细胞自噬范文
时间：2023-04-04 16:39:15
导语：如何才能写好一篇细胞自噬，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
细胞内损伤物质的积累是所有衰老细胞的普遍特征，能导致生命有机体生存能力降低。细胞自噬能够降解受损蛋白质和衰老或损伤细胞器等细胞结构，是细胞内主要的异化途径，参与衰老以及与衰老相关的各种病理过程。近年来研究发现，衰老进程中，细胞自噬活动下调，而对各种长寿突变体的研究表明自噬活动是寿命延长所必需的，多种自噬相关基因或蛋白直接受长寿途径的调节〔1～5〕，这些发现都支持细胞自噬是各种真核生物衰老非常重要的调节机制。
1 衰老进程中自噬活动下调
近年来的研究发现，与年龄相关的细胞自噬活动下降能影响细胞功能，引起各种衰老表现。在哺乳动物衰老过程中巨自噬和分子伴侣介导的自噬活动(CMA)下降〔6，7〕，CMA的效率降低，将受损蛋白结合在溶酶体膜上及转运进入溶酶体的活动明显减弱。CMA是通过以热休克蛋白70(HSP70)为主的分子伴侣，特异性的识别结合被降解的蛋白，然后在溶酶体膜上的受体LAMP2A(Lamp2A)作用下，转运到溶酶体内进行降解的过程。研究发现衰老过程中CMA效率的降低是由于溶酶体膜上的受体LAMP2A表达随着衰老进程进行性地减少造成的。进一步的研究表明〔7〕，在转基因鼠中阻止衰老引起的LAMP2A的表达减少，即使在老龄的细胞中，CMA依然保持活跃的功能，尤其重要的是，CMA功能的维持与减低细胞内有害蛋白的积累和改善肝功能密切相关。除了CMA，衰老过程中哺乳动物组织细胞的巨自噬活动可能也受到抑制，大量的研究表明，衰老能够影响巨自噬活动，尤其是影响巨自噬对功能缺陷的线粒体的降解〔3，8〕。对线虫的研究发现两种自噬基因沉默的野生型线虫和DAF2突变体的寿命会缩短〔9〕。另外，对其他真核生物，如酵母、果蝇等的研究也观察到了自噬对衰老的调节作用〔10〕。对拟南芥研究发现，剔除自噬相关基因(Atg)Atg7、Atg4和Atg9，植物能正常生长，但是却加速叶片衰老，增强对病原菌和碳饥饿的超敏反应〔11〕。
2 自噬活动增强具有抗衰老作用
细胞自噬通过保证细胞蛋白质组稳定和细胞器更新能阻止或者减缓细胞衰老进程。有研究认为抗脂药物的抗衰老作用可能是基于细胞自噬活动的增强〔12〕。用雷帕霉素或者海藻糖处理增强自噬的降解作用，可能对帕金森综合征等蛋白沉积性疾病模型具有治疗作用〔13〕。最近研究表明，一种p62蛋白在通过自噬摄取泛素化蛋白聚合物的过程中具有关键作用，p62能与聚泛素化蛋白结合形成聚合物，也能与自噬效应蛋白LC3 （LC3）相互作用，介导自噬对蛋白聚合物的摄取。p62缺乏能引起小鼠肝细胞和神经元细胞蛋白聚合物的沉积〔14〕。
线虫是细胞衰老和长寿研究常用的模式生物之一〔5〕。研究发现，线虫DAF2功能缺失突变能够诱导成虫表现出滞育样的代谢变化，明显延长线虫的寿命。而线虫与哺乳类Beclin1基因同源的自噬基因bec1是线虫DAF2功能缺失突变体耐受态形成和寿命延长所必需的，显然线虫耐受态的形成和寿命的延长与自噬率的增加有关〔15〕。在线虫或者哺乳动物，限制热量都是延长寿命的研究中常用的实验手段。限制饮食的过程中能诱导自噬的发生，抑制自噬对进食充足线虫的寿命没有影响，而影响限制饮食线虫的寿命，自噬对饮食限制的反应受到转录调节。同时还发现，寿命延长除了需要诱导自噬发生，还需一种转录因子DAF16/FoxO的表达，研究者认为自噬为细胞提供新的物质来源，而转录因子DAF16/FoxO负责将这些原材料转化为保护性的蛋白以延长线虫的寿命〔16〕。
另外有研究认为自噬激活的水平对线虫寿命的调节具有重要的作用，在生理水平下，能够促进生存，而低于或者超过生理水平都引起线虫的死亡〔17〕。对线虫的研究还发现，在DAF2突变体中自噬的增加能够增强对β淀粉样蛋白的降解，以对抗衰老过程线虫细胞淀粉样物质积累引起的蛋白毒性〔18〕。
3 长寿途径与自噬的调节
随着在细胞水平上自噬对衰老调节作用的认识，人们开始进一步在分子水平上探讨调节自噬和衰老的信号通路之间是否存在联系。近年来，对于调节自噬降解活动的信号通路有了一定的认识，尤其是mTOR信号通路和Beclin 1的调节作用。而且研究发现调节抗逆境和抗衰老进程的长寿途径，如FoxO3，NFκB，p53 和 SIRT1等对自噬活动也具有有力的调节作用。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，连接胰岛素、生长因子等上游信号对Atg1复合物等下游效应物的作用，是自噬的负调控因子〔19〕。NFκB信号系统是细胞对抗细胞损伤和环境伤害的防御机制诱导的重要信号通路，研究发现，NFκB信号通路通过激活mTOR激酶而抑制肿瘤坏死因TNFα诱导的自噬，或者通过下调Beclin 1和Atg5的表达抑制巨自噬活动。NFκB信号通路与自噬之间存在交叉对话，激活NFκB的上游激酶IKKβ和NIK都是自噬作用的靶蛋白〔20，21〕。
SIRT1是哺乳动物的一种沉默因子，是酵母Sir2蛋白的同源物，Sir2蛋白是公认的酵母抗逆和长寿因子，转录因子FoxO家族是调节细胞代谢、增殖和抗逆的重要因素，线虫FoxOs就是调节耐受态形成和寿命极限的主要因素〔15〕。最近的研究发现STRT1和FoxO3相关的信号通路参与对哺乳动物自噬的调节。研究表明，在体外培养的细胞或者转基因鼠体内，SIRT1能够激活自噬作用，SIRT1/转基因鼠的一些表型和Atg5/小鼠相似。研究还发现，SIRT1与自噬蛋白Atg5，Atg7 和Atg8的去乙酰化有关，表明长寿基因sir2和自噬降解过程的相关性。最近有研究发现，FoxO3能够诱导LC3和Bnip3等激活自噬活动的蛋白表达，而促进细胞降解作用，维持生物体的能量代谢〔22〕。
机体细胞脱离衰老过程可能会发生癌变，p53是一种抑癌基因，它的失活能引起肿瘤发生。p53对自噬作用跟细胞状态有关，有研究发现，p53能抑制mTOR信号通路诱导自噬发生〔23〕，相反另一研究发现，p53表达下调能够激活细胞的自噬活动〔24〕。对携带p53活性片段的转基因鼠的研究发现，可能是由于细胞自噬的抑制和细胞凋亡诱导而表现出早老症状，而携带完整的p53及其等位基因和Arf的转基因鼠，能够激活p53的表达，使p53表达适度增加，但是却表现出衰老延迟。由此推测可能p53Arf信号通路诱导p53在特定位置表达的适度增加能够抑制mTOR，激活自噬，而p53的过量表达或者乙酰化增加活性增强，却抑制自噬，表现出早老的症状〔25〕。
4 结论与展望
近年来人们开始关注自噬对生物体的生理和病理影响，同时，对于衰老过程的分子调节机制也有了进一步的认识。自噬对于衰老进程以及衰老相关的疾病都具有调节作用，适度激活自噬能够延缓衰老，而且调节自噬和衰老的信号通路之间存在交叉重叠。对于二者相关性的研究有助于延缓衰老，并为蛋白沉积性疾病的治疗提供了新的治疗方向。虽然，对于自噬和衰老的相关性有了一定的认识，但是怎样在衰老细胞中诱导适度的自噬活动延迟衰老进程、氧化应激在衰老进程中是否对自噬具有抑制作用、SIRT1是否通过自噬作用延长寿命以及增强自噬活动的药物是否对蛋白沉积性疾病具有疗效等很多问题仍有待于进一步的研究。
参考文献
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篇2
2016年的诺贝尔生理学或医学奖日前已经揭晓。在273位被提名的科学家中，日本科学家大隅良典（日文：大隅良典/おおすみよしのり；英文：Osumi Yoshinori）最后折桂，北京时间10月3日17：30分，诺贝尔基金会宣布将2016年的诺贝尔生理学或医学奖授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反应（autophagy）领域做出的卓越贡献。
大隅良典，是日本分子细胞生物学家。他1945年生于日本福冈县，1974年获东京大学博士学位。在美国纽约洛克菲勒大学度过三年之后，他回到东京大学，并于1988年建立了自己的研究团队。现年71岁的大隅良典现任日本综合研究大学院大学名誉教授、基础生物学研究所名誉教授，大隅良典的专长是生物学，特别是分子生物学领域，其最知名的成就，是阐明细胞自噬的分子机制和生理功能，是细胞自噬研究的先驱。今年7月11日大隅良典在《Developmental Cell 》上宣布：他们成功探明了细胞自噬（autophagy）的启动机制，这对预防和治疗由细胞自噬引发的多种疾病有重要意义。
诺贝尔生理学或医学奖评选委员会在10月3日的新闻公报中指出，大隅良典的研究成果有助于人类更好地了解细胞如何实现自身的循环利用。在适应饥饿或应对感染等许多生理进程中，细胞自噬机制都有重要意义，大隅良典的发现为理解这些意义开辟了道路。
细胞自噬是近年来热门研究领域，词语“autophagy”源自希腊词语“auto-”和“phagein”，前者意思是“自我”（self），而后者的意思则是“去吃”（eating），而“自噬”表示的字面意思是就是“自己把自己吃掉”（self-eating），实则是一种细胞自身成分降解和循环的基本过程。通俗地说，细胞可以通过降解自身的非必需成分来提供营养和能量，也可以降解一些毒性成分以阻止细胞损伤和凋亡。
正是通过大隅良典等科学家的不懈努力，现如今我们知道：细胞自噬是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的生命现象，是细胞在缺氧、饥饿等应激条件下通过自我分解受损、变形或失去功能的蛋白质和细胞器以维持细胞内环境的稳态和基因组稳定性的一种方式，有利于使细胞在生长或环境改变导致的应激和压力条件下获得生存优势。它既是细胞的一种自我保护机制，也是一种与凋亡并列的程序性死亡机制。
发现细胞自噬机制的艰难历程
在大隅良典等科学家的不懈努力下，今天我们对细胞自噬有了一定的了解，可是，搞清细胞自噬机制却历经了很多坎坷。
上世纪中期，科学家发现，细胞能将自己内部的多余的蛋白质和细胞成分打包在一起用膜包起来（也被称为“自噬体”），形成囊泡并运送到溶酶体（细胞中的小隔间，可以降解细胞成分），从而将其降解。打个比方，就好像打包好自己家的垃圾，通过垃圾车拉走，送到了垃圾回收站。
研究人员发现，正常大鼠肝细胞中存在包含退化细胞质的膜结构，但其丰度在灌注胰高血糖素之后或暴露于有毒物质之中时会大幅提升。在认识到这种结构具有消化细胞内部分内容物的能力后， 1963年，克里斯汀？德・迪夫创造了“自噬”这个词，并在发表的文章中广泛讨论了这个概念。
几年后，基于电子显微镜的观察结果，科学家发现了哺乳动物细胞中也存在这种自噬现象。研究人员接下来发现：自噬现象本身处于低水平状态，但在各种组织包括脑、肠、肾、肺、肝、前列腺、皮肤和甲状腺的分化和重塑期间，这种现象加剧。此外，除了单细胞真核生物中存在自噬现象，在阿米巴原虫、眼虫、四膜虫、昆虫和青蛙等后生动物中也发现了这种机制。
在随后的几十年里，该领域的进展有限，其作用机制和规律并没有得到很好的理解。当时人们还弄不明白细胞为什么要这样做，以及我们人类细胞是否也存在这样的行为。
直到上世纪90年代初，近30年过去，许多根本性问题仍无法确认：自噬过程是如何启动的？自噬体是如何形成的？自噬对细胞和有机体的存活有多重要？自噬在人类疾病中扮演什么角色？大隅良典的工作显著改变了人们对这一重要细胞过程的理解。
相关专家介绍，大隅良典的重要成就是利用酵母开展实验，发现了对细胞自噬机制具有决定性意义的基因。基于这一研究成果，他随后又阐明了自噬机制的原理，并证明人类细胞也拥有相同的自噬机制。
20世纪90年代，大隅良典带领其研究团队以酵母菌作为生物细胞的模板在研究细胞自噬的启动和进展过程获得重大突破，证明了酵母菌内存在细胞自噬现象，找到了识别和描述细胞自噬过程中重要基因的方法，并确认了细胞自噬机制上的15个起关键作用的基因。
大隅良典用面包酵母作为模型系统研究自噬，在检验了酵母细胞中确实存在自噬现象后，他开发出一种方法，能够识别和鉴定涉及这些过程的关键基因，他将第一个发现的突变基因命名为自噬基因1（APG1），随后报告了一系列真核细胞自噬机制必不可少的基因，命名为APG1-APG15。随着在酵母和其他物种中鉴定出的新自噬基因，ATG作为基因缩写命名在此后的学术研究中得到统一使用。
1993年，大隅良典发表了他在酵母15个基因中的开创性发现。随后，他在酵母和哺乳动物细胞中克隆了这些基因并阐明了编码蛋白质的功能。
在接下来的几年中，大隅良典克隆了ATG基因，并描述了一系列蛋白质产物的功能，包括在实验室证明自噬能参与调解细胞物质合成、降解和重新利用之间的代谢平衡，影响生物生命过程特别是响应饥饿等方面的作用。
基于大隅良典的开创性发现，自噬在人体生理和疾病中的重要性现在获得了广泛认可。同时，大隅良典的先驱性研究激起科学家对自噬的巨大兴趣。该领域已成为生物医学研究的最热门领域之一，自2000年起相关出版物的数量显著增加。
2001年，东京大学的生物化学与分子生物学教授Noboru Mizushima报道了Atg5的功能，这被认为是哺乳动物分子机制研究的第一环。2003年，以酵母的自噬相关基因为标准进行了统一命名，以“autophagy”中的字母ATG命名，后面加数字以区分不同的基因。2005年，密歇根大学生物化学家的Daniel Klionsky创办了第一本自噬杂志。2016年，东京大学的研究团队发现了Atg13在自噬启动复合物中起到重要调节作用。
如何通过细胞自噬机制治疗疾病
感谢研究者Yoshinori Ohsumi和其它从事后续研究的科学家们，如今我们知道，自噬能够控制细胞中重要的生理学功能，细胞中的组分需要被降解并且回收利用，而自噬作用就能够快速提供能量并且为细胞组分的回收利用提供基本的构件，同时自噬对于细胞对饥饿及其它压力的反应也至关重要。
自噬过程是将细胞内代谢废物以及一些无用或有损伤的细胞器装到其独特的运输工具――自噬小体中，然后沿着特定路线送到“垃圾加工厂”――溶酶体中进行回收和废物再利用。
通过自噬，细胞可以实现以下几种情况的动态调节：（1）在细胞能量匮乏时降解自身的非必需成分来提供营养和能量；（2）降解细胞内的毒性成分以阻止细胞损伤和凋亡；（3）在饥饿、缺氧或细胞损伤等特殊情况下启动应对压力的促存活通路。与细胞凋亡相比，细胞自噬更接近于逆境中的自救措施，维持了细胞的基本生命活动。
在细胞面对饥饿和其它种类的应激时，“自噬”发挥着不可或缺的作用，好比“食堂”、 “净化器”、 “兵工厂”、 “垃圾回收站”。“食堂”：细胞自噬能快速提供燃料供应能量，或者提供材料来更新细胞部件。“净化器”：有研究发现，在肿瘤发展的早期，“自噬作用”通过减少细胞内“垃圾”（过氧化物）而维持细胞内环境的稳定，抑制肿瘤形成。相反自噬功能降低，会增加致癌风险。“兵工厂”：在遭受感染之后，细胞自噬能消灭入侵的细胞内细菌活病毒。“垃圾回收站”：细胞还能利用自噬来消灭受损的蛋白质和细胞器，这个质检过程对于抵抗衰老带来的负面影响有举足轻重的意义。
“自噬”是把双刃剑，由“自噬基因”来掌控。如果自噬功能紊乱可能会引发神经系统疾病、自身免疫病、衰老、感染甚至是恶性肿瘤。而即使自噬功能正常，也可能对人体不利。当癌症患者接受了放化疗后，自噬系统可能救活奄奄一息的癌细胞，使癌症无法根治。偶尔它可能又会热心过度，去除一些重要细胞，完全不理会这样做是否符合生物体的整体利益。所以掌管着“自噬”各个阶段的“自噬基因”就显得尤为重要了，人们也正在进行紧张的研究以开发药物，希望能够自由地掌控这把“双刃剑”。
近年来科学家发现，细胞自噬作用与生物发育以及许多人类疾病，如衰老、肿瘤、感染与免疫、心血管疾病、肌肉病变及神经退化性疾病等密切相关。 应该说细胞自噬受到热捧的一个很重要原因就在于其与疾病的关联。复旦大学附属华山医院内分泌科的研究指出，作为基础性研究的“自噬”会从多方面对相关研究产生影响。
针对癌症的治疗
自噬在治疗癌症的方面有很大前景，如果细胞的自噬系统出了问题，正常细胞可能会转化成癌细胞。如果我们能知道怎么控制细胞自噬过程，也许就能让一些早期癌变的细胞通过加剧自噬的程度，让这些细胞凋亡以免发展成为癌症；另外还可以通过抑制癌症细胞的自噬，配合其他综合干预措施后，癌症细胞就会因为缺乏营养而死掉。
针对包括帕金森症在内的一些神经系统退行性疾病的治疗
人体的神经细胞不可再生，自打出生以后就是那么多，所以神经细胞能不能长寿，自噬细胞起到了关键作用。如果不能有效清除垃圾，就有可能造成帕金森氏病、阿尔兹海默症，这些病都跟神经细胞的不正常死亡有关。如果有办法可以控制神经细胞的自噬过程，那么就可以及时清除神经系统的垃圾，从而延缓、改善甚至逆转疾病。
2013年的一项研究就指出一种与细胞自噬作用相关的基因若出现异常，会导致一种罕见的脑病。这种罕见脑病被称作“伴随成人期神经退行性变性的儿童期静态脑病”（SENDA），患者大脑萎缩并伴随认知障碍。当时参与研究的科学家指出，自噬作用的异常，比如负责运送蛋白到溶酶体的自噬CMA过程出了问题，都有可能导致认知障碍。
针对糖尿病的治疗
有观点认为，绝大多数1型糖尿病是一种病毒感染后导致的胰岛细胞自噬凋亡，而2型糖尿病则是人体脂肪细胞受到了某种刺激后出现了一种自噬分化现象，所以如果能够进一步搞清楚自噬调控机制，就有可能为防治糖尿病提供崭新的思路。
针对病毒和细菌感染的治疗
病毒和细菌的感染是造成人类生病与死亡的主要原因，如果这些“侵略者”在细胞膜外面，免疫细胞就可以来对付他们，但如果像病毒那样，入侵到细胞内部了，自噬过程或能保护细胞，集中精力攻击病毒本身。有研究人员尝试用自噬机制治疗肺结核。
抗衰老
人体的衰老目前看来也是一种自噬受抑制现象，如果能够激发或者重建人体细胞的自噬，那么就能够完成细胞层面上的新陈代谢过程。
细胞自噬的典型特征是形成自噬体并呈递给溶酶体，这一过程在蛋白质和细胞器质量控制中起基础作用并维持了细胞能量的稳态。一些研究表明，自噬与细胞衰老密切相关，参与蛋白酶和自噬相关调节的BAG蛋白家族中BAG3/BAG1比值在复制性衰老时增高，且BAG3在细胞衰老时能介导自噬的激活。研究还发现在Ras诱导的细胞衰老进程中亦可观察到较高的自噬活性。
细胞中的受损蛋白质积累是生物体衰老的一个重要特征。而细胞自噬可以担任一个合格的“质检员”，消灭受损的蛋白质，以对抗衰老带来的负面影响。大隅良典的研究成果让人们明白了细胞自噬的关键基因和运作机制，有助于人类更好了解细胞如何实现自身的循环利用，从而找到抗衰老的办法。
自噬作用可能还能延长寿命
很多人都认为，许多疾病的发病几率，都会随着年龄的增长而升高。这可能是因为，年龄增大后，自噬作用的效率降低了。最新研究显示，如果能阻止自噬作用的效率降低，实验动物体内就不会有受损蛋白或细胞器的累积。
总之，自噬作用不但是细胞在养分不足时产生的应急反应，也是影响人类健康的重要因素。对于自噬作用，很多科学家开始从多个角度进行研究，对认识也在不断深入。了解如何控制自噬作用，对于治疗疾病甚至延缓衰老进程，都具有重大意义。
细胞自噬相关的增长点及投资热点
细胞自噬概念已经提出了相当长的时间，自噬机制的研究一直是生命科学的热门领域，不过，相关研究目前在临床应用方面还并不明朗。
雷帕霉素（西罗莫司）现已被科学家发现，是激活细胞自噬重要的化学分子，能诱发细胞自噬作用。研究表明，雷帕霉素（西罗莫司）能通过抑制靶蛋白（mTOR），激酶的活性从而激活细胞自噬。在阿尔茨海默和帕金森病小鼠模型中，应用雷帕霉素治疗能降低β淀粉样蛋白的水平、提高对β淀粉样蛋白聚集体的清除、抑制Tau蛋白过磷酸化等，但是目前雷帕霉素（西罗莫司）还没有被批准应用于人体细胞自噬异常相关适应症。
作为一种有效的自噬诱导剂，雷帕霉素（西罗莫司）通过诱导细胞自噬从而减轻炎症反应，可能是其可以发挥免疫抑制的机制之一。目前雷帕霉素的衍生品已经获得批准用于治疗某些癌症：肾癌、肺癌和乳腺癌。近10多年来，研究证明它不仅可延缓与衰老相关的疾病，如癌症、心脏病和老年痴呆症的病程进展，延长寿命，还能推延正常衰老所带来的多种影响。
在临床转化方面，研究人员开发细胞自噬治疗疾病的首个化学药物是雷帕霉素（Rapamycin），这是一种经典的自噬诱导剂，可以通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）促进自噬的发生。雷帕霉素（Rapamyein）作为一种免疫抑制药，当人体移植了新的肾脏或其他器官后，会自然产生排异，而它能抑制这种反应。
自1999年，美国食品和药物管理局（FDA）批准雷帕霉素作为器官移植患者的药物，迄今已拯救了数以万计的移植患者的生命。此外，它还被应用于多种用途，如药厂用于心脏支架的涂层材料上，用于防止产生癫痕组织，出现再狭窄。
作为全球最具权威性和影响力的奖项，诺贝尔奖对科技发展的引导作用非常明显，这对于着重于相关技术研发的公司来说是个利好。细胞自噬相关药物雷帕霉素（西罗莫司）生产企业首先将直接受益。
雷帕霉素原研厂家是惠氏（后被辉瑞收购），目前已被批准用于防止肾移植手术后的器官排斥反应等。国内获得西罗莫司生产批文的企业包括华北制药、浙江医药、华东医药、海正药业和福建科瑞药业。不过，据了解，目前西罗莫司作为一种免疫抑制剂药物使用，主要是提供给器官移植手术的器官接受者，西罗莫司现在还没有被批准用于细胞自噬异常相关疾病的治疗或者预防。
篇3
[关键词] 心肌细胞；心肌肥大；番茄红素；血管紧张素Ⅱ；自噬相关基因
[中图分类号] R542.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）11（c）-0011-04
The effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ
WANG Haining LI Jilin YAO Huaiqi YANG Baojun XU Tan
The First Affiliated Hospital of Shantou University， Guangdong Province， Shantou 515041， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of lycopene on autophagy in cardiac hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ）. Methods Cardiac hypertrophy was induced by AngⅡ incultured neonatal rat cardiomyocytes. Morphology and expression of hypertrophy marker atrial natriuretic peptide （ANP） were detected by optical microscope and Real time PCR. Protein level of Atg6 （Beclin1） and autophagic marker， LC3 were tested by western blotting. Results Lycopene down regulated cell surface area [（355.82±40.45） vs （517.19±52.31）， F = 56.518， P < 0.05] and RNA expression of ANP [（12.16±1.41） vs （17.83±2.07）， F = 157.048， P < 0.05] in cardiac hypertrophy induced by AngⅡ. Lycopene increased expression of autophagy related gene Beclin1 [（0.685±0.058）， F = 202.873， P < 0.05] and LC3 protein [（0.608±0.045）， F = 177.114， P < 0.05]. Blocking autophagy by 3-MA could significantly reduce the impact of lycopene on myocardial hypertrophy induced by AngⅡ（P < 0.01）. Conclusion Lycopene may inhibit myocardial hypertrophy by activating autophagy.
[Key words] Cardiomyocyte； Cardiac hypertrophy； Lycopene； Angiotensin Ⅱ； Autophagy related gene
番茄红素（lycopene，Lyc）是一种广泛存在于红色水果和蔬菜中的天然生物色素，属于类胡萝卜素一族，因最早发现于番茄中而得名[1]。目前国内外大量的研究证明Lyc不仅有极强的抗氧化能力[2]，还具有抑制炎症因子表达、抗癌、预防衰老等多种生物学效应[3-4]。虽然，近年来有少量关于Lyc可以防治心血管疾病、抗缺血缺氧、抑制动脉粥样硬化等文献报道[5-6]，但到目前为止，未见有关于其在心肌肥大方面的作用和机制的研究。因此，探索其内在的作用机制对于寻找预防和控制高血压等心脏肥大疾病的临床有效治疗具有重要的意义。
心肌肥大的本质是细胞合成代谢与分解代谢的失衡，机体主宰分解代谢的途径主要有自噬。自噬（autophagy，Atg）是广泛存在于真核细胞中一个保守的生物学现象，它是通过包裹待降解物形成自噬体，然后与溶酶体结合进行多种酶的消化及降解，参与机体受损细胞器和蛋白质的清除，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新、维持内环境稳定的重要方式[7]。微管相关蛋白1轻链3（tiny tubes related proteins 1 light chain 3，LC3）是自噬的特异性蛋白，分为胞质型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ，后者是LC3的活性形式[8]。在既往的研究中[9]，笔者已经证实在心肌肥大中自噬受到抑制，阻断自噬会促进心肌肥大的发展，而Lyc是否对心肌肥大产生作用，其作用是否与自噬相关尚未明确；本研究旨在AngⅡ诱导的心肌肥大中明确Lyc的作用，探讨Lyc和自噬的关系。
1 材料
1.1 动物
SD乳鼠，清洁级，1～2日龄，汕头大学医学院实验动物中心提供（SCXK粤2012-0017）。
1.2 主要试剂
DMEM-F12培养基（SH30023.01B）和胎牛血清（SV30087.01）（Hyclone）；胰蛋白酶（25200056）和Ⅰ型胶原酶（B1067）（Gibco）；5-溴脱氧尿嘧啶核苷BrdU（B5002），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）（A9525）和3-甲基腺嘌呤3MA（M9281）（Sigma）；Lyclycopene（L9879-10MG）（Sigma-Aldrich）；微管相关蛋白1轻链3 LC3 Ⅰ/Ⅱ抗体（3868s），Bclin1抗体（3738s）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GADPH（2118s）（Cell Signaling Technology）；羊抗兔IgG-HRP（SA00001-2）（PTG，proteintech group），免疫印迹发光液（WBKLS0100）（Millipore），四氢呋喃（THF）（tetrahydrofuran）和2，6-二叔丁基对甲酚（BHT）（butylated hydroxytoluene）（上海宝曼生物科技有限公司）；无核酶水（9012），逆转录酶（DR100A），RNA酶抑制剂+脱氧核糖核苷酸混合物（RR02MA）（Takara）。
2 方法
2.1 原代心肌细胞分离和培养
消毒乳鼠，开胸取心脏，用D-Hank's溶液去血污，分离心室。置入离心管，剪碎1 mm3大小，加入0.125%的胰酶37℃消化10 min，弃上清，放入0.05%Ⅰ型胶原酶，37℃振荡消化2 h。用上述胰酶重复消化1～2次，每次约6 min。将细胞悬液集中放入含10%胎牛血清培养基，均匀接种到培养皿，放置于5% CO2的培养箱60 min以分离成纤维细胞。以1×106/mL密度接种于6孔板，加入100 U/mL链霉素和青霉素防止污染，及0.1 mmol/L的Brdu抑制成纤维细胞生长，最后放入50 mL/L CO2培养箱内培养。接种24 h后80%的细胞生长成片并有规律搏动时，换无血清DMEM处理24 h后分组干预。在予以Lyc处理前，先将Lyc溶解于含有0.025%丁基羟基甲苯（BHT）的四氢呋喃。其在培养基中的浓度控制在0.05%（V/V），不会影响细胞活性。
2.2 细胞实验分组
首先在AngⅡ（1 μmol/L）诱导的心肌肥大中，观察Lyc（5 μmol/L）对细胞的作用，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和Lyc组（5 μmol/L）；于48 h检测心肌肥大的标志物ANP的mRNA表达水平。为观察心肌肥大时Lyc（5 μmol/L）对自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的影响，将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于48 h以Western blot法测定Beclin1和LC3蛋白的水平。
2.3 细胞镜检
用AngⅡ和（或）Lyc干预48 h的心肌细胞以4% PFA固定，显微镜400倍拍照，每组取50个同样大小视野，利用图像分析软件Image pro plus 6.0计算细胞面积[9]。
2.4 Western blot检测蛋白的表达
冰上裂解细胞30 min，收取蛋白。取总蛋白进行10% SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白以80 V，100 min转至PVDF膜上；用50 g/L的BSA封闭1 h，加LC3B抗体（1∶1000）、GADPH抗体（1∶10 000）4℃孵育过夜；次日用TBST洗膜，与辣根过氧化物酶标记的抗体（1∶10 000）室温孵育1 h；用ECL显影、曝光。采用图像分析软件检测蛋白条带的灰度值，LC3Ⅱ与LC3Ⅰ条带的比值代表LC3蛋白的表达水平，其余以GAPDH作为参照[9]。
2.5 实时定量PCR
常规Trizol裂解法提取mRNA并逆转录成cDNA。参照文献[9]做标准曲线和定量PCR体系。在Roche PCR分析仪器里扩增目的基因，反应条件为：94℃预变性5 min，然后94℃ 15 s，55℃ 45 s，72℃ 60 s，共30循环，72℃ 6 min。反应结束后，使用PCR仪配套软件进行分析。重复3次，数据进行统计学分析。引物序列：ANP：上游引物5'-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3'，下游引物5'-AGGCCAGGAAGAGGAAGAAG C-3'；GAPDH：上游引物5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物5'-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3'。
2.6 统计学方法
采用SPSS 15.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，各组之间的差异用One-way ANOVA比较均值的单因素分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用
本研究从心肌细胞形态、细胞面积及心肌肥大标志物水平这三个方面，明确Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用。将心肌细胞分为四组进行干预：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）和Lyc（5 μmol/L）组；结果显示，与对照组比较，AngⅡ刺激48 h后细胞面积增大（P < 0.01），心肌肥大标志物ANP的mRNA水平上调（P < 0.01）；Lyc结合AngⅡ干预，细胞大小和面积明显减小（P < 0.05），ANP的mRNA比值显著下降（P < 0.05）；而用Lyc本身对心肌细胞大小和形态无明显作用（P > 0.05），ANP的mRNA比值无显著影响（P > 0.05）（图1、表1）。提示Lyc可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。
与对照组比较，**P < 0.01；与AngⅡ组比较，*P < 0.05
图1 Lyc在AngⅡ诱导心肌肥大中的作用
表1 四组大鼠心肌细胞面积和ANPmRNA测定结果比较
（x±s，n = 5）
注：与对照组比较，**P < 0.01；与AngⅡ组比较，#P < 0.05
3.2 在心肌肥大中Lyc对自噬的作用
为明确在心肌肥大中Lyc对自噬的作用，将细胞分为四组：对照组、AngⅡ组、AngⅡ+Lyc组（5 μmol/L）和AngⅡ+Lyc（5 μmol/L）组+3-MA（5 μmol/L）组；于48 h以Western blot法测定Beclin1和LC3蛋白的水平，LC3Ⅱ/Ⅰ反应自噬活性。结果显示：与对照组比较，AngⅡ干预48 h后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平下降（P < 0.05），加入Lyc干预后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平有所增加（P < 0.05），而使用3-MA后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和Beclin1的蛋白水平迅速下降（P < 0.01）；3-MA（5 μM）对细胞本身无影响（图2、3，表2）。
与对照组比较，*P < 0.05；与AngⅡ组比较，#P < 0.05；与AngⅡ+Lyc组比较，**P < 0.01
图2 在心肌肥大中Lyc对LC3蛋白的影响
与对照组比较，*P < 0.05；与AngⅡ组比较，#P < 0.05；与AngⅡ+Lyc组比较，**P < 0.01
图3 在心肌肥大中Lyc对Beclin1蛋白的影响
4 讨论
从20世纪末人们发现服用Lyc能明显降低前列腺癌的发病率至今，已有大量的流行病学调查、临床研究和动物实验证明Lyc具有极强的抗氧化能力，可以预防各种慢性疾病[8-10]。特别是在心血管疾病中，Lyc不仅可以降低血脂，降低收缩压，减少心血管疾病的风险，还能缓解缺血/再灌注损伤[11-12]。但对于其是否有抑制心肌肥大的作用及相关机制，目前国内尚未有报道。本实验首次在心肌肥大的模型上探讨Lyc的作用和与自噬之间的关系。本实验观察到，AngⅡ干预心肌细胞后细胞面积明显增大、心肌肥大标志物心房利钠多肽（ANP）明显上升，说明AngⅡ诱导的细胞肥大模型成功；然后加入Lyc干预发现，Lyc减少了AngⅡ诱导心肌细胞面积的增大，降低了ANP的升高，在一点程度上对心肌肥大起到了抑制作用。实验进一步发现，AngⅡ诱导的细胞肥大中伴有自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白表达的下降，而Lyc的干预却促进了自噬相关基因Beclin1和LC3蛋白的表达。利用自噬阻断剂3MA降低了Lyc对心肌细胞肥大的抑制作用，提示Lyc可能通过激活自噬来抑制AngⅡ诱导的心肌肥大。
自噬在心脏中的作用存在着争议。早在20世纪80年代，人们就发现心肌细胞蛋白质合成增加和细胞肥大的同时，伴随着自噬水平的降低[13]。21世纪初Nakai等[14]在横主动脉缩窄诱导的早期心肌肥大模型中发现，自噬水平明显低于假手术组，提示心肌肥大代偿期，自噬活性显著下降；此外亦有文献报道自噬的激活剂雷帕霉素可以阻断由主动脉缩窄[15]、甲状腺激素[16]引起的心肌肥大，并且逆转已经存在的心肌肥大[17]。最近的研究发现，FoxO3可通过上调自噬水平，使心肌肥大的心脏体积缩小[18]。目前关于Lyc对自噬的作用在心脏病中的研究是空白。笔者前期实验表明自噬对于AngⅡ诱导的心肌肥大发展可能起抑制作用[9]。本实验在细胞水平上明确了Lyc具有抗心肌肥大和提高自噬水平的作用，而阻断自噬会明显降低Lyc对细胞肥大的影响，提示自噬可能是Lyc抑制心肌肥大的一个重要环节，而Lyc是如何调控自噬，其具体分子机制仍需进一步的研究和探索。
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篇4
关键词：自噬；凋亡；3-甲基腺嘌呤（3-MA）；顺铂（DDP）；骨肉瘤细胞
1实验材料
1.1细胞来源 骨肉瘤MG63细胞购于中科院上海细胞库。
1.2主要试剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA）、二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑盐（MTT）、单丹黄酰尸胺（MDC）购于美国Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒购于上海碧云天公司。
1.3实验仪器 流式细胞仪（美国BD公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（德国LEICA公司）、低温高速旋转离心机（美国Beckman公司）、细胞培养孔板（美国NEST公司）。
1.4试剂配制
1.4.1 MDC溶液 将1 mg MDC粉末溶于1 mL无菌水中，可获得3 mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100 μL加到6 mL无菌水中，获得实验用50 μmol/L的最终溶液，置于4℃冰箱避光保存备用。
1.4.2 DDP溶液 取1 mL浓度为5 mg/mL的DDP，用无菌水稀释到250 mL，即获得20 μg/mL的DDP用于实验，4℃冰箱保存。
2实验分组
该实验分为4组：空白对照组（加入等量的培养液做对照）、3-MA组（仅添加浓度为12.5 μg/mL的3-MA）、DDP组（仅添加浓度为20 μg/mL的DDP）、3-MA+DDP组（12.5 μg/mL的3-MA和20 μg/mL DDP同时添加）。
3实验方法
3.1细胞培养 骨肉瘤MG63细胞培养于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，其中含有100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。在湿度饱和的情况下，培养于5%CO2、37°的培养箱中，隔天换一次培养液，3 d传代1次，取适量对数生长期的细胞进行下一步实验研究。
3.2 MTT比色法 外源性MTT在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶作用下能够还原成蓝紫色结晶甲，且该结晶物质不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲溶解，在490 nm波长处可以用酶标仪检测光吸收值，在死亡细胞中不存在上述反应过程，检测不到吸光度值，从而可以用来比较不同组之间细胞增殖率。取细胞数为1×108个/L，种植于96孔板中，分别在每孔添加等量的细胞悬液，细胞培养液培养10 h后根据实验分组在3个组中加入相应的药物，在恒温（37℃）5%CO2的环境下培养24 h后，将每孔加入等量的MTT溶液作用4 h，然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，摇摆15 min，然后在酶标仪上检测不同组的吸光度值（A）。结合以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（%）=（实验组A/对照组A）×100%。
3.3 MDC染色法 单丹黄酰尸胺（MDC）被细胞吸收后蓄积于嗜酸性的细胞囊泡中，在荧光显微镜下可以看到蓝绿色或黄绿色点状结构出现在细胞核周围，经常被用来检测细胞自噬囊泡的存在。取处于对数生长期的骨肉瘤MG63细胞（细胞数为1×105个/mL）加入24孔细胞培养板中培养12 h待细胞贴壁后根据实验分组加入相应浓度的药物继续培养24 h，24 h后加入MDC溶液（浓度为50 μmol/L）避光环境中培养1 h，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤，然后用倒置荧光显微镜观察自噬空泡差异；同样方法，经相应药物处理24 h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，然后分别收集各组细胞（不能收集倒置荧光显微镜观察过的细胞，以免影响细胞荧光强度），用流式细胞仪检测不同组细胞荧光强度。
3.4流式细胞术检测细胞凋亡率 磷脂酰丝氨酸位于正常细胞膜的内侧，但是在细胞凋亡的初期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，出现在细胞外环境中，也就是所谓的磷脂酰丝氨酸外翻。Annexin-V是一种分子量为35~36 KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。 Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒是用带绿色荧光灯荧光探针FITC标记的Annexin，直接用流式细胞仪检测磷脂酰丝氨酸外翻这一细胞凋亡的重要特征，可以使坏死细胞呈绿色荧光。而碘化丙啶（PI）可以将坏死细胞和凋亡晚期失去细胞膜完整性的细胞染成红色。因正常细胞不被FITC和PI染色，所以二者结合可以较准确检测细胞凋亡情况。将细胞数为1×105个/mL的骨肉瘤MG63细胞种植于6孔板中培养，待细胞贴壁后，结合试验分组加入相应药物干预24 h，然后分组收集、离心细胞，PBS洗涤，按照Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒说明进行操作，经流式细胞仪检测细胞凋亡率，比较各组间差异。实验重复3次。
3.5统计学分析 用均数±标准差（x±s）表示实验结果，在SPSS 17.0统计软件帮助下进行统计学分析，多组间差异用单因素方差分析进行比较，取P
4结果
4.1 MTT法检测各组细胞增殖抑制率 MTT法检测结果显示：与对照组相比，单独添加3-MA对细胞增殖没有明显影响；单独添加DDP细胞增殖率为（47.6±3.1）%；与单独添加DDP相比，同时添加3-MA和DDP组细胞增殖率为（27.1±2.8）%，增殖率下降，P
4.2 MDC染色检测细胞自噬 MDC染色后在细胞核周围出现黄绿色的自噬空泡，与单独添加DDP组相比，3-MA和DDP同时添加组细胞自噬空泡较少。经倒置荧光显微镜拍片后显示，见图1。通过流式细胞仪检测各组荧光强度差异，结果提示：对照组为（83.1±8.2）%，单独添加3-MA组为（89.8±9.5）%，单独添加DDP组为（183.1±14.8）%，3-MA和DDP同时添加组为（121.5±10.4）%。3-MA和DDP同时添加组与单独添加DDP组相比，P
图1 不同组MDC染色后自噬空泡的变化
4.3流式细胞术检测细胞凋亡 经流式细胞仪检测我们发现，单独添加3-MA组细胞凋亡率为（2.5±0.4）%；单独添加DDP组为（12.5±1.1）%，与对照组相比，P
图2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率
5讨论
骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性是决定治疗效果的关键因素，据统计仍有10%~25%患者对化疗反应较差，根本原因在于对化疗药物产生耐药性[1-2]。另外，临床上不合理、不规范的使用化疗药物也可引起肿瘤细胞对药物产生耐药性，将严重影响治疗效果。近些年多数研究[3-4]认为骨肉瘤的耐药性与多种肿瘤基因位点或传导通路有关，如骨肉瘤的生长、发展或耐药性与信号传导子STAT3通路的激活存在一定的相关性；肿瘤细胞对甲氨蝶呤耐药与异位转染miR-140存在联系等。由于新的化疗方案的实施，外加新的化疗辅助药物的应用，能很大程度上控制骨肉瘤的发展，产生良好治疗效果[5-6]。为了寻找更有效、更广泛的肿瘤化疗辅助药物，自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤对肿瘤耐药性的影响日益引起大家的关注[7-8]。
顺铂属于细胞周期非特异性药物，结构类似于双功能烷化剂，在DNA复制过程中发挥抑制作用。在骨肉瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌等实体恶性肿瘤中应用较广泛。自噬是细胞通过自身来消除细胞内部衰老或死亡细胞来维持内环境稳定的过程。3-甲基腺嘌呤可以通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ClassⅢPI3K），阻止自噬体与溶酶体形成自噬溶酶体，进而发挥抑制作用，是一种常见的自噬抑制剂，广泛应用于自噬相关基础研究[9]。MDC是特异性自噬体标记物，被MDC染色的细胞核周围可见蓝绿色或黄绿色点状结构，常用来检测细胞自噬囊泡[10]。
本研究结合临床中顺铂在骨肉瘤化疗中的应用，借助自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤来说明自噬在骨肉瘤化疗过程中的作用。经MTT比色法检测，我们发现3-MA+DDP组细胞增殖率明显低于单独添加DDP组，P
随着人们对自噬与肿瘤发生、发展机制研究的深入，我们不难发现通过调控自噬可以克服肿瘤耐药性，促进细胞凋亡，为临床获得良好的治疗效果提供实验依据，该研究也证实调控自噬在改进肿瘤治疗方案中有更宽阔的研究前景。但是如今，自噬抑制剂不能在临床上应用的主要原因主要有：①自噬在临床上还没有特异性的抑制剂，实验中应用的药物还不能直接应用于临床。②在临床上对自噬水平的检测到目前为止还没有一个客观定量的方法，比如根据一个血液标本或者肿瘤组织就可以检测到自噬水平。这两点也正是我们下一步继续努力研究的方向。
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篇5
基金项目：苏州市2013年“科教兴卫”青年科技项目（KJXW2013026）
作者单位：215007 江苏省苏州， 苏州大学附属第二医院急诊与重症医学科[陆件（在读硕士研究生）、钱会银（在读硕士研究生）、刘励军、周保纯、肖盐]，心内科[毛锦宁、安国印（在读硕士研究生）]，血液科[芮明忠（在读硕士研究生）]，检验科[王涛（在读硕士研究生）]；南通大学医学院电镜教研室（朱昌来）
通信作者：刘励军，Email：
【摘要】目的 观察亚低温（MH）对心肺复苏（CPR）后海马神经细胞活性氧（ROS）产生量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）mRNA和自噬相关蛋白轻链3（LC3）表达的影响。方法 65只健康成年雄性SD大鼠随机数字法随机分为2组：空白对照组（BC，n=5）；CPR组（n=60）。CPR组制作窒息法心肺复苏模型，在自主循环恢复（ROSC）后再随机分为2组：常温CPR组（NT）和低温CPR组（HT）。NT组在ROSC后保持37 ℃恒温，HT组在ROSC后立即行低温32 ℃干预4 h。根据观察时点的不同，再将两组CPR组随机分2个亚组：即 ROSC后12 h和24 h组（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。到达观察时点先对存活大鼠进行神经功能缺损评分（NDS），然后立即取双侧海马组织，应用流式法检测大鼠海马单细胞悬液ROS水平。利用透射电镜观察海马神经细胞细胞核和线粒体的超微结构形态学变化。利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定海马神经细胞caspase-3mRNA的表达水平；蛋白免疫印迹法（WB）测定海马神经细胞LC3蛋白水平。应用SPSS 19.0软件包，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 60只大鼠中有44只（73%）成功ROSC，存活到观察时点的有33只大鼠（55%）。NT和HT组各时点的NDS明显低于BC组（F=8.107，P
【关键词】亚低温；心肺复苏；活性氧；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；轻链3；自噬
The impact of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation Lu Jian， Qian Huiyin， Liu Lijun， Zhou Baochun， Xiao Yan， Mao Jinning， An Guoyin， Rui Mingzhong， Wang Tao， Zhu Changlai. Department of Emergency and Critical Care Medicine， The Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， 215007， China
Corresponding author： Liu Lijun， Email：
【Abstract】Objective To observe the impact of mild hypothermia （MH） on the reactive oxygen species （ROS） and expression of cacpase-3mRNA and light chain 3 （LC3， a subunit of immunoglobulin） in hippocampus nerve cells of rats after cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods A total of 65 healthy male Sprague Dawley （SD）rats were randomly（random number） divided into 2 groups： blank control group （n=5） and CPR group （n=60）. Cardiac arrest （CA） was induced in rats of CPR group by asphyxia. The survival rats after CPR were randomly（random number） divided into 2 groups： normothermia CPR group （NT） and hypothermia CPR group （HT）. Homeothermia of 37 ℃ was maintained in NT group after restoration of spontaneous circulation （ROSC）， and hypothermal intervention to 32 ℃ was carried out in HT group for 4 hours immediately after ROSC. Both NT group and HT group were then randomly divided to 2 subgroups 12 hours and 24 hours after ROSC （NT-12， NT-24， HT-12， HT-24 subgroups）. During observation， the neurological deficit （NDS） of rats was scored， then the bilateral hippocampi were obtained from rats' head， and monoplast suspension of fresh hippocampus tissue was made immediately to determine the level of intracellular ROS by flow cytometry. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure changes of cellular nucleus and mitochondria. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to determine the expression of caspase-3mRNA and Western-blotting （WB） was used to determine the level of LC3 in frozen hippocampus tissue. Measured data were analyzed with paired sample T test and One-Way ANOVA. Results Of 60 rats with CA， 44 were successfully resuscitated （73%） and 33 survived until the end of the experiment （55%）. The NDSs of rats in NT and HT groups were significantly reduced in comparison with BC group （F=8.107， P
【Key words】Mild hypothermia； Cardiopulmonary resuscitation； Reactive oxygen species； Caspase-3； LC3； Autophagy
随着心肺复苏（CPR）技术和急诊医学的发展，大多数心脏骤停（CA）患者能恢复自主循环，但均遗留有不同程度的神经功能障碍，造成家庭和社会的巨大负担[1]。神经细胞凋亡是CA后存活患者神经功能障碍的主要病理生理过程，如何预防和控制CA后脑神经细胞凋亡的发生和发展是减少继发性神经功能障碍的重要治疗措施之一[2]。脑神经细胞在缺血缺氧后凋亡的发生与细胞自噬程度密切相关[3]，这种自噬与凋亡的关系以及其调节机制尚需进一步的明确。本研究采用窒息法大鼠心肺复苏模型，来观察亚低温（mild hypothermia， MH）对CPR后大鼠海马神经细胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）产生量和神经功能的影响，并探讨其相关机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
采用雄性健康成年SD大鼠[由中科院上海动物实验研究所提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005，周龄16～18 周，体质量（450±45）g，共65只；随机（随机数字法）分为两组：空白对照组（BC，n=5）、CPR组（n=60）。BC组用3.6%水合氯醛（批号：120203，国药集团化学试剂有限公司）按10 mL/kg进行腹腔内注射麻醉后，气管插管和股动、静脉置管，不建立窒息CPR模型，待稳定后开始计时，到达观察时间点后进行NDS，然后在麻醉状态下处死大鼠取脑。CPR组在麻醉后，气管插管和股动、静脉置管，并复制窒息大鼠CPR模型（详见模型制备），待成功自主循环恢复（ROSC）后，再将大鼠分为常温CPR组（NT）、低温CPR组（HT）。NT组在ROSC后保持其体温在
37.0 ℃，HT组在ROSC后立即予32 ℃低温干预，持续4 h后开始缓慢复温至正常体温。根据观察时点的不同，再将上述CPR组大鼠随机分为2个亚组，即ROSC后12和24 h组（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。
1.2 模型制备和神经功能缺损评分
模型参照Idris等[4]所建立的方法进行。用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后将大鼠固定于铺有控温毯（型号：MODLE6900，深圳瑞沃德公司）的操作台上。大鼠气管插管后用24 G套管针行股动、静脉置管，股动脉置管成功后接压力换能器。所有大鼠均行心电、肛温及有创动脉压监测（8导生物信号采集系统MD3000，安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）。操作完成后再稳定5 min，期间予心肺复苏装置（型号：A-CPR-IIC，中山大学心肺脑复苏研究所）机械通气，心肺复苏装置参数如下：呼吸频率100次/min、潮气量6 mL/kg、吸氧体积分数100%通气1 min，然后将吸氧体积分数改为21%继续通气4 min。采用呼气末夹闭气管导管模拟窒息，CA判定标准如下：收缩压（SBP）≤25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并持续至心电图呈直线。此后，开始复苏，予机械通气 （呼吸频率50次/min，潮气量6 mL/kg，氧浓度100%）；同时，使用心肺复苏装置进行胸外心脏按压，频率250次/min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3。复苏开始10 s后，经股静脉注射肾上腺素（批号：120505，上海禾丰制药有限公司）（0.01 mg/kg）。CPR后ROSC的标志：出现自主心律和SBP≥60 mmHg，
并持续10 min以上[4]。复苏前和复苏时动物肛温均控制在（37.0±0.5）℃。HT组在复苏后立即予控温毯、冰袋和风扇等降温措施将肛温降至32 ℃，持续4 h后再以0.5 ℃/h的速度缓慢复温至37.0 ℃。到达观察时点先按Geocadin等[5]的方法进行神经功能缺损评分（neurological deficit scores， NDS），然后在麻醉下处死大鼠获取海马组织标本。
1.3 检验取材方法
CPR组大鼠在窒息前、ROSC后0.5 h和4 h均从股动脉抽取0.5 mL动脉血（取血后补充等量生理盐水）行血气分析。各组大鼠在到达观察时间点之前均予5%GNS灌胃（10 mL/kg，1次/6 h），到达相应的观察时间点后，先对大鼠进行NDS，然后在麻醉状态下心内注射10%氯化钾2 mL处死大鼠，切开胸骨，分离心包，暴露心脏，将穿刺针经左心室送入升主动脉，剪开右心耳，经心脏快速灌注4 ℃生理盐水250 mL至右房流出液清，迅速断头取脑，分离双侧海马。左侧海马切取2/3立即在冰上研磨制作单细胞悬液，剩余1/3行电镜观察；右侧海马-80 ℃冻存，用于caspase-3mRNA和LC3B表达的测定。
1.4 流式细胞仪检测细胞内ROS水平
左侧海马取出后切取2/3在冰上用装有冷PBS的玻璃匀浆器内匀浆10次，经300目尼龙过滤网过滤，收集滤液600×g 4 ℃离心5 min，弃上清，冷PBS重悬沉淀，反复吹打后再离心，重复上述操作3次，最后用冷PBS重悬沉淀，用活性氧检测试剂盒（货号：S0033，碧云天生物技术研究所）中的DCFH-DA按1∶1000的浓度装载探针，37 ℃孵育20 min后用PBS洗涤3次，最后重悬后用流式细胞仪（型号：FACSCalibur，美国BD公司）检测，分析100000个单细胞内的DCF荧光强度，取其平均值。
1.5 caspase-3mRNA表达测定
采用RT-PCR法测定：用Trizol（批号：120805，美国GIBCO公司）抽提RNA；逆转录mRNA至cDNA；再用PCR扩增仪（型号：9700，美国应用生物系统中国公司）扩增cDNA。由invitrogen上海提供合成引物，caspase-3引物：上游5’-GCA CTG GAA TGT CAG CTC GCA-3’，下游5’-GCC ACC TTC CGG TTA ACA CGA-3’，扩增产物大小559 bp；β-actin引物：上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，扩增产物大小300 bp。反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用电泳仪（型号：三恒ECP3000，北京市六一仪器厂）电泳，电泳后摄片，并应用Vilber凝胶成像分析系统（型号：Type T2A，法国Lourmat公司）进行吸光度扫描，以目的条带与β-actin的积分比值表示caspase-3mRNA的相对表达量。
1.6 LC3B表达测定
采用Western blot法测定：用蛋白裂解液RIPA（中）（货号：P0013C，碧云天生物技术研究所）在玻璃匀浆器中裂解冻存组织，高速离心后得上清蛋白溶液。采用BCA蛋白含量测定试剂盒（货号：P0010S，碧云天生物技术研究所）测定蛋白浓度；然后，用SDS-PAGE（货号：P0012A，碧云天生物技术研究所）制备12%的分离胶和6%浓缩胶。加样后恒压100V电泳，电泳结束后转PVDF膜，转膜后加一抗（anti-LC3B 1∶1000；anti-GAPDH 1∶800）；过夜后加二抗（second anti-LC3B 1∶3000；second anti-GAPDH 1∶4000）。孵育后将膜包好进入暗室压片并洗片，使用凝胶成像分析系统对胶片进行扫描分析，以特定的目标蛋白条带OD值（volume）与内参蛋白GAPDH（volume）比值表示LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达水平。
1.7 透射电镜标本制作
将左侧海马剩余1/3新鲜组织块用手术刀片切成1 mm3大小，并用4%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次15 min。1%锇酸固定1 h，再用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次15 min。30%丙酮脱水15 min，50%丙酮脱水15 min，70%丙酮饱和醋酸铀过夜。过夜后再用80%丙酮脱水15 min，90%丙酮脱水15 min，100%丙酮脱水3次，每次10 min。将包埋剂与100%丙酮按1∶1比例放置1 h，然后将组织块放入胶囊包埋，放入烘箱，制超薄切片并枸橼酸铅染色待检。
1.8 统计学方法
用SPSS 19.0和office excel 2007统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用成组t检验，多组间比较用LSD-t检验，以P
2 结果
2.1 CPR组大鼠窒息和复苏时间以及存活情况
60只大鼠制模成功44只（73%），存活到观察时点者33只（55%）。心脏骤停后大鼠主要复苏措施以机械通气和胸外心脏按压为主。在复苏过程中大鼠的心律未见长时间的心室颤动，故在复苏过程中未使用心脏电除颤。各组大鼠窒息和复苏时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 CPR组大鼠基本生命体征及血气分析变化
CPR组大鼠在窒息前、ROSC后0.5和4 h各项生命体征（除Tc外）差异无统计学意义（P>0.05）。动脉血气分析结果比较，HT组ROSC后4 h乳酸水平明显低于NT组（t=2.146，P=0.036），余各相同时点血气分析指标间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、3。
2.3 ROSC后各组NDS情况
结果发现，CPR组各组大鼠的NDS显著低于BC组（F=8.107，P
NDS满分为80分，0分为脑死亡；BC：空白对照组；NT：常温CPR组；HT：亚低温CPR组；ROSC：自主循环恢复；NDS：神经功能缺损评分。NT和HT组与BC组比较，aP
图1 各组NDS比较
Fig 1 NDS in each group
2.4 各组大鼠海马单细胞悬液ROS的变化
与BC组比较，CPR组各组大鼠海马组织单细胞悬液反应ROS水平的指标――DCF值均明显上升（F=16.824，P
A：空白对照组；B：常温CPR组ROSC后12 h；C：低温CPR组ROSC后12 h；D：常温CPR组ROSC后24 h；E：低温CPR组ROSC后24 h。每组的左图是通过流式细胞术分辨出的在单细胞悬液中不同的有形物质，白色箭头标注的是所计数的单细胞群，右图是该细胞群的平均荧光度
图2 各组大鼠海马单细胞悬液ROS检测流式细胞图
Fig 2 ROS flow cytometry in hippocampus monoplast suspension of each group
2.5 海马神经细胞caspase-3mRNA表达水平
与BC组相比，CPR组各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达均明显升高（F=24.527，P
BC：空白对照组；NT12：常温CPR组ROSC后12 h；HT12：低温CPR组ROSC后12 h；NT24：常温CPR组ROSC后24 h；HT24：低温CPR组ROSC后24 h；ROSC：自主循环恢复。ROSC后NT和HT组的平均荧光强度与BC组比较，aP
图3 各组大鼠海马单细胞悬液ROS检测结果比较
Fig 3 ROS compare in monoplast suspension of each group rats
A：目的基因caspase-3mRNA（559 bp）的表达。从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h；B：为内参照β-actin （300bp）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h。BC，空白对照组；NT，常温CPR组；HT，低温CPR组
图4 各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达
Fig 4 Caspase-3mRNA expression in hippocampus nerve cells of each group
2.6 大鼠海马神经细胞LC3B表达水平
与BC组相比，CPR组各组大鼠海马神经细胞LC3B表达均明显升高（F=6.584，P
2.7 透射电镜观察结果
ROSC后24 h取各组大鼠海马组织作电镜观察。空白对照组大鼠的海马神经细胞核，核膜完整、光滑，核染色质分布均匀；线粒体，外膜完整，嵴光滑清晰可见，基质均匀。常温复苏组大鼠的海马神经细胞核体积缩小，核膜有皱褶，核染色质边集、密度不均匀；线粒体体积明显减小，嵴紊乱、粗糙，基质浓缩。低温复苏组大鼠的海马神经细胞核体积略有缩小，核膜尚光滑，核染色质略有边集，分布尚均匀；线粒体体积略有减小，嵴可分辨，基质浓度略不均匀。见图8。
BC：空白对照组；NT-12：常温CPR组ROSC后12 h；HT-12：低温CPR组ROSC后12 h；NT-24：常温CPR组ROSC后24 h；HT-24：低温CPR组ROSC后24 h。NT和HT组的caspase-3mRNA表达量与BC组比较，aP
图5 各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达水平比较
Fig 5 Caspase-3mRNA in hippocampus nerve cells in groups
（A）目的蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ（16/18 kd）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h；（B）内参照GAPDH（36 000）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h。BC，空白对照组；NT组，常温CPR组；HT组，低温CPR组
图6 各组大鼠海马神经细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达
Fig 6 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
3 讨论
治疗性低温已成为心脏骤停患者脑复苏治疗的有效措施之一；然而，它也主要对院外心室颤动心脏骤停患者有益，提示低温可能仅对轻、中度脑损伤患者有益；但是其有效的主要机制仍有待研究。
BC：空白对照组；NT-12：常温CPR组ROSC后12 h；HT-12：低温CPR组ROSC后12 h；NT-24：常温CPR组ROSC后24 h；HT-24：低温CPR组ROSC后24 h。NT和HT组的LC3B- Ⅱ/Ⅰ表达量与BC组比较，aP
图7 各组大鼠海马神经细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平比较
Fig 7 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
A：空白对照组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；B：常温复苏组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；C：低温复苏组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；D：空白对照组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；E：常温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；F：低温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；G：常温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）被双膜结构（黑箭头所示）包围形成自噬体
图8 各组大鼠海马神经细胞核和线粒体的超微结构变化
Fig 8 Electron micrographs of nucleus and mitochondria in each group
心脏骤停后全身各器官、组织和细胞缺血缺氧，使呼吸链传递电子的效能下降，并使电子受体减少，造成缺血区ROS的产生并未增加[6]。经CPR治疗恢复自主循环（ROSC）后，再灌注血液中含有大量的氧，而此时线粒体呼吸链的酶活性却未能迅速恢复，致使氧经单电子还原成氧自由基增多[7]。此外，Ca2+超载也使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统抑制，最终使ROS的产生超过组织的清除能力[6]，进而造成细胞膜和细胞器不同程度受损，甚至引起细胞坏死和凋亡[8]。本研究结果表明，大鼠海马神经细胞在缺血-再灌注（I/R）后胞内ROS明显增高，这与细胞在缺血缺氧后发生级联反应的结果是一致的。低温治疗使ROS的产生量较相同时点的NT组明显减少（图2、3），其原因可能与MH能降低ROS的产生，同时具有保护清除ROS的酶系统有关。
Caspase-3是凋亡通路的最后执行者，能从一定程度上反应细胞凋亡的程度[9]，已有研究结果表明，MH能通过减少神经细胞的凋亡而使神经功能得到保护[10]。本研究中发现，MH能显著减少脑细胞I/R后ROS的产生量，并且与caspase-3mRNA的表达有一定的相关性。其原因可能是ROS的减少，通过抑制钙介导的兴奋性氨基酸与氧自由基之间的恶性循环，使caspase-3mRNA表达减少（图4、5），在一定程度上降低了细胞凋亡的程度。
另外，自噬通常被认为是细胞的一种保护性作用，它在维持缺血缺氧等应激状态下使细胞存活[11]，并清除细胞内衰老细胞器和错误折叠蛋白中起重要作用[12]。但是，近年来也发现，在某些条件下细胞自噬也能导致细胞死亡，即所谓过度自噬[13]。除利用电镜可观察自噬体形成外，还可以利用WB的方法检测LC3的形成，从而判断自噬发生的程度[14]。由于LC3B在脑中表达较多，可以用作脑细胞自噬的分子标志[15]。在自噬过程中，LC3-I被泛素样体系修饰和加工，产生相对分子质量为16 000的LC3-Ⅱ，并被定位到自噬小体中。故此，自噬小体中存在的LC3I和LC3-Ⅱ均可成为细胞发生自噬的分子标志，并且LC3Ⅱ的含量和发生自噬的程度成正比[16]。本研究也发现，HT组LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达较相同时相点的NT组有所下降（图6、7），表明MH减小了细胞的自噬程度，并可能是大鼠神经功能改善的原因之一（图1）。提示大鼠复苏后脑神经细胞发生的自噬是过度的、有害的。
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篇6
1.1、延安红枣的现状及问题
延安大红枣是驰名中外的陕西传统名优特产之一。其特点是果大核小，皮薄肉厚，质脆丝长，汁多味甜，甘美醇香，含糖量高，色泽鲜红，水分较少，贮藏期长，品质优良。真乃“味夺石蜜甜偏永，红迈朱樱色莫论”，是色、香、味、形俱全的红枣。
但现状就如下面：
枣子青了、红了，烂了、收了;枣农喜悦了、揪心了、希望又落空了……年复一年。每年9月底10月初,老天爷的"脸色"总是那样地让延安枣农揪心。延安大红枣，牵扯到沿黄七县近百万群众的一项大产业，今年遭灾了吗?收成如何?红枣产业还面临什么亟待解决的问题?
⑴信息不能很通畅的进行交流
农民们不知外面市场的需求量有多大，是否还可以扩大种植面积，获得更多的利润
⑵交通不够发达
不能将如此好的产品销售出去。(路难：肩扛背驮的枣农无奈)
⑶当年的枣不能很好的卖出
虽然外面对枣的需求很大，延安人手中有枣，但是不能很好的销售出去。好多的枣由于在当年没有卖出去到了以后就会出现好多的问题(发霉，生虫等)
⑷目前红枣的营销模式局限于传统的营销模式，市场前景狭窄
销售渠道不广泛，导致了红枣的销售一直不是很理想，所以延安红枣应该发展新的营销模式 ⑴利用淘宝网店销售会使得延安红枣有个更好的前景
再好的东西得不到好的销售，就会积压在农民手中，就会失去它应有的价值。延安地区如果将迎来阴雨天气，省气象台应及时提醒，红枣成熟会受到影响。此外，还须加强地质灾害的监测和预防。
目前红枣的营销模式局限于传统的营销模式，市场前景狭窄，销售渠道不广泛，导致了红枣的销售一直不是很理想，所以延安红枣应该发展新的营销模式。
我方在淘宝网上注册了网店，就是为了让更多的消费者可以买到他们想要的延安大红枣。让延安红枣闯出陕西，走出中国，走向世界!
2、选择延安大红枣的理由
红枣，盛名己久，。尤其延安延川县的红枣，更负盛名。延安延川县东傍黄河，属温带半干旱区，气候干燥少雨，昼夜温差大，日照时间长，延安大红枣主要产于黄河沿岸，它以个大、核小、皮薄、肉厚、味醇、富含维生素c、d、p(芦丁)、糖份、果胶物质、铁钙、磷，钾等成分是名副其实的"果中皇后"。受黄河特殊的地理因素影响，是大枣的理想适生区。
红枣的功效
1.减少老人斑
红枣中所含的维生素c是一种活性很强的还原性抗氧化物质，参与体内的生理氧气还原过程，防止黑色素在体内慢性沉淀，可有效地减少色素老年斑的产生。
2.保肝护肝
红枣中所含的糖类、脂肪、蛋白质是保护肝脏的营养剂。它能促进肝脏合成蛋白，增加血清红蛋白与白蛋白含量，调整白蛋促进肝脏合成蛋白，增加血清红蛋白与白蛋白含量，调整白蛋白与球蛋白比例，有预防输血反应、降低血清谷丙转氨酶水平等作用。
3.防止落发
红枣有健脾养胃之功能。"脾好则皮坚"，皮肤容光焕发，毛发则有了安身之处，所以常食营养丰富的红枣可以防止发脱落，而且可长出乌黑发亮的头发。
4.健胃补脑
中医常用红枣养胃健脾。如在处方中遇有药力较猛或有刺激性药物时，常配用红枣，以保护脾胃，红枣中含有糖类、蛋白质、脂肪、有机酸，对大脑有补益作用。用红枣与面粉制成枣糕，能养胃补脑。
5.可补气养血
“红枣有补中益气，养血安神”之功效。红枣中的高维生素含量，对人体毛细血管有健全的作用。
延安红枣好处如此之多，我们就借助网络平台，让延安红枣的销售更上一个台阶，让更多的人受益!
3、项目的可行性
3.1、目前农村电子商务的发展
目前，从对中国互联网认识和使用的群体来看，绝大部分都集中于受过高等教育的人口。在电子商务迅速发展的情况下，农村电子商务出现了一些属于自己买卖的平台，秉承绿色、助农、至诚、共赢的价值观，树立开放式接入、专业化运营、市场化经营的经营理念，依托全省供销社行业资源，建立专业的、开放的、涉及农产品的电子商务平台"网上供销社"，联接城乡、服务三农，努力打造一条从线下到线上的绿色农产品通道。网上供销社全面整合供销社行业资源，以最优质、最全面的服务，为农民兄弟解决“买难”、“卖难”问题
3.2、农村网络使用的增长
近年来，农村经济的不断发展，农民的生活也火起来了，互联网也相继进入了各家各户。
4、方案策划
4.1、网络广告推广营销战略
4.1.1、网络广告
①广告目标
扩大陕北延安农村地区红枣的知名度，使其更好地走向市场。
②广告定位
篇7
姓名
性别
男
学号
分院
现代服务系
专业
实践
单位
山东百利通亚陶科技有限公司
实践
岗位
助理技术员
实习
时间
2021-09-10至2022-12-10
（一）实践主要内容及进程
1. 对生产原料以及产品进行质检，将不符合生产标准的原料、产品淘汰，提高成品率
2. 及时处理或上报各工序出现的的异常情况，恢复正常生产
3. 协助技术员做好组织生产工作，保证车间员工严格按照工艺标准及相关准操作规程进行生产
4. 负责设备工序的组装与打包，对生产车间和设备进行日常维护
（二）主要收获与体会
通过此次实习，我学到了如何运用所学知识解决处理简单问题的方法与技巧，积累了一线的生产知识，增强了实践操作技能，为专业课学习打下坚实的基础。同时使我体验到了社会工作的艰辛，磨练了自己的意志。更重要的是，我懂得了与员工同事相处沟通的有效方法途径，积累了社会工作的简单经验，为毕业后走向工作岗位打下了一定基础。
（二）对实践单位的建议
1. 检修器件后剩余材料、备件应注意重新入库，避免造成浪费。
2. 生产车间需保持通风状态良好，整洁。
3.
（四）实践成果
1. 对车间生产流程、工艺标准以及有关注意事项建立了清晰的认识
篇8
自动化认识实习报告一
一、实习目的和任务
认识实习是实践性教学环节中的重要组成部分，是实现本专业应用型人才培养的主要手段之一。通过实习使学生对工业企业生产过程和主要设备，以及自动控制在工业生产中的应用有一个全面、感性的认识，提高学习专业知识的积极性和主动性。
其任务是：通过参观了解工厂的生产概况及生产组织和管理的一般情况，了解自动控制在工业生产中的作用，了解工厂电气控制设备生产状况，了解电气控制技术的新工艺，新设备及电气控制的新方向，了解工程技术人员、生产管理人员在生产和试验过程中的作用和职责。
二、实习时间
20xx年6月21日-20xx年6月25日
三、实习地点
湘潭市各有关工厂企业【湖南京电开关厂、世通电气、双马电气、超宇科技和凌天科技】
四、实习内容
20xx.6.22 星期二 多云
今天我们参观湖南京电开关厂，该厂位于湘潭市双拥路27号火炬创新创业园，早上8：10后，我们坐车奔赴了目的地。
湖南京电开关厂是隶属于国家电网公司中兴电力实业发展总公司的全资企业，于1995年成立，厂房面积约7200平方米。注册资本人民币壹仟贰佰万元整，是电力、冶金、矿山、煤炭、化工等行业高低压电器和高压低压电气成套设备的专业生产厂家,是湖南省电器行业的重点骨干企业。
该厂子分为两层，我们首先参观了第二层，我们去的时候，有些工人正在工作，那里的一个师傅给我们介绍了一些产品的性能、结构、原理等方面的知识，限于专业知识还没有学到，部分东西还不能理解。但对这些产品有了感性的认识，同学们参观时兴趣盎然，都对这些以前没有见到过的东西有着浓厚的兴趣，我们几个同学走到一个接线工人的工作台观察她接线，只见他技术娴熟，接线速度很快，而且美观。我们很多人在旁边看了好久，都对她的接线技术赞不绝口，自叹不如，我们觉得自己在以前的电工实习上接的线都比这个差了很多，同学们表示自己一定要多动手，把自己要做的事情做的美观，就像接线工人接的线一样结实、漂亮!
参观完了第二层，我们来到了第一层，这里没有工人在生产，有很多的开关都摆在这里，我以前总觉得开关是个非常简单的东西，不就一开一关吗?能有什么高级的开关么?事实证明我错了，开关很多，我之所以这么想，就是以前接触过的都是生活中见到的简单的开关。在这里，我们看到了VSI型户内高压真空断路器、KYN28A(GZSI)-12户内交流金属铠装抽出式开关设备、VJD中压固封式真空断路器、GCS型低压抽出式开关柜和MNS型低压成套开关装置等设备。
在这里，我具体GCS型低压抽出式开关柜的一些情况，我从挂在那个柜子上的说明书上了解到：这种低压抽出式开关柜的主构架为两种,全组合式结构和部分焊接式结构;装置各功能室严格分开, 各功能室主要分为单元式、母线式、电缆式,各单元的作用相对独立;水平母线采用框后平置式排列布置,以增加母线抗短路电流电动力的能力;电缆间采用上下进出线方式;按三相五线制或三相四线制;一个抽屉为一个单元, 抽屉尺寸分为一单元、二单元、三单元、二分之一单元、四分之一单元, 五个尺寸系列, 各单元回路额定电流在630A及以下。抽屉尺寸的变化仅仅为高度的变化, 其宽度、 深度不能变化,相同功能的单元可以互换。
MNS型低压成套开关装置我也了解了一下，它适用于发电厂、变电站、石油化工、冶金轧钢、轻工纺织等厂矿企业和住宅小区、高层建筑等场所，作为交流50～60Hz，额定工作电压交流660V及以下的电力系统的配电设备的电能转换、分配及控制之用。
VSI型户内高压真空断路器我也仔细地看了一下产品说明书，它有很多优点，其优点之一是：它的触头常采取对接式触头。因为一般的真空断路器在分闸状态下动静触头的距离只有16mm这么小的距离很难制作出其他形状的接触面，而且平直的接触面瞬间动作电弧的损伤也较小。真空断路器的优点之一是体积小，动静触头要在一个绝对真空的空间内动作，如果制作成其他的对接方式也会增加断路器自身的体积!
说实话，我还不太懂得这些高级开关设备的原理，这次在京电开关厂的参观使我对电器原理产生了更大的好奇，我一定在大三的时候努力学好专业知识，立志以后从事电气行业，为电气事业奉献自己的绵薄之力。
自动化认识实习报告二
一、实习目的
1. 通过亲身接触自动化设备和实验器材，并且通过老师及工厂人员的讲解，对自动化专业进行初步的认识，在实践中验证、巩固和深化已学的专业理论基础知识。
2.加强对企业技术操作的理解，将学到的知识与实际相结合，运用已学的专业基础课程理论知识，对实习单位的各项技术操作进行初步分析观察和分析对比，找到其合理和不足之处，灵活运用所学的专业知识，在实践中发现并提出问题，找到解决问题的思路和方法，提高分析问题和解决问题的能力。
3.见识电子控制类产品的设计、开发及维护等过程，理解自动化专业的发展动态与专业前景。
4.通过一定的实践认知实习，为以后的毕业设计及论文撰写做好铺垫。
5. 让我们了解到知识与现实之间的差距，提升自己实际的工作能力，领悟到现实工作中我们需要什么，我们应该朝哪一方面发展，对我们以后的发展指明了道路，为今后真正走上工作岗位打下良好基础。
二、实习地点及时间安排
1.实习地点：
中冶连铸技术工程股份有限公司
2.时间安排：
8：30 由武汉科技大学黄家湖校区出发
9：20 到达中冶连铸技术工程股份有限公司，开始参观
11:00 返回学校
三、实习单位介绍
中冶连铸技术工程股份有限公司(简称中冶连铸，CCTEC)，是由中国冶金科工集团(MCC)发起设立的科技型股份制企业。xxxx年，中冶集团在美国《财富》杂志评选的世界企业500强中，排名第280位。中冶连铸总部设在武汉，是国内最大的以连铸、板带冷轧与表面处理为特色的冶金专业化技术工程公司;xxxx年7月，中冶集团宣布，中冶南方合并中冶连铸，自此，中冶连铸成为中冶南方的全资子公司。
公司主营业务为：方坯、板坯和薄板坯连铸连轧工程，板带冷轧与处理工程和工业电气自动化控制系统。自动化专业认识实习心得。中冶连铸现依托集团各项优势在北京设立了分支机构，从事国内外海水淡化项目的投资、建设和运营。连铸核心业务有：EPC工程总承包，事业部具有专业化连铸技术研发、工程设计、设备制造能力的优势，可以为客户提供各类连铸机(大小方坯、圆坯、矩形坯、异型坯、扁坯、板坯、薄板坯等)的设计、制造、安装、调试一条龙工程总承包及单项服务;技术服务，事业部依靠专业化连铸技术研发实力，为客户提供连铸生产工艺、品种开发、生产工艺诀窍、铸坯质量问题诊断等相关技术服务;设备维护服务外包，事业部具有专业化连铸设备制造、供应链管理能力，能够提供连铸设备维护服务外包，为客户带来良好的经济效益。
公司人力资源实力：xxxx年初，公司已有职工854人，其中技术管理人员496人，拥有博士学位11人、硕士学位101人、高级工程师以上职称83人。公司在北京设有自己独立的研究院，拥有多项自主知识产权的核心技术，每年研发费用占营业额的5%#from 本文来自高考资源网gkstk.com end#，研发实力强大。中冶连铸拥有专业的设备制造基地中冶易新科技，设备制造能力强大。主要机械、电气设备在公司内部制造完成，产品质量和交货期有保证。
事业部/子公司：连铸事业部、海外事业部、北京科贸、斯瑞普科技、中冶易新科技、中冶重工。
四、实习内容
1月5日我们到了中冶易新科技股份有限公司，在实习开始，由公司员工李华刚师傅带领全班同学对公司各个车间进行专业性的参观，在车间里李师傅对同学们参观中的疑问进行了专业、技术性的讲解。在参观过程中，李师傅针对我们专业对他们车间采用及开发的新技术、新设备进行了详细的介绍，这对我专业知识的认识更深了一层。各个车间各司其职，但又紧密联系，比如做一台轧钢机，它需要各个车间的配合，从最初的图纸设计到最后的零件组装要求毫无差错，精密准确。
对于李师傅介绍的一些简短又新鲜的名词如铜排总、分控制机PID等，同学们疑惑百出，纷纷提出自己的疑问。而李师傅耐心的为我们在专业技术与知识方面进行了解惑，电子产品本来就更新速度快，在技术研发方面需要什么，大学生需要具备什么，专业的发展前景怎样等问题他都做了非常详细的介绍。因为他做该公司工作了挺长一段时间，所以对大学生他很了解，对我们在大学中应掌握的技能都做了一些要求，对专业知识的掌握以及在他们产品中占据的地位进行了解惑，让我受益匪浅。
五、实习心得与体会
通过此次实习，让我学到了很多课堂上更本学不到的东西，仿佛自己一下子成熟了，懂得了做人做事的道理，也懂得了学习的意义。我看清了自己的人生方向，也让我认识到了从事电子工作应支持仔细认真的工作态度，要有一种平和的心态，创新的精神，应该拥有一颗随时接受考验的心，迎接未知的世界。
实习期间，我谦虚谨慎，认真听取相关技术人员的指导讲解，并能够仔细观察、切身体验、独立思考、综合分析，也培养了我的耐心和素质，能够做到服从指挥。感受到了提出疑惑和疑惑解决后的。对自己的专业也更喜爱，不再迷茫。
篇9
光阴似箭，岁月如梭。一晃几个月的实习生活已经过去了，在最近的几个月的实习过程中，我有着许多的收获和欢乐，但也有苦涩和教训，这些成功的经验将激励我在以后的人生之路上取得更大成绩。下面是小编和大家分享的实习期间自我鉴定报告资料，欢迎参阅。
报告一
光阴似箭，岁月如梭。一晃几个月的实习生活已经过去了，在最近的几个月的实习过程中，我有着许多的收获和欢乐，但也有苦涩和教训，这些成功的经验将激励我在以后的人生之路上取得更大成绩，失败的经历将使努力去改变自己不完美的地方，让自己在以后的日子做的更好，这一切将成为我生命中最宝贵的财富之一。
我实习的单位是厦门富仪建筑设计有限公司。富仪建筑设计有限公司是一家从事企业设计模型(BIM)及技术开发与实施服务的高新技术企业。一开始我主要是了解企业文化，了解易维的价值之处，我从培训中了解到QAD、SAP、EPICOR这几家都是全球前几名的软件公司，同时他们的ERP软件都是全球商业软件市场的领导厂商。富仪公司是一家台商喜人企业，QAD是专门为制造业企业提供信息化解决方案的软件公司。所以富仪是一家国际化的企业。富仪还有他的一批典型的客户，这些客户长期与富仪合作，达成了长期的合作伙伴关系。在这样的环境中生活，每天擦肩而过的都是IT精英，不知道会不会因此而感染，不过可以感觉到很自豪，也很荣幸，因为可以学到很多东西。
我实习的岗位是绘图员，作为实施绘图就要学习BIM系统，BIM系统的各个模块要了解他的作用以及怎么样操作。其中人事、考勤、薪资、合同、保险模块是一个公司或者一个企业都必须具备的软件，起先学习的也就是这些，经过不断的培训、练习、测试基本了解了系统的功能。除了学习系统外，我还学习了Revit数据库开发技术，这是开发组必须学的东西，但是对我们实施的如果能够掌握好这门软件，就能更好的运用系统，还能用PB快速的画出各种各样的报表。Revit是一款设计各种建筑的一款BIM软件，它采用面向对象的开发技术，具有可视化图形用户界面，开发人员能够使用它快速开发应用程序。
通过几周紧张而又忙碌的生活，我渐渐适应了这样的高压力，高动力。这一切让我深刻地体会到做任何事情都必须尽自己最大的努力，也只有尽了自己最大的努力才能将工作作好、做扎实，才能得到领导和同事的认可，这段艰难的经历将激励我在以后的日子更加努力的付出，因为只有付出才有可能获得成功。刚刚踏入社会碰到挫折是正常的，现在主要是看我们的承受能力了，有时候有些事情是要靠自己去争取，可是又有些时候由于种种关系我们都胆怯了，因为我们无法了解社会的这些所谓的条条框框，因为我们还没有真正的融入这个社会。对于初出茅庐的我们来说，缺少的是阅历，缺少的可能也是那份交际，毕竟大学还算是纯洁的净土，没有任何利益关系可言，人与人之间也是毫无戒备的。
经过这个几月的实习，真的改变了很多，也真的成熟了很多，需要学习的真的还有很多。实习对于我们刚踏入社会的大学生真的是一个历练的过程。实习是让我们有一个认识社会的过程，首先通过这样的方式来接触社会，所以碰到挫折是难免的。每当遇到问题的的时候，通常我都会自己试着解决，然后通过群里请教前辈们，他们都能很好的帮着我去解决，这又使我感觉到集体的温暖，从而更有信心的完成工作，认真做好每一件小事将是我们每一个人都必须去努力追求的。在实习中，我一开始我都是在学习BIM概念系统，通过几次实施组的会议中，我渐渐的明白了光光掌握系统远远不够，还要掌握HR顾问必备的额外的一些知识，每当客户问你的时候必须给以很好的解释。所以他们会安排我收集一些关于BIM概念系统中的一些资料，并且做课程进行演讲，这样既锻炼我的胆量也有了和其他同事之间的一个交流。还有就是一些文字上的训练，常常要整理一些会议记录啊，多方面锻炼我的才能。在此我要感谢公司给我学习的机会，还要感谢诸多同事在工作上给我的帮助，才能够使我成长，使我进步。
经过几个月的实习生活我深深的认识到，踏入社会不仅仅要认真努力的工作，最重要的还是要学会做人，记得前辈们说过要做事必须先学会做人。所以交流沟通十分重要，交流沟通是一种智慧，是一种为人处事的生活方式，我会慢慢改变自己，让自己拥有交流的智慧，养成一种为人处事的良好生活方式，这一切不仅是个人发展的需要，也是时代和社会发展的趋势。
路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。通过几个月的实践学习，我学到了许多在校园内无法学到的知识，这些宝贵的人生经历将激励我在以后的人生路上勇于实践，开拓创新，为人生的下一次辉煌奠定坚实的基础，成为我受益终生的宝贵财富。
报告三
转眼间三个月的实习过去了。从学校到社会的大环境的转变，身边接触的人也完全换了角色，同学变成同事，相处之道完全不同。在这巨大的转变中，我们可能彷徨，迷茫，无法马上适应新的环境。我们也许看不惯企业之间残酷的竞争，无法忍受同事之间漠不关心的眼神和言语。很多时候觉得自己没有受到领导重用，所干的只是一些无关重要的杂活，自己的提议或工作不能得到老板的肯定。做不出成绩时，会有来自各方面的压力，老板的眼色同事的嘲讽。而在学校，有同学老师的关心和支持，每日只是上上课，很轻松。常言道：工作一两年胜过十多年的读书。六个月的实习时间虽然不长，但是我从中学到了很多知识，关于做人，做事，做学问。
“在大学里学的不是知识，而是一种叫做自学的能力”。参加工作后才能深刻体会这句话的含义。课本上学的理论知识用到的很少很少。我担任的是减速器操作一职，平时在工作只是在流水线上工作，几乎没用上自己所学的专业知识。而同公司的技术人员就大不一样了，虽然他们已经学了很多知识经验和技巧，但是在这个信息爆炸的时代，知识更新太快，靠原有的一点知识肯定是不行的。我们必须在工作中勤于动手。
最庆幸的是实习结束后我还能回到学校在学习新知识，我会在接下来的半个学期里加倍学习，阅读跟自己专业相关的书籍为下次进入工作岗位做准备。
报告四
两个月的实习，让我受益匪浅。课堂教学、班主任工作、教育调查三项都颇有成绩也颇多感慨。其中付出的努力、其中的感慨、其中的得与失，恐怕是这寥寥的纸张无法承载的。 首先，我就课堂教学这个方面谈谈我最深的体会。这些体会也许不如那些经验丰富的老师们真知灼见，却对我也是一笔难得的财富。我教的是305班，这个班的班主任老师是三年级的组长，教学理念新颖，因此颇受关注。到底该如何教好这个班呢，开始我一脸的茫然。思考之后，我决定先从指导老师的上课风格、学生的语文水平、教材的理念这些基本情况入手。进班第一周的三天里，我总共听了指导老师四堂课，发现她的课堂大半交给学生，课堂气氛活跃。因为工作繁忙加上又要包班，她不可能有大量时间教我具体该怎么分析课文、怎么调节气氛、怎么设计教案。但她给了我一个总的教学思路：把课堂话语权交给学生。用她的话说，一节课能让所有的学生都在听都能听明白都能学到东西，这堂课就算成功了。这句话可以说是她对我指导的核心，但在后来的教学实习中，我发现这句话也是使我受益最多的。虽是是这么简简单单一句话，却胜过千言万语。
之后的一个礼拜，我通过与指导老师交流、批改作业、代课、下课到班里巡视、放学后与作业拖拉而留下来写作业的学生交流初步了解了本班同学的成绩水平。得知这个班的成绩水平还可以，除了一个转学生，一个学习困难儿童以外，其他学生的平均学业水平在年级里都是拔尖的，且全班的学习氛围很好，课堂纪律和作业上交情况都非常好，学生的课外阅读量很大，作文水平尤其突出，更重要的是他们不局限于传统的课堂教学，不喜欢老师垄断课堂。了解了这些情况，我再仔细的研究了一下教材与教参。教材总体上要求教学中充分发挥学生的主体性、创造性，它从先前的应试教育转为对学生综合能力的提高上。所有的这些给我的只有一个讯息——我不能只用传统的教学方式教学。虽然这一周里我也匆匆忙忙代了一些课，但是相比我的目标还是觉得差太多，但是两个礼拜观察下来，我开始觉得自己已经准备好了。
利用双休日，我翻阅了大量的资料，再结合本班实际，完成了下一周的备课。设计教案是一件很辛苦的事，耗体力也耗脑力，同时也是一件颇艺术的工作，经过良久的冥思苦想，忽然头脑开窍，一个思路出来了，一个问题解决了，那种成就感、兴奋感是不言而喻的。到了后来的教学实习，我才更深刻的切身的体会到一个好的教学设计对上好一堂课的重要性。教案和讲课是相辅相成的，又是必须灵活变通的。我的教案、我;的课堂，学生的参与是三个不可忽略的极其重要的组成部分。下面，我具体结合教学实习谈谈我的一种教学模式。某种程度讲，它已经成为我在这两个月里的教学风格。它取得了良好的效果，颇受指导老师的赞赏和学生的喜欢与接受。
我的课堂大都采用一种教师点拨法即设问析疑。所谓设问析疑，是教师首先由一堂课的的主题入手提出问题，然后引导学生回答、分析疑问并由此把学生引导到预定的教学目标中。通过这种设问析疑，在加上适当的讨论，某些课文再结合适应三年级学生情况的教学方法进行教学。尤其是在语文教学中，考虑到三年级学生丰富的想象力，必须留有大量的时间由他们思考、发言、提问，对比传统的满堂灌式教学，这样一方面能够保持学生的创造性，一方面不会扼杀他们的想象力，更重要的是，营造了一种积极的课堂氛围。这在我见到高年级班级上课时整堂课没有几个学生举手发言的情况后觉得尤其有意义。这里，我只抓住设问析疑这个点谈谈我的见解和感受。
法国教育学家第惠多斯说过：教学的艺术不在于传授本领，而在于激励、唤醒、鼓舞。那么，怎么去激励、唤醒、鼓舞听课者呢?让他们参与课堂，给予他们更多的机会，惟有这样，学生才会更加的融入课堂，惟有这样，学生的学业水平才会有所提高。设问析疑无疑是一个较好保证学生参与课堂的一种的教学模式。经过多次实习，我发现这种教学模式有颇多好处，具体的说有助于学生思考多方面的意见，增强学生思维的灵活性，发展了学生清晰明白地交流思想和看法的能力，有助于发展学生分析和综合的能力，鼓励学生专心地有礼貌地倾听，使学生的想法和体验得到了尊重，使学生成为知识的共同创造者。总的说来设问析疑可充分增强学生的创造性、口头表达能力、应变能力以及学生的主动性。
可以说，具体如何设问、如何析疑是设问析疑的关键。我把一堂精彩的课看作是一曲动人的交响曲，提问则是这乐曲中的旋律。如何提问，首先需要教师吃透教材、明确教学目标、重点和难点，准确落实设问点。有的时候，不仅老师可以提问，学生也可以提。问题提出来了，如何引导呢?首先对学生的发言应该鼓励。发完言后应有恰当的评价。不要小看了那几句鼓励的话，它对激发学生的积极性至关重要。有好几位学生在给我的留言本里写道：“谢谢老师对我的鼓励，谢谢老师对我回答问题的赞美和肯定。我从没想过我还会受人关注，我从没料到我的发言也可以受到肯定。我们需要肯定，需要关注，需要鼓励。”这是他们心底发出的话，因此不要忽视了给她们鼓励。我的指导老师在这方面就做得很好，所以每次把自己的课与她的课比较起来，我都觉得自己还有很多不足有待提高。也许是接受了十余年沉闷的课堂教学，很多理念虽然在脑海中涌现，但是在实际运用中不知不觉有时又走了老套路。与指导老师谈话的过程中我得知她在实行这种教育理念的初期也承受着巨大的压力：万一效果不好怎么办?但好在这三年的努力证明她是对的，从每一个学生快乐的笑脸、从每一位家长满意的赞许声中这一切都变得值得。
其次，在为期两周的班主任工作实习中，我从各位老师身上还充分体会到“爱心”在师生中的关键作用，只有你对学生付出真爱，你才能取得学生对你的尊重和信任。就比如在课堂教学之余，我需要监督学生的学习、纪律以及卫生，在监督的同时，不忘给他们灌输一些道理，能结合他们的年龄特点进行思想道德教育。然而我渐渐发现我们班有太多调皮的学生，又或者对于三年级才九岁的儿童，调皮才是他们的天性，但是学校的规章制度，课堂的纪律不允许他们过分调皮。我发现自己很难对他们进行思想教育，你不能对他硬来，你越是态度强硬，他内心就越反抗。于是我向同年级另一位班主任请教为什么她班里的学生都特别懂事自律，她告诉我，对于学生，在平时应和他们多交流，在交流中适当地通过一些他们能够理解的生动而有哲理的小故事启发他们自己领悟，而不是纯粹残暴地压制，要相信他们自己能够懂事，果然，借鉴成功老师的经验，我的班主任工作开展得异常顺利。
另外，在实习期间，我积极参加学校组织的各项听课评课活动，认真完成每一次包班工作、代课任务，这些宝贵的经历，使我有更多的机会接触到除我所在年级外其他年级更多优秀的老师，听到更多的好课;同时我作为实习班主任组织了一次以“推广普通话”为主题的主题班会，这次主题班会由两名同学主持，采取了分角色演讲、讨论、朗诵、合唱等形式，取得了圆满成功，班主任给予了高度评价。这些都丰富了我的阅历。
篇10
宾就是客人，只有把对方当客人，自己才能有感恩之心，才会有克制之心，才可能站在对方的角度思考问题、处理问题。教师和学生、家长之间也要做到相敬如宾，要保持一定的距离。
1.要把学生当孩子
这是开展一切教育活动的基础，把学生当孩子，你就会明白爱和责任这两个教育法则的真正含义；把学生当孩子，你就不会把大人的意志强加于他们身上；把学生当孩子，你才会懂得要选择适合孩子的方法来教育他们。
2.别把学生当自己的孩子
面对自己的孩子，也许你还可以随心所欲地教育他们，因为他是你的孩子，即使错了，他也会原谅你。但学生只是孩子，而不是你的孩子，如果你也把他们当成自己的孩子，爱之深、责之切，那你的麻烦就来了。
3.别把学生当以前的孩子
当我们还是学生的时候，都很尊敬教师，不管在学校里发生什么事情，都不会和家长说，受到了委屈也是尽可能地将大事化小，小事化了。家长也很忙，一般也没有时间来管孩子。现在就不一样了，现在的孩子不但会在家里讲自己在学校的事，还会讲别人的事，更可怕的是会断章取义地讲自己受委屈的事。而现在的家长又以冲动型的居多，看到自己的孩子受了委屈，就会把所有的责任都推到教师身上。如果我们把现在的孩子当成是十几年前的我们自己来教育，那就大错特错了。
4.别把学生当作简单的个体
学生的背后是家庭，在面对一个学生的时候，你其实是面对着这个家庭。所以你应该了解这个家庭、了解这个家庭的一些生活习惯。如果你不能主动去了解他们家庭的优缺点以备后患，那说不定，不经意间你的麻烦就出现了。
二、刚柔并济
刚柔并济，要求我们在教育学生时，必须要做到一手打一手揉，除了要有严厉的教育，还要有温暖的安慰，一只手打疼了学生，就要用另一只手去抚慰学生。
1.真正的教育在后半场
现在学生的抗压能力普遍都比较弱，以前说有学生跳楼，大家都会觉得不可思议，而现在学生跳楼已经不是什么新鲜事儿了。仔细分析一下，导致学生跳楼的原因虽然有很多，但有一c应该引起我们的重视，那就是后半场的教育问题。当你严厉地批评了某个学生之后，在你当众拒绝了学生的要求之后，当学生感到委屈的时候，你有没有注意到学生的心理变化，你有没有在用一只手打了学生之后，用另一只去安慰一下他们呢？
现在的学生在情绪发作的时候，是什么事都干得出来的，但后半场的教育就像是和风细雨一般，能抚平学生内心的创伤，让学生感受到温暖。一是给了学生下台的机会，二是给了学生思考的机会，三是给了学生平复心情的机会，也许这只是教育中的一些细节，但却是教育的关键。
2.我们所做的不一定都是对的
我们以为自己是一片好心，我们教育他们完全是为了他们好，可是万万没有想到，有些学生竟然是那么抗拒，甚至坚决不从。我们觉得很受伤，觉得学生不懂事，可是我们有没有考虑过学生的心理感受呢？学生为什么会抗拒？是抗拒我们的爱心吗？
不是的！学生抗拒的，不是教育的内容，而是我们的教育方式。因此，教育者一定要明白一个道理，即我们所做的也不一定都是对的。学生有自己的价值观，我们要学会换位思考，想一想假如我是学生，这样的方式我能接受吗？
3.给学生发泄的机会
心理健康教育是一项专业要求很强的工作，我们教师虽然拥有B证、C证，但充其量也只是个伪专家。
但不管你是否承认，学生的心理问题都客观存在。要想用非专业的手段去解决专业的心理问题，我们可以尝试一个最原始的方法――发泄和倾诉。对于成年人来说，男同志遇到烦恼的时候都喜欢喝酒，一醉解千愁；女同志遇到委屈的时候都想大哭一场，让烦恼随眼泪飞走。这些都是很好的心理调节方式，而对于小学生来说，这些方法同样有效。让学生喊出来、说出来，心理问题就没有体力和心力去累积了。
4.刚柔并济、先刚后柔
当刚柔并济无法同步时，我们应该先威严后温柔，这样的温柔是风雨后的阳光，总是会让人无比欣喜。
当然，还有一个很重要的事情，就是不要让学生丢了学业。当学生放弃学习的时候，他就会觉得无所事事，逐渐开始做坏事，问题学生就这样产生了。哪怕学生并不聪明，也一定要培养他们的学习兴趣，要让学生有事做。否则，你再怎样刚柔并济都无济于事。
三、掌控时机
教育除了形式和内容，还有它内在的时间规律。
1.有些事要第一时间处理
如，学生受到伤害，不管轻重，都要第一时间通知家长，并及时进行简单的包扎或送医院进行治疗。有礼有节，才能让家长无话可说。
学生犯了错误，你批评了学生，也要第一时间告诉家长，争取家长的理解，当然你后续的“温柔”也必须跟上。这样你的规矩也做了，家长也理解支持了，你的麻烦也就没了，说不定家长还会感谢你呢！
2.有些事要让子弹先飞一会儿
教书一辈子，我们要跟各种各样的学生和家长打交道，但有一个原则必须坚持：遇事要冷静，不要与学生发生正面冲突。一旦发生冲突，错的永远是教师，不管你的出发点是什么，也不管学生是多么调皮，因为你是教育者，他是受教育者；一有冲突，除非你是大获全胜，否则你的威信就没了，其他学生都看样子，你的工作永远失去了先机。
学生当面与你顶撞的时候该怎么办？你感觉到全班学生内心反抗情绪很激烈怎么办？这个时候千万要记住：自我保护是第一位的，该忍的时候要忍，该让时候的要让。有时候不妨让子弹先飞一会儿，避其锋芒，日后再慢慢图之。三十六计，走为上计，现在的撤退是为了将来大踏步地前进，现在的自保是为了将来更好的发力。
3.有些事要适得其“火”
当你第一次发火时，威力是百分之百的，第二次发火的威力就只剩下50%，之后一次比一次少，火要发在刀刃上。尤其是让学生到办公室订正作业的时候，你先发了一通火后，学生战战兢兢、如履薄冰，这次补习也就基本无效了。
此外，你跟学生一个人发火，和跟一群学生发火，威力又不一样。跟一群人发火时，大家会觉得反正法不责众，无所谓。而你，还要承担很大的风险，尤其是当孩子断章取义地把你的话告诉家长时，很多学生都会童言无忌地为这个同学作证，这个时候你就百口难辩了。
4.有些事要“见好就收”
教师让学生罚站、把学生拖到教室外，这也算正常的惩罚。但有些教师一忙起来就忘了学生在罚站。一开始学生会有些害怕，但时间一长，学生就会觉得无所谓了。如果碰到比较调皮的学生，跑出去玩儿了，受伤了，你该怎么办？所以惩罚学生，要学会见好就收。
