细胞膜范文
时间：2023-04-05 20:39:53
导语：如何才能写好一篇细胞膜，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
1、细胞膜是细胞表面的一层薄膜，细胞膜呈液态，可以流动。
2、细胞膜的功能主要是维持细胞的一定形态，对细胞起保护作用，活的细胞不断进行新陈代谢，既可以从周围环境当中摄入必须的营养物质以及氧气，又可以排出代谢产物，细胞内外的物质交换必须通过细胞膜。
3、细胞膜在显微镜下是非常清晰的，是脂质双层的结构，细胞膜有选择性的让物质通过，它可以使某些小分子物质透过，而对一些有害的物质或大分子物质限制通过，保持细胞内物质的稳定。
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篇2
【摘要】 目的： 研究γ射线辐照对β淀粉样肽(Aβ)诱导的红细胞膜损害的保护作用. 方法： 红细胞经50 Gy和100 Gy γ射线照射后，再用Aβ处理，分别用分光光度法测定红细胞溶血率和渗透脆性；扫描电镜观察细胞形态；1，6二苯基1，3，5己三烯（DPH）荧光探针标记检测细胞膜流动性. 结果： γ射线辐照可抑制红细胞的自然溶血和Aβ导致的溶血，但只有100 Gy辐照的差异具有统计学意义（P
【关键词】 γ射线； 淀粉样β蛋白； 红细胞； 溶血； 膜流动性
0引言
低剂量γ射线辐照（
1材料和方法
1.1材料新鲜全血取自健康志愿者，枸醛酸抗凝；Aβ和荧光探针1，6二苯基1，3，5己三烯（diphenylhexatriene， DPH）（美国SigmaAldrich公司）；其它试剂均为国产分析纯. 1240型紫外可见分光光度计 (日本岛津公司)；LS55型荧光分光光度计（美国PerkinElmer公司）；3k30型冷冻离心机（美国Sigma公司）；Gammacell R 1000型血液辐照仪 (加拿大Nordian公司)；Quanta 200型环境扫描电镜（荷兰PhilipsFEI公司）.
1.2方法
1.2.1红细胞的制备和辐照处理取新鲜全血750 g，4℃离心10 min，吸去上层血浆和白细胞，并用等渗PBS（150 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L NaH2PO4，pH 7.4）洗涤3次，制备成200 mL/L细胞悬液，然后用γ射线照射，照射剂量分别为0，50和100 Gy.
1.2.2红细胞溶血率的检测照射过后的红细胞悬液用等渗PBS稀释至20 mL/L，加入Aβ使其终浓度为5 mg/L，37℃水浴30 min后取出，750 g，4℃离心10 min，取上清， 540 nm处测出吸光度值A1；沉积红细胞用蒸馏水全溶血后离心，用同样方法测得吸光度值A2. 按下式计算溶血率：溶血率（%） = A1/（A1+A2）× 100%.
1.2.3扫描电镜观察红细胞形态处理过的红细胞经终浓度为10 g/L戊二醛固定，用500，700，900，1000 mL/L丙酮系列脱水，喷金后进行扫描电镜观察.
1.2.4红细胞的渗透脆性测定红细胞分为未照射组，50 Gy照射组和100 Gy照射组. 配制不同渗透压的PBS，其中NaCl的浓度为0~135 mmol/L，在上述PBS中分别加入各组红细胞悬液，细胞终浓度为2 mL/L，37℃水浴30 min，取出后以1.3.2中的方法分别测溶血率，以NaCl浓度分别为135 mmol/L和0 mmol/L的PBS为对照和全溶血对照，计算50%溶血时的NaCl浓度.
1.2.5红细胞膜流动性的检测用四氢呋喃作溶剂配制2×10-3mol/L的DPH储存液，于棕色瓶中4℃低温保存. 工作液浓度为5×10-5mol/L，临用前用等渗PBS稀释. 红细胞用等渗PBS稀释至2 mL/L浓度，与DPH工作液等体积混合，于37℃水浴孵育45 min后，检测偏振荧光（激发光波长为362 nm，发射光波长为450 nm）.
统计学处理： 用SPSS10.0统计软件进行处理，实验数据以x±s表示，多个样本均数比较采用方差分析及t检验.
2结果
2.1红细胞的溶血率在未经辐照处理的情况下，等同实验操作可使红细胞发生少量溶血（溶血率
2.2红细胞形态未经γ射线辐照的红细胞，Aβ处理后形态发生明显改变，部分细胞出现棘突，并伴随有细胞的轻度聚集；经过γ射线照射后，Aβ处理的红细胞中变形的细胞比例减小，聚集程度相对降低，形态维持较好. 说明γ射线照射对红细胞维持正常形态有一定的作用（图1）.
A: 对照组； B: 未加入Aβ，辐照剂量为50 Gy； C: 未加入Aβ，辐照剂量为100 Gy； D: 未经辐照处理的RBC加入Aβ； E: 加入Aβ，辐照剂量为50 Gy； F: 加入Aβ，辐照剂量为100 Gy.
图1红细胞形态的扫描电镜观察×2000（略）
2.3红细胞的渗透脆性红细胞的渗透脆性反映了细胞对低渗溶液的耐受性. 经过γ射线照射的红细胞与未照射组相比较，细胞膜的渗透脆性有下降趋势，未照射组，50 Gy和100 Gy照射组在50%溶血时对应的NaCl浓度分别为82.3 mmol/L，80.7 mmol/L和78.9 mmol/L，说明红细胞在这一渗透压范围内随着照射剂量的升高，其低渗耐受性有所提高，细胞膜在低渗环境下的稳定性增加.
2.4红细胞膜流动性偏振条件下DPH荧光的各向异性值可反映细胞膜的流动性，各向异性值越低，其膜的流动性越高. 实验结果显示，加入Aβ后各向异性值变化很小（P>0.05 ），说明Aβ几乎不影响细胞膜的流动性. 红细胞经50 Gy和100 Gy γ射线照射后，DPH荧光的各向异性值降低，50 Gy和100 Gy照射组与对照组（0.36±0.02）相比较分别降低至（0.29±0.01）和（0.26±0.01），细胞膜流动性有所提高（P
3讨论
γ射线的生物学效应与其剂量有关. 在本研究的实验条件下，经50 Gy和100 Gy两个剂量的γ辐照处理之后，红细胞的自身溶血作用和Aβ诱导的溶血作用均有所降低，说明该剂量范围的γ辐射具有稳定细胞膜的作用. 细胞正常形态的维持依赖于细胞膜及膜骨架的支持，因此细胞形态可以反映细胞膜的结构和稳定性的变化. Aβ作用于红细胞后，部分红细胞发生棘突，形态改变，增加了膜融合和形成非专一性离子通道的可能性. 这提示Aβ的溶血作用与细胞膜的损害有关. 而γ辐射能够降低这种损害作用，使红细胞维持正常的形态，减小了Aβ的溶血作用. 我们认为，γ辐射的这种作用除了与膜蛋白的构象变化有关以外，还在一定程度上与细胞膜的流动性增加有关. 已有研究［6］表明，Aβ的细胞毒性的分子机制之一是Aβ通过在膜上的自聚集而形成非专一性离子通道，从而破坏细胞膜结构. 当膜的流动性降低时，如增加膜中的胆固醇含量或者减少不饱和脂肪酸的比例等，Aβ对细胞膜的损害会增强［7］. 这与本研究中γ辐照增加细胞膜流动性，同时降低Aβ诱导的膜损害的结果是一致的. 值得指出的是，经γ辐射处理的红细胞，仅在数小时内具有抑制Aβ溶血的作用.
综上所述，在一定的剂量范围内（30 Gy~100 Gy）的γ辐射能够降低Aβ导致的红细胞损伤. 通过对50 Gy和100 Gy两个辐照剂量的比较发现，100 Gy辐照的保护作用更强. 这两个剂量的辐照能够提高细胞膜的流动性，使细胞维持正常形态. 这些结果为进一步研究Aβ的细胞毒性机制和γ辐射对细胞的作用提供了依据.
【参考文献】
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［4］ Hirayama J， Abe H， Azuma H， et al. Leakage of potassium from red blood cells following gamma ray irradiation in the presence of dipyridamole， trolox， human plasma or mannitol［J］. Biol Pharm Bull， 2005，28:1318-1320.
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篇3
细胞膜上钠泵活动的生理意义是建立起一种势能贮备、保持渗透压。钠钾泵又称“钠泵”或“钠钾ATP酶”，使细胞外的NA+浓度高于细胞内，当NA+顺着浓度差进入细胞时，会经由本体蛋白质的运载体将不易通过细胞膜的物质以共同运输的方式带入细胞。
钠钾泵（也称钠钾转运体），为蛋白质分子，进行钠离子和钾离子之间的交换。每消耗一个ATP分子，逆电化学梯度泵出三个钠离子和泵入两个钾离子。保持膜内高钾膜外高钠的不均匀离子分布。钠钾泵的一个特性是他对离子的转运循环依赖自磷酸化过程，与之相类似的还有钙泵和质子泵，它们组成了功能与结构相似的一个蛋白质家族。
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篇4
目的: 探讨低浓度α生育酚对神经元细胞膜的保护作用. 方法: 培养SD胎鼠皮层神经元细胞作为实验对象. 将神经元细胞进行分组：正常对照组、氧自由基损伤组和不同浓度α生育酚处理组(10，20，40和80 mg/L). 用Fenton反应对神经元细胞膜造成损伤. 在损伤后1及2 h分别对各组神经元进行PI染色，利用激光共聚焦显微镜观察神经元细胞膜的损伤情况，并用TBA法检测神经元细胞外液中丙二醛(MDA)生成量. 结果: 80 mg/L浓度α生育酚可减少氧自由基对神经元细胞膜的损伤， 且可减少MDA生成量. 结论: 80 mg/L浓度α生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元细胞膜的损伤.
【关键词】 α生育酚 神经元 细胞膜 低浓度
0引言
氧自由基是引起颅脑损伤等多种中枢神经疾病继发损伤的重要因素. 而维生素E是一种天然的抗氧自由基物质. 维生素E共包括8种分子，其中α生育酚为公认抗氧自由基最有效的［1］. 在近年的研究中，已证实α生育酚可阻止氧自由基对细胞膜中多不饱和脂肪酸及膜蛋白的攻击，防止细胞膜功能的丧失［2］. 然而国内外学者对应用多大浓度的α生育酚才可有效保护细胞膜有很大分歧. 本实验我们利用Fenton反应形成氧自由基对胚胎大鼠皮层神经元的损伤，观察低浓度α生育酚对神经元细胞膜的保护作用.
1材料和方法
1.1材料α生育酚、碘化吡啶（PI）染料（Sigma公司，美国）；2.5 g/L胰蛋白酶、0.2 mol/L EDTA、各种细胞培养液（GibcoBRL公司，美国）；MDA检测盒，购于南京建成生物公司；300 mL/L双氧水，硫酸亚铁，维生素C和无水乙醇，均为国产分析纯. 孕14 d的SD大鼠2只，购自中国军事医学科学院实验动物中心. TE200E型激光共聚焦显微镜观察( NIKON公司， 日本)；TG150型二氧化碳培养箱(Jouan公司，法国)；CR22G型离心机（日立公司，日本）；UV240型紫外分光光度计（岛津公司，日本）.
1.2方法
1.2.1α生育酚水溶液配制取α生育酚10 mg溶于1 mL无水乙醇中，将无水乙醇缓慢滴入49 mL 30℃去离子水中，制成200 mg/L α生育酚水溶液母液备用. 碘化吡啶染料配制：将碘化吡啶粉末以去离子水溶解为终浓度为1 mg/L工作液.
1.2.2SD大鼠皮层神经元分离及培养将实验大鼠断颈处死，取胚胎脑皮层组织，剪碎，用2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 mmol/L EDTA，令其分散成单细胞悬液，过200目不锈钢网，于37℃， 50 mL/L CO2培养箱中进行培养. 隔日换液. 培养到第4日，细胞悬液于离心机中以1000 r/min速度离心10 min，去沉淀细胞，加入神经元培养液，接种于涂有鼠尾胶原的25 cm×25 cm细胞培养瓶中，使干细胞转化为神经元，隔天换药一次，第6日使用.
1.2.3实验分组将所有神经元培养瓶进行分组，共分为：正常对照组；氧自由基损伤组；不同浓度α生育酚处理组（10， 20， 40和80 mg/L亚组，与神经元作用1 h后备用）.
1.2.4利用Fenton反应造成神经元氧自由基损伤按照Yamazaki等［3］方法，在培养皿中加入硫酸亚铁、维生素C和300 mL/L双氧水，使溶液中硫酸亚铁终浓度为0.2 mmol/L，维生素C终浓度为0.2 mmol/L，双氧水终浓度为0.4 mmol/L，制作氧自由基损伤模型.
1.2.5PI染色按照袁兰等［4］方法，将PI粉末以去离子水溶解为终浓度1 mg/L工作液. 将氧自由基损伤组及α生育酚处理组及正常组培养瓶中加入试剂后，立即开始计时，并取反应开始后1和2 h培养瓶中的神经元进行PI染色，将PI工作液100 μL均匀滴在神经元细胞上，置于暗室中染色15 min，用pH 7.0 PBS液冲洗3遍.
1.2.6激光共聚焦显微镜观察细胞形态激光共聚焦显微镜荧光激发波长为567 nm，发射光波长大于590 nm，伪彩色采用红色，在保证信噪比的情况下尽量增大检测的pinhole和PMT. 选定5个图像清晰的视野，在200倍镜下观察. 细胞红染者为细胞膜损伤细胞，未染色者为正常细胞［4］. 每个视野随机计数100个神经元，记录其中有细胞膜损伤的神经元数，共记录5个视野内神经元，计算平均值.
1.2.7MDA测定采用MDA检测盒，结合紫外分光光度计，按照TBA法分别检测各组神经元培养瓶中溶液的MDA浓度. 每一次取0.1 mL溶液检测，每瓶测值为该瓶溶液的MDA浓度.
统计学处理：所有数据以x±s表示，多个样本间均数比较用方差分析，用StudentNewmanKeuls(SNK)法进行多组间两两比较. P
2结果
2.1神经元细胞膜损伤分析正常对照组只有极少荧光染色阳性细胞，而损伤组和α生育酚处理组均有荧光染色阳性细胞（图1，2）. α生育酚浓度为正常生理浓度10 mg/L时，不能有效消除Fenton反应所造成的氧自由基损伤. 而当α生育酚达到80 mg/L时，细胞膜损伤的神经元总数减少，有统计学意义.
2.2MDA结果分析80 mg/L α生育酚处理组MDA产生量低于单纯氧自由基损伤组（表2），但仍高于正常对照组.表1碘化吡啶染色结果比较表2不同处理组的MDA值比较
3讨论
氧自由基对于细胞膜有很多的损害［5］，所以，抗氧自由基治疗是减少颅脑损伤等病理状况下神经元损伤的重要手段.
α生育酚与氧自由基反应后，生成α生育醌，减少氧自由基与其他分子反应［2］. α生育酚为脂溶性，血浆浓度为5~10 mg/L. 在细胞膜中，维生素E与不饱和脂肪酸的比例为1∶1000，可以有效地消除正常生理状况产生的氧自由基对细胞膜的损伤. 在病理情况下，氧自由基大量产生，5 min内即可使血浆内的α生育酚浓度大幅下降，不能有效的对抗氧自由基的损伤［6］. 因此，早期补充α生育酚减少氧自由基对细胞的损伤，成为人们较感兴趣的治疗策略.
De Jesus Ferreira等［7］主张保护细胞膜的α生育酚浓度应达到1 g/L，才能有效对抗氧自由基的破坏作用. Sperling等［8］ 甚至提出可用100 g/L浓度的α生育酚进行神经元保护是可行的方案. 贾丽红等［9］在对神经胶质细胞试验中，认为50 mg/L α生育酚即可起到抗氧化的保护作用. 而国内尚少有低浓度α生育酚对神经元保护作用的报道. 从本试验可以看出，正常血浆浓度8~10倍的α生育酚即可产生较为明显的神经元细胞膜保护作用，细胞膜脂质多不饱和脂肪酸氧化产物MDA也小于单纯氧自由基损伤组. 而且，80 mg/L α生育酚组在损伤后2 h存在细胞膜损伤的神经元为（41.5±5.9）个，少于损伤后1 h存在细胞膜损害的神经元（66.0±7.3）个. 这种现象是否意味着α生育酚可促使损伤细胞膜发生自我修复改变，尚需深入研究. 低浓度α生育酚的治疗作用对于临床应用较有意义. 因为现今应用α生育酚进行动物试验，多采用口服及腹腔注射两种方法. 而生物体内的α生育酚主要存在于肝脏，不能自由穿过血脑屏障，所以这两种方法均不能使脑组织中的α生育酚浓度达到很高浓度. Naziroglu等［10］采用口服800 mg，仅能使血浆中α生育酚达到21 mg/L，腹腔注射160 mg/kg α生育酚后，血浆中α生育酚可达到类似结果. Cherdyntseva等［11］在研究中发现，给与SD大鼠标准腹腔注射量α生育酚（600 mg/kg）每天进行腹腔注射，只能使血浆中α生育酚浓度达到80 mg/L. 高浓度的α生育酚在以往的实验中显示可以使氧自由基对神经元损伤减少到较低的程度［8-9］. 但在当今条件下，临床无法达到使脑组织和血浆中α生育酚达到至1 g/L的水平，而且，如此高浓度的α生育酚在脑组织中是否会引起不良反应尚无定论. 相反，在颅脑损伤等情况下，血脑屏障受到损伤，则可很容易地使伤区脑组织中α生育酚浓度达到接近80 mg/L的水平，从而达到治疗目的. 这使临床应用α生育酚治疗颅脑损伤等神经系统疾病成为可能.
【参考文献】
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［3］ Yamazaki I， Lawrence HP. EPR SpinTraping study on the oxidizing species formed in the reaction of the ferrous ion with hydrogen peroxide［J］. J Am Chem Soc， 1991，113: 7588-7593.
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［5］ 江基尧，主编. 现代颅脑损伤学［M］. 2版. 上海：第二军医大学出版社，2004:467-484.
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［8］ Sperling O， Bromberg Y. Reactive oxygen species play an important role in iodoacetateinduced neurotoxicity in primary rat neuronal cultures and in differentiated PC12 cells［J］. Neurosci Lett， 2003， 351(3): 137-140.
［9］ 贾丽红，刘莉等. VE拮抗氟对大鼠脑氧化损伤的实验观察［J］. 中国地方病学杂志，2002，21(6):447-449.
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篇5
[关键词] 植物细胞膜稳态剂；抗病能力；水稻产量；经济效益
植物细胞膜是一层有选择性通透作用的薄膜，它使细胞能从外部环境不断地取得所需要的水分、无机盐和其他必须的物质，而又阻止有害物质的进入；该产品能增强植物细胞膜的稳定性，提高农作物抗病能力，有效控制由细菌、真菌和病毒引起的多种农作物病害。对于干旱、低温、盐碱等逆境因子对农作物造成的不利影响有抵御作用，改善品质，增加产量和经济效益。
一、试验区概况及试验方法
1.试验区概况
试验区位于辽宁省盘山县坝墙子镇。土壤为粘质盐渍型水稻土，气候属暖温带大陆性半湿润季风气候区，年平均气温8.9℃，≥5℃活动积温3551度，≥10℃活动积温3509度，年降水量633.6 mm，蒸发量1551.7 mm，无霜期171d。全年太阳能总辐射量137.9kcal/cm2，生理辐射量69.6 kcal/cm2，其中作物生育期（4月～9月）生理辐射量43.9kcal/cm2。
2.试材
试区土壤为粘质盐渍型水稻土，耕层有机质含量15.4g/㎏，全氮（N）0.101g/㎏，碱解氮60.037mg/㎏，有效磷（P）9.2 mg/㎏，有效钾（K）85.8mg/㎏，pH值8.25。供试水稻品种为辽星1号；肥料为土圈粪（0.2—0.18—0.70），尿素，辽宁津大肥业有限公司生产的“津大盛源”牌一次性螯合肥（16－14－10），山东天达生物制药股份有限公司生产的天达2116植物细胞膜稳态剂（简称天达2116）。
3.试验内容
试验设水稻叶面喷施天达2116和对照（CK）2个处理，4次重复，单行式顺序排列，秧田小区面积为1.5㎡，本田小区面积为66.7㎡。小区间筑田埂，设保护行，实行单排单灌。水稻叶面喷施天达2116处理于秧田2叶1心时用天达2116（壮苗灵）600倍液叶面喷雾1次，本田分蘖始期用天达2116（壮苗灵）600倍液叶面喷雾1次，拔节期、乳熟期各用天达2116（粮食专用型）600倍液叶面喷雾1次；对照秧、本田水稻喷清水。
4.水稻栽培
2009年4月17日水稻薄膜保温隔离层旱育苗，6月3日插秧，密度为29.7㎝×13.2㎝，每穴3株～4株。插秧时田间保持水层3cm～5cm；插后至分蘖期保持5cm～6㎝左右；分蘖至成熟期根据稻株高度确定每次灌水深度在6cm～8cm，灌后自然渗漏至田面呈现花泥水再灌下一次水，后水不见前水，循环交替补水；水稻成熟后自然落干。
5.调查、考种及测产
5月27日秧田每小区随机取20株，调查秧苗素质。10月10日本田每小区用对角线法取2点，每点1㎡，考种、测产，同时调查稻曲病发生株数。
二、结果与分析
1.秧苗素质分析
水稻秧苗素质调查、测定结果：秧田期叶面喷施天达2116（壮苗灵），株高比对照增加1.3㎝，叶龄增加0.4片，叶宽增加1.4㎜，白根数增加3.7条，茎基宽增加1.1㎜，百株干重增加2.7g，充实度增加1.3（mg/㎝），株高变异系数降低1.34，秧苗长势好。
2.稻曲病调查分析
稻曲病调查调查结果：水稻秧、本田叶面喷施天达2116，稻曲病发生率为0.5‰，比对照1.0‰降低0.5‰。
3.水稻经经济性状及产量分析
水稻经济性状及产量分析结果：水稻秧、本田叶面喷施天达2116，每㎡穗数比对照增加11穗，每穗成粒数增加7粒，水稻产量增加56.3㎏/667㎡，增产9.3%（表1）。
水稻叶面喷施天达2116和对照两个处理小区平均产量差异显著性检验结果：自由度=6，t（2.83）＞t0.05（2.45），处理间差异显著。表明水稻叶面喷施天达2116有增产作用。
4.经济效益分析
天达2116按2.50元/25g和水稻2.20元/㎏计算经济效益，水稻叶面喷施天达2116比对照增加经济效益116.36元/667㎡（表2）。
篇6
对于血瘀证研究而言，虽然有关中医宏观辨证和西医微观辨证的冲突方面的争论一直存在，但不可否认的是作为目前中西医研究衔接较好的证候，有关血瘀证在血液流变学、微循环、血液动力学方面的异常已得到公认。因此，以气虚血瘀大鼠模型，从血液流变学及红细胞膜组分变化探讨少腹逐瘀汤改善气虚血瘀的作用机制，为血瘀证相应方药药理作用及作用机制的研究提供更为客观的依据。
材料
1. 动物 清洁级雄性Wistar老龄大鼠40只，雌雄各半，体质量（27519）g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供[动物合格证号SCXK（黑）2008004]。
2. 药物 少腹逐瘀汤由当归9g，赤芍6g，川芎6g，延胡索3g，蒲黄9g，干姜3g，肉桂3g，小茴香1.5g，没药3g，五灵脂6g 组成，上述十味药，加10倍量水浸泡0.5h，加热回流煎煮2次，第1次1.5h，第2次1.0h，合并煎煮液，浓缩成浓度为4.8g/kg的少腹逐瘀汤备用。
3. 仪器 Anthos 2010酶标仪（郑州博赛生物工程有限责任公司），BECKMAN低温超速离心机（美国贝克曼库尔特有限公司），LBY-N6B型血液黏度仪（北京普利生仪器有限公司），LBY-BX型红细胞变形仪（北京普利生仪器有限公司），TGL-16G型高速台式离心机（上海医用分析仪器厂），Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），蒸发光散射检测器ELSD2000（美国Alltech公司），LBY-XC全自动动态血沉测试仪（北京普利生仪器有限公司）。
4 . 试 剂 巯 基（南 京 建 成 生物工程研 究 所，批号20120503）；唾液酸（由南京建成生物工程研究所，批号20120503）；丙二醛（malonaldehyde, MDA）（南京建成生物工程研究所，批号20120423）；Na+-K+-ATP酶（南京建成生物工程研究所，批号20120428）。
方法
1. 分组及给药 40只大鼠按体质量随机分为4组，即少腹逐瘀汤高剂量组（4.8g生药/kg）、少腹逐瘀汤低剂量组（1.2g生药/kg）、模型组（蒸馏水）和空白组（蒸馏水）。其中除空白组给予正常饮食饮水外，正式造模前1d禁食不禁水，之后每天置于水深（301）cm，水温（402）℃水槽中，力竭游泳。当大鼠出现自然下沉（头没入水面超过5s）为终止信号，将大鼠取出烘干。每天力竭游泳后再给正常饮食量的1/3饲养，每天每只大鼠按照40g/kg喂食，每日1次，连续14d。末次造模后禁食不禁水12h。
2. 红细胞膜的制备 取新鲜肝素抗凝血2mL以及枸橼酸钠抗凝血6mL。其中枸橼酸钠抗凝血以3 000r/min离心10min，弃上清液，除去中间的白细胞和血小板层，再以1∶3比例加入等渗pH值7.4 PBS，3 000r/min离心10min，弃上清液，反复洗涤3次，最终得到干净的红细胞。按照1∶80比例向红细胞中加入预冷的5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液，同时加入0.1mmol/L蛋白酶抑制剂PMSF（对甲苯磺酰氟），超声15min（80Hz，20℃），放入4℃冰箱过夜使其充分溶血。红细胞溶血液以15 000r/min离心10min，弃上清液，加入5mmol/L pH值7.4 Tris-HCl溶液以15 000r/min离心10min，反复洗涤3次，最后得到乳白色膜，将其1∶1悬浮在PBS溶液中，膜蛋白定量后置于低温冰箱备用。
3. 血液流变学指标检测
3.1 全血黏度的测定：取肝素抗凝血1mL，用LBY-N6B型血液黏度仪测定全血黏度。
3.2 血浆黏度的测定：取肝素抗凝血1mL离心（3 000r/min，10min），取血浆用于血浆黏度测定。
3.3 红细胞变形性的测定：取肝素抗凝血20L，加入15%PVP悬浮液1mL中混匀，吸取500L采用LBY-BX型红细胞变形仪进行测定，剪切参数分别为600、800、1000s-1。
4. 红细胞膜组分变化
4.1 红细胞膜胆固醇含量测定 取制备好的红细胞膜液0.5mL，加入2.5mL提取液（氯仿∶甲醇=2∶1），向膜液中每加入0.5mL涡旋振荡器剧烈振荡混匀，直至全部加完后，避光室温静置2h，取下层有机层2mL，作为供试品溶液。
4.2 红细胞膜Na+-K+-ATP酶活性测定 采用比色法测定红细胞膜上Na+-K+-ATP酶活性。
4.3 红细胞膜唾液酸及巯基含量测定 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上唾液酸及巯基含量。
4.4 红细胞膜MDA水平检测 根据试剂盒说明书检测红细胞膜上MDA水平。
5. 统计学方法 采用SPSS 16.0软件处理所得数据，选用One-way ANOVA进行统计分析，数据以x-s表示。以P0.05为差异有统计学意义。
结果
1. 造模前后大鼠身体表征及体质量变化 见表1。造模后，模型组大鼠体质量显著下降，毛色暗淡无光易脱落，倦怠，便溏。与自身造模前比较，模型组及给药组体质量均明显下降（P0.01）；空白组体质量显著上升（P0.01）。
2. 对气虚血瘀大鼠血液流变学指标的影响 见表2。与空白组比较，模型组大鼠全血黏度及血浆黏度显著升高（P0.05，P0.01），红细胞变形指数显著降低（P0.01）。少腹逐瘀汤高剂量能够显著降低3s-1、30s-1和200s-1切变率下全血黏度（P0.01，P0.05），降低血浆年度（P0.01）。
3. 红细胞膜组分变化 结果见表3。与空白组比较，气虚血瘀组Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量及巯基含量均显著降低（P0.05，P0.01），MDA含量和膜胆固醇含量均显著升高（P0.05）；与模型组比较，少腹逐瘀汤高剂量组可显著升高Na+-K+-ATP酶活力、唾液酸含量以及巯基含量（P0.05），低剂量组显著降低MDA含量（P0.01）。
讨论
篇7
目的探讨健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗(insulin resistance,ir)大鼠肝细胞膜胰岛素受体（insulin receptor,insr）mrna表达的改善作用及机理。方法取wistar大鼠60只，雌雄各半，采用链脲佐菌素(streptozotocin,stz)加高脂饮食造成2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型。设空白组、模型组、健脾活血方低剂量组、健脾活血方高剂量组和罗格列酮组，以rt-pcr法检测大鼠肝细胞膜insr mrna的表达。结果健脾活血方高剂量组大鼠肝脏insr mrna的表达与罗格列酮组相当，与模型组比有显著性差异（p<0.01）。结论健脾活血方能够上调大鼠肝细胞膜insr mrna的表达，从而改善胰岛素抵抗。
【关键词】 健脾活血方 2型糖尿病大鼠 肝细胞膜insr
abstract：objectiveto explore the effect of strengthening spleen and activating blood prescription on expressions of insulin receptor gene in the liver membrane of type 2 diabetes mellitus rats and its mechanism.methods60 wistar rats ,half male and half female, were randomly devided into five groups: normal control group,model group, strengthening spleen and activating blood prescription lowdose group and highdose group, and rosiglitazone group. the model of insulin resistance of type 2 diabetebes mellitus was established by stz injection and high-fat diet. expression of insulin receptor gene in liver membrane was detected.resultsthe expressions of liver insulin receptor gene in strengthening spleen and activating blood prescription high dose group was the same with rosiglitazone group. there were significant differences compared with model group (p<0.01). conclusionstrengthening spleen and activating blood prescription can up-regulate the expressions of liver insulin receptor gene in type 2 diabetic rats, and improve insulin resistance.
key words：strengthening spleen and activating blood prescription； type 2 diabetes mellitus rats； liver membrane insulin receptor； experimental research
目前普遍认为，ir与ins分泌缺陷是2型糖尿病的发病基础，其中ir是贯穿于2型糖尿病发生、 发展 的全过程的重要因素，ir被认为是基因与环境间相互作用的结果［1～3］，已经证实有不同种族的许多基因与2型糖尿病的发生有关联，这些后选基因包括：胰岛素基因、insr基因等［4，5］ 。它们通过影响胰岛素信号传递和葡萄糖利用等机制在ir的发生发展中起作用［6］。本研究将从分子水平探讨健脾活血方对肝细胞膜insr mrna表达的改善作用和机理。
1 材料与仪器
1.1 动物wistar大鼠60只，雌雄各半，体重220～240 g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。
1.2 药物健脾活血方由人参、黄芪、三七、丹参、生地等组成。饮片购自哈尔滨世一堂制药厂。将以上中药按配方煎成200%的药液(即每毫升药液含2 g原生药材煎出物)，冷却后密封，4℃保存备用；罗格列酮：太极涪陵制药有限公司，批号0511020。试验动物用药0.20 g/kg，临用前将罗格列酮用蒸馏水配制成混悬液，4℃保存备用。
1.3 试剂抗胰岛素受体 β亚单位抗体和抗 β-actin抗体：博士德公司；rt-pcr试剂盒：美国 promega公司；上、下游引物来源于美国生物信息中心（ncbi），引物设计使用primer5.0软件设计，上海捷倍思基因技术公司合成；胰岛素放射免疫分析药盒（fr-fj-021）：北京市福瑞生物工程公司；stz:sigma公司；β-actin （长度540 bp）5'-gtcacccacactgtgcccatc-3'；肝细胞膜insr上游引物(长度370bp) 5'-ccggcgtggc gtgctctgat-3'；肝细胞膜insr下游引物 (长度370bp) 5'-atgatcacagactacctgct-3'。
1.4 仪器数字凝胶成像系统chemi imager4000（algpha innotech corporation）：美国安来公司 ；du640核酸分析仪：美国生产；电泳凝胶图象分析系统 ：backman公司；血糖仪及试纸：美国强生公司。
2 方法
2.1 动物分组与处理造模参照 文献 方法［7］加以改造，将60只 wistar大鼠给予基础饲料及自来水适应性喂养1周。第2周，将大鼠随机分为两组。空白组12只给予基础饲料，饮用自来水；造模组48只喂高脂饲料,饮用自来水。两组鼠分别喂养8周。第10周开始，造模组按体重25 mg/kg一次性腹腔注射0.25% stz（溶于0.1 mmol/l柠檬酸缓冲溶液，ph4.4）；空白组腹腔注射等体积0.lmmol/l、ph4.4枸椽酸盐缓冲液。禁食12 h。除空白组12只鼠外，造模组断尾采血，挑选空腹血糖≥11.1 mmol/l的大鼠，共有40只大鼠进入实验。造模组根据体重随机分为4组，即模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、罗格列酮组。空白组大鼠和模型组大鼠灌胃给予蒸馏水；高剂量组和低剂量组给予健脾活血方，分别为16 g/kg和8 g/kg，罗格列酮组按0.20 g/kg的剂量灌胃罗格列酮组混悬液，连续给药2周后，处死大鼠，取出肝脏，于低温冰箱（mdf-u50v型）中保存备用。整个实验过程中，模型组大鼠死亡2只，中药低剂量组大鼠死亡1只。
2.2 检测指标及方法
2.2.1 空腹血糖（fbg）测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，断尾采血。用血糖仪测定血糖。
2.2.2 空腹胰岛素（fins）测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，眼眶静脉丛取血5 ml，用lg-10a 离心机37℃恒温离心（2 500 r/min,10 min）15 min，取血清，采用放射免疫双抗体法测定。
2.2.3 胰岛素敏感性指数（isi）isi=ln［1/（fins×fbg）］［8］
2.2.4 肝细胞膜 insr mrna的表达rt-pcr法检测。
2.2.5 统计方法数值以±s表示，用stata 7.0软件 计算 。p﹤0.01，p﹤0.05为差异具有显著性。
3 结果
3.1 对大鼠fbg，fins，isi的影响结果显示，造模后，各组大鼠fbg、fins显著升高，isi显著下降，与空白组相比，有显著性差异(p<0.01)，说明造模成功。给药后，各组大鼠血糖下降，其中以罗格列酮组疗效最显著，与模型组比，有显著性差异(p<0.01)；健脾活血方组与模型组比有明显差异(p<0.05)，且健脾活血方高剂量组较低剂量组疗效显著，但其降血糖作用不及罗格列酮。经 治疗 后，各组大鼠fins均下降，isi提高，其中以中药高剂量组和罗格列酮组改善最为显著，与模型组比有显著性差异(p<0.01)，中药高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。见表1～2。表1 给药前大鼠fbg，fins，isi（略）表2 给药后大鼠fbg，fins，isi（略）与模型组比较，﹡﹡p<0.01，﹡p<0.05
3.2 对大鼠肝脏细胞膜insr mrna表达的影响rt-pcr产物在琼脂糖电泳凝胶紫外灯下均可见：各β-actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为300bp。肝脏insr mrna的500bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异，模型组大鼠insr mrna的表达减弱，与空白组比较有显著性差异（p<0.01）；各治疗组大鼠肝脏insr mrna的表达增强，以罗格列酮组和健脾活血方高剂量组的改善最为明显，与模型组比较有显著性差异（p<0.01）；健脾活血方低剂量组与模型组比亦有明显差异（p<0.05）。健脾活血方高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。见图1～2和表3。表3 对大鼠肝脏insr/β-actin mrna rt-pcr电泳产物灰度扫描比值的影响（略）与模型组比较，﹡﹡p<0.01，﹡p<0.05
4 讨论
insr广泛分布于全身各组织细胞膜，每个细胞约有l×103～105个受体。insr是由2个-α亚基及2个-β亚基构成。α亚基肽链n端及富含半胱氨酸残基的结构域是胰岛素的结合位点［6］。β亚基跨膜存在于胞质，具有酪氨酸蛋白激酶活性，它又可分为三区：胞外结构域、跨膜区及胞质结构域。胞质结构域又由含酪氨酸的三个区域构成：即近膜结构域、酪氨酸激酶结构域及c末端结构域［6］。近膜结构域为insr β亚基与胞质内insr底物结合所必需，在胰岛素信号的传递上发挥关键作用。酪氨酸激酶结构域具有三磷酸腺苷结合部位。insr β亚基c末端两个酪氨酸磷酸化部位与信息传递蛋白grb10结合，参与细胞增殖［9］。insr数目异常及功能缺陷均可影响胰岛素的信号转导。
已知胰岛素是通过细胞膜上的insr起作用的，其作用受细胞上受体密度和亲和力的变化调节。多项研究证明stz糖尿病大鼠的肝脏、肌肉细胞膜insr数目受血中胰岛素浓度的影响，即血胰岛素浓度对insr量呈负向调节：胰岛素浓度升高，受体数目降低，反之则受体数目升高［10］。本实验表明，模型组大鼠肝脏insr mrna表达减少，可能与血中胰岛素浓度升高引起的insr数量减少有关。虽然其胰岛素浓度升高，但是血糖仍然不降，表明胰岛素效应不全，存在细胞内限速反应，即insr的抵抗。健脾活血方可以上调大鼠肝脏insr mrna的表达，结合大鼠给药前和给药后isi说明健脾活血方对insr抵抗有治疗作用。
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篇8
[关键词] 胆固醇代谢紊乱；P-糖蛋白；肝脏；内分泌
[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2017）07-09-04
Parallel control analysis of Biological pump glycoprotein expression of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder
YU Jingxi
Department of General Surgery，the Third People's Hospital of Huizhou，Huizhou 516002，China
[Abstract] Objective To analyze the difference of Biological pump glycoprotein （Pgp） of SD rat liver cell membrane with cholesterol metabolism disorder and its related biochemical indexes and the normal rats. Methods 30 SD rats were selected and randomly divided into observation group and control group，15 rats in each group.The rats in observation group fed with high fat diet were prepared for the disorder of cholesterol metabolism in model，and rats of control group fed healthy.Immunohistochemical method was used to analyze the expression of Pgp in two groups of rats. And they were compared.The related biochemical indexes of rat liver homogenate of the two groups were also compared. Results The average Pgp value of rat liver of control group was （1.01±0.13），the liver index was （1.69±0.68）.The average Pgp value of rat liver of observation group was （5.36±1.21），the liver index was （3.35±0.37）.The average Pgp value of rat liver and liver index in observation group group were significantly higher than those of control group （P
[Key words] Cholesterol metabolism disorder；P-glycoprotein；Liver；Endocrine
肝脏是人体代谢胆固醇的主要脏器，也是唯一具有大规模清除胆固醇的脏器[1-3]。多数高脂血症的患者通常合并有肝内的脂肪沉淀积聚，可对患者的肝功能造成损伤，从而进一步加剧胆固醇代谢的紊乱程度。Pgp为ATP结合盒超系列成员，于肝细胞膜上可见高表达，并参与至胆汁酸的形成与转运过程当中[4-6]。本研究旨在通过动物模式观察胆固醇代谢紊乱大鼠的Pgp蛋白的表达变化以及肝细胞脂肪的病变情况，以为胆固醇代谢紊乱的防治提供新的依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
2015年3月自中山大学实验用动物中心购买SD雄性大鼠30只，随机分为对照组与观察组，每组各15只。两组大鼠月龄均为8～12个月，两组大鼠的年龄结构等无统计学意义（P>0.05）。具有可比性。适应性喂养时全部大鼠均食水自由，自然光照，室温控制在18～25℃，相对湿度保持在40%～50%，每日上午加水、喂食并更换垫料。对照组大鼠给予啮齿类动物标准饲料，确保大鼠健康，在足够范围内自由活动。观察组大鼠给予高脂饲料喂养，高脂饲料由啮齿类动物标准饲料86.3%、猪油5%、蛋黄粉8%、胆酸钠0.2%、胆固醇0.5%组成，缩小大鼠活动范围尽量减少大鼠运动。两组均喂养4周。
1.2 观察方法
采集两组大鼠眼底静脉血样3mL；立即处死，剖取肝脏，放入冷生理盐水当中充分漂洗，以滤纸完全吸干，以肉眼观察大鼠的外观并称取质量，依肝质量（g）/体质量（g）×100%公式计算肝指数。⒏卧喾治两部分，其中一部分肝脏以甲醇-氯仿以1∶1比例制备为100g/L的肝脏组织匀浆，使用离心机以2000r/min速度离心后取得上层上清液待检；另一部分肝脏组织以100g/L甲醛溶液完全固定，使用石蜡包埋制作切片。所制作的石蜡切片以HE染色后于光镜下观测肝脏脂肪的变程度，以肝小叶中的含脂滴细胞数量/总细胞数量计算的结果作为判断肝细胞脂肪病变的程度，以0为-、以2/3为+++。
检测并比较对照组与观察组大鼠肝组织当中Pgp的表达水平，使用免疫组化测定，一抗使用羊抗鼠Pgp单克隆抗体（Invitrogen公司出品），免疫组化样品为DAB染色，以苏木素对全部样本的细胞核进行复染。使用Imagepro plus-6.0分析软件分析Pgp显色的强度，获取单个组织区域面积的平均光度值。
将对照组与观察组大鼠血样进行生化分析并比较，将血样以离心机离心取得上层血清，使用全自动型生化分析仪检测血清中各项肝功能相关指标包括：谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、胆红素（BIL）、总胆汁酸（TBA），脂质相关指标包括总三酰甘油（TG）、总胆固醇（Tch），肝组织匀浆中的Tch、TG及TBA水平。分析肝细胞脂肪病变的程度与Pgp表达水平的相关性。
1.3 统计学方法
研究相关数据均以手工输入方式录入至SPSS20.0软件，一人录入、一人复核。全部数据中的计量资料均采取独立样本均数t检验，相关性采取Spearman等级相关分析，等级资料采取Mann-Whitney U秩和检验，P
2 结果
2.1 两组肝脏Pgp光度值与肝指数比较
对照组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（1.01±0.13），肝指数为（1.69±0.68）%；观察组大鼠肝脏Pgp平均光度值为（5.36±1.21），肝指数（3.35±0.37）%；观察组肝脏Pgp平均光度值与肝指数均显著高于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 肝脏脂肪病变
观察组肝脏脂肪病变+++的发生率为53.33%，对照组无+++级别肝脏脂肪病变发生，观察组整体肝脏脂肪病变程度较对照组严重，差异有统计学意义（P
2.3 血清与肝匀浆生化指标及体质量
观察组与对照组大鼠初始体质量、肝匀浆比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组与对照组大鼠血清Tch、肝匀浆TBA比较，差异有统计学意义（P
2.4 相关性分析
经Spearman等级相关分析，肝脏脂肪病变程度与肝脏Pgp光度值呈显著高度正相关性，r=0.996，0.8
3 讨论
肝脏是人体脂肪代谢的一个主要器官[7-9]。肝细胞所合成的胆固醇于酯化作用后在27羟化酶与7α羟化酶的共同催化作用下生成胆汁酸，通过主动排泌到达胆管腔内，从而参与到胆汁形成的过程当中，这一过程是人体胆固醇清除的一项主要渠道。多数高脂血症的患者可合并有明显的肝内脂肪异常聚积[10-12]，对于肝脏功能可形成持续性损伤，并可进一步加重胆固醇代谢的紊乱[13-15]。Pgp糖蛋白以主动形式将肝细胞所合成的胆汁酸转运入毛细胆管腔当中，促使其参与至肝细胞对于胆固醇的代谢过程。Pgp非选择性的抑制类药物能够有效的控制胆固醇的酯化与合成，分析其主要机理为抑制剂将胆固醇由细胞膜至内质网的这一转运过程完全或部分阻滞而形成的。细胞水平的相关研究表明Pgp的表达可致使细胞内的胆固醇总量升高。提示了Pgp的异常表达对于胆固醇的代谢紊乱形成与发展以及肝内脂肪发生沉积的过程发挥了促进作用。
本研究通过高脂饲料喂养的方法建立了胆固醇代谢紊乱的大鼠模型，建模后观察组肝脏脂肪病变+++的发生率为53.33%，对照组无+++级别肝脏脂肪病变发生，观察组整体肝脏脂肪病变程度较对照组严重，差异具有统计学意义（P
综上所述，胆固醇代谢紊乱SD大鼠的肝细胞膜生物泵糖蛋白较正常健康SD大鼠显著升高，提示Pgp蛋白在胆固醇代谢紊乱的形成与演进过程中均发挥着重要的促进作用，这一研究结果希望能够为临床防治及相关药物研究提供新的参考与思路。
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篇9
【关键词】 糖尿病；组织因子；血栓形成；单核细胞；血小板
2型糖尿病（T2DM）患者有血栓形成倾向，在血管病变的形成和发展中起着相当重要的作用。新近研究表明，血栓性疾病不仅在组织水平，而且在细胞水平已处于高凝状态〔1〕，组织因子（TF）是凝血过程的始动因子，以往认为主要来源于血管内皮，而现在发现外周血细胞中单核细胞能自身合成的TF，血小板亦含有TF〔2〕，后两种细胞含有的TF在T2DM患者血栓形成中的作用，目前国内外研究不多。本文检测了T2DM患者外周血单核细胞和血小板膜表面TF表达情况及活性，探讨其在DM发病机制中的作用。
1 对象与方法
1.1 对象
按WHO DM诊断标准〔3〕确诊的T2DM患者42例，男26例，女16例，年龄55～78〔平均（61.12±10.41）〕岁。根据白蛋白排泄率将其分为单纯性DM组（DM组，22例）和DM合并微血管病变组（DN组，20例）。正常对照22例，男性12例，女性10例，年龄56～77岁〔平均（63.52±11.21）〕岁，排除了血栓性疾病及抽血2 w前使用过阿司匹林、肝素等抗凝药物者。
1.2 方法
流式细胞仪型号:FACS Calibur，美国 BectonDickinson 公司，CD62PPE-Cy5、CD61-PE、CD14PE以及同型对照IgG2a均购自BD Pharmingen公司。TFFITC 同型对照IgG1及Spectrozyme FXa购自American Diagnostica Inc。因子Ⅶa和因子Ⅹ购自上海船夫生物科技有限公司。①标本准备 单核细胞荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血100 μl及CD14PE、TFFITC单克隆抗体10 μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加入FACS Lysing Solution(1×)溶血素2 ml，混匀后室温暗处反应6～10 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清液；加生理盐水2 ml，低速涡流混匀后1 500 r/min离心5 min，弃上清液，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀后上机检测。血小板荧光标记技术：取Falcon管若干支顺序编号，每管加入枸橼酸钠抗凝外周血5 μl及TF FITC、CD62PPECy5、CD61PE单克隆抗体各10 μl，另外在对照管中加入同型对照抗体，低速涡流混匀后室温下避光孵育20 min，加1%多聚甲醛液500 μl，低速涡流混匀避光保存30 min以上，24 h内上机检测。②单核细胞膜表面TF活性的测定：外周血单个核细胞（MNC）包括单核细胞和淋巴细胞，但淋巴细胞不表达TF，可采用MNC来研究单核细胞TF活性，MNC分离采用密度梯度法，肝素抗凝血经Hank氏液稀释，加入装有淋巴细胞分离液的试管中，2 000 r/min离心30 min，用毛细吸管吸出MNC，显微镜下确定单核细胞百分率，调单核细胞浓度为3×104/ml。根据TF/Ⅶa复合物可以使因子Ⅹ转变为活化因子Ⅹa的原理，利用发色底物Spectrozyme FXa，测定反应体系因子Ⅹa的生成量，判断单核细胞表面TF活性。在体外分离培养的血液单核细胞（2×104/孔），用HEPES缓冲液〔含CaCl2(5 mmol/L)0.1%BSA〕洗涤细胞2次，分别加入因子Ⅶa (100 pmol/L)和因子X（135 nmol/L），37℃孵育30 min，最后在反应体系中加入Spectrozyme FXa（0.5 mmol/L）底物，以405 nm波长测定反应物的吸光度，换算成FXa生成量（nmol/L）。FXa的生成量与单核细胞表面TF活性成正比。血小板膜表面TF活性的测定：外周血用ACD抗凝，经1 000 r/min离心10 min获得富血小板血浆，用PBS调血小板浓度为2×109/ml，利用发色底物法测定FXa生成，方法同上。
1.3 统计学分析
数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件，组间比较采用t检验。
2 结 果
2.1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达
正常对照组血小板膜表面CD62P、TF阳性表达率及单核细胞膜表面TF表达率很低，而DM患者均明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表1。表1 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的表达（略)
2.2 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性
正常对照组血小板及单核细胞膜表面TF活性很低，而DM组较正常对照明显增高（P＜0.01），而DN组较DM组明显增高（P＜0.05），见表2。表2 T2DM患者单核细胞和血小板膜表面TF的活性（略)
2.3 血小板膜表面TF与CD62P表达相关分析
TF的表达与CD62P表达呈明显正相关（r=0.685，P＜0.001），提示二者变化是一致的。
3 讨 论
T2DM患者血栓形成的倾向在各个环节均有体现〔4〕，主要有血管内皮细胞的损害、血小板的激活、凝血纤溶系统的异常和血液流变学的改变，这些变化在伴有血管病变者更明显，提示两者之间存在密切联系，TF是凝血的启动因子，亦在病理血栓形成中发挥关键作用。既往研究认为TF主要由血管内皮细胞受损后产生，而新近的研究发现，一些血细胞成分：如单核细胞、血小板亦能在活化状态下释放TF参与凝血过程〔5〕，在血栓性疾病中（包括DM）血小板含有TF蛋白水平较正常人高〔6〕，这提示在DM患者中，单核细胞、血小板不仅可以通过已知的方式（如单核细胞释放CD14、血小板黏附聚集释放凝血因子）参与病理血栓形成，还可能以释放TF而独立启动凝血过程及血栓形成。
基于一系列血细胞如单核细胞、血小板、中性粒细胞上TF的发现，人们提出了细胞水平的止血模式〔5〕，该模式认为凝血途径可不依赖于血管内皮细胞释放的TF来启动，在一定条件下这些血细胞释放的TF亦可独立启动凝血过程。这一模式是经典凝血途径的补充。由于在正常情况下，血细胞如单核细胞、血小板是处于静息状态，不释放TF，只有在病理情况下单核细胞、血小板活化，TF才可释放出来，故血细胞来源的TF在血栓性疾病中的意义可能更大。
TF与DM发病紧密相关，DM血管病变者患者外周血单个核细胞中TF mRNA水平、TF 活性及外周血TF蛋白水平较单纯DM患者明显增高，并有研究认为血浆中可溶性TF水平是DM合并血管病变患者疾病进展的一个标志〔7〕。本研究在国内首次采用流式细胞术检测了DM患者体内血小板、 单核细胞膜表面TF的表达及活性，证实DM患者较正常对照明显增高，而DM合并血管病变者增高更明显，并且血小板膜表面TF的表达与血小板活化标志物CD62P表达成正比。这提示DM患者血细胞释放的TF亦可能参与了其发病过程中高凝状态的形成及病理血栓的生成。研究表明，DM患者体内高血糖，高胰岛素血症、高渗透压可激活体内单核细胞和血小板〔8〕，并能促进单核细胞合成及释放TF，而单核细胞又可以含TF微粒的形式将TF传递给血小板，后者摄取后可将TF贮存至a颗粒中，活化时可将其释放出来；血小板的活化又可进一步促进单核细胞TF活性，它们之间的作用主要是通过血小板膜CD62P介导的，这种相互作用，互为影响可形成恶性循环，促进血栓形成。
参考文献
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6 黄细莲，陈方平，杜建伟，等.血栓性疾病患者血小板相关组织因子水平及活性的改变及意义〔J〕.中华内科杂志，2005；44（8）：5857.
篇10
关键词 液基薄层细胞涂片法 免疫细胞化学 细胞学诊断
材料与方法
2005年9月～2007年11月收治患者73例浆膜腔积液标本，其中胸水32例，腹水35例，心包积液6例。男43例，女30例，年龄16～84岁，中位年龄52岁。经形态学及免疫细胞化学确定，腺癌42例，23例为反应性间皮细胞。42例腺癌中来源于肺癌6例、乳腺癌2例、卵巢癌12例、胃腺癌12例、肠腺癌6例，另4例来源不明；5例鳞状细胞癌和1例小细胞癌来源于肺；淋巴瘤2例。上述结果经活检或手术切除标本病理证实。
结果判断：CEA、EA、Ca1、CK和CD68阳性均定位于细胞质，细胞质出现黄色即为阳性着色；CD56和LCA阳性定位于细胞膜，细胞膜出现黄色即为阳性着色。MC染色胞膜线状着色为阳性。
统计学处理：经SPSS软件采用卡方检验。
结 果
恶性肿瘤细胞及反应性间皮细胞病例免疫细胞化学结果：73份浆膜腔积液标本，细胞学涂片病理检出恶性肿瘤细胞38例，可疑恶性肿瘤细胞12例。经TP免疫细胞化学确定腺癌42例、鳞癌5例、淋巴瘤2例、小细胞癌1例。
腺癌及反应性间皮细胞病例免疫细胞化学结果：在恶性肿瘤中腺癌最多共42例，CEA、EA染色在腺癌细胞胞质可见均匀棕黄色。腺癌中90.5%CEA表达阳性，95.2%EA表达阳性，4.8%MC表达阳性，两组之间有非常显著的差异（P＜0.01）。在23例反应性间皮细胞中，反应性间皮细胞CEA和EA全部呈阴性表达，91.3%MC表达阳性，87.0%Cal表达阳性，两组之间有非常显著的差异（P＜0.01）。2例淋巴瘤中100%（2/2）LCA表达阳性，CD68表达阴性。
CEA、EA、MC、和Ca1在腺癌及反应性间皮细胞中表达的特异性。CEA和EA在腺癌细胞异性为100%。MC和Cal在良性反应性间皮细胞异性为95.2%。见表1。
讨 论
免疫细胞化学常用的标本制备方法有4种［1］：直接涂片法（CS）、细胞离心涂片法、细胞块石蜡包埋法（CB）和液基薄层制片法。本研究结果显示：①癌胚抗原及上皮抗原对腺癌的敏感性及特异性均较好，特异性达到了100%，敏感性分别为90.5%、95.2%。②间皮细胞抗体在反应性间皮细胞中的敏感性及特异性分别为91.3%、95.2%，另外间皮细胞抗体在恶性积液标本中正常间皮细胞有的也表达。③Cal在反应性间皮细胞中的敏感性及特异性分别为87.0%、95.2%。、结论：癌胚抗原及上皮抗原对上皮细胞的特异性及敏感性较好，间皮细胞抗体、钙结合蛋白对上皮细胞的特异性及敏感性较好。薄层细胞涂片法进行免疫细胞化学染色，质量优良和观察效果满意，有效提升了诊断细胞病理学诊断及鉴别诊断的能力。
