色谱柱范文
时间：2023-03-20 21:24:55
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篇1
关键词 离子色谱法；色谱柱；性能比较
中图分类号O657 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）102-0126-02
0 引言
离子色谱是高效液相色谱的一种，主要用于阴离子、阳离子的分析。对难以用其他仪器和方法分析的常见阴离子、阳离子、有机酸和有机胺类等组分的分析，离子色谱法也具有选择性好，灵敏、快速、简便，同时测定多组分的优点。
离子色谱的最重要的部件是分离柱。柱管材料应是惰性的，一般均在室温下使用。分离柱的填料由基质和功能基两部分组成。作为填料的基质可分为有机聚合物基质和无机（硅胶、氧化铝）基质两大类。其中有机聚合物离子交换树脂应用较广，是目前商品化分离柱的主要填料。高性能分离柱的有效性，是离子色谱发展的关键。
本实验是针对国产的阴离子柱对于常见七种阴离子的分离效能与美国戴安公司的阴离子柱的柱效进行比较，藉以了解国内与国外离子色谱技术的水平。
1试验部分
1.1仪器和试剂
1.2溶液和淋洗液的配置
1.2.1浓度为1000ppm储备液的配置
1.2.2浓度为10ppm单标的配置
1.2.3混标的配置
1.2.4淋洗液的配置
1.3色谱条件
2 结果与建议
2.2 结果
从图1与图2中能看出国产SH-AC-1样品的保留时间要大于戴安色谱柱。SH-AC-1需要22min才能完全出峰，戴安的15min能完全出峰。从表1与表2中能看出国产色谱柱对各峰的保留时间长和理论塔板数偏低。国产SH-AC-1色谱柱F离子和水负峰分离不开，H2PO4与Br分离度小于1.5，戴安的色谱柱的柱效要比国产色谱柱的柱效要好。
2.3 建议
1）与国外的色谱柱的柱填料相比国产柱的柱填料应做哪些改进；
2）与国外的色谱柱的柱内径相比国产柱的柱内径能更小为好；
3）若国产柱的柱压与总电导与戴安的离子柱一样，这样对F离子与水负峰的分离与H2PO4与Br分离度是否会更好，柱效会有所提高。
参考文献
[1]ISO/IEC17025-1999.General Requirement for the Competence of Galibration and Testing Laboratories [S].
篇2
[关键词] 牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04
Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin
牛血清白蛋白色谱柱的制备
及对阿司匹林的
1.广西医科大学公共卫生学院，广西南宁 530021；2.广西医科大学第一附属医院药学部，广西南宁 530021
[摘要] 目的 制备生物色谱柱，用于分离或测定药物成分。 方法 采用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）与硅胶反应生成氨基功能化的活化硅胶，并与牛血清蛋白（BSA）共价结合形成BSA键合固定相，匀浆装柱制备成BSA生物色谱柱，以阿司匹林（Aspirin，ASP）为分析对象考察BSA固定相的结合性能和分离性能。 结果 BSA结合率为3.69 μmol/g，ASP在BSA键合固定相色谱柱上的最大结合量为74 mg/g，经BSA色谱柱测得阿司匹林肠溶片的含量为14.65 μg/片，标示量为107.8%。 结论 这表明BSA与硅胶载体成功结合形成BSA键合固定相，所制备的BSA生物色谱柱具有良好的结合性能与分离性能。
[关键词] 牛血清白蛋白；生物色谱柱；阿司匹林
[中图分类号] R96[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0101-04
Preparation of bovine serum albumin biological chromatographic column and its application in determination of Aspirin
TANG Lingli1 WEI Shibai2 HUANG Dongping1 HUANG Mingli1 RUAN Chong1
1.College of Public Health of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China; 2.Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
[Abstract] Objective To prepare biological chromatographic column to separate and determine the ingredients of drugs. Methods Silica gel was reacted with 3-aminopropyl trimethoxylsilane to form amine functionalized activated silica gel, which was covalent binding with BSA to synthesize BSA bonded stationary phase. Then BSA bonded stationary phase was packed column with homogenization, thus BSA biological chromatographic column was prepared. Aspirin was taken as a detective object to examine the combination performance and separation performance of BSA bonded stationary phase. Results It came to that, the combined rate was 3.69 μmol/g, the biological chromatographic column was 74 mg/g, the amount of Aspirin in per tablet was 14.65 μg and the labeled amount was 107.8% detected by BSA biological chromatographic column. Conclusion All of above shows that BSA bonded stationary phase is synthesized successfully, and the BSA biological chromatographic column has good combination property and separation property.
[Key words] Bovine serum albumin; Biological chromatographic column; Aspirin分子生物色谱法（MBC）是20世纪80年代中后期逐渐发展起来的以酶、受体、抗体、传输蛋白等生物大分子为固定相的一类色谱法，是基于生物大分子的特异性相互作用原理进行分离纯化具有活性的化合物或测定生化参数的一项新兴技术[1]。药物作为一类重要的生物活性物质与血浆蛋白存在可逆性的结合平衡，药物分子通过血浆白蛋白的运输到达受体部位发生药理作用，而药物分子在体内与血浆蛋白的相互作用是其发挥药理作用的前提，因此可以通过血浆白蛋白生物色谱筛选药物中的活性成分。付强等[2]通过自制人血清白蛋白色谱柱成功对DL（±）色氨酸进行了手性分离；Bentucci等[3]制备出的血清白蛋白色谱柱，不仅可筛选出药物活性成分，还可通过体外实验反映药物-血清白蛋白的相互作用。蔡汉宁等[4]制备出核心组蛋白色谱柱作用于其活性物质，至少筛选出9种组蛋白作用蛋白。与传统的实验方法相比，分子生物色谱法具有高度专一性、分离速度更快、容易自动化操作、重复性好等优点[5]。
由于人血清白蛋白价格昂贵，用于制备生物色谱柱成本太高，有学者利用牛血清白蛋白与人血清白蛋白结构相似的特点，制备成牛血清白蛋白色谱柱用于中药活性成分的分离测定。Tan等[6]通过制备的牛血清蛋白生物整体柱，成功的分离出当归的活性成分，并考察了当归提取液在该整体柱上保留的影响。本文主要通过将硅胶氨基功能化与BSA共价键结合合成BSA固定相，制备BSA生物色谱柱，并选择了阿司匹林（ASP）作为与BSA结合的对象来验证BSA色谱柱的性能。ASP作为一种代表性药物，不仅具有卓越的消炎、退热、止痛能力，研究表明它还可以协同干扰素抑制肝细胞癌生长转移[7]，抑制宫颈癌Hela细胞增殖[8]，预防妊娠期高血压[9]等。通过对ASP及其肠溶片的分离测定，可以进一步探讨生物色谱柱在药物有效成分分离测定中的应用前景。
1 仪器与材料
6010紫外可见分光度计（安捷伦科技公司，上海）；LC-10Tvp高效液相色谱仪（日本岛津公司）；spectrum 100傅立叶变换红外光谱仪（美国penkim Elmer仪器有限公司）；Bio-Rad垂直电泳槽、电泳仪（美国Bio-Rad公司）。
3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）（97%，上海晶纯试剂有限公司，批号：15122）；N，N′-琥珀酰亚胺碳酸酯（98%，阿拉丁公司，批号：25231）；考马斯亮蓝G250（沃凯，批号：WB20091102）；BSA（Solarbio）；硅胶Sepra Silica （粒径50 μm，phenomenex 美国）；ASP标准品（Purity>99%）；ASP肠溶片（50 mg/片，国药准字H43021814）；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、Tris碱、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（SDS）均来自北京索莱宝。
2 方法与结果
2.1 BSA色谱柱的制备
取硅胶2 g（平均粒径为50 μm，孔径46 Å（1 Å=0.1 nm），比表面积为518 m2/g），加入适量甲苯回流除去残留水分，按10 μmol/m2加入3-氨丙基三甲基硅烷反应8 h得到氨丙基硅胶，过滤，分别用甲苯和甲醇洗涤，真空干燥后置干燥器保存。取氨丙基硅胶2 g，加入乙腈5 mL和N，N′-琥珀酰亚胺碳酸酯2 g，于30℃反应24 h，过滤后分别用乙腈、甲醇洗涤得到活化硅胶。取制备得的活性硅胶1.5 g，加入到25 mmol/L（pH=6.6）的磷酸盐缓冲液中，再加入适量BSA，30℃下搅拌反应20 h，过滤后依次用水及5%乙醇多次洗涤，得到BSA固定相。将制备好的BSA固定相用缓冲液匀浆后注入不锈钢柱（4.5 nm×150 nm）中，并抽真空压紧柱，制备得到BSA色谱柱。
2.2 傅里叶红外光谱（FTIR）验证活化硅胶功能基团
用溴化钾压片法制备活化硅胶样品，进行FTIR分析。FTIR分析结果见图1，硅胶（a）和活化硅胶（b）共有的吸收峰有：1099、1103 cm-1处的非对称伸缩振动，指纹区800 cm-1的对称伸缩振动和470 cm-1的弯曲振动，均为硅胶的主要结构Si-O的特征谱带；与硅胶（a）相比，活化硅胶（b）增加了伯胺（-NH2）的吸收峰1402、1561 cm-1，2928 cm-1峰为亚甲基的不对称变形振动峰，说明硅胶上中有亚甲基的存在，表明APTS已结合在硅胶上。由此可见，活化硅胶成功连接上了氨基功能基团。
a.硅胶；b.活化硅胶
图1 硅胶和活化硅胶的红外光谱图
2.3 BSA与活化硅胶结合量
按硅胶与BSA质量比8∶1、4∶1、2∶1、1∶1进行表面覆盖率的测定。称取四份硅胶，每份0.5000 g，分别与0.0625、0.1251、0.2500、0.5000 g BSA反应，反应结束后各取100 μL洗涤液采用考马斯亮蓝染色法[10]测定其中BSA含量，用BSA加入量与反应剩余BSA量之差计算出结合量，按照下列公式计算出BSA的表面覆盖率：表面覆盖率=结合蛋白的物质的量（μmol）/活化硅胶质量（g）。结果显示，活化硅胶与BSA质量比为4∶1时，BSA结合量已基本达到饱和，加大剂量并不能明显的增加键合量，表明BSA表面覆盖率可能受空间位阻大小的影响。见图2。
图2 活化硅胶与BSA不同配比下的BSA表面覆盖率
2.4 BSA固定相结合ASP研究
精密称取ASP对照品50 mg，用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至50 mL，摇匀，得到ASP标准溶液。取ASP标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL用冰醋酸-甲醇（1∶10）溶液稀释至10 mL，各取10 μL用于HPLC。色谱条件：流动相：甲醇-20%冰醋酸（3∶1）；流速：1 mL/min；色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：30℃；紫外检测器，λ=237 nm。得到ASP标准曲线方程：Y = 97 941X+ 37 178，r = 0.9997，其中Y为峰面积，X为ASP浓度（μg/μL）。
称取一定量的硅胶和BSA固定相匀浆法分别填装于两根柱子中，精密称定适量的ASP，用中性乙醇溶解后缓缓倾注入色谱柱中，用蒸馏水洗涤柱子，接收洗涤液，根据标准曲线计算洗脱液中ASP含量，ASP加入量与洗脱液中ASP含量之差得到固定相对ASP的结合量，见图3。对比硅胶固定相和BSA固定相对ASP的结合量，ASP与BSA固定相结合量明显大于与硅胶固定相结合量，证明与ASP结合的主要是BSA而不是硅胶。
图3 硅胶固定相、BSA固定相与阿司匹林结合量的比较
2.5 BSA色谱柱性能考察
篇3
Abstract: Filled chromatographic column meets the test requirements, but the chromatographic peak tailing phenomenon happens when testing. Changing the parameters and sample size, no significant improvement. Hollowing some distance at the intake end of filled chromatographic column, the chromatographic peak becomes normal and completely improved.
关键词:色谱填充柱;柱效;探讨;色谱峰
Key words: chromatography packed column;column efficiency;exploration;chromatographic peak
中图分类号:S37文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)18-0248-01
1问题的由来
1.1 按GB/T 18415-2001《小麦粉过氧化苯甲酰测定方法》规定的溶剂和进样量分别进样2μl丙酮、石油醚(60℃~90℃沸程),在注温240℃ 条件下,1.6min以后,出现溶剂峰,但严重拖尾。
1.2 改用6#溶剂油饱和蒸气进样0.2ml,18秒后,出现溶剂峰,是个很尖的峰,没有出现拖尾。
为什么会出现以上现象,实验开始时怀疑可能柱子老化不完全造成的,我们对玻璃填充柱进行了24小时老化,没有任何改善。反复检查安装过程,没发现任何异常。大连物化所提供的玻璃填充柱的质量是可靠的,我们又开始分析查找可能出现其它原因。
1.3 尝试改变有关参数,逐步降低或提高柱温,增大减小载气流量,燃气和助燃气流量,又分别注射2μl丙酮、石油醚,溶剂峰拖尾现象无明显改善,又分别加苯甲酸的丙酮溶液,进样2μl,浓度分别为15μg/ml、20μg/ml时,在7分钟后出峰,在国标准法标准曲线最小浓度5μg/ml、10μg/ml,注射2μl,基本不出峰(或峰形不明显)。这样的情况显然无法满足工作需要,基本不能工作。
1.4 改变进样量,分别以1μl,0.5μl丙酮进样,溶剂峰峰形明显好看,又以同样的进样量加入20μg/ml的苯甲酸标准溶液,溶剂与样品峰出现分离,但样品峰较小,其中进样1μl时,浓度为20μg/ml 以上浓度的苯甲酸丙酮溶液,色谱峰有响应值;进样量为0.5μl,只有40μg/ml以上浓度的苯甲酸丙酮溶液时才有响应,分离效果还可以,因此可以说明色谱柱本身填充质量问题不大,只是由于进样量的减少,标准物质(苯甲酸)要很大浓度才有响应,无法满足工作需要,按国家标准来看,已经没有实际意义了,显然必须进行改进。
1.5 经分析,可能是样品汽化过程有问题,会不会是汽化空间过小,出现类似死体积过大原因导致拖尾,于是尝试将柱子进气端进行一些掏空,掏空1mm后,以2μl丙酮进样试验,峰形有较大改善,笔者又继续掏空1mm后进行实验,峰形完全改善,恢复正常,用石油醚实验,情形大体相当。于是又用苯甲酸丙酮标准溶液进样,测试最低检出限,完全达到工作需要,恢复正常。
2原因分析
2.1 据资料介绍,拖尾峰的产生大致有这么几种 :即色谱柱安装位置不正确;柱子进样口污染;溶剂极性不匹配;温度过高;柱子液相流失等等。经分析和认真检查,在减小进样量后,获得明显效果,于是进行少量挖空试验。
2.2 样品进入色谱柱之前,样品有一个汽化过程,在240℃条件下迅速汽化,由于色谱柱汽化空间较小,在较短时间内样品汽化后体积较大,不能及时随载气完全进入色谱柱,造成一部分死体积过大,样品进入柱子时间无法保持一致,分离过程不能同时进行,是一段一段地进入柱子进行分离,即使填充物完全合格也不会清晰的分离,最后就是出现大拖尾峰形。
2.3 使用6#溶油气体进样正是由于体积相对小得多就表现出正常状态,进一步说明了实验所用溶剂是由于汽化不完全,无法正常随载气进入到色谱柱,形成较大的死体积造成了拖尾现象的出现。
2.4 由于样品随溶剂进入色谱柱,按一定比例保留一部分在过大的死体积内,所以在出峰部位(样品保留时间)的样品量过少,响应值就很低,而且没有办法保证重复性。这样的结果既降低检出限,又不能保证准确定量。因此会出现大浓度标准样品注入会出峰,而小浓度标准样品却不能出峰或出峰很小的情况。
2.5 通常情况下,每提高柱温30度,可以使分配系数减少一半,这样是可以使前述实验中的溶剂峰形稍显好看一些,但却不能改善柱效,温度过高,一些液相会流失,因此在工作中不能过大随意改变温度,一定要在最高和最低温度之间进行测试。降低柱温可以改善分离效果,但不会改变拖尾现象,通过实验,温度改变和气流改变确实对溶剂峰拖尾情况没有改善。
3结论
3.1 根据气色谱的塔板理论,塔板数越高分离效果越好,色谱柱一旦装好,柱的塔板数在一定条件下是不会变化的,通过改变进样量,不能提高柱效,相反过多的进样量,可能对色谱柱有污染,从而降低柱效,我们在开始出现的现象,在客观上就相对地“加大”了进样量,从而造成原有的塔板无法满足对样品成分的分离作用,造成进样口样品堆积,就相当于反复注入样品,一次次从头层析,重新分离,无法实现干净的环境和准确的进样量,不能如实地反映出一组样品组分在柱子中的行进情况。
3.2 根据气相色谱的条件和国家标准方法规定,我们的进样量应控制在一定的范围内,一般液体样品要在0.1-5μl,气体在0.1-10ml之间,太低或太高的进样量都可能改变标准方法的检出限,是不可取的。因此采用减少进样时来改变图形效果没意义。
3.3 分析本实验出现的现象,我认为,正是色谱进样端汽化腔过小,样品来不及完全汽化或者汽化后无法一次进入柱子,造成溶剂峰的假拖尾现象,改变柱温,无论增高或降低都没有改善效果,是因为没有解决问题的实质,通过减小进样量,能够改善峰形恰恰说明了这一问题,由于增大进样端汽化腔,满足了全部汽化所需空间条件,而明显改善了图形效果。根据塔板理论,我们所用的柱子塔板数在2000-3000以上,进样前端少量掏空,对塔板影响不是很大,实验结果也能体现出保证分离能力,是可行的。
3.4 将色谱柱的进样少量掏空实验,这和毛细管色谱柱将进气端适量剪切方法差不多,可以在适当的情况下分析使用,也可以用来处理使用时间较长,可能有少量污染情况下的柱子,具体掏空多少,如何掏,应通过实验来慢慢进行,只要够达到分离效果,检出限也能达到要求就可以进行尝试。
参考文献:
[1]H・M・麦克奈尔,E・J 博内利.气相色谱基础[M].林炳承,译.北京:人民教育出版社,1979.
篇4
【摘要】 建立了高效液相色谱串联质谱(HPLCMS/MS)测定猪肉样品中新型兽药泰拉霉素残留的方法。样品用V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30混合溶液提取，经离心后用PCX固相萃取小柱净化， 以SymmetryC8色谱柱为分离柱，在串联质谱多反应监测(MRM)模式下检测，内标法定量。方法的线性范围为10～500 μg/kg，检出限为5.0 μg/kg，在3个浓度水平(10，20和50 μg/kg)进行添加实验，平均回收率为93.1%～105.5%; 批内相对标准偏差为1.5%～4.6%; 批间相对标准偏差为1.8 %～5.6%。
【关键词】 高效液相色谱串联质谱， 猪肉， 泰拉霉素， 残留
1 引 言
泰拉霉素(Tulathromycin)是一种新近上市且为动物专用的大环内酯类半合成抗生素，分子式为 C41H79N3O12(分子量806)，其分子结构如图1所示。我国农业部在2008年第957号公告中首次批准使用泰拉霉素。泰拉霉素主要用于放线杆菌、支原体、巴氏杆菌、副嗜血杆菌引起的猪、牛的呼吸系统疾病。具有用量少、一次给药、低残留、动物专用等优点[1，2]。我国广泛使用的大环内酯类药物为泰乐菌素和替米考星，虽然这两种药物的使用效果良好，但随着使用时间的延长， 图1 泰拉霉素分子结构式
Fig.1 Structure of tulathromycin在很多地区出现了不同程度的耐药性[3]，而泰拉霉素药效强于泰乐菌素、替米考星和氟苯尼考等市场广泛使用的大环内酯类药物，因此，泰拉霉素必将在畜禽生产中大量使用。作为一种新药，泰拉霉素的残留检测方法的研究尤为必要。目前，大环内酯类药物残留检测方法有ELISA筛选法[4]、薄层色谱法[5]、气质联用法[6]、高效液相色谱[7～10]和高效液相色谱串联质谱法等[11，12]。有关泰拉霉素的残留检测研究较少[13]。本研究建立了以罗红霉素(C41H76N2O15， 837)为内标的泰拉霉素的HPLCMS/MS检测方法，方法的定量限为10 μg/kg，可以满足有关法规对大环内酯类药物的检测要求，为动物组织中泰拉霉素的残留监控提供技术支持。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司);固相萃取仪(美国Supelco公司);PCX固相萃取柱(3 mL， 60 mg， Agela公司);T25B组织匀浆机(德国Ika公司);RE120旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司);MS1Minishaker旋涡混合器;EEVAP水浴氮气吹干仪(美国Organomation公司);超纯水器(美国MilliQ公司)。
泰拉霉素标准品与罗红霉素内标(Sigma公司)、乙腈、甲醇、H3PO4为色谱纯;甲酸、KH2PO4、 NH3·H2O为分析纯;实验室用水为MilliQ高纯水。
2.2 标准溶液的配制
泰拉霉素标准储备液：准确称取泰拉霉素10.0 mg，用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)定容至10 mL，摇匀，置冰箱冷藏储存，有效期3个月。内标物罗红霉素的配制方法同泰拉霉素。
添加溶液的配制：吸取储备液1 mL于100 mL容量瓶中并用V(0.05 mol/L K2HPO4)∶V(乙腈)=75∶25(pH 6.0)混合液定容，再从中吸取1 mL于50 mL容量瓶中得添加液浓度为0.2 mg/L(冰箱冷藏储存，有效期2个月)。
2.3 内标物质的确定
由于大环内酯类药物的同位素内标物质很少， 至今无泰拉霉素同位素内标物出售。而测定大环内酯类药物的检测方法研究和标准修制订一般采用外标法或者采用大环内酯类某种结构相似药物作为内标物来进行定量分析。本实验选用一种没有用于兽药用途且结构与泰拉霉素非常相似的大环内酯类药物罗红霉素作为内标， 分子结构如图2所示。 图2 内标物罗红霉素分子结构式
Fig.2 Structure of roxithromycin as internal standard
2.4 供试样品溶液的制备
称取2.0 g组织样品于50 mL聚四氟乙烯塑料管中，加入10 mL提取液(V(甲醇)∶V(0.1% H3PO4)=70∶30)和适量内标工作液，7800 r/min匀质1 min后，5000 r/min离心2 min，收集上清液过已经分别用3 mL甲醇和3 mL提取液润洗过的60 g/3 L的PCX小柱，待全部过柱后，再用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，最后用4 mL 4%氨化甲醇洗脱，50 ℃水浴氮气吹干后用1 mL流动相定容，进行HPLCMS/MS分析。
2.5 LCMS/MS分析条件
SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，流动相：V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30;柱温：30 ℃，进样室温度15 ℃，进样量：10 μL，流速为0.3 mL/min。
ESI(+); 多级反应检测(MRM); 毛细管电压： 4.2 kV; 锥孔电压： 20 V; RF透镜电压： 0.2 V; 离子源温度： 110 ℃; 脱溶剂气温度： 350 ℃; 锥孔气流速： 50 L/h; 脱溶剂气流速： 600 L/h; 倍增器电压： 650 V; 二级碰撞气： 氩气。
3 结果与讨论
3.1 样品的提取和净化
泰拉霉素含3个碱性的氨基基团，为弱碱性化合物，易溶于酸性溶液和极性溶剂中，在pH 6～8的水溶液中较稳定，在酸性(pH9)条件下均不稳定。对泰拉霉素残留的提取和净化方法的设计主要依据其弱碱性、脂溶性和酸不稳定性。据文献[3]报道， 乙腈和甲醇是组织中大环内酯类药物常用的提取溶剂，且采用酸化的乙腈或甲醇为提取溶剂可促进大环内酯类抗生素从组织中溶出， 改善提取效率。本实验比较了4种提取液：乙腈0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、甲醇0.1%偏磷酸(70∶30， V/V)、乙腈0.1%磷酸(70∶30， V/V)和甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)对泰拉霉素的提取效果。结果表明，甲醇0.1%磷酸(70∶30， V/V)提取液对泰拉霉素的提取效果较好，回收率高于其它提取液，故本实验选择甲醇0.1%磷酸(70∶30)为样品提取液。液液分配(LLE)和固相萃取(SPE)是大环内酯类药物的两种主要净化手段。液液分配操作比较麻烦且回收率相对较低， 重复性较差，所以本研究采用固相萃取技术净化。比较了C18、Oasis MCX和PCX3种SPE净化小柱， 由于Oasis MCX小柱和PCX小柱兼有阳离子交换和疏水作用机制，基于泰拉霉素的弱碱性和脂溶性的理化特性，Oasis MCX小柱和PCX小柱的净化效果优于C18小柱。Oasis MCX小柱和PCX小柱提取效率没有明显差别，但PCX小柱成本低，所以，本方法选择PCX小柱。
3.2 色谱与质谱条件的优化
3.2.1 液相色谱条件的优化 泰拉霉素是弱碱性和脂溶性的极性化合物，通过选择不同规格、不同填料的色谱柱和调节流动相中缓冲溶液的pH值、离子强度和有机溶剂(如乙腈或甲醇) 的含量，从而控制泰拉霉素的离子化强度和溶解性，使其在色谱柱上获得适当的保留和有效的分离。本实验选用了SymmetryC8柱(20 mm×3.9 mm， 5 μm)，Venusil ASB C18柱(30 mm×2.1 mm， 5 μm)， XTerra MSC18柱(15 mm×2.1 mm， 3.5 μm)和XDBC18柱(50 mm×1.0 mm， 5 μm)4种不同规格、不同填料的色谱柱进行实验。结果发现，选用SymmetryC8色谱柱时，基线平稳，峰形对称，重现性好。流动相优化实验发现，当流动相为V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水溶液)=70∶30等度洗脱时，可使泰拉霉素在SymmetryC8色谱柱上得到较好的分离效果和较高的灵敏度。
3.2.2 质谱条件的优化 根据泰拉霉素的分子结构的特征，选择了ESI(+)为电离模式。通过流动注射直接进样，对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、RF透镜电压、质谱分辨率等条件进行了优化，并最终确定本方法质谱优化条件为：毛细管电压 4.2 kV，锥孔电压 20 V，RF透镜电压0.2 V，离子源温度 110 ℃，脱溶剂气温度 350 ℃，脱溶剂气流量600 L/h 。质谱图见图3，母离子、子离子以及定性、定量离子对见表1。表1 泰拉霉素的定性、定量离子
3.3 样品基质效应的消除
电喷雾离子化( ESI)方法容易受样品基质的影响。实验发现， 样品基质对离子化有非常强的抑制作用。为消除样品基质效应，以待测样品制备对应的空白样品提取液，并以其作为标准溶液的稀释溶液，可使标准和样品溶液具有同样的离子化条件。
3.4 方法学考察
3.4.1 方法的线性范围与检出限、定量限 在上述条件下，以基质添加标准曲线内标法定量(标准品色谱图如图4所示)，泰拉霉素质量浓度为10～500 μg/L时，线性关系良好，线性方程为Y=90.835X+0.187，(r=0.9993)。泰拉霉素的检出限为5 μg/kg(S/N>3)，定量限为10 μg/kg(S/N>10)，超过了国内相关标准对大环内酯类药物检测的灵敏度要求。
图4 罗红霉素(A)内标物和泰拉霉素(B，C)的色谱图
Fig.4 Chromatograms of roxithromycin (A) as internal standard and tulathromycin (B， C)3.4.2 方法的回收率与精密度 取适量空白猪肉，进行3个浓度水平(10，20和50 μg/kg)的添加回收实验，每个水平取5个平行样(添加和空白色谱图见图5)，结果见表2所示。方法的回收率为93.1%～105.5%; 批内相对标准偏差为1.5%～4.6%; 批间相对标准偏差为1.8 %～5.6%; 满足了药物残留分析的要求。表2 方法回收率及精密度
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篇5
关键词 定量结构-保留相关关系； 香精； 醛； 酮； 酯； 气相色谱-质谱； 气相色谱-红外光谱
1 引 言
气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术结合了GC高效分离和MS定性专属性强的优势，具有灵敏度高、分析速度快和鉴别能力强的特点，可同时完成待测组分的分离鉴定，适用于混合物中未知组分的定性和定量分析，在食品[1]、环境[2]、医药[3]、化工[4]等领域中应用广泛。但气相色谱的色谱柱容量有限，同系物或异构体化合物的色谱保留时间相近或一致[5]。虽然GC-MS配置的NIST数据库中已包含超过20万张化合物的EI质谱图谱，但在含有较多同系物和同分异构体的复杂样品分析中，有些化合物在EI（与GC常联用的离子化方式）电离方式下不产生分子离子峰；利用谱库检索一般只能给出某个成分的可能匹配物质，一些结构异构体的EI质谱图较为相似，仅仅依靠GC-MS得到的结果对化合物进行定性并不十分充分，需要通过其它电离技术获得分子量信息，或采用多级质谱（MSn）技术获得结构信息。研究者常通过与其它定性方法联用、建立指纹图谱[6]或化学计量学[7]的手段来弥补NIST数据库在同系物和异构体鉴定分析中的不足。气相色谱-红外光谱（GC-IR）联用技术结合了GC良好的分离能力和IR结构鉴定的优势，适合复杂未知物成分分离及其定性定量分析。另一方面，定量结构保留相关关系（QSRR）是直接利用分子结构信息关联和预测有机物的色谱保留时间[8]。多元线性回归模型是QSRR中应用广泛的一种经典建模方法，它对自变量和因变量加以线性拟合得到最小二乘意义下的最佳结果，在环境、食品、化工等领域未知化合物的分离分析中得到广泛应用[9～15]。
香精香料是食品香味的主要来源之一，它们使制造食品的香味能够与传统手工制作的食品相媲美。香精香料已经广泛应用到食品生产的各个领域，它能改善食品质量、降低生产成本、增加食品的色香味，大大提高了人民的生活质量和品味，同时促进了食品工业的快速发展[16]。醛酮酯类化合物是重要的工业原料、药物原料、合成中间体，也是合成香精香料的重要组成之一[17]。目前，醛酮酯类化合物的QSRR方面的相关研究已多有报道[18～24]。
本研究采用QSRR辅助GC-MS/IR方法快速定性分析饱和醛酮酯同系物及其同分异构体。以醛酮酯标样保留时间tR为因变量，分子拓扑指数0Q为自变量，构建简单醛酮酯类化合物定量结构-保留相关关系（QSRR），采用本方法辅助GC-MS/IR方法建立快速、准确的香精样品中醛酮酯类化合物定性分析方法。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
GC 6890N气相色谱（美国Agilent公司）；IR 6170红外光谱联用仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），另配有FID检测器；6890/5790气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，美国Agilent公司）。
2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮、5-甲基-2-己酮、3-辛酮、正己醛、1-辛醛、丙酸乙酯、丁酸甲酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、丁酸异戊酯、丁酸正戊酯、异戊酸异戊酯、丁酸己酯、乙酸戊酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、棕榈酸甲酯、三醋酸甘油酯（纯度≥99.5%，阿拉丁试剂公司）；正己烷（色谱纯，百灵威公司（上海））。香精等样品由某企业提供。
各标准品以正己烷为溶剂，配制成1000 mg/L储备液备用；单标使用液和混标使用液根据需要由储备液用正己烷稀释而成。
2.2 分析条件
2.2.1 GC-MS条件
色谱柱： Agilent HP-VOC（60 m × 0.32 mm × 1.80 μm）； 进样口温度： 260℃； 质谱接口温度270℃，离子源温度230℃，电离方式为 EI，电子轰击能量 70 eV；载气为高纯He，柱流速1.0 mL/min；进样量1 μL，分流进样，分流比为25∶1；程序升温：以5℃/min的速率从70℃升至270℃。
2.2.2 GC-IR/FID条件 Agilent HP-VOC色谱柱 （60 m × 0.32mm × 1.80 μm）；进样口温度： 260℃，FID检测器温度：250℃；载气为高纯He，柱流速1.0 mL/min；进样量1 μL，分流进样，分流比为5：1；程序升温：以5℃/min的速率从70℃升至270℃；红外光谱分辨率：16 cm1，扫描次数：8次；GC-IR接口传输线温度：270℃，光管温度：270℃。
2.3 样品处理
在0.2 mL香精样品中加入0.5 mL 正己烷，振荡2 min后，用1 mL 注射器吸取上清液，重复3次，得到1 mL萃取液，备用。
2.4 分子拓扑指数0Q
3 结果与讨论
3.1 GC-MS和GC-FID/IR中醛酮酯化合物的保留时间
结合GC-IR可对未知物进行官能团鉴定的特点，辅助GC-MS定性分析复杂样品中的醛酮酯类化合物。本研究首先考察了醛酮酯类化合物在不同方法中的色谱保留时间（表1）。结果表明，采用同一方法和同型色谱柱，由于GC-IR接口构造特殊，馏出物在气红接口中滞留时间较长，导致醛酮酯化合物在GC-MS和GC-IR/FID中保留时间不同，但色谱保留时间顺序基本一致，相应化合物的保留时间差值近似为常数，这为GC-IR辅助GC-MS用于复杂样品中未知物的分析鉴定奠定了基础。
3.2 QSRR模型建立
将17种饱和酯类化合物分为两类，其中7种乙酯类同系物（丙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、十二酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯）作为训练集，推测对应关系式；剩余的不同取代基的其它酯类化合物作为预测集，用于检验方法准确性。饱和酯类化合物的Q值、在GC-MS方法中保留时间实验值见表2。由表2可知，乙酯类同系物的色谱保留时间与其分子结构参数Q值间存在良好的线性关系，相关系数为0.997。由于这些乙酯类同系物都是直链羧酸基乙酯，在GC中存在良好的碳数规律。因此，本对应关系式与同系物碳数规律结果一致。此对应关系式对其它酯类化合物的保留时间预测值也列于表2。
由于作为预测集的酯类化合物与训练集的乙酯类化合物的结构存在较大差异，单独采用保留时间碳数规律无法得到良好的预测。但经过分子拓扑结构处理后的结果表明，酯类化合物的保留时间与其对应的Q值能很好地符合此线性关系，预测值与实验值的偏差不超过5%。
对于醛酮类化合物，以2-戊酮、3-戊酮、2-己酮、4-庚酮及5-甲基-2-己酮作为训练集，将醛酮化合物在不同方法上的色谱保留时间（tR）与相应化合物的0Q进行多元线性回归分析。结果表明，tR与0Q具有良好的相关性，其相关系数R2=0.997。其中醛酮化合物在GC-MS方法中色谱保留时间（tR）与0Q的拟合方程为：
tR=0.9090Q-8.141（4）
以4-庚酮、3-辛酮、1-辛醛和4-壬酮为测试集，用公式（4）对测试集在GC-IR方法中的色谱保留时间进行预测，所得预测值及其与实验值的相对偏差见表3。结果表明，测试集化合物的预测值与实验值的相对偏差小于3.4%，表明模型预测能力较强。
3.3 QSRR辅助GC-MS/IR方法在复杂样品醛酮酯类化合物鉴定中的应用
3.3.1 香精样品1#分析 采用GC-MS分析香精样品1#的正己烷萃取液（图1A）。通过NIST质谱图谱库搜索，其中9、16、19和24号峰可能为醛酮类化合物，相应化合物及其匹配度见表4。
由图1A可见，3号和16号谱峰的匹配度并不高，而24号谱峰不仅质谱匹配度低，而且给出了相似匹配度的不同化合物。本研究进一步采用GC-IR分析该样品（图1B），结合IR谱库鉴定结果，可以基本确定谱峰9和19为醛酮类化合物，峰3为酯类化合物，但具体结构无法确定。
为了准确确定这些醛酮酯类化合物的同系物结构，采用QSRR模型进一步处理。表5给出了6～14个碳直链饱和醛的0Q值及其根据已知模型中拟合公式得到的色谱保留时间预测值。
为壬醛。而24号峰（十三醛和十四醛）相应的色谱保留时间预测值与实验值相对误差相当大，初步判断MS谱库推荐的两个可能结果均不正确。根据保留时间预测值与实际色谱保留时间判断，24号谱峰应为十一醛。通过标准样品对预测结果进行核实， 3号峰为丁酸乙酯；16号峰为壬醛；24号峰为十一醛，证明采用QSRR结合GC-MS/IR能准
确判断未知化合物的结构。
3.3.2 香精样品2#分析 香精样品2#经正己烷处理后的GC-MS分析结果见图2，通过NIST质谱谱库搜索给出的相应化合物及其匹配度见表6。
结果表明，虽然GC-MS NIST谱库和GC-IR都显示香精样品2#中含有多个酯类化合物，但GC-MS对多个酯类化合物的同系物给出了匹配度相近的可能结果，单独通过GC-MS或通过GC-IR辅助MS难以准确简单酯类化合物同系物的结构。为此，本研究通过NIST推荐的化合物的0Q值并结合QSRR已建立的模型进行预测。结果表明，辛酸乙酯、十二酸乙酯、癸酸异戊酯和十五酸乙酯的预测保留时间与实验中2， 8， 9和10号峰的保留时间吻合度较好，进一步采用相应标准样品进行对比，最终确定预测结果与实际结果一致。
4 结 论
根据分子拓扑指数0Q和色谱保留时间关系，建立了醛酮酯类化合物的QSRR模型tR=0QA+B，该模型因变量、自变量具有较好的线性相关性，预测能力良好。采用GC-MS、GC-IR对香精样品分离分析并进行初步定性，利用所建立的tR-0Q模型对初步定性结果辅助定性确定准确的定性结果，确立了快速、准确判定香精香气等复杂样品中未知化合物结构的分析方法。本方法中气相色谱采用的色谱柱均为HP-VOC柱，在其它色谱柱体系，本方法并不适用。另外，本方法的tR-0Q模型对脂肪族饱和醛酮酯类化合物的能够准确定性，但对苯系物或不饱和化合物的定性误差较大。
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篇6
【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法。方法 色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。结果 样品的室内加标平均回收率为86.7％～91.8％，室内相对标准偏差为4.5％～6.0％，室间加标平均回收率为81.4％～95.0％，室间相对标准偏差3.7％～7.1％，定量测定低限（LOQ）为10μg/kg。结论 本方法简便，准确，可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留含量的测定。
【关键词】 高效液相色谱法;脂肪;醋酸美仑孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮
Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC
【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.Methods Chromatographic separation was carried out on a C18column（250mm×4.6mm，5μm）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μl.Results The intra-laboratory average recoveries ranged from 86.7％～91.8％ and RSD of 4.5％～6.0％.The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 81.4％～95.0％ and RSD of 3.7％～7.1％.The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/kg.Conclusion The method is simple and sensitive.It is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.
【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate
醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)恶心、头晕、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，会增加女性后代的男性化作用。孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显著和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力。畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害。因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的。
检测孕激素类药物的方法有很多，如液相色谱/质谱法（LC/MS）［1］、气相色谱/质谱法（GC/MS）［2，3］和液相色谱法［4～6］等。本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测。
1 试剂与仪器
1.1 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品（Sigama公司），乙腈（HPLC级），甲醇（HPLC级），乙酸乙酯（HPLC级），其他试剂为分析纯。水由Milli-Q净化系统（Millipore公司）制得。
（1）标准储备液：1000μg/ml，分别准确称取0.050g醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于50ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
（2）混合中间溶液I：100μg/ml，分别吸取10.0ml醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用一年。
（3）混合中间溶液II：1.0μg/ml，取1.00ml混合中间溶液I于100ml容量瓶中，用甲醇定容。于4℃保存，可使用半年。
（4）混合标准工作液：分别吸取10、20、40、80、100μl混合中间溶液II添加到980、970、950、910、890μl的乙腈-水（65:35）中，再加入10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml和0.10μg/ml混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用。
1.2 仪器 Waters液相色谱系统，510泵体，486紫外-可见光检测器，Emprower pro色谱软件。氮气吹干仪（Organomation Associates，Jnc.公司）；固相萃取装置（Supelco公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；涡旋混匀器（XW-80A型，上海医大仪器厂）；CN固相萃取柱（3ml，Waters公司）。
2 测定步骤
2.1 试样的制备与保存
2.1.1 试样的制备 把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入150ml的烧杯中，将烧杯置于微波炉内。根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热30～60s，如果脂肪没有融化，可在间隔30～60s以后重复加热30～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中。把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记。
2.1.2 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中，冷冻保存。
2.2 提取 称取熬制好的脂肪油2.00±0.01g，置于50ml具塞离心管中，加入5ml乙腈，于60℃水浴中保温3min以使固体脂肪溶化，涡旋振摇1min，在-5℃下离心7min（离心力1160g），吸取上清液至15ml带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入5ml乙腈重复提取一次，合并上清液。在合并的乙腈提取液中加入2×2ml正己烷，涡旋振摇1min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），弃去正己烷层。乙腈提取液于60℃中用氮气吹干仪吹干，残渣待皂化。
2.3 皂化 在残渣（2.2项）中依次加入4ml正己烷、1ml 0.1mol/L 氢氧化钠溶液和0.5ml1.0mol/L氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀10s，在60℃水浴中保温15min，于-5℃中离心5min（离心力1160g），吸取上清液至15ml玻璃试管。在沉淀物中再加入4ml正己烷混匀后，在60℃水浴中加热15min后，在-5℃中离心5min（离心力1160g），合并上清液。于60℃中用氮气吹干仪吹干，用1.0ml正己烷溶解残渣，待净化。
2.4 净化 将皂化后的样液（2.3项）倒入经5ml乙酸乙酯和6ml正己烷预处理过的CN柱中，用2×1ml正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到CN柱中。待样液流过后，依次用5ml正己烷和6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气2min。最后用3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于15ml玻璃试管中，于60℃中用氮气吹干仪吹干。残余物用990μl乙腈-水（65:35）涡旋溶解，静止15min后，加入10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定。
2.5 测定
2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；预柱：C18柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-水（65:35）；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。
2.5.2 液相色谱测定 根据样液中3种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中3种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作液和样液等体积参样测定。在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图1。
图1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美仑孕酮
3 结果与讨论
3.1 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在0.010～0.10μg/ml范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数（γ2）均大于0.998。
3.2 回收率、精密度和定量检测限 本实验以2种脂肪（牛脂肪和猪脂肪）作为样本。取适量标准品加入到2.0g样品中，使添加量相当于10、20和50μg/kg，每个添加水平各取24份试样（每种脂肪各12份）。图2为空白脂肪样品和添加样品（10μg/kg）的色谱图。表1为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度。表2为8家实验室的室间回收率和精确度结果。根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限（LOQ），LOQ为10μg/kg，满足残留限量的检测要求。
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篇7
实验方法试剂与药品
本实验中猪肉由本地市场采购。所有试剂都是质谱纯级，高效液相纯级或分析纯级。乙腈和水由Scharlau公司提供。乙酸乙酯、异丙醇由Fisher公司提供。标准物均采购自国家药品生物制品检定所(NICPBP)，以甲醇配制单个标准溶液(1.0mg／mL)，并在4℃下冷藏。以甲醇－水(10：90)配制合并工作溶液(10μg／mL)，并在4℃下冷藏。添加溶液应每周配制，以适当稀释合并工作溶液来制备。
设备与材料
安捷伦1200高效液相色谱系统，安捷伦6460三重四极杆液相色谱一质谱／质谱联用系统，安捷伦SamliQ SCX聚合物柱，50×3mL管，60mg(部件号：5982－3236)，安捷伦ZORBA×EcipsePlus C18色谱柱，50×2.1mm，1.8μm(部件号：959741-906)，安捷伦真空歧管处理盒(部件号：5982-9120)。
样品制备
液－液提取：于1.5mL带盖聚丙烯管中称取2g猪肉(精确至±0.01g)。加入8mL0.2M的乙酸钠(pH值5.2)溶液，并涡旋以混合均匀。然后加入β2－葡萄糖醛酸酶(1000U／mL)100μL，并涡旋混合2分钟。样品在37℃下水解16小时，水解产物经震动处理15分钟后，在离心机中用4000 rpm的速度离心分离10分钟。取4m上层清液至另一离心管中，加入5mL、0.1 M高氯酸溶液并调节pH值至1±0.3，再在离心机中以4000 rpm的速度离心分离10分钟。将上层清液移至另一试管中，用10M氢氧化钠溶液调节其pH值至11。
于样品试管中分别添加10mL饱和氯化钠溶液和异丙醇一乙酸乙酯(60：40)混合液，并震动处理5分钟。以4000 rpm离心分离5分钟后，将有机层仔细转移至另一离心管中。将异丙醇一乙酸乙酯混合液的添加、震动处理，离心分离和转移有机液层的过程重复两次，并将所有上清液合并。样品于40℃以氮气吹干，并将残留物复溶于5mL、0.2M的乙酸钠(pH值5.2)溶液中。该样品将用于固相萃取纯化。
固相萃取
固相萃取过程(SPE)如图1中所示。先用3mL甲醇活化安捷伦SampliQSCX柱，然后用3mL水平衡。取5mL样品溶液载入到柱中，并以重力通过色谱柱(约1 mL／min)。用2mL水和2mL、2％甲酸水溶液；中洗SPE／小柱，丢弃所有洗脱液。真空抽干SPE／小柱。最后以5mL、5％氨甲醇溶液洗脱，流速约为1mL／min。洗脱液于40℃氮气吹干，残留物复溶于1mL、0.1％甲酸的水／乙腈(90：10)溶液。样品经涡旋混合和超声波处理以完全溶解后转移至1.5mL离心管中，并在3000 rpm条件下处理5分钟。最后将样品转移至2mL的色谱小瓶中等待分析。
仪器条件
高效液相色谱条件
色谱柱：安捷伦ZORBAX EcllpsePlus C18色谱柱，50×2 1mm，1.8μm(部件号959741-906)，
流速0.4mL／mln；
柱温40℃：
进样体积：5μL：
流动相：水(0.1％甲酸溶液+2mM乙酸铵，A)；
乙腈(0.1％甲酸，B)；
梯度淋洗：
质谱条件
在正极模式下对4种化合物进行了监测。离子源条件如图2所示，多反应监测通道如表2中所示。
结果与讨论线性与检测限
实验中标准工作曲线(0.2b、0.5、1.0，2.0和5.0ng／g)是以添加适量混合工作溶液于空白基质来配制的。空白基体是通过将猪肉进行水解、液液萃取和固相萃取来制备的。校准曲线的结果如表3中所示。检测限(LOD)定义为每个化合物给出信噪比(S／N)大于3:1时的浓度。各化合物的检测限也列于表3中。
回收率与重现性
在猪肉中分别添加标样浓度为0.5、1.0、2.0ng／g，计算回收率和重现性。每个浓度重复分析6次。回收率和重现性数据列于表4中。添加猪肉萃取物(1.0ng／g)的色谱图如图3中所示。
结论
篇8
关键词 超高效液相色谱.串联质谱法； 痕量残留； 猪尿液； 瘦肉精
1 引 言
“瘦肉精”（Lean meat agents）最早是盐酸克伦特罗的俗称，现在泛指一类可以促进动物生长，提高瘦肉率的药物[1]，主要包括盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林等β.受体激动剂，以及近年来监测发现的赛庚啶、可乐定等具有促进动物生长、提高饲料转化率的化合物[2]。由于上述药物在动物性食品中的极易残留，会对食用者产生系列毒副作用，因此，包括我国在内的许多国家和国际组织已经制定了极其严格的规定。到目前为止，我国已明确禁止在食品动物养殖过程中使用克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、苯乙醇胺A、氯丙那林、多巴胺、班布特罗、齐帕特罗、马布特罗、西马特罗、溴布特罗、福莫特罗/阿福特罗、特布他林、赛庚啶、可乐定共15种具有促进动物生长、提高瘦肉率的药物[1]。
近年来，我国加大了对明令禁止的上述15种“瘦肉精”非法使用的打击力度，“瘦肉精”药物在畜禽养殖中的非法使用得到了有效遏制，然而具有促进动物生长、提高瘦肉率功效、而未被列入国家禁用药物名单的β.受体激动剂同系物或衍生物（如克罗潘特、羟甲基克伦特罗、克伦丙罗、西布特罗、妥布特罗、马喷特罗、喷布特罗、卡布特罗、丁酚胺、利托君、克伦己罗、克伦塞罗、异克伦潘特、溴氯特罗、苯氧丙酚胺等）极易被不法分子利用，作为新型“瘦肉精”替代物，用于生猪养殖过程中，达到非法牟利的目的，进而威胁广大消费者的健康安全。
尿液常被选择作为药物代谢、残留消除实验的重要靶组织，而且，与其它组织样品相比，尿液在样品采集过程中可有效避免对动物造成损伤，因此，动物尿液通常作为大批量样品监测的测试对象[3]。近年来，研究者针对动物尿液中β.受体激动剂药物残留建立了包括液相色谱[4]、气相色谱.串联质谱[5]、液相色谱.串联质谱[3，6～11]、ELISA[12]、胶体金试纸法[13]、免疫传感器[14]、液相芯片法[15]等一系列快速检测及定量确证检测方法。而赛庚啶、可乐定作为新型“瘦肉精”药物，分别属于H1受体拮抗药和α2.受体激动剂[14，15]，其化学结构与β.受体激动剂药物有较大的差异（各药物的化学结构见图1），理化特性、色谱行为也有较大差别，因而同时检测赛庚啶、可乐定与β.受体激动剂的方法鲜有报道[16]。
本研究建立了超高效液相色谱.串联质谱快速、简单地同时测定猪尿液中30种不同种类“瘦肉精”药物（赛庚啶、可乐定及28种β.受体激动剂类）残留的方法，为加强生猪养殖、屠宰过程中违法使用不同种类“瘦肉精”的监管提供了可靠的技术支撑。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
AcquityTM UPLC.Xevo TQ MS超高效液相色谱.串联质谱仪（配电喷雾离子源）、UPLC CSH C 18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、固相萃取装置、Oasis MCX固相萃取柱（60 mg， 3 mL）均为美国Waters公司产品； 5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）； 氮吹仪（美国Organomation公司）。
标准品： 盐酸克仑特罗（Clenbuterol hydrochloride， 98.5%）、盐酸溴布特罗（Brombuterol hydrochloride， 98.5%）、盐酸班布特罗（Bambuterol hydrochloride， 98.0%）、莱克多巴胺（Ractopamine， 97.0%）、沙丁胺醇（Salbutamol， 100%）、盐酸克伦潘特（Clenpenterol hydrochloride， 99.5%）、羟甲基克伦特罗（Hydroxy.methyl clenbuterol， 99.0%）、克伦丙罗（Clenproperol， 99.0%）、特布他林（Terbutaline， 985%）、非诺特罗（Fenoterol， 100 mg/L， 溶于乙腈）购自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司； 苯乙醇胺A（Phenylethanolamine A， 98.0%）、盐酸马布特罗（Mabuterol hydrochloride， 99.0%）、齐帕特罗（Zilpaterol， 98.0%）、卡布特罗半硫酸盐（Carbuterol Hemisulfate Salt， 98.0%）、硫酸丁酚胺（Bamethane sulfate， 98.0%）、苯氧丙酚胺（Isoxsuprine， 98.0%）购自Toronto Research chemicals INC公司； 盐酸利托君（Ritodrine， 98.0%）购自Tokyo Chemical Industry公司； 盐酸可乐定（Clonidine hydrochloride）、盐酸赛庚啶（Cyproheptadine hydrochloride）购自European Pharmacopoeia公司； 氯丙那林（Clorprenaline， 99.0%）、西布特罗（Cimbuterol， 99.0%）、西马特罗（Cimaterol， 99.0%）、妥布特罗（Tulobuterol， 99.0%）、克伦己罗（Clenhexerol， 99.6%）、盐酸克伦塞罗（Clencyclohexerol hydrochloride， 99.0%）、盐酸异克伦潘特（Clenisopenterol hydrochloride， 99.7%）、盐酸马喷特罗（Mapenterol hydrochloride， 99.0%）、盐酸溴氯特罗（Bromchlorbuterol hydrochloride， 99.0%）、盐酸喷布特罗（Penbutolol hydrochloride， 99.0%）购自Witega Laboratorien BerlinAdlershof GmbH公司； 酒石酸福莫特罗 （Formoterol tartrate， 98.0%）购自美国International Laboratory 公司。
2.2 标准溶液配制
分别准确称取各标准品（10.00±0.10）mg， 以甲醇溶解并定容至10 mL， 即为各标准物质储备液。分别量取适量的30种药物储备液于另一洁净10 mL容量瓶中混合，配制100 μg/L混合标准工作液， 20℃保存备用。
2.3 样品前处理
准确量取尿液5.00 mL于50 mL具塞离心管中，5000 r/min离心5 min，将上清液用5%乙酸溶液调至pH 3.0后，加入经3 mL甲醇、3 mL水活化的MCX柱，分别用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，真空泵抽干后以3 mL 5%氨化甲醇洗脱，45℃水浴条件下N2吹近干，用1 mL 0.1%甲酸.乙腈（9∶1， V/V）溶液复溶，UPLC.MS/MS检测。
2.4 色谱.质谱条件
色谱条件： 流动相A为0.1%甲酸溶液，B为乙腈，液相洗脱梯度程序： 0～1.0 min，95% A； 1.0～3.0 min，95%～87% A； 3.0～4.0 min，87%～60% A； 4.0～5.0 min，60%～10% A； 5.0～5.1 min，10%～95% A； 5.1～7.0 min，95% A。进样量： 5 μL，柱温： 35℃，流速： 0.3 mL/min。
质谱条件： 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式。毛细管电压2700 V，离子源温度150℃，雾化室温度450℃，去溶剂气（氮气）流量： 1000 L/h； 锥孔气（氮气）流量： 50 L/h； 碰撞气（氩气）流量： 0.24 L/h。
3 结果与讨论
3.1 质谱参数的确定
选择一定浓度的标准溶液，利用Intelstart软件，以ESI正离子模式对待测药物进行母离子确认及子离子全扫描。确定以[M+H]+作为各药物的分子离子，分别对仪器的锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，进行子离子扫描，选取2个丰度强、稳定的碎片离子作为定性与定量离子，以满足欧盟2002/657/EC[17]对于禁用药物LC.MS/MS方法的定性监测的规定，即满足1个母离子、2个子离子共4个鉴定点数的要求。因此，本方法根据待测药物的保留时间，采用分段扫描的方式对不同药物的特征离子进行数据采集，以提高灵敏度。30种药物的保留时间及定性、定量离子等参数见表1。
3.2 色谱条件的优化
由于28种β.受体激动剂药物具有较为相似的化学结构及相近的色谱保留特性，而可乐定和赛庚啶与β.受体激动剂药物化学性质、色谱行为差异较大[16]，为了将上述药物在尽可能短的时间内有效分离，本实验分别考察了BEH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、BEH Shield RP 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）4种型号的色谱柱对30种目标化合物的分离效果。结果表明，HSS T3色谱柱对目标化合物的保留能力较弱，尤其是沙丁胺醇、西马特罗、特布他林等12种极性较强的药物，即使用含量低于5% 的乙腈进行淋洗，其保留时间均小于1.0 min， 且不能有效分离。其余3种色谱柱均能有效保留30种药物，而采用CSH C 18色谱柱较BEH C 18和Shield RP 18色谱柱，可有效分离上述药物，且各化合物峰形尖锐。图2为30种典型的瘦肉精的空白和加标样品色谱图。
为了更好地将待测物有效分离，降低共流出物基质干扰，本实验还考察了甲醇、乙腈分别与水、0.1%甲酸及含 50 mmol/L甲酸铵的0.1%甲酸溶液等作为流动相，对目标化合物的峰形、分离度、灵敏度等的影响。结果表明，流动相中添加甲酸后，待测物的信号强度明显提高，且药物保留时间有所提前； 而以50 mmol/L甲酸铵.0.1%甲酸溶液作为流动相时，待测物的信号强度、分离度等与0.1%甲酸溶液无显著差异。甲醇和乙腈作为流动相对信号强度的影响不显著，而甲醇作为流动相进行梯度洗脱时，色谱柱压差变化范围较大，平衡时间延长。因此，本实验采用UPLC CSH C 18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）作为分析柱，以乙腈.0.1%甲酸作为流动相进行梯度洗脱。30种“瘦肉精”药物可在5.0 min内实现良好分离，各药物的定量离子的提取离子色谱图如图2所示。
3.3 样品前处理条件的优化
本方法采用将尿液简单离心，直接用MCX固相萃取柱净化的样品前处理方法。为了充分确保本方法的可靠性，本实验考察了文献[5，19～21]所采用的样品前处理方法（需酶解、液液萃取和/或固相萃取等步骤），分别采用叔丁醇.叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯/异丙醇[5，20]、HClO4[20，21]等试剂对猪尿样品中待测药物的提取，对各操作方法的提取操作步骤、所需的主要化学试剂及数量、方法的回收率、精确度等技术参数进行比较。检测结果表明，本方法不仅可获得较为满意的方法准确度、精确度（如表2所示，本实验采用尿液经离心后直接净化，30种药物的回收率在67.6%～103.2%，相对标准偏差为2.8%～16.8%），满足药物残留定量确证检测的要求，而且操作步骤简单、快速，试剂使用量少，不需要复杂的样品前处理步骤，平均每个样品的提取、净化过程仅使用很少量的有机溶剂（约7 mL甲醇），较文献[5，19～21]大大减少了有机溶剂的使用量，尤其是高氯酸等卤素试剂的使用量。本方法可作为环境友好型的样品前处理方法，适用于猪尿液样品中不同种类“瘦肉精”多残留大批量样品的筛选及确证检测。
3.4 方法学考察
3.4.1 基质添加标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和定量限 在上述最佳色谱.质谱条件下，将空白猪尿样品按照2.3节进行样品处理，在洗脱液中加入一系列30种药物混合标准溶液（0.1， 0.3， 0.5， 1.0， 2.0， 5.0和10.0 μg/L），LC.MS/MS进行检测，以各组分的浓度与其定量离子峰面积进行线性回归，呈良好的线性关系（r2>0.992）。以3倍信噪比（S/N）计算，本方法测定猪尿液中30种“瘦肉精”药物的检出限为0.1 μg/L； 以l0倍信噪比（S/N）计算，定量限为0.3 μg/L。
3.4.2 准确度和精密度 本实验，分别在猪尿液中以3个浓度水平（0.3， 0.6和3.0 μg/L）进行空白样品加标回收实验，考察方法的回收率、日内变异系数和日间变异系数，以基质添加标准曲线进行校正，结果如表2所示。30种“瘦肉精”药物的平均回收率在67.6%～103.2%之间，日内、日间相对标准偏差分别为2.8%～16.8%和2.6%～15.8%。
3.5 实际样品的检测
运用本方法对浙江省某生猪屠宰场随机抽取的100份猪尿液进行测定，与农业部1025号公告.11.2008[5]和农业部1063号公告.3.2008[19]两个标准方法的测定结果基本一致，有1份样品检出莱克多巴胺残留，其余样品均未检出“瘦肉精”药物残留。利用本方法及两个行业标准测定的检出值分别为6.58、7.03和6.46 μg/L，变异系数小于4.5%； 而本方法却极大地节省了检测时间， 有机溶剂使用较少， 说明本方法简单快速、灵敏、可靠。
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篇9
关键词：苯唑西林钠；反相高效液相色谱法；物质；测定；检测
苯唑西林钠是青霉素抗生素类的一种常见药物，不仅用于口服，目前很多临床诊疗中都将这类药物作为肌肉注射药物，主要用于治疗轻度感染方面。但如果采用静脉注射还是静脉滴注，那说明患者的感染比较严重，是用于葡萄球菌等抗生菌药物的常见方式。近年来，随着人们健康医疗医师的不断提升，对于各类药物的使用安全提出了新要求，由此做好这些药物相关物质检定工作不容忽视，也是临床诊疗工作重点所在。下面我们就反相高效液相色谱法在苯唑西林钠中的具体检测应用情况作了深入分析。
1 仪器与药物的选择
1.1 仪器选择
在本次试验中所选择的高效液相色谱仪主要是以美国某公司生产的，它包含了四元梯度泵、自动进样器等。电子天平主要选择了梅特勒240型号，其灵敏度最高达十万分之一。
1.2 药物的选择
本次试验中，苯唑西林钠的选择是严格按照其药物性质开展的，这类药物作为耐酸耐酶的半合成青霉素药物，具体疗效与青霉素相差无几，属于细菌细胞蛋白结合药物，主要在于影响细胞细胞壁的合成，从而达到杀菌、消毒、消炎的作用。目前，我国国内生产的苯唑西林钠普遍都为无菌分装、无辅料的方式。但是时至今日，国内对这些药物的检定标准并不都，各种鉴定结果还并不是很完善。在本次试验中我们选择的苯唑西林钠为注射用药，药物规格为：0.5g・瓶-1，乙腈和醋酸铵都满足国家生产标准和用药标准。水主要为纯净水（即蒸馏水）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱条件的预备工作主要包含了对色谱柱、醋酸铵溶液、流动相等准备工作的开展。色谱柱主要为C18，其内部物质为250mm×46mm.醋酸铵溶液在配备的时候酸碱值为5，与乙腈的比例为75：25；流动相为0.01mol・min-1。
2.2 检测波长的选择
此次实验工作的目标在于注射用苯唑西林钠，因此在检测的时候首先用电子天平城区一定量的苯唑西林钠含量，并且用流动相溶解的方法将其制作成为含1mg・ml-1的苯唑西林钠溶液，用二极管阵列检测的方式对这些溶液中的含量进行检测，通过扫描得出溶液汇总的波长为400～200nm。通过研究得出，这些波长在225nm的时候吸收能力最强，杂质也比较少。因此在具体的研究中我们可以将225nm波长作为研究重点，具体如图1所示。
2.3 色谱条件的选择与优化
2.3.1 溶液的制备。称取注射用苯唑西林钠25.16mg，置25mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。
2.3.2 流动相pH值的确定。用醋酸和三乙胺调节不同pH值的流动相进行试验，结果表明在pH值为5.0时，峰的对称性最好。
2.3.3 缓冲盐浓度的确定。配制不同浓度的醋酸铵溶液作为流动相水相进行试验，结果表明在浓度为0.01mol・L-1时，杂质的分离度与对称性最好。
2.4 方法的专属性考察
2.4.1 酸破坏。称取注射用苯唑西林钠约25mg，置于25mL量瓶中，加1mol・L-1盐酸10mL溶解后，放置1h，调节pH值至7.0，再加流动相稀释至刻度。
2.4.2 碱破坏。称取注射用苯唑西林钠约25mg，置于25mL量瓶中，加0.05mol・L-1氢氧化钠溶液2mL溶解后，放置3min，调节pH值至7.0，再加流动相稀释至刻度。
2.4.3 氧化破坏。称取注射用苯唑西林钠约25mg，置于25mL量瓶中，加3%过氧化氢2mL溶解后，放置2h，调节pH值至7.0，再加流动相稀释至刻度。
2.4.4 热破坏。称取注射用苯唑西林钠约25mg，置于25mL量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，70℃水浴中加热2h，放冷至室温。
2.4.5 光照破坏。称取注射用苯唑西林钠约25mg，置于25mL量瓶中，用流动相溶解稀释至刻度，用3000～4000Lx光照射10d。具体结果间图2所示。
2.5 线性关系
精密称取注射用苯唑西林钠58.57mg置50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取2.5mL置100mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1、2、4、6、10、12和24mL各置25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件分别精密量取10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以供试液浓度C（μg・mL-1）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，回归方程为：A=5.238×104C+4.182×103，r=0.9998，表明苯唑西林钠浓度在1.171～28.11μg・mL-1与峰面积呈良好的线性关系。
3 讨论
中国药典2010年版二部收载了本品的质量标准，有关物质的检验方法和限度设定系完全参照BP2008制定，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，并采用相对保留时间对其中的特殊杂质进行定位[杂质B≤1.5%、杂质D≤0.5%、杂质E（即氯唑西林）≤1.0%、其他单个杂质≤0.5%，总杂质≤3.0%]。经对该方法进行方法学考察，发现采用相对保留时间对特殊杂质定位的误差较大，且色谱系统的耐用性不好，部分色谱柱的分离度无法达到要求或完全无法分离。本文采用的HPLC色谱条件能将各杂质进行有效分离，且实验中选择醋酸铵溶液作为流动相的水相，便于将质谱仪串联于PDA检测器之后，流出液可直接进入质谱仪，利于后续研究的进行。选择醋酸铵溶液浓度为0.01mol・L-1，峰形对称，柱效高，基线平稳。
结束语
在酸、碱、氧化破坏试验中表明，本品易受这些条件的影响，光照与温度也易影响本品的质量，故应注意本品的储藏条件和使用的期限。
参考文献
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[2]乐健，陈桂良，洪战英.HPLC法用于苯唑西林钠及其制剂中含量和有关物质的测定[J].中国抗生素杂志，2014（9）.
篇10
关键词：1，4二氯苯；吹扫捕集；气相色谱；毛细管柱；1，4二氯苯
中图分类号：TG4 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）06-0050-02
1，4二氯苯广泛用于工业用和家用产品，如气味掩盖剂、染料和杀虫剂，有资料显示DCB短期接触后会对人体造成急性溶血性贫血、肾小球肾炎，长期接触1，4二氯苯会引起网状内皮系统紊乱、中枢神经受影响和肝损伤。1，4二氯苯是《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）要求检测的有机物指标，规定在饮用水中的含量不得超过0.3mg/L。GB5749-2006中采用填充柱进行分离，由于填充柱分离度、灵敏度不高，使用效率较低。吹扫捕集技术具有浓缩倍数高、可测定范围宽、无溶剂污染等优点，是测定水中挥发性有机物的有效方法，为此建立毛细管柱气相色谱法测定水中1，4二氯苯，其分离度好，采用吹扫捕集进样，预处理简单快速，灵敏度高。
1 试验仪器与试剂
1.1 试验仪器
安捷伦7890气相色谱仪，ECD检测器，毛细管柱使用19091J-413毛细管柱（30m×0.32mm×0.25um），
色谱柱使用HP-5型；吹扫捕集进样器使用美国
TELEDYNE TEKMAR（型号），5mL注射器。
1.2 试验试剂
标准溶液：购自百灵威公司（J&K）1，4二氯苯浓度为100mg/L。
甲醇：色谱纯。
纯水：无挥发性有机物（VOCS）超纯水。
2 试验方法
2.1 样品进样处理
采用直接进样方式，进样时用5mL注射器于待测水样中抽吸几次，排出气泡后迅速注入吹扫捕集进样器中，按预先设置好的条件进行分析。
2.2 标准曲线的制备
将浓度为100mg/L的1，4二氯苯标准溶液用甲醇配置成1mg/L的1，4二氯苯储备溶液，然后用纯水配置成100μg/L的1，4二氯苯标准使用溶液，再取4个100mL的容量瓶，分别取1mL、2mL、5mL、10mL的100μg/L的1，4二氯苯标准使用溶液，用超纯水配置成浓度为0.001mg/L、0.002mg/L、0.005mg/L、0.010mg/L的1，4二氯苯标准系列，按2.3的条件测定。
2.3 仪器条件
2.3.1 检测器：以ECD为检测器。
2.3.2 色谱条件：色谱柱采用非极性常用柱19091J-413；升温程序：40℃保持1min，以5℃每分钟速率升至80℃，以10℃每分钟速率升至150℃保持1min。
进样方式：分流进样，分流比5：1；进样口温度：210℃；检测器温度：250℃；载气流量（高纯氮）：柱流速1.5mL/min。
3 结果与分析
3.1 标准曲线及检出限
1，4二氯苯浓度作为X轴，峰面积为Y轴，做标准曲线，如图1所示，拟合得到标准曲线方程为Y=725.19X+86.20，相关系数R=0.9995。1，4二氯苯标准曲线中各浓度测定的响应值（峰面积）见表1，1，4二氯苯标准色谱见图2。
由表3可知，该实验加标回收率良好，加标回收率在97.33%～98.87%之间，平均回收率为98.26%，符合75%～105%范围。
4 结语
采用吹扫捕集毛细管柱气相色谱法测定水中的1，4二氯苯，操作简便，测定结果稳定、准确。该方法实验的标准曲线方程相关系数R=0.9995，线性良好；相对标准偏差（RSD）为2.70%，小于5%；加标回收率在97.33%～98.87%之间，平均回收率为98.26%，符合75%～105%范围，精密度和加标回收率良好，对于检测自来水和地表水中的1，4二氯苯具有很好的实用价值。
参考文献
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