t淋巴细胞范文
时间：2023-03-27 00:38:38
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篇1
关键词: 吸烟;免疫系统;T细胞
摘 要:目的 探讨长期吸烟对免疫系统影响的机制. 方法 分别于3mo和9mo对吸烟组及对照组大鼠行抗体形成细胞（AFC）试验和抗CD3 抗体诱导的T细胞增殖试验以测定其体液和细胞免疫. 结果 9mo后，吸烟组大鼠对绵羊红细胞的抗体形成细胞反应及抗CD3 抗体诱导的增殖反应均较对照组显著降低，而3mo时无显著差异. 结论 长期吸烟所引起的免疫抑制是与抗原刺激T细胞后，T细胞不能有效地活化、增殖和分化有关，T细胞自身的细胞免疫受到损伤，也使得它不能有效地辅助B细胞进行增殖及产生抗体，从而使体液免疫也变得无能.
Keywords:smoking;immunization system;T cells
Abstract:AIM To investigate the mechanism of how cigarette smoke affects the immunization system.METHODS Antibody-forming cell response and assay for anti-CD3 -in-duced proliferation were performed to determine the cellular and humoral immunity after3and9months’smoking.RESULTS Compared to those of the control group，the an-tibody-forming cell response and anti-CD3 -induced prolifera-tion of smoking group reduced significantly after9months，while there was no significant difference between the two groups after3months.CONCLUSION Immunosuppression caused by chronic exposure to cigarette smoke is related with the impairment of antigen mediated signaling in T cells.The impairment leads to the significant reduction of activation and proliferation of T cells，which in turn causes the impairment of the cellular immunity and thereby the disability to help the B cells to produce antibodies.Therefore，the humoral immu-nity is anergy as a result.
0 引言
吸烟是影响身体健康的一个重要因素，可以显著升高心脏病、肿瘤、急慢性呼吸道感染的发病率.有人认为就是因为吸烟所引起的免疫系统的损害才导致了人体对这些疾病的易感性［1］ .吸烟可影响广泛的包括体液的和细胞介导的免疫反应功能［2］ .尽管人们了解到长期吸烟会影响兔子、猴和人类的T细胞反应，但其确切的分子机制却尚未阐明.大鼠若长期暴露于烟草的主要毒性成分尼古丁，抗体形成细胞的反应就会受到影响.其原因可能是T细胞的反应性增殖降低，也可能是T细胞依赖的抗体反应降低.然而，吸烟对T细胞功能影响的机制人们尚未清楚，这种免疫抑制有可能与T细胞内抗原介导的信号转导受损有关［3］ .除尼古丁之外，烟草中含有成千上万种其他毒性物质.为研究吸烟引起的免疫抑制的分子机制，我们给SD大鼠每日持续吸烟数小时，持续9mo，然后观察其免疫功能的改变.
1 材料和方法
1.1 材料 ①动物:4～5wk龄的SD雄性大鼠共50只购自本校实验动物中心，到6wk龄时按质量随机分为对照组和吸烟组，3，9mo时分别处死10，15只.②抗CD3 抗体购自北京中山公司.
1.2 方法 ①烟卷点燃后通过与饲养笼相通的进气管吹入，吸烟组每日暴露6h，对照组暴露于正常饲养环境.②免疫:大鼠在处死之前4d给予iv5×108 绵羊红细胞.③淋巴细胞的准备:取大鼠脾脏后将之研碎，经不锈钢滤网过滤后用NH4 Cl溶液将红细胞溶解，将脾细胞过nylon wool柱，不结合nylon wool柱的细胞为T淋巴细胞，从而将T淋巴细胞分离出来，然后再用流式细胞仪分析;经不锈钢滤网过滤的脾细胞用小鼠抗大鼠CD3 单克隆抗体，再在用抗小鼠IgG抗体包被的板上孵育，CD3+ 的细胞被除去，非结合细胞为B淋巴细胞，用流式细胞仪分析.④抗体形成细胞（AFC）试验［4］ :不同浓度的脾细胞与20μmol・mL-1 的绵羊红细胞、25μL豚鼠补体混合，再用含100μmol・mL-1 胎牛血清的RPMI1640将液体总量加到150μL，37℃培养45min，然后记数抗体形成细胞.⑤抗CD3 抗体诱导的T细胞的增殖试验:在96孔板中加入含2×105 个细胞的培养液0.2mL，一组加入5μg・mL
-1 的抗CD3 抗体，另一组不加，37℃培养3d后掺入3 H（0.5μCi/孔），测定.
2 结果
2.1 长期吸烟对抗体形成细胞反应的影响 3，9mo后，与对照组相比，吸烟大鼠脾细胞的T，B淋巴细胞所占比例无明显差异.经绵羊红细胞免疫4d后，对两组大鼠的抗体形成细胞反应进行了测定，结果表明9mo时吸烟组大鼠对绵羊红细胞的抗体形成细胞反应较对照组显著降低（P
图1 略
2.2 吸烟对TCR介导的T细胞增殖的影响 有研究表明，长期吸烟可以减低T细胞对其有丝分裂原的反应［5］ .我们用抗CD3 抗体直接连接TCR，诱导T细胞的增殖，结果发现，吸烟9mo时的大鼠对抗CD3 抗体诱导的增殖反应较对照组显著性降低（P
图2 略
3 讨论
有报道表明，长期吸烟可以降低机体的免疫力，而且很可能是同时抑制了体液和细胞免疫反应［6］ .作为烟草中的主要毒性成分，尼古丁可以导致T细胞的反应无能，而且很可能是与抗原介导的信号转导系统的损伤及细胞内Ca2+ 反应抑制相关［3］ .
从本研究结果看，吸烟早期（3mo）并不引起显著的免疫力降低，而长期吸烟不仅会导致体液的，而且会导致细胞免疫的损伤，说明免疫力的降低是一个损伤逐渐积累的过程.吸烟若能在早期及时戒烟，对机体免疫力的损伤是不会很大的.长期吸烟并不引起淋巴细胞数量和比例的改变，这说明吸烟引起的免疫抑制并不是由于淋巴细胞数量和比例的改变引起的，而是T、B淋巴细胞的功能障碍.长期吸烟者的T细胞在接受了外源性抗原刺激后，并不能够被有效激活、增殖和分化，细胞免疫受到损伤，也使得它不能有效地辅助B细胞进行增殖和分化，这很可能是体液免疫降低的一个重要原因.作为烟草中的主要毒性成分，尼古丁可以导致T细胞的反应无能，而且很可能是与抗原介导的信号转导系统的损伤及细胞内Ca2+ 反应抑制相关［3］ .
蛋白磷酸化是细胞调节过程中一个主要的作用方式.抗原刺激T细胞后，蛋白酪氨酸激酶被活化，这就会通过酪氨酸依赖的机制激活磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）及产生IP3［7］ .而IP3是人们所熟知的引起细胞内Ca2+ 迅速、持久上升的重要介质.IP3的产生和细胞内Ca2+ 的蓄积是T细胞发挥其功能的基本条件，因而，长期吸烟所引起的T细胞的功能障碍很可能是由IP3产生或Ca2+ 蓄积障碍所引起的信号转导途径受损引起的.
参考文献
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篇2
【关键词】T细胞；胸腺细胞；分化；选择
T淋巴细胞(T lymphocyte)简称T细胞，是数量最多、功能最复杂的淋巴细胞群，也是适应性细胞免疫应答的执行者，并在TD-Ag诱导的体液免疫应答中发挥重要的辅助作用。T细胞及其亚群历来是组织胚胎学、医学免疫学等生物科学领域的研究重点，成果显著，理论也较为丰富，但不能否认的是，各学科在相关内容的描述上往往不够统一，或者缺乏足够的知识关联，难免会给读者带来一些理解上的困难。本文就T细胞的分化发育过程及其形态与表面标志变化进行归纳。
1T细胞的来源
T细胞和B细胞一样，都是由多能造血干细胞(MHSC)发育分化而来。MHSC首先分化为髓样祖细胞和淋巴样祖细胞，胚胎第7周时，淋巴样祖细胞定向发育成原T(pro-T)细胞(表型为CD410、CD3-、CD8+、CD25-、C-kit+、Lin-、TCRαβ-)，在胸腺血管形成之前，胸腺原基分泌的趋化因子即吸引循环血液中的原T细胞进入其内。原T细胞先后来自卵黄囊、胎肝和骨髓，但进入胸腺的具体途径和机制还不完全清楚。有人认为是经皮-髓质交界处的毛细血管后微静脉进入胸腺实质，有人则认为是随组织液从胸腺被膜进入实质的，从发生上来说，两种观点都具有阶段性意义。原T细胞进入胸腺被膜下而未到达胸腺皮质之前，称前T(pre-T)细胞，当其进入胸腺皮质后即称为胸腺细胞。在相关文献资料中，多数对于淋巴干细胞的定位较为模糊，名词使用也比较混乱，因此有必要进行讨论，统一认识。笔者认为，淋巴干细胞是淋巴系造血祖细胞的统称，可分为两级，淋巴样祖细胞属于一级(多向)淋巴干细胞，由其分化而来的pro-T细胞、pro-B细胞和pro-NK细胞(后者尚未证实)则属于二级(定向)淋巴干细胞；从这个意义上来讲，髓系造血祖细胞也可分为二级或三级以上，髓样祖细胞为一级，可向单系(如红系)或二系(如粒单系)发展；就T细胞的发育而言，pro-T细胞以前为干细胞阶段，pre-T细胞以后为胸腺细胞阶段。
2 胸腺微环境
胸腺微环境是胸腺细胞赖以生存的场所，由诱导其增殖、分化与选择性发育的各种因素构成。淋巴干细胞早期即在胸腺内开始分化，应用小鼠胸腺细胞实验模型研究表明，在胚胎11～12天pro-T细胞已进入胸腺，在胸腺微环境的影响下胸腺细胞迅速发生增殖和分化。
目前已知诱导T细胞在胸腺内分化、成熟的主要因素包括：①胸腺基质细胞(TSC)通过细胞表面的粘附分子直接与胸腺细胞相互作用，其中胸腺内的哺育细胞(nurse cell)对于T细胞的成熟和分化起着重要的调节作用；②胸腺基质细胞分泌多种细胞因子(SCF、IL-1、IL-6、IL-7、GM-CSF等)和胸腺激素(胸腺素、胸腺α肽、胸腺生成素等)诱导胸腺细胞分化；③胸腺细胞自身分泌多种细胞因子(IL-2、IL-4、IFNy、IFNα等)对胸腺细胞本身的分化和成熟起重要的调节作用；④胸腺上皮细胞(TEC)、巨噬细胞(M )和树突状细胞(DC)对于胸腺细胞分化过程中的自身耐受、MHC限制以及功能性T细胞亚群的形成起着决定性作用；⑤细胞外基质也是胸腺微环境的重要组成部分，包括多种胶原蛋白、网状纤维蛋白、葡萄糖胺聚糖等，它们可促进上皮细胞与胸腺细胞接触，并促进胸腺细胞在胸腺内移行和成熟。
3胸腺细胞的分化阶段
胸腺细胞从皮质浅层到皮质深层，进而经过皮、髓质交界处进入髓质，在胸腺微环境的作用下逐渐分化成熟，它们的分化程序受到严格的调控。根据对人胸腺不同部位胸腺细胞的表型分析，胸腺细胞的分化可分为4个阶段。
3.1前T细胞:主要位于胸腺被膜下，细胞体积较大，胞质内细胞器少。pre-T细胞的表型为CD3-、CD4-、CD8-、CD25-、C-kit10、TCRαβ-，即尚未出现T细胞标志，但表达末端脱氧核苷转移酶(Tdt)，部分细胞表达CD7。
3.2早期胸腺细胞:主要分布于被膜下、小叶间隔附近及胸腺皮质浅层。早期胸腺细胞体积大，核圆形，电子密度较低，染色质呈细粒状，核仁不明显；胞质少，呈环带状，细胞器少，仅见少量游离核糖体和球形线粒体。在胚胎10～14周时，这种细胞是构成胸腺的主要细胞成分。15～20周时，该类细胞数量相对减少，30周至足月则更少。早期胸腺细胞的表型为CD2+、CD3+、CD5+、CD4-、CD8-、CD25-、TCRαβ-，由于缺乏CD4和CD8分子，因此又称双阴性(DN)细胞。DN细胞向皮质深层迁移的同时，发生TCRβ基因重排及转录，可使自身免于凋亡(apoptosis)，更重要的是，其TCRβ-βCD3可逐渐表达于细胞表面，与基质细胞配基结合后，经p56lek传导信号，诱导CD4/CD8分子表达及TCRβ基因发生等位排斥。
3.3普通胸腺细胞:由早期胸腺细胞经数次分裂后移向皮质深层发育而成，是胚胎20周以后胸腺皮质的主要成分。细胞中等大小，核圆形或椭圆形，染色质呈斑块状，功能活跃者多见核仁，趋向退化者核深染。
普通胸腺细胞表达CD3、CD1和T细胞抗原受体(TCR)，随即出现CD4和CD8分子。这种具有完整TCR 及CD4+CD8+T细胞又称双阳性(DP)细胞，约占此类细胞总数的80﹪～85﹪。只有极少数普通胸腺细胞继续分化为成熟胸腺细胞，而绝大部分将在阳性和阴性选择中凋亡而被清除(后述)。
3.4成熟胸腺细胞:主要位于皮质深层或髓质。细胞体积相对较小，与外周血小淋巴细胞形态无异，光镜和电镜下也难与普通胸腺细胞区分。成熟胸腺细胞除高表达TCR外，主要表达CD4+或CD8+，所以又称单阳性(SP)细胞。
4胸腺选择过程
T细胞发育成熟的关键步骤是双阳性(DP)细胞向单阳性(SP)细胞分化阶段所发生的胸腺选择，包括阳性选择与阴性选择，主要组织相容性复合体(MHC)抗原(分子)在这两种选择中起决定性作用。
4.1阳性选择过程:主要发生在DP细胞与胸腺上皮细胞之间的相互作用。在TCRαβ的介导下，若DP细胞能与胸腺皮质上皮细胞表面MHC-Ⅰ类或MHC-Ⅱ类分子以适当亲和力结合，则可能被选择而继续发育，分化为SP细胞；若DP细胞不能与MHC分子有效结合或发生高亲和力结合，则在胸腺皮质中发生程序性细胞死亡(PCD)即凋亡。在此过程中，MHC-Ⅰ类分子选择CD8共受体，而使同一个DP细胞表面CD4共受体减少；MHC-Ⅱ类分子则选择CD4共受体，使CD8共受体减少。这种选择过程赋予成熟CD8+CD4-T细胞具有识别外来抗原与自身MHC-Ⅰ类分子复合物的能力，CD4+CD8-T细胞具有识别外来抗原与自身MHC-Ⅱ类分子复合物的能力，此即T细胞获得MHC限制性的基础。阳性选择可消除所有非己MHC限制性T细胞克隆，而保存自身MHC限制性T细胞克隆，包括潜在而有害的自身反应性T细胞克隆。
4.2阴性选择过程:主要发生于DP细胞与胸腺内巨噬细胞(M )、树突状细胞(DC)或髓质上皮细胞间的相互作用。位于皮质与髓质交界处的DC和M 均表达高水平的MHC-Ⅰ类抗原和MHC-Ⅱ类抗原，后者与自身抗原结合成复合物，对已经历过阳性选择的胸腺细胞进行阴性选择。能识别自身抗原-MHC分子复合物的胸腺细胞即被激活而发生程序性细胞死亡，而不能识别该复合物的胸腺细胞则继续发育。经阴性选择后，排除了自身反应性T细胞克隆，并获得对自身抗原的耐受性。
经历上述与MHC有关的选择过程，约有95%以上的胸腺细胞被灭活或淘汰，只有少量胸腺细胞分化成熟为具有MHC限制性、可识别非己抗原的CD4+CD8-或CD4-CD8+单阳性细胞，即具有免疫功能的成熟T细胞。
5成熟T细胞库
成熟的胸腺细胞大部分通过皮质与髓质交界处的高内皮微静脉(HEV)进入血液，少数经淋巴管入血。成熟胸腺细胞为处女型T细胞，或称初始T细胞(Tn细胞)，它们都是未经抗原刺激的CD45RA+T细胞群，这和记忆T细胞(Tm细胞)表达CD45RO+有所不同。Tn细胞迁出胸腺后，依靠其表面的归巢受体(HR，即CD44分子)定居于周围淋巴器官并参加淋巴细胞再循环。遍布全身各处的T细胞共同构成T细胞库(T cell repertoire)。成熟T细胞库具有两个基本特性：①TCR识别抗原受MHC限制，即不仅特异性识别经抗原提呈细胞(APC)加工处理的抗原肽，而且须同时识别与抗原肽结合成复合物的MHC分子；②对自身抗原具有耐受性，一般不对自身MHC分子或与之结合的自身抗原分子产生应答，即所谓自身耐受现象。
参考文献
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篇3
1 资料与方法
1. 1 一般资料 选取2008年1月～2014年6月收治的肺癌患者80例。按照随机数字表法分为观察组和对照组， 各40例， 其中观察组：男23例， 女17例；年龄30～76岁， 平均年龄（59.69±12.44）岁；平均KPS评分（64.39±21.25）分。对照组：男22例， 女18例；年龄32～76岁， 平均年龄（58.30±12.33）岁；平均KPS评分（65.06±22.21）分。两组在性别、年龄及KPS评分等一般资料方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1. 2 治疗方法 对照组患者给予常规方案化疗， 连用4个周期。观察组在化疗间期给予六君子丸治疗， 每袋重9 g， 9 g/次口服， 2次/d。
1. 3 观察指标 观察两组治疗前后血清T淋巴细胞亚群水平变化， 检测方法为：采患者晨空腹静脉血， 置于抗凝管中， 以3000 r/min， 高速离心5 min， 采集上层血清， 置于-20℃保存， 采用流式细胞仪（美国BD公司BD LSRFortessa型）测定血清T淋巴细胞亚群水平：包括NK细胞、CD3、CD4、CD8、CD4/CD8， 试剂盒为仪器配套。
1. 4 统计学方法 采用SPSS15.0版软件进行处理。计量资料用均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验， 计数资料用率（%）表示， 采用χ2检验。P
2 结果
两组血清T淋巴细胞亚群比较， 治疗前两组的血清T淋巴细胞亚群水平比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗后对照组患者血清NK细胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平较治疗前明显降低， CD8水平明显升高（P
3 讨论
祖国传统医药在提高免疫功能方面有独到的优势， 认为现代医学所谓的免疫功能低下与中医的“虚证”密切相关[2]；其从整体出发， 通过调整人体阴阳平衡， 来提高患者的免疫功能。作者认为肺癌患者的中医辨证以“虚证”为主， 对应了其免疫功能低下的说法， 认为应采用“补虚扶正”的方法治疗， 并通过检测患者血清T淋巴细胞亚群水平的变化观察“六君子丸”对中晚期SCLC患者免疫功能的影响。六君子丸是由传统的六君子汤化裁而成， 组方如下：党参、白术、茯苓、半夏、陈皮、瓜蒌皮、杏仁、薏苡仁， 具有补脾益气， 燥湿化痰之功效。
T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的一大细胞群， 在正常机体内各个T淋巴细胞亚群相互使用， 维持着机体正常的免疫功能。在T淋巴细胞亚群中NK细胞是抗肿瘤的重要效应细胞， 不仅可以直接杀伤肿瘤细胞， 还可以通过产生白介素-2（IL-2）、干扰素细胞因子而增强其他细胞的抗肿瘤作用；CD3代表总T细胞， CD4代表T辅助细胞（TH）即免疫辅助细胞， CD8代表T抑制细胞（TS）即免疫抑制细胞[3]。
本研究结果显示经过4个周期的化疗后对照组患者血清NK细胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平较治疗前明显降低， CD8水平明显升高， 说明化学治疗损害晚期SCLC患者的免疫功能， 而观察组患者血清NK细胞、CD3、CD4及CD4/CD8水平较治疗前明显升高， CD8水平明显降低， 说明中医补虚扶正治疗能够提高患者的免疫功能。
综上所述， 中药六君子丸可以提高晚期SCLC患者T淋巴细胞所介导的免疫功能， 从而提高临床疗效， 值得临床推广应用。
参考文献
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篇4
[关键词] 肺癌；T淋巴细胞；NK细胞；流式细胞术
[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）04（b）-0093-03
肺癌是全世界最常见的恶性肿瘤。肺癌的5年生存率只有10%～20%[1]，预后极差。近50年来，我国肺癌发病率明显增高，在大中城市肺癌已居男性肿瘤之首。T淋巴细胞在抗肿瘤中具有极其重要的作用；T细胞应答是控制肿瘤生长发育的最重要的宿主应答；参与抗肿瘤免疫的两类T细胞亚群为CD4+辅助/诱导T细胞、CD8+抑制/细胞毒T细胞；T淋巴细胞及亚群可作为临床判断患者状态的一个敏感指标，对临床治疗具有重要意义。NK细胞在抗肿瘤的天然免疫和特异性免疫中发挥效应作用，能够直接杀伤各种肿瘤细胞和病毒感染细胞，是机体抗肿瘤的第一道防线。本文旨在探讨肺癌患者淋巴亚群变化和不同年龄组细胞免疫状况。
1 资料与方法
1.1 一般资料
570例肺癌患者均为2009年1月～2012年10月淮南东方医院集团肿瘤医院初次住院的临床确诊患者，其中，男性481例，女性89例，男女比例为5.4∶1；最大年龄92岁，最小27岁，中位年龄66岁。正常对照组20例，其中，男性13例，女性7例，年龄35～57岁，均为体检未发现肿瘤及免疫性疾患的人员。
1.2 样本采集
肝素真空采血管采集静脉血2 mL，室温放置，样本24 h内做染色处理。
1.3 试剂仪器
使用BD MultitestTM IMK kit 四色荧光抗体试剂盒（Cat No：340503），CaliBRITETM 3 COLOR KIT（Cat No：340 486）和CaliBRITETM APC（Cat No：340487）定标荧光微球，FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），调用四色免洗条件MultiSET软件自动分析淋巴细胞亚群；报告NK细胞（CD16+56+）、T淋巴细胞（CD3+）、辅助/诱导T细胞（CD3+ CD4+ CD8-）和抑制/细胞毒T细胞（CD3+ CD4- CD8+）占淋巴细胞的百分比和CD4+/CD8+细胞比值。
1.4 统计学处理
实验数据均以 x±s表示，组间比较用t检验，淋巴亚群结果的年龄趋势分析用线性回归分析，应用SPSS 17.0统计软件，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肺癌不同年龄组构成比
本组结果在51～80岁年龄段内发病人数占肺癌总人数的78.3%，是肺癌高发年龄段。肺癌在71～80岁组发病率最高（28.8%），可能是人的衰老，免疫系统功能衰弱，特别是细胞免疫功能下降，导致肿瘤发病率增加。由于80岁以上人群数量明显减少，其发病率明显减低并不能说明其发生肺癌的概率会降低。各组比例如图1。
2.2 肺癌患者不同年龄组与对照组淋巴细胞亚群结果
肺癌患者CD4+ T细胞相对减低、CD8+ T细胞相对增高、CD4+/CD8+比值明显降低，与正常对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；NK和CD3+ T细胞与对照组比较，差异无统计学意义。肺癌患者不同年龄组与对照组淋巴细胞亚群结果见表1。
2.3 肺癌患者淋巴亚群结果的年龄趋势分析
以年龄组（1）～（5）组为自变量，以淋巴亚群结果为因变量作线性回归分析，SPSS 17.0软件统计结果见表2。
随着肺癌患者年龄降低NK细胞有明显降低趋势（P < 0.01），CD3+ T细胞有明显增加趋势（P < 0.01），如图2。
3 讨论
CD4+ T细胞可直接杀伤肿瘤细胞，可识别肿瘤细胞分泌的可溶性抗原，参与B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和细胞毒T细胞的激活，进而发挥抗瘤作用；CD4+ T细胞的减少可以解释肿瘤的免疫逃避机制。肿瘤细胞具有分泌多种免疫抑制因子功能，可抑制T细胞和NK细胞[2]，使CD4+ T细胞和NK细胞数量减少，CD4+ T细胞和NK细胞减少可削弱机体的免疫监视作用。本组结果显示CD4+ T细胞和NK细胞明显降低，说明肿瘤患者存在免疫逃避；随着年龄的增大CD4+ T细胞降低明显，免疫功能随年龄增加而不断下降[3]，肿瘤的免疫逃避增加。
CD8+ T细胞按CD28有无可分为CD8+/CD28+和CD8+/CD28-两类，前者有细胞毒细胞功能，而后者则有抑制功能，CD28分子在T细胞激活、增殖中具有重要作用；恶性肿瘤患者CD8+ T细胞CD28+分子表达率显著下降，影响T细胞的活化增殖，而CD8+/CD28- T细胞逐渐增高，进而造成机体对肿瘤免疫力的下降[3-4]。在抗肿瘤的免疫应答中，细胞毒性T细胞（CTL）成为抗肿瘤免疫的主要效应细胞[5]。本组结果CD8+ T细胞明显增加超过CD4+ T细胞减少的数量导致CD3+总T细胞增加，说明肺癌患者有抑制功能的T细胞增加，CD8+ T细胞不能被充分激活而无法产生有效抗肿瘤作用。在杀伤肿瘤中往往CD4+、CD8+两类细胞相互配合，共同协作。肿瘤形成发展过程中，产生或分泌可溶性免疫因子，可诱导CD8的产生同时阻止CD4的形成和成熟而导致CD4+/CD8+比值下降，CD4+/CD8+比值可反映机体的免疫功能状况。
NK细胞具有抗肿瘤，抗病毒感染，抗器官移植，参与T淋巴细胞、B淋巴细胞的调节及其免疫调节的功能。NK细胞通过受体作用维持平衡、发挥杀伤效应[6-7]。Cooper MA等[8]研究证明人外周血NK细胞可分为二群，80%～90%的NK细胞低表达CD56高水平表达CD16（CD56dim CD16brigh），此类细胞可有效地发挥细胞毒作用；10%～20%的NK细胞表型为CD56brighCD16dim或CD56brighCD16-，其功能主要是分泌细胞因子，参与机体的免疫调节。陈文宽等[9]研究78例喉咽鳞癌患者发现癌症组较非肿瘤对照组NK细胞活性低；局部晚期患者及有区域淋巴结转移患者的NK细胞活性同样降低。康培良等[10]报道胰腺癌根治手术治疗后可明显提高T细胞亚群和NK细胞的免疫功能。本研究肺癌患者NK 细胞降低与文献一致[9-11]，患者越年轻NK细胞免疫活性越低。
在21～40岁组NK细胞明显降低，CD3+细胞、CD8+ T细胞明显增高，CD4+/CD8+比值显著降低（P < 0.01），在71～80岁组NK细胞比前四组明显增高（P < 0.01）、稍高于对照组，说明年轻患者细胞免疫功能活跃，老年患者机体代谢慢、肿瘤生长也相对缓慢，老年机体本身免疫低下，细胞免疫反应降低。不同年龄的肺癌患者细胞免疫功能不同，其治疗策略、方法也应不同。肺癌患者越年轻细胞免疫功能紊乱越明显，提示年轻患者的治疗更要注重细胞免疫的调节和平衡。而老年患者机体本身免疫功能低下，细胞免疫对肿瘤的抑制能力有限，应注意机体的整体性治疗，防止并发症。
总之，肺癌患者的CD4+ T细胞降低、CD8+ T细胞升高、CD4+/CD8+比值显著降低，NK细胞降低，说明患者免疫功能处于抑制状态，T细胞亚群及NK 细胞活性检测可作为肺癌免疫功能及预后的监测指标。肺癌年轻患者细胞免疫功能紊乱明显，提示年轻患者的治疗更要注重细胞免疫的调节和平衡。
[参考文献]
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篇5
【关键词】丙型肝炎病毒；特异性细胞毒性T淋巴细胞；功能
【中图分类号】R373.2+1 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0763-01
慢性丙型肝炎是一种具有严重危害性的传染性疾病[1]。一些报道表明丙型肝炎患者CTL的免疫功能低下，只能起到抗感染的作用，无法抵抗感染细胞中的病毒，导致病毒一直存在于细胞中，最后可能诱发肝癌。本文对18例慢性丙型肝炎患者外周血中丙型肝炎病毒CTL的活性进行检测，研究了丙型肝炎患者丙型肝炎病毒CTL的功能。现将结果报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
慢性丙型肝炎患者18例，其中男11例，女7例，年龄25-56岁，平均年龄41.32岁。所有患者均符合丙型肝炎相关诊断标准，排除乙肝和免疫缺陷病感染，且半年内没有接受抗病毒和免疫调节治疗。使用特异性引物聚合酶链式反应法进行丙型肝炎病毒基因型检测。此外选择10例正常人作为对照，其中男6例，女4例，年龄19-36岁，对照人员免疫缺陷病毒和肝炎标志物检测均为阴性，无饮酒和损肝药物使用史。
1.2 实验方法
使用PCR-SSP法对患者进行丙型肝炎病毒基因型检测。将表达丙型肝炎病毒核心蛋白的真核表达质粒通过基因转染法转染HepG2细胞，经筛选获得稳定转染的Hep-Core细胞，经过蛋白质印迹法检测证实有HCV核心蛋白表达；分离患者外周血中的单个核细胞，经体外诱导扩增获得HCV特异性CTL（HCV-CTL），以Hep-Core细胞和HepG2细胞作为靶细胞，运用乳酸脱氢酶释放法检测HCV-CTL的活性，用酶联免疫吸附法检测培养上清液中干扰素-γ（IFN-γ）的含量，以正常人作为对照组。
1.3 统计学处理
使用采用 SPSS15.0分析软件包对所得到的数据进行分析处理，计量资料采用方差分析和t检验，P
2 结果
2.1 转染细胞中丙型肝炎病毒核心蛋白的表达
运用蛋白质印迹法检测证实使用HCV-C转染的HepG2细胞中有HCV核心蛋白表达，没有转染或空白的细胞中无HCV核心蛋白表达。
2.2 HCV-CTL活性检测
运用乳酸脱氢酶法分析18慢性丙型肝炎患者和10例正常人的HCV-CTL活性。丙型肝炎组患者的HCV-CTL活性为（24.1±4.6）%，正常对照组为（43.2±6.1）%，两组比较差异有统计学意义（P
2.3 靶细胞培养上清液中IFN- γ浓度的测定
丙型肝炎组患者靶细胞培养上清液中IFN-γ的浓度为（961±239）pg/ml，正常对照组为（3125±676）pg/ml， 两组比较差异有统计学意义（P
2.4 HCV-CTL活性和获得SVR的关系
本研究中另外选取完成常规抗病毒治疗的慢性丙型肝炎患者16例，其中获得SVR患者9例，无应答患者7例，均经过HCV-CTL活性检测。其中获得SVR患者的HCV-CTL活性为（41.5±2.6）%，无应答患者为（25.1±3.5）%，两组比较差异有统计学意义（P
3 讨论
慢性丙型肝炎（CHC）是一种具有严重危害性的传染性疾病，主要通过血液传播。CHC的发病机制比较复杂，丙型肝炎病毒（HCV）和人体免疫系统的相互作用决定了该病的发生发展和转化。HCV慢性感染可能引发肝脏慢性炎症、纤维化等，严重者甚至会导致肝癌[2]。丙型肝炎患者CTL免疫功能和肝病的恶化程度有一定的关系[3]。CTL免疫功能低下包括细胞抗病毒能力下降、刺激后增殖能力下降、IFN-γ分泌减少等。丙型肝炎病毒感染细胞后机体会产生针对HCV的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫应答，CTL的数量和质量决定了机体阻止病毒感染恶化和清除病毒感染的效果。如果CTL的免疫应答较强，能够起到完全清除HCV的作用；如果CTL的免疫应答功能低下，只能起到抗感染的作用，无法抵抗感染细胞中的病毒，导致病毒一直存在于细胞中，最后可能诱发肝癌。
本次研究发现，慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性明显低于正常人。研究显示细胞诱导后CTL培养上清液中IFN-γ浓度的浓度较正常人明显降低，这也说明慢性丙型肝炎患者CTL细胞的分泌能力明显下降，进一步导致其免疫功能低下。获得SVR患者的HCV-CTL活性明显高于无应答组，可见随着血液中HCV RNA水平的下降，细胞中HCV-CTL的活性显著提高，提示HCV-CTL活性和HCV RNA复制水平有一定相关性，CTL细胞的免疫功能和控制丙型肝炎病毒复制和清除的基因组有一定关系。
综上所述，本次研究表明慢性丙型肝炎患者HCV-CTL的活性降低，CTL的免疫功能会随之下降。慢性丙型肝炎患者HCV-CTL活性降低，CTL的免疫功能低下与病毒水平和基因型有一定关系。
参考文献：
[1] 窦晓光，丁洋.慢性丙型肝炎抗病毒治疗的新策略和新方法[J].中国实用内科杂志，2010，08（03）：54-55.
篇6
【关键词】 ； 甲基化； 淋巴细胞； 细胞免疫
人体免疫系统是由多种免疫细胞、免疫分子共同参与，形成复杂的网络结构而发挥作用。其中淋巴细胞对免疫应答的启动起着至关重要的作用。研究发现，吸毒人群的免疫系统受到极大破坏，淋巴细胞的活性也受到破坏[1]。而在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身性免疫疾病中，均发现其淋巴细胞DNA甲基化水平发生异常[2]。吸毒所导致的免疫力低下，与淋巴细胞甲基化水平是否存在特定规律，这是本研究的主要着眼点。本研究通过检测康复期强制戒毒人员外周血淋巴细胞基因组DNA甲基化水平和T淋巴细胞亚群变化，研究吸毒者免疫力受损与DNA甲基化的关联，为探讨对免疫病理损伤可能机制提供理论参考。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本试验于2002年9月-2002年12月间进行。以80例康复期强制戒毒人员为研究对象，其来源于福建省司法厅所属强制戒毒场所自愿参加戒毒的人员，男40例，女40例，平均年龄（32.16±0.98）岁；符合ICD-10阿片类药物依赖诊断标准和苯丙胺类药物依赖诊断标准的脱毒患者；经告知同意，自愿参加，并签署知情同意书；排除HIV、肺结核、肝炎等传染性疾病患者，排除肝、肾、心功能不全者及精神病患者中不能配合者。以80例正常健康人群为对照，采集静脉血样，其来源于福建省二人民医院健康体检中心参加体检且身体健康无重大疾病者，男40例，女40例，平均年龄（29.33±2.41）岁。两组在性别、年龄方面比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 主要仪器和试剂 多功能酶标仪Infinite M200 F200（奥地利TECAN）；流式细胞分析仪EPICS XL（美国Coulter）；超低温冰箱Premium Range（美国NBS）；超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）；生化培养箱SHP-250（上海精宏）；台式离心机（美国EPPENDORF）；可调式移液器（美国EPPENDORF）。
淋巴细胞基因组DNA抽提试剂盒（美国Omega公司）；整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）；单克隆抗体（美国BD公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 外周血T淋巴细胞亚群检测 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于肝素抗凝管中。取肝素抗凝血100 μL于小试管底部，分别加20 μL荧光标记的单克隆抗体，混匀，室温（18～25 ℃）孵育15 min。加红细胞溶解液1 ml，充分混匀。待红细胞完全溶解后上流式细胞仪检测。在波长488 nm时，计数30 000个细胞。记录分析直方图，数据经ELITE软件处理，以百分率报告。
1.3.2 淋巴细胞基因组DNA的提取 被试人员在清晨空腹静脉采血5 ml于EDTA抗凝管中。供试血样淋巴细胞基因组DNA抽提采用SE Blood DNA Kit（美国Omega公司），按试剂盒说明进行，抽提的DNA保存于-20 ℃备用。
1.3.3 DNA含量测定及纯度鉴定 取抽提好的DNA溶于双蒸水中，于超微量紫外分光光度计NANODROP2000（美国THERMO）上测量260/280 nm光密度值。保证供试样本A260/280比值均在1.7～1.9之间，浓度在50～100 μg/ml，以用于整体DNA甲基化水平的测定。对不符合要求的DNA样本重新进行抽提和定量。
1.3.4 淋巴细胞整体基因组甲基化水平测定 DNA整体甲基化水平采用整体甲基化定量试剂盒（美国Epigentek公司）检测。该试剂盒采用抗原抗体结合的方法，将DNA固定到一个对DNA具有高亲和力的反应孔中，甲基化的DNA能够被5甲基胞嘧啶抗体识别，通过抗原抗体识别反应进行定量，甲基化的DNA与OD值的高低成正比。具体操作步骤按试剂盒说明书操作，DNA甲基化的程度采用如下公式计算：
甲基化%=OD（样本-空白对照）/2×OD（阳性对照-空白对照）
1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，相关性分析采用多元回归分析，以P
2 结果
2.1 整体DNA甲基化水平检测结果 康复期强制戒毒人员淋巴细胞中基因组DNA甲基化百分率为（15.37±3.28）%，显著低于正常健康人群的（23.18±7.98）%，差异具有统计学意义（P
2.2 T淋巴细胞亚群检测结果 康复期强制戒毒人员CD3+、CD3++CD4+ 和CD3++CD4+/CD3++CD8+值均明显低于正常健康人群，差异具有统计学意义（P0.05），见表1。
2.3 淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与T淋巴细胞亚群的相关性 以基因组DNA甲基化水平为因变量进行多元线性回归分析发现，CD3+、CD3++CD4+与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平呈正相关（r=0.21，0.36，P0.05）。
3 讨论
本研究表明吸毒者总T细胞（CD3+）减少，CD3++CD4+细胞也显著降低，CD3++CD8+无显著变化，故CD3++CD4+/CD3++CD8+明显下降，说明抑制吸毒者的正常免疫功能。对人体细胞免疫的影响早有报道。早在1974年Brown等[3]就报道，海洛因成瘾者免疫功能缺陷，表现为淋巴细胞转化率显著降低。海洛因广泛抑制机体细胞免疫功能，使淋巴细胞增殖和活性受抑制[4-5]。同时还能引起T淋巴细胞对PHA刺激导致的分化能力下降，分泌IL-2、INF-γ、IL-4能力下降[6]。研究表明，吸毒者整体细胞免疫功能处于抑制状态，其机制可能是海洛因等药物毒性代谢产物抑制了T细胞的活性和增殖能力，也可能是长期滥用外源性阿片样物质引起机体下丘脑神经内分泌激素系统（阿片肽系统）退行性改变，使其对T细胞及其亚群的正常调节作用减退和消失导致细胞免疫功能受损[7]。
DNA甲基化是目前研究较为深入的一种表观遗传学调控机制。在近几年研究中发现，DNA甲基化在自身免疫性疾病中起着重要作用。DNA甲基化水平改变可以影响许多基因的表达，包括一些与黏附因子和细胞因子表达相关的基因，导致T细胞的自身反应性发生改变，从而与疾病发病密切相关。如在系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）和系统性硬化症（systemic sclerosis，SSc）患者中，基因组普遍DNA甲基化水平都降低[8-9]。DNA的低甲基化可能通过引起患者的某些基因的异常表达，参与疾病的发生发展[10]。
本文研究结果表明，康复期强制戒毒人员淋巴细胞基因组DNA甲基化水平显著低于正常人水平，说明对人体淋巴细胞DNA有一定影响，其表观遗传修饰发生改变。同时发现淋巴细胞基因组DNA甲基化水平与CD3+和CD3++CD4+呈正相关，说明吸毒所导致的细胞免疫功能下降与淋巴细胞基因组DNA甲基化水平存在关联。本研究揭示了康复期戒毒人员的甲基化水平状态，发现细胞免疫功能与淋巴细胞甲基化水平相关性，为今后从分子水平探索对人体免疫病理损伤机制具有重要意义。
参考文献
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篇7
【关键词】
宫颈癌；外周血T淋巴细胞；NK细胞检测；临床意义
The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients
WANG Hongning.
Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P
【Key words】
Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance
T细胞亚群是反映细胞免疫功能的重要指标之一，肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫功能，特别是与T淋巴细胞功能有密切的关系，在肿瘤免疫监测中起着重要的作用［1］。而肿瘤患者以T细胞介导的细胞免疫存在不同程度的紊乱与缺陷。宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康，近年来其发病率有明显上升趋势，我们对宫颈癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞进行检测，了解其临床意义，具体汇报如下。
1 资料与方法
11 一般资料 选取2009年1月至2011年1月收治的宫颈癌患者214例，年龄38~71岁，平均658岁。所有病例检测前均未经放疗或化疗。依据《新编常见恶性肿瘤诊治规范》
对214例宫颈癌患者(宫颈癌组)进行肿瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。选取同期进行健康体检200例(体检组)，进行外周血T淋巴细胞及NK细胞检测两组在年龄上比较，差异无统计学意义，具有可比性。
12 检测方法 仪器和试剂荧光标记单克隆抗体：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色标记和同型对照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均购自法国Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式细胞仪购自美国BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鲜抗凝静脉血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述单抗20 μl，混匀，室温避光20 rain染色；加入15 ml红细胞裂解液，混匀后室温避光放置10 min，破坏红细胞；1 500 r/min离心5 min，弃上清；每管加入2 ml 01％叠氮钠的磷酸盐缓冲液混匀，1 000 r/rain离心5 min，弃上清；加PBS 1 ml，混匀，2 h内上机检测。FCM激光为冷亚激光，波长488 nm，采用flowcheck调整光路，用同型对照
调电压，以SSC为横座标，FSC为纵座标，构建散点图，在散点图上采用设门技术分析淋巴细胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表达情况，每份标本计数1×105细胞。
13 统计学方法 使用SPSS 130统计学软件进行统计学分
析，因数据不符合正态分布，故采用秩和检验，P
2 结果
对两组病例进行外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测，观察体检组、宫颈癌组(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)变化并比较，具体见表1.
表1
3 讨论
机体的免疫系统是在生物进化中逐步建立起来的，其存在与功能的正常建立在机体稳定性的基础上。在正常情况下，机体的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵袭，消除体内损伤或变老的自身细胞，处理体内出现的少量异常细胞。在抗肿瘤免疫中，细胞免疫占据着重要的地位。细胞免疫应答主要是T细胞介导的特异性细胞免疫，已证明T细胞具有有效的抗肿瘤作用［2］。对于T淋巴细胞和NK细胞等细胞免疫的主要效应细胞的研究已经成为现代肿瘤免疫学研究的重点。
胸腺依赖性淋巴细胞即T淋巴细胞又是细胞免疫系统的关键组成部分。机体内的T淋巴细胞能识别肿瘤细胞，在接受肿瘤细胞刺激后，转化为能攻击和杀伤肿瘤细胞的致敏淋巴细胞，有着免疫监视机能。一旦这种监视机能遭到破坏，患肿瘤的危险就将增加。
CD+3抗原分子通常分布在成熟T细胞表面，故CD+3T细胞数量可代表机体总T细胞数量，而CD+4T细胞通常代表T辅助细胞，CD+8T细胞通常代表T抑制细胞，CD+4/CD+8比值反映了机体细胞免疫功能状态是否稳定，比值降低代表细胞免疫功能降低。NK细胞是在肿瘤早期发挥作用的效应细胞，不需要预先接触抗原，无组织相容性复合体(MHC)限制性，不依赖抗体或补体即可直接杀伤MHCl类基因表达低下或缺如的肿瘤细胞，被称为抵抗肿瘤生长的第一道防线，其表面标志是CD+16CD+56［3］。
宫颈癌患者的T细胞亚群与正常人相比，当具有免疫反应活性的CD+4细胞减少，而具有免疫抑制功能的CD+8细胞升高时，可能引起机体的免疫平衡失调，造成恶性肿瘤患者的免疫功能减退或受到肿瘤细胞产生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可广泛抑制杀伤细胞的活性，同时在肿瘤抗原的刺激下，脾细胞免疫抑制细胞前体被激活，分泌免疫抑制因子，造成宫颈癌患者免疫功能低下［4］。NK细胞在杀伤肿瘤细胞的过程中消耗了大量的NK细胞，以及TDSF使NK活性降低，NK细胞在血液循环中再分布等原因导致宫颈癌患者NK细胞降低［5］。
通过对两组进行观察宫颈癌患者的T细胞亚群与正常人相比差异有统计学意义，CD+4细胞减少、CD+8细胞升高。并且随着宫颈癌患者病情的发展，Ⅰ期 、Ⅲ期与Ⅲ期、IV期外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测比较差异有统计学意义（P
参考文献
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篇8
【关键词】 T辅助淋巴细胞； 功能变化； 急性肺损伤； 意义研究
【Abstract】 Objective：To investigate the significance of functional changes of T helper lymphocyte in acute lung injury.Method：100 mice were selected and randomly divided into the observation group and the control group，each group had 50 mice.Mice in the observation group were injected with proper amount of LPS and made models of acute lung injury.The contents of interferon and interleukin in the cell supernatants of mice were measured by enzyme linked immunosorbent assay.The expression situation of IFN-γ gene in the mice’s spleen cells was measured by reverse transcriptase-PCR determination method.The measurement results were compared between the two groups.Result：The content of IFN-γ in the observation group was lower than that in the control group，the content of IL-4 in the observation group was higher than that in the control group，the differences were all statistically significant（P
【Key words】 T helper lymphocyte； Functional change； Acute lung injury； Significance research
First-author’s address：The First People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510180，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.25.005
目前认为，促炎与抗炎反应失衡为诱导急性肺损伤发生的根本原因，但目前对促炎与抗炎反应失衡准确评估有较大难度。大量研究表明，T辅助淋巴细胞可反映机体炎症反应的免疫功能状态，其功能变化在急性肺损中的作用较大[1]。为了探讨T辅助淋巴细胞的功能变化在急性肺损伤中的意义，本文选取100只小鼠作为研究对象进行分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 实验小鼠均为野生鼷鼠的变种，来源于野生的小家鼠，选取100只小鼠作为研究对象。采用随机数字表法将其分成观察组和对照组，每组50只，雌雄各半，体重20～24 g。两组小鼠的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 小鼠处理 首先为观察组小鼠进行适量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔处，7.5 h之后再为小鼠注射适量的甲酰基-苯丙氨酸，然后进行急性肺损伤小鼠基本模型的制作，等到大约3.5 h之后将小鼠处死；对照组小鼠则进行适量生理盐水的简单注射，注射的量和观察组小鼠药物注射量相同。
1.2.2 细胞培养 在对小鼠进行有效处理之后，按照相关要求进行小鼠脾细胞的正常分离，适量增添细胞培养液，利用显微镜观察小鼠脾细胞的数量，然后对小鼠脾细胞进行稀释处理，最终使其量控制在10×106个左右，加入适量的刀豆素，使其浓度控制在1.1 μg/mL左右，温室温度下及4.5%浓度的二氧化碳的环境下进行细胞培养，细胞培养的时间在70 h左右，培养结束之后，留取细胞上清液，检测上清液中的IFN-γ浓度及IL-4浓度，最后提取脾细胞中的RNA。
1.2.3 浓度测定 在检测细胞当中的相关因子浓度时，需要用到IFN-γ酶的专门吸附盒和IL-4酶的专门吸附盒，按照吸附盒上面的具体要求进行细胞测定，利用酶标仪对波长500 nm的位置进行密度检测，按照标准曲线的变化规律，最终确定小鼠细胞当中的具体因子浓度。
1.2.4 基因表达数量计算 利用PCR的标准测定试剂盒，进行小鼠脾细胞当中的基因转录，使其最终合成cDNA，然后进行PCR的有效扩增。对引物序列进行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它们分别有各自的上游引物和下游引物。经过对引物图像的观察和分析进行产物测量，对三大序列产物进行正常扫描，确定出具体的光密度数值，最后进行三大序列引物光密度数值的相互对比，从而测得基因表达。
1.2.5 损伤指标检测 首先进行肺组织含水量的正常检测，在处死小鼠以后，把小鼠的右肺进行有效割除，进行表面水清除之后进行肺组织称重，称重之后放到专门烘箱当中进行有效烘干后称重；然后进行漏出量的具体检测，在小鼠腹腔当中进行药物注射，处死小鼠之后利用专用针进行小鼠右心室的有效穿刺，利用适当浓度的生理盐水进行小鼠肺部的清洗，使其完全干净，切除小鼠的肺部相关组织，对肺门组织进行正常称重，进行小鼠肺组织的孵育，孵育的时候要添加适量的甲酰胺，收集其浸出的液体，进行液体吸光值的具体有效计算。对照组小鼠确定伊文思蓝的具体浓度值；最后进行小鼠肺组织的有效观察，进行肺下叶的正常染色，观察其病理变化情况，利用相关分析软件确定出细胞PMN的平均值。
1.3 观察项目和指标 （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾细胞中IFN-γ的基因表达能力[2]。
1.4 统计学处理 所得数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P
2 结果
观察组小鼠上清液中IFN-γ的含量明显低于对照组，IL-4含量明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P
3 讨论
急性肺损伤是一种各种致病因素引发的广泛肺泡毛细血管损伤，以致炎因子释放、中性粒细胞浸润、广泛肺泡毛细血管损伤为特征，临床以难以纠正的低氧血症及进行性呼吸困难为主要表现，急性严重肺损伤，在临床被定义为急性呼吸窘迫综合征[3]。如何对肺损伤过程中肺泡受损毛细血管保护并修复，是肺保护的重点。ALI的发生发展，由机体过度炎症反应参与介导[4]。危重病医学会在2001年将机体过度炎症反应定义为全身炎症反应综合征，其后果为破坏机体自身组织。机体内源性抗炎症反应伴随炎症反应的发生，呈增强趋势[5]。Bone等[6]将此种抗炎症反应按抗炎症反应综合征概括，其引发的后果是脓毒症及免疫功能低下，故不管哪方占优势，ALI病发中，促炎及抗炎反应失衡均为本质原因。故针对检测的促炎、抗炎反应失衡的程度和方向，应用不同的措施干预，使双方动态平衡恢复，是对ALI防治的关键。但对促炎、抗炎双方平衡的相关性评价，目前临床尚无有效评估指标。有研究显示，Th细胞，可反映双方平衡关系，Th1细胞以对促炎细胞因子分泌为特征，与促炎反应有密切相关性；Th2细胞以对抗炎细胞因子分泌为特征，与抗炎反应有密切相关性[7-9]。IFN-γ、IL-4为特征性细胞因子，分别由Th1、Th2细胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情况。
有研究示，取LPS、FNLP经腹腔注射后，肺湿重与干重比、肺伊文斯蓝浸出量、肺病理改变均提示成功建立ALI模型[10]。对脾细胞中IL-4、IFN-γ变化进行观察，结果相较对照组，BLAB/C小鼠在ALI时，脾细胞中IFN-γ呈近60%的下降，而检测IL-4，呈4倍多的升高。此与蒋雄斌等[10]报道一致，但IL-4升高更为明显。
IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡变化的典型细胞因子，此种变化表明，在ALI发生时，Th1漂移至Th2。目前研究显示，Th1飘移至Th2，与下列因素可能相关。（1）LPS结合单核巨噬细胞表面CD14受体，对TNFα、IL-1等炎症细胞因子释放，同时伴随大量抑制介质前列腺素E2的释放，经PGF2依赖性通道，促使Th细胞向Th2表型明确转化。PGE2可对Th1合成IFN-γ、IL-2明显抑制，却对Th2生成IL-4不影响[11]。（2）与炎症介质IL-6、IL-1、TNF-α的释放伴发，糖皮质激素有增加表现，糖皮质激素可对Th1细胞核转录抑制因子合成增加产生刺激，此因子与核因子结合，促使复合物形成，从而对炎症细胞因子的基因转录阻止[12]。此外，糖皮质激素，可影响炎症细胞因子相关基因转录。
对脾细胞中的IFN-γmRNA表达进一步观察得出，ALI时IFN-γmRNA表达下降明显，IL-4m RNA表达量显著升高。提示ALI时，可在mRNA水平上使促炎细胞因子IFN-γ的表达抑制，抗炎细胞因子IL-4的表达增加，从而引发促炎、抗炎失衡。
Th1向Th2飘移，表明抗炎症反应在ALI发生时，呈增强趋势，而抗炎症反应的增强，诱导机体细胞免疫功能出现低下。故可通过对Th1、Th2平衡变化检测，选择适当的时机，针对免疫功能低下，采取有效的免疫调节措施，使促炎、抗炎平衡恢复，对ALI进行防治。促炎与抗炎反应失衡，为诱导急性肺损伤发生的本质原因，对促炎与抗炎反应失衡准确评估有较大难度[13]。T辅助淋巴细胞可反映机体炎症反应的免疫功能状态。
在受到严重的创伤之后，伤口是容易感染的，而在感染之后，伤口处容易出现各种病毒和细菌，会严重损害人们的身体健康。相关研究结果证明，急性肺损伤与体内炎症反应不平衡相关，会导致机体促炎、抗炎反应不平衡[14]。机体内各类脾细胞当中，存在很多促炎细胞和抗炎细胞，比如干扰素和白介素等，只有保证这两种因子平衡，才能保证两种细胞平衡[15]。当发生急性肺损伤，机体炎症反应规律是不明确的，各种细胞的反应情况也是不明确的，本文主要通过对急性肺损伤小鼠的功能试验研究，反应急性肺损伤机体炎症反应情况。
相关研究结果表明，在急性肺损伤研究当中，观察机体炎症反应是比较重要的，因为在肺损伤的过程中，会产生伤口感染从而引起伤口炎症出现[16]。因此，通过肺损伤相关部位抗炎反应及能力的检测和观察，就可以判断急性肺损伤病情。本文主要通过小鼠淋巴细胞试验，对小鼠急性肺损伤的相关平衡因子和基因表达功能进行检测，最终发现，机体抗炎反应在急性肺损伤中的作用非常大，而T辅助淋巴细胞对小鼠体内这种抗炎反应的调节和控制作用也比较大，在急性肺损伤疾病临床研究中的意义比较大。急性肺损伤机体抗炎反应主要表现为单核细胞的有效受体结合、抗炎因子的生成和细胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4两大因子的有效合成和转化、IL-10因子的生成和增加、糖皮质激素的不断增加及脾细胞因子的异常转录等[17]。经过对小鼠体内T辅助淋巴细胞功能变化的有效观察可以判断急性肺损伤小鼠的病理学变化情况，急性肺损伤小鼠脾细胞mRNA表达能力比正常小鼠弱很多，证明抗炎反应是导致急性肺损伤的主要原因。
本研究结果表明观察组小鼠上清液当中IFN-γ的含量明显比对照组低，IL-4含量却比对照组高，且经过逆转录测定结果显示，观察组小鼠体内脾细胞IFN-γ基因表达能力明显比对照组低，以上比较差异均有统计学意义（P
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篇9
【摘要】 目的 本研究检测食管癌、贲门癌患者的免疫功能，寻找肿瘤患者的病情量化指标，用来预测和判定临床治疗效果。方法 采集本院胸外科手术前的食管癌贲门癌患者115例及359例正常体检者的血液标本，应用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞表面CD3、CD4、CD8及NK细胞（CD56）的表达。结果 食管癌、贲门癌组与健康对照组相比较CD3、CD4有明显下降（P＜0.05），而CD8、CD56有明显的增高（P＜0.05）。将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴转移组，两组间CD3、CD4、CD8、CD56的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 食管癌外周血T细胞免疫检测有助于了解疾病的发展进程。
【关键词】 食管癌；贲门癌;T淋巴细胞亚群；NK细胞；CD3；CD4；CD8；CD56
现代肿瘤免疫学研究表明，肿瘤的发生和发展同机体免疫系统功能异常存在密切关系，而抗肿瘤免疫主要以细胞免疫为主，其中胸腺依赖性淋巴细胞即T淋巴细胞又是细胞免疫系统的关键组成部分〔1〕。机体内的T淋巴细胞能识别肿瘤细胞，在接受肿瘤细胞刺激后，转化为能攻击和杀伤肿瘤细胞的致敏淋巴细胞，有着免疫监视机能。一旦这种监视机能遭到破坏，患肿瘤的危险就将增加。免疫功能正常与否，直接关系到肿瘤的发生、发展和预后。因此对于T淋巴细胞的研究越来越受到免疫学界和医学界的重视，成为近年来的研究重点。食管癌是目前我国发病率较高的恶性肿瘤之一，本研究就是通过对食管癌贲门癌患者外周血T淋巴细胞以及NK细胞相关指标的检测，来探讨食管癌贲门癌患者T淋巴细胞及NK细胞功能同食管癌贲门癌发生和发展的关系，以便临床上监测食管癌人群的免疫状态，对其免疫治疗具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 标本来源
标本来自河北医科大学第四医院2006～2007年间搜集的115例食管癌患者，包含发生转移56例，未发生转移59例，患者平均年龄60岁，男87例，女28例。食管癌患者在采样前均未经手术、放疗、化疗等方法治疗。正常体检者血液标本359例作为正常对照组，其中男151例，女208例，平均年龄53岁。采集静脉血2 ml，EDTAK2抗凝。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞的免疫荧光标记
取抗凝全血0.1 ml，加入鼠抗人单克隆CD3FITC/CD56PE，CD4FITC/CD8PE；双标记抗体20 μl，（美国，BECKMAN COULTER公司生产，克隆系CD4：13B8.2，CD8:B9.11），室温孵育30 min。在免疫荧光制备仪上裂解红细胞后，流式细胞仪检测各亚群百分比。
1.2.2 流式细胞仪检测条件及参数
采用美国Beckman Coulter公司生产的EpicsXLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。
1.3 统计学处理
应用SPSS11.5统计软件包，进行t检验、单因素方差分析。
2 结果
免疫功能检测结果：经单因素方差分析发现4个指标（CD3、CD4、CD8、CD56）在癌症组与正常对照组间比较有统计学意义(P＜0.05)，见表1。将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组，经单因素方差分析发现4个指标（CD3、CD4、CD8、CD56）在两组间均没有差异(P＞0.05)，见表2。表1 癌症组与正常对照组免疫指标比较，表2 有无淋巴结转移组间免疫指标比较(略)
3 讨论
恶性肿瘤作为一种免疫功能异常所导致的疾病得到了医学界的广泛共识，恶性肿瘤患者机体的免疫调节作用及其效应网络大多处于一种相对紊乱的状态，其中包括机体多种淋巴细胞、细胞因子、黏附因子及共同刺激因子等众多因素中单个因素或多个因素的失衡，而细胞免疫的紊乱在肿瘤免疫中具有主导作用，因此近年来对于T淋巴细胞和NK细胞等细胞免疫的主要效应细胞的研究已经成为现代肿瘤免疫学研究的重点。CD3是成熟T淋巴细胞的共同分化抗原，表达于所有成熟T淋巴细胞的表面，代表组织和血液中总的成熟T淋巴细胞〔2〕。陈罡〔3〕等的研究发现，在肝癌组织中，肿瘤细胞产生的肿瘤特异性抗原刺激肿瘤特异性T细胞在肿瘤组织中聚集、成熟，使得肝癌组织中的CD3+T细胞数量明显高于肝硬化组织及正常肝组织。冯伟华〔4〕等的研究显示，在实体肿瘤和非实体肿瘤中患者外周血CD3+CD56T细胞测定值在实体肿瘤组显著低于非实体肿瘤组和健康组，非实体肿瘤组和健康对照组间比较无显著性差异。由于本次实验的研究对象为食管癌贲门癌，也是实体肿瘤的一种，加之又都是应用流式细胞术检测外周血，所以本文中CD3+的表达情况同冯伟华等的报道相一致。基于以上文献的报道和本次试验的结果推测，食管癌贲门癌这类实体肿瘤患者的外周血CD3+T淋巴细胞数量较正常对照组显著降低可能是由于恶性肿瘤细胞所产生的肿瘤特异性抗原趋化CD3+T细胞向肿瘤组织中聚集并发育成为成熟的T淋巴细胞从而发挥其特有的抗肿瘤免疫的作用，因为这种聚集的作用，使得外周血中表达CD3的成熟T淋巴细胞的数量显著减少。
CD56作为一种抗原标志，是220 kD糖蛋白，存在于外周血淋巴细胞及NK细胞表面，而不存在于中性粒细胞上，在人体内CD3-、CD16+、CD56+细胞的数量最多，约占外周血淋巴细胞总数的10%，表现出最强的NK细胞杀伤活性，CD3-、CD16-、CD56+细胞只占外周血淋巴细胞的5%以下，杀伤活性也较前一类细胞小〔5〕，本次试验的结果中显示，食管癌贲门癌组患者外周血CD56+细胞的数量显著多于正常对照组，将癌症组分为淋巴结转移组和无淋巴结转移组后比较，虽然两组间均值差异没有统计学意义，但是转移组较无转移组高的结果同孙文辉〔6〕等的研究报道相一致，这一现象的产生可能是随着肿瘤的进一步发展，刺激人体的免疫系统产生更多的NK细胞参与抗肿瘤免疫，但是，NK细胞的成熟需要IL2的刺激，而恶性肿瘤病人尤其是转移组mIL2R的结合表达率显著降低，与肿瘤患者体内存在封闭因子有关，随着病情的进展肿瘤本身产生的sIL2R可作为封闭因子与mIL2R竞争性结合周围的IL2，从而使与mIL2R结合的IL2减少，进而降低了IL2的生物学作用〔7〕。因此，不能发育成熟的NK细胞无法到达肿瘤组织中，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，而只能滞留在肿瘤患者的外周血中，造成食管癌贲门癌患者外周血表达CD56的细胞多于正常对照组。
CD4+Th细胞是人体抗肿瘤免疫的重要组成部分，它所产生的IL2、IL4、IL5、INFγ是诸如NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等重要的免疫细胞活化所必需的，另外CD4+Th细胞本身还可以通过INFγ介导的机制直接杀伤肿瘤细胞〔8〕，从以上的论述可以看出CD4+Th细胞在抗肿瘤免疫中的核心地位，所以CD4+Th细胞数量的减少和活性的降低有可能是机体抗肿瘤免疫功能下降的根基。
研究表明，T淋巴细胞活化需要2个信号，即T细胞活化不仅需要T细胞受体识别主要组织相容性复合物分子(第1信号)，还需要抗原递呈细胞(APC)表面的共刺激分子与其受体结合(第2信号)的共同作用，而CD28这个广泛表达于T淋巴细胞上的免疫蛋白超基因家族的成员正是扮演着这个第2信号的角色，CD8+T细胞根据CD28的表达与否分为细胞毒性T细胞(CD8+ CD28+)和抑制性T细胞(CD8+CD28-)，前者是重要的杀伤效应细胞而后者是不具有杀伤活性的免疫调节细胞。CD8+T细胞CD28表达受多种细胞因子调节，CD8+ CD28+T细胞的丢失和CD8+ CD28-T细胞积聚直接导致了CD8+T细胞杀伤肿瘤细胞功能的下降，因而是T细胞功能下降的标志〔9，10〕，这一观点得到了临床研究的证实〔11〕。
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篇10
【摘要】 目的： 观察茶多酚对人γδt细胞杀伤肿瘤细胞活性的影响和诱导人结肠癌细胞株（sw?480）凋亡和死亡的作用。方法： 在体外用不同浓度的茶多酚诱导人γδt细胞和sw?480细胞株，然后测定人γδt细胞杀瘤活性和对肿瘤细胞的作用。用不同浓度的茶多酚分别诱导sw?480细胞4 h后，弃含有茶多酚的培养液再继续培养24 h，然后测定其死亡和凋亡数，用γδt细胞作对照组。结果： 茶多酚浓度350 mg/l，作用γδt细胞4 h后能明显增强γδt细胞的杀伤肿瘤细胞活性，与未诱导组和其他浓度组相比，p<0.01；γδt细胞对经茶多酚处理后的sw?480细胞杀伤活性也明显高于对照组（p<0.01）。各种浓度的茶多酚分别与γδt和sw?480细胞作用4 h，弃诱导液再继续培养24 h后，均能诱导其死亡和凋亡，在茶多酚浓度350 mg/l、诱导时间4 h时最明显；同一浓度的茶多酚诱导sw?480细胞死亡和凋亡率明显高于γδt细胞组。结论： 茶多酚在一定浓度时能明显提高γδt细胞对肿瘤的杀伤活性；经茶多酚处理的sw?480细胞更易被γδt细胞杀伤。茶多酚浓度在350 mg/l时能诱导sw?480细胞凋亡而对人γδt细胞无影响。
【关键词】 茶多酚； γδ淋巴细胞； sw?480细胞株； 抗肿瘤活性； 凋亡
［abstract］ objective: to observe cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols and the direct effects of tea polyphenols on human tumor cells sw?480 cell strain death and apoptosis.methods： γδt cells and sw?480 cell strain were induced by tea polyphenols in vitro to examine cytotoxic activity of γδt cell and its direct effects on tumor cells. sw?480 was induced by tea polyphenols continuously for 4 hours following being cultured without tea polyphenols for 24 hours, then the rate of death and apoptosis of sw?480 were measured. γδt cell was used as control group. results： cytotoxicity of γδt cell induced by tea polyphenols with concentration of 350 mg/l was significantly higher than that of control group and other groups(p<0.01). cytotoxicity of γδt cell on sw?480 induced by tea polyphenols was higher than the control group(p<0.01).after being induced by tea polyphenols continuously for 1～8 hours following cultured without tea polyphenols for 24 hours, sw?480 showed significant cell death and apoptosis in different concentration comparing with the control group. tea polyphenols did not display significant effects on γδt cell. conclusion： tea polyphenols can significantly enhance cytotoxicity of γδt cell and the sw?480 induced by tea polyphenols was easily killed by γδt cell. tea polyphnols in certain concentration can induce cell death and apoptosis of sw?480, while it appears no cytotoxicity to γδt cell.
［key words］ tea polyphenols； γδt cell； sw?480；antitumor activity；apoptosis
茶是备受人们喜爱的饮品之一，而在茶叶中最具有药效作用的成分为茶多酚类物质。众多的体内外研究及动物实验证明，茶多酚有多种生物活性，其防癌抗癌、抗突变、抗氧化、抗衰老、抗菌等作用已有许多研究报道，在诱导肿瘤细胞凋亡中也具有重要意义［1-3］。γδt细胞是体内的固有免疫t细胞，它广泛分布于消化系统和呼吸系统上皮组织内；γδt细胞除了有与αβt细胞类似的一些功能特征外，识别抗原不需要mhc分子提呈，直接识别蛋白质和肽类抗原以及非肽类抗原，有抗原提呈作用，能通过细胞接触和分泌的细胞因子起免疫调节作用［4］。γδt细胞和茶多酚均具有抗消化道肿瘤作用，为了解两者有无相关性，我们用茶多酚诱导人γδt细胞和人结肠癌细胞株，观察在体外用不同浓度的茶多酚经不同时间诱导的sw?480细胞死亡和凋亡情况，并观察γδt细胞对sw?480杀伤活性的作用，现报告如下。
1 材料和方法
1.1 材 料
茶多酚，从市售龙井茶中制备，茶多酚纯度为77.0％； sw?480细胞株（上海细胞生物研究所）；胰蛋白酶、rpmi1640（gibco公司产品）；人ab血清（徐州市血站）；胎牛血清和淋巴细胞分离液（中国科学院血液病研究所）；异戊烯焦磷酸、四甲基偶唑蓝(mtt)(isopentenylpgrophosphate，ipp)、二甲亚砜(dms0)（sigma公司）；il2（厦门特宝生物公司）；抗人tcrγδfitc购自杭州联科生物（immunotech, france）；seac全自动酶免系列分析仪(北京希亚克技术有限公司)；流式细胞仪(美国bd公司的facscaliar)，分析软件为cellquest，每个标本分析细胞数≥1×104。
1.2 方 法
1.2.1 γδt细胞的培养和鉴定 按文献［5］方法取健康献血者末梢抗凝血10 ml,加入淋巴细胞分离液上，以2 000 r/min离心15 min，吸取单个核细胞层，用生理盐水洗涤3遍（1 500 r/min离心，10 min/次），加入含10%小牛血清、5%人ab血清和ipp 3 mg/l的rpmi1640培养液中，调整细胞数为1×108/l，置75 cm2细胞培养瓶中，于37℃,50 ml/l co2培养箱中培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10 d的细胞进行细胞表面标志检测和其他试验。
1.2.2 茶多酚对sw?480和γδt细胞生长的影响 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw?480细胞以每孔5×104个细胞分别接种于96孔板，用茶多酚(终浓度分别为100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)诱导，每组设5个复孔，细胞经茶多酚诱导4 h后弃诱导液加入含10%小牛血清的rpmi 1640，继续培养24 h后加入mtt（5 mg/ml）20 μl/孔，继续培养4 h，弃上清，加入dmso 150 μl/孔。混匀后在全自动酶标阅读仪上测各孔d值，根据测定数换算成抑制率。
1.2.3 γδt细胞和sw?480细胞凋亡检测 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw?480细胞以每孔2×105个细胞接种于6孔板，用茶多酚(终浓度分别为100,200,400,800,1 600和3 200 mg/l)诱导，每组设3个复孔。细胞经茶多酚诱导4 h后弃诱导液继续培养24 h，弃上清，sw?480细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，γδt细胞直接收集，用rpmi 1640培养液洗涤3遍，加入70%冷乙醇固定，4℃过夜。pbs洗涤3次，加入pi染液(生理盐水 129.6 ml，pi 10 mg，rna酶2 mg，tritonx?100 1 ml，枸橼酸钠200 mg，加双蒸水至200 ml)，4℃避光染色30 min，用fcm检测，记录激发波长488 nm处的红色荧光。
1.2.4 γδt细胞杀伤活性检测 取培养10 d的γδt细胞和对数生长期sw?480细胞均配成2×108/l，加入6孔细胞培养板中，每孔3 ml，培养24 h后加入不同浓度的茶多酚，同时设未加药的对照组，继续孵育24 h后，sw?480细胞用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞和直接收集γδt细胞，用rpmi?1640培养液洗涤3遍，将靶细胞sw?480细胞配成2×108/l，效应细胞γδt细胞配成2×109/l的悬液，用本室建立的乳酸脱氢酶释放法［6］测定γδt细胞杀伤活性，将效靶细胞数按10∶1比例混合，以500 r/ min离心5 min，置37℃,50 ml /l co2培养箱中孵育6 h后，轻轻混匀细胞，再以1 500 r/min离心10 min。收集上清液在全自动生化分析仪（olympus au1000）340 nm波长下测定光密度值d）。
杀伤活性=实验组d值-效应细胞自然释放组d值靶细胞最大释放组d值-靶细胞自然释放组d值×100%
1.3 统计学处理
采用stata8.0软件，数据以±s表示，用χ2检验比较γδt细胞和sw?480细胞凋亡率有无统计学意义。
2 结果
2.1 γδt细胞形态学观察和纯度鉴定
pbmc在γδt细胞培养基中培养24 h即可见贴壁生长，48 h后集落开始变大，培养10 d可见大的集落和单个贴壁生长细胞，单个细胞可见细胞呈条梭状，也有小量呈浮悬生长细胞。收集培养前后细胞进行mab荧光标记后经流式细胞术检测并分析结果。见图1，培养前γδt细胞数为4.21%；培养10 d时γδt细胞数为70.35%。
图1 pbmc 培养前后γδt细胞百分率表达（略）
fig 1 percentage of γδt cell and expression before and after cultured by pbmc
2.2 不同浓度茶多酚诱导后的γδt细胞和sw?480细胞凋亡率
结果显示，经茶多酚诱导4 h弃诱导液继续培养24 h后，茶多酚浓度在350 mg/l时引起γδt细胞凋亡率为7.88%，显著低于sw?480细胞（24.76%），见图2。其他浓度均有明显差异（表1）。
图2 茶多酚在350 mg/l时诱导的γδt细胞和sw?480细胞株凋亡率（略）
fig 2 figure of apoptosis of γδt cell and sw?480 cell lines which were induced by tea polyphenols(350 mg/l)
表1 不同浓度的茶多酚对γδt细胞和sw?480细胞凋亡的影响（略）
tab 1 effect of various concentration tea polyphenols on the apoptosis of γδt cell and sw?480
a：与同一药物浓度作用的γδt细胞比较， p<0.05；b：与同一细胞的对照组比较， p<0.05
2.3 茶多酚对γδt细胞和sw?480细胞株杀伤活性的影响
在实验中发现经茶多酚作用4 h时γδt细胞杀伤活性最高，因此本实验选择该时间为作用时间。γδt细胞经茶多酚(350 mg/l)作用后，杀伤sw?480细胞活性显著高于其他浓度组，与对照组和其他浓度组相比较，p<0.01。结果见图3。
图3 茶多酚对γδt细胞杀伤活性的影响（略）
fig 3 effect of cyctotoxic activity of γδt cell
2.4 茶多酚对γδt细胞和sw?480细胞的抑制率
见图4。茶多酚浓度在400 mg/l之内对两者均没有明显的影响，随着浓度升高γδt细胞组死亡率显著高于sw?480组，p<0.01，而sw?480变化不明显。
图4 不同浓度茶多酚对γδt细胞和sw?480的抑制率（略）
fig 4 effect of various concentration tea polyphenols on the inhibitory tatio of γδt cell and sw?480
3 讨论
茶多酚是茶叶中的主要成分，约占茶叶干重30％，具有防癌和诱导肿瘤细胞凋亡作用。但其诱导不同的肿瘤细胞凋亡结果却不相同，可能与其调控某些肿瘤细胞的致癌基因／抑癌基因的表达以及其他机理有关，如对c?fos和c?myc基因的调控上的差异，致使其对癌细胞生长抑制和诱导凋亡上有所不同。其防癌作用主要是通过抗氧化和消除自由基，抑制亚硝基形成反应，调节致癌原代谢酶等［4］。直接抗癌作用的研究近年来也有重大进展，许多体外试验表明，茶多酚能抑制多种肿瘤细胞包括肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、上皮细胞癌和黑色素瘤等的生长［7-9］，甚至直接杀伤这些肿瘤细胞。
自1990年从肺癌肿瘤浸润淋巴细胞（tils）中分离出γδτ细胞，并发现这些细胞对新鲜的自体肿瘤细胞和k562细胞有高效杀伤活性以来，许多研究证实了在直肠癌、肾癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等实体瘤的til中存在有γδτs细胞，并具有抗肿瘤作用［10-13］。
γδτ细胞杀伤肿瘤细胞的机制与ctl细胞和nk细胞相似，主要通过穿孔素、颗粒酶和fas/fasl途径起作用。然而γδτ细胞对肿瘤细胞的识别方式还不完全清楚，通常γδτ细胞对肿瘤细胞的识别大多数是mhc非限制性的，主要是通过nkg2d识别肿瘤细胞表达的mica,micb,ulbpi?3,mhcⅰb类蛋白和f1?atp合酶等配体。corvaisier等［14］研究也证实，对肿瘤细胞的识别还与肿瘤细胞上γδtcr刺激物（如甲羟戊酸途径代谢物?ipp）产生和icam?1表达密切相关。我们的实验也表明，从人外周血分离培养出的γδτ细胞对消化道系统常见肿瘤细胞均有较强的杀伤作用。zheng等［15］给已建立的鼻咽癌裸鼠注射正常人γδτ细胞两次，每次5×107，可见肿瘤明显缩小和生存期延长，且与注射次数相关，免疫组化结果证实肿瘤内有局部坏死，注射的γδτ细胞在瘤内聚积。戴梦华等［16］用人胰腺癌外周血经抗人tcrγδτ单抗包被扩增的γδτ细胞注入已建立胰腺癌的裸鼠腹腔内，发现γδτ细胞具有显著的抑瘤作用。朱忆期等［17］用自身外周血培养的γδτ细胞治疗4例胃癌术后患者，随访10～25个月未见复发。γδτ细胞体内应用除直接杀伤肿瘤细胞外，还可以通过与nk细胞和dc相互作用以及释放出抗肿瘤免疫中的关键分子ifn?γ来启动抗肿瘤免疫细胞网络来实现持续的抗肿瘤免疫应答［18,19］。为了解茶多酚与人γδt细胞的关系，我们应用茶多酚诱导人γδt细胞和sw?480细胞株，发现经诱导的γδt细胞对肿瘤细胞的杀伤活性明显增高，含量在350 mg/l时增高最为显著，与对照组和其他浓度组比较均有显著性差异，当茶多酚浓度＜50 mg/l和＞500 mg/l时作用明显降低。这一结果说明茶多酚对人γδt细胞的用量有一个最适浓度或“浓度窗”(concentration window)现象，这一点在设计实验和临床应用时要加以注意。
本组实验结果提示，茶多酚在一定浓度和条件下能诱导sw?480细胞死亡和凋亡。我们用各种浓度的茶多酚在持续作用sw?480细胞实验中，作用时间达48 h，茶多酚的浓度增加至3 200 mg/l时均不能明显诱导出sw?480细胞死亡和凋亡，此时对照组（γδt细胞）死亡率明显增加；而作用1～8 h后再继续培养24 h即能明显致sw?480细胞死亡和凋亡。可能原因是，茶多酚影响了肿瘤细胞的生长周期，使肿瘤细胞生长阻滞在g0／g1［20］，当除去诱导剂后，细胞开始增殖，受损的细胞逐渐死亡。另外，由于茶多酚中混有多种成分，可能有的成分能诱导sw?480细胞死亡或有凋亡的信号，而有的成分能阻断其作用，待将茶多酚成分洗弃后，这些死亡或凋亡信号继续作用而致细胞死亡和凋亡。因此要搞清其机理，有必要筛选出茶多酚粗提物中的确切有效成分。
以上结果表明，茶多酚可以诱导sw?480细胞死亡和凋亡,茶多酚持续作用不如短时作用后弃诱导液继续培养24 h对sw?480细胞致死和凋亡作用明显。γδt细胞经茶多酚作用4 h后能明显提高其对sw?480细胞的杀伤活性，提示茶多酚对消化系统大量存在的γδt细胞杀伤肿瘤细胞功能有增强作用。然而茶多酚诱导肿瘤细胞死亡、凋亡和提高γδt细胞杀伤性机理仍不十分清楚。是否与其抑制sw?480细胞多聚酶作用［21］和诱导其凋亡有关还是其他因素致使γδt细胞对sw?480细胞杀伤易感性增加所致仍有待研究。因此，开展这方面研究对茶多酚药用价值的开发和临床应用具有重要意义。
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