高效液相色谱仪范文
时间：2023-03-27 06:20:54
导语：如何才能写好一篇高效液相色谱仪，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
DOI：10.16640/ki.37-1222/t.2017.01.182
0 引言
当前，液相色谱仪包含示差折光、二极管阵列、荧光、紫外等多种检测器，其在轻工、食品、农药、医药化工、生物等领域应用非常广泛。高效液相色谱仪的自动化程度较高，其可实现对样品的高灵敏度、高效和高速分离测定，其不仅能够控制液相色谱仪的各项操作参数，而且可以科学处理色谱图。为了确保高效液相色谱仪保持良好使用性能，应仔细分析故障原因，有针对性地进行解决处理。
1 高效液相色谱仪常见故障分析
1.1 高压输液系统故障
高压输液系统包括高压泵、贮液器等部分，过滤器安装在流动相输液管顶部，贮液器主要用于盛装流动相，一旦流动相、贮液器受到污染，往往会堵塞过滤器，导致基线发生波动，流速不稳定，而且色谱图上还会显示多余峰，使得基线底值提高，无法准确检测出样品的低浓度组分。高效液相色谱仪运行过程中高压泵是其动力来源，高压泵工作不稳定，往往会造成流量相抽取量反复变化，系统压力变化较大，直接影响了高效液相色谱仪测定结果的准确性。高压泵常见故障主要有柱塞杆磨损、密封圈渗漏和泵头有气泡。
1.2 进样系统故障
进样系统主要包括两种：自动进样器和手动进样器，一般情况下，手动进样器是六通阀，不管是自动进样器，或者手动进样器，在实际应用中易发生进样阀堵塞故障，往往会造成进样系统接头渗漏、压力不断升高，导致进样量准确性下降。
1.3 分离系统故障
分离系统是高效液相色谱仪的核心，而柱压和柱效指标对于色谱柱使用寿命有着直接影响，若一支色谱柱的柱压过高或者柱效过低，一般情况下，这种色谱柱就需要进行报废处理，而色谱柱堵塞、键合相碳链断裂等往往会造成这种情况。
1.4 检测系统故障
检测器是高效液相色谱仪的重要组成部分，其可以将样品浓度转换为电信号，紫外检测器在日常检验中应用最为广泛，在实际应用中往往会发生基线漂移、基线噪声等故障。
1.5 峰拖尾故障
高效液相色谱仪在实际使用中，其色谱图上有时会出现峰拖尾的情况，而造成这种情况的原因主要有：柱效下降、柱外体积较大、柱塌陷、硅羟基作用、峰干扰、柱超载等，这直接影响了高效液相色谱仪的检测精度。
2 高效液相色谱仪故障处理方法
2.1 高压输液系统故障处理方法
对于专用贮液器，要定期用水、酸仔细清洗，然后使用超纯水再荡洗几遍，若贮液器采用溶剂瓶，使用一段时间后应做好废弃处理，防止滋生微生物，并且通过超声波每月对流动相过滤器进行清洗，使用高效液相色谱仪专门的试液和试剂来配制流动相。使用流动相之前，通过超声波进行脱气，在高压输液系统中设置脱气装置，最大程度地控制气泡对高效液相色谱仪的影响，并且高效液相色谱仪长时间采用含盐流动相和运行往往会导致柱塞杆磨损和密封圈渗漏，所以使用合适溶剂洗出高压泵缓冲液，防止盐析出后严重磨损柱塞杆。
2.2 进样系统故障处理方法
进样系统应用过程中，要有针对性地处理样品，利用高速离心机进行离心处理，然后通过0.45m滤膜进行过滤，对样品的细小颗粒有效去除，从而延长阀使用寿命。并且为了避免进样系统流动相中析出缓冲盐，每次使用完高效液相色谱仪以后，对进样系统使用不含盐流动相进行反复冲洗。
2.3 分离系统故障处理方法
对于分离系统故障，应采取有效的处理方法，其一，在色谱柱pH允许使用范围内合理控制流动相pH值；其二，使用色谱纯试剂和超纯水，样品分析之前，通过针筒对样品过滤，利用0.45m滤膜过流动相，流动相和样品中的固体颗粒网往往会将色谱柱堵塞，造成柱压升高，造成色谱峰形变宽；其三，使用在线过滤器或者保护柱，由于流动相和样品过滤以后无法将固体颗粒物质全部消除，而一旦流动相将这些固体颗粒带入色谱柱，会造成柱效下降、柱压升高；其四，对色谱柱使用强溶剂进行冲洗，每次使用完高效液相色谱仪以后，利用过渡流动相冲洗色谱柱，先使用缓冲盐流动相，然后再利用过度流动相，最后使用乙腈或者甲醇进行清洗，有效保存色谱柱。
2.4 检测系统故障处理方法
对于检测系统的基线漂移故障，应仔细检查贮液瓶、色谱柱和检测器是否受到污染，灯能量是否过低，检测器温度变化幅度是否太大，有针对性地采取有效措施。对于基线噪声，检查高压泵的稳定性，检测池是否存在气泡和受到污染，使用高效液相色谱仪的专业溶剂，检查检测器和工作站输出信号以及电压稳定性。
2.5 峰拖尾故障处理方法
对于高效液相色谱仪的峰拖尾故障，应采取有效的处理方法：其一，及时更换柱，尽量在低腐蚀环境下使用，采用保护柱；其二，降低连接点，合理调整所有连接点，采用细内径连接管；其三，在弱腐蚀条件下更换色谱柱；其四，设置在线过滤器，对烧结的不锈钢进行更换；其五，降低流动相pH值，添加碱或者三乙胺钝化柱，增加盐或者缓冲液浓度；其六，调整流动相，清洁样品；其七，增加柱直径，降低样品量，使用高容量固定相。
3 结束语
为了保持高效液相色谱仪良好的使用性能和稳定性，应仔细分析其常见故障，科学地进行分析，采用逻辑推理方法，采取有效、合理的故障处理措施，消除高效液相色谱仪故障问题，延长其使用寿命。
参考文献：
[1]伍音茵.高效液相色谱仪的故障分析及处理对策[J].精细化工中间体，2013（02）：56-57+67.
篇2
论文关键词：高效液相色谱仪；水环境；监测；前景
一、高效液相色谱仪及其技术简介
高效液相色谱（HPLC)也叫高压液相色谱、高速液相色谱、高分离度液相色谱等。是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器(能检测色谱柱流出组分及其量的变化的器件。指机械的、电子的或化学器件，用于区分、记录或指示环境中某一变量的变化，如温度、压力、电荷、电磁辐射、核辐射、粒子或分子等。)时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
二、高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱仪在水环境监测中的应用主要分为三个方面：一方面是对传统监测项目指标的监测；一方面是针对水体中的有机物进行监测；另一方面是利用其高效分离的技术特点在对水体中污染物质总量的监测的基础之上对不同价态及其形态的污染物进行分类定量监测。
（一）对传统污染物的监测
对传统污染物的监测主要是针对日常水体中常见污染物的重点监测。根据国家的相关要求及其本站的实际监测条件，对水体中主要污染物的监测包括了重金属元素（铜、锌、砷、汞、镉、铬等）、营养元素（氮、磷、钾等）、特殊元素（硒、氯、硫等）。通过如上监测对水体的日常污染状况进行把握与评价。同时，传统污染物的监测还包括了对特定企业排污点的污水监测，作为其环保达标的重要依据。
（二）对水体中的有机物
在传统的污染物的基础之上工业以及农业淋容等多方面因素会对水体中造成一定的有机物污染，在针对有机物的污染监测过程中传统的监测方法无法在精度与效率方面达到要求。在此方面应用高效液相色谱仪在对有机物进行定型的同时进行定量的监测。主要监测的项目包括了，工业有机污染物（氰化物、）挥发酚、石油类、总有机物等）、农业有机物（如杀虫剂、除草剂、消化抑制剂）、特殊有机物（微生物代谢物、医疗污染物、生活污水等）。针对如上的有机物监测一方面能够对水体中有机污染现状进行评价，另一方面可以鉴别污染物种类进而对排查污染源提供一定的帮助。
（三）对不同价态及其形态的污染物的监测
同种化学元素的不同存在价态以及形态对其生物毒性的影响至关重要。比如铬元素在水体中存在三价与六价之分，其中三价铬毒性较小且对在较大浓度范围内对人体有益，而六价铬则表现为较强的生物毒性，在较低浓度下对人体造成较大危害。在水环境的监测过程中传统的六价铬的监测方法是利用六价铬与二苯碳酰二肼的显色反映进行检测的。这种检测方式由于收到氧化还原条件的影响容易造成较大误差，进而使得对水体环境的判断失准。采用高效液相色谱仪能够同时监测同种元素的不同价态进而对水体的污染物及其毒性进行更好的定量分析，为后续的环境评价与治理奠定基础。
三、高效液相色谱仪的特点
（一）高效液相色谱仪的准确性
与传统的检测方法相比较，高效液相色谱仪具有更高的准确性，这种准确性主要表现在两个方面：一方面高效液相色谱仪为全自动检测仪器，在避免了人为误差出现的同时降低了机械误差。而机械误差经过标准物质的校订之后可以得到很好的控制，这就决定了高效液相色谱仪在监测过程中误差较小。同时，在另一方面高效液相色谱仪在监测原理上同样优于传统的监测方法，以火焰原子吸收测量水体中的重金属浓度为例，其以火焰原子激发的峰值为测定浓度结果，在测定过程中的波动式消耗会使得测量结果较实际浓度偏低的现象。而采用高效液相色谱仪则是利用全部曲线的面积来代替相对体积内的总量，在计算优化方面更具备准确性。
（二）高效液相色谱仪的高效性
高效液相色谱仪的高效性主要表现为三个方面：
1、高效液相色谱仪的检测效率本身，样品从进样到出结果仅需要30秒作用的时间对于单向测定，此时间还具有一定的下降空间。
2、高效液相色谱仪的多重测定效率。在针对多项目的测定过程中。利用高效液相色谱仪进行测定可以单次进样多指标共同检测的效果，大大的降低了进样的重复性工作，提高了整体的工作效率。 3、高效液相色谱仪的连续进样机制，在前一样品转移到检测室后，后一样品既可以做进样处理，在监测相同的项目指标的情况下，连续进样与单独进样的监测效率提高越30%。
此外，通过高效液相色谱仪与质谱仪的连用可以实现在定量分析的基础之上进行定性的监测。一方面省略了定性检测的二次步骤，另一方面降低了样品前处理的难度与过程。进而，降低了监测的时间。
（三）高效液相色谱仪的广泛性
高效液相色谱仪的广泛性主要表现为对监测物质的广泛性，其监测项目几乎涵盖了水体环境监测的所有基础项目。包括了重金属的测定、营养元素的测定、其他离子的测定、不同价态的测定、有机物的测定等等诸多方面。尤其是其针对有机物的测定方面还可以细致划分为多环芳烃类化合物的测定、酚类化合物的测定、苯胺类化合物的测定、邻苯二甲酸酯类化合物的测定、氯联苯和卤代化合物的测定、苯基脲类化合物的测定、酞酸酯类化合物的测定等等。几乎涵盖了所有类别的污染物种类，使得在实际的操作过程中可以根据不同的监测目标与监测目的进行合适的项目选择。
四、高效液相色谱仪的应用前景
（一）与评价软件连用
高效液相色谱仪与评价软件连用主要是利用高效液相色谱仪的数据收集功能以及数据计算功能。在高效液相色谱仪对数据计算的基础上结合电脑的评价软件对获得数据进行进一步处理的过程。通过与评价软件的连用可以达到在监测的过程中根据不同的监测目的进行合理的评价结果输出的方式。进一步使得环境监测具有高效化与准确性。
在具体的操作层面其可能应用主要分为两个方面：一方面是利用评价软件的评价功能对超标样品进行筛选。在测定前利用标准物质对环境标准进行测定。而在测定的过程中利用评价软件的筛选功能自动对超标样品进行报警或者标红处理，而对于未超标样品则可以采用忽略的处理方式。最终的数据输出结果为超标样品编号与浓度。这样能够有效的降低环境监测站的工作强度。
另一方面是利用预设的国家标准以及不同污染物的环境效应权重针对同一样品的权指标测定项目进行评价报告的生成。在测定的过程中自动的对比国家环境标准，进而生成科学的环境评价报告，为后续的环境治理提供一定的依据。
（二）与质谱仪连用
高效液相色谱仪只能够定性的分析被监测物质，或者通过对吸收光谱的设定来测定特定物质的浓度，而对于未知物质的监测则存在一定的不足。此方面的缺陷使得其在使用的过程中测定项目具有一定的盲目性。通过高效液相色谱仪与质谱仪的连用可以在同一样品测定的情况下测定未知样品中的特定物质种类以及物质浓度。方便并拓宽了水环境监测的广度。
（三）与连续进样装置的连用
高效液相色谱仪具有一定的连续进样能力。但是，此种进样依旧采用手动的模式进行。在手动模式下，一方面对进样效率的提高程度不显著。另一方面则表现为对进样的准确程度不精确。因此，采用高效液相色谱仪与连续进样装置的连用在进一步提高工作效率的同时，保障了进样的准确性与测定的自动化程度。在效率与精度方面对高效液相色谱仪的检测均是一种提高。
篇3
[关键词]高效液相色谱法； 大豆异黄酮；含量测定
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）06-0197-02
曾经1999年10月FDA了第11个健康声明：每人每天食用25g黄豆，可以减少发生冠心病的风险。而近年来一些研究表明，大豆及豆制品具有更加广泛的生物功效，如抗肿瘤、防治骨质疏松和增强记忆等，这些功能均与大豆异黄酮有关。大豆异黄酮与防治一些和雌激素水平下降有关的疾病，延缓女性衰老、改善更年期症状、骨质疏松、血脂升高、乳腺癌、前列腺癌、心脏病、疏松症、心血管疾病等。
大豆异黄酮是大豆生长中形成的一类次生代谢产物，是生物黄酮中的一种，也是一种植物雌激素。它主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。80%～90%的异黄酮存在于子叶中，浓度为0.1%～0.3%。胚轴中所含异黄酮种类较多且浓度较高，为1%～2%，但由于胚只占种子总重量的2%，因此尽管浓度很高，所占比例却很少（10%～20%）[1-3]。迄今为止，共发现有12种成分，分为游离型的苷元和结合型的糖苷两类。苷元占总含量的2%～3%，包括软料木黄酮、黄豆苷元和黄豆黄素3种[4]。糖苷9种，以葡萄糖苷、乙酰基葡萄糖苷、丙二酰基葡萄糖苷3种形式存在，其中染料木苷、黄豆苷、丙二酰金雀异黄苷、丙二酰大豆苷4种成分约占总量的83%～93%[5]。
目前国内外测定大豆异黄酮的方法主要有比色法、纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法（GC） 、紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC）等。但紫外分光光度法常以染料木苷标准品来表征大豆异黄酮总浓度，该方法虽然简便易行、成本低廉但仅适用于粗略测定异黄酮总量，结果有一定偏差[6]。薄层色谱法具有取样量少，操作简单、分离效果好等优点，但其薄层显色剂用量难于准确控制，人为误差大。康纯[7]等以6种SDS、正丁醇、正庚烷、水微乳液作展开剂，通过聚酰胺薄层色谱法分离和检测13种黄连药材、饮片及中成药，并且观察了微乳液类型副I分辨率的影响，结果表明，含水量75%的微乳液为适宜的展开剂。GC 法采用了样品衍生后进行测定，存在操作烦琐，条件不易控制、杂质干扰严重等问题；高效液相色谱法则具有样品不需要预处理、测定快速、定量准确的优势。本研究采用高效液相色谱法（HPLC），甲醇s乙腈s磷酸水（pH=3.0）=30s10s60作为流动相，同时对大豆异黄酮4种主要成分大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素进行分离定。
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
岛津LC10AT高效液相色谱仪：附带SPD-10A紫外检测器，色谱柱为安捷伦 Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm 5μm），0.45？m微孔滤膜过滤器，JP-030S型超声波清洗器，TU-1810紫外-可见分光光度计，BSA224S-CW分析天平。大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量均≥98%，且均购置于曼思特生物科技有限公司。乙腈色谱纯，甲醇色谱纯。样品大豆异黄酮软胶囊购置于深圳医药公司。
1.2 标准溶液制备
1.2.1 大豆异黄酮标准贮备溶液：称取大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素各1mg，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，经超声处理10min，再用甲醇定容至刻度，制成400μg/mL标准溶液。
1.2.2 大豆异黄酮混合标准使用溶液：吸取1.2.1中标准贮备液，配成200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，20μg/mL的混合标液，使用甲醇定容。
1.3 供试液制备
胶囊去壳，将内容物混合均匀，称取样品0.05g-0.5g（精确至0.1mg），加入适量80%乙醇。超声提取30min，加水定容，离心分离5-10min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后，收集滤液待测。
2 结果与分析
2.1 色谱条件确定
2.1.1 检测波长选择
通过紫外扫描，可知四种大豆异黄酮在260nm处均有较大吸收，故选取检测波长260nm。
2.1.2 流动相的选择
分别采用甲醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作为流动相。甲醇-水作流动相时发现染料木素峰有严重的拖尾现象，且大豆苷和大豆苷元无法完全分开。当流动相pH3.0时，大豆苷和大豆苷元能很好的分开，但是染料木苷有前出峰现象，当流动相中加入一定比例的乙腈时，这种现象能够很好的改善。因此流动相选择甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60。
2.1.3 色谱条件确定
根据上述实验，确定本实验的色谱条件为：流动相为甲醇s乙腈s磷酸水（pH3.0）=30s10s60，流速为：1.0mL/min，波长：260nm，进样量：10μL，柱温：30℃。
2.2 检测方法的验证
2.2.1 线性关系考察
分别精密吸取一系列浓度范围的对照品混合溶液，进样量10μL。按照2.1.3条件注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归。回归方程及线性范围见表1。
大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的理论塔板数分别为2412、2402、6803和7115，其理论塔板数显示各成分的分离程度，能够满足检测的需要。在进样量为10？L时，四种大豆异黄酮最低检测浓度均为：2.5μg/mL。
2.2.2 稳定性试验
精密吸取供试品溶液10？L，每隔8h，按照2.1.3项色谱条件进样一次，共测6次，测定峰面积，结果大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素的RSD分别为1.56%、2.03%、1.05%和2.37%。表明48h内测定结果稳定性良好。
2.2.3 重复性试验
取同一样品，按照1.3制备供试液，按照2.1.3项色谱条件，分别测定四种大豆异黄酮日内含量重复性和日间重复性，结果分别见表2和表3。样品在一天时间内重复测定6次完成其日内重复性。每隔2天测定一次，共测定3次完成日间重复性。表2和表3的结果显明本方法精密度好，准确度高，且操作简便，适合推广应用。
2.2.4 回收率试验
称取已知含量的同一样品共9份，每3份为1组，按高、中、低3个水平分别加入对照品溶液，按照1.3制备供试液，按照2.1.3的色谱条件进样，进行回收率试验。回收率见表2。
3 结论
本方法讨论了用不比例的醇-水，甲醇-磷酸水（pH3.0），甲醇-乙腈-磷酸水（pH3.0）作流动相，结果显示甲醇s乙腈s磷酸水=30s10s60作流动相时，四种大豆异黄酮能很好的分开。对方法的重复性考察，在6天时间内方法是稳定的，重复性好，精密度高。分别对四种大豆异黄酮的回收率加以考察，回收率均在90%以上，表明方法可操作性高。
本方法用高效液相色谱法同时测定4种大豆异黄酮苷元的含量，结果准确、可靠，为大豆异黄酮的定量测定提供了一定的支持。
参考文献
[1] Wang HJ， Murphy PA. Isoflavones composition of American and Japanese soybeans in Lowa： effects of variety. Crop year， and location. J Agric Food Chem， 1994， 4：1674～1677.
[2]杨薇.大豆植物性雌激素的构效关系及药理作用[J].中国新药杂志，2001，10（12）：892.
[3]董怀海，谷文英.高效液相色谱-质谱法在大豆异黄酮测定中的应用[J].粮食与饲料工业，2002，（5）：48～50.
[4]张玉梅，孙学斌，高旭年.紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量[J].中国食品卫生杂志，2000，12（4）：7～9.
[5]郝青南，马超，马兵钢. 大豆异黄酮的生理功能及其分离检测方法研究进展[J].中国医药生物技术，2007，10（2）：383～385.
篇4
关键词：恩替卡韦 对映异构体测定 高效液相色谱法
Enantiomers of Entecavir by HPLC
Zhao Hai-qiao Wu Shuang-jun Fu Jian Su Gui-yong
（Shandong Fangming Pharmaceutical Group CO.，LTD.，Dongming 274500 ，China）
Abstract：Objective To establish a method for the enantiomers of Entecavirby HPLC.Methods The determination was carried out on CHIRALPAK AD-H，with Hexane - Isopropanol -ethanol - trifluoroacetic acid （70：10：：30： 0.5） as the mobile phase at the flow rate of 0.8ml？min-1 .The detection wavelength was 254nm. Results The method showed good linearity with a correlation coefficient （r） of 0.9999； the precision and stability were satisfactory with all RSDs below 2%. Conclusion This method is an accurate，fast and simple method for the enantiomers of Entecavirtablets.
Key word： entecavir Enantiomers HPLC
恩替卡韦（Entecavir）为最新抗乙肝病毒的一线药物，恩替卡韦是环戊酰鸟苷类似物。II/III期临床研究表明，成人每日口服0.5mg能有效抑制HBV-DNA复制，疗效优于拉米夫定；III期临床研究表明，对发生YMDD变异者将剂量提高至每日1mg能有效抑制HBVDNA复制。对初治患者治疗1年时的耐药发生率为0，但对已发生YMDD变异患者治疗1年时的耐药发生率为5.8%。我国SFDA也已批准用于治疗慢性乙型肝炎患者。恩替卡韦对映异构体测定目前还未有报道，本文建立的方法，方法简便，结果可靠。
一、仪器与试药
1.仪器 日本岛津 SPD-20A高效液相色谱仪。
2.试药 恩替卡韦对照品（山东方明药业集团股份有限公司，1301001）；正己烷、三氟乙酸、无水乙醇为色谱纯；对映异构体对照品（山东方明药业集团股份有限公司，1205001）；恩替卡韦（山东方明药业集团股份有限公司；批号：1310001、1310002、1310003）
二、方法与结果
1.色谱条件
色谱柱为CHIRALPAK AD-H （250mm×4.6mm，5μm），以正己烷-无水乙醇-三氟乙酸（70：30：0.5）为流动相，流速为0.8ml﹒min-1，检测波长为254nm，柱温为30℃，进样量为20μl。
2.供试品溶液的制备
取恩替卡韦对照品约20mg，精密称定，置20ml容量瓶中，加稀释剂（正己烷：无水乙醇=1：1）溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液。
3.对照溶液的制备
精密量取恩替卡韦供试品溶液0.1ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。
4.专属性试验
为考察空白溶剂对本品异构体检测的影响，进行专属性试验。取恩替卡韦对映异构体及恩替卡韦对照品各约5mg，分别置两个100ml量瓶中，加稀释剂适量超声使溶解，放冷至室温，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取分离度试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果表明，空白溶剂不干扰本品异构体的检测。恩替卡韦与其对映异构体能有效分离。
5.线性关系考察
通过试验考察本品对照溶液浓度与峰面积在一定范围内是否呈线性关系。①线性储备液的配制：取恩替卡韦对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加稀释剂超声使溶解并稀释至刻度；精密量取1.0ml，置100ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。②样品溶液的配制：精密量取线性储备液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml，分别置10ml量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得系列线性溶液。③测定方法：精密量取上述样品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用最小二乘法，以恩替卡韦峰面积（A）为纵坐标，其浓度（C）为横坐标，进行线性回归。结果显示本品在浓度为0.10μg /ml～2.00μg /ml的范围内与峰面积具有良好的线性关系，回归方程为y=74478x-3302.1，相关系数r=0.9999。
6.精密度试验
以在相同条件下，由同一分析人员对同一样品重复进样6次峰面积的偏差为考察目的，配制本品0.1%对照溶液进行精密度试验。结果显示RSD为0.51%，小于2%，表明进样精密度良好。
7.稳定性试验
样品检测过程中可能会将样品溶液在室温里放置数小时，为考察样品溶液在室温放置的稳定性，进行溶液稳定性考察。试验结果显示，供试品溶液室温放置8小时，主峰峰面积的RSD为0.75%，小于2.0%，结果表明，样品溶液在8小时内稳定性良好。
8.样品测定
对批号为1310001，1310002，1310003的恩替卡韦样品，按照“2.2及2.3”项下方法制备供试品及对照溶液，结果均未检出。
三、结果与讨论
1.流动相的选择
刚开始选正己烷-无水乙醇（1：1），结果发现主峰出峰时间太长，改用正己烷-无水乙醇-三氟乙酸（60：40：0.1）分离效果好，且峰形比较好，故选择该流动相。
2.检测波长的选择
以无水乙醇为溶剂，配置 0.05 mg·mL的溶液，在 200～400nm 范围内扫描，结果表明，在 254nm 波长有最大吸收，故将 254nm 作为检测波长。
参考文献
篇5
关键词 粉葛； 高效液相色谱电喷雾质谱； 同分异构体； 源内碰撞诱导解离
1 引 言
粉葛（Radix puerariae thomsonii）为豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根, 味甘, 辛、凉,有解肌退热、透疹、生津止渴、通经活络之功效 \。粉葛自古与野葛同作葛根用。研究发现, 粉葛与葛根（野葛）HPLC指纹图谱\及临床应用\存在较大差别, 2005版中国药典首次将粉葛与葛根（野葛）分列作为中药材记载。粉葛中主要成分为异黄酮类化合物, 大部分以苷的形式存在, 主要包括：葛根素、3′羟基葛根素、大豆苷等\, 其主要结构见表1。该类化合物中存在多对同分异构体, 主要分为碳苷和氧苷两类化合物。同分异构体结构相似, 极性相近, 分离难度大。分离和鉴别中药中同分异构体化合物, 一直是药物分析的难题。
高效液相色谱质谱联用（HPLCESIMS）技术结合了色谱与质谱的优点, 可有效分析复杂混合物中的单个和多个组分\。文献\采用高效液相色谱（二极管阵列）/电喷雾质谱联用系统（HPLCESIMS）方法分析葛根中异黄酮类化合物。但对粉葛中化合物质谱分析尚未见报道。本研究采用HPLCPDAESIMSn技术鉴别分析了粉葛中C苷和O苷两类化合物, 建立区分粉葛中异黄酮类化合物同分异构体的电喷雾质谱方法。表1 粉葛中主要异黄酮类化合物
谱配有电喷雾离子源（ESI）；高效液相色谱仪系统（Surveyor HPLC）包括 Surveyor PDA Plus检测器、Surveyor AutoSample Plus自动进样器、Surveyor MS Pump四元泵； Xcalibur 2.0化学工作站软件； Mass Frontier 6.0软件。
粉葛药材购于合肥市当地药店, 经安徽中医学院药学院中药教研室王德群教授鉴定为豆科植物甘葛藤（ Pueraria thomsonii Benth）的干燥根；葛根素对照品（中国药品生物制品检定所, 批号 0752200509）; 乙腈、甲酸（色谱纯, 美国Merck公司）, 实验用水为亚沸蒸馏水。
2.2 样品处理
篇6
脱氢乙酸(dha，dehydroacetic)，别名 二乙酰基乙酰乙酸，固态呈白色或淡黄色结晶粉末，无嗅、无味、熔点108～110℃，沸点270℃，是一种低毒高效防腐、防霉剂。在酸、碱条件下均有一定的抗菌作用，尤其对霉菌的抑制作用最强。我国自20世纪70年代中期开始用于食品防腐剂至今，曾用于果汁、酱菜、腐乳、人造奶油、乳酸菌饮料、果酱等食品的防腐剂[1]。虽然它的抗菌作用是有效的，但是它的毒性较大的缺点却限制了脱氢乙酸的广泛应用。脱氢乙酸能迅速被人体所吸收，进人人体后即分散于血浆和许多器官中，有抑制体内多种氧化酶的作用。目前，脱氢乙酸的安全性受到质疑，国际上已明确禁止使用，我国在一定范围内允许其使用，但最大允许使用量为0.3g/kg[2]。目前检测脱氢乙酸的国标方法为气相色谱法[3]，前期样品处理过程涉及到有机溶剂萃取、浓缩等步骤，操作起来比较麻烦，而且脱氢乙酸还容易造成色谱峰出现拖尾现象，使得难以获得准确的定性和定量的结果[4]。应用高效液相色谱测定食品中脱氢乙酸的方法已见报道，比如采用超声萃取、氢氧化钠溶液浸泡等方法萃取月饼中的脱氢乙酸后再注射到色谱柱进行分离测定[5]。这些研究为应用高效液相色谱法测定果汁、罐头、瓶装腐乳等液态食品中的脱氢乙酸做了探索性的工作。本研究在国标gb/t 5009.1212003的基础上，通过对目前市场上广泛销售的多种液态食品中的脱氢乙酸以高效液相色谱的方法进行分析，取得了比较满意的结果，克服了气相色谱法前处理复杂以及污染性大的缺点。
1 材料与方法
1.1 实验样品、主要仪器与试剂
参加测定的样品主要包括目前市场上销售的果汁、腐乳、罐头以及酸奶。hp1100型高效液相色谱仪、紫外分光光度计(上海光谱仪器公司);快速混匀器。甲醇(hplc级，dikma公司);甲醇(分析纯，国药);碳酸氢钠(优级纯，国药);脱氢乙酸(国家标物中心);脱氢乙酸标准溶液：精密称取脱氢乙酸标准品100 mg，用甲醇定溶至100ml。再用甲醇稀释成1、5、10、15、20、30 mg/l的标准系列溶液，经0.45μm滤膜过滤。测定用水为二次蒸馏水。
1.2 样品处理
果汁和酸奶混匀后直接称取，腐乳和罐头样品需要先将固体物粉碎后再混匀。预先混匀的样品称取大约5.0g，加入到25.0ml容量瓶中，再加入10ml 2%的碳酸氢钠溶液，用双蒸水稀释至刻度，摇匀。静置10min后将上清液过0.45μm滤膜，以10μl进样器加入到液相色谱仪测定。
1.3 色谱条件
色谱柱c18(5um,250×4.60mm);柱温25℃;流动相选用甲醇0.02mol/l乙酸铵(5:95);流速1.0ml/min;进样量10ul;检测波长310nm;按照这种条件进行分析，以保留时间定性，以峰面积定量，测定样品中脱氢乙酸的浓度。
1.4 结果计算
待测样品中脱氢乙酸的含量(g/kg)=c×v×10-3/m
式中，c:样品中脱氢乙酸的浓度(mg/l);v: 样品体积(ml);m:样品质量(g)
2 结果与讨论
2.1 检测波长的确定
用紫外分光光度计对脱氢乙酸进行全波长扫描检测到两个吸收峰，在310nm处有最大吸收，在230nm处有次强吸收。在310nm处的干扰比在230nm处要小，背景吸收少，因此选择310nm作为检测波长。标准品及待检样品中的脱氢乙酸的检出峰色谱图见图1，脱氢乙酸的保留时间在8.5min左右。
2.2 流动相的选择
液相色谱柱c18分析中常用的流动相有甲醇磷酸盐缓冲溶液系统、甲醇硫酸溶液系统以及甲醇乙酸盐溶液系统。参考以前的研究结果，从流动相的本底吸收、灵敏度的影响和色谱柱的寿命等方面来考虑，本研究选择了甲醇-0.02mol/l乙酸铵(5:95)。在流动相中加入甲醇，可以提高出峰的对称性，随着甲醇量的增加，出峰时间明显加快，为了避开样品中其它成分的干扰，将甲醇的比例调整到5%时，脱氢乙酸的出峰时间较为理想，且不受杂质的干扰。
2.3 测量精密度和回收率
取同一罐头样品10份，每5份添加同一个浓度的脱氢乙酸标样，分别进行hplc分析。从表1的结果可以看出这种方法有较好的重复性和较高的回收率，可以用来进行定量分析。
2.4 线性实验和灵敏度分析
取同一果汁样品10份，每份约5.0g，置于25ml容量瓶中，分别加入脱氢乙酸标准液(5mg/l)1ml、2ml、3ml、4ml和5ml，样品按照标准步骤处理后取10ul进入色谱柱测定，以出峰面积对脱氢乙酸浓度进行回归分析，结果表明脱氢乙酸浓度与色谱峰面积有良好的线性关系，线性相关系数为0.9993。以信噪比(s/n)为3测得各成分的最低检出限为0.25mg/kg。
2.5 样品的测定
取目前国内销售的液态食品4种，每种选取3种不同的品牌按照前面介绍的方法进行hplc分析，结果见表2。可以看出，一般酸奶中并没有添加脱氢乙酸，因为酸奶的保质期通常只有半个月到1个月。果汁中也基本不含脱氢乙酸，而在选取的腐乳和罐头中则添加了少量的脱氢乙酸，但是都远低于最大添加量。总之，该法简便快速，可以在相应类型的食品检验中推广使用。表2 常见的4种液态食品中脱氢乙酸的含量测定结果
【参考文献】
1 骆萌. 脱氢乙酸及相关化合物生产技术. 化工中间体，2004，1(7)：31～33.
2 明立艳，张忠义. 高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量.食品研究与开发，2009，3(30):106～108.
3 卫生部食品卫生监督检验所. gb/t 1494194 食品中脱氢乙酸的含量测定. 北京：中国标准出版社，1994.
4 张辉珍，马爱国，梁惠，等. 高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸的方法研究. 卫生研究，2007，6(36):748～750.
篇7
【摘要】
目的延胡索乙素作为对照品，建立高效液相色谱（HPLC）法控制复方元胡止痛胶囊的质量。方法采用Alltima C18色谱柱（5μm，4.6 mm×250 mn），用甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）为流动相，检测波长280 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min。结果延胡索乙素含量在0.102 9～1.028 8 μg范围内呈良好线性关系，得回归方程Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7，平均加样回收率及RSD分别为101.17%和1.02%。结论以延胡索乙素为对照品，采用HPLC法控制复方元胡止痛胶囊质量的方法简便快速、准确可靠、重复性好，专属性强。
【关键词】 复方元胡止痛胶囊；高效液相色谱； 延胡索乙素
Abstract：ObjectiveTo establish the method for determining the content of tetrahydropalmatine in complex Yuanhu Zhitong capsule by HPLC. MethodsThe separation was performed on Alltima C18 column (5μm， 4.6mm×250mm) with methanol-H2O -triethylamine (65∶35∶0.5) as mobile phase .The detection wavelength was at 280 nm， the column temperature was 30 ℃， and the mobile phase speed was 1.0ml per min.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.1029 to 1.0288 μg for the tetrahydropalmatine content and the linear equation was y＝4.840 1x +0.089 5(r=0.999 7). The average recovery rate was 101.17% and the relative standard deviation was 1.02%. ConclusionThe method is simple，rapid，accurate and reproducible.It can be used for the determination of tetrahydropalmatine content complex Yuanhu Zhitong capsule.
Key words：HPLC； Rhizoma Corydalis Decumbentis； Protopine； Content determination
复方元胡止痛胶囊是由延胡索（醋制）、香附（醋制）、川楝子、徐长卿4味药组成的中药复方制剂，是在复方元胡止痛片的基础上经剂型改变而来，功能疏气止痛，可用于肝胃气痛，胃脘胀痛，胸肋痛，月经痛［1］。延胡索为方中君药，现代研究表明，其主要有效成分为生物碱，其中以延胡索乙素的镇痛作用较强，另外还有延胡索甲素（d-紫堇碱）、延胡索丙素、延胡索丁素（1-四氢黄连碱）、延胡索戊素（dl-四氢黄连碱）、黄连碱、非洲防己碱、d-海罂粟碱等［2］。为了提高产品的质量可控性，我们建立了HPLC测定样品中延胡索乙素含量的质量控制法。现报道如下。
1 器材与方法
1.1 仪器
高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)：P200 II型高压恒流泵，UV200 II 紫外可变波长检测仪，Rheodyne 7725i 高压六通进样阀，20 μl定量环；HW色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；百万分之一电子天平（瑞士Mettler公司M3型）。
1.2 试药
复方元胡止痛胶囊（由本实验室自制）；延胡索乙素对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号0726-200208）；甲醇为色谱纯（中国医药集体上海化学试剂公司）；三乙胺（中国医药集体上海化学试剂公司）。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为Alltima C18柱（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流动相为甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5），使用前用孔径为0.45 μm的有机滤膜减压过滤，超声20 min；检测波长280 nm；柱温30℃；流速1.0 ml/min；进样量10 μl。
2.2 可行性实验精密称取供试品2 g，精密加入浓氨试液-甲醇（1∶20）50 ml，称定重量，回流90 min（75℃），放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇(1∶20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至5 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过，作为HPLC检测的供试品溶液。取配制好的延胡索乙素对照品溶液、供试品溶液分别进样，原儿茶醛峰保留时间为9.275 min（见图1～3）。由图1～3可知，延胡索乙素保留时间为16.5 min左右，与其它组分分离很好，且阴性对照无干扰峰。理论板数以延胡索乙素计算为3 000。
2.3 线性关系的考察精密称取延胡索对照品1.286 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为0.051 44 mg/ml。从中分别精密吸取2，5，10，15，20 μl注入色谱仪，测定其峰面积，以延胡索乙素进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。见图2。由图2可知，延胡索乙素在0.102 9～1.028 8μg范围内进样量与峰面积有良好线性关系，回归方程为Y＝4.840 1X +0.089 5，r=0.999 7（n=5）。
2.4 精密度实验精密吸取对照品溶液10 μl注入液相色谱仪，记录峰面积，重复测定6次，RSD为0.64%。结果见表1。结果表明精密度好。表1 精密度测定结果（略）
2.5 样品回流时间考察取本品50粒，去胶囊壳后，混匀，取约2 g（批号20040501），精密称定，称取4份，分别置平底烧瓶中，精密加入浓氨-甲醇（1∶20）50 ml，密塞，称定重量，分别回流30，60，90，120 min（75℃），放冷，再称重，用浓氨-甲醇(1∶20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解定容至5 ml，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。依上述的方法测定。结果见表2。由表2可知，样品回流90 min即可。表2 不同回流时间测得的延胡索乙素含量（略）
2.6 稳定性实验取供试品溶液（批号20040501），间隔一定时间进针1次，共考察12 h，测定延胡索乙素峰面积积分值，结果表明本品12 h内稳定，RSD为0.97%。结果见表3。表3 稳定性实验结果（略）
2.7 重复性实验取本品50粒（批号20040501），去胶囊壳后，称定重量，混匀，称取5份，2 g/份，精密称定，按供试品制备方法，制备供试品溶液，照样品含量测定方法测定。结果见表4。结果表明本测定方法重复性较好。表4 重复性实验结果（略）
2.8 加样回收率实验取本品已知含量，同一批号（批号20040501）样品共6份，每份约1 g，精密称定，置平底烧瓶中。另取延胡索乙素对照品用浓氨试液-甲醇(1∶20)配制成浓度为0.055 mg/ml的溶液，每份样品中精密加入50 ml此溶液，称定重量，回流90 min，放冷，再称定重量，用浓氨试液-甲醇(1:20)补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 ml置水浴锅上蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 ml，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。
照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定延胡索乙素含量，按以下公式计算回收率。结果见表5。结果表明本法回收率较高，方法可行。表5 延胡索乙素含量测定加样回收率的实验结果（略）
2.9 样品含量测定按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μl，依上述色谱条件测定10批样品延胡索乙素的含量（n＝4）。结果见表6。由表可知，本品的延胡索含量为0.068 5～0.083 5 mg/粒，暂定本品每粒含延胡索乙素（C21H25NO4 ）不得少于0.05 mg。表6 样品含量测定结果（略）
3 讨论
延胡索对中枢神经系统具有明显的镇痛作用，并能使肌肉松弛具有解痉效应，口服能产生类似吗啡以及可待因的效果，能缓解一般神经痛、头痛、腰痛、关节痛、月经痛、肿疡疼痛等。延胡索乙素是延胡索生物碱中具有较强镇痛作用的成分，因此选择延胡索乙素作为控制质量标准的指标之一，有一定意义。
在原剂型复方元胡止痛片的部颁标准中，只有3个理化性质鉴别，专属性不强，也没有含量测定项，显然已经不符合我国中医药现代化的要求。本实验室在参考文献［4～6］的基础上，先后考察了不同的预处理方法与流动相，最终选用了甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）为流动相，分离效果好。方法学考察结果表明，采用HPLC法测定延胡索乙素在复方元胡止痛胶囊制剂中的含量，稳定性好、精密度高、结果可靠、专属性强，而且它是一个主要的活性成分，这样就可以更好地控制产品质量，使产品更符合我国中药现代化的要求。
参考文献
［1］中华人民共和国卫生部药政局.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂，第7册［S］.
［2］中国药材公司. 中国常用中药材［S］.北京：科学出版社， 1995：289.
［3］徐婷， 金昔陆， 曹惠明.延胡索乙素药理作用的研究进展［J］.中国临床药学杂志， 2001， 10(1):58.
［4］朱才庆，范其坤，熊胜泉，等. 高效液相色谱法测定夏天无注射液中原阿片碱的含量［J］.中草药， 2005， 36(5):699.
篇8
[关键词]小儿氨酚黄那敏颗粒；对乙酸氨基酚；高效液相色谱法
中图分类号：U164 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）10-0335-01
小儿氨酚黄那敏颗粒是一种适用于缓解儿童普通感冒及流行性感冒引起的发热、头痛、四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咽痛等症状常用的复方制剂，由对乙酸氨基酚、马来酸氯苯那敏、人工牛黄等组成，是临床常用的小儿抗感冒药。
现行标准中仅采用紫外分光光度法测定对乙酸氨基酚的含量，专属性不强，结果重现性差，因此产品质量可控性差。我们在文献工作的基础上，建立了一种快速检测小儿感冒药中对乙酸氨基酚含量的高效液相色谱法，并取得满意效果。
1、仪器与试药
Agilent1200型高效液相色谱仪、61328B一级管阵列检测器，关国安捷伦公司；KQ5200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DZF}型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学
仪器有限公司；ME254S电子天平，德国Sartorius公司；UV-2550紫外分光光度计，日本岛津公司。
对乙酸氨基酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号为100018200408）；甲醇（色谱纯，Methane、公司，美国），娃哈哈纯水。小儿氨酚黄那敏颗粒均购自不同厂家（产品批号分别为：1001321，100607，100885；其中每袋含对乙酸氨基酚125mg，马来酸氯苯那敏0.5mg，人工牛黄5mg）。
2、方法与结果
2.1 确定色谱的应用条件
选择C18色谱柱进行实验，该色谱柱为150×4.6mm，波长为5um，而实验选择的流动相则为甲醇：水，两者的配比为40：60，流动相的流速控制为1.0ml・min-1，选用的进样量需要设定为20ul，确保色谱柱的温度保持在25℃点上，并且将检测波长的峰值设定为275nm，选用相应的对照品，将其与样品的色谱柱图进行对比分析，详情可见图1。
2.2 制备对照品溶液
选用精确的称量仪器进行对乙酰氨基酚对照品的称取，对照品的温度要控制为105℃，将其进行干燥处理后达到恒重的状态，确保其重量为0.0146g，将其放置选用的容量瓶中，该容量瓶为50ml，然后在容量瓶中加入适量的水进行稀释，充分摇匀后，将其作为对照品溶液备用。
2.3 制备样品溶液
从五个不同的生产厂家各选择一袋小儿氨酚黄那敏颗粒，将这五袋小儿氨酚黄那敏颗粒进行混合磨碎，然后精确的称取出一袋的药品粉末重量，将粉末放置到准备好的容量瓶中，该容量瓶为100ml，加入适量的水，使得药品粉末可以稀释到制定的浓度刻度，摇匀，并利用微孔滤膜进行过滤处理，将过滤后的溶液留用。
2.4 测定线性关系
针对制备的对照品溶液进行称量，分别称出1-5ml的溶液，分别将称取出的溶液，加入五个容量为50ml的容量瓶中，并利用水进行定容处理，在完成定容处理后，容量瓶中溶液的溶度分别为5.84mg・L-1，17.52mg・L-1，29.2mg・L-1，40.88mg・L-1，58.4mg・L-1，而且将进样量也设定为标准溶液量，标准溶液量为20ul，然后就可以总结得出色谱的流出曲线图。将对乙酰胺基酚的浓度作为X轴，其浓度单位设定为mg・L-1，而Y轴则设定为峰面积，进行线性回归方程的计算，计算结果为Y=20.96X+0.8787，r=0.9998。从计算的结果就可以看出，对乙酰氨基酚的浓度范围以及峰面积之间在对乙酰氨基酚的浓度达到5.84mg・L-1以上，58.4mg・L-1以下的时候，呈现出线性关系。
2.5 测定精密度
严格的依据相应的方法进行对照品溶液的选取，分别选取6次，而且选取的对照品溶液溶度需要控制为58.4mg・L-1，每一次选用的值均为20ul，通过实验计算可知，RSD=1.19%（n=6），这就表明所选用的仪器有着较高的精度值。
2.6 重复性试验
分别取制备样品溶液项下3种药品供试液按制备对照品溶液项下的色谱条件重复进样3次，分别测得各种药品供试液中对乙酸氨基酚色谱峰峰而积的RSD值，结果分别为0.29%，0.17%，0.73%（n=3），表明本法重复性好。
2.7 稳定性测定
分别取制备样品溶液项下3种药品供试液，在时间0，1，2，3，4，5h按2.2项下的色谱条件进样，记录峰面积，分别计算其RSD值。结果分别为2.68%，0.86%，0.89%（n=6），表明样品在5h内稳定。
2.8 加标回收率测定
取同一批（批号：1001321，4g/袋）已知含量的小儿氨酚黄那敏颗粒样品5份，每份约0.800g，分别精密加入对乙酸氨基酚2.500mg，依法测定，对乙酸氨基酚总平均回收率为116.6%，RSD为1.46%（表1）。
2.9 样品测定
取制备样品溶液项下处理好的样品溶液各20ul，按上述色谱条件进行测定，按外标法（峰而积）计算含量，结果3批样品1001321，100607，100885的含量分别为：83.2%，84.1%，84.5%（标示量）。
3、讨论
3.1 选择适宜的溶液
就相关的文献资料可以了解到，流动相作为溶剂溶解样品经常被应用于实验研究。通过本文的研究可以了解到，将水作为对照品，分别针对水和流动相进行溶剂溶解检定，对比的结果就是两者之间没有明显的不同。所以，可以选择价格较低的纯净水作为溶剂溶解样品进行应用。
3.2 选择适宜的流动相
就相关的文献资料表明，在利用高效液相色谱法进行实验的过程中，应用的流动相多选择甲醇：磷酸二氢钾溶液：三乙胺溶液，或者是选用的甲醇：乙腈：磷酸溶液。而就本文的实验研究来说，选择的溶液则为甲醇：水，两者的比例为40：60，这样的溶液在实验中进行应用，具有操作便利的特点，而且也很容易出峰，并且在分离度上也相对较高，出现的峰形具有一定的对称性，而且在实验完成后，也很容易对色谱柱实施清洗。
3.3 合理的选用适宜的测定波长
测定对乙酰胺基酚紫外吸收波长后，根据测定的结果可以了解到，样品溶液的峰值在275nm的时候，吸收率表现为最大。所以，本文在展开实验的时候，选用的检测波长峰值为275nm，就依据该检测波长所检测到的结果表明，基线处于较为稳定的状态，不会对对乙酰氨基酚中的杂质造成严重的影响。
参考文献
[1] 田磊.HPLC法同时测定复方银翘氨敏胶囊中维生素C及对乙酰氨基酚的含量[J].安徽医药.2010（09）.
[2] 冀爱芬，裴小勇，王红燕，华丽云，张勇.HPLC法测定复方对乙酰氨基酚片中三种成分的含量[J].中国药师.2010（08）.
篇9
[关键词] 含量测定；高效液相色谱法
中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：2055-5200（2014）01-069-03
Doi：10.11876/mimt201401018
HPLC Determination of Content of Isoquinoline H-4 and its Related Substances
XU Chao1.2， YANG Jian-yun2，XIAO Bing-kun2，HUANG Rong-qing2
（1.Jiangxi university of TCM，Nanchang 330004；2.Academy of military medicine science，Peking 100850）
[Abstract] Objective： To establish a method for the determination of the content of H-4 and its related substances. Methods：RP-HPLC method was established. Column： Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）；Mobile phase： water-methanol， Linear gradient elution， at a flow rate of 1mL/min with a diode array detector set at 236 nm； the temperature of column is 40℃.Results： Good linearity of the H-4 curve range of 20μg/mL～400μg/mL （r=0.9990）.The limited of detection is 0.8ng.Conclusion： The method is simple， rapid， sensitive and convenient which can be used to control the quality of H-4.
[Key words] Determination of content； HPLC
1 概述
近年来，环境污染、快节奏的生活规律已让癌症的发病率越来越高，目前已成为世界性的难题。临床上治疗癌症的方法有化疗、放疗、手术，免疫疗法和其他方法 [1]。H-4是新型研发的异喹啉抗肿瘤药物，为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能引起细胞周期阻断和细胞凋亡基因的激活，从而抑制肿瘤细胞的生长[2]。本文采用高效液相色谱法对H-4及其在合成中产生的有关物质进行检测，结果表明，该法灵敏度、精密度和重现性均能满足要求，实验数据准确可靠。
2 仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪（waters2695泵，2 9 9 6型二极管阵列检测器，自动进样器，EMPOWER数据处理系统）；BP211D型电子天平（德国SARTORIUS）；甲醇、乙腈为色谱纯（FISHER生产商），水为纯净水（娃哈哈有限公司）；H-4对照品（纯度99.6%），原料药（批号20120715，20120716，20120717）均由军事医学科学院放射与辐射医学研究所提供。
3 实验部分
3.1 对照品溶液的制备
取对照品H-4 12mg，精密称量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得对照品溶液。
3.2 供试品溶液的制备
取供试品12mg，精密称量，置100mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀即得供试品溶液。
3.3 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱：流动相为甲醇-水，线性梯度洗脱（0-25min 35%甲醇75%甲醇，25-45min 75%甲醇，45-50min 75%甲醇35%甲醇），检测波长为236nm；流速1.0mL/min；柱温40℃，进样体积20μL。在该色谱条件下，理论塔板数大于10000，分离度大于1.5，色谱行为良好（如图1）。
4 方法学考察
4.1 线性关系
取对照品约10mg，精密称定，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密取对照品贮备液0.5 mL，1.0mL，2.0 mL，4.0 mL，5.0 mL，6.0mL，分别置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得一系列浓度的溶液。取上述溶液及贮备液20μL，按“3.3”色谱条件下分别进样两次，记录色谱图。以对照品进样浓度（X，μg・mL-1）为横坐标，以对照品峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，进行回归分析，得线性方程：Y=109261X+899070，r=0.9990（n=7），结果表明H-4在 20μg/mL～400μg/mL范围内具有良好的线性关系。
4.2 检测限与定量限的确定
以信噪比3：1时注入仪器的量为检测限，以信噪比约为10：1时注入仪器的量为定量限。结果H-4的检测限为0.8ng，定量限为3.2ng。
4.3 精密度试验
取3.1项下得对照品溶液，连续吸取6次，每次20μL，以峰面积计算其RSD为0.50%（n=6）。结果表明测定是仪器精密度良好。
4.4 重复性试验
分别精密称取样品（批号20120717）9份，按3.2项下方法操作，配制成浓度为100μg/mL，120μg/mL，150μg/mL的低中高三个浓度，每个浓度溶液制备3份，按3.3色谱条件下测定H-4的含量，平均含量为99.4%，RSD为0.87%（n=9），表明该方法重复性良好。
4.5 稳定性实验
取4.4项下配制好的高、中、低3个浓度的供试品溶液，在0，4，8，12，24，48，72h分别进样20μL，测定峰面积，计算高、中、低三个浓度的峰面积的RSD分别为1.45%、1.21%及0.93%。表明供试品溶液在室温放置72h内稳定性良好。
4.6 样品含量测定
按3.1，3.2项下的方法分别制备对照品溶液和供试品溶液，分别进样20μL，按外标法以峰面积计算样品含量。实验数据如表1，3批样品H-4含量均在99.0%以上。
4.7 有关物质含量测定
取3.2项下的供试品溶液1mL，精密量取，置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得自身对照溶液。以3.2项下配置的溶液为供试品溶液，按不加校正因子主成分自身对照法计算有关物质的含量。结果表明，有关物质均在1%以内（见表1）。
5 讨论
5.1 流动相溶剂的优化
流动相是改善分离度的重要参数，分别考察甲醇―水、乙腈―水以及混合溶剂（甲醇乙腈）―水三种流动相对样品的分离。试验表明乙腈―水系统主峰与有关物质峰分离度小于1.5。而混合溶剂（甲醇乙腈）―水则表现出理论塔板数低的缺点。所以最终选择甲醇―水系统。在该流动相系统条件下能较好的改善峰型，且分离度大于1.5，理论塔板数大于10000。
5.2 波长的选择
H-4溶解在甲醇中最大吸收波长为236nm，有关物质也在此波长处有较强吸收；且在此波长处溶剂无干扰，故选择236nm波长为检测波长。
5.3 色谱柱的考察
选择了不同填料、规格及厂家的色谱柱进行比较，包括Phenomenex LUNA C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、Diamonsil C18 Column（250mm×4.6mm，5μm）、 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 （250mm×4.6mm，5μm）。结果表明Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18最佳，所得色谱图分离度良好，柱效高，而且相对于其他两类色谱柱，保留时间也有一定的提前。
6 结论
综上所述，该法灵敏度高，重复性好，专属性强，可为H-4样品的质量标准提供可靠的依据。
参 考 文 献
篇10
[关键词]小儿氨酚黄那敏颗粒；对乙酰氨基酚；高效液相色谱法；含量测定
中图分类号：TM459 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）10-0343-01
小儿氨酚黄那敏颗粒是一种临床比较常用的复方制剂，主要适用于缓解儿童普通感冒及流行性感冒所引起的发热、头痛以及打喷嚏、流鼻涕等症状，具有较好的应用价值。现行标准中对小儿感冒药中乙酰氨基酚的含量测定存在一定的局限性，因而采取高效液相色谱法对小儿氨酚黄那敏颗粒中乙酰氨基酚进行含量测定，具有重要的现实意义，并取得了较好的测定效果。
1 测定实验中仪器与试药
在高效液相色谱法测定小儿感冒药中乙酰氨基酚含量的实验中，选用国外先进的高效液相色谱仪和二级管阵列检测器作为乙酰氨基酚含量测定的专用设备，确保这两种设备的实际性能满足实验的标准。先用专业化的超声波清洗器和电热恒温鼓风干燥箱，确保乙酰氨基酚含量测定的精准性和可靠性，与此同时，选用国外先进的紫外分光光度计，以促进含量测定实验的顺利进行。
在试药方面，选用乙酰氨基酚的对照品，确保其质量和规格满足国家药品生物制品检验标准，与此同时进行甲醇、娃哈哈纯净水的配备。所选用的小儿氨酚黄那敏颗粒均购自于不同的厂家，其中每袋内乙酰氨基酚以及人工牛黄等的含量具有一定的一致性。
2 实验方法与结果
2.1明确色谱条件。在高校液相色谱法对小儿氨酚黄那敏颗粒中乙酰氨基酚的含量进行测定的实验操作中，对色谱条件以及流动相进行明确，流动相为甲醇-水，并将实际流速和进样量控制在合理范围内，对实验中的检测波长进行明确，乙酰氨基酚对照品与样品的色谱图分别建图1。
2.2对照品溶液的制备操作。在本实验中，精密称取标准温度条件下干燥至标准重量的乙酰氨基酚的对照品适量，置于容量瓶内，并通过娃哈哈纯净水进行稀释，至刻度后进行摇匀，即可能到标准的乙酰氨基酚对照品溶液。
2.3样品溶液的制备操作。在本实验中，分别选取购买自不同厂家的不同规格的小儿氨酚黄那敏颗粒数袋，经研磨至标准形态后，精密称取适量并置于标准的容量瓶内，加哇哈哈纯净水进行稀释，稀释至刻度后可采用专业的滤膜进行过滤，留作备用。
2.4对实验中的线性关系进行测定和明确。在实验过程中，分别称取对照品溶液适量，加入50ml容量瓶内进行定容操作，并对定容后的浓度进行准确的记录，从而得出色谱流出曲线。在此基础上，以乙酰氨基酚浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，做标准化的线性回归方程，线性回归显示，乙酰氨基酚浓度范围与峰面积具有良好的线性关系。
2.5对实际精密度进行准确的测定。在本实验中，对同一种对招聘溶液进行重复进样操作，并对每次进样的对照品溶液的量进行合理的控制，可以发现本实验过程中仪器具有良好的精密度。
2.6进行重复性试验操作。在本实验中，按照色谱条件，对药品供试品溶液进行重复进样，并对各种药品溶液中的乙酰氨基酚色谱峰峰面面积进行明确，实验表明高效液相色谱法具有良好的重复性和应用性。
2.7对稳定性进行测定。在实验过程中，严格按照色谱条件进行进样操作，并对峰面积进行准确的记录，实验结果显示，实验中样品溶液在5小时之内具有较好的稳定性。
2.8对加标回收率进行准确的测定。在实验中，选取同一批的含量已定的小儿氨酚黄那敏颗粒样品适量，分别加入对乙酰氨基酚适量，在高效液相色谱法测定条件下进行测定，可以明确乙酰氨基酚的总平均回收率，详情见表1。
2.9对样品进行准确可靠地测定。在实验过程中，选取处理好的标准样品溶液适量，按照高效液相色谱条件进行测定，并严格按照外标法对乙酰氨基酚含量进行计算，实际样品含量均在80%以上。
3 讨论
3.1溶剂的选取。实验研究显示，以流动相和纯净水分别作为溶剂对乙酰氨基酚含量进行测定，发现并不存在明显差异，因而在高效液相色谱法对小儿感冒药中乙酰氨基酚含量进行测定时，可以选用廉价易得的纯净水作为溶剂，来对式样样品进行溶解操作。
3.2对流动相进行选取。相关资料研究显示，高效液相色谱法进行乙酰氨基酚含量测定的过程中，流动相对位甲醇、三乙胺溶液、磷酸溶液等。而在本实验中，主要采用甲醇：水（40：60）作为流动相，实际操作具有一定的便捷性和可靠性，操作简单且出峰时间较快。对实验结果进行观察和分析可以发现，甲醇：水（40：60）作为流动相时，实际分离度较高且峰形对称，试验后色谱柱的冲洗也比较简便，具有良好的适用性。
3.3测定波长的选择。对对乙酰氨基酚紫外吸收波长进行测定，结果显示样品溶液在275 nm处有最大吸收。因此本实验选择275 nm作为检测波长。此时检测基线稳定，对乙酰氨基酚前后杂质干扰小。
3.4高效液相色谱法，又称“高压液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱法分析速度快、载液流速快，分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。应用范围广，百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。
参考文献
[1] 闫海燕-高效液相色谱法测定小儿氨酚黄那敏颗粒中对乙酰氨基酚的含量《安徽医药》，2011.
