用的有油酸及其酯类、二甲亚砜及其衍生物和氮酮等,其中以氮酮(azone)最为普遍[2]。
本室合成一种新的透皮吸收促进剂――壬代环戊双醚[3],化学名为2正壬基1,3二氧戊环。由癸醛和乙二醇在对甲基苯磺酸催化下脱水环合而成。性状为无色、透明、无毒、略有香味的稀油状液体。其合成方法、药理毒性另文报道。
双氯芬酸钠为非甾体抗炎药[4],口服易引起胃肠道反应,采用经皮给药方法,可以消除其对胃肠道的刺激,但经皮吸收又受到角质层的限制,透皮速率较小,需添加促透剂以改善药物的透皮释药。本文选用双氯芬酸钠为模型药物结合不同浓度的新型促渗剂壬代环戊双醚研究其对药物透皮制剂吸收的影响,考察壬代环戊双醚新型促渗剂的开发价值。
1 试剂、仪器与实验动物
1.1 试剂与仪器
高效液相色谱仪(LC―10A,日本岛津),智能透皮实验仪(TP―2A,南京红蓝电子科技中心),改良Frans扩散池(购自沈阳药科大学),ZD―85双功能气浴恒温振荡器(江苏金坛市富华仪器有限公司),卡波姆940(Carbomer,美国Goodrich公司),双氯芬酸钠(北京双鹤药业有限公司),双氯芬酸钠对照品(购自中国药品生物制品检定所),壬代环戊双醚(本室合成),氮酮(azone,药用,广州化学助剂厂),甲醇(色谱醇,南京汉邦试剂厂),其他试剂均为分析纯。
1.2 实验动物
昆明种小白鼠,体质量20~22 g,SPF级,雌、雄兼用,福建医科大学动物实验中心提供,合格证号为医动字第23―006号(质)。
2 实验方法 1 双氯芬酸钠凝胶剂的制备
取双氯芬酸钠150 g溶解于60 ℃ 1 500 mL丙二醇中,另将150 g卡波姆940加入800 mL蒸馏水中充分溶胀,搅拌下将双氯芬酸钠溶液加入卡波姆基质中,并分别加入质量浓度为0%,0.5%,1.0%,1.5%,2.0%,25%,3.0%的壬代环戊双醚、2.0%的氮酮,用三乙胺调pH为7.5,搅拌使成凝胶状,蒸馏水加至1 000 g,搅匀,分装即得。 2 含量测定 2.1 色谱条件
色谱柱shimpack ODS柱(4.6 mm×150 mm,10 μm);检测波长284 nm;流动相:甲醇乙酸水溶液(pH调3.0)(体积比70∶30);流速:1.0 mL?min-1;柱温为室温;进样量:20 μL。柱效以双氯芬酸钠计,理论塔板数不低于3 000。 2.2 标准曲线的制备
精密称取105 ℃干燥至恒重的双氯芬酸钠对照品50 mg,置于50 mL量瓶中,用流动相溶解定容,振荡摇匀,备用。精密量取标准液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL置于100 mL量瓶中,用流动相溶解定容,振荡摇匀。精密吸取20 μL进高效液相仪测定峰面积,以峰面积(A)为纵坐标与双氯芬酸钠质量浓度(ρ)进行线性回归,得标准曲线方程: A=2377.15 ρ+01152,r=0.9998,线性范围:5.0~30.0 μg?mL-1。 2.3 稳定性试验
取双氯芬酸钠适量,加接收液生理盐水配成高低不同浓度的溶液,分别在0,2,4,8,12,24 h处测定峰面积,RSD分别为0.78%和0.61%。结果表明,双氯芬酸钠在24 h内稳定。 2.4 精密度试验
精密吸取对照品溶液(15.078 μg?ml-1)20 μL,分别于同一日内,不同日内重复进样5次,测得RSD分别为1.19%和2.13%。 3 体外透皮试验 3.1 离体鼠皮的制备
取体质量20~22 g健康小鼠,处死后立即剃除腹部毛,剥离腹部皮肤,除皮下脂肪,用生理盐水冲洗后浸泡于生理盐水中,置于4℃冰箱冷藏,24 h内使用。 3.2 体外透皮试验
试验装置的透皮面积为4.52 cm2,接受池体积为10.05 mL。磁力搅拌器速度为60 r/min,实验温度为(37±0.5) ℃恒温水浴。接受液为生理盐水。
将双氯芬酸钠凝胶均匀涂布于预先处理好的鼠皮上,固定在释放池下端(角质层朝向玻璃管侧),凝胶含壬代环戊双醚的质量浓度分别为0%,0.5%,1.0%,15%,2.0%,2.5%,3.0%和含2.0%的氮酮在1,2,4,6,8,10,12,14 h取样4 mL,立即补充同温生理盐水4 mL,以0.45 μm微孔滤膜过滤,取续滤液,于284 nm处测定峰面积。 3.3 接受液含量测定和累积透皮量的计算
将所测峰面积代入标准曲线方程计算浓度,并量取接受液的体积,按以下公式计算累积释放药量(Q)。 4 统计学方法
数据的录入和分析处理在SPSS l0.0统计软件上完成。不同浓度各时间点累积透皮药量比较采用重复测量的方差分析,用LSD法作多重比较。
3 结 果
体外鼠皮透皮吸收试验结果见表1。表1 含不同浓度壬代环戊双醚和氮酮的双氯芬酸钠凝胶的体外释放量(略)
本实验对含药量相同,但含壬代环戊双醚浓度不同的7种凝胶分别进行6次体外鼠皮透皮吸收试验,经重复测量的分析,表明在6种浓度中,2.0%,2.5%,3.0%组的透皮药量显着高于其他浓度组(P0.05),在时间方面以14 h组最高(P0.05);但是2.5%,30%组的透皮药量与2.0%组的透皮药量差异无显着性。同样2.0%浓度组的氮酮略低于2.0%浓度组壬代环戊双醚(P0.05),两者差异无显着性。
综合考查,ρ=2.0%的壬代环戊双醚对双氯芬酸钠凝胶累积透皮药量较高,选择其为本凝胶的促渗剂。
4 讨 论