凝胶色谱范文
时间：2023-03-21 14:58:51
导语：如何才能写好一篇凝胶色谱，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
关键词 QuEChERS方法； 在线； 凝胶渗透色谱； 气相色谱-串联质谱； 烟叶； 农药残留
1 引 言
为了防治病虫害，烟草在育种、种植、调制和保存期间要使用农药。残留农药会降低烟叶质量，加剧环境污染， 并威胁人类和其它生物的健康[1]。因此，烟叶中的农药残留检测对保证烟叶质量和环境安全具有重要意义。由于烟叶样品基质复杂，其中残留农药含量低（低至ng/g级），因此通常需要样品预处理过程才能进行后续测定[2]。目前，液-液萃取[3]、固相萃取[4]、固相微萃取[5]等方法已用于烟叶中农药残留测定。这些方法存在有机溶剂消耗量大、操作繁冗费时、回收率低等不足。Anastassiades等[6]开发了“快速、简便、经济、高效、耐用且安全（Quick， easy， cheap， effective， rugged and safe， QuEChERS）”的样品前处理技术。QuEChERS方法具有回收率高、稳定性强和被分析目标物范围广等优点，因此在农药残留检测中广泛应用[3]。常规QuEChERS方法在净化步骤中通过离心或过滤将吸附剂与样品液分离，耗时费力。为了克服这一缺陷，本研究组以石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基键合硅烷/四氯化三铁（GCB/PSA/Fe3O4）复合材料为吸附剂，改进了QuEChERS方法[7]，吸附剂可以在磁场作用下与提取液快速分离，具有操作简单、快速高效的优点。
在线凝胶渗透色谱-气相色谱-质谱（GPC-GC-MS）是将凝胶渗透色谱和气相色谱-质谱在线联用的分析检测技术，不但具有抗基质干扰能力强、灵敏度高的优点，而且可以连续自动分析，能提高分析速度和结果的准确性，已被应用于农药残留检测[8～10]。本研究采用改进QuEChERS方法对烟叶样品前处理，以在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱（GPC-GC-MS/MS）检测，选取烟草种植生产中对烟叶质量和烟草制品产品安全有影响的常用10种除草剂、抑芽剂和杀虫剂为代表性化合物，建立了烟叶中农药残留量的快速、准确、灵敏分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
在线GPC-GC-MS/MS系统（日本岛津公司），GPC配有LC-20AD泵，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A3R脱气机和SPD-20A紫外检测器；GC-MS/MS包括日本岛津2010-plus气相色谱和TQ 8030三重四级杆质谱，由FCV-12AH电磁阀实现GPC和GC-MS/MS的在线连接。用Quanta 200 扫描电镜（Quanta 200，FEI，Holland）对材料形貌进行表征。
环己烷和丙酮（色谱纯，韩国德山纯化工有限公司）。所用水由Milli-Q系统（Milford， MA， USA）制得。10种目标物和内标（磷酸三苯酯）均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，以甲苯（必要时添加丙酮或甲醇）为溶剂配制目标物母液（100 μg/mL）。混合标准工作溶液（内标浓度为20 ng/mL）以甲苯配制，并在-20℃下避光保存。采用溶剂热方法制备Fe3O4[7]：在200 mL反应釜内将5.0 g FeCl3・6H2O 溶解在100 mL 乙二醇中并搅拌得到澄清溶液，再加入15.0 g NaAc 和50 mL乙二胺，搅拌30 min，将反应釜于200℃下反应8 h。待反应釜降温后，用水和乙醇清洗产物， 60℃下干燥，备用。制备磁性吸附剂时，将0.4 g GCB、 0.5 g PSA和1 g Fe3O4置于15 mL具盖玻璃瓶内，用5 mL乙腈清洗3次后，将产物在60℃下干燥即可。
2.2 仪器条件
GPC条件：色谱柱为Shodex CLNpak EV-200（150 mm × 2 mm，16 μm）；柱温为40℃；流动相为环己烷-丙酮（70∶30， V/V）；流速0.1 mL/min；进样量10 μL；GPC收集时间为3.30～5.30 min；GC-MS/MS条件：惰性前置柱5 m × 0.53 mm空柱；预柱DB-35 ms（5 m × 0.25 mm × 0.25 μm），分离柱DB-35 ms（25 m × 0.25 mm × 0.25 μm），柱温箱程序：初始温度82℃，保持5.0 min，再以8℃/min升至300℃，保持7.75 min；不分流进样，进样时间7.0 min；高纯He为载气，压力程序：由120 kPa开始，以100 kPa/min升至180 kPa，保持4.4 min，再以49.8 kPa/min恢复至原始压力，保持33.8 min；程序升温进样口程序：120℃保持5 min，以100℃/min升至250℃，保持33.7 min；接口和离子源温度为300℃和200℃；电离源为EI源；电离电压70 eV；溶剂延迟时间15 min；目标物及内标的多反应监测（MRM）参数如表1所示，碰撞气为Ar，压力200 kPa。
2.3 样品制备
本研究建立烟叶提取液快速净化和检测的方法，因此直接采用文献＼[2＼]报道的方法提取烟叶： 称取2.00 g 烟叶于离心管中，加入10 mL水浸润样品；静置10 min后加入10 mL 乙腈和100 μL 内标溶液，振荡2 min；于-20℃下保持10 min后加入5 mL甲苯、4 g 无水Na2SO4、1 g NaCl＼， 1 g柠檬酸钠和0.5 g 柠檬酸氢二钠，振荡2 min后离心5 min，收集上层提取液；提取液的净化和检测方法为：取0.5 mL提取液到装有磁性吸附剂的离心管中，振荡1 min；在磁场下将磁性吸附剂与溶液分离，所得溶液为待测液，可进行在线GPC-GC-MS/MS分析。将不含目标物的净化液浓缩吹干，再加入相同体积、不同浓度的系列标准工作溶液，混匀溶解即得到基质匹配标准曲线。
3 结果与讨论
3.1 磁性吸附剂的表征
如图1a所示， PSA表面光滑，而磁性吸附剂中PSA表面粗糙（图1b），且在PSA颗粒之间也有材料均匀分布，观察是GCB和Fe3O4颗粒（图1c）。Fe3O4能使吸附剂在磁场作用下与样品溶液快速分离，同时PSA和GCB能分离提取液中的杂质。
3.2 GPC收集时间考察
图2为在线GPC-GC-MS/MS系统的示意图。其原理为：样品经GPC柱分离，废液直接排出系统，含有目标物的馏分先被储存在定量环（0.2 mL）中，再全部注入GC。注入GC的样品通过打开溶剂蒸气出口实现溶剂的排出，同时目标分析物在保留在预柱中。待溶剂排出口关闭后柱，温箱开始升温，目标物进入分析柱分离。因此选择收集时间显得尤为重要。目标物的分子量在溴氰菊酯和灭螨蜢之间，因此目标物在GPC上的保留时间也介于二者之间，二者在GPC上的保留时间为3.50和5.08 min。考虑灵敏度和基质去除效果，确定收集时间为3.30～5.30 min。
3.3 改进QuEChERS方法的优化
为了得到较好的净化效果，优化了磁性吸附剂的用量和净化时间（GCB、PSA和Fe3O4之间的质量比为4∶5∶10）。如图3a所示，随着吸附剂用量增加，提取液的颜色由黄色逐渐变为近无色，当吸附剂用量达到80 mg时，继续增加用量对净化效果改善不大。且在考察的范围内，各目标物的峰面积没有变化，这可能是因为在烟叶提取液中含有甲苯，使吸附剂与含苯环目标物之间的相互作用力减弱而引起的。考虑净化效果和吸附剂用量，将吸附剂的用量定为80 mg。在0.5～6.0 min范围内，净化时间对净化效果影响不大，且目标物的峰面积没有变化，这是因为吸附剂在净化时是分散的，可以使吸附快速达到平衡，因此净化时间对净化效果没有太大影响。为了稳定净化效果，净化时间选取1.0 min。
比较了本方法与常规QuEChERS方法的净化效果，如图3b所示，未经净化的烟叶提取液颜色为黄色，经过常规QuEChERS方法净化后，提取液颜色变浅；经过本方法净化后，提取液几乎无色（Ⅲ）。因此，本方法对色素等杂质的去除效果较好。
3.4 方法确认
在优化条件下，考察了方法的检出限、定量限、线性范围和重现性。检出限和定量限为目标物信噪比为3和10时对应的浓度。以目标物浓度及其与内标峰面积之比为横、纵坐标，绘制工作曲线。如表2所示，10种目标物的检出限在0.94～100 ng/L之间，定量限在3.1～34 ng/L之间，线性相关系数R2≥0.9989。本方法提取烟叶的结果与标准方法[11]相同，其中9种目标物（甲氰菊酯除外）的检出限为40～600 ng/L。本方法能显著提高灵敏度，是由吸附剂降低基质干扰和在线GPC-GC-MS/MS提高进样量引起的。
为了考察本方法的重现性，配制3种浓度（各目标物线性范围最低值的2、10和100倍）的样品，以一天内配制的4个样品和连续3天配制的样品进行分析，计算日内和日间相对标准偏差。如表3所示，目标物的日内及日间精密度分别小于15.1%和19.8%，其中目标物在中浓度和高浓度下的日内及日间精密度数值不高于8.5%，低浓度下的日内及日间精密度数值相对较高，这可能是由于测定误差引起的。美国分析化学家学会（Association of Official Analytical Chemists， AOAC）提出[12]，可接受的精密度数值随着分析物的浓度或含量降低而升高。本研究中目标物在低浓度（1.52～4.00 μg/L）下的精密度数值低于21%（目标物浓度为10 μg/L时所能接受的精密度数值），说明本方法的重现性可以接受。
3.5 实际样品分析
为了证明本方法在实际样品中应用的效果，采用本方法和现行标准方法[11]处理3种烟叶样品并进行测定。在样品A中测到了七氟菊酯、二甲戊灵和联苯菊酯，采用本方法和标准方法均无法对其进行定量分析；在样品B中测到了七氟菊酯，两种方法的测定结果为1.06和1.03 μg/L，对氟节胺和联苯菊酯均无法进行定量分析；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，两种方法的测定结果为92.1和92.7 μg/L、108.2和112.2 μg/L以及3.68和3.70 μg/L，对七氟菊酯也均无法进行定量分析。结果表明，本方法与标准方法[11]的检测结果相吻合。样品C中测到的目标物数目最多，给出了其中被测到目标物的典型色谱图。如图4所示，目标物均不存在干扰。同时，对净化前的烟叶提取液直接进行在线GPC-GC-MS/MS分析，检测结果与以上两种方法不存在显著性差异：在样品B中测到了七氟菊酯，其浓度为1.01 μg/L；在样品C中测到了仲丁灵、二甲戊灵和氟节胺，其浓度为92.8， 110.2和3.81 μg/L。
将上述3种样品加标后用本方法测定，将所测量与实际加标量相比得到相对回收率。如表4所示，目标物的相对回收率在68.8%～132.2%之间，不同实际样品中目标物在不同浓度下的回收率相差较大，可能是因为不同产地烟叶样品的基质差异引起的。使用气相色谱-串联质谱检测烟叶中的农药残留时，基质增强效应和基质抑制效应同时都存在[13]，其中含有氨基的极性农药化合物在气相色谱分析时主要表现为基质增强效应（如二甲戊灵和联苯菊酯，回收率最高为132.2%），但含有同一功能基团的化合物由于理化特性的差异所呈现的基质效应也会有较大差别（如七氟菊酯，回收率最低为68.8%），而且同一化合物在不同浓度水平和样品基质下产生的基质效应程度也不尽相同（如甲氰菊酯）[14]。
4 结 论
采用磁性吸附剂净化烟叶提取液，再用在线GPC-GC-MS/MS检测，优化了在线GPC-GC-MS/MS条件和影响净化效果的因素，在最佳的条件下建立了烟叶样品中10种农药残留量的测定新方法，并用于实际烟叶样品的测定。由于磁性吸附剂可以在磁场作用下实现快速回收，且在线GPC-GC-MS/MS系统可以提高进样量。与现有标准方法[11]相比，本方法具有样品前处理过程操作简单、净化能力强、灵敏度高等优点，为日常烟叶样品中农药残留量的测定提供了一种可选择的方法。
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篇2
【摘要】
建立了凝胶渗透色谱（GPC）净化、气相色谱质谱（GCMS）同时测定金银花中33种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。样品中的待测农药组分经乙酸乙酯环己烷混合溶剂（1∶1， V/V）提取、GPC净化去除色素等杂质，GCMS采用全扫描/选择离子监测模式（Scan/SIM）采集数据后进行定性/定量分析。方法的相对标准偏差（RSD）≤16.70 %（6.9～84.6 ng/g，n=5）；5种不同加标浓度下，待测农药的标准加入回收率在57.4%（甲胺磷）～109.9%（马拉硫磷）之间；各农药组分的定性检出限（3σ）为0.10～10.5 ng/g，定量检出限（10 σ）为0.33～20.0 ng/g。
【关键词】 金银花； 凝胶渗透色谱； 气相色谱质谱； 农药残留
Abstract A method was developed for the simultaneous determination of 33 pesticide residues， including organochlorine， organophosphorus and pyrethroid pesticide， in honeysuckle by gel permeation chromatography(GPC) purification and gas chromatographymass spectrometry(GCMS) detection. The pesticides were extracted using mixed solvent of ethylacetate and cyclohexane(1∶1， V/V). The pesticides extracted from sample were separated and purified with matrices such as pigment by gel permeation chromatography. The pesticides were finally separated and detected by GCMS with full scan and selective ion monitor mode simultaneously. The precisions of developed method with relative standard deviation for 33 pesticide were lower than 16.7%(6.9－84.6 ng/g， n=5). The recoveries for 33 pesticide standards spiked samples were between 57.4%(methamidophos) and 109.9%(malathion). Limits of detection(3σ) and quantifications(10σ) of the method were 0.10－10.5 ng/g and 0.33－20.0 ng/g， respectively.
Keywords Honeysuckle; Gel permeation chromatography; Gas chromatographymass spectrometry; Multipesticide residues
1 引 言
中药安全问题，如中药中的有害成分[1]、重金属污染[2，3]、农药残留[4，5]等已引起广泛关注[6，7]。有关中药中农药残留测定方法的研究已有许多报道[4，5，8～10]，但涉及的农药品种较单一，多数仅局限于2000年“中国药典”规定的六六六、滴滴涕和五氯硝基苯，同时测定中药中有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药的方法尚未见报道。
已报道的中药中农药残留检测方法中，多数采用固相萃取（SPE）净化和气相色谱（GC）测定[11～13]。与传统的SPE相比，凝胶渗透色谱（GPC）净化具有自动化程度高、重现性好等优点，适合于中药材、生物等复杂基质中农药残留测定的净化过程。气相色谱质谱（GCMS）不仅能准确定量，而且能定性确证目标组分［14］，避免了GC测定造成的误判和假阳性结果。
金银花为传统中草药，具有清热解毒功效，用量多，用途广，严格控制农药残留量显得尤为重要[13]。本研究结合凝胶渗透色谱和气相色谱质谱技术，建立了同时测定中药材金银花中33种有机氯、有机磷和拟除虫菊酯农药残留的方法。GPC将待测目标农药与样品基质中的大分子物质（如色素等）分离[14～17]，达到分离、净化农药组分的目的；GCMS则根据保留时间和特征离子丰度比进行双重定性，避免误判，SIM模式提高测定的灵敏度和选择性，达到准确定量的目的。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
7890A5975C 气相色谱质谱联用仪（美国Agilent公司）， 配备自动进样器和化学工作站； LC Tech全自动凝胶渗透色谱仪， Bio Beads SX3凝胶净化柱（40 0mm×25 mm×(38～75) μm）； EVAⅢ自动浓缩仪（德国LC公司）； B5200SOT超声波清洗仪（美国Branson公司）； MS2微型旋涡混匀器（德国IKA公司）； 04121离心机（上海手术器械厂）；实验室自制氮吹浓缩装置。
丙酮、乙酸乙酯和环己烷(色谱纯， 美国Fisher公司）; 33种农药标准(购于国家标准物质研究中心)。
2.2 样品预处理
将金银花样品磨碎，过孔径380 μm的筛后准确称取1.0000 g于15 mL聚乙烯离心管中，加入5 mL乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）混合提取剂，混匀，超声波提取10 min后， 3000 r/min离心3 min，取上清液；重复上述操作两次，合并3次提取液，氮吹浓缩至10 mL；0.2 μm滤膜过滤后取5 mL通过GPC进行净化，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）为流动相，流速5 mL/min，收集17～36 min流出物95 mL，用EVA Ⅲ自动浓缩仪浓缩至5 mL，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）定容至0.5 mL，供GCMS测定。
2.3 色谱质谱条件
DB5 ms毛细管柱（30 m×250 μm， 0.25 μm），载气为高纯氦气（纯度≥99.999%）；进样口温度250 ℃，恒压模式，不分流进样，进样量1μL；以甲基毒死蜱作保留时间锁定。色谱柱初始温度50℃，保持1 min，以25 ℃/min升至125 ℃，再以10 ℃/min升至300℃，保持10 min。
电子轰击源（EI），70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；接口温度280 ℃；溶剂延迟3.5 min； 测定模式为全扫描/选择离子监测（Scan/SIM）同时采集模式，表1为SIM模式下的离子分组。表1 SIM离子分组（略）
3 结果与讨论
3.1 多种农药的定性分析
各目标农药的保留时间、特征离子及其相对丰度列于表2。TIon， Q1， Q2和Q3为各农药对应的特征离子，其中TIon为定量离子，R1，R2和R3分别为特征离子Q1， Q2和Q3与定量离子TIon的丰度比值，即特征离子Q1， Q2和Q3的相对丰度。图1为33种农药混合标准的总离子流图（TIC）。实验中首先通过保留时间对样品中33种农药残留进行定性，表2(The peak number is the same as in Table 2).再通过比对样品中各农药特征离子的相对丰度与标准溶液中对应农药特征离子的相对丰度，对目标农药进行进一步确证。
3.2 提取和净化条件的优化
在金银花样品基质中，加入适量的33种农药混合标准溶液，振荡混匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，按2.2和2.3节的操作流程进行样品处理及测定。比较乙腈、乙酸乙酯和不同比例的乙酸乙酯环己烷（3∶1和1∶1，V/V）：各农药的预计保留时间(Expectant retention time for pesticides)。的提取效果。实验结果表明，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）不仅能有效地提取33种农药，同时也减小了基质共提取物对目标农药定性/定量测定的干扰。此外，乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）与GPC流动相一致，因而选择乙酸乙酯环己烷（1∶1， V/V）为农药目标物的提取剂。表2 33种农药的保留时间、特征离子及其相对丰度（略）
通过分时段收集GPC的流出物，发现33种农药主要在16～36 min流出，但16～17 min的流出物仍含有较多色素。为避免色素对目标物测定的干扰，最终选取17～36 min为流分收集时间。实验结果表明： 17～36 min之间的流出物既能保证各农药有较高的回收率，又可避免色素等杂质的干扰，可达到待测组分GPC净化的目的。
3.3 方法精密度
以人工合成样品进行方法精密度实验。准确称取5份各1.0000 g金银花样品，分别加入相同量的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照2.2和2.3节进行目标物提取、净化和测定。33种农药在添加标准浓度在6.9（毒虫畏E）～84 ng/g（毒虫畏Z）范围内的相对标准偏差为5.9%（马拉硫磷）～14%（氯氰菊酯）范围内，各种农药的添加标准浓度，测得的标准偏差、相对标准偏差和定量检测下限详见附表(analchem.cn/table/090832.pdf)。结果表明，在较低添加浓度水平时，各农药组分测定的相对标准偏差小于16.7%。
3.4 方法的准确度
以标准加入回收实验的回收率来验证方法的准确度。准确称取5份各1.0000 g金银花样品，分别在5份样品中加入表4所列浓度的农药混合标准溶液，振荡混合均匀后在－4 ℃冰箱中放置4 h，制备成含适量农药的人工合成样品；然后按照2.2和2.3节进行目标物提取、净化和测定，计算各组分的回收率。以各农药组分的定量离子峰面积对添加农药标准浓度作图，用线性回归的方法对测得的峰面积和标准加入农药浓度进行回归，求得线性回归方程和相关系数。表3列出了33种农药在5个不同加标浓度下的回收率、线性回归方程和相关系数。
结果显示，5种不同加标浓度下，除甲胺磷（57.4%）和敌敌畏（66.0%）外，其它待测农药的标准加入回收率在72.3%（六氯苯）～109.9%（马拉硫磷）之间，线性相关系数r≥0.9855，说明本方法在各组分所添加的浓度范围内，各组分的回收率是稳定的。表3 33种农药的加标加入回收结果（略）
3.5 方法检出限
以3倍信噪比(S/N)计算33种农药的定性检出限（LOD）， 10倍信噪比计算定量检出限（LOQ）。33种农药的检出限列于表3。33种农药的定性检出限为0.10～10.5 ng/g，定量检出限为0.33～20.0 ng/g。 结果表明，本方法自动化程度高、选择性较好、检出限低，具有稳定的回收率和较小的相对标准偏差，可满足典型中药金银花中多种农药残留测定的要求。
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篇3
[关键词] 热毒宁注射液；聚山梨酯80；高效凝胶色谱-蒸发光散射法；质量控制
[收稿日期] 2014-03-06
[基金项目] 国家“重大新药创制”科技重大专项（2013ZX09402203）
[通信作者] 萧伟，研究员级高级工程师，博士，研究方向为中药新制剂的研究与开发，E-mail：
[作者简介] 沈娟，工程师，主要从事中药材规范化种植与质量标准研究，Tel：（0518）81152322，E-mail：
聚山梨酯80收载于美国药典、欧洲药典和《中国药典》[1]，又名吐温-80，化学名为聚氧乙烯去水山梨醇单油酸酯，是一种稳定的非离子型表面活性剂[2]，可用作乳化剂、分散剂、增溶剂或稳定剂等，被广泛应用于药物和食品。很多中药注射剂在制备工艺过程中因挥发性成分增溶的需要加入了聚山梨酯 80。近年来研究发现，聚山梨酯 80的浓度在0.5%以内安全性较好[3]，故中药注射剂中聚山梨酯 80的检测与控制对于保证临床用药安全具有重要意义[4-5]。热毒宁注射液处方由栀子、金银花、青蒿3 味药材组成，具有清热、疏风、解毒等功效。制剂中因青蒿药材挥发性成分的有效利用，使用了聚山梨酯 80作为增溶剂，故增加了制剂中聚山梨酯 80的检测。关于聚山梨酯 80的含量测定已有一定的文献报道[6-9]，采用硫氰酸钴铵显色法测定聚山梨酯 80时会出现显色干扰，影响检测结果。本文建立了高效凝胶色谱串联蒸发光散射法测定热毒宁注射液中聚山梨酯 80的含量测定方法，该方法方便、快捷，可用于热毒宁注射液中聚山梨酯80的含量测定。
1 材料
Agilent-1200液相色谱仪及工作站，Alltech 3300 ELSD，METTLER AE240电子天平；氯仿（分析纯，南京化学试剂有限公司），水为重蒸馏水，聚山梨酯 80（注射级，南京威尔化工有限公司）。热毒宁注射液（江苏康缘药业股份有限公司，批号100906，101011，110702，110703，110704，110705，110708，110710，110711，110714）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 TSK G4000 PWxl 凝胶色谱柱（300 mm×7.8 mm，10 μm）；以水为流动相；流速0.7 mL・min-1；柱温30 ℃；ELSD 检测条件： 漂移管温度55 ℃ ， 氮气流速2.0 L・min-1，增益 1.0；进样体积20 μL。
2.2 对照品溶液的制备 精密称取聚山梨酯 80适量，加水溶解并稀释成每1 mL含50 mg的对照品贮备液。量取上述贮备液适量，用水稀释成每1 mL含5.068 2 mg的聚山梨酯 80对照品溶液，摇匀，备用。
2.3 供试品溶液的制备 精密吸取供试品5 mL置分液漏斗中，加入氯仿萃取5次，每次10 mL，小心分取氯仿层（不能混有水层），合并氯仿液，挥干，残渣加水溶解，转移至5 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
2.4 阴性样品溶液的制备 取不加聚山梨酯 80工艺制得样品同供试品制备法制得溶液。
2.5 阳性样品溶液的制备 精密称取聚山梨酯 80约10 mg，加入5 mL水溶解，转移至置分液漏斗中，按2.3项下自“加入氯仿萃取5次”起，同法制备溶液，作为阳性样品溶液。
2.6 专属性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图，见图1。供试品溶液分离度好，达到定量要求，阴性样品的色谱图在聚山梨酯 80保留时间的相应位置上无峰出现，表明此方法专属性强，阴性无干扰。
2.7 线性关系考察 精密量取上述贮备液0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL至10 mL量瓶中，加水稀释至刻度摇匀，进样10 μL。测定峰面积，以浓度 对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标，绘制标准曲线。对数方程Y=1.737 9X+2.012 8，R2+=0.999 3。表明本法在1.013 64～15.204 6 g・L-1具有良好的对数线性。
2.8 精密度试验 精密吸取110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作，进样20 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果聚山梨酯80峰面积的RSD 1.9%，表明仪器精密度良好。
2.9 样品稳定性试验 精密吸取110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作，在0，2，4，8，12，24 h进样20 μL，测定峰面积。结果样品面积的RSD 0.99%，表明本法在24 h内有良好的稳定性。
2.10 重复性试验 精密吸取6份110703批次热毒宁注射液样品5 mL按供试品溶液的制备项下操作。进样，每次20 μL，测定峰面积并计算含量和RSD。结果热毒宁注射液中聚山梨酯80的平均质量分数为1.89 g・L-1，RSD 2.1%。表明本法具有良好的重复性。
2.11 加样回收率试验 采用加样回收法。精密吸取已知含量的110703批次热毒宁注射液样品6份各2.5 mL，精密加入聚山梨酯 80对照品适量加水至5 mL，按供试品溶液的制备项下操作，吸取20 μL进样。测定峰面积并计算回收率，见表1，聚山梨酯80的平均回收率为99.37%，RSD 0.67%。表明本法回收率符合含量测定要求。
2.12 样品测定 通过对聚山梨酯 80的线性、精密度、稳定性、重复性和回收率等进行考察，证明该方法可以用于测定聚山梨酯 80含量。按上述方法，测定10批热毒宁注射液成品中聚山梨酯 80含量，见表2。
3 讨论
3.1 测定方法的选择 TSK-GEL Wxl 的填充色谱柱是一种高水相的凝胶色谱柱，用于分析和制备水溶性的物质，例如蛋白质、酶、核酸。蒸发光散射检测器可以检测不挥发的成分，其响应值与光学性能和官能团无关。聚山梨酯80是一种大分子物质，不具有紫外末端吸收和不挥发的特性，因此选择用高效凝胶色谱串联蒸发光散射检测法检测热毒宁注射液中的聚山梨酯80。
3.2 流动相组成和比例的选择 试验过程中比较了乙腈-20 mmol・L-1醋酸铵（10∶90）、乙腈-20 mmol・L-1醋酸铵（5∶95）、20 mmol・L-1醋酸铵水溶液、水溶液，结果表明以水溶液为流动相时色谱峰分离度高，峰形较好。
3.3 色谱柱比较 本实验比较了Phenomenx poly Sep-GFC-P1000，Phenomenx Bio Sep-SEC-S2000，Waters UltrahgdrogelTM 120，TOSH TSK-GEL G1000PW，TOSH TSK-G2000SWxl和TOSH TSK-GEL G4000PWxl色谱柱，结果TOSH TSK-GEL G4000PWxl（可检样品相对分子质量2 000～300 000）色谱柱对聚山梨酯80的分离效果更佳。
中药注射液成分复杂， 部分品种不适合直接上凝胶柱进行分析， 样品的前处理方法十分重要， 需视具体情况进行， 热毒宁注射液根据干扰成分的性质采用液-液萃取方法去除干扰，保证了该测定方法的准确性；该方法的建立也间接的控制了热毒宁注射液的安全性和有效性。
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Determination of polysorbate 80 in Reduning injection by HGPC-ELSD
SHEN Juan， ZHANG Qiao， LI Jia-chun， BI Yu-an， WANG Zhen-zhong， XIAO Wei
（1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co.， Ltd.， Lianyungang 222001， China；
2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process， Lianyungang 222001， China）
[Abstract] Objective： To establish the method for determining polysorbate 80 in Reduning injection by HPLC-ELSD， and to control the mass of polysorbate 80 in Reduning injection. Method： It was performed by HGPC-ELSD with TOSHTSK-GEL G4000PWxl （7.8 mm×300 mm，10 μm）. Water was used as mobile phase， the flow rate was 0.7 mL・min-1， and the temperature was set at 30 ℃. The evaporated light scattering detector was adopted. The drift tube temperature was 55 ℃， and nitrogen was used as carrier gas， with the flow rate of 2.0 L・min-1 and gain of 1.0. Result：The calibration curve showed good linearity of polysorbate 80 in the test range from 1.01 to 15.20 g・L-1（r2+=0.999 3）. The recovery rate was 98.10% with RSD of 2.0%.Conclusion： The method is simple， rapid， accurate and reliable and suitable for the determination of polysorbate 80 in Reduning injection.
篇4
【关键词】 羊藿苷；乳增宁胶囊；高效液相色谱法；含量测定
Abstract：Objective To develop a method for determining the content of icariin in Ruzengning Capsules. Methods A HPLC method was set up to with Hypersil ODS C18 (4.6 mm×250 mm， 5 μm) column， and methanol-water (70︰30) as mobile phase， the UV detection wavelength was 275 nm and the flow rate was 1.0 mL/min. Result The calibration curve was showed good linearity (r＝0.999 8) within the range of 0.105～0.840 μg and the average recovery was 99.5%， RSD was 1.27% (n＝6). Conclusion The method is simple and rapid， and with good reproducibility for the determination of icariin in Ruzengning Capsules.
Key words：icariin；Ruzengning Capsules；HPLC；content determination
乳增宁胶囊由艾叶、羊藿、柴胡、川楝子、天门冬、土贝母6味药材经加工制备而成，具有疏肝解郁、调理冲任的功效，临床上用于肝郁气滞型及冲任失调型的乳腺增生等的治疗[1]。本试验参考文献[2-3]的方法，以高效液相色谱(HPLC)法测定乳增宁胶囊中羊藿苷的含量，拟建立简便快捷、专属性和重复性均较好的含量测定方法。
1 仪器与试药
日本岛津LC-10ATvp型高效液相色谱仪；SPD-20Avp型紫外检测器；KQ-100DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。羊藿苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号110737-200312)；乳增宁胶囊(市售，批号分别为070901、080301、080302、080303)。甲醇为色谱纯；其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(70︰30)；检测波长：275 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：(30.0±1)℃；保留时间：约为10 min；进样量：20 μL；理论塔板数按羊藿苷计应不低于2 000。
2.2 对照品溶液的制备
精密称取羊藿苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含25 μg的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备
取本品装量差异项下的本品内容物，研细，混匀，精密称定约0.5 g，置50 mL棕色量瓶中，加入70%乙醇约40 mL，超声处理20 min(功率100 W，频率40 kHz)，取出，放冷，加70%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 空白试验
取处方项下除羊藿以外的其余药材，按供试品溶液的制备方法制备阴性溶液，按上述色谱条件分析。在与对照品的相应位置上，无明显其他峰出现。见图1。
2.5 线性范围考察
配制52.5 μg/mL的羊藿苷对照品溶液。分别精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL转移至10 mL棕色量瓶中，用甲醇定容。分别精密吸取上述溶液各20 μL进样。以羊藿苷对照品量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y＝1.288×106X－3 479.602，r＝0.999 8。结果表明，羊藿苷对照品在0.105～0.840 μg范围与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度试验
取同一对照品溶液重复进样6次，测定，羊藿苷平均峰面积为722 896，RSD＝0.41%(n＝6)，结果表明精密度良好。
2.7 重复性试验
取同一批供试品(批号070901)进行6次平行的供试品溶液制备与测定，结果羊藿苷平均含量为1.126 6 mg/粒，RSD＝0.82%(n＝6)。
2.8 稳定性试验
取同一批供试品(批号080301)适量，按上述方法制成供试品溶液，放置0、1、3、6、10、20 h，分别进行测定，结果平均峰面积为547 734，RSD＝2.83%，表明供试品溶液在20 h内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取已知含量的同一批样品粉末6份，各约0.1 g，分别加入羊藿苷对照品溶液(0.216 mg/mL)1.0、2.0、4.0 mL，按供试品溶液制备方法制备供试液。照上述色谱条件进行测定，计算回收率，结果见表1。表1 羊藿苷回收率试验结果（略）
2.10 样品含量测定
取3批样品，按供试品溶液制备方法制备供试液，依上述色谱条件测定样品中羊藿苷的含量，测定结果见表2。表2 3批样品羊藿苷含量测定结果(略)
3 讨论
本试验曾考察了多种流动相：甲醇-水(15∶85)、乙腈- 0.4%磷酸(13∶87)、3%甲酸-甲醇(79∶21)和甲醇-0.5%醋酸(70∶30)等，结果发现甲醇-0.5%醋酸(70∶30)能够达到分离效果，且出峰时间适中，峰型较好。本试验对超声提取时间进行了比较，加入50%甲醇分别超声提取10、20、30、40 min，结果显示，羊藿苷在20～30 min提取完全，为了便于操作、提高检验效率，将超声时间确定为20 min。此方法简便快捷，重复性和稳定性均较好，操作简便，可用于乳增宁胶囊的质量控制。
参考文献
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篇5
硝磺草酮（Mesotrione），化学名2（4甲磺酰基2硝基苯甲酰基）环己烷1,3二酮，又名甲基磺草酮、硝磺酮，是瑞士先正达公司发明的玉米田芽前和苗后广谱选择性除草剂，因具有低毒性、高活性、对环境友好等特点\[1,2\]，是近几年广泛使用的除草剂。但最近研究发现，硝磺草酮具有高效的起始活性和残留活性，长期食用含有硝磺草酮残留的食物会对人畜产生致癌作用，或引起胎儿畸形\[3,4\]。欧盟和世界贸易组织对浆果、亚麻籽、越橘、栗草料等物质中硝磺草酮的限量为0.05 mg/kg。而美国、加拿大等国对芦笋、草杆、草料等物质中硝磺草酮的限量为0.01 mg/kg\[10～13\]。
目前，检测硝磺草酮的方法主要有高效液相色谱法\[5～8\]、荧光检测法\[9\]、液相色谱核磁共振和液相色谱质谱法\[10\]。高效液相色谱法专属性差，而液相色谱核磁共振和液相色谱质谱法主要用于硝磺草酮代谢的研究，并且检出限不能够满足检测要求（0.01 mg/kg）。本研究采用液相色谱串联质谱方法检测食品中硝磺草酮，本方法的检出限为0.01 mg/kg，能够满足检测要求。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂 API4000液相色谱串联质谱（美国AB公司）；凝胶色谱（美国J2公司）；涡旋混合器（美国Vortex.Genie）；旋转蒸发仪（日本Eyela N1100）；高速离心机（上海安亭公司）；MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、环己烷（色谱纯，德国Merck公司）；硝磺草酮标准品（德国Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥99.5%），根据需要用甲醇配制成适当浓度的标准工作溶液（0～4 ℃保存）。其它试剂为国产分析纯试剂，实验用水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法 （1）提取 称取（粮谷、水果、蔬菜、肉类）样品试样2.00 g于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈水（3∶1,V/V）溶液，用NaOH溶液调至pH 7～8，超声5 min，加入2.0 g NaCl，涡旋混匀，以10000 r/min离心4 min，将上清液转移至鸡心瓶，在40 ℃旋转蒸发至约1 mL；将液体转移至试管中，以6 mL乙酸乙酯环己烷（1∶1,V/V）分3次洗涤鸡心瓶，合并洗涤液于试管中，用环己烷乙酸乙酯（1∶1,V/V）定容至10 mL，过0.22
SymbolmA@ m滤膜，待净化。（2）净化 凝胶色谱（GPC）净化：Bio Beads SX3凝胶净化柱（700 mm×25 mm）；流动相：乙酸乙酯环己烷（1∶1,V/V）；流速：3.0 mL/min；样品定量环：10 mL；预淋洗时间：10 min；凝胶色谱平衡时间：5 min；收集时间：15～24 min。将10 mL待净化液按此条件进行凝胶色谱（GPC）净化，收集组分于40 ℃旋转蒸发至约2 mL，待固相萃取净化。 固相萃取（SPE）净化：将浓缩液流过活性炭柱（预先用6 mL甲醇活化），用15 mL甲醇洗脱，收集流出液及洗脱液，40 ℃旋转蒸发至近干，用甲醇定容至1.0 mL，过0.22
SymbolmA@ m滤膜，供液相色谱串联质谱测定。（3）测定 液相色谱串联质谱条件：ZOREAX SBC18色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5
SymbolmA@ m）；
[FQ（7\.30,Y－WZ][HT6][HJ*4]表1 硝磺草酮选择离子对和优化参数
Table 1 Selected ion pair and optimized parameters of mesotrione
[HT6][BG（][BHDFG4*2,WK6,WK7。2,WK6,WK7W]药物Compound母离子Precursor ion（m/z）子离子Daughter ion（m/z）去簇电压Declustering
potential
（V）碰撞能量
Collision Energy
（eV）
硝磺草酮
Mesotrione
338.0290.9
Symbolm@@ 32.3
Symbolm@@ 12.4338.0211.9
Symbolm@@ 31.3
Symbolm@@ 42.5[BG）F][HT5”][HJ]
流动相：甲醇0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序：0～5 min, 10%～50%甲醇; 5～10 min, 50%～95%甲醇；10～15 min, 95%～50%甲醇。流速：200
SymbolmA@ L/min；柱温：30 ℃；进样量：10
SymbolmA@ L。质谱条件：电喷雾离子源；负离子扫描方式；多反应检测方式（MRM）；其它质谱条件见表1。选择离子m/z 338.0/290.9为定量离子对。
3 结果与讨论
3.1 凝胶色谱净化条件的选择 食品样品中含有的脂肪、色素等杂质干扰分析结果，GPC能有效去除这些干扰物，常用于食品中农药残留的净化\[11\]。本实验分别将硝磺草酮标准溶液加入水果、蔬菜、粮谷、肉等多种空白样品溶液中，采用凝胶色谱柱净化，在254 nm波长下观察硝磺草酮紫外光谱图，确定凝胶色谱净化的收集时间。凝胶色谱流出曲线表明，硝磺草酮在15～24 min时流出，收集此区间的洗脱液可最大程度地除去基质干扰，同时保证农药组分的回收率。
3.2 固相萃取柱及洗脱液的选择 分别以乙腈、甲醇、乙酸乙酯环己烷（1∶1, V/V）、 甲苯乙腈（3∶1,V/V）和丙酮为洗脱液，以活性炭柱、Florisil硅土柱、氨基柱、中性氧化铝柱、HLB柱、PSA柱和C18柱为固相萃取柱，进行硝磺草酮回收率测定。实验表明，采用活性炭固相萃取柱，甲醇为洗脱液时的回收率（95.2%～110.4%）最佳。
分 析 化 学第40卷
第5期张代辉等： 高效液相色谱串联质谱法测定食品中硝磺草酮
3.3 线性关系 硝磺草酮标准溶液的浓度在0.005～0.2 mg/L范围内与响应值有良好线性关系，线性方程为y＝2.87×107x＋1.13×105，相关系数r＝0.9995（n＝6）。
3.4 方法准确度和精密度 选取不含硝磺草酮的粮谷、水果、蔬菜、肉类的空白样品，分别添加0.01, 0.05和0.10 mg/kg的硝磺草酮标准溶液，进行回收测定，回收率为85.5%～98.1%；相对标准偏差为3.0%～6.1% （n＝??）。
3.5 样品分析 采用本方法对菠菜、玉米、猪肉、土壤等23个样品进行测定，仅在1个土壤样品中检测出硝磺草酮，含量为0.25
SymbolmA@ g/kg。由此可见，硝磺草酮农药在农作物上残留较少，但会部分残留在土壤中。
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2（Changchun University of Technology, Changchun 130012, China）
3（Jilin EntryExit Inspection and Quarantine Bureau, Changchun 130062, China）
Abstract A method for the determination of mesotrione in foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry （LCMS/MS） has been developed. The mesotrione in food samples was extracted with acetonitrilewater （3∶1, V/V）. The extract was cleaned up by gel permeation chromatography （GPC） and solid phase extraction cartridges （SPE）, and then diluted to a certain volume with methanol. The mobile phase in LC was an acetonitrile0.1% formic acid aqueous solution. Electrospray ionization （ESI） source in negative ionization mode as well as multiple reaction monitoring（MRM） mode was used in the detection. The final solution was determined and confirmed by LCMS/MS, and quantified by the external standard method. While the fortified levels of mesotrione were in the range of 0.01－0.10 mg/kg, the recoveries were 85.5%－98.1%, and the RSDs were in the range of 3.0%－6.1%. The limit of determination was 0.01 mg/kg. The method is highly sensitive and well repeatable for the determination of mesotrione in foods.
篇6
胶原广泛存在于动物体的皮肤、肌腱、韧带、软骨等结缔组织中，是细胞外基质 4 大组分之一，属于一种结构蛋白质。胶原是哺乳动物体内含量最高的蛋白质，占体内蛋白质总量的25% ～ 30%［1 －2］。由于具有独特的三股螺旋结构，赋予了胶原良好的生物相容性、弱抗原性、可降解性等生物学功能。胶原应用于医学材料领域具有得天独厚的条件，如具有良好的生物相容性、较弱的抗原性、亲水性好、利于细胞的粘附，促进细胞生长等［3］。正是由于胶原的应用广泛，作为生物医用材料的潜力巨大，胶原的分离纯化成为了众多学者研究的热点。胶原的结构较为复杂，且不溶于水，导致从动物组织中纯化较为困难。如果胶原中无机盐含量过高，不仅影响纯度，还将会影响其作为止血材料的性能，对创面造成不良的影响［4］。胶原的分离纯化主要有以下特点: 胶原作为一种蛋白质，是具有生物活性的物质，在分离纯化过程中，有机溶剂、溶液 pH 值、环境温度、离子强度的变化等，均可使蛋白质变性失活; 原料的组成非常复杂; 作为医用的生物材料，所要求的产品必须是高度纯化的，且无菌、无致热源等［5］。应用色谱法分离纯化生物大分子，效率高，选择性好。其中又主要以包括凝胶色谱等液相色谱为主［6］。凝胶色谱又叫凝胶层析或凝胶过滤色谱，是混合物随流动相经固定相( 网状孔径) 的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术，通过蛋白质分子大小不同实现分离的。孔径比凝胶大的分子不能进入凝胶内网状结构，而被排阻于凝胶之外，随着溶剂在凝胶之间的空隙向下移动并最先流出柱外; 比网孔小的分子可渗透进入凝胶颗粒内部，再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出［7］。与其他的色谱法相比较，凝胶色谱有其自身的优点，如凝胶过滤的介质价廉易得、可重复再生、溶质与介质不发生相互作用等，适合于规模化的分离纯化。因而在生物大分子分离纯化过程中应用最普遍，尤其是在分离纯化初级阶段及成品化前的脱盐工序被广泛应用［8］。本研究对凝胶色谱法分离纯化胶原进行了探索和试验，通过紫外分光光度计检测收集样品的吸光值的变化趋势，结合电导率的走向，分析胶原的分离效果和除盐效果，为胶原规 模 化 的 分 离 纯 化 奠 定 一 定基础。
1 材料与方法
1． 1 主要试剂与仪器
纯化猪皮［9］，经过一系列物理化学与生物方法处理，除去脂肪、毛发等杂质成分实验室自制而得;葡聚糖凝胶，Dextran Gel G － 25( 粒度 100 － 200 目) ，中 国 长 征 制药厂;牛腱 I 型胶原( 生化级) ，Sigma 公司;三羟甲基氨基甲烷( BR) 、氯胺 T( AR) ，成都科龙化工试剂厂;冰乙酸( AR) ，重庆申渝化学试剂厂;硫酸铵( AR) ，重庆茂业化学试剂有限公司;对二甲氨基苯甲醛，天津新纯化学试剂研究所。精密 pH 计，PHS － 3B，上海雷磁仪器厂;电导率仪，DDS － 307，上海雷磁仪器厂;磁力搅拌器，84 －1A;电子天平，FA2004N，上海箐海仪器有限公司;层析柱，成都蜀都化验设备厂;微量移液器，上海荣泰生化工程有限公司;冷冻干燥机，Freeze 6，Labconca;紫外可见分光光度计 UV751GD，上海分析仪器总厂;傅里叶变换红外光谱仪，NicoletiS10，美国 Thermo Fisher。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 凝胶色谱法分离胶原
1． 2． 1． 1 凝胶的预处理
称取适量葡聚糖凝胶 G － 25，加入蒸馏水中; 沸水加热溶胀，然后用浮选法除去小颗粒和碎片。
1． 2． 1． 2 凝胶的装柱
选用柱高 20cm，内径 6cm 的层析柱，排除死体积内气泡，溶胀好的凝胶与洗脱液混合后，缓慢加入到柱体内，将其垂直固定，少量洗脱液冲洗管壁，稳定下沉。
1． 2． 1． 3 粗提胶原的制备
纯化猪皮剪碎，经三羟甲基氨基甲烷 － 氯化钠缓冲溶液浸泡直至皮块稍微溶胀，倾去缓冲液，调节 pH 值 2．5，2% 胃蛋白酶，4℃ 条件下反应 8h( 皮块基本水解完全) ，抽滤得清液，调节 pH 值至 7． 5，硫酸铵盐析，得到胶原粗提物，上样时做适当的稀释。
1． 2． 1． 4 上样
打开柱底出口，放洗脱液至胶床面齐，关闭下口，取稀释后的胶原溶液样品 5mL，使移液管尖端慢慢地沿着管壁，将样品放入床内，再用少量洗脱液冲洗管壁 2 次，保留液面 2 ～ 3mm时开始上样。
1． 2． 1． 5 洗脱、收集样品
每 4mL 收集一管，共收集 30 管。
1． 2． 2 透析方法纯化胶原
将盐析处理的胶原盐溶液过滤，加入适量 0． 2mol/L 醋酸溶液溶解，将此胶原溶液装入透析袋( 截流分子质量 14kDa) ，对 0． 04mol/L 和 0． 02mol/L 的 Na2HPO4溶液各透析 1d，蒸馏水透析 2d，经常换液( 整个透析过程于4℃ 下进行) 。完成后，将透析袋内的样品均匀转移至干净的培养皿中冷冻干燥( 2d，－ 37℃ 真空冷冻干燥) ，得海绵状胶原固体。
1． 2． 3 样品的性能检测
1． 2． 3． 1 紫外检测
将收集的样品于 225nm 处测定吸光值，以管号为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。
1． 2． 3． 2 电导率测定
测定收集到的样品的电导率，以管号为横坐标，电导率为纵坐标，绘制电导率变化趋势图。
1． 2． 3． 3 傅里叶变换红外光谱检测
红外光谱的形成是以分子的振动为基础，而这些振动可以定位到分子殊的键和基团［10］。因此可以通过红外检测手段对分离样品进行二级结构的表征，检测出胶原特有基团的特征吸收峰。收集到的吸收峰段的试样在 －37℃ 下，真空冷冻干燥 2d。制样采用溴化钾压片，进行检测时扫描波数为450 ～ 4 000cm－ 1，分辨率为 2cm－ 1，每次扫描重复 16 次。
1． 2． 3． 4 羟脯氨酸含量的测定
准确称取羟脯氨酸标准品，加入少许 0. 001mol/L 盐酸溶液，配制浓度分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9 和10mg/L的羟 脯 氨 酸 标 准 液，待 用。以 0．001mol /L 盐酸溶液为空白液，于 2mL羟脯氨酸标准液和空白液中加入 1mL氯胺 T 溶 液，混 合 均 匀，室 温 静 置20min; 加入过氯酸溶液 1mL，室温静置 5min; 加入对二甲氨基苯甲醛溶液1mL，混合均匀; 60℃ 保温 20min 后，立即置于水中冷却; 测定在 560nm 处的吸光值; 以羟脯氨酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。取 0． 5mL 样品溶液和 0． 5mL 盐酸至安醅瓶( 另取 0． 5mL 蒸馏水和 0．5mL 盐 酸 作 空 白 对 照) ，封 管 后 于120℃ 加热 6h 进行水解。调节 pH 值至 4 ～ 6，定容至 25mL 待用。样品的羟脯氨酸含量测定操作方法同标准液的测定方法。
2 结果与讨论
2． 1 紫外分析和电导率分析
试验及文献［11］表明，胶原溶液在225nm 处有强烈的吸收峰，故试验收集样 品 在 225nm 处 检 测 吸 光 值，225nm 处测得吸光值及电导率的变化如图 1 所示。由图 1 可以看出: 在 225nm 处的吸光值先是非常平缓，因为首先流出来的洗脱液中既没有盐也没有溶解的胶原分子，故吸光值较低，且都处在同等水平; 然后吸光值急剧上升到一个平台，保持在一定的水平，说明此刻已经有物质从凝胶色谱柱系统中流出，此物质即为胶原。胶原是大分子物质，不会进入凝胶内部的网状结构，被排阻于凝胶之外，所以会先流出柱体;由于上样量是一定的，当然体系中胶原分子也是一定的，随着胶原逐渐的流出，吸光值也会下降。因此，在出现平台之后，曲线又急剧下降到一定程度，趋于平缓。但是此时的吸光值比初始的吸光值高，说明有一些小分子蛋白的流出，同时开始有盐的流出，这点从电导率的曲线急剧上升可以明显看出。硫酸铵盐是小分子物质，能进入到凝胶内部，渗透进凝胶颗粒的网状结构，故流出较胶原大分子慢。用氯化钡溶液检测硫酸铵盐的存在，结果发现直到第 27 管开始才有沉淀析出，这点与电导率的变化是一致的，进一步证实了之前吸光值变化的结果。由以上分析初步断定第 17 －20 管( 即吸光值变化曲线平台段) 收集的样品为胶原溶液，且没有盐分的存在。
2． 2 红外光谱分析
通过红外光谱的检测，可以反映物质的分子结构，图谱中的吸收峰与分子中的各个基团的振动形式相对应，因此可以得到试样的官能团化学键的基本信息。酰胺Ⅰ带的特征吸收位于 1 600 ～1660cm－ 1左右，是由羰基的伸缩振动引起的强烈吸收。文献［10］表明，α － 螺旋的酰胺Ⅰ带吸收波数范围在 1 650 ～ 1658cm－ 1处。酰胺Ⅱ带的特征吸收峰在1 550cm－ 1附近，与 N—H 弯曲振动和C—N 伸缩振动有关。位于 1 220 ～ 1 330cm－ 1区域的吸收归属于酰胺Ⅲ带，酰胺Ⅲ带的振动能明显区分 α － 螺旋与无规则卷曲这 2种二级结构。另1 450cm－ 1附近的吸收峰是由 C—H 的弯曲振动引起。图 2 中 a 和 b 是凝胶色谱分离得到胶原样品和常规透析方法得到的胶原的红外光谱图，图 3 为 SigmaⅠ型胶原的红外图谱，各吸收峰的归属情况见表1。比较3 条红外图谱可以发现:不论是凝胶色谱分离胶原还是常规透析法制得的胶原，均与 SigmaⅠ型胶原有相似的主要吸收峰。据文献［12］表明，于1 235 ～1 450cm－ 1范围的吸收峰可以表明胶原的三股螺旋结构的存在。图 2a 中波数为 1 239. 37、1 338. 98 和1 404. 83cm－ 1等处存在吸收峰，图2b 中1 240. 8、1 338. 6 和 1 402. 5cm－ 1等处，也同样明显存在吸收峰，图 3 中1 239. 58、1 337. 35、1 402. 49cm－ 1等处存在吸收峰。3 条图谱中在 1 235cm－ 1和1 450cm－ 1附近的吸收峰的吸光度比值均在 0. 9 以上，较接近Ⅰ型胶原特征值1．0，而不是同等条件下的变性胶原和明胶的 0. 59［12］。因此，由红外光谱分析可初步认为凝胶色谱法分离的胶原基本保持了三股螺旋的结构，且与同等条件下常规透析方法纯化得到的胶原和 Sigma 公司的Ⅰ型胶原类似。
2． 3 羟脯氨酸含量分析
羟脯氨酸是胶原的一种特征氨基酸，通过检测溶液中羟脯氨酸的含量，可以较好地反映胶原含量及纯度，按照 Woessner 法( 第 I 法)［13］测定羟脯氨酸 含 量，此 法 操 作 简 单，且 重 复性好。根据此方法测得羟脯氨酸含量为8． 02% ，与文献值［14］7% ～ 14% 接近，基本符合羟脯氨酸在胶原中所占的比例，表明所分离得到的胶原样品的纯度较高，可初步判定应属于 I 型胶原。对于采用凝胶色谱法分离得到的猪皮胶原的结构的分析，还需要进一步通过电泳法，氨基酸全分析、圆二色谱法和原子力显微镜等检测手段加以确证。
篇7
护理
【关键词】 僵蚕 抗凝活性部位 化学成分 凝胶色谱法 高效液相色谱法 氮测定法
Abstract：Objective To explore the anticoagulating active components in water extraction, alcohol sedimentation and fraction separated by gelfiltration chromatography of Bombyx Batryticatus. Methods Anticoagulating active fractions were prepared by the methods of water extraction, 70% alcohol sedimentation and gelfiltration chromatography. Components (such as porteins or polypeptide, amino acids, oxalic acid ammonium) in each fraction were determined by chemical reaction indentification, Kjeldahl method, conductance, UV and HPLC. Results Polypeptide, amino acids and oxalic acid ammonium were the main components in anticoagulating active fractions, content of which reached more than 80%. The content of oxalic acid ammonium decreased about 52% processed by alcohol sedimentation, while the content of polypeptide and amino acids only decreased about 8%. The content of peptides and amino acids increased about 28% purified by gelfiltration chromatography compared with the one in water extraction and about 39% compared with the one in alcohol sedimentation. The content of oxalic acid ammonium was the same as the one in alcohol sedimentation, but decreased about 1 time compared with the one in water extraction. The content of 15 kinds of amino acids were 40%～50% in the solids of each fractions, which maked up to 60%～76% of the content of proteins determined by Kjeldahl method. Molecular weight range of peptides is 1.0～4.4 kDa. Conclusion This study provides a experimental basis for further separation and purification of anticoagulating active components from Bombyx Batryticatus.
Key words：Bombyx Batryticatus；anticoagulating active fractions；chemical components；gelfiltration chromatography；HPLC；Kjeldahl method
僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori L.4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌而致死的干燥体,为传统中药,性味咸、辛、平,归肝、肺、胃经[1]。具熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效,可用于治疗急性惊风、癫痫、中风、面瘫及顽固性头痛等。僵蚕含有蛋白质、脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵菌素以及微量元素等成分[2-4],其水提液在体内外实验中均表现出很强的抗凝、抗血栓、促纤溶及抗内毒素所致红细胞膜损伤等作用[5-7],草酸铵和蛋白质(或多肽)、氨基酸等可能为其主要活性成分[8]。为进一步研究僵蚕的抗凝活性成分,本实验探讨了僵蚕水煎煮液的醇沉液和凝胶色谱分离净化,及其抗凝活性成分中氨基酸和草酸铵等的定性定量分析,现报道如下。
1 实验材料
护理
Waters 515 HPLC系统(Waters 公司)；BS100A自动部分收集系统(上海市沪西仪器厂)；Start-4半自动四通道血凝仪(法国STAGO公司)；4300-Pro紫外分光光度计(瑞士安玛西亚公司)；HR2838型匀浆机(菲力普公司)；LP115 pH计(METTER TOLEDO公司)；DDS-ⅡA电导率仪(上海理达仪器厂)；移液枪(0.1 mL和1.0 mL,日本)；半微量凯氏定氮装置；Z-16和Z-26层析柱(上海化学仪器厂)。制僵蚕(购自湖南振兴中药饮片有限公司)；葡聚糖凝胶(Biotech公司)；凝血酶试剂(上海太阳生物技术公司,批号N25006)；兔血浆(自制)；15种氨基酸对照品(Sigma公司)；水为超纯水；甲醇(色谱纯)、三氟乙酸(THF)、2-巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等化学试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 样品溶液的制备
称取制僵蚕1 500 g(样品A),用8倍量水浸泡过夜,以3 000 r/min匀浆,然后煎煮2次,每次30 min,过滤,合并滤液,离心,得提取液8 450 mL(样品B),将其浓缩至含原药材2 g/mL,加无水乙醇浓度至60%,4 ℃放置过夜,3 000 r/min离心,取上清液水浴浓缩至含原药材约6 g/mL,即得粗提液240 mL(样品C)。将30 mL该液加到用0.05 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)缓冲液平衡的Sephadex G-25凝胶柱(φ2.6 cm×80 cm)上,用相同缓冲液洗脱,自动分步收集器收集,2.5 mL/ (10 min·管),每2～3管按文献方法[8]测定凝血酶时间(TT,s)、紫外吸收光谱,用重量法测定质量百分浓度(m/v)、电导率仪测定溶液电导率,得洗脱曲线(见图1)。将TT在40～100 s之间的组分合并得洗脱液69 mL(样品D),TT≥100 s的组分合并得洗脱液82.5 mL(样品E),E即为抗凝活性部位。
图1表明, 紫外吸收光谱法(UV)检测的最强色谱峰的前半部分为具有抗凝活性的部位,与UV法测得的G-25凝胶色谱峰值不重合,而按质量百分浓度(M/V)和电导率法测得的色谱峰值与抗凝活性峰值基本重合。
2.2 抗凝活性部位的化学成分理化鉴别
2.2.1 茚三酮反应、pH值、电导率、AgNO3/HNO3反应和CaCl2/HNO3反应 分别取B～E样品溶液进行理化测定,结果表明,僵蚕提取分离后的B～E样品所检测的理化性质结果一致,提示所含主要成分基本相同。茚三酮反应阳性,活性部分电导很大,与AgNO3产生白色沉淀,滴加HNO3后沉淀部分溶解,与CaCl2产生沉淀,滴加HNO3沉淀溶解。提示抗凝活性成分可能是盐类(如氯化物、草酸盐等)、蛋白质、肽类或其它含氨基酸的化合物。
2.2.2 紫外吸收光谱
取各样品稀释适当后在200～400 nm扫描,其紫外吸收光谱见图2。
图2表明,样品B～E的UV光谱形状均不相同,表明提取分离所得样品化学成分有所不同。提取分离后除去了大量的无活性物质,特别是经过凝胶色谱纯化后,UV光谱变化较大。
2.2.3 样品E的凝胶色谱分析及其分子量分析
取样品E中TT≥600 s的馏分2 mL上Sephadex G-15(φ1.6 cm×50 cm)柱,用水洗脱盐,4.0 mL/(10 min·管),自动分步收集器收集,测定各管的TT值、260 nm和280 nm处的吸光度及化学反应特性,结果见表1。表1 TT≥600 s馏分的凝胶柱脱盐中馏分的抗凝活性和理化特性检
测结果（略）注：*必要时,通过稀释馏分,测定吸光度在0.2～0.8之间,计算而得
2.3 定量分析护理
2.3.1 固形物含量测定
精密吸取样品B～E各2.0 mL,80 ℃下烘至近干,100 ℃下烘至恒重,精密称定,按每1 mL样品溶液扣除5.0 mg的Tris和NaCl重量,得固形物重量和浓度(各样品均为n＝3,RSD不超过0.8%),结果见表2。表2 僵蚕各部位中的固形物和蛋白质测定结果（略）注：*与样品A比
2.3.2 指标检测
蛋白质：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作,计算总氮含量。将该氮含量扣除铵态氮含量,再与6.25相乘,即为蛋白质质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.4%。铵根[9]：按《中华人民共和国药典》中半微量氮测定法操作(40% NaOH试液用120 g/L氧化镁悬浊液代替),计算铵根质量和百分浓度(W/V)。各样品均为n＝3,RSD不超过1.2%。草酸根[3]：精密取B～E样品液约5 mL,氯化钙沉淀-高锰酸钾滴定法测定(各样品均为n＝3,RSD不超过1.0%)。结果见表3、表4。表3 僵蚕各部位中铵根和草酸根的测定结果（略）注：*与样品B比表4 僵蚕各部位固形物中蛋白质和草酸铵含量比较（略）
2.3.3 HPLC法测定氨基酸含量
2.3.3.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ODS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)；流动相A为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(82∶17∶1),流动相B为50 mmol/L NaAc(pH 6.8)-甲醇-THF(22∶77∶1),梯度洗脱；柱温：27 ℃；流速：1.0 mL/min；荧光检测器：λex 338 nm,λem 425 nm。
2.3.3.2 样品测定 样品溶液B～E经5.7 mol/L盐酸液,在110 ℃水解24 h,OPA试剂衍生化,然后取20 μL注入液相色谱仪。测定结果见表5。表5 僵蚕各部位中氨基酸的测定结果(略)
3 讨论
本研究表明,僵蚕的水煎煮提取、醇沉和凝胶色谱分离所得抗凝活性部位中,多肽、氨基酸类和草酸铵都是其中的主要成分。已有报道,草酸铵具有抗凝活性[8],本研究表明,凝胶色谱分离部位中不含草酸铵,但含多肽和氨基酸类成分的馏分具有抗凝活性,因此,僵蚕中的多肽类或氨基酸类成分可能是抗凝活性成分之一。本研究对僵蚕抗凝活性部位的化学成分和理化特性进行的初步探索,也为今后对僵蚕抗凝成分的分离纯化提供了实验基础。
【参考文献】
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护理
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篇8
【关键词】红外光谱；凝胶色谱；聚羧酸减水剂
The application of micro equipments in analysing polycarboxylate high preformace water reducer
Wang Lei,Chi Pei-yun,Yang Pei-dong,Niu chang-hui
(School of Architecture and Civil Engineering, Qingdao Technological UnivercityQingdaoShandong266033)
【Abstract】High performance water reducing agent especially polycarboxylate water reducer has increasingly been come under recognition because of its remarkable water-reducing ability and slump retention ect. And micro test methords lay an important foundation and server a supporting power for exploring new kinds of polycarboxylate water reducer. In this paper, detailed discription has been made about the priciple of infrared spectorscopy technology and its application in detecting functional groups of polycarboxylic acid, and priciple of Gel permeation Chormtography techonlogy and its using in calculating molecular weight and molecular weight distribution of polycarboxylate water reducer is also been systematically introduced.
【Key words】 Infrared spectorscopy;Gel permeation Chromtography technology;Polycarboxylate water reducer
1. 红外光谱分析（infrared spectrum analysis）
1.1红外光谱分析原理
当PC样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子会吸收与其振动频率一样的红外光波使其从振动――转动能级的基态跃迁到激发态，相应与这些区域的投射光波强度就会降低，记录百分透过率他T%对波数或波长的曲线即可得到PC样品的红外光谱。由于聚合物中的官能团的红外光谱特征吸收峰总是在一定范围之内变动，因此通过分析PC样品的红外光谱即可得出该聚合物所含有的官能团。下表1为PC减水剂中常见官能团的特征吸收峰。
1.2实验及分析。
1.2.1实验仪器和样品制备。
（1）实验仪器。
傅里叶交换红外光谱仪，德国bruker公司，分辨率优于0.09cm-1，光谱范围12500～50cm-1。
（2）试样制备。
采用薄膜法制样，样品先经过异丙醇和丙酮的分离，然后将PC溶液倒入到低沸点（5～8倍）溶剂中反复沉淀，在60℃浓缩一定时间后再真空抽滤，除去水分然后涂抹在NaCl盐片上成膜。
1.2.2图谱分析。
下图1为两种聚羧酸减水剂MPC-1和MPC-2的红外图谱，通过分析红外光谱结合减水剂中各基团特征峰的位置，可以看到MPC-1和MPC-2有相似的结构 3300，2850，1725，1575，1460，1350，1280，1107，951，845，622及523cm-1等波数附近都有 吸收峰，可见这两种减水剂分子结构上具有磺酸基，羧基，聚氧化乙烯基，酯基和羟基等基团。由于MPC-1比MPC-2具有更长的聚氧化乙烯基长链，因此其在 1120～1110 cm-1之间有更宽阔的吸收峰，随着环氧乙烷加成数增加，在1105 cm-1的吸收带也随之增强，O-H基团的伸缩振动在3300～2500 cm-1范围处出现，酯基的吸收峰出现在了1725 cm-1处，羧酸衍生物的水解羧基C=O对称伸缩振动吸收峰在1563 cm-1和1430 cm-1处生成，硫酸酯吸收峰可以在1230 cm-1处找到，而磺酸基S-O伸缩振动的吸收峰出现在1220 cm-1，1105 cm-1和1045 cm-1处出现。
图1聚羧酸减水剂MPC-1和MPC-2的红外光谱
2. 凝胶渗透色谱分析
聚合物分子量具有多分散性，不同的聚合方法、聚合工艺会使聚合物具有不同的分子量和分子量分布。分子量和分子量分布对PC减水剂的性能有十分密切的关系，因此测定其分子量和分子量分布就显得尤为重要。通过人们不断探索，改进和创新测定分子量和分子量分布的方法，凝胶色谱法在60年代末应运而生并成为现今最有效的分子量和分子量分布的测试方法。
2.1凝胶渗透色谱原理。
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，简称GPC）是对同一聚合物种不同分子量的高分子组份进行分离。当样品中不同分子量的各组份的分子量和含量被确定后，就可得到聚合物的分子量分布，然后可以很方便地对分子量进行统计，得到各种平均值。一般认为，GPC是根据溶质体积的大小，在色谱中由于体积排除效应即渗透能力的差异进行分离。高分子在溶液中的体积决定于分子量、高分子链的柔顺性、支化、溶剂和温度，当高分子链的结构、溶剂和温度确定后，高分子的体积主要依赖于分子量。
凝胶渗透色谱的固定相是多孔性微球，可由交联度很高的聚苯乙烯、聚丙烯酸酰胺、葡萄糖和琼脂糖的凝胶以及多孔硅胶、多孔玻璃等来制备。色谱的淋洗液是聚合物的溶剂。当聚合物溶液进入色谱后，溶质高分子向固定相的微孔中渗透。由于微孔尺寸与高分子的体积相当，高分子的渗透几率取决于高分子的体积，体积越小渗透几率越大，随着淋洗液流动，它在色谱中走过的路程就越长，用色谱术语就是淋洗体积或保留体积增大。反之，高分子体积增大，淋洗体积减小，因而达到依高分子体积进行分离的目的。
图2是GPC的构造示意图，淋洗液通过输液泵成为流速恒定的流动相，进入紧密装填多孔性微球的色谱柱，中间经过一个可将样品送往体系的进样装置。聚合物样品进样后，淋洗液带动溶液样品进入色谱柱并开始分离，随着淋洗液的不断洗提，被分离的高分子组份陆续从色谱柱中淋出。浓度检测器不断检测淋洗液中高分子组份的浓度响应，数据被记录最后得到一张完整的GPC/SEC 淋洗曲线。
图2GPC的构造
淋洗曲线表示GPC对聚合物样品依高分子体积进行分离的结果，并不是分子
量分布曲线。实验证明淋洗体积和聚合物分子量有如下关系：
lnM = A -BVe （1）
式中M为高分子组分的分子量，A、B与高分子链结构、支化以及溶剂温度等影响高分子在溶液中的体积的因素有关，也与色谱的固定相、体积和操作条件等仪器因素有关，因此（1）式称为GPC的标定关系。（1）式的适用性还限制在色谱固定相渗透极限以内，也就是说分子量过高或太低都会使标定关系偏离线性。一般需要用一组已知分子量的窄分布的聚合物标准样品（标样）对仪器进行标定，得到在指定实验条件，适用于结构和标样相同的聚合物的标定关系。
2.2用凝胶渗透色谱法计算聚羧酸高效减水剂的分子量。
2.2.1实验方法。
2.2.1.1所用仪器和试剂。
组合式GPC/SEC 仪（美国Waters 公司），电子天平，13mm 微孔过滤器；配样瓶，注射针筒等。
四氢呋喃（AR）（淋洗液）；聚羧酸减水剂（被测样品）；窄分子量分布的聚羧酸减水剂（标准样品）；
2.2.1.2标定标准样品的GPC，求得A、B的值。
选取5个不同分子量的单分散标样，按分子量顺序1、2、3、4、5，分别称取标样2mg，混在一个配样瓶中，用针筒注入约2ml 溶剂，溶解后，用装有0.45 微米孔径的微孔滤膜的过滤器过滤。在配样瓶中称取约 4mg 被测样品，注入约2ml 溶剂，溶解后过滤。
待仪器基线稳定后，用进样针筒将混合标样进样，进样量为 100 微升，等待色谱淋洗，最后得到完整的淋洗曲线。作logM- Ve 图，得GPC/SEC 的标定关系，得A，B值。
2.2.1.3计算样品的Mn和Mw。
GPC的数据处理，一般采用“切割法”。在谱图中确定基线后，基线和淋洗曲线所包围的面积是被分离后的整个聚合物，以横坐标对这块面积等距离切割。切割的含义是把聚合物样品看成由若干个具有不同淋洗体积的高分子组份所组成，每个切割块的归一化面积（面积分数）是高分子组份的含量，切割块的淋洗体积通过标定关系可确定组份的分子量，所有切割块的归一化面积和相应的分子量列表或作图，得到完整的聚合物样品的分子量分布结果。因为切割是等距离的，所以用切割块的归一化高度就可以表示组份的含量。切割密度会影响结果的精度，当然越高越好，但是一般认为，一个聚合物样品切割成20 块以上，对分子量分布描述的误差已经小于GPC/SEC 方法本身的误差。当用计算机记录、处理数据时，可设定切割成近百块。用分子量分布数据，很容易计算各种平均分子量。
式（2）、（3）、（4）分别是多分散高分子的数均分子量，重均分子量和其多分散系数。
3. 结论
红外光谱用于分析聚羧酸高效减水剂的官能团种类的作用是巨大而显著的，凝胶渗透色谱技术为计算聚羧酸减水剂的分子量和分子量分布提高了精确的结果。这两种现代化微观分析设备的使用大大提高了新型聚羧酸减水剂的研发力度，极大的提高了新型减水剂的研制速度。
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篇9
Abstract: In the process of using high-performance liquid chromatography, unavoidably will encounter all sorts of problems, from the valve, chromatographic column and flow equal to introduce the correct use of chromatography, common failure causes and eliminating methods.
关键词:高效液相色谱仪;故障排除;正确使用
Key words: high performance liquid chromatography;troubleshooting;used correctly
中图分类号:TS207 文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)20-0097-01
0引言
高效液相色谱仪是分析实验室常用的测试仪器之一,其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中,难免会出现各种各样的问题,并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。
1使用试管的问题
①试管的洁净问题。高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法,如果因使用不洁净的试管,便会影响试验结果的准确性。②塑料试管的溶解问题。可用相同的实验条件先行试验一下,看看不含被抽提物时,提取液在检测器上能否产生干扰信号,如确有干扰信号存在,就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。③被测样品在试管壁上的吸附问题。操作中宜采用聚丙烯管,为防止提取中吸附现象发生,可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂,可有效地防止吸附。
2操作进样阀的问题
在高效液相色谱法的试验过程中,有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题,这主要是由于操作方法不当所引起,要想解决此类问题,需从以下几个方面入手。①进样量的控制。用进样阀来进样时,阀内的样品环是定量的,由于进样时,注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度。因此,要想使样品环中充满样品溶液,从而使用进样阀来准确地定量,则必须使进样量大于样品环体积的两倍。②进样阀的清洁问题。如果样品环中有上次进样时样品的残留,必然会污染下次注射进的样品,为防止这种现象的发生,应按下列步骤操作:1)进样阀有两个位置,INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时,以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次,每次用量大约40ul;2)然后将进样阀板手扳至INJECT位置时,再以流动相清洗几次,每次用量还是40ul;3)再将样品注射到进样阀里.按照上述的步骤操作,可以避免由进样阀引起的污染,从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。③进样阀溢流管的堵塞。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液,而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时,可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡,端口处盐的结晶就能被溶解掉,故障排除。如能在每次进样完成之后,用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出,则可避免此故障的发生。
3流动相的问题
甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂,如色谱纯试剂。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器,因此,从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑,应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。①流动相的过滤。配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒,如果不把它们滤除掉,就会堵塞泵口、柱头上的过滤器,这样就堵塞了流动相的正常通道,使色谱柱的阻力增加,柱压升高,柱效下降。碰到这种情况时,要换用经过滤的流动相,并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟,以除去滤片上的堵塞物。②流动相的脱气。流动相在使用前必须脱气,以尽可能的除去溶解在流动相中的气体,否则,这些气体会使柱填料的性能降低,还能够对检测器的信号产生很大的干扰。水和甲醇混合后会产生大量的气泡,如果不脱气就使用,气泡就会进入色谱柱和检测器,并将影响分析工作的正常进行。
4色谱柱的使用和保养
色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件,被测物质能否被很好的分离和测定,色谱柱的性能起着决定性的作用。在日常工作中,应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养,以延长色谱柱的使用寿命。
4.1 使用预柱和保护柱预柱安装于泵和进样器之间,它给色谱柱中的流动相提供了完全的平衡,并防止了对柱填料有破坏作用的组分或污染物进入色谱柱。保护柱可以阻挡能够牢固地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱,保护柱应与色谱柱的填料相同。
4.2 防止气体进入色谱柱有些色谱柱是不允许气泡进入的,否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此,为了防止气泡进入色谱柱,一定要使用经过脱气的流动相,并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。①拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝,观察是否有溶剂渗出;②如有溶剂渗出,即可将色谱柱接到管路上,以避免气泡的进入;③如无溶剂渗出时,表明色谱柱的此端已经进去空气了,可将色谱柱的出口端接到进样阀上,以流动相来反方向冲洗色谱柱,以便将柱内的空气排除。④如果流出的溶剂里不含有气泡,说明柱内的气体已经被排出了,再将色谱柱以正确的方向接好,这样气泡就进不到色谱柱里面了。
4.3 色谱柱的清洗为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中,在每次的样品分析工作完成之后,都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱,以分析工作中常用的反相色谱分析法为例,因其先流出的物质是极性大的物质,此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来,洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。凝胶滤过色谱法中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相,用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。
4.4 色谱柱的存放如果色谱柱暂时不用,存放时要注意:①几天之内的短期放置,应先用溶剂冲洗好色谱柱,再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。②如果色谱柱长期不用,仅用上述方法来处理就不行了,这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱,反相柱一般使用甲醇,正相柱则可用正已烷或庚烷,而凝胶柱则不能用水了,因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低,此时应用0.05%的NaNs水溶液来冲洗色谱柱,再将色谱柱封严。
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1、色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。
2、色谱有多种，按固定相类型和分离原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱、聚焦色谱等。最常用的是吸附色谱分离技术。
3、吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物中各组分分离的方法。此法特别适用于脂溶性成分的分离。被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。
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