多能干细胞范文
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篇1
[中图分类号]Q 813[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.04.025
Research progress on induced pluripotent stem cellsMao Runyi, Wang Jing, Lin Yunfeng.（State Key Labora－tory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China）
[Abstract]Takahashi and Yamanaka got induced pluripotent stem cells through the instantaneous high expression exogenous transcription factor, and the cells have much potential traits and indicate a new stem cell research way. The development and the latest progress of induced pluripotent stem cells are reviewed in this paper.
[Key words]induced pluripotent stem cell；somatic cell；reprogramming；embryonic stem cell
2006年，Takahashi和Yamanaka[1]首次通过瞬时高表达外源性的转录因子获取了诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC），并且成功建立了iPSC系。研究采用逐一淘汰制，从24个因子中筛选出4个基因———Oct4、Sox2、cMyc、Klf4，通过反转录病毒将其导入小鼠成纤维细胞中获取了iPSC。随后许多研究人员[2-4]也通过该方法获得了iPSC，Choi等[5]通过导入Oct4、Sox2、Nanog、Lin28也同样获取了iPSC。Qin等[6]于2007年利用反转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4导入未经遗传修饰的小鼠成纤维细胞，诱导其成为iPSC。近年来，通过导入不同因子得到的iPSC为生物医药领域开拓了新的研究方向。
1iPS细胞的研究方向以及发展历程
1.1多种体细胞的重编程
2007年，Takahashi等[7]将人皮肤成纤维细胞重编程为iPSC，揭开了人体细胞重编程的序幕。此后不同研究小组将人的间充质干细胞[8]、肺成纤维细胞[9]、骨髓间质细胞[10]、脂肪干细胞[11]、肿瘤细胞[12]、血液B淋巴细胞[13]、牙胚细胞[14]重编程后得到iPSC。
许多研究表明，从任何一个胚层发育分化而来的细胞都可重编程成为iPSC，而且不同阶段的细胞重编程的难易程度是不同的，在间充质干细胞等分化程度较低的诱导过程中，重编程回档易于已处于终末分化的体细胞；血细胞和脂肪干细胞因其取材来源较为容易，能提供足够大量的细胞来源，是iPSC较为理想的供体细胞。
1.2因子导入方式
研究者们利用特定的小分子化合物，或者改变因子导入方式，改善并提高了iPSC的安全性以及低重编程率。迄今为止，此研究领域已取得了许多突破性的进展。Stadtfeld等[15]利用腺病毒作为载体转运4个因子成功得到了iPSC，使得这些因子在短时间内高表达，且在之后不介入永久整合；另外，他们还使用转座子的方法成功制备了无病毒整合的较为安全的iPSC。Okita等[16]采用2种质粒分别携带了4个因子进行了共转染，此方法利用质粒转染的特点，剔除了整合的4个因子，获得了没有病毒基因的iPSC。另外，也有研究者[12]使用microRNA等方法进行因子的导入研究。
1.3小分子化合物的选择
体细胞在重编程的过程中可以加入一些小分子化合物替代某个因子，以此来提高iPSC的重编程率，通过研究这些小分子化合物，对于提高iPSC病毒转染时病毒基因整合的安全性也有着十分积极的意义。Shi等[17]将G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂BIX-01294和Oct4、Klf4进行组合后，大大提高了神经干细胞的重编程率。Mikkelsen等[18]通过研究证实，5-氮（杂）胞苷可以提高重编程的效率。Huangfu等[19]则认为，丙戊酸比5-氮（杂）胞苷的作用更佳。Esteban等[20]证实了丙戊酸与维生素C可大大提高iPSC的重编程效率，比Takahashi等[1]首次报道时的重编程率提高了近500倍。
目前对体细胞重编程的分子机制尚未明了，通过引入iPSC，有望深入小分子化合物信号通路的相关研究，更好地理解存在于重编程中深层次的调控信号网络，有利于推动干细胞的研究发展。
1.4iPSC的筛选鉴定
iPSC的筛选鉴定是得到iPSC非常重要的一个环节，如何判定细胞克隆已成为研究的热点，细胞是否具有胚胎干细胞多能性一般从以下6个步骤来鉴定：1）iPSC多潜能性细胞表面标志物；2）体外定向分化能力；3）裸鼠畸胎瘤；4）嵌合体的形成；5）进入生殖系遗传的能力；6）胚胎干细胞的形成胚胎发育能力。
Takahashi等[7]研究获取的iPSC细胞，因为筛选策略问题，虽然表达了多潜能性细胞的表面标记物，但无法得到嵌合体鼠。对于iPSC的鉴定和筛选的关键，集中于后三步的鉴定内容上，只有真正使iPSC通过了这三步的鉴定，才能从科学的角度确定iPSC是否具有胚胎干细胞的特性。2009年以前，在iPSC的鉴定上，嵌合体的形成和进入生殖系遗传的能力的鉴定已成为研究者们鉴定iPSC的必须步骤，但是对于公认的iPSC鉴定的金标准———四倍体小鼠的鉴定研究，一直停滞不前。2009年，Zhao等[21]通过iPSC成功繁育出了四倍体小鼠“小小”，这成为了继“多莉”羊之后又一个里程碑式的干细胞研究成果。
2疾病特异性诱导多能干细胞
Dimos等[22]提取了家族型肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者的上皮细胞，将其重编程为iPSC，此种iPSC拥有疾病特异性的特点，不仅通过定向诱导分化成为了患者运动神经元的共体细胞，而且还可为寻找药物靶点提供具有疾病特异性的细胞来源。Soldner等[23]诱导iPSC向多巴胺神经元分化，有望为帕金森患者带来一种新的有效的治疗方法。此外，Park等[10]建立了多种遗传性疾病的特异性iPSC系，包括亨廷顿病、唐氏综合征等。
Chamberlain等[24]通过重编程的方法，已为某些遗传性疾病患者的细胞建立了拥有疾病特异性的iPSC系。疾病特异性iPSC系的问世为人们提供了一个个性化的治疗途径，使得不同患者的个体化药物研究有了一定的理论基础，并且通过对某种疾病特异性细胞的研究，可以了解疾病的发生机制。
3iPSC的应用前景展望
干细胞近些年一直是学术界研究的热点，但其涉足伦理、宗教问题等，受到了很大的阻力；而iPSC因其没有伦理问题和免疫排斥反应，拥有较好的应用前景。
近年来iPSC在利用各种体细胞重编程技术上已经比较成熟，热点从前期的提高重编程率、重编程不同体细胞，逐渐转变为对重编程机制、细胞受体、组蛋白修饰等的研究上来。近年的研究发现，重编程后的细胞在组蛋白甲基化水平上与已分化细胞有着很大的不同，iPSC拥有低水平甲基化[25]的特点，这暗示着重编程在基因水平上的改变。重编程不同的体细胞、肿瘤研究以及基因层面上细胞信号通路机制的研究将会成为日后重要的方向。
iPSC的发现为构建患者-疾病-特异性多能干细胞[26]开辟了一条新途径，研究人类iPSC有助于了解疾病的发生机制和筛选药物。iPSC的应用正逐渐转向临床方面，基于iPSC的再生治疗模型[27-28]逐渐建立，关于心脏肌细胞、骨骼肌细胞的再生修复已取得了良好的效果[29]。
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篇2
关键词：诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）；诱导性细胞；细胞治疗
中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-0993-05
将已分化的体细胞重编程为类胚胎干细胞样细胞的技术完成于2006年。Takahashi等[1]通过外源表达一组选择性的转录因子导入成体小鼠成纤维细胞，最终确定最少有4种转录基因组合――Oct4（也称Pou5f1、Oct3/4）、Sox2、Klf4和c-Myc可将成纤维细胞重编程为诱导性多潜能干细胞（iPS细胞）。从此iPS细胞的研究开始成为干细胞研究领域的热门，并且iPS细胞的来源也越来越广泛。利用iPS细胞诱导技术将终末分化细胞先诱导成iPS细胞，再进一步诱导成具有特定功能的细胞，如神经细胞，心肌细胞等，称为诱导性细胞。时至今日研究者已经开始尝将iPS细胞应用于临床治疗。
1 诱导性多潜能干细胞的研究进展
从iPS细胞诞生之日起，iPS细胞的研究就成为细胞研究领域的热门。起初，研究者诱导iPS细胞时，iPS细胞的诱导效率极低，而且他们用的是4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，其中c-Myc还具有一定的致癌作用。后来经过科学家们的不断尝试，开始用小分子化合物、miRNA、mRNA或蛋白质等导入细胞来诱导iPS细胞[1-6]，转录因子的个数也从4个减少到1个，甚至只用小分子化合物等物质来诱导iPS细胞[7-9]。近年来iPS细胞研究取得了突破性进展，如建立了人类疾病特异的iPS细胞，借助锌指核酸酶和转座子等介导的转基因技术高效制备了无病毒的iPS细胞[10-13]。
从2007年Takahashi 等[2]和Yu等[3]先后将人的体细胞重编程为iPS细胞开始，多种人类成体干细胞被重编程为诱导性多潜能干细胞，但是直到2013年Trokovic等[14]才将人类骨骼成肌细胞重编程为iPS细胞，他们通过逆转录病毒载体（图1）或仙台病毒载体介导目的基因的异位表达，在无饲养层且含有适宜的培养基条件下，可以使人类骨骼成肌细胞达到和人类成纤维细胞一样的重编程效率，再加入组蛋白脱乙酰酶抑制剂丙戊酸钠（VPA）、丁酸钠（NaB）和ALK4/5/7抑制剂SB431542（SB），能明显提高人类骨骼成肌细胞重编程为iPS细胞的诱导效率。
到目前为止，除了人之外，小鼠、大鼠、猴子、绵羊、猪的iPS细胞系均已建立[15-19]。
iPS细胞研究的意义重大，它不仅为多潜能干细胞[20]的获取提供了新的途径，而且避免了传统胚胎干细胞研究中存在的伦理问题，同时还解决了免疫排斥反应问题，为细胞的体外培养和诱导提供了平台（图2），使人们在细胞和分子水平上研究人类多种疾病及其发病机理成为可能（图3），也为相应药物的研发提供了便利。正是由于iPS细胞技术使得整个细胞生物学研究发生了质的飞跃，所以Yamanaka荣获了2012年的诺贝尔医学奖。当然，目前iPS细胞的发生机制还不是十分明确，还有待深入了解，iPS细胞的诱导效率仍然很低，整个诱导过程相对繁琐，费用比较昂贵，达到商业化、大众化应用的地步还有些遥远，这一切都有待进一步研究和开发。
2 诱导性细胞的研究进展
利用iPS细胞诱导技术，通过导入特定的转录因子组合，再加入一些小分子化合物等物质，将终末分化细胞先诱导成iPS细胞，再进一步诱导成具有特定功能的细胞，如神经细胞、心肌细胞等，称为诱导性细胞或诱导细胞。到目前为止，已经在多种具有重要功能的细胞上诱导成功[21-23]。
2.1 诱导性造血和血管祖细胞
Park等[21]在改进的无饲养层的内皮培养条件下，利用了一组重组生长因子[骨形态发生蛋白4（BMP4）、血管内皮生长因子（VEGF）和纤维母细胞生长因子2（FGF2）]的最适组合，然后在成分明确的内皮细胞生长培养基（EGM-2）中附着低密度培养，用人类胚胎干细胞和人类诱导多潜能干细胞培育出大量的CD34+CD45+造血祖细胞（表1）。这些造血祖细胞出现在附着于内皮或基质的细胞层周围，从某种意义上来说，这种方式与体内胚胎生血内皮的造血方式类似。虽然之前已经证实由成纤维细胞衍生而来的hiPSC细胞系并不具备有效分化为造血内皮的能力，但是这个培养体系能够使hiPSC具有和hESC一样分化为造血内皮的能力。这个有效的分化体系可用于直接延时摄像和造血发生过程的时间进程研究等。
2.2 诱导性神经细胞
Kuo等[22]在由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神经生长因子构成的水凝胶中将iPS细胞诱导成神经元。这种由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神经生长因子构成的水凝胶在整个诱导过程中发挥着重要作用，而孔隙结构、孔隙度和溶胀比也有一定的影响。在这种水凝胶中，iPS细胞分化的形态学图像（图4）展示出神经元的特点。在诱导iPS细胞向神经元分化的过程中，表面神经生长因子可以增强β Ⅲ微管蛋白的表达强度而抑制SSEA-1的表达强度。iPS细胞在这种水凝胶中的分化可以通过SSEA-1和β Ⅲ微管蛋白的表面抗原免疫化学染色和扫描电子显微镜来观察鉴定。
2.3 诱导性心肌细胞
Jiang等[23]使用从Oct4-GFP-C57小鼠身上获得的心脏成纤维细胞（Cardiac fibroblasts，CFs）感染逆转录表达重组因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）来诱导功能性心脏细胞（Cardiomyocytes，CMs）。以初代的小鼠胎儿成纤维细胞（MEFs）作为对照，试验发现由CFs衍生而来的iPS细胞（CF-iPS）与胚胎干细胞（EBs）及MEF衍生而来的iPS细胞（MEF-iPS）具有同样的生理学特性。他们使用经典拟胚体的方法和Transwell CM共培养体系来模拟心肌旁分泌微环境，进而将CF-iPS向功能性心肌细胞诱导。在模拟的心肌旁分泌微环境中，CF-iPS自发地形成可以跳动的EBs。这些分化而来的能够自发跳动的细胞可以表达心脏特有的组织特异性转录和结构因素，而且显示出典型的心肌形态学和电生理特征。
当然，除了上述诱导性造血和血管细胞、诱导性神经细胞和诱导性心肌细胞外，还有其他的诱导细胞也已经被人们所发现并认知。如Yamaguchi等[24]将小鼠的iPS细胞诱导成肥大细胞。
3 展望
iPS细胞自诞生之日起即受到人们的关注，iPS细胞的研究开创了细胞生物学的新篇章，也极大地促进了表观遗传学和胚胎生物学的发展，为人类再生医学和特异的细胞治疗带来了更美好的希望。
如果供体细胞是来源于病人自身的体细胞，就可以避免免疫排斥反应问题，将这些体细胞先诱导成iPS细胞，进而再诱导成具有特定功能的目的细胞，理论上就可以用于临床医学和再生医学，这样就有望实现个性化治疗。然而，到目前为止，诱导细胞的种类有限，诱导效率也有待提高，并且细胞的功能仍需要大量动物模拟试验验证。
目前，如何获取更多的从终末分化细胞诱导而来的iPS细胞，并进一步诱导成具有特定功能的细胞成为热点，对多种体细胞衍生的iPS细胞和多种新的培养诱导方法[25-28]也已经进行了尝试。
尽管这种诱导的功能性体细胞在将来可能具有较高的应用价值，但是其中的详细机理仍需要探索明确。相信在胚胎干细胞研究、iPS细胞研究、现代基因组学和RNA组学以及蛋白质组学的发展和带动下，在不远的将来，越来越多的诱导细胞有望在临床医学和生物学基础研究上发挥重要作用，从而加快再生医学和动物组织工程的发展，同时，也能促进发育生物学、表观遗传学和细胞生物学等基础研究的发展。
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篇3
2013年5月26日，这项研究成果被发表在国际学术期刊《自然·细胞生物学》上。一时之间“细胞逆转，即将实现‘返老还童’”的说法充斥着各大媒体。
细胞“逆转”的历程
有一天，每个人都将成为自身健康的“庇佑者”，不论是因为衰老、创伤或者疾病，只要是造成组织的缺损和伤害，都可以取自身的体细胞作为“种子”，让其重新“逆转”成多能干细胞，并进一步分化为心脏、神经、胰岛、肝脏、肾脏等多种类型细胞，甚至组织器官……这听起来真像是一部科幻电影里的场景，不过从2012年诺贝尔生理或医学奖揭晓的那一刻起，人们就开始触摸到了打开这个原本只存在于幻想中的世界大门的钥匙。而科学家为之奋斗的时间更是长达半个多世纪。
2012年8月17日，京都大学物质-细胞统合系统据点iPS细胞研究中心主任山中伸弥、英国发育生物学家约翰·戈登因在细胞核重新编程研究领域的杰出贡献而获得2012年诺贝尔生理学或医学奖。
所谓细胞核重编程即将成年体细胞重新诱导回早期干细胞状态，以用于形成各种类型的细胞，应用于临床医学。
一直以来，人体干细胞都被认为是单向地从不成熟细胞发展为专门的成熟细胞，生长过程不可逆转。然而，戈登和山中伸弥教授发现，成熟的、专门的细胞可以重新编程，成为未成熟的细胞，并进而发育成人体的所有组织。
而早在20世纪60年代，约翰·戈登等人便首先证明末端分化细胞的特化过程是可逆转的。在一项经典实验中，他将蝌蚪肠道的成熟特化细胞的细胞核替换掉青蛙卵细胞的细胞核，从而使卵细胞发育为性成熟的成体青蛙。尽管这一研究开展于50年前，但这些早期的核移植和克隆实验还是引起了报刊上关于克隆人可能性的猜测。
自体细胞核移植实验建立以来，领域内众多科学家相信在卵细胞和胚胎干细胞中含有某些能“赋予”末端分化体细胞核全能性或者多能性的因子，并做了诸多尝试，但一直未能成功。直到2006年，山中伸弥等人在对24个胚胎干细胞高表达的候选基因进行筛选后，最终确定了Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4四个因子起关键作用。而这个“简单处方”可以使成熟的体细胞重编程为多能干细胞，这一开创性研究成果发表于国际知名期刊《细胞》上，引起了全世界的轰动。不到6年的时间，这一研究成果几乎包揽了拉斯克基础医学奖、沃尔夫医学奖等所有医学界大奖。
在业界专家看来，这项研究首先具有重要的生物学意义，即对细胞实现人工主动调控和干预，实现细胞水平的生命再造，对研究发育本身提供了新的思路，同时避免了异体移植产生的免疫排斥反应，是人类真正进入生命再造时代的开始；其次，具有重要的医学意义：每个人身上约有千万亿个体细胞，如血液细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、神经细胞等，这项技术意味着生产人自体干细胞有了无穷尽的原料细胞，为干细胞抗衰老保健和疾病治疗带来了新的希望。
“这项成果颠覆了人们对发育分化的传统观念，颠覆了人们对干细胞分化为体细胞这一过程不可逆的固有观念，为获取多能性干细胞增添了一个新的途径，为干细胞与再生医学、疾病发生发展机制研究和药物研发打开了一扇新的窗户。”“十二五”国家“863”计划“干细胞治疗临床转化研究”主题项目首席科学家、军事医学科学院全军干细胞与再生医学重点实验室主任裴雪涛教授对于该获奖项目曾给出这样的评价。
“所谓细胞核重编程，就是将已经分化了的成年体细胞进行诱导，让其重新回到发育早期多能性干细胞状态，重新获得发育成各种类型细胞的能力。通俗来讲，就是在细胞层面实现了‘返老还童’。”中科院动物所赵同标研究员在接受采访的时候说，“一直以来，生物医学界普遍认为高等动物从受精卵发育到神经细胞、肌肉细胞、肝脏细胞等特化细胞，是一个不可逆的过程，末端分化的成体细胞绝对不会反过来逆分化变成干细胞，但英国科学家约翰·戈登和日本科学家山中伸弥的工作从根本上颠覆了这一传统观点。”
科研争夺的高地
自2006年日本科学家山中伸弥等人建立诱导多能干细胞技术以来，干细胞多能性研究一直是国际干细胞研究的热点和难点，全世界该领域的实验室就像在赛跑一样，一系列重大成果相继诞生。
2007年，日本科学家运用相同的“简单处方”成功实现人表皮成纤维细胞的重编程。同年，全球共有4个研究小组报道了人诱导多能干细胞体系的建立。美国和日本科学家相继通过诱导多能干细胞培育出嵌合体小鼠，证实诱导多能干细胞的多能性。此后，诱导多能干细胞的研究成为生物医学研究领域前沿中的前沿，多个实验室着眼于诱导多能干细胞技术的更新，先后创建了腺病毒载体技术、蛋白转染技术、小RNA技术等一系列非整合重编程技术，期望解决传统依靠病毒转染建立诱导多能干细胞的安全性问题。
同样，我国在细胞核重编程及再生医学应用领域也取得了令人瞩目的成就。在体细胞克隆领域，我国相继成功获得第一头克隆牛、猪、猴等大动物，并在国际上率先成功获得人类体细胞克隆胚胎。在诱导多能干细胞领域，中科院动物所研究员周琪和北京生命科学研究所高绍荣两支研究团队，于2009年分别利用iPS细胞克隆出小鼠，从而在世界上首次证明诱导多能干细胞的全能性。
据统计，2011年，中国在诱导多能干细胞领域发表的论文数量位居世界第三，而在干细胞领域的总数量已经超过日本，跃居世界第二。
而早在2010年，裴端卿团队就发现，细胞“逆转”过程是由间充质细胞状态转变到上皮细胞状态来驱动的。在进一步的研究中，裴端卿、郑辉团队通过优化转化因子导入的顺序，发现在间充质细胞状态转变到上皮细胞状态前还存在一个上皮细胞状态向间充质细胞状态转换过程，并证明这样的多次转换有利于提高重编程效率。
“这一发现与中国传统阴阳太极理念较一致。我们进一步推论，间充质细胞状态与上皮细胞状态之间的多次相互转换机理具有较高的普遍性，在其他系统或研究中也存在。”裴端卿说。
诱导多能干细胞及其产生的功能细胞移植被认为是治疗遗传病、器官损伤以及帕金森等退行性疾病的重要手段。诱导多能干细胞过程可以将人体内的普通细胞“逆转”回到早期胚胎发育状态，从而重新获得可分化成为体内绝大多数种类细胞的能力。
据了解，按照新细胞生物学机制，其可像正常胚胎干细胞一样转换成各种不同类型的细胞，如神经细胞、肝细胞和心脏细胞等。由于这些重组细胞产自患者的核遗传物质，因此不用考虑患者的移植排斥反应。“以干细胞治疗为核心的再生医学，将成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径，从而成为新医学革命的核心。”科技部《干细胞研究国家重大科学研究计划“十二五”专项规划》对干细胞治疗的地位作了上述评估。
技术用于临床为时尚早
据介绍，2011年年初，中国科学院已将“干细胞与再生医学研究”作为战略性先导科技专项。该专项首席科学家、中科院动物所研究员周琪表示，希望通过发现干细胞生物学的基本规律，揭示干细胞在组织器官发生和形成及再生中的本质作用，建立具有自主知识产权的新技术，实现干细胞修复组织和治疗疾病的总体目标。
然而，干细胞产业尽管市场前景广阔，但国内干细胞技术的科研成果转换目前还存在一定障碍。国家干细胞工程技术研究中心主任韩忠朝表示：“干细胞再生医学产品研究开发代表着新方向，但是目前只有干细胞库技术服务产生了经济效益，其他干细胞产品还不能走入市场。干细胞药物上市审批存在障碍，导致科研成果难以转化、VC/PE不敢投资、企业不愿投入科研资金。”
裴雪涛认为，之所以将细胞核重编程技术视为再生医学发展的基础，是因为它为多能干细胞的获得提供了新的途径。此前，实验室研究的干细胞主要来源为胚胎干细胞和成体干细胞，前者虽具有多向分化潜能，但因伦理、技术、资源、免疫、致瘤等问题使其研究和应用受到限制；而后者虽然较易获得，但其分化效率、组织整合等并不理想。综合而言，诱导多能干细胞则集合了两者的优点，淡化了两者的缺点：来源为成熟细胞，获得相对广泛、数量充足；通过细胞核重编程，可使其获得多向分化潜能；来源于患者自体，因此免除了伦理和免疫排斥等问题的困扰。
裴雪涛坦言，诱导多能干细胞也有其不可回避的问题。它不仅要面对与其他干细胞研究相同的挑战，例如，如何分离获得各种组织特异性干细胞，如何保证高效的定向分化，如何确保整个分化过程安全、有效、可控，以及后续必须要解决的临床前研究、安全性评估、质量控制等。此外，还要解决其在诱导过程中可能出现的一系列问题，包括在重编程过程中，因基因转入而带来的安全风险；如何提高分化效率，确保在体外大量繁殖，以适应未来临床需要；一旦拿到重编程细胞，如何界定其与生理性细胞发育的区别等。
很多专家也提出，诱导多能干细胞的应用面临的最大的挑战就是它可能潜在的致瘤性。来自美国加州大学戴维斯分校的研究人员发现的证据表明，如今被认为大有希望用于一系列疾病治疗之中的诱导多能干细胞，非常类似于产生癌症的细胞类型。“科学家和临床医生必须对任何临床应用保持审慎。将诱导多能干细胞用于临床治疗，还需开展更多研究。”
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造血干细胞与其它多能干细胞相比，具有下列不同特点：首先在个体发育过程中，造血干细胞历经多次迁移，先由卵黄囊转移至胎肝，最后到达骨髓，而在其后的某些条件下又可出现髓外造血的情况，而其它多能干细胞多在固定的场所发育成特定的组织；其次，由于生理需要，造血干细胞始终处于较为活的增殖与分化状态，能从骨髓源源不断地进入外周血而到达全身各处，而成熟个体中的多能干细胞多局限于相应的组织器官中，一般情况下处于类似休眠的状态；第三，造血干细胞具有可塑性，可分化为肝脏、肌肉、神经等组织的细胞，一定条件下又可来源于肌肉干细胞及神经干细胞等，而这种分化大多在相应组织病变的情况下完成。
由此可见，造血干细胞是全能干细胞存在成熟个体的一种形式。成熟个体干细胞参与组织损伤的修复可能存在两种方式：一是相应组织内固有的干细胞参与修复；二是组织损伤动员骨髓释放造血干细胞，后者通过血液循环到达该组织，在特定的环境下增殖、分化，最终转化成该组织细胞，从而完成结构与功能的重建。而后者有可能起主导作用，也就是说，这些新的认识将有助于干细胞研究领域的进一步拓宽。
造血干细胞移植分同基因和异基因两种，移植成功的前提是患者与供者的人体白细胞组织相溶性抗原分型必须完全相合。同基因指同卵双生兄弟姐妹，相合概率为100%。异基因分血缘关系和非血缘关系两种，血缘关系指兄弟姐妹，相合概率为四分之一，非血缘关系的相合概率为四百分之一至万分之一。
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由于心脏疾病正威胁着很多人的健康，这种疗法在个性化治疗方面将是一个重大进步。未来这项新技术有望切实治疗人类最大的健康杀手之一——心脏病。该研究结果刊登在最新一期的美国《国家科学院学报》上。
人体皮肤细胞的“华丽变身”
研究人员将人体皮肤细胞的基因在实验室中进行“重新编程”，形成部分干细胞，并最终培育出功能性血管。英国心脏基金会教授徐庆博（音译）和英国伦敦帝国学院主席约翰·帕克都表示，这是个非常令人兴奋的研究，采用源于人体皮肤细胞的干细胞首次可以在人体外制成人造血管。
干细胞
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
利用基因编程手段既可以将培育出的人造血管植入体内，以取代堵塞或损坏的血管，又可将“重新编程”的细胞注入人的腿部或心脏恢复血液流动。这种方法也可用于血液循环不畅通的糖尿病患者，以防止截肢。
在临床中，通过采用骨髓干细胞疗法治疗心脏病已经实现，然而，其长期有效性是比较低的，并且某些干细胞在被引入人体之后，有可能会形成肿瘤。新的研究表明，来源于皮肤细胞的部分干细胞在进入人体之前，可“重新编程”为血管细胞，且没有形成肿瘤的风险。
在动物实验中，他们把这些“重新编程”后获得的细胞注射到缺血的小腿（一条限制血流量的腿）中，结果腿部功能明显得到改善。研究人员说，新研究将带来患者自身的皮肤细胞转化成血管细胞来治疗血管堵塞类疾病的疗法，下一步将会把这种疗法用于测试治疗其他血管疾病。
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目的综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题，并展望其前景。方法广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献，并进行综述。结果心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景，但还处于起步阶段，仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源。结论组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景，其细胞来源值得进一步研究。
【关键词】 心肌组织工程； 种子细胞。
组织工程是应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。其核心是模拟体内组织发生的环境，在体外培养细胞，构建由细胞和生物材料组成的、具有特定功能的三维工程化组织。组织工程心肌主要涉及种子细胞来源，支架以及体外构建方式和移植。下面我们主要讨论重点是心肌组织工程种子细胞。
1心肌组织工程的细胞来源
构建工程化心肌组织的最佳细胞，应该是容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。遗憾的是，目前还没有发现这样的细胞。供体(异源的)细胞相对容易获得，但是具有免疫排斥反应的风险；而自体细胞虽然很难获得和扩增，但是没有免疫排斥的困扰。目前，已报道的应用于心肌组织构建的细胞包括胎儿心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、骨骼成肌细胞、天然骨髓细胞、间充质千细胞和胚胎干细胞等。
1.1心肌细胞胎儿心肌细胞是研究的最早最广泛，被认为是目前干细胞研究领域的一个重要方面。Soonpa等［1］最早将胎儿心肌细胞移植到鼠的心肌。Scorsin等［2］将胎儿心肌细胞注射到心肌梗死模型鼠的左心室心肌，研究表明有50％的鼠的梗死边缘区有被注射的心肌细胞。胎儿心肌细胞移植能改善左心室功能，提高射血分数和心输出量。但胎儿心肌细胞作为种子细胞受到至少两个方面的限制：一是胎儿心肌细胞的来源，包括由于胎儿心肌细胞来源带来的伦理和法律问题；二是作为一种异体细胞移植而带来的免疫排斥问题。
1.2天然骨髓单核细胞天然骨髓单核细胞与其他细胞相比，这种细胞具有易获得、自体的和易扩增的优点。应用受限是由于它们很难转分化为心肌细胞或内皮细胞。
1.3骨骼肌成肌细胞骨骼肌成肌细胞不太可能成为心肌组织工程种子的原因是其分化后很难与宿主心肌发生电机械偶联。
1.4骨髓间充质干细胞干细胞被视为一种好的组织工程心肌种子细胞来源，是因为它们可再生能力强，高增殖能力和多能性。干细胞具有可以在一定条件下分化成心肌细胞的能力。因此多种心肌组织工程方法都是基于干细胞的运用。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下，能分化为成骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、内皮细胞，神经细胞和心肌细胞等。大量研究表明人骨髓间充质干细胞在适宜条件下也可向心肌细胞分化，除此之外，它还能分化成血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等，对心肌细胞起着重要的支持作用［3］。Rangappa等［4］应用人骨髓间充质干细胞和人心肌细胞在体外共培养，结果表明人骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化，有收缩蛋白和心肌特异基因的表达。Xu等［5］成功地进行了成人骨髓间充质干细胞的体外培养及向心肌细胞的诱导分化。苑媛等［6］报道，血管紧张素Ⅱ在体外可能经细胞外信号调节激酶通路诱导人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。动物实验显示，对实验动物的心脏梗死区移植经5一氮杂胞苷诱导的骨髓间充质干细胞，1个月后，骨髓间充质干细胞能在心肌梗死后心力衰竭的心肌及疤痕中存活并向心肌细胞分化，且改善受体的心功能［7］。骨髓间充质干细胞具有以下特点：（1）来源于自体，无免疫源性；（2）取材损伤小，仅行骨髓穿刺就可获得；（3）来源充足，可反复取材；（4）扩张能力强；（5）培养要求低。因此，骨髓间充质干细胞是心肌组织工程中前景广阔的细胞来源。
1.5胚胎干细胞胚胎干细胞有和骨髓间充质干细胞很类似：胚胎干细胞的来源不受限制，具有无限扩张能力，而且已证实了具有心肌分化潜能。但它来源于异体，但是目前研究发现，胚胎干细胞及其子代细胞具有免疫源性，另外人类胚胎干细胞的移植还涉及伦理方面的问题。申请临床应用受阻的主要原因也是人们对于同种异体来源导致潜在致癌性的担虑。
1.6诱导多能干细胞最近的一个克服上述问题的方法是将不成熟的基因（如卵母细胞）整合在成熟自体的干细胞。这种全新的概念叫做核移植，并且可以产生自体多能干细胞系。这种细胞被称为“诱导多能干细胞（iPS）”。Mitalipov’s group报道已经成功通过核移植的方法改编哺乳动物的成体上皮细胞，得到了多能干细胞［5］。就在同时，京都的研究人员将带有4种确定转录因子(Oct3/4，Sox2，Klf4，and c-Myc)的人皮肤成纤维细胞转导产生了一个多能干细胞系［8］。这些细胞表达人ESC的表面标志，具有正常的核型，并且表达端粒酶，满足多能性的标准。核移植也许对将来的心肌组织工程具有相当重要的意义。比如在组织工程化组织窦房结，组织工程化心肌等方面，能制造出理想的种子细胞。
1.7心脏自身干细胞由于免疫方面的顾虑阻碍了做关于人类心脏组织工程的研究。最近发现人类固有的心脏自身干细胞能够分化成有有功能的心肌，这无疑给人类心肌组织工程带来了新的希望。人类心脏一直被认为是终末分化的器官。10年前，研究人员在成年大鼠心脏里面发现存在固有心肌干细胞［9-12］。最近在人类心脏中也发现了类似的干细胞［13-15］。将其和正常心肌细胞混合培养后，注射到心梗区域，这些细胞能够产生新的心肌组织并且修复心脏的功能。现在已经找到该细胞的数种细胞表面标志物，比如c-kit，sca-1，isl-1，以及ABC载体（Abcg2）。但都还缺乏特异性，要如何准确筛选该细胞依旧还是没有解决的问题。
2总结
构建工程化心肌组织的最佳种子细胞，必须是能够容易获得的、能增殖的、无免疫原性的、具有分化为成熟的有功能的心肌细胞的能力的细胞。遗憾的是，目前还没有发现兼具这样优点的细胞。制造或再生心肌组织去替换或是修复因损伤、衰老、疾病或基因变异而丧失功能的心肌组织目前大量研究表明是可行的。但是，心肌组织工程领域仍然面临巨大的困难和挑战，如何获得足够数量的种子细胞就是其中之一。并且工程化心肌组织移植到体内后，还需要维持其结构和功能，并与宿主心肌建立机械和电偶联，此外还要解决免疫排斥以及潜在的致瘤性等问题。这些问题都是我们需要一一攻破的。除了实验室培育的心肌结构外，更多研究理所当然地应该放在原位再生具有功能的心肌上。如上文所说的越来越多的资料证据开始打破我们的传统观念，表明心脏是具有自我再生能力的。将来的研究应该是进一步找到心脏祖细胞的特殊标志，以及控制心肌组织再生的其他因素的潜力。如果成功的话，这些策略将解决供体器官短缺的问题，而且还能用于梗死心肌或先天性心脏病的外科修复。而需要实现这些，都需要我们在大量实验中细细探究。
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1 地中海贫血的治疗方法
1.1 地中海贫血重型患者手术治疗方法
通常而言,重型地中海贫血患者
会时常出现溶血现象,对此,临床诊治医生需对地中海贫血患者实施输血治疗.若是患者为重型地中海贫血,经常输血可能会造成继发性血色病,针对此种境况,则需要采用别的方式进行治疗.比如给应该给重型地中海贫血患者采用铁螯合剂,促进重型地中海贫血铁的排出.地中海贫血患者红细胞僵硬并伴有膜损伤,红细胞在脾内破坏,引起溶血,脾超出常规大小的重型地中海贫血患者可考虑脾切除手术.此外,有条件的地中海贫血患者可尝试用异基因骨髓或外周血干细胞移植.此外,铁螯合剂也是地中海贫血的一种治疗方法,但是使用过程中会对心脏产生毒性作用,医护人员应慎用。
1.2 地中海贫血重型患者的药物辅助治疗 溶血危象是重型地中海贫血患者经常出现的一种临床现象,除了对重型地中海贫血患者进行输血治疗之外,医护人员可以尝试采用糖皮质激素进行药物防御.需要注意的是,地中海贫血虽然可以采用药物治疗控制地中海贫血病症,但是患者用药必须遵循相应的药物原则,按照地中海贫血病情严重程度对患者进行按部就班的药物匹配.
2 地中海贫血的药物治疗研究方向
2.1 一般治疗 地中海贫血患者应注意个人休息和饮食营养,医护人员在给其服用药物的时可适当补充叶酸和维生素E.此外,保持病房内的环境卫生和空气清新,并提前进行消毒处理,尽力减少地中海贫血患者感染因素。
2.2 输血治疗 对地中海贫血患者进行输血治疗是当前来地中海贫血临床诊治中最常用到的一种治疗方法,也是比较有效的治疗方法.医护人员对地中海贫血患者实施输血治疗时,需注意的是红细胞输注仅适用于中间型和地中海贫血,不可用在重型地中海贫血.对重型地中海贫血患者,医护人员应从发病治疗早期,就对其实施中、高量的输血治疗,便于地中海贫血患儿生长发育期尽量接近正常,避免地中海贫血患儿在之后出现骨骼病变.具体的方法为:首先医护人员向地中海贫血患者反复输注浓缩红细胞,使地中海贫血患者的血红蛋白含量达120~150g/L;然后每隔14~28d向地中海贫血患者输注浓缩红细胞10~15ml/kg,使患者的血红蛋白含量能保持在90~105g/L以上.但是此种地中海贫血治疗方法,极易造成地中海贫血患者铁血黄素沉着症,对此,医护人员在进行输血治疗的基础上,还应加入铁鳌合剂辅助治疗,共同改善地中海贫血患者的病症.
2.3 铁鳌合剂 针对铁螯合剂对地中海贫血患者的治疗,一般情况下是在给地中海贫血患者输注红细胞1年之后,根据患者体内铁含量的多少,对其进行铁螯合剂辅助治疗.比如SF g/L,就需要使用铁鳌合剂进行地中海贫血临床病症的辅助治疗,常用药物为去铁胺、地拉罗司等.给地中海贫血患者注射去铁胺每日25~50mg/kg,每晚1次,连续皮下注射12h,每周5~7d,坚持长期应用.虽然去铁胺副作用不大,只是偶尔情况下地中海贫血患者会出现过敏反应,然而,一旦长期给地中海贫血患者使用,患者很可能会白内障和长骨发育障碍.对此,医护人员可将维生素C 与铁鳌合剂联合.2.3手术治疗地中海贫血患者的手术治疗中,最常见的治疗方式为骨髓移植,或者是造血干细胞移植.目前为止,异基因造血干细胞移植是医护人员能找到彻底根治重型地中海贫血唯一的治疗方法,但是造血干细胞移植需要事先进行HLA 配型,对此,医护方面应着重对HLA 相配的造血干细胞的多渠道宣传,一旦重型地中海贫血患者需进行造血干细胞移植,医院方面能第一时间找到符合的造血干细胞捐献者,避免延误地中海贫血患者治疗的最佳治疗时机。
3 地中海贫血药物治疗的研究进展
3.1 珠蛋白肽链基因调控剂 在人体发育的不同生长阶段,不同的珠蛋白肽链基因会呈现不同的开启和关闭形式,用于调控血红蛋白四聚体组合发展的不同形式.比如,胎儿期主要是为HbF,在胎儿出生六个月之后一直到其成年,其血液中红细胞的组成主要有三种血红蛋白分别是HbA、HbA2 以及HbF,其含量分别是HbA95%、HbA2 在1.0%~3.5%之间,HbF2%.按照这个标准,对地中海贫血患儿进行相应的输血治疗,但是要建立在患儿可承受的范围内.肽链基因活化剂能有效激活地中海贫血患者体内原本关闭的 基因,促进基因的急剧增长,使得新合成的链取代有缺陷的链,而且基因还能与过剩的链构成HbF,提高血红蛋白的含量,同时可以减轻链包涵体,进一步改善地中海贫血患者的临床表现症状。
3.2 多功能干细胞移植 虽然地中海贫血危害很大,临床上常用的定期输血和去铁治疗治疗费用高昂,因此在近些年的地中海贫血治疗中,科学家将目光瞄准了近年来兴起的诱导多能干细胞.通过诱导多能干细胞(iPS)通过对成体细胞进行重新编程,从而使细胞成为多能干细胞,重新获得分化成多种细胞的能力.项目组将把病人皮肤细胞等体细胞诱导成多能干细胞系,然后通过致病基因的原位修复,进一步分化成有功能的血液干细胞,最终用于地中海贫血患者的移植治疗,从而根治地中海贫血病.
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干细胞能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，实现组织的更新和修复。丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效。近年许多实验证实丹参在诱导干细胞增殖和分化上显示出巨大的潜力，选择性采用神经干细胞标志物巢蛋白(Nestin)、神经元标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、βⅢ微管蛋白(βⅢTubul{n)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)进行鉴定，结果显示阳性，表明中医药在干细胞研究的道路上迈出了新的一步。
1 干细胞的概念及生物学特性
干细胞(stem cell，SC)是一类具有自我更新和多向分化增殖潜能的原始细胞，能产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，形成人体多种组织器官的祖细胞。既具有生理性的更新能力，又具有对损伤疾病导致的修复功能。目前公认的干细胞应具备的几点主要细胞生物学特点有：①具有自我更新能力与维持能力，也就是说它可以分裂，分裂后的子细胞与母细胞一样保持其原有的各种细胞生物学特性，而且还可以不断地分裂下去。干细胞一旦形成，在机体内终生都具有自我更新能力，不同于那些有限自我更新能力的祖细胞。这对于维持机体组织器官的稳定性有很重要的意义；②具有多向分化的能力(多能性或全能性)，可以分化发育成各种胚层组织的细胞，或可以分化成为本系统各谱系的细胞(特定组织干细胞，如造血干细胞)；③既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力，如骨髓间充质干细胞等；④干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境(nitches)，也就是说干细胞往哪一种方向分化，必须在该细胞生存的特定微环境前提下进行分化。已有诸多的实验表明，如将胚胎细胞种植人小鼠大脑内，这些干细胞将向神经系统分化。
2 干细胞的分类
干细胞存在于早期的胚胎、骨髓、脐血和部分成年人的细胞中。在一定条件下可以分化为多种功能细胞。
2．1 按分化潜能的大小分类可分为3种：一是全能性干细胞，它具有分化成人体内各种细胞的潜能，如胚胎干细胞；另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化为多种细胞组织的潜能，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可以分化出至少12种血细胞，还可以分化出造血系统以外的其他细胞；还有一类为单能干细胞(也称专能、偏能干细胞)，这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的肌原细胞或叫卫星细胞。
2．2 根据干细胞生存阶段分类可以分为胚胎干细胞和成体干细胞两类。胚胎干细胞是来源于哺乳动物早期胚胎内细胞团中的一种二倍体细胞，一般可从植入子宫内膜前的囊胚中分离出来。这种细胞是能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有全能性或多向性分化潜能。它们能分化为属于外胚层、中胚层和内胚层的各种分化细胞。它们的基本特性是具有发育的全能性，即具有分化成为机体内任何一部分组织和器官的能力，因而有人称之为“万能”细胞。美国的威斯康星大学的Thomson等和霍普金斯大学的Gearhart实验小组分别报道用不同材料、不同方法成功地分离并建立具有多向分化潜能和永久生殖能力的胚胎干细胞(ES)细胞系和畸胎瘤干细胞(Ec)细胞系。研究模型的解决，为人类的健康和现代生命科学的发展、研究开创了一个新时期。成体干细胞也称为特定组织干细胞，多能干细胞继续向前分化则成为定向祖细胞(committed progenitor)，持续停留在某种组织中，被称为特定组织干细胞。它们在特定的条件下，可以对称地分裂为2个新的子代干细胞或2个功能细胞，也可以不对称地分裂成1个子代干细胞和1个功能干细胞，从而使组织分化与器官保持生长和衰退的动态平衡。它们具有自我更新和产生本系统后续细胞的增殖细胞，如造血干细胞(hernatopoietic stem cell，HSC)、骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cdt，MSC)、神经干细胞(neural stem cdl，NSC)、肌肉干细胞、表皮层干细胞、肝干细胞，最近我国已成功培养心肌干细胞等。传统的观点曾认为成体干细胞的分化潜能较弱，只能分化成与其组织来源一致的某种特定的组织细胞。然而在某些情况下，干细胞的分化并不遵循这一规律。在实验中分离出小鼠的肌肉干细胞，经过体外培养7 d后，将它与小量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化成为各种造血干细胞系。这种现象被称为干细胞的可分化性H]。迄今对成体干细胞研究较多的是造血干细胞和骨髓间充质干细胞；其次神经干细胞的研究也较多，以及成肌干细胞和皮肤干细胞。也许是人们渴望找到一种对于神经系统退行性疾病的有效治疗方法，近年来对于神经干细胞的研究颇多也颇深入，并且已经有实验表明神经干细胞的移植可以治愈帕金森病。事实上可能各种成体组织中均含有分裂能力的干细胞。当组织受到外伤、老化、疾病等损伤时，这些细胞就增殖分化产生新的组织来代替，以保持机体平衡。
3 丹参与千细胞的相关实践基础
干细胞归巢于新的组织后，在局部组织微环境的作用下定向分化为相应组织的成熟细胞，才能实现组织的更新和修复。关于干细胞分化的调控机制目前还不十分清楚，大多数的观点认为与微环境的调控密切相关。干细胞通过与邻近细胞、细胞基质和细胞因子的相互作用，而影响其分化进程。丹参(Slvia miltiorhiza Bge)在临床广泛应用于心、脑、肝缺血／再灌注损伤的保护、调节免疫应答、抗感染等，其在诱导干细胞增殖和分化上亦显示出巨大的潜力。其成分包括：丹参酮I、IIA、IIB、隐丹参酮、二氢丹参酮、原儿茶醛、丹参素等。丹参注射液具有活血化瘀、理气止痛的功效，是临床治疗冠心病、心绞痛的常用中药。近年发现丹参注射液有细胞诱导作用，孟凡刚等用丹参诱导成年小鼠骨髓基质干细胞，分别于诱导后5h，24h，72h进行免疫细胞化学染色，结果显示巢蛋白(Nesfin)和βⅢ一微管-蛋白(BⅢTubulin)均呈阳性表达。杨立业等用丹参注射液诱导鼠间充质于细胞分化为神经样细胞。项鹏等用丹参注射液诱导成人骨髓间质干细胞，为进一步确定MSC是否分化为神经元，采用神经元标志物神经元特异性烯醇化酶、NF、神经干细胞标志物巢蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAD)进行鉴定。结果显示，丹参诱导5h后，多数细胞表现为NSE阳性，棕黄色染色，细胞形态多样，出现简单的双极细胞和复杂的多极细胞。NF是神经元特异性中间纤维，是神经元胞质主要结构之一，NF免疫组化结果与NSE类似，部分细胞体与突触皆为阳性。诱导5h后多数细胞巢蛋白染色阳性，证明该细胞具有神经干细胞。GFAP免疫组化染色显示无阳性细胞，证明本研究诱导MSC分化为神经元而非星形胶质细胞。马廉等用丹参注射液诱导人的脐血MSCs后细胞形态发生明显改变，细胞表达3类神经细胞的相关标记，少量细胞表达神经干细胞标记兔抗巢蛋白抗体，40％－50％细胞表达神经元标记鼠抗BⅢ微管蛋白和鼠抗神经微丝抗体。余氏等已经证实丹参素、丹参酮可在体外成功诱导人MSC为神经元样细胞。Nestin，NSE，NF-M染色呈强阳性(棕黄色)，而未分化的MsC为阴性(蓝色)。原清涛等用隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞行神经元标志物NSE，NF的鉴定，结果显示，用隐丹参酮诱导的细胞可以呈现NSE，NF阳性，证明已经诱导为神经元样细胞。夏文杰等用隐丹参酮诱导成人骨髓间质干细胞，结果显示隐丹参酮诱导5h后，大多数细胞Nestin阳性，7h后多数细胞NSE染色阳性部分神经元拉成网状，诱导5d后NF－H染色阳性。
4 小结与展望
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关键词：诱导性多功能干细胞（iPS）重编程条件优化重编程机制再生医学
【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1671-8801（2013）03-0002-02
1体细胞重编程研究发展
由于胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES cells）的生物学特性及其在医疗领域的广阔应用前景，使其一直备受国内外医学科研工作者的青睐。但是，由于人类胚胎干细胞的取材触及伦理道德问题，所以已被很多国家法律明令禁止，相关的研究也因此陷入进退两难的境地。
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，分别将24种转录因子按不同组合方式导入小鼠成纤维细胞，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞[2]。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
2008年4月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞改造成iPS细胞，然后成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞。
2009年2月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的iPS细胞制成的iPS细胞培育出血小板，而且从技术上说用iPS细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的。
2009年3月伊始，iPS细胞研究便相继迎来两项重大突破，英国和加拿大科学家发现了不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为iPS细胞的方法；美国科学家则在《细胞》杂志上宣布，他们可以将iPS细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证由此获得的神经元细胞的基本功能不受影响。
2009年7月，中国科学家周琪和高绍荣等人利用iPS细胞克隆出活体实验鼠，首次证明iPS细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。
2010年7月27日，日本京都大学iPS细胞研究所中川诚人讲师的研究小组发现，制取iPS细胞的转录基因c-Myc易致癌，应用目前的技术克隆出的活体小鼠中一年后的死亡率为70%，而其中有半数为得癌而死。该研究小组用一种结构相近的L-Myc的转录基因取代这一基因制取人体干细胞，得到的干细胞数量是之前的5倍，而且将这一技术应用于克隆活体小鼠实验发现，活体小鼠的死亡率降到了10%。
2iPS形成的细胞内机制浅析
最初的遗传研究显示同源转录因子Oct4、Nanog在早期发育和ES细胞判定中是至关重要的。它们在多能胚胎干细胞和囊胚期的内细胞团中都有表达。但是，最近的研究揭示，Nanog只是稳定胚胎干细胞的多能性状态而非维持其多能性。在ES细胞中，Oct4能与HMG-box转录因子Sox2形成异源二聚体共同作用于细胞的多能性。对Oct4，Sox2，Nanog在全基因组上调控基因的研究显示：①Oct，Sox2，Nanog结合在一起共同作用于各自的基因起始区促进转录，如此形成一个循环的自我调控环，从而维持蛋白表达的稳定，可促进多能性的维持；②三个因子常常共同募集到几百个特定的靶基因上，这也解释了为何诱导iPS需要多个基因；③Oct4，Sox2，和Nanog调控的基因有两类，一类被激活，另一类被沉默（激活的基因与多能性有关，沉默的基因与分化有关）。被Oct4，Sox和Nanog沉默的基因往往还募集一种抑制转录因子――PcG蛋白。PcG形成PRCs蛋白复合物家族。其中PRC2催化组蛋白H3K27甲基化，H3K27位的甲基化提供PRC1的结合位点，PRC1使染色体结构更紧密，同时抑制染色体重塑活性以维持基因的沉默状态；④三个因子促进特定microRNAs（miRNAs）的表达，研究证实miRNA在ES细胞基因调控中发挥重要的作用，但具体机制尚不清楚[1]。
总的来说，利用慢病毒转导方法转入细胞的诱导因子（Oct4，Sox2等）引起细胞内连续的随机的遗传事件，包括激活部分基因的表达或者抑制部分基因的表达等，而只在特定的敏感转入细胞中才随机发生重大的变化足够另体细胞诱导为iPS细胞。这样的重大变化包括什么呢？比如：①内源多能性基因，Oct4，Sox2，Nonag等基因的稳定足量表达；②形成iPS细胞必须的DNA修饰及染色体结构变化和修饰能够缓慢的足够完成；③被修改的这些DNA修饰及染色体结构变化和修饰必须在DNA复制即细胞增殖被保持等。
相比于Oct4，Sox2和Nonag，Klf4和c-Myc在重编程中的作用我们更不了解。一种论点是这两个因子使体细胞癌化，赋予MEFs无限快速增殖类似ES细胞的潜能；第二种论点是c-Myc更改MEFs的染色体结构使重编程因子更容易募集到它们的靶基因上；第三种论点c-Myc促进DNA复制，从而使体细胞有机会重置它的遗传表达状态。Klf4可在体细胞中辅助Oct4和Sox2激活关键ES细胞基因的表达。
3iPS细胞研究中存在的问题
2006年8月，日本的Yamanaka研究组利用反转录病毒载体，成功确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四种转录因子可将终末分化的细胞重编程为iPS细胞。2007年11月，该研究组又用同样的方法将人皮肤成纤维细胞重编程为iPS细胞，从而正式掀起了iPS细胞应用于疑难疾病临床治疗的研究热潮。
虽然iPS细胞的临床应用潜力巨大，但目前仍有许多亟待解决的科学问题困扰着它在医疗和制药领域的实际应用。这些问题主要包括：①iPS细胞的安全性不稳定。现阶段制备iPS细胞的主要方法是利用逆转录病毒或慢病毒载体携带转录因子转染细胞，使转录因子的编码基因整合到宿主细胞中诱导细胞的重编程。这种以插入基因诱导细胞重编程的制备方法，可能会因为破坏细胞基因组的完整性，或因为过量表达转入的外源基因，从而导致iPS细胞不能最终分化成熟甚至导致肿瘤的发生；②iPS细胞的制备效率不高且制备成本仍然很高；③对iPS细胞自我更新以及定向分化的调控机制知之甚少[5]。
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就生命伦理学而言，生命主要指人类生命，但也包括动物生命和生态，伦理学是对人类行动的规范性研究。可以将生命伦理学界定为运用伦理学的理论和方法，对生命科学、生物医学和生物技术以及医疗卫生中的伦理学问题进行系统研究。伦理问题是应该做什么和应该如何做的问题，对前者的探讨构成实质伦理学，对后者的探讨构成程序伦理学。
在某种意义上说，生命伦理学是医学伦理学的扩展。经典的医学伦理学主要是临床伦理学，探讨临床实践中的伦理问题。近年来生命伦理学的研究专业化程度不断提高，标志是有分科越来越细的趋势。目前己经提出的生命伦理学的分支学科领域除了原有的临床伦理学(clinicalethics)和研究伦理学(researchethics)越来越多的学者在探讨公共卫生伦理学(publichealthethics)、遗传伦理学(genethics)、神经伦理学(neuroethics)、纳米伦理学(nanoethics)，以及合成生物伦理学(synbioethics)。
生命伦理学是实践哲学。与哲学其他学科关注知识相比，它关注人类的行动，并不谋求建立体系而以问题为取向，其目的是如何能够更好地解决生命科学、生物医学和生物技术以及医疗卫生中的伦理问题，从而采取较为合适的行动(包括政策)医学或科学技术解决是“能做什么”的问题，而伦理解决的是“该做什么”的问题，涉及价值取向。生命伦理问题的解决不是从任何一种伦理学理论演绎出来的，它需要对所涉及的各方面的不同价值进行权衡，在伦理学理论和原则指引下找到可能的解决办法。通过伦理学的论证和辩护，从中选择合乎伦理的问题解决办法和行动方针。在探寻最佳办法或行动时还要运用案例分析、概念分析和论证分析等方法。因此生命伦理学是所应采取的是“骑单车”模型，而不是“放风筝”的模型，运用的是“具体问题具体分析”的方法，而不是从一个喜爱的理论推演出伦理问题的所有答案。正因为如此，生命伦理学不同于其他哲学学科，自诞生以来一直比较兴旺发达，并且也是首先体制化的伦理学。
关注当代生命科学、生物医学和生物技术的发展提出的伦理问题永远是生命伦理学的核心要务。当年促使生命伦理学诞生的主要是生命维持技术和人类辅助生殖技术的应用在人的生死两端提出的伦理问题，而如今新兴技术(emergingtechnologies)更是层出不穷，由于知识的创造不可预测，因而新兴技术的出现也往往是出乎意料的①而它们的创新、研究、开发、应用也会提出意料之外的伦理问题，从而使生命伦理学这门学科永远激动人心。本文将集中考虑新兴生物医学技术伦理学的最近进展。同时从国际视角来看生命伦理学的最近进展，其中也要提及我国学者或机构的重要工作。所谓“最近”是追溯近5年的进展，但个别地方可能会追溯得更早一些。
一、干细胞研宄
(一)人的胚胎干细胞研究
干细胞研究的伦理问题曾经主要在于人的胚胎干细胞研究。宗教影响比较大的国家反对进行人的胚胎干细胞研究，他们认为人的胚胎与人具有同等的道德地位，但人胚胎干细胞研究必须涉及人胚胎，并在获取干细胞后毁掉胚胎，在他们看来这就是杀人，因而不能容许。2005年3月8日联合国通过了一项关于人的克隆声明，要求成员国采取一切必要手段禁止所有形式的人的克隆，因为它与人的尊严和保护人类生命是不相容的。但声明并没有解释什么是所有形式?什么是人的尊严?为什么所有形式的人的克隆与人的尊严不相容?什么是人的生命?为什么所有形式的人的克隆与保护人类生命不相容?包括我国在内的34个国家投票反对这项声明。
在人的道德直觉中人的胚胎与人并不享有同等的道德地位。人的胚胎不享有人的伦理地位，不具有与人一样的价值，毁掉胚胎不是‘杀人”。然而它确实应享有一定的伦理地位，因此我们对它应该有一定程度的尊重(duerespect)，处置它要有一定程序(dueprocedure)和要求。应有的尊重和处置程序包括:人类胚胎用作研究必须是体外的;胚胎的研究不能超过14天;只能用于不用人类胚胎重要研究目的无法达到的研究;胚胎不是商品，不能买卖;科学家应采取必要的行动纪念那些胚胎的贡献;对胚胎的埋葬或火化应有一定方式，应有简单庄严的仪式等。
(2)非人胚胎来源的干细胞研究
如果我们不用人的胚胎干细胞进行干细胞研究，特别是现在可从人体细胞诱导出多能干细胞GPSC)，是否就可如有人所说“回避”伦理问题呢?确实有人认为，iPSC的优点之一是“摆脱伦理问题”。141然而，来自人胚胎以外的干细胞研究有其自身的伦理问题。
Hyun指出，日美两国科学家分别成功地对人类皮肤细胞进行遗传修饰这些细胞经遗传修饰后其行为类似胚胎干细胞，称为诱导多能干细胞(PS细胞)然而这并不能经过干细胞的伦理挑战。首先iPS细胞并不能代替胚胎干细胞，由于基于许多理由iPS细胞的研究与胚胎干细胞的研究是要齐头并进的。对胚胎干细胞的研究有助于我们理解iPS细胞，知道这两类干细胞在生物学和临床上的异同，以及哪一种在临床应用方面最佳。
另外iPS细胞有安全问题以及知情同意问题。在可预见的未来，病人寻求iPS细胞及其直接衍生物的临床应用时，要考虑病人利益和福利问题。此外由于iPS细胞较易获得，滥用的可能性也更大，应该考虑如何防止一些医生和科学家利用病人及其家属的绝望心理，提供给他们未经证明的疗法。151Sugarman指出，诱导多能干细胞GPSC)研究，涉及的伦理问题包括：在获得这些干细胞时有知情同意、隐私保密和公正问题，在进行动物实验时有动物伦理问题以及嵌合体/杂合体问题，尤其首次用于人有许多伦理问题，还有知识产权和利益冲突问题。
2008年HinxtonGroup发表“共识声明：有关多能干细胞衍生配子研究对科学、伦理和政策的挑战”17，提出7条建议，其中包括:PSC衍生配子研究必须遵循伦理原则和行动规范，并符合现有的监督机制;杂志编辑审阅PSC衍生配子研究时，应支持并促进其符合伦理标准;在试图将PSC衍生的配子用于人类生殖的研究开始之前，必须保证己有审查机制到位;在考虑制定对技术应用的管理政策时，必须区分基于技术和安全性考虑的分歧和基于道德考虑的分歧等。
二、人一动物混合胚胎(嵌合体和杂合体)研究
有关讨论嵌合体"①和杂合体②研究的哲学/伦理问题的文献很多。人一动物混合胚胎或机体(嵌合体和杂合体)的哲学问题包括本体论问题和伦理问题。本体论问题是，这类人一动物混合胚胎或机体到底是什么实体?人还是动物?还是半人半动物?还是既非人，又非动物?伦理问题有两个:一个是这些人一动物混合胚胎或机体的道德地位怎样?所谓道德地位是一个我们应该怎样对待它们的问题;二是是否允许对人一动物混合胚胎或机体进行研究?但要讨论是否允许，首先要确定标准。一些学者曾经提出的标准有：厌恶(repugnance)、不自然(unnaturalness)、跨越物种界线(crossingspeciesboundary)和违反人类尊严(humanitydignity)等。但大多数认为这些标准本身不能得到伦理学辩护，而认为评判杂合体/嵌合体研究是否应该允许的主要标准应该是不伤害/有益原则。如能促进科学发展和未来使许多人受益，而伤害较小，则应允许进行。当有可能对杂合体和嵌合体自身或周围生命体的伤害超过受益时，就应中止或制止。
2008年英国下院通过法案允许进行人一动物混合胚胎的研究，某些类型的胚胎含有人和动物的DNA，成为“人混合胚胎”按照法律接受管理，包括:细胞质杂合体(cybrids)胚胎、人一动物杂合体胚胎、人的转基因胚胎、人一动物嵌合体等。
规定不可在最早出现下列情况之一后仍保留经批准创造的任何人混合胚胎：出现原条(开始胚胎细胞分裂为3种不同细胞类型继而形成不同类型的组织)或从创造人混合胚胎过程开始那天起14天。
