细胞凋亡范文
时间：2023-03-23 13:06:43
导语：如何才能写好一篇细胞凋亡，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
论文摘要：就近年来中药抑制细胞调亡的文献进行整理，从中药调控细胞凋亡途径、影响凋亡信号传导、调控凋亡相关基因表达、调控细胞因子4个方面进行系统综述。认为中药在抑制细胞凋亡方面有较好的作用。
细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。
1通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡
机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。
1．1通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca2+水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。
有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。
1．2通过调控死亡受体途径抑制凋亡凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。1．2．1通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positiveexpressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。
1．2．2通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。
2通过影响凋亡信号传导抑制凋亡
细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。2．1P13K／PKB途径P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。
2．2RAS－MAPK途径丝裂原活化蛋白激酶家族(MAPKS)参与细胞凋亡的信号转导过程。MAPKS级联反应包括MAPKKK，MAPKK与MAPK等3个顺序的活化过程。每一种激酶又由不同成分组成。MAPK包括ERK，jNK／SAPK，P38。有研究探讨肝星状细胞丝裂原活化蛋白激酶(HSCsMAPK)通路中ERK、JNK的活化情况，以及丹参药物血清对磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P－ERK)、磷酸化氨基末端蛋白激酶(P－JNK)表达，肝纤维化大鼠经丹参药物血清干预后较对照组均显著降低，正常大鼠经丹参药物血清干预后较正常大鼠对照组也均显著减少。表明活化的HSCs中ERK、JNK保持着较高的磷酸化水平，两者介导的信号转导通路是HSCs活化和增殖的重要途径之一；阻断MAPK信号通路可能是丹参治疗肝纤维化的重要作用途径之一。
2．3NF－κB途径在大多数细胞类型中，NF－κB在胞浆中与抑制亚单位lκB结合形成无活性的复合物。在TNF诱导的细胞凋亡过程中，可刺激lκB的磷酸化作用及降解作用。使NF－κB能从复合物中释放并活化，活化的NF-κB迅速转位进入胞核，继而作用于靶基因，诱导基因表达，编码前炎性蛋白，如IFN，细胞因子，生长因子，细胞黏附因子，红细胞生成素与MHC－I类分子等，抑制NOS的生成，并诱导编码凋亡抑制蛋白C－IAPl，C－IAP2基因表达，诱导抗凋亡基因Bcl－2，Bcl－x1的表达。探讨人参皂甙对心血管疾病的保健和防治机制的研究发现，结果显示内毒素脂多糖(LPS)促使HUVECNF－κB向细胞核内转移，人参皂甙则能阻止LPS诱导的NF－κB核内转移；能完全阻止LPS致内皮细胞核提取物NF－κBDNA结合活性；IJs能使HUVl3CPAl－1蛋白及mRNA表达显著增强，人参皂甙则使LPS的这种作用明显减弱。认为人参皂甙对心血管疾病的防治机制之一可能是通过NF－κB途径拮抗LPS致HUVECPAI－1的表达。
2．4NO途径NO对细胞的增殖与存活有双重效应。它可以通过多种机制诱导细胞的凋亡，但在一些特定环境中，NO又可在一些细胞类型中作为凋亡的潜在抑制剂。川芎嗪对多巴胺诱导PCI2细胞凋亡的保护作用的研究发现，认为川芎嗪可抑制DA引起的PCI2细胞凋亡，此作用可能与降低NO生成有关。NO的抗凋亡作用还与caspase水平有关。在死亡配体依赖与配体非依赖的凋亡中，NO均能抑制caspase的活性。黄芪、当归注射液可通过促进NO的生成、诱导caspase3表达促进体外培养的血管平滑肌细胞凋亡。同时还可通过上调bcl－2表达而抑制其阻止氧自由基破坏细胞结构，起抗细胞凋亡作用，通过抑制粘着斑激酶的表达，调节其对细胞增殖和凋亡的影响。已发现，NO在某些细胞类型的线粒体中起抗凋亡作用。如在鼠肝线粒体中，生理浓度的NO能可逆性的抑制PTP的开放，机制是通过膜的去极化与Ca2+的积聚作用。2．5其他胞浆中游离的Ca2+作为第二信使在凋亡信号传递过程中起关键作用；细胞核内钙离子浓度的持续升高是导致细胞凋亡的主要原因。细胞凋亡时最显著的变化是DNA的断裂，钙离子可直接激活核酸内切酶促进DNA断裂，也可通过激活蛋白酶、磷酸酶和磷脂酶，导致染色质结构完整性的丧失。葛根素及由红参和麦冬有效成分制成的参麦注射液对脑缺血／再灌注中神经细胞均有一定的抑制作用。作用机制可能是阻断Ca2+内流和／或胞内钙库的释放。从抑制神经细胞内钙超载。
目前发现在某些细胞中，cAMP是引起细胞凋亡的信号。细胞内cAMP浓度的上升可激活cAMP依赖性蛋白激酶，使靶细胞上某些丝氨酸和苏氨酸磷酸化，从而影响这些蛋白的生物学功能，引起细胞凋亡。黄精多糖对正常小鼠血糖水平无明显影响；但可显著降低肾上腺素诱发的高血糖小鼠的血糖值；其机制可能是降低肾上腺素模型小鼠肝脏中cAMP的含量，通过抑制凋亡减轻高血糖肝脏的损害。
3通过调控凋亡相关基因表达抑制凋亡
Bcl－2基因家族是最重要的细胞凋亡调控基因。抗凋亡基因bcl－2和bcl－xL是Bcl－2家族蛋白成员中主要的抗凋亡分子。bax基因是Bcl－2家族中重要的促凋亡基因。另外，p53、c－myc、Fas、c－fos等基因均是参与调控细胞凋亡的重要基因。有研究用黄芪注射液进行治疗贫血小鼠，提示黄芪注射液可通过上调抗凋亡蛋白Bcl－XL表达减轻骨髓有核细胞的凋亡，并促进红系、巨核系造血。丹参对持续性非卧床式腹膜透析(CAPD)相关性腹膜硬化模型大鼠腹膜间皮细胞凋亡有抑制作用，其机理是下调Fas基因的蛋白表达，上调Bcl－2基因的蛋白表达。c－los是一种转录调节因子，正常情况下在脑内水平极低。c－fos不适当的过度表达可干预细胞核的修复功能，导致细胞凋亡。有实验表明。c－fos可能诱导脑缺血一再灌流时海马CAl区细胞晚期促凋亡基因的表达，共同调控细胞凋亡，而中药有效成分葛根素可通过下调凋亡相关基因c－fos的表达，减少神经细胞的凋亡，从而具有保护神经的作用。
4通过调控细胞因子抑制凋亡
细胞因子(cytokine，CK)是机体细胞分泌调节细胞增殖、分化与死亡的一大类因子。与凋亡有关的细胞因子有氧自由基、氧化低密度脂蛋白(OX2LDL)及某些细胞因子等。清热解毒方泻心汤可显著降低实验性AS大鼠血清MAD水平，增强SOD活性，降低OX2LDL及N()水平等，从而抑制血管细胞过度凋亡。细胞因子如TNF(Tumomecrotiefactor)具有多种生物学功能，TNF在体外可诱导肿瘤细胞、树突状细胞及大鼠肝细胞出现凋亡，其中TNF-α与凋亡的关系更为密切，能与TNF受体结合，引起细胞内贮存Ca释放，引起细胞内游离Ca2+浓度升高，从而激活Ca2+依赖性核酸内切酶，引起DN段断裂和细胞凋亡。此外，与凋亡有关的细胞因子还有IL-2、IFN-γ、TGFβ1，NK细胞、IL-3、IL-4、IL-6、LAF-1(白细胞黏附因子)、CAM-1(细胞内黏附分子)、GM-CSF(粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子)、NGF(神经生长因子)、SCF(干细胞因子)、IGF-1(胰岛素样生长因子)、核转录因子xu等。黄芪对脂多糖(LPS)致大鼠急性肺损伤(AIJ)后大鼠肺组织细胞有保护作用，其机制是减少促炎因子TNF-α、IL-1β的释放，抑制肺泡上皮细胞凋亡。地黄饮子对阿尔茨海默病动物模型细胞凋亡抑制的机制，与上调核转录因子κB、hsp70mRNA的表达，抑制线粒体释放细胞色素C，控制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的激活有关。
篇2
【论文摘要】细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。认识肝病发生、发展中细胞的异常凋亡有重要作用。
细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmedcelldeath，PCD）。
一、细胞凋亡机制与检测方法
1.凋亡机制
细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶激活。参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶家族成员和组织蛋白酶等。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用；caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE，FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2相结合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1及其受体、肿瘤坏死因子及其受体在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成员。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X是较大的拼接变种，短Bcl-X是短拼接变种。
2.检查方法
（1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。
（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及SouthernBlotting方法。
（3）荧光标记膜蛋白V的检测。
（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。
二、肝中的细胞凋亡
近年来研究表明：肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下。
1.病毒性肝炎。Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡。1998年Galle等报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。
2.肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。
3.肝硬变。凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。
4.肝癌。肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年CrasL等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。
篇3
【论文摘要】细胞过度凋亡参与了缺血再灌注损伤(Ischimiareperfusioninjury,IRI)的发生。我国传统中药丹参可在细胞、分子、基因水平调控IRI时细胞凋亡的发生，从而对IRI具有良好的防治作用。
在肝、肾、脑等器官缺血再灌注损伤(Ischimiareperfusioninjury,IRI)造成的细胞死亡形式中，凋亡也是一种常见而重要的形式[1-4]。组织细胞一旦坏死，目前人们尚无办法干预；但细胞凋亡是受一系列程序控制的过程，人们有可能通过干预死亡程序加以挽救。丹参经现代实验技术证实，对IRI时细胞过度凋亡有抑制作用，本文就此方面的内容予以综述。
1丹参对IRI时细胞凋亡的抑制作用
Wu.W等[5]利用原位细胞凋亡标记(terminaldeoxynucleotidyltransferasemediateduridinenucleotideendlabeling,TUNEL)实验观察到：左大脑中动脉结扎后24h大鼠大脑皮层、尾状核、豆状核缺血区出现大量凋亡细胞，24~48h达到高峰；预先给予丹参则在相应部位只见到少量凋亡细胞；且与对照组比较，24h时间段组织损伤明显减轻。提示丹参可能通过减少神经细胞凋亡对脑IRI发挥保护作用。丹参是否对其他器官也有类似作用目前尚未明了。
2丹参抑制IRI时细胞凋亡的作用机制
2．1减少蛋白酶表达
细胞发生凋亡的中心环节是激活以蛋白酶-白介素-1转化酶(interleukin-1β-convertingenzyme,ICE)组成的级联反应。ICE可在天冬氨酸残基之后将33KD的IL-1前体裂解为17．5KD的IL-1β，属于ICE蛋白酶超家族。
目前已发现13个成员，根据其序列同源性分为3个亚家族：ICE-样、ICE-1样和CPP32样蛋白酶。它们具有保守的底物结合和酶促序列，在天冬氨酸后将底物降解，故该酶现被称为半胱天冬蛋白酶(cysteineapartate-specificproteinase,caspase)，并把上述三个亚家族分别称为caspase-1、caspase-2和caspase-3亚家族。它们的过度表达将导致细胞凋亡的发生[6]。
张金涛等[7]利用S-P免疫组化法发现，前脑IRI后1d，大鼠海马CA1、CA4区出现明显的ICE免疫阳性反应，第3天达高峰，第5天后明显减少；脑皮质也呈现出与海马区类似的现象，ICE免疫阳性反应细胞散在分布。与此相反，丹参组ICE的表达明显减少，特别是大脑皮层区和海马CA1区。因此，作者认为ICE在脑缺血中可能发挥重要的凋亡调节作用；丹参能下调脑缺血区ICE表达，从而发挥其神经保护作用。
2．2阻断诱导细胞凋亡的信号转导
大多数情况下，来自于细胞外的诱导因素，如自由基、细菌、病毒等作用于细胞后转化为细胞凋亡信号，并通过胞内不同的信号转导途径最终激活细胞死亡程序，导致细胞凋亡。因此，凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DN段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节[6]。丹参经实验证实，可干预下列已知的凋亡相关信号转导通路，从而实现其抗凋亡作用。
2．2．1死亡因子及其受体介导的信号转导
肿瘤坏死因子(TNF)家族中的TNF、Fas配体、TNF-相关凋亡诱导性配体(TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL或Apo2L)和Apo3L能诱导细胞凋亡，因此被称为死亡因子[6]。介导它们诱导凋亡的受体为死亡受体。在体内，TNF主要由巨噬细胞(Mφ)分泌。大量体内外实验证明，丹参不仅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，还可以在基因水平抑制TNF-α在肝、肾、心等组织中的蛋白表达[8,9,10,18]。所以，丹参可能通过抑制TNF-α的生成和释放，减少IRI时细胞凋亡。但其具体受体后途径是抑制NF-κB还是JNF/AP-1则目前尚无文献报道。
2．2．2第二信使钙诱导的凋亡
Ca2+是细胞凋亡发生过程中重要的信息分子。［Ca2+］i持续升高可使核酸内切酶激活，DN段化。应用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)双标记及流式细胞术、全细胞膜片钳放大系统显微荧光测定术同步观察H2O2诱导人类肝细胞(LO2细胞)、内皮细胞(EVC304)凋亡时不同时限Ca2+流变化和丹参提取物Rxa的影响时发现：①H2O2作用后0．5h即出现Ca2+跃升现象；当［Ca2+］i>400nmol/L后1h出现典型的细胞凋亡膜翻转现象，即磷脂酰丝氨酸从细胞膜内层转移到外层；此后，［Ca2+］i持续升高，早期凋亡细胞(Annexia-V+)、死亡细胞(PI+)指数均上升；荧光显微镜下出现大量绿色荧光的早期凋亡细胞和胞浆或胞核红染的死亡细胞。同时［Ca2+］i上升了一个数量级；②在Rax处理组H2O2作用8h后［Ca2+］i尚未超过400nmol/L，与对照组比较差异显著(P<0．01)。其余各指标也相应降低，细胞凋亡数减少[11]。这一实验表明，H2O2诱导的细胞凋亡可能主要是Ca2+依赖性的，且［Ca2+］i>400nmol/L很可能是细胞凋亡启动的早期信号。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜转运，由此可能减少其在核内促进凋亡基因信号传递中的作用及其后引起的细胞凋亡，减轻细胞损伤。分析其机理可能是：①作为咖啡酰缩酚酸衍生物之一的Rax富含酚羟基，可和H2O2发生氧化反应，接受O-生成羧基-COOH，从而直接减轻H2O2对细胞膜及细胞器膜的损伤，减少Ca2+经细胞膜和内质网渗漏入细胞内；②因肝细胞Ca2+内流由钙-钙调蛋白复合物和IP3敏感钙池共同调节。故Rax对LO2极显著的Ca2+阻滞作用可能是直接作用于钙-钙调节蛋白受体，阻止受体操纵性钙通道开放所致[11]。
2．2．3由线粒体损伤后启动的细胞凋亡新近的研究证实，由活性氧(ROS)、细胞内Ca2+超载或缺血缺氧等病理因素也是诱发细胞凋亡的重要触发机制[11,12]。当这些死亡信号到达线粒体后，首先引起线粒体渗透性转换并释放凋亡相关蛋白，包括细胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后参与激活凋亡激活因子与caspase-9的结合及caspase-9的激活，后者继而激活caspase-3，从而导致细胞凋亡。IRI时ROS生成过多，细胞内Ca2+超载，线粒体受损，诱导细胞过度凋亡[6]。丹参具有强大的清除自由基、减轻钙超载、保护线粒体结构和功能的完整等作用，因而可切断上述诱导因素的产生，阻断了此通路启动的细胞凋亡[13-15,17]。
2．3调节凋亡相关基因表达
细胞凋亡是级联式基因表达的结果。目前已知细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能不同分为三类：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中对Bcl-2的研究最为详细而系统；促进凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；双向调控基因，如J-myc、Bclk等。正常情况下，促进凋亡基因与抑制凋亡基因处于协调的对立统一状态，IRI时这种平衡被打破，组织细胞凋亡增多[2]。
张金涛等[7]报道BcL-2在前脑缺血2h就有表达，于6h达高峰，其后减少。此变化以海马CA1区最为显著。说明BcI-2主要在细胞凋亡早期发挥作用。丹参在缺血30min给予后，BcL-2的表达明显增加。赵明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫组化法进一步证实复方丹参滴丸不仅可以使BcL-2蛋白的阳性表达数(PEI)明显增加，还可使心肌细胞凋亡指数及Fas蛋白PEI下降。且随着复方丹参滴丸的剂量加大而进一步降低(P<0．05；P<0．01),说明丹参可恢复各凋亡基因之间的平衡，从而发挥其保护作用。
综上所述，丹参作用广泛，对IRI细胞凋亡各环节都有调节作用，从细胞、分子及基因水平阻断了IRI发生发展过程中因细胞凋亡引起的一系列“恶性循环”，从而表现出对IRI显著的保护作用。因此，丹参对减轻IRI来说是一种十分理想的药物，在临床上具有广阔的应用前景；同时丹参的抗凋亡作用也为临床上治疗因凋亡过度引起的疾病提供了一条新思路。
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篇4
【关键词】 中药； 肿瘤； 细胞凋亡； 作用机制
1992年英国科学家Hickman 等首次提出将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究中的主要目标和手段以来，肿瘤细胞诱导凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点，诱导肿瘤细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的新靶点。研究结果表明，许多中药的有效成分具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。这不仅为肿瘤的治疗提供了新的方法，同时也为中药的发展开辟了新的途径。中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制主要有以下几个方面。
1 阻滞肿瘤细胞增殖周期
根椐细胞的增殖特点，每一代细胞分裂都必须经历G1-S-G2-M 4个周期。在细胞分裂后进行 G1期前存在一个相对静止期（G0期），此期是决定细胞继续进行分裂或发生分化的重要阶段。许多中药的有效成份能够作用于细胞周期的某一环节，从而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。藤梨根氯仿提取液对细胞周期产生影响，可使G0／G1期细胞数目增多，S期和 G2/M期细胞减少，出现G0/G1期阻滞，提示藤梨根氯仿提取液可抑制肿瘤细胞的有丝分裂［1］。Li等［2］报道小檗碱可以在不影响CyclinB1 mRNA表达的情况下，抑制Cyclin B1蛋白活性，使CDC2 激酶活性降低，细胞进入有丝分裂受阻，停留在G2 期。Iizuka等［3］报道小檗碱可抑制食管癌细胞的增殖，使细胞在G0-G1期聚集，同时，使S期细胞减少，直至细胞全部凋亡。
而有些中药则是通过阻滞肿瘤细胞S期进入G2/M期而诱发其凋亡。榄香烯对G0/G1期细胞无明显作用， 主要作用在S期， 阻止细胞由S 期进入G2/M期， 从而抑制肿瘤生长［4］。马东礼等［5］在研究榄香烯对HeLa细胞的作用时发现，HeLa细胞增殖受到明显的抑制，细胞的分裂能力降低，绝大多数细胞阻滞在G2/M期。张曼颖等［6］研究发现刺五加叶皂甙能诱导SPC-A-1细胞凋亡，经细胞周期分析，G1和S期细胞百分率明显降低，G2/M期细胞明显升高，提示刺五加叶皂甙作用使SPC-A-1细胞阻滞于G2/M期。
2 影响癌基因和抑癌基因的表达
在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞表达的凋亡相关基因起重要的调控作用，其中的某些基因发生缺失，突变或过度表达，可导致细胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何调控凋亡相关基因或其相应产物，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，并诱导细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键。目前 bcl-2、c-myc、p53是几个了解较为深入的与凋亡调控有关的基因。
野生型 p53（wtp53） 基因的主要生物学功能为引起细胞周期限滞，诱导细胞凋亡和促进分化，对细胞生长起负调控作用，而因基因缺失或突变产生的突变型 p53（mtp53）蛋白则对细胞的增殖和转化起促进作用，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生［7］。p53基因发生突变是许多人类恶性肿瘤中常见的基因改变之一。实验证明大蒜素通过促进抑癌基因p53和p21的表达可以诱导人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的凋亡，还可诱导胃癌BGC-823细胞凋亡［8］。Wilson LC等［9］发现金雀异黄素(genistein)能诱导大肠癌HCT2116细胞的抑癌基因-非甾体抗炎药活化基因NAG21和p53、p21的表达，并通过诱导p53基因来调节NAG21的表达。而在大肠癌HCT215细胞(p53基因缺失)中NAG21不能被诱导表达，提示金雀异黄索通过调节p53基因而诱导肿瘤细胞凋亡。郭伟剑等［10］采用血清药理学方法研究健脾理气药(党参、白术、茯苓、八月札等)的体外诱导凋亡效应。结果显示含中药血清作用2 d后，诱导肝癌细胞凋亡，使细胞周期阻滞于S期，并上调p53蛋白的表达，提示上调p53蛋白的表达可能为健脾理气药诱导肝癌细胞凋亡的分子机制之一。抗癌口服液（由人参、灵芝和白花蛇舌草组成的复方水煎汤剂）作用于人胃癌 MGC-803细胞株，发现其具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用，用药前后凋亡相关基因p53 有显著性改变［11］。
原癌基因 bcl-2、c-myc 是主要的凋亡调控基因。bcl-2能抑制细胞凋亡，故bcl-2受抑制可能是细胞凋亡的共同通道［12］。而 bax 基因则倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强。在功能上与bcl-2 相反，其过度表达则触发凋亡。袁怀波等［13］用RT-PCR和蛋白质免疫印迹技术检测葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元处理HL-60后，对bcl-2和bax基因的mRNA和蛋白表达的结果显示，葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元处理HL-60细胞后能够上调bax mRNA表达水平，下调bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达。姚保泰等［14］研究发现盐酸小檗碱可通过下调bcl-2的表达而达到防治胃癌及癌前病变的目的。左小东等［15］研究华蟾素诱导肿瘤细胞凋亡与细胞周期阻断和抗凋亡基因bcl-2表达之间的关系。结果华蟾素能将肿瘤细胞阻断在S期，并能抑制bcl-2基因的表达。马靖等［16］研究表明，c-myc，c-jun和c-fos上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。何承伟等［17］研究半边旗提取物6F对HL-60细胞内c-myc、bcl-2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，发现8-23l nmol/L 6F作用HL-60细胞12 h后c-myc、bcl-2及PCNA蛋白表达水平明显下降，并呈剂量效应关系。
3 通过提高机体免疫功能
大量研究结果表明，中药能诱生和增强机体的免疫功能，通过增强机体免疫功能，诱生细胞因子如 IL-2（白介素－2），IFN（干扰素）诱导 LAKC（淋巴细胞激活的杀伤细胞）产生及 NKC（自然杀伤细胞）增殖，从而介导肿瘤细胞发生凋亡或诱生 TNF（肿瘤坏死因子）提高 TNF 活性，诱导肿瘤细胞凋亡。正所谓“扶正固本”达到“祛邪”的目的。戴馨仪等［18］探讨中药复方清金得生片对荷瘤动物的抑瘤作用及其对免疫功能的影响。结果显示清金得生片能使受抑制的免疫功能提高，从而达到抑制肿瘤生长，阻止癌细胞扩散，诱导癌细胞凋亡的目的。半枝莲，雄黄，水蛭通过促进机体的细胞免疫功能从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制 DNA 合成［19，20］。某些中药如黄芪、党参、灵芝等还可通过诱生干扰素、白介素-2等细胞因子，诱导LAK细胞吞噬和增加TNF诱导调亡的能力［21］。
4 对端粒酶活性的影响
端粒酶可能是目前已知的最为广谱的恶性肿瘤分子标记物，并且与细胞周期和肿瘤凋亡基因表达关系密切。因此，鉴于端粒酶在肿瘤发生和发展中所扮演的如此重要的角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌药物发挥作用的机制。陈伟忠等［22］实验证明，肝癌细胞株中大多有端粒酶活性表达，并利用TRAP-ELISA法定性检测了不同浓度的苦参碱对肝癌细胞HepG-2端粒酶活性的影响。结果显示苦参碱对HepG-2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同时认为苦参碱抗肿瘤的机制可能与抑制hTERT表达、降低端粒酶活性有关。曾建新等［23］的实验结果发现肝癌HCC-9204细胞中端粒酶活性较高，而当用As2O3 处理48 h后，测得端粒酶活性显著降低，提示抑制端粒酶活性是As2O3诱导肝癌细胞凋亡的机制之一。黎丹戎等［24］的实验表明，茶多酚具有诱导BEL-7402细胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表达。同时并没有发现发生分化的细胞端粒酶活性不下降的情况。这说明端粒酶的活性抑制是细胞分化过程所伴有的，提示茶多酚的抗癌机制可能是通过抑制端粒酶的活性而实现的。李伏娥等［25］用PCR-ELISA法对胃癌细胞端粒酶活性进行检测，苦参碱在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调，且随苦参碱浓度增大和时间延长，抑制作用逐渐增强。提示苦参碱诱导细胞凋亡的调控可能与端粒酶表达调控之间存在密切联系。
5 对凋亡信号传导的影响
Moragoda［26］报道，姜黄素能抑制胃癌KATO-III和结肠癌HCT-116细胞增殖并诱导凋亡，使HCT2l16细胞的细胞周期停止于G2/M期，免疫印迹结果显示两种细胞cyclin D、E水平下降，其诱导凋亡的机理是导致PARP断裂，激括caspase8活性，启动Fas凋亡途径。
Caspase-3是ICE/CED-3家族的重要成员，是细胞凋亡调控的重要因子之一。一般以23 000相对分子质量的无活性前体存在于细胞质中，当细胞进入凋亡时被激活，并可促进ICE家族的其他成员一起促进细胞凋亡。Pan等［27］研究乌龙茶多酚诱导人组织淋巴瘤U937细胞凋亡时发现，乌龙茶多酚可通过释放细胞色素c，活化Caspase-9、Caspase-3来诱导细胞凋亡。
另外，某些中药诱导肝癌细胞凋亡的机理还与蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有关，PKC可拮抗皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡，槲皮素作为PKC的拮抗剂，可逆转这种作用，增强机体对肿瘤细胞的吞噬能力，诱导细胞发生凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，调节细胞内二者的比值，控制细胞凋亡的蛋白磷酸化，导致肿瘤细胞发生凋亡［28］。
6 调节体内激素水平诱导凋亡
激素可引起某些肿瘤细胞凋亡。某些中药如人参、刺五加、党参等可刺激机体分泌肾上腺皮质激素。甘草、甘草甜素等具有分泌糖皮质激素作用。由于上述中药使体内激素水平升高，推测其有诱导细胞凋亡作用，对治疗激素敏感性肿瘤提供了可应用的中药［29］。
7 结语
随着研究工作的不断深入，对细胞凋亡的认识取得了令人瞩目的进展，细胞凋亡的研究为肿瘤治疗提供了新的思路和靶点。人们已经认识到诱导肿瘤细胞凋亡很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是，目前人们对细胞凋亡的概念、生化机制、生理病理意义乃至在生命科学中的应用等诸多方面的认识尚处于初级阶段，不仅尚有许多有待开拓的领域，而且在已经涉及的领域中还有很多问题没有得到很好解决，如迄今尚未完全确立细胞凋亡和细胞坏死的严格界限，细胞凋亡发生的确切机制亦尚不完全清楚等。而且在中医药与细胞凋亡关系研究领域，相关中医基础理论研究明显滞后于中药作用机制研究，目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，而缺乏对相应中医理论的探讨。因此，如何将传统中医基础理论与现代分子生物学有机地结合，开展“中医分子生物学”的研究，对中医药现代化研究具有十分重要的意义。
总之，通过中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究，既可深入研究抗肿瘤中药的作用机制，还可在传统扶正祛邪治疗基础上，赋予新的含义，提出新的治疗方案，并与化疗药物配合使用，提高疗效，减少毒副作用。 参考文献
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篇5
【关键词】 肺肿瘤 蛋白质PTEN 细胞凋亡 细胞增殖 免疫组织化学
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expression of PTEN and its relationship with cell proliferation and apoptosis in nonsmallcell lung cancer (NSCLC). MethodsThe immunohistochemistry stain （SABC） method was applied to investigate the expression of PTEN and PCNA in samples of 43 NSCLC and 20 normal adjacent lung tissues. TUNEL method was applied to detect the apoptosis. The apoptosis index (AI) and mitotic index (MI) were defined. ResultsThe positive rate of PTEN was significantly lower in cancer tissues than in their normal adjacent tissue (χ2=13.609，P
［KEY WORDS］ lung neoplasms; protein PTEN; apoptosis; cell proliferation; immunohistochemistry
细胞周期失控是癌变的重要原因。细胞总是处于一种增殖与凋亡的动态平衡中，细胞的增殖和凋亡状态受一系列基因的调控，当促增殖的基因过度表达，促进凋亡基因突变或缺失均会造成增殖和凋亡动态平衡的打破，导致肿瘤的发生。基因控制增殖与凋亡失衡在肺癌发生发展中起主要作用。本研究对PTEN基因在不同组织类型、分化程度、临床分期及预后的肺癌组织标本中的表达进行检测，旨在探讨PTEN基因表达及细胞增殖、凋亡在肺癌发生发展中的作用和它们之间的关系。
1 材料与方法
1.1 标本及其来源
43例肺癌、20例癌旁正常肺组织标本均取自我院手术病理证实标本。43例肺癌病人中，男23例，女20例；年龄41～77岁，平均（59.2±9.7）岁。鳞癌17例，腺癌26例；高分化2例，中分化20例，低分化21例。有淋巴结转移21例，无淋巴结转移22例。按国际抗癌联盟（UICC）1997年肺癌国际分期修正标准进行TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期4例。随访3年，存活19例，死亡24例。
1.2 方法
1.2.1 标本处理 标本均经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，按4 μm厚连续切片4张，1张行苏木精伊红染色，3张分别行PTEN、PCNA免疫组化染色和TUNEL法染色。
1.2.2 PTEN、增殖细胞核抗原（PCNA）以及TUNEL免疫组化染色 采用SABC免疫组化检测技术，严格按照试剂盒说明书进行操作，以PBS替代一抗作为阴性对照，以已知肺癌阳性切片作为阳性对照。
1.2.3 结果判断 PTEN蛋白主要分布在胞浆，细胞浆显示棕黄色颗粒者为阳性。肿瘤细胞核、胞浆均未见棕黄色颗粒为（－）；0～10%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（±）；11％～30%癌细胞内可见棕黄色颗粒为（+）；31％～50%癌细胞可见棕黄色颗粒为（）；>50%癌细胞见棕黄色颗粒为（）。以（+）、（）及（）表达作为阳性，以（±）及（－）表达作为阴性。PCNA主要分布在胞核，细胞核出现棕黄色颗粒为增殖细胞。TUNEL染色阳性颗粒位于细胞核内，细胞核出现棕黄色颗粒为凋亡细胞。随意计数5个以上高倍视野，不少于1 000个细胞，以凋亡细胞与总细胞比值作为凋亡指数（AI），增殖细胞与总细胞的比值作为增殖指数（MI）。
1.3 统计学处理
数据间比较采用四格表χ2检验和t检验。
2 结
果
2.1 肺癌与癌旁正常肺组织PTEN表达、细胞凋亡和增殖情况
本文43例肺癌组织PTEN阳性20例，阳性率为46.51%；20例癌旁正常肺组织PTEN阳性19例，阳性率为95%，两者相比较差异有显著意义（χ2=13.609，P
癌旁正常肺组织AI为（1.250±0.775）%，肺癌组织为（4.126±2.088）%，两者比较，差异有显著性(t=8.279，P
癌旁正常肺组织的AI与MI无相关性（r=0.026，P>0.05）。肺癌组织AI与MI比值呈正相关（r=0.622，P
2．2 肺癌组织PTEN蛋白表达、AI、MI与临床病理的关系
鳞癌与腺癌PTEN表达、AI和MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达、AI和MI与组织类型无关。高中分化肺癌与低分化肺癌比较，PTEN蛋白表达和AI差异有显著性，MI差异无显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与组织分化程度有关，MI与组织分化程度无关。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期比较，PTEN蛋白表达和AI差异无显著性，MI差异有显著性，提示肺癌PTEN蛋白表达和AI与TNM分期无关，MI与临床分期有关。肺癌淋巴结转移组PTEN表达与淋巴结无转移组差异有统计学意义，提示肺癌PTEN蛋白表达与淋巴结转移有关。肺癌淋巴结转移组AI和MI与淋巴结无转移组差异无统计学意义，提示肺癌AI与MI与淋巴结转移无关。肺癌存活组PTEN蛋白表达、AI及MI与死亡组比较有显著性差异，提示肺癌PTEN蛋白表达、AI及MI与预后有关。见表1。
2.3 肺癌PTEN蛋白表达与细胞凋亡和增殖关系
PTEN阳性的肺癌组织细胞AI为（5.585±1.782）%，阴性者为（2.857±1.399）%，二者比较，差异有显著性(t=5.525，P
3 讨
论
PTEN（或称MMAC1，TEP1）是1997年由STECK等3个研究小组分别发现并命名的一种新的抑癌基因，是至今为止发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因［1］。它在肿瘤细胞浸润、血管发生以及肿瘤转移中起重要作用［2］。研究发现，PTEN可去除3，4，5三磷酸磷脂酰肌（PIP3）3′位上的磷酸基团，调节丝苏氨酸激酶（Akt）的功能， 对细胞增殖分化具有负调节作用［2，3］。丢失PTEN的细胞会失去这种负调节作用，促进肿瘤的进行性生长。在多种人体肿瘤中均发现PTEN基因的突变和杂合性丢失。KIM等［4］报道，42％～70%的小细胞肺癌和27％～50%的非小细胞肺癌有PTEN的杂合性丢失（LOH）。
本实验结果显示，肺癌组织中PTEN基因的蛋白表达主要分布在胞浆，在核膜上也有少量着色，癌旁正常肺组织较肺癌组织着色明显增强，肺癌组织PTEN的蛋白表达显著低于癌旁正常肺组织，肺癌PTEN表达下调，提示PTEN蛋白的缺失在肺癌的发生中可能起重要作用；PTEN蛋白表达与肺癌的组织类型、临床分期无关，而与组织的分化程度、淋巴结转移和病人的预后密切相关。MCMENAMIN等［5］报道，PTEN蛋白在前列腺癌中表达水平越低，肿瘤的恶性程度越高；临床分期越晚，预后越差。本实验结果也显示，低分化肺癌PTEN蛋白表达水平低，说明PTEN蛋白表达水平越低，肺癌恶性程度越高。REIFENBERGER等［6］研究发现，PTEN突变的恶性黑色素瘤较未发生突变的黑色素瘤更易发生淋巴结转移。本文实验结果显示，有淋巴结转移的肺癌病人PTEN表达水平明显低于无淋巴结转移者，提示PTEN蛋白低表达的肺癌病人更容易发生淋巴结转移，可能是因为PTEN蛋白缺失的肺癌病人失去PTEN对FAK介导细胞浸润、转移和生长的抑制作用，从而更容易发生淋巴结转移。以上结果提示，PTEN的蛋白表达可以抑制肿瘤细胞的浸润、转移和生长。PTEN蛋白表达与肺癌病人预后的关系至今未见报道。MCMENAMIN等［5］研究发现，PTEN蛋白的丢失严重影响前列腺癌病人的预后。本实验结果显示，PTEN蛋白表达与肿瘤的恶性程度及淋巴结转移密切相关，PTEN蛋白高表达的肺癌病人预后良好，PTEN可以作为判断肺癌病情和预后的指标。
细胞凋亡是一种不同于细胞坏死的细胞生理性死亡方式，是受基因编码的细胞主动“自杀”过程，又称程序性细胞死亡。细胞凋亡在肿瘤发生发展过程中主要起负反馈调控作用，可以阻遏肿瘤细胞的迅速生长。
STAUNTON等［7］研究发现，不同类型的肿瘤有不同的细胞AI，而且与肿瘤分化、分级、进展和肿瘤的生物学行为有关。本文实验结果与HWANG等［8］报道结果相似。AI与肺癌临床病理特征之间的关系目前研究较少。本实验结果显示，细胞AI与肺癌组织的分化程度密切相关，细胞AI越高，肺癌恶性程度越高。但本实验结果未显示细胞AI与肺癌组织类型、TNM分期有关。LANGENDIJK等［9］报道，细胞AI越高的非小细胞肺癌，越容易发生淋巴结及远处转移。本组资料虽显示淋巴结转移组比非转移组细胞AI高，但无统计学意义。
细胞AI与肺癌预后的关系报道较少，EEROLA等［10］报道，细胞AI高的手术治疗的大细胞肺癌病人的预后差。本实验资料显示，肺癌死亡组细胞AI较存活组明显增高，提示细胞AI可作为判断肺癌预后的指标。另有文献报道，行放疗肺癌病人中高AI者提示预后良好。提示在临床上可以通过检测细胞AI，选择细胞AI高的肺癌病人行放化疗，或通过转基因技术提高病人对放化疗的敏感性。
肿瘤细胞增殖活性是指肿瘤组织的增生状态，取决于进入细胞周期的增殖细胞及它们在全体肿瘤细胞所占的比例，是用以反映肿瘤良恶性及恶性程度的重要指标。PCNA也称周期蛋白（cyclin），是存在细胞核内的一种蛋白质，它对细胞由G1期向S期过渡起着重要的调节作用。
有关PCNA与肺癌的关系，国内外学者作了较多研究。本实验结果与KAWAI等［11］报道的结果相似。目前有关PCNA及MI与肺癌组织类型之间的关系还存在争论，本实验结果未发现MI与肺癌组织类型及淋巴结转移有关，与大多数学者结果一致，认为PCNA的表达仅能反映细胞的增殖状态，与组织类型无关。
本实验结果显示，癌旁正常肺组织细胞MI明显低于肺癌组织，提示肺癌组织较癌旁正常肺组织细胞增殖明显活跃，这可能也是肺癌得以发生发展的重要机制。有学者研究表明，PCNA表达与肺癌分期相关，分期越晚，PCNA表达越高［10］。本实验结果也显示，PCNA表达与肺癌临床分期密切相关，临床分期越晚，PCNA增殖指数越高。PCNA可作为肺癌早期诊断的参考指标。
有研究表明，PCNA表达随肺癌的恶性程度增高而增高，PCNA及MI与肿瘤分级呈正相关，提示肺癌PCNA的表达可反映肺癌细胞分化的程度，预示肿瘤恶性度的高低。本实验显示，高分化肺癌较低分化癌MI低，但无统计学意义。OYAMA等［12］报道，PCNA的表达与非小细胞肺癌的预后密切相关，PCNA的阳性表达越强，病人的预后越差。本实验结果也显示，PCNA及MI与肺癌病人的预后密切相关，MI越高，病人的预后越差。PCNA可作为判断肺癌病人病情及预后的指标。
以往认为肿瘤的发生仅仅是由细胞凋亡减少引起。许多证据证实，在大多数肿瘤，细胞凋亡不是减少了，而是增多了。王洁等［13］报道肺癌组织细胞凋亡较癌旁肺组织明显增多，且随着细胞增殖的增加而增加。本实验结果显示，肺癌组织细胞增殖和凋亡均较活跃，细胞AI与细胞MI呈正相关。推测其机制可能是肺癌恶性细胞无限度增殖，打破细胞增殖与凋亡的平衡，启动了凋亡机制。本实验结果显示，肺癌组织MI/AI比值为11.97，癌旁正常肺组织为10.96，肺癌组织MI/AI值同癌旁肺组织基本一致，提示细胞凋亡随细胞增殖的增加而呈比例增加。本实验结果还显示，癌旁正常肺组织AI与MI无相关性，而肺癌组织AI与MI呈正相关。这也说明肺癌组织细胞凋亡增加是由于增殖增加引起。但因为增殖细胞在数量上远远大于凋亡细胞，凋亡速度不可能跟上增殖的速度，在肿瘤的发生发展过程中所谓细胞凋亡减少是相对过快的细胞增殖而言的，癌细胞过度增殖及凋亡的相对不足在肺癌的发展过程中起重要作用，这可能是肿瘤得以迅速发展的原因之一。
PTEN蛋白与细胞凋亡的关系至今未见报道。本实验结果显示，PTEN蛋白阳性表达的肺癌细胞AI明显增高，MI明显降低，提示PTEN蛋白在肺癌具有促进细胞凋亡、抑制细胞增殖的双重作用。在众多抑癌基因中，具有双重抑癌作用者是不多见的，已有研究将PTEN作为靶基因用于肺癌基因治疗中。因此，PTEN很有可能成为将来肺癌转基因治疗最为有效的基因之一。
PTEN是通过诱导细胞凋亡和抑制癌细胞增殖双重作用来抑制肺癌发生发展过程的。而细胞增殖与凋亡又是癌细胞周期失控发生癌变的根源。基因治疗癌症是一种新的有效方法。目前主要是难以筛选出一种较为有效的靶基因。PTEN可能成为今后肺癌基因治疗最为重要的靶基因。
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篇6
[关键词] 白血病细胞；Ca2+浓度；凋亡；分化
Ca2+广泛存在于细胞内液与细胞外液中，它作为第二信使，在细胞的生理调控中具有重要的功能，如细胞代谢、分裂、分泌、细胞的归巢、黏附、聚集、淋巴细胞的变形能力和供氧等。在生理状态下，胞浆内游离Ca2+浓度大约维持在100nmol/L左右，细胞内的Ca2+主要存在于线粒体和内质网中，细胞外及内质网内的Ca2+浓度比胞浆内要高得多，在mmol/L水平。细胞内外Ca2+稳态的维持是保证细胞能够进行正常生命活动的重要物质基础。早期研究表明，Ca2+稳态的破坏是药物引起细胞死亡的一个普遍的终末事件，然而体内的细胞在内外环境各种因素的作用下，会打破细胞内外Ca2+的稳态，而当细胞内外Ca2+浓度升高或降低时可以分别调节不同的转录因子，从而影响细胞的功能。
目前治疗白血病的有效机制之一就是诱导白血病细胞的凋亡与分化，大量研究表明，诱导白血病细胞凋亡与分化的过程中都伴随着细胞内Ca2+浓度的变化，可见细胞内Ca2+浓度对白血病细胞的凋亡和分化有着一定的影响。
1.Ca2+浓度对白血病细胞凋亡的影响
细胞凋亡是细胞基因调控的一种自主性的自杀现象，是为了更好的适应环境而主动采取的一种死亡过程。其生化变化包括DN段化，胞内Ca2+浓度增高以及酶学改变。而细胞凋亡时最早可以检测到的生化改变就是细胞内Ca2+浓度快速持续的升高。大量文献报道，在许多因素作用于白血病细胞后都是首先出现细胞内Ca2+浓度的升高然后出现白血病细胞的凋亡，说明细胞内Ca2+浓度异常升高是导致白血病细胞凋亡的重要信号。80年代初，人们发现在用糖皮质激素诱导动物胸腺细胞凋亡的过程中，出现了细胞内Ca2+浓度的持续上升，从此Ca2+信号与细胞凋亡的关系就一直受到人们的关注。
研究表明，当细胞内Ca2+浓度升高后可以通过很多途径参与细胞凋亡，如诱导凋亡相关基因的活化；激活Caspases蛋白酶；激活转谷氨酰胺酶等等。但也有文献报道[1]，细胞内Ca2+浓度的升高又可以通过阻断MAPK途径促进白血病TF-1细胞系的生长和增殖。所以随着研究的细胞类型和处理因素的不同，各项研究对Ca2+在细胞凋亡中的作用机制的报道不一，甚至出现矛盾和分歧。如：在胸腺细胞当细胞内Ca2+增加被抑制时.糖皮质激素引起的细胞凋亡被抑制，而在HL-60细胞使用Ca2+螯合剂EGTA没有使细胞内Ca2+浓度减少，并且FTY720诱导的细胞凋亡也没有被抑制，但是当细胞内得Ca2+被去除时，细胞凋亡也被抑制。
2.Ca2+对白血病细胞分化的影响
细胞内外Ca2+浓度的改变与白血病的分化也有着密切的关系。国外有实验报道，钙离子载体（CI）可通过细胞信号转导机制，诱导幼稚的造血细胞进一步分化为成熟的树突状细胞（DC）。国内也有报道，利用CI和GM-CSF共同诱导外周血的单核细胞，可以使其分化成具有典型的树突状突起的细胞，而且DC的特征性表面标志CD83，CD86，CD54及MHC-Ⅱ表达也上调[2]。当这种CI作用于HL-60细胞时，也可以将其诱导分化成具有活性的DC样细胞[3]。说明Ca2+在诱导白血病细胞分化中也发挥着重要的调节作用，其机制可能是因为CI可以提高胞浆游离Ca2+浓度，导致Ca2+与钙调蛋白（CaM）结合，使CaM的构象发生改变，结合各种蛋白受体分子，诱导了依赖Ca2+的相关基因转录。刘北忠[4]等在利用苦参碱诱导K652细胞分化的研究中发现，无论是在细胞外有Ca2+还是无Ca2+的情况下，苦参碱都可以使细胞内Ca2+浓度升高，说明Ca2+是苦参碱诱导K562细胞分化早期的一个非常重要的信号，其机制可能与PLC的活化有关。
由上可见，无论是白血病细胞的凋亡还是分化，Ca2+对白血病细胞都有一定的影响，所以以钙离子为出发点的研究为治疗白血病开辟了一个新的途径。但由于Ca2+调节机制的复杂性，加上细胞类型及处理因素的不同，使实验出现多种不同的结果，甚至出现矛盾。可见Ca2+在白血病细胞中的作用机制还有待于进一步的研究。
参考文献：
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篇7
摘 要：电镜观察益肺饮诱导肺癌细胞凋亡。镜下可见：细胞凋亡分为早期阶段、中期阶段、凋亡小体形成阶段和晚期阶段(3期4阶段)，其超微结构主要可见到细胞形态、胞浆、胞核、染色质的变化，及细胞凋亡的特异性标志――凋亡小体。提示：细胞凋亡多见孤立、分散的癌细胞。益肺饮可谤导肺癌细胞凋亡。
关键词：TEM；益肺饮；细胞凋亡
中图分类号：11285.5
文献标识码：A 文章编号：1673－7717(2007)07－1390－02
研究中药诱导肿瘤细胞凋亡国内报道不多。笔者应用透射电镜(TEM)观察了中药益肺饮灌胃治疗接种Lewis肺癌株小鼠实体瘤，以血清药理法诱导A549人肺癌细胞株凋亡，现将其超微结构特征结果总结如下。
1 材料与方法
1．1 实体瘤组取瘤组织切成1mm3小块，投入2.5％戊二醛固定2h以上，漂洗后，1％锇酸固定1h，乙醇梯度脱水，EponS12树脂包理，超薄切片，铀铅双染色，TEM观察。
1．2瘤株组2.5％戊二醛培养瓶内原位固定2h以上，橡皮铲刮下细胞，放入离心管内，2000r/min离心15min，漂洗后，如上法固定，脱水、包埋、切片、染色、观察。
2 结 果
2．1 细胞凋亡初期阶段凋亡细胞与其周围细胞的间隙增宽，连接消失，体积缩小，电子密度增强。细胞表面微绒毛明显减少，胞浆内线粒体肿胀，粗面内质网扩张，表面核糖体脱落。胞核大，异染色质浓缩呈团块状，积聚在核的周边。细胞膜正常。
2．2细胞凋亡中期阶段除细胞膜外，其余细胞形态学变化均与初期阶段相同。该阶段，细胞膜变化尤为明显。胞膜表面呈数量不一、大小不等、电子密度适中的泡状膨出(发泡、长芽)。此时，凋亡的细胞从癌巢中脱离，成为孤立
2．3凋亡小体形成阶段细胞破裂，形成单个或数个具有细胞凋亡的特异性结构――凋亡小体。
2．4细胞凋亡晚期阶段凋亡小体被其周围的吞噬细胞吞噬。
3 讨 论
篇8
【关键词】 超声;凋亡;形态学
Abstract: Objective To investigate the effect of diagnostic ultrasound exposure on the apoptosis of human embryonic kidney (HEK293) cells. Methods HEK293 cells were exposure to abdominal ultrasound probe for 0， 10， 20 and 30 min， and their apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining. Results Compared with control group， apoptotic rate of HEK293 cells increased significantly after 20min exposure (P
Key words:ultrasound; apoptosis; morphology
超声应用于产科，可以推算胎龄、诊断先天畸型及了解胎儿宫内发育情况，它能为胎儿、胚胎甚至正在发育成熟的卵泡提供一个清晰的图像，同时也需要更高的超声输出功率。随着孕前卵泡检测和产前检查越来越细致和精确，超声运用的频率、时间、输出功率也在不断增加，敏感的胚胎组织及生殖细胞受到的威胁也随之加大。人们对超声使用的安全性也越发关心。有关产科超声的安全性，目前尚无统一定论，更无具体的辐照剂量可引起哪方面的影响这样的规律可循，孕期超声检查只能尽可能地使用最低剂量。这使超声的产前检查安全性的遵循原则带有盲目性，或者引起因不了解超声的安全范围而滥用超声，为产前检查带来隐患。要明确知道产前超声的安全范围还需要一个漫长的过程，本实验拟探讨超声近距离辐照对体外培养细胞凋亡形态学改变的影响，为产前超声的安全使用提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 试剂
Hoechst 33258购自美国Sigma公司，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程公司，胰蛋白酶购自美国Gibco公司，其余试剂为国产分析纯。HEK293细胞株由广东医学院生化教研室提供。1 mg Hoechst 33258溶解于10mL PBS中，配成100 mg/L的10×Hoechst 33258储存液，密封避光，4℃短期保存。
1.2 仪器
MCO15A CO2细胞培养箱(日本SANYO公司)，YJ875DA 医用净化工作台(苏州净化设备厂)，IMTI型荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)，Vivid 7彩色多普勒超声诊断仪(GE公司)。
1.3 细胞培养与处理
HEK293细胞采用常规培养方法，无血清饥饿培养调整细胞周期一致后进行实验。将细胞分成超声照射0 、10、20、30 min组，空白组予以假照，腹部探头产科诊断条件(3.5 MHz、MI 0.8)，介质为细胞培养液(主要成分为DMEM培养基)，辐照距离
1.4 细胞染色与观察
收集处理后的细胞，PBS洗涤离心2次后取10μL细胞悬液滴于盖玻片上，加1mL固定液(甲醇∶冰乙酸3∶1)，4℃固定5 min，弃去固定液，用PBS洗两遍，吸尽液体。加入1mL Hoechst 33258工作液(10 mg/L)，摇床轻摇，染色10 min，弃去染色液，用荧光显微镜避光拍照，激发波长350 nm左右，发射波长460 nm左右。
1.5 结果评判
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。由两位病理学技术人员对图片进行分析对照。
1.6 凋亡百分率的计算
把载波片置于24孔板培养细胞，细胞爬片，调整周期及分组照射(方法同1.3)后培养24h，5mg/L的Hoechst 33258避光染色5min，荧光显微镜观察。计算每孔5个高倍(×400)视野平均细胞总数、凋亡细胞数，最终算出细胞凋亡百分率。
1.7 统计学处理
计量数据以(±s)表示，使用SPSS10.0统计软件进行处理，多个样本均数的比较采用单因素方差分析及q检验。
2 结果
2.1 HEK293细胞体外培养
HEK293体外培养成功，经传代培养后，待细胞生长疏密适中，于倒置相差显微镜下进行放大倍数为600倍拍照，光镜下HEK293细胞的形态呈多角形，贴壁生长，细胞间有连接，细胞核圆形或椭圆形，大小约占整个细胞的1/3，核内染色质及核仁清晰，部分可见分裂相。
2.2 凋亡细胞Hoechst 33258染色的形态学变化
空白组：超声处理0 min(假照)，细胞核大小较一致，核膜完整，核内染色质呈小点状均匀分布，部分可见有丝分裂相，未见异型核，见图1。
1组：超声处理10 min，细胞核形态尚规则，核膜完整，未见异形核，但对比空白组，本组细胞核部分出现大小不一，核内染色质聚集的现象，见图2。
2组：超声处理20 min，细胞核大小不均，一部分细胞核胀大，染色质边集，一部分细胞核缩小浓染，呈小颗粒状，个别细胞核膜不完整，染色质疏松，表现为凋亡Ⅰ期和Ⅱa期改变，见图3。
3组：超声处理30 min，细胞核大小不均，部分可见异形核的出现，部分细胞核内染色质浓染边集，呈小团块状，个别核膜破裂染色质疏松分布于胞质中，表现为凋亡Ⅱa期和Ⅱb期改变，见图4。
图1图2图3图4
图1 空白组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);图2 超声照射10 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600);
图3 超声照射20 min组细胞Hoechst 33258染色结 (×600);图4 超声照射30 min组细胞Hoechst 33258染色结果(×600)。
2.3 细胞凋亡率比较
详见表1。
3 讨论
细胞凋亡是多细胞有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡过程。细胞凋亡的主要特点为：细胞体积小，染色质浓缩，呈块状致密染色区，DNA分子被特异性DNA内切酶在核小体间切断，核裂解，形成凋亡小体[1]。生殖细胞、受精卵和胚胎组织中，即便是个别细胞出现异常的凋亡，都有可能对其生长发育造成影响。因此超声对细胞凋亡的影响受到学者们的关注。bcl2是一种重要的凋亡抑制因子，周海燕等[2]研究证明，长时间连续超声照射可引起胎鼠肾小管上皮表1 不同剂量的超声作用HEK293细胞凋亡百分率的改变细胞bcl2蛋白表达水平下降。p53基因在诱导神经细胞凋亡时有重要的作用，赵晶等[3]研究表明，超声辐照时间和剂量的增加可引起p53基因的蛋白表达水平增加。何明生等[4]发现，电压为10 mV条件下超声辐照K562细胞10 min以上，辐照组细胞形态变化较大，核染色质浓缩呈斑块状，并有核碎裂、凋亡小体出现。有学者发现低频超声辐照HL60后细胞膜空隙率增加，这可能是凋亡前的形态学改变[5]。Lagneaux等[6]则认为低频超声效应与声化学机制有关，超声诱导的声化学冷光能触发光敏感性单态氧的产生，从而对细胞产生一个“氧化应激”，继而启动细胞凋亡反应。一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有Hoechst 33258，它能与DNA非嵌入式结合，主要结合在AT碱基区，紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光，从而对细胞核进行形态学的观察。Hoechst 33258凋亡染色法具有直观，方便的优点，并可通过形态学的变化对其凋亡的早中晚期进行估测。本实验用Hoechst 33258对空白组和处理组细胞染色后，经荧光显微镜观察，与凋亡形态的标准相符合，其中超声处理30 min组部分细胞核染色质高度凝聚、边缘化并产生了凋亡Ⅱb期的形态学改变，部分细胞核呈异形核，细胞核形态改变最明显，细胞凋亡比例最高(P
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篇9
【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞增殖；细胞凋亡
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0047-03
Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.
Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis
膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，其中移行细胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又称为尿路上皮癌，其中70%～85%的移行细胞癌为表浅性膀胱癌[1]。临床中非肌层浸润性膀胱癌的常用治疗方法为经尿道膀胱肿瘤切除术[2]。然而，经尿道膀胱肿瘤切除术后的患者有50%～80%的复发，10%～25%的患者复发后发展为肌层浸润性膀胱癌[3]。为了抑制膀胱肿瘤的复发及进一步恶化，化疗以及免疫治疗被广泛用于浅表性膀胱癌患者的术后治疗中。较常用的膀胱内化疗及免疫治疗的药物包括顺铂、丝裂霉素 C、卡介苗以及干扰素-α[4-5]。这些方法虽然在一定程度上取得疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。
芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮，Apigenin， API），又称芹黄素，是一种广泛存在于多种水果和蔬菜中的黄酮类化合物，具有多方面的药理作用[7-8]，以抗肿瘤作用最为突出。实验证明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的癌细胞的生长和诱导其凋亡，包括：宫颈癌[9]、卵巢癌[10]、结肠癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用。
1 材料与细胞
1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；Hoechst 33258，购置南京碧云天。RPMI 1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
2 实验方法
2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每个浓度设4个复孔，同时以不加芹菜素为空白对照组培养72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl继续培养4h，弃上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解结晶体，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次，计算平均值。
2.2 Hoechst 33258 细胞核染色法观察细胞凋亡的形态学改变 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素为空白对照组）作用24h后，吸去培养液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1荧光倒置显微镜下以340nm 激发光观察细胞凋亡形态并随机拍照。
2.3 软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对5637克隆形成能力的影响 将1×103个5637细胞悬浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔点琼脂糖，10%FBS， 1%双抗）并加入不同浓度的芹菜素（40、80μmol/L），接种于预处理的6孔板中，同时以不加芹菜素为空白对照组。6孔板预先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔点琼脂糖， 10%FBS， 1%双抗）。培养3周以后，细胞克隆形成，采用0.01%结晶紫染色，观察计数。实验重复3次。
2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。
3 结果与分析
3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P
3.2 芹菜素对5637细胞克隆形成能力的抑制作用 不同浓度芹菜素处理的细胞克隆形成能力均受到严重的抑制，与空白对照组相比差异有统计学意义（P
3.3 芹菜素诱导5637细胞凋亡的形态学变化 采用Hoechst 33258染色的细胞核结果显示，80μmol/L芹菜素处理后，大量的5637细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征；与此相比，对照组的活细胞，细胞核膜完整，核呈圆形或椭圆形，染色质分布较均匀，细胞核为蓝色均匀淡染，并未见凋亡细胞（图3左图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的细胞核形态观察；右图为芹菜素对5637细胞凋亡诱导的统计学分析）。以上实验结果表明芹菜素可诱导5637细胞凋亡。
4 讨论
芹菜素作为一种广泛存在于植物中的天然黄酮类化合物，近年来已成为研究的热点[13]，但有关芹菜素抗膀胱癌作用的实验研究比较少。逃逸了正常细胞增殖的调控体系而自主地无限生长是肿瘤细胞的典型特征。通过MTT实验实验结果显示，20、40、60、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的增殖能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。芹菜素抑制膀胱癌细胞增值的主要机制，可能与其直接抑制5637细胞生长，并诱导5637细胞凋亡等有关。
在有机体中，细胞凋亡是一个复杂的生理和病理过程，肿瘤的增值与凋亡是调控肿瘤的发生、发展的最重要的因素之一。研究肿瘤的发生发展机制，寻找抑制肿瘤细胞增值，增加肿瘤细胞凋亡的分子药物，是抑制肿瘤生长，阻碍肿瘤发生、发展的一个重要途径。我们通过Hoechst 33258细胞核染色结果显示，80μmol/L芹菜素处理人膀胱癌5637细胞，大部分细胞细胞出现核固缩、染色质凝集和核碎片化等典型的细胞凋亡特征。肿瘤的自我更新能力是肿瘤细胞一个重要特征，我们采用软琼脂克隆形成实验检测芹菜素对膀胱癌5637细胞自我更新能力的影响[14]，结果显示，40、80μmol/L芹菜素对人膀胱癌5637细胞的克隆形成能力具有显著的抑制的作用，且随着浓度的增加抑制效果更加明显，呈现出良好的和量效关系。
总之，我们的研究发现芹菜素作为一种植物提取的活性成分，能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖以及克隆形成，并诱导其凋亡，芹菜素有望成为无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物。
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篇10
【关键词】 细胞凋亡; 动脉粥样硬化; 斑块稳定性; 综述
[Abstract] Apoptosis is definied as a mechanism of a lontrolled sequence of events which occurs as a spontaneous programmed cell death in normal phsiological or pathologial condition. When the pathways of apoptosis are out of control， it will lead to related diseases. At present it is considered that apoptosis is an independent risk factors of atherosclerotic lesions. Cellular excessive apoptosis in the atherosclerotic plaques plays an important role in the process of the formation of unstable plaques. The relationship between the apoptosis of vascular endothelial cells， vascular smooth muscle cells and macrophage and the atherosclerosis， and the effects of apoptosis on atherosclerotic plaque stability will be discussed in this review.
[Key words] apoptosis; atherosclerosis; plaque instability; review
细胞凋亡(apoptosis)是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序化死亡过程。由于细胞缩小而丧失与周围细胞接触，染色质固缩在核膜附近，细胞骨架崩解，核膜消失，DNA断裂成片段，细胞膜起泡，最终细胞解体为许多由细胞膜包裹的凋亡小体，并被周围的健康细胞或吞噬细胞吞噬。动脉粥样硬化(atherosclerosis， AS)，是危害人类健康最严重的心血管疾病。病变特征是血中脂质在动脉内膜沉积，内膜灶性纤维性增厚及其深部成分的坏死、崩解，形成粥样物，而使动脉壁变硬、管腔狭窄。主要累及弹力型动脉和弹力肌型动脉(如冠状动脉、脑动脉)。动脉粥样硬化的特点是受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变存在，包括局部有脂质和复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉着，并有动脉中层的逐渐退变，继发性病变尚有斑块内出血、斑块破裂及局部血栓形成。随着分子心血管学的研究深入，越来越多的文献报道细胞凋亡参与了AS的发生发展过程。本文就细胞凋亡与动脉粥样硬化的关系及细胞凋亡影响斑块稳定性的相关证据作一综述。
1 细胞凋亡的途径
细胞凋亡主要是通过死亡受体途径及线粒体途径激活半胱氨酸天冬氨酸酶(caspase)家族，引起不可逆的蛋白质降解和细胞解体造成凋亡。当细胞内外许多因素相互作用产生凋亡信号，传递至caspase，即引发caspase蛋白酶的级联反应[1]。凋亡途径有两种：一是死亡受体途径，又称外源性凋亡途径，指被胞外信号所诱导的细胞凋亡途径。死亡受体存在于细胞膜表面，主要是肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α， TNFα)受体家族成员。由死亡受体与相应配体结合组装死亡诱导信号复合物(deathintroducing signal complex， DISC)，诱发caspase8前体活化，导致下游效应者caspase3活化，切割底物使细胞凋亡。二是线粒体途径，又称内源性凋亡途径，可由多种因素诱发，如细胞失去了赖以生存的生长因子或激素的支持、或者脱离了原来的生长环境、或由于DNA损伤等。内源性凋亡途径的关键步骤是Bcl2家族中促凋亡因子使细胞色素C从线粒体膜间隙释放到细胞浆。细胞色素C与凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic proteaseactivating factor 1， Apaf1)、ATP/dATP形成凋亡体，活化caspase9前体，导致下游效应者caspase3活化，切割底物使细胞凋亡。可见，活性caspase3是级联反应中关键蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，作用底物大多是细胞中功能蛋白质，它们参与DNA修复、mRNA裂解、类固醇合成及细胞骨架重建等过程[2]。
2 动脉粥样硬化中的细胞凋亡
近年来发现，AS斑块中存在着多种细胞的凋亡与坏死，如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞，而凋亡占其主导地位[3]。Zeini等[4]研究发现，在组成AS斑块的不同种类细胞中单核细胞和巨噬细胞与平滑肌细胞和内皮细胞相比更易于发生细胞凋亡。细胞凋亡直接影响粥样硬化动脉的形态和结构，以及斑块的稳定性。动脉粥样硬化斑块的发生发展取决于细胞凋亡和细胞增殖的平衡。
2.1 AS中血管内皮细胞的凋亡
血管内皮细胞被覆于全身的血管腔面，在维持机体内环境稳定中发挥多种重要生理功能，包括以下几种主要功能：(1) 具有血液成分与组织间物质交换的屏障作用;(2) 合成多种生物活性物质;(3) 参与机体的多种生理过程等。早期血管内皮细胞凋亡的证据是1991年Robaye等首先提出的，该研究发现炎症因子TNFα可以诱导血管内皮细胞出现凋亡。此后大量研究陆续证明，一些促动脉粥样硬化因子，包括氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein， oxLDL)、血管紧张素Ⅱ、过氧化剂、凋亡和细菌毒素脂多糖等，也是血管内皮细胞转录因子Foxo3a的诱导剂[5]。一些抗动脉粥样硬化因子，包括低剪切力、一氧化氮(nitrous oxide，NO)、抗氧化剂和雌激素等可以抑制血管内皮细胞凋亡。Banfi等[6]研究发现，血管内皮细胞凋亡可引发血管调节功能失衡，促进血管平滑肌细胞的增殖、迁移;且认为血管内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的一个始动因素。内皮细胞可选择性地抑制血液或血浆成分进入血管壁发挥屏障作用。当内皮细胞发生凋亡可使血管通透性增强，血浆中的大分子物质包括血浆脂蛋白易于沉积于血管壁，从而使血管内皮局部的抗凝、纤溶及防止血脂沉积的屏障作用减弱，而且凋亡的内皮细胞释放出白细胞介素21(interleukin21，IL21)，激活相邻内皮细胞，使其表达、释放黏附分子及促炎症细胞因子，导致进一步的损伤;内皮细胞发生凋亡时，线粒体释放出细胞色素C致超氧化物合成增加，并和自由扩散的NO形成超氧化物硝酸盐，直接促进内皮细胞凋亡。综上可知，这些因素可造成血管内膜损伤及血管壁局部血栓形成，加速AS进展。
2.2 AS中血管平滑肌细胞的凋亡
近年的研究表明，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell， VSMC)的凋亡是影响动脉粥样硬化斑块稳定性的重要因素。体外培养发现，动脉粥样硬化斑块来源的平滑肌细胞比正常动脉平滑肌细胞具有更高的凋亡率。Sukhanov等[7]研究发现在离体细胞中，oxLDL通过下调甘油醛3磷酸脱氢酶(glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAPDH)消耗细胞内ATP，抑制糖酵解，在VSMC凋亡过程中发挥作用。AS中诱导VSMC凋亡的因素有氧化型低密度脂蛋(oxLDL)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、一氧化氮(NO)、机械应力及细胞成分的影响[8]。这些诱导凋亡的因子或刺激是通过第二信使系统传导信号的。O2介导细胞增殖，是VSMC的丝裂原，而H2O2、OH则介导其凋亡。NO不仅作为一种细胞因子诱导VSMC凋亡，同时又作为信号传导分子介导其他细胞因子引发VSMC凋亡。近年研究表明，机械应力直接牵拉细胞膜并改变受体或G蛋白构象，从而启动信号转导途径来诱导细胞凋亡。另外，体外实验发现巨噬细胞和T淋巴细胞产生的炎症细胞因子，如γ干扰素(γinterferon，γIFN)、TNFα及IL1等能诱导VSMC凋亡。Leskinen等[9]研究发现，肥大细胞所分泌的糜蛋白酶通过核因子κB(nuclear factorκB，NFκB)介导的生存信号途径引起VSMC凋亡。总之，VSMC在动脉粥样硬化斑块可有多种因素促进及加快其凋亡。在动脉粥样硬化晚期由于VSMC凋亡，致使粥样斑块的纤维帽区和交界区VSMC数目减少、细胞外基质分泌减少及破坏崩解增加，使斑块不稳定易于破裂且可诱发动脉瘤形成、血栓形成及栓塞等并发症发生。所以，在动脉粥样硬化晚期阻止VSMC凋亡对防止动脉粥样硬化临床并发症的发生有积极意义。
2.3 AS中巨噬细胞的凋亡
动脉粥样硬化的早期病变脂纹由内皮下大量吞噬胆固醇的泡沫细胞聚集而成，此后的粥样坏死中心的形成与泡沫细胞的聚集和凋亡密切相关。一般认为，病变早期的泡沫细胞多数是来源于血液中的单核细胞，进入内皮下转变为巨噬细胞，其表面的特异性受体(LDL受体和清道夫受体)可与氧化变性的LDL结合，使之摄取大量的胆固醇成为泡沫细胞。巨噬细胞成簇分布于粥样病灶内皮下、富含脂质的病灶中心和纤维帽的肩部。巨噬细胞源性泡沫细胞的凋亡主要发生在病变的脂质核心处，较血管平滑肌细胞更易发生凋亡，特别是在脂质核内和脂质核周围，在脂质核的非细胞部分可发现其凋亡残留物。斑块的“肩部”最容易发生破裂，纤维帽薄，含有大量激活的巨噬细胞，并存在凋亡残体及许多内含凋亡细胞的巨噬细胞和淋巴细胞，凋亡细胞和凋亡残体对巨噬细胞具有强烈的化学趋化活性，而巨噬细胞本身也遭受细胞凋亡所释放的细胞因子的影响而发生凋亡[10]。氧化型低密度脂蛋白已被证实在动脉粥样硬化中是开始和放大的因子，在巨噬细胞和平滑肌细胞转变为泡沫细胞以及调节细胞增殖、凋亡中起到重要的作用。巨噬细胞摄取各种脂蛋白的过程不受细胞的反馈性抑制，当摄入过量的脂蛋白后，细胞内积聚了大量游离胆固醇对其有细胞毒性作用，它可激活FasL的表达，从而可导致细胞发生Fas介导的凋亡[11]。Hung等[12]认为巨噬细胞中游离胆固醇增多可诱发超氧负离子水平增高，使氧化应激增加，触发短暂的炎症反应。可见氧化型低密度脂蛋白和游离胆固醇在巨噬细胞凋亡中有重要的作用。同时被激活的巨噬细胞还可以释放多种生长因子和细胞因子，促进中膜平滑肌细胞的迁移和增生，促进动脉粥样硬化损伤的启动和发展。此外，巨噬细胞凋亡可导致细胞外脂质核的发生和扩大，对斑块破裂及血栓形成有重要影响。
3 细胞凋亡对AS斑块稳定性的影响
近年来细胞凋亡对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响渐成为研究热点。实验研究表明，易损斑块常具有活动性炎症(大量单核细胞/巨噬细胞以及T细胞浸润)、大的脂质中心(脂核)、薄的纤维帽(纤维帽的厚度40%)和内皮剥脱伴表面血小板聚集等[13]特点。最常见的不稳定斑块类型是薄帽纤维粥瘤[14]，其病理特征表现为偏心斑块、含较大的脂质坏死核心、纤维帽较薄、有大量炎症细胞浸润、肩部及基底部有较多新生血管且易发生破裂。斑块破裂伴血栓形成是造成动脉粥样硬化临床急性症状的主要原因，凋亡过度是不稳定斑块的明显特征，而大量的细胞凋亡直接造成斑块不稳定[15]。
血管内皮细胞：研究证明，血管内皮细胞的过度凋亡一方面增强组织因子的活性，加强血小板聚集能力，从而促进血液凝固;另一方面促进动脉粥样硬化斑块的糜烂，继发血栓形成[16]。血管平滑肌细胞：Chen等[17]研究证明，晚期斑块内血管平滑肌细胞较正常血管壁的血管平滑肌细胞的增殖减少且更易凋亡。斑块内血管平滑肌细胞可直接影响斑块内的血管重构、炎症和钙化等[18]，从而影响斑块的结构和稳定性。另外，凋亡的平滑肌细胞还可产生凝血酶并增加动脉粥样硬化局部凝血酶的活性，促进血栓形成;不稳定性心绞痛患者较稳定性心绞痛患者斑块内血管平滑肌细胞的凋亡率高。巨噬细胞：大量研究表明巨噬细胞凋亡是造成斑块不稳定的决定因素，有研究证实巨噬细胞较血管平滑肌细胞和内皮细胞更容易发生凋亡[4]。巨噬细胞凋亡可以影响斑块的组织结构，从而导致动脉粥样硬化斑块变得更加易损;尤其是晚期斑块脂质核心处巨噬细胞凋亡增多，提示巨噬细胞凋亡与斑块脂质核心增大有关，进而影响斑块稳定性。此后，Hartung等[19]试验结果显示巨噬细胞凋亡减少可能有助于斑块的稳定。可见各项研究都突出说明巨噬细胞凋亡可能为易损斑块形成的重要原因之一。
4 结 语
细胞凋亡是机体正常的生理过程，细胞凋亡途径的失控，会引发相关疾病。目前认为，细胞凋亡是AS病变的独立危险因素。动脉粥样硬化斑块内细胞过度凋亡，在促进不稳定斑块形成的过程中起着重要的作用。深入了解动脉粥样硬化斑块相关细胞的凋亡途径及影响因素，将为通过调节细胞凋亡而稳定动脉粥样硬化斑块以及防治心脑血管疾病提供证据。因此，对于细胞凋亡的深入研究将为探讨AS发生机制和临床治疗开拓新领域。随着细胞凋亡研究的深入和完善，将会对动脉粥样硬化中细胞的凋亡进行更有利的调控，从而使动脉粥样硬化有更好更广阔的临床治疗前景。
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