细胞培养范文

导语：如何才能写好一篇细胞培养，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

[关键词]动物细胞培养　动物血清

动物细胞培养培养基中要加入动物血清,而其在培养过程中究竟起什么作用,一直是高中教学的疑点。为了解决这个问题通过查阅相关资料从血清的成分出发得出以下结论。

一、血清及其成分

血清是血液凝固析出的淡黄色透明液体。如将血液自血管内抽出,放人试管中,不加抗凝剂,则凝血反应被激活,血液迅速凝固,形成胶冻。凝血块收缩,其周围所析出之淡黄色透明液体即为血清,也可于凝血后经离心取得。从成分上看动物血清的成分主要包括:水90.7血清白蛋白4.4血清球蛋白2.1氨基酸氮0.005尿素氮0.012其他非蛋白氮0.025葡萄糖0.08乳糖0.025各种脂肪酸0.38脂肪0.14卵磷脂0.2胆固醇O,22钠离子0.38钾离子0.02钙离子0.01镁离子0.0035亚铁离子0.0001氯离子0.36磷酸氢根离子0.01硫酸根离子0.001碳酸氢根离子0.17DPG SGOT各种激素酶碱基各种氨基酸(以上数据均为百分比)。从成分上看血清在动物细胞培养中的作用是很复杂的。

二、各成分的功能

1　可以起到营养物质的作用

动物在代谢的过程中所需的营养包括水、无机盐、维生素、糖类、脂肪、氨基酸和纤维素等。这些成分动物血清都可以提供给体外培养的动物细胞,但这些营养物质(除水以外)的含量在动物血清中所占的比例很少,而且主要的营养物质在动物细胞培养基的配制中已经添加了。所以,从这些角度看动物细胞培养加入的动物血清虽然能起到为培养的动物细胞提供营养物质的作用,但这并不是主要的作用。

2　可以起到调节的作用

动物细胞的代谢离不开调节。在动物体内有两种调节方式来维持动物代谢的稳定,而细胞本身的代谢调节中激素调节的作用很关键。血清中提供了适量且比例适中的各种各样的激素来保证动物细胞离体后的正常代谢。

3　可以为动物细胞提供必需物质

在微生物的培养中要为培养的微生物提供生长因子。同样动物细胞代谢过程中有很多物质是动物细胞所必需而自身无法合成的的,例如碱基、维生素、氨基酸等微量物质,它们的作用非常重要,细胞需要它们合成核酸和蛋白质,缺乏-要导致细胞生长不良甚至死亡;提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力;,提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。这些物质都存在于血清中,如果在配制培养基的时候一项项添加是非常麻烦的。所以加入动物血清类似微生物培养中的天然培养基的做法,简单方便、效果好。

4　可以为离体的动物细胞提供能量及解毒功能

血清中存在大量的糖类、脂类物质,这些物质可以为动物细胞提供大量的能量。有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。

5　是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源

动物细胞培养的一个很重要的用途就是用取自烧伤病人皮肤的健康细胞进行培养,可以获得大量自身的皮肤细胞,为大面积烧伤的病人移植。人工皮肤的制备需要培养的细胞贴附在薄膜上形成皮肤组织,血清就为这个过程提供所需因子。

6　起酸碱度缓冲液作用

在动物血清中存在丰富的无机盐,还具有很多缓冲物质,在培养基的酸碱度发生变化时起到缓冲作用。

7　提供蛋白酶抑制剂

使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。

总之,动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能,更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等,这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10%～20%)。

参考文献

[1]王玢,左明雪等

人体及动物生理学(第二版)

北京:高等教育出版社、2008

篇2

达情况，着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间。结果 以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞，在96孔板中进行体外培养，获取12个细胞亚系（获取比例为6.25%），均有高成瘤性。癌干细胞相关标志CD44

与ESA均为高水平表达，而CD184表达则在12个细胞系之间有差异。在单个细胞培养中，形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态，12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆，均可进行连续传代与扩增，而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡。结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞，而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系，是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式。

[关键词] 单细胞； 有限稀释法； 舌癌干细胞； 完全克隆

[中图分类号] Q 21 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.021 癌干细胞是癌组织中一小群具有干细胞特性的细胞，具有自我复制与更新的能力，而且增殖与分裂能力极强，少量细胞即可形成体外移植瘤[1]。近年

有关肿瘤发生、转移、耐药与复发等诸多难题均从癌干细胞的角度进行研究。这种研究的基础和前提是明确癌干细胞的标志或分离出癌干细胞，以提供研究的靶细胞。目前已发现多种永生性癌细胞系中存在有癌干细胞，Tca8113M1舌癌细胞系同样可能存在有癌干细胞，可以作为舌癌干细胞的研究对象。鉴于癌干细胞独特的自我复制与更新能力，本研究以Tca8113M1舌癌细胞系为研究对象，采用有限稀释法分离出单个舌癌细胞进行体外培养，利用癌干细胞的自我复制能力进行分裂增殖，形成预期的单细胞克隆，进一步形成细胞亚系，以此证明Tca8113M1

舌癌细胞系中存在癌干细胞的可能性，同时检测细胞亚系癌干细胞标志的表达情况，观察不同细胞亚系的生物学特性，并且动态观察单细胞培养中细胞克隆形成的规律，为从Tca8113M1细胞系中分离舌癌干细胞提供前期实验依据。

1 材料和方法

1.1 舌癌细胞系来源

人舌癌细胞系Tca8113由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室建系，四川大学华西口腔医院赠送。右江民族医学院肿瘤分子生物学实验室在此基础上建立了转移人舌癌细胞系Tca8113M1[2]。

1.2 主要试剂和仪器

胎牛血清（Hyclone公司，美国），RPMI1640培

养基（Gibco公司，美国）；PE标记抗人CD44抗体，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人细胞外可溶性抗原（extracellular soluble anti-

gen，ESA）抗体，PE/cy5标记抗人CD184抗体，同

型对照抗体分别为大鼠IgG2bκ2、小鼠IgG1与小鼠IgG2aκ4。CO2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪（BD公司，美国），倒置显微镜（Olympus公司，日

本）。

1.3 体外单细胞培养、建系及细胞克隆生长的动态

观察

采用有限稀释法进行体外单细胞培养与建系。Tca8113M1细胞经复苏后，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。用0.25%胰蛋白酶消化细胞制备细胞悬液，转移至96孔板，采用有限稀释法保证每个孔有1个细胞，在倒置显微镜下观察其生长和增殖情况，待其生长成多个细胞克隆后，用0.25%胰蛋白酶消化转移至6孔板扩增培养后，在培养瓶中反复传代建立细胞亚系。此外，在此培养过程中动态观察单个细胞形成细胞克隆的形态与生长情况，观察时点分别为3 d和1、2、3周。

1.4 舌癌细胞亚系成瘤性检测

建立裸鼠皮下移植瘤模型。体外培养Tca8113、Tca8113M1、Tca8113M1舌癌细胞亚系细胞，选取形态良好的生长期细胞，在生长旺盛时接种。具体步骤如下：消化收集舌癌细胞，800 r・min-1离心3～

5 min，弃上清液，计数细胞总量，以含10%胎牛血清的DMEM培养液按每毫升1×107个细胞的密度稀释细胞；消毒裸鼠右腋窝的皮肤，将细胞接种于皮下，以皮下结节直径超过1.0 cm为成瘤标准。共接种裸鼠45只，具体分组如下：1）Tca8113M1舌癌细胞亚系组，共12个亚系，每组3只，共36只；2）Tca8113M1舌癌细胞组，6只，为母系细胞系对照组；3）Tca8113舌癌细胞组，3只，为来源细胞系对照组。

1.5 流式细胞术检测舌癌细胞亚系癌干细胞相关标

志CD44、CD184、ESA的表达情况

将舌癌细胞（密度为每毫升1×106个）消化以后，800 r・min-1离心5 min，弃上清液，加入D-hanks液重悬，尽量将细胞吹散，将细胞悬液分别移入试管中（每管体积为500 μL），设置对照管和样本管。在对照管中加入同型对照抗体（分别是大鼠IgG2bκ2、小鼠

IgG1与小鼠IgG2aκ4）各5 μL，在样本管中加入荧光抗体（PE标记抗人CD44、FITC标记抗人ESA、PE/cy5

标记抗人CD184）各5 μL，置于避光环境下室温孵育30 min，然后于流式细胞仪上检测CD44、CD184、ESA的表达情况。

2 结果

2.1 Tca8113M1细胞体外单细胞建系培养

Tca8113M1单细胞培养12 h后，细胞贴壁；24 h后部分细胞出现变大变薄、空泡样变等老化现象；3 d后，有7个孔的细胞出现增殖分裂现象；7～10 d后有12个孔的细胞开始增殖为单个或数个完全细胞克隆（克隆形成过程见图l）。

培养4～6周后，细胞基本达到稳定生长并增殖的状态，以癌细胞的克隆样生长为主，细胞呈铺路石状，可见巨核、多核细胞，核分裂象多见。待培养孔接近80%铺满时，将细胞转移至6孔板上扩增培养，1～2周后转移至培养瓶中继续传代培养，稳定传代30代后冻存。本研究以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单细胞，并在96孔板中进行体外传代建系培养，获取12个细胞亚系，比例为6.25%，分别命名为Tca8113-S1～Tca8113-S12。

2.2 Tca8113M1细胞体外单细胞培养形成细胞克隆

的动态观察

以3 d和1、2、3周为观察时点，发现单个细胞形成细胞克隆的形态主要有3种：完全克隆、部分克隆、旁克隆。Tca8113-S1～Tca8113-S12细胞亚系的细胞均源于单个细胞形成的完全克隆，均可以进行连续传代与细胞培养扩增，而其他单个细胞培养形成的部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡，未能连续传代进行细胞扩增。3种克隆在培养过程中的变化情况如下。1）完全克隆：细胞之间紧凑密集成型，增殖速度快，其中1～2周为典型的完全克隆状，3周时在细胞克隆中央出现细胞重叠生长现象（图2中A1～A4）；2）部分克隆：克隆形态界于旁克隆与完全克隆之间，细胞间较疏松，其中1～2周为典型的部分克隆状，但第3周细胞克隆疏松，形状消散，

有转变为旁克隆的趋势（图2中B1～B4）；3）旁克隆：

细胞间疏松不成型，第1周较典型，第2、3周后细胞老化（图2中C1～C4）。

2.3 Tca8113M1舌癌细胞亚系成瘤情况

将舌癌细胞亚系Tca8113-S1～Tca8113-S12接种于裸鼠皮下后，1周后可触及皮下结节，表面光滑、质硬、可活动；2周后可见皮下结节生长迅速；3～4周后皮下结节最大直径达1.0 cm以上。含对照组在内的45只裸鼠均接种成瘤，成瘤率为100%。

2.4 流式细胞术检测细胞亚系癌干细胞相关标志

CD44、CD184、ESA表达情况

流式细胞术检测结果见表1：除了Tca8113-S1、Tca8113-S6与Tca8113-S10的ESA阳性表达率分别为60.7%±3.6%、74.1%±1.5%与65.3%±2.8%外，其余细胞亚系ESA的阳性表达率均在80%以上；各亚系CD44阳性表达率均很高，除了Tca8113-S7为68.9%±2.4%外，其余亚系的阳性率均在90%以上；12个亚系的CD184表达存在差异，阳性率在14.8%±3.5%至74.4%±1.5%之间波动。

3 讨论

本研究利用有限稀释法等经典的细胞培养技术，以舌癌Tca8113M1细胞系为研究对象，随机选取192个舌癌细胞，在96孔板中进行单细胞培养，经过长期传代培养，共建立12个舌癌Tca8113细胞亚系，比例为6.25%，而且都具备很强的成瘤性。进一步检测12个Tca8113细胞亚系的癌干细胞相关标志，结果发现：CD44与ESA均为高水平表达，阳性表达率多在90%左右，而CD184的阳性表达率则各有不同。据此结果可以结合癌干细胞的生物学特性对本实验获得的细胞系进行分析。

本研究发现：舌癌Tca8113M1细胞系中有6.25%的单个细胞可以进行自我分裂、增殖，形成细胞亚系。还有研究[3]发现：Tca8113细胞连续经过两次单细胞培养实验，其中具备分裂增殖活性的细胞比例为5.09%～10.85%。这提示即使在永生化细胞系中，具备持续增殖能力的细胞占整个群体的比例都较少。根据目前的文献[4]报道，在癌细胞群或组织中，癌干

细胞比例为0.01%～5%；体外培养的永生化癌干细胞系中，癌干细胞的比例可能偏高一些。本研究采用经典的有限稀释法获取单个细胞，这种细胞表现出强大的增殖与分裂活力，而且还形成了成瘤性很强的细胞亚系。这些单个培养的细胞是否就是癌干细胞尚需进行单细胞水平的鉴定，但可以大胆推测的是，其中应该包含有癌干细胞。肿瘤干细胞的概念于20世纪60年代提出，并据此建立了肿瘤细胞克隆实验。本研究在单个细胞培养中也发现，单细胞的增殖方式是克隆样增殖，即形成一个细胞克隆后扩大生长，并且在周围形成小的细胞克隆，最后融合成片，但究其细胞来源就是一个癌细胞而已，所有后续的细胞克隆与癌细胞就是源于它，所以可以认为该细胞具有癌干细胞的潜质，可以考虑从癌细胞系中筛选癌干细胞。

在12个Tca8113细胞亚系中，为明确其癌干细胞相关标志的表达情况，为后续舌癌干细胞的筛选提供前期实验数据，本研究综合文献报道，选取了CD44、ESA与CD184等癌干细胞相关标志进行检测。CD44是乳腺癌、头颈部肿瘤、结肠癌等上皮组织的癌干细胞的相关标志，CD184是胰腺癌干细胞的相关标志；ESA则是上皮来源的癌干细胞标志，而且属于细胞黏附分子[5-6]。在本研究建立的12个细胞亚系中，

CD44与ESA均处于高水平表达，而CD184的表达则高低不一，其中亚系间均数差值最大者接近60%。从这3个指标的表达情况来分析，可以进行如下推测：1）CD44与ESA是不同细胞亚系共有的标志，提示这些细胞亚系可能具有共同的组织起源；2）CD184的差异性表达提示Tca8113细胞系中存在细胞异质性，但从其比例来看，大致有3个等级，即15%、30%、50%以上，提示其生物学特性可能有明显的差别，但可作为舌癌干细胞研究的候选细胞群体进行研究。

此外，在单个细胞培养基础上建立细胞亚系的过程中，笔者发现单个细胞形成细胞克隆的形态与细胞最后成系关系密切。在单个细胞形成完全克隆、部分克隆以及旁克隆等3种克隆形式中，只有完全克隆能够形成细胞亚系，而且这些细胞亚系表现出肿瘤的异质性与成瘤性，而部分克隆以及旁克隆则在传代与扩增培养过程中逐渐老化或消亡。这一结果可进行逆向推理：将最初形成完全克隆的12个细胞确定为舌癌干细胞，而其形成的完全克隆则是癌干细胞自我更新与增殖的结果，其中可能富含癌干细胞。这一观点也为前列腺癌、小鼠肉瘤、胰腺癌以及神经胶质瘤等相关研究[7-12]所证实。这些研究发现完全克隆细胞可以高表达癌干细胞标志；接种1 000个完全克隆前列腺癌细胞就可形成移植瘤；通过悬浮球培养的癌细胞球在消化后进行单细胞培养，可以形成高比例的完全克隆。有学者[13]进一步在头颈肿瘤细胞系中发现，CD133与CD44阳性表达的癌细胞多形成完全克隆，而CD133与CD44阴性的癌细胞则多趋向于形成部分克隆或旁克隆，从而认为CD133与CD44是头颈肿瘤癌干细胞的标志。由此可见，完全克隆为癌干细胞的自我更新方式与富集、纯化癌

干细胞及癌干细胞标志的研究提供了新的途径，近年在癌干细胞研究中逐渐被应用和关注[11]。此外，针对完全克隆的研究切入时间与方式也需要注意。在本研究中，典型的完全克隆在单个细胞培养1～2周时形成，最好不要超过3周；扩增培养后，可使癌干细胞比例减少或分化细胞比例增加，从而影响对癌干细胞行为学的观察。

本研究属于寻找舌癌干细胞的前期性和阶段性实验，但是结果很有意义，这12个细胞亚系表明了Tca8113M1细胞系中有存在舌癌干细胞的可能性，而其最初的来源细胞系Tca8113也应存在癌干细胞。结合细胞克隆形态分析的单个癌细胞培养模式可为深入研究舌癌干细胞提供细胞研究平台。

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篇3

关键词：天然气；催化燃烧；细胞；培养

中图分类号：F407文献标识码： A

随着我国大气污染的日益严重，雾霾天气区域性频发，环境问题已变成当前棘手的问题[1]。天然气催化燃烧能从源头上防治污染和保护生态环境，有助于形成低投入“低消耗”低排放和高效率的节约型增长方式，有利于对消耗高“污染重”技术落后的工艺和产品实施淘汰，降低污染物排放总量，加强资源综合利用，加强污染防治[2]。

天然气属于清洁能源，天然气催化燃烧能达到CO和NOx均小于5ppm的近零污染物排放，是一种节能环保的燃烧方式。天然气燃烧温度在1000℃以上，燃烧后的烟气无菌洁净[3-4]，对环境无污染，可将烟气与空气和CO2按照一定比例配比，配比后的气体达到干细胞所需要的气体成分，[5-7]，由于高温烟气与空气和CO2混合的，所以混合后的气体洁净无菌[4]，可将其经过过滤和降温通入无菌箱或超净工作台使工作区域洁净无菌，也可将气体通入到CO2培养箱中，应用到干细胞培养。

1.天然气催化燃烧烟气分析

中国计量科学研究院对天然气催化燃烧烟气检测报告结果如表1所示：

表1 天然气催化燃烧各组分气体浓度

天然气催化燃烧，燃料燃烧充分，并且其燃烧温度在1100摄氏度左右，基本上全部转为CO2和H2O，CO 和 NOx均小于5ppm，基本为零，由于天然气中掺加极少量的H2S，燃烧产物为SO2和SO3，但其含量小于5ppm，几乎为零，所以天然气催化燃烧效率高，燃烧产物洁净无菌，可将其用到无菌箱中。

2.干细胞培养所需气体环境

除了满足营养的需要以外，培养环境还必须具备细胞生存并繁殖的生理学能接受限度内的物理化学特性，包括温度、气相及PH等。

2.1温度

体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长，其适宜的温度与取材的动物种类有关。

2.2气相及pH

体外培养细胞需要理想的气体环境。包括O2及CO2，但其量则须恰当。多数细胞需要在有O2条件下才能生长，氧张力通常维持在略低于大气状态，若O2分压超过大气中氧的含量可能对有些细胞有害。体外培养细胞采用开放培养时，其气体环境一般应为5%CO2＋95%空气的混合气体。大多数细胞适于在pH7.2~7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6可能对细胞有害，甚至退变或死亡。

3.3 无污染及无毒

体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境。无毒是培养细胞的必需条件 [5]。

3. 催化燃烧烟气在细胞培养上的应用

无菌箱或超净工作台是细胞培养中要使用的，催化燃烧烟气作为洁净无毒无污染的烟气可作为无菌气体持续不断地通入无菌箱，可使无菌箱持续保持无菌的状态[4]，燃烧的烟气与空气、CO2按照一定比例混合后经过过滤降温通入无菌箱可以持续的保持无菌箱的无菌状态，我们将在无菌箱中对细胞操作完之后，将处理后的细胞放入CO2培养箱，传统形式下需要一个5%的CO2瓶专门向CO2箱通入所需气体，现在我们只需要将通入无菌箱的气体通入CO2培养箱即可。

4. 实验装置

天然气催化燃烧V型炉烟气分析系统如图1所示，本次实验采用了两块独石并排的催化燃烧V型燃烧器，所用独石为堇青石蜂窝陶瓷，独石内表面上镀着钯（Pd）和铑（Rh）催化剂，独石采用正方形截面尺寸为150mm×150mm，厚度为20mm，独石孔道尺寸1mm×1mm，壁厚0.18mm，软化温度为1380℃。

图1. 天然气催化燃烧V型炉系统图

反应气体天然气和空气分别通过量程为0~50 L/min 型号为GMS005 0BSRN200000的流量计和量程为0~80m3/h 型号为CMG400A080100000的空气流量计进行调节，这两个有稳流稳压器提供电流。在催化燃烧器点火前需要对燃烧器内部的混合腔利用风机进行吹扫5 分钟左右，来保证内部无残留的燃气。点火过程中，先将过量空气系数调整到1.3左右进行气相燃烧从而达到预热的目的，期间观察催化剂独石表面待表面火焰基本消失且内部变为红色时，将空气量调大使过量空气系数达到2.0左右，此状态为催化燃烧的稳定燃烧状态。此时，通过烟气分析仪测量排放的烟气，NO-NO2-NOx分析仪测量烟气含量，待数据稳定后进行记录。在箱体出口处插入热电偶测量烟气温度。

5. 实验结果分析

5.1 实验结果

我们做了四组实验分别是燃气流量为6.1L/min 、7、8、9，相应的空气流量为7.3m3/h、7.8、9.2、10.3，对应的空气系数是2.09、1.94、2、2。图2为记录的烟气成分CO、CO2、NOx浓度以及烟气温度。

图2.不同燃气流量下烟气各成分浓度图 3.不同燃气流量下烟气温度

从图2可以看出，NOx体积分数都在1ppm以下，CO体积分数在5ppm以下，接近于0，污染物含量极低，燃烧效果较好，CO2含量在5.7%上下，略高于细胞培养要求的5%，若将其应用到细胞培养必须改变CO2含量。从图3可以看出，排烟温度在300℃以上，接近400℃，与细胞培养要求的37℃相差甚远，必须降温。因此需要考虑将烟气中通入某种气体或者某几种气体将CO2和O2含量调节到细胞培养要求的含量。下面具体分析烟气的主要成分。

5.2 天然气组分说明

表 3-2 为通过气相色谱仪所测得的实验过程中所使用的天然气组分及各组分的体积含量。

表1.天然气各组分体积分数

5.21由于天然气的主要成分是甲烷，所以天然气燃烧的化学反应方程式如下[8]：

实验用到的天然气中甲烷占燃料总体积的 93%以上，所以实验中是以甲烷的不完全燃烧情况进行了计算。所有含碳燃料在燃烧过程中都会产生CO这一中间产物。根据上述反应方程式可知，反应前后C原子个数是守恒的，反应后CO和CO2的总体积与反应前CH4的体积相等，即 。因为含量微乎其微，可以忽略不计，所以可以认为和燃烧前的含量相等，即；产生水蒸气的量为，需要氧气量，需要空气量

烟气总体积:

5.22 过量空气系数为时，过量空气相当于多出未参加燃料反应的那部分空气产生的和水蒸气的量不变，即，

过量空气相当于多出未参加燃料反应的那部分空气，烟气中氧气的体积:

烟气的总体积：

干烟气的总体积：

二氧化碳的体积分数:

氧气的体积分数:

干烟气中二氧化碳的体积分数:

氧气的体积分数:

催化燃烧空气的空气系数是2，当过量空气系数为2时，带入上式

二氧化碳体积分数（烟气中有水蒸气）:

氧气体积分数（烟气中有水蒸气）:

二氧化碳体积分数（烟气中没有水蒸气）:

氧气体积分数（烟气中没有水蒸气）:

5.23 烟气分析仪使用塑料管将气体通入分析仪分析烟气成分，在管道中烟气降温到室温，水蒸气冷凝，所以可以近似认为烟气分析仪分析的气体为干烟气，数据计算CO2含量5.5%与实验相当接近。

由于需要将烟气中通气体，虽然向湿烟气中通气体调节，但通入细胞培养仪器时的温度为37℃，中间水蒸气还会冷凝，所以调节气体的体积分数时仍然需要按照干烟气的计算调节。

对比烟气成分含量与要求的成分含量可以看出，需要降低CO2含量，提高氧气含量。因为氧气提高到略低于21%所以可以通入空气，即能提高O2含量又能降低CO2。假定烟气总体积为V，通入空气体积为Vx，则CO2体积为5.541，O2为11.082。

通过计算通入空气后CO2含量会低于要求的含量，因此还需通入CO2，通入CO2体积为VY

将，，，

解得，

当烟气的体积为V（不含水蒸气）时，通入的燃气量为0.0554V，空气量为1.0554V，所以只要通入体积，燃气量：空气量：CO2量=0.0554:155；0.0523=1:2797:0.944时，输出的烟气的成分即为，。

6. 结论

天然气属于清洁能源，天然气催化燃烧烟气洁净无菌，将燃烧废气收集重新利用通入CO2培养箱进行干细胞培养，此种方法使用即可以将烟气充分利用，减少CO2排放，并且操作简单，只需要向燃烧完的高温烟气中通入定量的空气和CO2即可，而且从通入气体的比例来看，生成需要的气体向烟气中通入的空气很多，通入的CO2确很少，比较经济，因此天然气催化燃烧烟气应用到细胞培养是种经济环保的方式。

致谢

本资金由北京市供热供燃气通风及空调工程重点实验室提供，项目编号cxy2012019。

参考文献

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篇4

关键词：高职教育;工学结合;细胞培养;课程开发

中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）05-0044-02

一、工学结合的定义

工学结合是一种学习和工作相结合的人才培养模式，是将理论与实践相结合，从而提高课堂教学效果的一种教学模式。2001年4月由东北大学主持召开的“美国合作教育大会”指出，工学结合是将理论知识和职业技能以及工作实践结合在一起，是使学生提高就业率的一种有效的教学方法。

二、工学结合培养模式的开发背景及现状

工学结合人才培养模式的主要功能是提高学生综合素质和就业竞争力。这种模式涉及面很广，牵涉到了社会、教育、产业等多个方面，从而需要获得社会、教育和政府等多个方面的配合和支持。在教育教学方面，工学结合的模式需要建立对应的教学制度和管理体制，多个部门相配合，同时还是要聘请一些大企业的优秀工程师做相应的讲解等活动，以增加学生的社会实践经。

在产业方面，学生去企业单位实践需要满足三个要求：一是雇佣实习生需要付出的费用较低。企事业单位的部分岗位技术要求和风险较低，用成熟的老手费用高，因此才会考虑刚毕业的技术不成型的学生;二是国家政策的需求。国家支持鼓励企事业单位吸纳实习学生，同时还推出税收优惠的政策，从而使更多的单位乐于接受实习生;三是着眼于长远之计，企事业单位由于每年的人流量很大，雇佣实习生也能够为企业储备后继力量。

从政府方面来说，很多发达国家都制定了相关政策。一是支持鼓励企业单位雇佣实习生;二是鼓励学校更多的运用工学结合教学模式。而我国由于开展工学结合模式较晚，所以各个方面的条件还不是很完善，尤其在产业和政策方面，国家处于发展的阶段，一些政策还不能满足用人单位的雇佣条件，不能够让单位和学生产生较高的积极性。在教育教学方面，政府没有鼓励学校实施工学结合人才培养模式的专项经费投入，造成因条件不健全学校实施工学结合人才培养模式困难重重：首先，多数学校都没有建立专业的管理部门，管理上比较薄弱。由于教学管理部门的功能设定和主要服务对象是校内，因此很难胜任大量的对外联系和过程管理。其次，在人员结构方面，由于没有专门的管理机构，缺乏真正意义上的“双师结构”队伍。高职院校大部分教师缺乏生产实践锻炼，受传统普通高等教育的影响，课程体系和教学内容设计过分强调理论的系统性。第三，在教学制度方面，我们尚没有成熟的“完全学分制”和“弹性学制”，学生的自主选择受到一定的限制。第四，在课程方面，我们还是从教学而不是从育人的角度看待课程。第五，在社会层面，国人也还停留在重知识、轻技能的传统思想里，希望孩子通过读书改变自身现状，家长更愿意看到孩子在校读书，而不是进入企业工作。

三、细胞培养课程的开发思路

由于政府、产业、教育和社会等各方支持系统要素的短缺，现有国情限制了学生大规模、有序地进入企业工作、学习，我国高等职业院校的教育与企业生产实际需求脱节，已经造成了目前劳动力市场上高等职业教育培养的毕业生与企业需求供求失衡的现象，只能摸索适合中国国情的工学结合人才培养模式。这种情况下，教师可以通过社会调研，掌握相关企业及研发机构的职业领域、岗位知识、岗位技能及职业素养等。

《细胞培养》是生物制药技术专业的重要课程，课程目标是培养能够从事细胞分离制备、纯化及检验的专业人员。通过企业调研，将岗位工作任务进行能力分析，设置学习项目，通过一个个子任务来强化学生技能，循序渐进安排教学过程。引导学生熟悉细胞培养所需要的无菌空间、常见设备及操作规范、细胞分离、纯化、检验及冻存方法，提升学生职业操作能力，提高职业素养，实现实践教学与企业岗位需求的对接。

四、细胞培养课程内容的开发及设计

《细胞培养》是在充分进行岗位调研的基础上设立的。课程内容是以符合实际岗位能力需要的工作任务为载体，以工作过程为导向，结合学生的认知规律和实际教学需求进行设计，包含无菌操作空间设计和仪器设备操作维护、实验前准备、动物细胞的制备、细胞的分离纯化、鉴定和保藏等，共9个项目、24工作任务及相关职业能力培养，突出实践课程的重要性，注重学生技能操作和职业素质培养，基本涵盖生物制药企业和科研院所细胞培养岗位所必须具有的制备、培养、分析鉴定所需的全部方法和技术。

五、有效课程评价体系的开发与设计

为了检验学生是否具备从业岗位所需的综合职业能力和素质，保证课程内容能够有效实施，我们建立了《细胞培养》课程评价体系，采用项目过程考评（任务考评）的方法，课程总成绩=项目过程考评成绩（70%）+理论应知考试成绩（30%），项目课程考评成绩=素质考评成绩（25%）+实操考核成绩（75%）。具体分类见表2。

六、教学实施中的有关问题分析

工学结合开发《细胞培养》课程是针对高职院校设计的，考虑到高职学生的特点，在教学实施中有以下几个问题需要注意：

1.为了不污染无菌环境，无菌空间应该避免一次性进入过多学生。学教师带领分组学生在无菌间实操时，无菌间外学生的安全卫生及纪律问题需要设计周全。

2.受学时限制，任务以团队形式完成，少数学生会完全依赖团队“主力”，参与程度不够。项目实施过程过中必须细化任务，确保每个学生都参与了项目的实施。

3.本课程是理论教学和学生实践交叉进行，理论是根据实践任务所需的知识构建，不同任务之间构建的学习领域以细胞制备工作流程排序。

参考文献：

[1]陈解放.基于中国国情的工学结合人才培养模式实施路径选择[J].中国高教研究，2007，（7）.

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【关键词】羊水细胞培养；染色体制备；方法

文章编号：1009-5519（2008）15-2221-02 中图分类号：R71 文献标识码：A

羊水细胞培养及其染色体制备技术是胎儿染色体病产前诊断的重要手段。由于羊水细胞培养技术要求高、羊水中活细胞少、培养周期长、易污染、分裂相少；细胞收获、低渗、固定、显带、染色诸多环节，相对于外周血染色体的制备，羊水细胞染色体制备的难度较大，任一环节不合适都可能导致失败。针对上述情况，借鉴国内外的一些经验[1~5]，我们摸索出了一种简便、易行，提高羊水细胞培养及染色体制备成功率的方法，收到良好效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料：（1）标本来源：选择来我院遗传门诊咨询的15~29孕周，年龄25~45岁疑有染色体病胎儿的孕妇50例，其中产前筛查后，风险率大于1/270的40例，年龄大于35岁的孕妇10例。（2）培养器皿：CO2培养箱，纯度99.99%的CO2，25 ml培养瓶（CORNING，型号：3289），离心机，倒置显微镜等。（3）试剂：羊水培养基购自浙江贝因美公司。20 ?滋g/ml的秋水仙素，1%的柠檬酸三钠，0.075 mmol/L的KCl，0.25%的胰蛋白酶，固定液由甲醇与冰醋酸按3∶1比例配成。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：嘱孕妇平卧在手术床上，让其左右翻身10次左右，以使羊膜腔内脱落的细胞悬浮，在B超引导下，用7号穿刺针经腹抽取羊水，先用5 ml注射器抽出2 ml羊水丢弃，再换用20 ml注射器抽取羊水20 ml，并迅速送到无菌间。

1.2.2 羊水细胞培养：（1）细胞收集：在生物安全柜内，将羊水注入2只15 ml无菌离心管中，每只10 ml，1 000转/分，10分钟，弃上清，留0.5 ml，用无菌吸管轻轻吹打混匀。（2）接种：将混匀的羊水细胞接种于2个25 cm2细胞培养瓶中，每瓶加入5 ml羊水培养液，轻轻混匀。（3）培养：酒精灯过火瓶口，拧紧瓶盖卧式静置于CO2培养箱中，温度37 ℃，CO2浓度5%，培养6~7天后观察细胞贴壁及生长情况。（4）细胞培养情况观察：细胞培养6~7天后方可在倒置显微镜下观察。此时，可见瓶底贴壁细胞已形成6~10个克隆，可换液。无菌操作将瓶内液体收集于1个15 ml无菌离心管，重新加入4 ml羊水培养液，继续培养1~2天，镜下可见较多大而亮圆的分裂期细胞，可终止培养进行收获。换液时换下的培养液可重新离心后将细胞接种于一个25 cm2的培养瓶内继续培养，在培养6~8天后仍会有新的细胞贴壁，并形成克隆，能有效防止第一次羊水细胞收集及染色体制备失败。（5）终止培养：每瓶加秋水仙素（20 ?滋g/ml）40 ?滋l，旋紧瓶盖37 ℃继续培养1小时。

1.2.3 羊水细胞收获：将羊水细胞培养液倒入一个干净离心管中，用吸管吸干净，快速将37 ℃温浴（30分钟以上）的0.25%的胰蛋白酶和1%的柠檬酸三钠1∶9混合液1 ml加入培养瓶中，轻摇培养瓶，使消化液与培养瓶底面充分接触，立即放回37 ℃培养箱中温浴0.5~1分钟，取出培养瓶，将上述离心管中的培养液倒入培养瓶中，轻摇培养瓶，终止胰蛋白酶的消化作用，用细胞刮片轻轻刮下细胞。用吸管将培养瓶中的细胞转移到离心管中，1 000转/分，离心10分钟，弃上清，保留细胞沉淀。

1.2.4 低渗：加入37 ℃预温30分钟以上的0.075M KCl低渗液7 ml，用吸管轻轻吹匀细胞，使细胞悬浮于低渗液中，放回37 ℃温浴箱中，静止30分钟。

1.2.5 预固定：沿管壁缓慢加新鲜固定液（冰醋酸∶甲醇=3∶1）1.5 ml，用气泡轻轻吹打溶液使其混匀；1 000转/分，10分钟。然后吸弃上清液，保留沉淀。

1.2.6 固定：沿离心管壁加入新鲜固定液5.5 ml，用气泡吹匀，继续固定30分钟。1 000转/分，离心10分钟。弃上清液，保留沉淀。

1.2.7 再固定：再加入新鲜固定液5.5 ml，用气泡吹匀，静止30分钟。1 000转/分，10分钟。弃上清，保留沉淀。

1.2.8 3次固定：加入新鲜固定液0.5 ml制成细胞悬液。

1.2.9 滴片、烤片和显带：用滴管吸细胞悬液2~3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，并在酒精灯的火焰下过火几次，置75~80 ℃烤箱中烤片2小时。用预温15分钟的0.01%的胰蛋白酶消化25~30秒，Giemsa染色液染色10分钟。

2 结果

2.1 羊水细胞生长情况：实验结果显示，50例孕妇羊水细胞培养均获得成功，成功率100%，其中2例血性羊水细胞培养也获得成功。

2.2 羊水细胞收集及染色体制备：实验结果显示，50例孕妇羊水细胞培养通过细胞收集及染色体制备，有49例获得满意的染色体分裂相，成功率98%，见图1和图2。

3 讨论

羊膜腔穿刺技术具有一定的创伤性，一旦失败孕妇难以接受再次穿刺。在实际工作中，影响羊水细胞培养及染色体制备成功率的因素很多[6，7]。实验结果显示，虽然50例羊水细胞培养均获得成功，但在细胞收获、制片、消化、显带等环节上有1例出现问题，导致结果分析失败。说明羊水细胞培养在加秋水仙素的时机、细胞收获、低渗、固定、显带、染色等环节，也非常重要。在实验中对以下环节进行了改进和优化，取得了满意效果。

3.1 羊水细胞培养的环境

3.1.1 细胞培养瓶：使用CORNING 3289型细胞培养瓶，细胞易于贴壁，快速生长。

3.1.2 在实验中，使用纯度为99.999%的高纯CO2，细胞生长旺盛、舒展，在培养至第七天时，形成多个克隆。我们认为高纯度的CO2有利于羊水细胞的生长。

3.1.3 收获时机的掌握非常关键：我们在换液后第二天，低倍镜下见到5~10个细胞克隆，克隆中央基本无细胞老化，且细胞大而亮圆，有比较多的双核细胞，即进行收获。我们发现培养时间越长，细胞越易老化，不宜收到较多的分裂中期的细胞。并不是细胞生长的时间越长、细胞越多获得的中期细胞就越多。如果发现细胞老化的太多，可进行传代培养。

3.1.4 秋水仙素的浓度：加秋水仙素的终浓度为0.20 ?滋g/ml，置37 ℃继续培养1小时，获得的染色体长短适中，易于分析。

3.1.5 收获时消化液的选择：采用1%的柠檬酸三钠于0.25%的胰蛋白酶1∶9混合。消化时间短，仅需1~2分钟即可。柠檬酸三钠能使细胞连接松散，易于吹打成单个细胞，易于进行低渗。

3.1.6 滴片：用滴管吸细胞悬液2滴，滴在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，使细胞平铺于载玻片上，并在酒精灯的火焰下通过几次。载玻片过火可使染色体散开，便于找到好的染色体分裂相。

参考文献：

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[6] 许争峰，胡娅莉，朱瑞芳.高效羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用[J].中华妇产科杂志，2006，41(4)：275.

篇6

支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物，约有30.3％～50.5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括：所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达107个/ml，而培养的细胞看起来很正常，在肉眼观察或普通光学显微镜下观察，受污染的细胞可无明显变化。由于竞争营养及支原体有毒的代谢产物，支原体污染可显著影响培养细胞的生理活性，使研究结果的真实性和可靠性大大下降。本实验拟使用4种方案处理体外培养的支原体污染贴壁细胞，并就其疗效进行比较，现报道如下。

1 材料

1．1 试剂及动物：(高糖)DMEM培养基：Giboco；胰蛋白酶：Gi-boco；DNA荧光法染色检测支原体试剂盒：Epitomics；BM-Cy-din：Roche；Bab/c裸鼠：北京动物所。

1．2 细胞的来源和培养：人乳腺癌MCF-7细胞株，购自四川大学华西医学中心分子遗传学研究室。体外于不加抗生素的内含10％小牛血清的DMEM培养基，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。

2 方法

实验分为试验组、阳性对照组和阴性对照组。试验组为支原体污染且用不同方法作用的细胞，阳性对照组为支原体污染常规培养未作特殊处理的细胞，阴性对照组为常规培养支原体未污染的正常细胞。

2．1 支原体污染检测：被检细胞接种在无菌的6孔细胞培养板中，接种密度为2×10O4/ml。5天后，先吸去培养液，再加入1ml的固定液，静置20min，吸去固定液，风干10min。于每孔中，加入lml的Hoechst33258工作液，37℃，20min。吸去Hoechst 33258工作液，风干后加入1滴封固液，并以盖玻片覆盖。用400x荧光显微镜观察细胞。

2．2 支原体污染清除：试验组细胞按5×104/ml密度接种于25ml培养瓶内。利用各种方法作用后，检测支原体污染情况。阴性对照组及阳性对照组用不加抗生素的含10％小牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2恒温培养箱中培养。

2．2．1 加温法：试验组细胞放入41℃温箱内，分别在8h、12h、16h、24h及48h末进行支原体的检测。

2．2．2 多西环素、环丙沙星联合排除法：多西环素和环丙沙星联合用药，试验组分为3组，两种药物用量分别为30μg/ml，50μg/ml和100μg/ml，培养24h、36h、48h末进行支原体的检测。

2．2．3 BM-Cyclin-1、2排除法：细胞传代同时加BM-Cychn-l10μg/ml，37℃培养3天；胰蛋白酶消化、传代，加入BM-Cyclin-25μg/ml，37℃培养3天；继续传代追加BM-Cychn-2 5μg/ml次，培养2～4天弃药液，D-Hank's液洗2次，胰蛋白酶消化传代，进行常规培养。

2．2．4 裸鼠过继法去除支原体闯：将支原体污染的细胞用0，25％胰酶，0.02％EDTA消化制成单细胞悬液后用PBS洗涤离心2次，调细胞密度至107个/ml；经小鼠背部皮下接种0.2ml细胞约10～15天后即可形成移植瘤；3～4周后无菌条件下取出移植瘤组织，剔除坏死部分，用注射器针芯在200目筛下将组织压碎使细胞释放人含0.1％EDTA的无血清DMEM培养液中：将细胞悬液小心加入含有淋巴细胞分离液离心管上层，室温下水平离心3000r/min，20min；用吸管吸出两种液体界面层的细胞置无血清DMEM培养液中，计数细胞；于无血清DMEM将细胞洗涤离心1次，用完全培养液调细胞密度至5×105个/ml，置37℃，5％CO2培养箱中培养。

3 结果

3．1 阴性对照组和阳性对照组：阴性对照组细胞经Hoechst33258荧光染色后，仅细胞核显色，细胞表面及细胞周围干净、清晰，无荧光小点。阳性对照组经Hoechst33258荧光染色后，可见细胞核与细胞膜及其周围均可见散在的蓝色荧光颗粒，其密集程度与污染呈正相关。

3．2 加温对支原体污染的治疗效果：经观察发现，加温8h后，荧光小点开始变少。16h细胞周围支原体几乎消失。进入24h开始细胞周围的荧光小点完全消失，但细胞开始逐渐变圆。脱落飞48h大部分细胞已完全变圆，细胞正常形态消失，培养基中出现飘浮死亡细胞。

3．3 多西环素、环丙沙星联合治疗支原体的效果：30μg/ml组和50μg/ml组多西环素和环丙沙星作用细胞24h开始，荧光开始减少，36h仅见少量荧光，48h荧光完全消失。细胞未见明显变形脱落、死亡。100μg/ml组的多西环素和环丙沙星联合作用24h荧光完全消失，至36h细胞无明显变形死亡，但48h开始出现细胞变圆，脱落，生长变慢。

3．4 BM-Cyclin-1、2排除法：按以上方法处理后，经Hoechst33258荧光染色后，细胞表面及细胞周围干净清晰，无荧光小点。细胞无明显脱落、变形死亡。

3．5 裸鼠过继法处理细胞后常规培养，经Hoechst33258荧光染色后，未见支原体感染。细胞分裂生长旺盛。

4 讨论

支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，大小一般在0.3～0.5μm之间，呈高度多形性，有球形、杆形、丝状、分枝状等多种形态。支原体约有1％可通过滤菌器，用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性，因此在普通光学显微镜下不易被发现。在电子显微镜下可见支原体多吸附或散在于细胞之间，断面与细胞徽绒毛相似。支原体感染发生后能改变细胞的DNA、RNA及蛋白表达，对细胞的生理活动产生多方面的影响。由于支原体无细胞壁，所以通常作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐药。本试验用4种方法对支原体污染的体外培养贴壁细胞MCF-7进行救治，现就其疗效进行比较。见表1。

篇7

抚顺市疾病预防控制中心，辽宁抚顺113006

[摘要] 目的 比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法 采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法，同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。 结果 细胞培养病毒分离的阳性数为26份，实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份，χ2=8.1， P<0.005。 结论 通过该实验，验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感，适用于实验室快速诊断。

关键词 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应；细胞培养法；流感病毒

[中图分类号] R4[文献标识码] A[文章编号] 1674-0742（2015）03（b）－0192-02

[作者简介] 姜红涛（1965-），女，天津人，本科，主管检验师，主要从事病毒检验工作。

2013年出现的流感病毒H7N9经自然重配，致病迅速，易变异，给人们带来极度恐慌，引起WHO 的高度重视[1]，从而使流感病毒病原学的准确快速诊断显得尤为重要。该实验室在2014年1月采用整群抽样法对抚顺市流感监测哨点医院的80份疑似流感样标本进行了实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法与细胞培养法进行了检测流行性感冒病毒的方法比较，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

2014年1月在抚顺市国家级流感监测哨点医院，每周采集内科和儿科门诊就诊的流感样病例（体温≥38℃，同时伴有咳嗽或者咽喉疼痛等症状的急性呼吸道感染者）的咽拭子标本，放人pH 7．4-7．6的DMEM采样液中，当日低温送流感实验室检测，每周采集 20份流感样病例的咽拭子标本。

1.2主要试剂

①抗A（H1N1）亚型血清，抗A（H3N2）亚型血清，抗A（H3N2）亚型血清，抗A（SWL1）亚型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由国家流感中心提供。MDCK细胞，辽宁省疾控中心提供；胰酶、Hank’液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白组分V， 采购于BI公司。DMEM培养基，采购于GIBCO公司。

②提取RNA试剂盒为QIAGEN。

1.3主要仪器

AB PCR仪；二氧化碳培养箱 ；倒置显微镜等。

1.4实验方法

1.4.1采用细胞培养法分离流感病毒，细胞为狗肾传代细胞（MDCK）每份标本接种细胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hank’s液洗2遍，加入病毒维持液，置34.5 ℃培养，每天观察病理变化（CPU），当CPU出现3～4个加号时，按常规法检查维持液中的红细胞凝集活性。将HA≥1：16的标本采用血凝抑制方法（HI）进行流感病毒型别鉴定[2]。确定病毒的型别和亚型。并送国家流感中心做进一步鉴定。HA≤1：16的标本未做分型鉴定。

1.4.2RT-PCR反应体系的配置[3-4]反应条件：60℃ 5min 50℃ 30min 95℃ 15min95℃ 15s，55℃退火30 s（收集荧光），72℃延伸 30s 45 cycle 72℃ 5min4℃ 保存。见表1。

1.5统计方法

配对设计的χ2检验，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差异有统计学意义。

2结果

2.1两种方法对80份咽拭液检测流行性感冒病毒的结果

细胞培养分离病毒26株，阳性百分率32.50%，RT-PCR检出36株，阳性百分率45.00%，见表2。

2.2两种检验方法统计结果比较

细胞培养分离病毒36株，阳性26株，RT-PCR检出36株，两种检验方法统计结果为χ2=8.1，因为χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，两种检验方法敏感性差异有统计学意义。见表3。

2.3两种方法对80份咽拭液检测流行性感冒病毒的分型结果

细胞培养分离病毒H1N1（22份），H3N2（4份），荧光定量RT-PCR分离病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3讨论

流感病毒病原学相关检测目前常用的有病毒分离培养法、快速检测、分子生物学方法等。病毒分离是诊断流感病毒的金标准[5]，但耗时长是其缺点。而且宿主细胞生长状态也是影响病毒生长及复制的关键因素[6]，导致疑似流感样标本到实验室后，培养完成时间不确定。同时培养液中营养物质的持续消耗以及宿主细胞的逐渐死亡是导致病毒滴度降低的直接原因[7]，收获的病毒滴度高低存在着很多的不确定因素。而且，标本采集后的保存运送等环节都对MDCK培养分离流感病毒存在较大的影响。而实时荧光定量RT-PCR法应用于流感病毒实验室诊断，国内外早已有许多报导[8]，它具有灵敏度高、特异性好、检测所需时间短等等优点，尤其在应急疫情快速诊断中得到了广泛的应用。它与经典的MDCK细胞分离法相比，检测时间可缩短到1 d之内。由于在封闭管中进行，省略了电泳这一步骤，减少了以往PCR技术导致的假阳性可能[8]。

该实验室对2014年1月流感监测点送检的80份标本，采用细胞培养、实时荧光定量RT-PCR 两种方法检测，同时进行比较， 结果证实，实时荧光定量RT-PCR法对流行性感冒病毒的检出率为45.00%，高于细胞培养法的病毒检出率32.50%。实时荧光定量RT-PCR法和细胞培养法两种检验方法χ2检验结果为χ2=8.1，P<0.005。对流感病毒的检出敏感性差异显著，对流感病毒的分型也是准确无误，在病毒含量较低的标本中不存在漏检情况发生。通过这两种方法的比较，与浙江省疾病预防控制中心通过比较得出的，实时荧光定量RT-PCR法对大量疑似标本进行实验室快速鉴别诊断，实用性强，快速敏感[9]的结论一致。验证了实时荧光定量RT-PCR法确实是实验室快速诊断流行性感冒病毒的首选方法，用实时荧光定量RT-PCR法检测为流感病毒阳性的标本接种MDCK细胞，培养分离流感病毒，可以降低细胞培养法分离流感病毒的成本，减少不必要的试剂材料的消耗，提高检测效率。这仅仅是本实验室的验证结论，还需要其它研究中心加以验证。

参考文献

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篇8

【关键词】 灌注培养；微载体；细胞截留

随着单克隆抗体药物产业的发展，带动了大规模动物细胞培养技术的不断提高。利用动物细胞生产单克隆抗体已成为当前生物制药企业的发展方向。在上世纪六十年代，灌注培养技术的出现为动物细胞大规模培养开辟了广阔的前景。在随后的研究中，灌注培养技术得到了迅速发展，已成为动物细胞大规模培养的重要方法。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，并带走代谢副产物，而细胞保留在反应器系统中，由于细胞生长环境优良，可以达到很高的细胞密度，并延长表达时间、增大收获体积，同其它方法相比，灌注培养的产率可以提高很多。

1 悬浮灌注培养

1.1 微载体悬浮灌注培养

微载体培养最先是由A1 L1 Van Wezel提出，其方法是在细胞培养时，将细胞悬液与经过特殊处理的微载体混合培养，待细胞贴附于微载体上后移至培养液中培养，借助搅拌系统使细胞随载体均匀悬浮于培养液中。近年来随着对微载体材料的深入探索，相继开发出液体微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA 微载体、藻酸盐凝胶微载体等，并有很多微载体已进行商业化生产，如明胶微载体Gelibead 、Cultispher 、Cytodex3和Microsphere以及大孔的Cellsnow和Cytopore等。

1.2 悬浮细胞截流灌注培养

随着无血清悬浮培养技术的日趋成熟，现有细胞密度及表达量已不能满足需求，人们重新将目光转移到灌注培养上，但是如何不用微载体而将细胞截流在反应器中并结合无血清悬浮培养工艺进行产物的表达成为热门。该工艺的重点在细胞截流上，如何高效的截流细胞而不对细胞产生损害及降低堵塞成为焦点。

1.2.1 中空纤维柱细胞截流装置

中空纤维柱是由若干根孔径在10kd-0.45um的圆筒形膜束捆绑在一起构成的，含细胞液由圆筒中间快速通过形成切向流，因膜的孔径小于细胞直径，因此细胞被截流在膜内侧，而培养液透过膜渗出到膜外侧而达到截流细胞的目的。当前该种灌注培养装置最具代表的就是ATF System(Refine TECHNOLOGY ），其特有技术可有效防止柱体的堵塞，达到长时间截流细胞的目的。据报道，应用该系统进行悬浮细胞培养密度可达4-15×107个/ml，蛋白产量可达1g/L/day甚至更高。

图1 ATF系统运行示意图

1.2.2 沉降法细胞截流

在众多的细胞截留装置中，倾斜式重力沉降器由于设备简单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和CHO 细胞连续灌注培养，在采用上流式沉降操作的连续灌注培养生物反应器系统中实现了高密度培养。但该系统在进行细胞培养时还存在诸如细胞损失、灌注流速过慢等问题而限制了系统的放大，无法应用于商业化生产。

1.2.3 声学细胞截流装置

这是一种基于声频引起细胞聚集的新型细胞截留装置，BioSep声学细胞截流设备（Applikon ）的原理完全是基于温和的声频引起松的细胞积聚，然后再沉淀。与其他的细胞分离技术相比，BioSep内的声频能量网构成一个“虚拟网”，因而是更好的，无接触、不移动的过滤模式。该技术可以进行长达数千小时的连续培养，因而大大提高细胞密度、生产率并获得高的产品质量。

1.2.4 离心细胞分离

该方法较为简单，即在无菌条件下利用重力离心分离细胞与培养液，但该方法使细胞受到的剪切力较大，对细胞损伤较大，另外，对操作环境要求较高及离心机体积上的限制而无法应用于大规模生产，仅在研究中应用。

2 床层灌注培养

2.1 流化床培养

利用一些诸如磁、电场等技术手段将微载体局限于一定区域内，细胞生长于多孔微载体内部，培养基在流通过程中不会损失细胞，该培养方式适用于贴壁依赖型细胞，具有培养基交换快，细胞养分充足的特点。

2.2 固定床培养

是将微载体固定于无菌容器内，细胞贴附生长在载体上或载体内部，进行培养液更换时，微载体并不移动，可很大程度上降低血清的用量。

2.2.1 中空纤维灌注培养

由于中空纤维培养系统具有类似于生理状态的纤维毛细管模式和灌注式培养基循坏系统, 既有利于高密度细胞在纤维管壁和周围的停留、生长和增殖, 也便于营养物质的供应和代谢产物的转移, 近年来, 已被越来越多地用于杂交瘤细胞的体外培养。

2.2.2 堆积床培养

该方式是将反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。

篇9

[关键词] 雪旺氏细胞；培养；人

[中图分类号] R421 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0025-02

雪旺氏细胞（SCs）是周围神经系统中一种功能特殊的胶质细胞，是周围神经中神经鞘的主要组成部分。近年来发现，SCs不仅能维持周围神经正常的电生理传导功能，还在神经损伤后修复再生过程中起重要的作用[1]。研究表明[2]，SCs在周围神经损伤后的修复过程中，主要是通过分泌多种神经生长因子，维持神经元的存活；另一方面，SCs还通过产生细胞外基质、细胞黏附分子等，在神经轴突的再生过程中起支持和引导的作用。利用SCs的这种特性，将SCs作为一种支持细胞移植到中枢神经系统上，在神经系统损伤修复中发挥巨大的作用[3]。作为细胞移植前的基础工作，本实验探讨从人胚胎脊髓背根中分离、培养并纯化人SCs。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DMEM细胞培养基（Gibco公司），胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）；0.125%胰蛋白酶-EDTA（Gibco公司）；胶原酶（Sigma公司）；Forskolin、牛脑垂体提取液（BT1，Sigma公司），阿糖胞苷（Sigma公司），D-Hanks平衡液，CO2培养箱（NAPCO公司），倒置相差显微镜（Olympus公司），35 mm一次性培养皿，多聚赖氨酸，兔抗人S-100（Neomarkers公司）；即用型SABC免疫组化试剂盒和褐色DAB显色试剂盒，均购自博士德公司；引产的28周死亡胎儿（汕头大学医学院第一附属医院妇产科提供）。

1.2 雪旺氏细胞的分离和培养

从引产的28周胎儿中分离背根神经，将背根神经在D-Hanks平衡液中切成小块，在37℃下加入胶原酶进行消化约1 h，后加入等量含10%胎牛血清、青酶素和链酶素的DMEM溶液中止消化。800 r/min离心5 min，移除上清，加入2 mL的DMEM，用火焰抛光的吸管进行吹打，将吹打后的细胞悬液用微孔大小约10 μm的滤网进行过滤，制成单细胞悬液。将单细胞悬液移入用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，置摇床上每隔10 min 摇10 s，总共摇30 s，将雪旺氏细胞与混杂在其中的成纤维母细胞进行分离。将上层的细胞悬液移入另外一个培养瓶中进行培养，原培养瓶中底部沉淀的成纤维母细胞和少量的雪旺细胞加入10 mL的DMEM进行培养，约4 h后，原培养瓶再进行震摇，将悬浮细胞移入另一培养瓶中进行培养，原培养瓶中余下的细胞大部份为成纤维母细胞。将上述方法取材、消化、纯化后的细胞悬液种植于含20%FBS的DMEM培养液中，于5%CO2，37℃条件下培养24 h后，更换成含阿糖胞苷（终浓度为5 μg/mL）和20% FBS的DMEM培养液，48 h左右更换成含有Forskolin及BT1生长促进剂的培养液，每周2～3次。待细胞长满皿底后以0.125%的胰蛋白酶-EDTA液消化1～2 min，同时镜下观察，当细胞开始皱缩后加入含血清培养液中止消化，离心（1 500 r/min，5 min），加入适量培养液，用抛光的吸管吹打，稀释后接种在预先涂布有多聚赖氨酸的35 mm培养皿中。静置5～15 min，吸出上清液，离心（1 500 r/min，5 min），加适量培养液， 用抛光的吸管吹打，均匀后重新接种于另一只预先涂布多聚赖氨酸的35 mm培养皿中，于5% CO2，37℃条件下培养。

1.3 S-100免疫组化法鉴定SCs及纯度

反复传代后，待P4代SCs长满底部后，以3%甲醛固定10 min，PBS冲洗3次。加入一抗兔抗人S-100多克隆抗体（1∶100），4℃过夜；0.1 mol/L PBS冲洗3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗2 min×3次；滴加试剂SABC，20～37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS漂洗5 min×4次；DAB（用蒸馏水1 mL加试剂盒中A，B，C试剂各1滴），室温下显色5～30 min。显微镜下观察，S-100阳性细胞为SCs。细胞纯度采用抽样法进行统计。该方法大略如下：用一带网格的盖玻片在显微镜下对S100抗原阳性细胞（雪旺氏细胞）和S-100抗原阴性细胞（非雪旺氏细胞）进行细胞计数。第一个计数区域选择在盖玻片中央部位，计数后水平或垂直移动盖玻片2 mm，再进行计数，依同样的方法共计数9个区域，最后再进行统计。

2 结果

细胞悬液种植2～4 h后，倒置显微镜下观察，刚贴壁的SCs呈小而圆，折光性好，少数呈双极或三极的梭形；成纤维细胞胞体较大，形状不规则，较SCs贴壁更早，黏附更牢。24 h后大部分细胞完全贴壁，大多数细胞呈两端突起的梭形，少量呈多角形，相邻细胞之间以突起相连（图1）；在这些梭形细胞中间，夹杂一些散在分布，形状不规则，细胞个体较大的细胞，这些细胞是纤维母细胞。加用阿糖胞苷后，有少量的细胞胞体变黑浮起，细胞增殖明显受抑制，成纤维母细胞受抑制更明显。细胞生长融合延缓，第6～9天细胞才长满皿底部。经传代后SCs纯度明显提高。

免疫组织化学检测，SCs被染成黄褐色（图2），而成纤维母细胞不着色。示SCs呈S-100抗原阳性。细胞纯度统计示SCs纯度达99%。

3 讨论

有研究表明[4]，SCs能分泌20多种蛋白质，这些蛋白质的分子量分布在15～250 kD之间，这其中就包括多种神经营养因子（NTFs），这些神经营养因子中，NGF、CNTF、BDNF和FGF研究较多。有研究表明，单一的神经营养因子既能维持某些神经元的生存，又能促进其突起生长，而多种神经营养因子在一起可能有协同的生理效应，即他们可能作用于相同的受体，起协同作用。将SCs移植到中枢神经系统中，SCs能长期存活并分泌神经生长因子和细胞外基质，这将在中枢神经系统损伤中起到很重要的作用[5-6]。近年来，SCs细胞中枢神经系统移植作为支持细胞与神经干细胞移植治疗中枢神经系统损伤的研究很多，部分研究已经应用于临床[7-8]。因此，探索人SCs的分离、培养和纯化方法对人类有着迫切的需要。

目前SCs细胞的分离培养方法已经较为成熟，难点在于与成纤维母细胞的分离[9]。由于两种细胞的贴壁特性的不同，成纤维母细胞的贴壁时间更早，贴壁更牢固，因此，可以利用两种细胞的这种特性对其进行分离。本实验在原代培养阶段，将经过酶消化后的混悬液置于用多聚赖氨酸包被的培养瓶中，在摇床上进行振摇，SCs在这种条件下贴壁很少，而成纤维母细胞由于较易贴壁，大部份附着于瓶底，通过提取上清液，达到SCs与成纤维母细胞的分离。在分瓶传代过程中，利用成纤维母细胞贴壁较牢固的特性，通过调节适当的消化酶的浓度，使大部份SCs悬浮，而成纤维母细胞仍然处于贴壁状态，通过提取上清液的方法，既而与底部成纤维母细胞分离。通过不断的传代培养，使SCs不断纯化。由于阿糖胞苷对两种细胞的生长抑制程度不同，在培养液中加入阿糖胞苷，抑制成纤维母细胞的生长，使SCs的增殖速对相对于成纤维母细胞快，从而达到减少成纤维母细胞，提高SCs纯度的目的。本实验综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法分离、培养和纯化人SCs，经鉴定，这些细胞呈S-100抗原阳性，纯度达99%。本实验为将来临床利用SCs移植治疗中枢神经系统损伤奠定基础。

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篇10

【关键词】软骨细胞 提取 培养

软骨细胞作为软骨组织在软骨基质中唯一存在的特定的细胞种类，在软骨组织再生与代谢方面起到了重要作用。但因软骨组织中缺少血管和神经系统，其自身修复方面存在一定的局限性。近些年，生物组织工程学将工程学和生命科学的方法原理相互结合构建人体组织或器官的功能替代物。在软骨组织工程中，体外构建的自体软骨细胞组织复合物可移植到机体受损关节修复其结构并恢复原有功能。自体软骨组织移植技术已引起人们越来越多的重视，但由于机体软骨组织中的软骨细胞相对较少，无法满足机体受损关节修复和愈合所需的软骨细胞数量；并且软骨细胞在体外扩增的过程中，会发生“去分化”现象。发生了去分化现象的软骨细胞则不宜再用于软骨组织工程。因此，本实验通过结合国内外文献，试图探讨通过简易的方法来获取大量活性化、增殖能力强的软骨细胞。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试剂

2月龄新西兰大白兔1只（由苏州大学动物实验中学提供），体重1.5kg。II型胶原酶（collagenase type II）、HEPES液、脯氨酸、抗坏血酸及非必须氨基酸均由Sigma公司提供；高糖DMEM、PBS从Hyclone购买；胎牛血清、青链霉素由Gibco公司提供；cck8试剂购自国产碧云天。

1.2 软骨细胞的分离和培养

耳缘静脉空气栓塞法处死新西兰兔，75%酒精消毒双侧膝关节。将关节以及周围肌肉组织完全离断，75%医用酒精浸泡消毒后，放入含有双抗的PBS液中。在超净台上分离关节，剔除周围的软组织。仔细清除软骨表面的滑膜，用刀片削下透明软骨，放入含2ml PBS的5ml EP管中，并用PBS清洗3次。去掉PBS后，加入4ml 0.2%II型胶原酶，并移入15ml离心管中，放入37℃恒温摇床振荡消化。消化过程中，观察到约3h，软骨组织已全部变为絮状。将细胞悬浊液经过200目滤网过滤，收集到的软骨细胞分别按2000个/孔接种于96孔板、5000个/cm2接种于25cm2培养瓶。在37℃、5%CO2培养箱中培养。每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况，并每3天换液一次。

1.3 软骨细胞培养液的组成

对照组：高糖DMEM培养基，添加10% FBS和1%双抗。实验组是在对照组的基础上，添加0.1mM非必须氨基酸、10mM HEPES液、0.4mM脯氨酸、50mg/L抗坏血酸。

1.4 原代软骨细胞贴壁和增殖情况

（1）细胞贴壁情况：原代细胞接种24h后，每天于倒置显微镜下观察贴壁生长情况并拍照。

（2）cck8法检测细胞增殖：原代细胞按2000个/孔的密度接种于96孔板，设5个复孔，接种后1-10d每天测得其吸光值（OD490）。测定前每孔加入10ul cck8溶液，放置培养箱继续培养。2h后于酶标仪检测OD490。

2 结果

2.1 原代软骨细胞的贴壁情况及形态学观察

原代软骨细胞接种后，分别按实验组和对照组的培养基进行培养，连续观察7d。原代分离的软骨细胞为圆球形，悬浮于培养基中；实验组，24h后细胞开始贴壁，逐渐展开，第3天时细胞基本均已展开呈多角形，在增殖过程中，出现抱团现象，至第6天，细胞可长满瓶底，单层生长的细胞呈现典型的“铺路石”样表现；而对照组的细胞，在48h才开始贴壁，第4天细胞基本展开呈多角形，第7天时呈现“铺路石”样。

2.2 原代软骨细胞的增殖情况

通过cck8法检测了实验组和对照组细胞连续9d的增殖情况。实验组的细胞在接种第2天即开始增殖，而对照组的细胞从第4天才开始明显增殖，实验组细胞的增殖率明显高于对照组。

3 讨论

随着社会快速发展，人口老龄化的问题日趋严重，伴随而来的关节软骨损伤的发病率也出现持续升高。因软骨组织缺乏血液和神经供应，其自身修复能力较差，故软骨损伤的治疗问题一直是医学界的研究热点。近年来，软骨组织工程技术已成为治疗关节软骨缺损的重要手段，而足够数量的高质量种子细胞的来源则是组织工程软骨构建的关键。

本研究在软骨细胞的消化分离过程中，清除软骨表面的滑膜组织后，采用对细胞毒性较小的0.2% II型胶原酶消化，可以减轻胰酶对软骨细胞的伤害。置于37℃恒温摇床振荡，可以在较短时间内使软骨消化更彻底。本实验中，1只兔的双膝关节软骨经3h左右的消化后已可完全消化，收集细胞后计数可达500万，且细胞的活性较高，贴壁率达90%以上。本消化方法较很多文献报道中的联合酶消化法等，具有步骤简单、耗时短、污染率低、获取细胞数量多等特点。

在软骨细胞的培养中，我们发现，使用添加了HEPES液、非必须氨基酸、脯氨酸及抗坏血酸的培养基可以促进原代软骨细胞的贴壁和增殖，且pei等表明这种培养基可以利于软骨细胞表型的维持。因此，在软骨组织工程中体外准备种子细胞时可以考虑使用该培养基，以获取更多具有软骨细胞表型的细胞。

参考文献：

[1]赵强，王一洲.兔膝关节骨性关节炎模型的建立及软骨细胞的分离、培养[J].天津中医药，2013（03）.