流式细胞仪范文

导语：如何才能写好一篇流式细胞仪，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

关键词：流式细胞仪；科研平台；使用现状

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是一门综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等多种学科知识的自动分析技术[1]，即利用流式细胞仪结合定量荧光细胞化学方法、单克隆抗体和免疫荧光染色原理和技术，对处在快速直线流动状态中的生物颗粒，比如各种细胞、微生物及人工合成微球等的多种参数（包括细胞大小、内部结构、DNA和RNA含量、细胞表面或胞内蛋白质分子的表达等）进行测量和分析，是当代最先进的细胞定性、定量分析以及细胞分选技术。近年来，随着流式细胞术的不断发展和完善，其应用领域已经从最初的细胞生物学基础研究扩大到现如今的肿瘤学、血液学、免疫学、药物学、临床检验等各个方面[1]。本研究以某医学院校科研平台流式细胞仪为分析对象，对其近3年来学生（包括本科生和研究生）使用人次和测试样品数加以统计，分析其使用现状，并对现存问题提出建议。

1流式细胞仪使用现状

学校科研平台于2013年购入一台BD公司的FACSVerse型流式细胞仪，是一台分析型流式细胞仪，蓝、红、紫三激光配置，配套BDFACSuite软件系统。对2017—2019年该台流式细胞仪的学生使用人次和测试样品数进行统计，如表1—2所示。从表1中可以看出2017—2019年学生使用流式细胞仪的人次和测试样品数逐年升高，从表2中可以看出使用人次增长率从2018年的67.74%提高到2019年的107.69%，测试样品数增长率从2018年的81.48%提高到2019年的137.87%，增幅明显。这些数据说明近年来流式细胞仪的利用率明显提高，越来越多的学生（包括本科生和研究生）能够学习、了解流式细胞术，并在日常科研活动中使用流式细胞仪，有效促进了学校的人才培养。

2使用现状分析

近年来，高等学校越来越重视本科生的科研能力培养。除了研究生参与科研活动，随着本科生课题申请量的增多，比如可以申请国家级、省级和校级大学生创新创业训练计划项目等，越来越多的本科生也参与到科研活动中。此外，学校还会成立科研兴趣小组，在老师的带领下，本科生在完成基础课程学习之余，加入到老师所在实验室的科研工作中，参与科学研究的热情高涨，大大提高了自身的基础科研能力和科研实践水平。一方面，可以使本科生增强对课题学习的理解，使其受到早期科研训练，另一方面，可以增强其接受研究生教育的能力和信心，有助于本科生顺利进入研究生阶段的学习[2]。目前，流式细胞术作为细胞分析和分选的重要技术，在医学基础研究、临床诊断及相关科学研究中广泛应用[3]，已进入科研及临床工作的各个方面，贯穿于基础研究及临床检验等多方面。在医学院校，培养一名医学生，不仅要使其掌握医学基本知识与临床技能，还要使其掌握医学发展最新动态，了解医学相关的最新技术手段，不断增加知识储备量。但在目前的医学生培养过程中，还没有系统地开设流式细胞术相关课程，学生在科研及临床检验中对流式细胞术的检测原理、应用范围及数据分析等并不了解，限制了流式细胞术在科研及临床工作中的应用及普及[4]。近年来，皖南医学院每年开展大型仪器实验技术培训，培训对象为本科生、研究生及教师，旨在进一步加强广大师生对学校大型仪器设备的了解，提高校内科研人员的仪器设备使用水平，为更好地开展科学研究工作打下良好的基础。培训本着以教促学、示范促用的基本原则，以学校常用大型科研仪器的操作与应用为主要内容，通过理论讲座对每台仪器的原理、构成、应用范围等方面进行详细介绍，并结合现场讲解、全流程操作演示等环节，加深对仪器的认识，了解操作规范。通过此类培训，广大师生能够进一步了解学校大型仪器设备资源，有更多机会与实验室技术人员进行直接、积极的沟通，共同促进了师生与实验技术人员自身技术水平的提高，进一步提升了学校科研项目的承载能力和实验室的服务水平，促进了学校的人才培养。在培训中以BDFACSVerse型流式细胞仪为例，首先，以PPT理论形式向师生介绍流式细胞仪的基本结构、工作原理、仪器操作等内容，并结合皖南医学院流式细胞仪应用实际举例，介绍其在细胞凋亡、细胞周期、线粒体膜电位、细胞内活性氧、细胞表面分子标记等检测中的应用，使师生对其有初步了解。其次，理论培训结束后，进入实验室进行上机操作，向师生演示如何进行开关机、仪器质控、方案建立、电压调节、荧光补偿调节、样品收集、数据获取与分析、仪器保养与维护等。将流式细胞术相关知识融入到大型仪器实验技术系列的培训中，使学生对流式细胞术的原理、操作步骤和应用范围有了基本了解，激发了学生的学习兴趣，启发其带着自己研究课题中或参加的科研活动中实际遇到的问题或可能会遇到的问题来学习和运用这门技术，为今后的相关课程学习和实际应用奠定良好的基础[5]。由于皖南医学院是一所医学院校，在培训中着重介绍流式细胞术在基础医学相关领域和临床检验中的应用，使学生有了更直观的了解，大大调动了其钻研科研的热情，使其能够更好地理解和掌握先进科学技术的原理及应用，积极主动地参与到科研活动中，不仅最大限度地发挥了现有仪器设备的资源优势和师资特长，还使学生接受了最好的专业训练[6]，使学生在毕业后走上工作岗位时能够更快、更好地适应工作需要。

3结语

由于流式细胞仪单价较高，学校拥有流式细胞仪的教研室较少，并且无专人操作，导致仪器使用率偏低。学校科研平台自购入流式细胞仪以来，专人专管该仪器，与其他教研室相比，流式细胞仪使用频率相对较高；随着后期仪器实现资源优化，开放共享力度加大，会有更多的学生参与到科研中，可以进一步提高流式细胞仪的使用率，更大限度地发挥仪器自身的价值。目前，该科研平台流式细胞仪主要应用于细胞凋亡、细胞周期、活性氧、线粒体膜电位、细胞表面标志等方面的检测，今后随着师生科研水平的提高以及承担的科研项目数量的增多，仪器使用率会进一步提高，仪器应用范围会得到进一步扩大，而不局限于以上检测范围。此外，目前学校流式细胞仪主要应用于科研方面，在教学方面使用得较少，今后如何有效地将流式细胞仪与教学联系起来，在教学中涉及流式细胞术的知识，激发学生对相关课程的学习兴趣，提高流式细胞仪在教学中的利用率，是下一步要探讨的问题。

[参考文献]

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【关键词】儿童；B淋巴细胞性白血病；免疫分型；流式细胞仪

Immunophenotype of acute B-lineage lymphoblastic leukemia in children by flow cytometry

WANG Yi-lin,SUN Li-rong.The Medical Shchool Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

【Abstract】 Objective To investigate the value of detecting immunophenotypes by flow cytometry(FCM) in B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) and discuss the relationship between immunophenotype and outcome.Methods 39 children with B- ALL were enrolled at diagnosis and immunophenotypes were detected by FCM.Gating was performed using the CD45-SSC plot.Various combinations with two monoclonal antibodies among CD19,CD10,CD20 and CD22 were analyzed with three-color stainings.CD33 and CD13 were used as myeloid antibodies for B-ALL with myeloid markers.2 groups were divided by myeloid markers.Results ①The positive rates of CD19,CD22 and CD10 were 94．87%,92．31%,and 87．18% respectively.The positive rates of CD20 was only 15．38%.CD13 and CD33 were expressed in 33．33% children with B-ALL,in which 8 cases of CD13 positive and 5 cases of CD33 positive were included.②There are 6 patiens relapse.There were no significance between 2 groups by Fisher’s Exact Test( P>0．05).Conclusion ①Flow cytometry can be used to detect immunophenotypes in the majority of children with B-ALL.②Myeloid markers in acute B-ALL are not the risk factors of relapse.

【Key words】Children；B-lineage Leukemia；Immunophenotype；Flow cytometry

白血病免疫分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，随着儿童急性白血病治疗的进展，其免疫分型越来越受到重视，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的。为了发现儿童急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）免疫表型的特点及与预后的关系，我们利用流式细胞仪对39例急性B淋巴细胞白血病患儿的免疫表型进行分析，并对其治疗结果动态随访。现报告如下。

1 材料和方法

1．1 病例 选择我院2002年9月至2007年1月初诊的B-ALL患儿共39例，年龄1岁4个月~12岁，中位年龄7岁，其中男27例，女12例，其中L1 10例，L2 28例，L3 1例，随访时间3~50个月，平均随访时间 16．87个月。

1．2 主要设备与试剂 流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司生产，仪器型号：EPICS-XL。所有单克隆抗体（McAb）均购自法国Immunotech公司。

1．3 检测方法 采用直接免疫荧光标记法，每种单抗20 μl，各加入100 μl 肝素抗凝的骨髓，室温避光，溶解红细胞，PBS洗涤，离心，加入500 μl PBS，上机检测。采用CD45-SSC设门，用Elite 4．5软件进行分析，同时以异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白荧光素（PE）、多甲藻素叶绿蛋白（PerCP）荧光素标记的无关同型IgG1亚类作为阴性对照。不同的抗体组合及不同的患者标本都用同一设定的条件检测，收集每管中的全部细胞。

1．4 资料分析 所有样本均在EPICS- XL流式细胞仪上检测，CD45-SSC设门将被检测细胞群分为4个区域：R1(淋巴细胞门)、R2(原始细胞门)、R3(成熟粒细胞门)、R4(单核细胞、巨核细胞门)，使用Elite 4．5软件对R2门内的细胞进行分析，同时在CD19、CD10、CD20和CD22中选择两个单克隆抗体（McAb）组合，进行三色组合分析，确定免疫表型，≥20％为阳性。

1．5 统计学处理方法 χ2检验精确概率法。

2 结果

2．1 各种单克隆抗体阳性发生率 39例急性B-ALL患儿中，CD19、CD22、CD10的阳性率都超过或接近90%，说明此3种McAb是B-ALL患儿最普遍的表达标志。同时有33．33%的患儿检测到髓系抗原（My）标志，其中以CD+13 8例，CD+335例。见表1。

2．2 复发病例 共有6例患儿复发，其中有3例患儿伴有髓系表达，见表2。经χ2精确概率法检验分析，P>0．05。说明B-ALL患儿是否伴有髓系表达与复发无关。见表2。

3 讨论

近年来,随着FCM技术的不断发展以及大量细胞表面分化抗原和胞浆内抗原单克隆抗体(MaAb) 的研制成功,用FCM 进行免疫表型分析已成为鉴别正常细胞和白血病细胞的重要手段[1]。

CD45为白细胞共同抗原，在细胞表面的表达量与细胞分化程度有关。原始细胞表达量比成熟细胞低，幼红细胞不表达。用两个系列或分化阶段特异性McAb加CD45进行三色免疫荧光染色后，根据细胞的颗粒性与CD45表达量的不同，用SSC/CD45双参数设门，十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞，可特异地分析原、幼白血病细胞的免疫表型而不受成熟细胞的干扰，大大增强了白血病免疫分型的准确度与灵敏度[2]。

研究表明,细胞表面所表达的抗原表明该细胞处在不同的分化过程中的特殊阶段[3]。正常B 淋巴细胞分化过程中细胞表面分子出现的先后顺序大致为CD19、CD10、CD22、CD20、Cμ、SmIg,依此可判断B系ALL 的分化阶段。B-ALL细胞发育与正常B细胞基本相似[4,5]。我们采用从原B细胞至成熟B细胞出现频率高有一定代表性的CD10、CD19、CD20、CD22和HLA-DR等作为常规表型检测，对其结果进行分析，可基本确定被测B细胞所处的发育阶段。

本组B系ALL系列相关抗体CD19具有高敏感性（阳性率达94．87%）,CD22阳性率也达到92．31%，可以看出两者不失为B系ALL的良好标志。CD10的阳性率亦高达87．18%，与国外文献报道的CD10的阳性率 10%～50%[6，7]，Thalhmmer等[8]认为CD10 不是B细胞系列相关抗体。造成这种国内外B-ALL表型表达的差别，可能与地区和人种不同有关。本组CD20的阳性率只有15．38%，说明CD20的敏感性差，且文献报道CD20在T-ALL时也有42．9%阳叉表达。所以利用 CD45及SSC设门，CD19/CD22/CD10中选择两个单克隆抗体组合，可有效分析国内儿童急性B淋巴细胞性白血病的免疫表型。

细胞免疫表型分析在白血病诊断中的突出优点之一是能区分伴有髓系抗原的ALL。本组有33．33%的患儿同时伴有髓系的表达，以CD33和CD13常见。与国内报道的18%～34．9%[9，10]相符。而国外多报道在5%～16%[11，12]。My+ ALL 的文献报道结果迥异其可能原因包括:抗体组合不同,抗体组合多则较易发现交叉系列抗原的表达；使用的染色方法或荧光素不同,如PE标记的抗体较FITC 标记的抗体有更高的敏感性等[13]。我们的结果显示ALL患儿髓系抗原表达率为33．33%。虽然儿童ALL 免疫分型与其预后相关,但是ALL 伴髓系抗原表达与预后的关系迄今尚无定论。本组患儿通过四格表精确概率法分析，发现伴有髓系抗原表达的B-ALL，其复发率与无髓系抗原表达患儿的复发率差异无统计学意义。国内王菊香等[10]报道My+ ALL 与My- ALL 患儿相比,其对化疗的早期反应以及复发率等均差异无统计学意义。国外BM F90 协作组大样本研究认为My+ ALL 和My- ALL 的治疗效果及预后相同[14]。因此,ALL患儿髓系抗原表达对于其不良预后无提示意义。

参考文献

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【关键词】流式细胞术；临床；进展

流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段[1]。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,发挥着重要作用。本文就其在临床上的应用综述如下。

1 流式细胞术在免疫学中的应用

FCM可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定了解淋巴细胞的分化功能,鉴别新的淋巴细胞亚群。更重要的是通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某些细胞表面标志的存在、缺乏、过度表达等,对一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植监测等有重要的临床意义。如HIV主要侵袭CD4+T细胞而导致CD4淋巴细胞减少,CD4/CD8淋巴细胞比值下降,为艾滋病的诊断和治疗提供依据[2]。在其它免疫功能性疾病的诊治方面如系统性红斑狼疮(SLE)患者的淋巴细胞变化可反映该病的活动情况和器官侵犯程度,伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象[3]。此外,FCM可以用来进行组织相容性抗原(HLA)群体分析;HLA-B27抗原阳性与强直性脊柱炎等一系列关节病有着不同程度的正相关。FCM应用HLA-B27特异性单抗检测抗原，其敏感性较传统的微量细胞毒性实验大大提高,同时多参数的荧光测定使我们能够在特定的细胞亚群中分析HLA-B27[4-5],还可以利用FCM进行移植配型移植后免疫状态监测。

2 流式细胞术在血液学中的应用

血液系统肿瘤的诊断和治疗 FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病、淋巴瘤等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病、淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有决定性作用，其诊断的准确性可达到90%左右[5]。微小残留病变(MRD)是白血病复发的主要根源,FCM能在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，及早发现后采取措施避免复发。而且测定 DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。急性白血病的多耐药基因(MDR)也常用FCM检测，FCM特有的敏感性和特异性，用于检测二氨基苯茚酮 mRNA的表达产物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作为药物的排出泵，降低细胞内药物浓度)，可以更直接的反映耐药程度。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种造血干细胞克隆病,细胞 CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标。FCM通过某些荧光染料(吖啶橙等)与红细胞中 RNA结合，定量测定网织红细胞中 RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有报道认为[6]FCM比目测法的精确度更高。此外，FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放、化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。造血干/祖细胞计数造血干/祖细胞具有自我复制和多向分化潜能，是各种血细胞和免疫细胞的始祖。造血干/祖细胞计数对造血干细胞移植意义重大。CD34抗原是早期造血干/祖细胞的表面标志，应用 FCM分析、计数 CD34 细胞已成为造血干/祖细胞移植、造血重建的重要指标。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况可以诊断血小板膜糖蛋白异常所致疾病,这类疾病很少见但病因明确,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,导致血小板聚集功能明显低下,这就是常染色体隐性遗传病-血小板无力症。而巨血小板综合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物数量或质量的缺陷导致的遗传性出血性疾病。FCM还可以通过单抗免疫荧光标记血小板膜糖蛋白监测血小板功能及活化情况,评价活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前状态发生发展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗,此外血小板活化时细胞内的钙离子浓度是活化血小板监测的一项非免疫性指标,免疫性血小板减少性紫癜患者血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,检测血小板表面或血清中的相关抗体,可用于该病的诊断及治疗监测[7]。

3 流式细胞术在肿瘤学中的应用

FCM在肿瘤学中的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作,FCM可精确定量DNA含量,能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断,有助于癌变的早期诊断[6]。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶P1)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰存在可为肿瘤诊断提供有力依据[6]。肿瘤细胞DNA倍体分析对患者预后的判断亦有重要作用。异倍体肿瘤恶性病变的复发率、转移率及死亡率均较高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳治疗方案。从DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果。

4 流式细胞术在细胞凋亡和多药耐药基因中的应用

细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞死亡的过程,凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片断,最后形成数量不等的凋亡小体。FCM可以进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达。通过FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞,从而确定细胞的凋亡情况。多重耐药性(multidrugresistance,MDR)是由多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)亲脂化合物,包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,患者对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其它治疗方式。多药耐药是肿瘤患者化疗失败的主要原因,FCM对多药耐药基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定,可为临床治疗效果分析提供有力依据[8]。

5 流式细胞术在器官移植中的应用

FCM在器官移植中占有重要地位,可被用来判断供者与受者之间是否合适,用来鉴别和定型同种异体反应抗体[6]。通过供者白细胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在针对供者的循环抗体,就会同供者的淋巴细胞结合,再加入荧光素标记的二抗来显示这种结合,此方法能在移植手术前发现高风险的受体。移植后免疫表型的监测也很重要。FCM可用于检测移植后血液或移植内免疫成分的变化,以预防移植后免疫

排斥反应,细胞免疫抑制治疗效果和移植存活情况,可敏感地预测排斥反应的发生,为临床治疗提供有效依据。

6 流式细胞术在临床细菌学中的应用

流式细胞术在临床细菌学中的应用具有快捷、灵敏,能同时进行多参数分析等优点,可广泛用于细菌、病原体、毒素和血清抗体及药敏试验。免疫荧光检测方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一个新应用。这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体的混合感染的检测。近年来,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌的活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议作为临床实验室的常规药敏试验。FCM药敏检测方法较多,通过测量加入药物孵育后的散射光的DNA含量来判断抗生素对细菌的敏感性。该法现被认为是FCM在该领域应用的经典方法[6]。

7 FCM在细胞生物学中的应用

在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DNA异倍体。可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是pH值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内pH值测定[9]。

8 流式细胞术在优生遗传领域中的应用

流式细胞术可使含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景[10]。

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[关键词] 流式细胞术；细胞形态学；脑脊液；中枢神经系统白血病

[中图分类号] R725.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）10（b）-0042-03

[Abstract] Objective To evaluate the value of flow cytometric of cerebrospinal fluid cells in the diagnosis of central nervous system leukemia in children. Methods Used Double immunofluorescence staining with monoclonal antibodies，45 cerebrospinal fluid samples who had central nervous system involvement was analyzed with flow cytometric immunophenotyping and conventional cytology in January 2015 to March 2016，the results of flow cytometry were compared with conventional cytology. Results The results showed that 33.33% children had abnormal cells by flow cytometry and 20% children had abnormal cells by conventional cell morphology in 45 cases。The difference had statistical significance （P < 0.01）. Conclusion Flow cytometriy analysis of cerebrospinal fluid has important clinical significance in the diagnosis of CNSL in children。

[Key words] Flow cytometry；Conventional cytology；Cerebrospinal fluid；Immunophenotyping；Central nervous system leukemia

随着化疗方案的改进，我国儿童急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblastic leukemia，ALL）的疗效获得了显著改善，儿童ALL诱导缓解率高达91%～94%，5年无事件生存（EFS）率达70%～80%[1-3]。中枢神经系统白血病（Central Nervous System Leukemia，CNSL）是导致白血病化疗失败的主要原因之一，如何早期诊断CNSL具有重要意义。该文将对2015年1月―2016年3月期间45例急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL）的脑脊液进行分析，以研究脑脊液FCM在CNSL诊断中的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

根据2014年制定的儿童 ALL诊疗建议（第四次修订）为诊断标准[4]，以明确诊断急性淋巴细胞性白血病的患儿为对象，方便选取该院收治的临床疑似中枢神经系统浸润45例进行脑脊液CC及FCM检测。符合以下任何一项，并除外其他原因导致的枢神经系统病变时，列为可疑中枢神经系统浸润病例：①有神经系统症状；②脑脊液常规白细胞计数大于5×106 个/L时；③头颅核磁或CT提示影像学病变。

1.2 脑脊液细胞常规计数

将留取无菌新鲜脑脊液标本2 mL充入细胞计数板，高倍镜下计数有核细胞数。

1.3 脑脊液细胞学检查

吸取 2～3 mL脑脊液，标本离心后涂片，干燥后进行瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态，发现原始幼稚细胞则判定结果阳性。

1.4 FCM分析

采用单克隆抗体双重直接免疫荧光素（FITC/PE）标记法。留取2～3 mL新鲜脑脊液于无菌试管中，离心（1 400 r/min，5 min）后弃上清，留取100 μL，加入相应抗体，充分混匀，在室温、避光条件下孵育15 min，加入1 mL溶血素1 mL，混匀后避光，室温放置8 min，离心（1 400 r/min，5 min）弃上清，用PBS洗涤细胞，离心（1 400 r/min，5 min）后，弃上清，加入约3 mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清，加入约100 μL PBS后，震荡混匀，立即上机检测。流式细胞仪及所有抗体来自美国BD公司。含六种荧光抗体标记：FICT、PE、APC、PerCP、APC-Cy7、PE-Cy7。

1.6 统计方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析。计数资料以例数表示，采用χ2检验，P

2 结果

2.1 45例儿童ALL的临床特点

可疑中枢神经系统浸润者45例，所有病例均进行FCM及CC检测，其中男性28例， 女性17例， 年龄1～18岁，平均年龄（9.09±5.41）岁，其中B系20例，T系25例。45例病例中3例患儿有头痛、呕吐表现，44例患儿脑脊液常规白细胞计数≥5×106个/L，未发现头颅核磁及CT的影像学改变。两组检测方法在年龄、性别、免疫型、白细胞计数及神经系统症状方面，差异无统计学意义。见表1。

2.2 FCM与CC两种方法对45例ALL脑脊液异常细胞的检测结果

45例怀疑中枢神经系统侵润者的脑脊液细胞，其中FCM有15例发现异常免疫表型，其中B系6例，T系9例，阳性率为33.33%，CC发现9例存在原始幼稚细胞，其中B系3例，T系6例，阳性率为20%，两者检测方法的差异具有统计学意义（P

3 讨论

儿童CNSL发病率在2%～10%之间[5]，目前CNSL诊断金标准仍是脑脊液细胞形态学发现异常幼稚细胞，但脑脊液标本细胞数量少，离体环境下容易发生自溶，受主观经验性判断影响大，容易出现CNSL的误诊及漏诊，假阴性率高达20%～60%[6]，单纯依靠脑脊液细胞学检查并不能完全排除CNSL的诊断。FCM的细胞免疫分型是检测微量异常细胞非常敏感的方法，通过细胞表面标记片段确定各细胞群性质，受细胞形态变化影响小，亦不易受主观影响，能够准确的检测恶性肿瘤细胞，已广泛用于脑脊液检查中。

早期CNSL可无临床表现、影像学阳性发现，甚至脑脊液常规检查也无细胞数增高。蒋能刚等[7]报道，多参数FCM 分析在细胞数量较少情况下，显示出明显优越性。该次130例脑脊液中，发现1例细胞数为4×106 个/L的ALL（T系），CC-FCM+发现异常细胞群，异常细胞群占总细胞的54.14%，表达CD5。在45例怀疑CNSL的脑脊液中，15例诊断CNSL的病例中白细胞数在4～100×106个/L之间有6例，其中FCM+有4例，CC+有2例。脑脊液白细胞计数越高，形态学及FCM越容易发现异常细胞，其中细胞形态学更为明显。而脑脊液白细胞数少时，FCM相较于CC更敏感。此外，有报道指出[8]，当行FCM及CC检测时，CC容易受到FCM结果影响。该次研究也存在类似问题，有2例脑脊液发现FCM阳性结果后，CC更改了起初阴性结果的判读，可见，细胞形态学分析对于良恶性细胞的判断主观性仍较强。

脑脊液FCM在CNSL诊断中，具有很高的灵敏度和特异性。Mitri Z等[8]报道，脑脊液流式细胞术和CC的特异性均为100%，但前者的敏感性明显高于CC，接近100%。Ranta S等[9-11]研究显示，在高度怀疑中枢神经系统侵润的淋巴瘤中，FCM的CNSL检出率是细胞形态学的2～3倍。该研究对70例ALL患儿，共130例次脑脊液标本进行FCM及CC检测，其中45例怀疑有CNSL可能，CC阳性检出率为 20%（9/45），FCM的阳性检出率为33.33%（15/45），是CC检出率的1.67倍，与报道类似。建议对怀疑有中枢神经系统病变的患者，在进行脑脊液细胞形态学检测的同时，进行FCM的评估，以提高早期诊断CNSL的阳性率。

综上所述，脑脊液FCM 的阳性检出率及准确性明显高于传统脑脊液CC方法，对CNSL的诊断具有极大的应用价值，是诊断CNSL方法的重要补充。由于CNSL发病率较低，对于FCM及CC诊断的一致性仍需要今后大样本进一步研究论证。

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篇5

[关键词] 脐血干细胞；类风湿关节炎；IL-1β；TNF-α；IL-4；IL-10

[中图分类号] R684.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（b）-0022-03

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以关节滑膜及周围结缔组织异常增生、关节进行性破坏为特征的慢性自身免疫性疾病[1]。传统的治疗药物，如免疫抑制剂、糖皮质激素、生物制剂等，虽能使部分患者的病情活动得以控制，但长期应用副作用较大[2]。间充质干细胞因具有免疫调节作用[3]，为RA治疗带来新的希望。本研究尝试采用hUCBSCs穴位移植方法治疗类风湿关节炎大鼠模型（CIA），观察对白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）的影响，探讨hUCBSCs穴位移植治疗RA的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

牛Ⅱ型胶原（C7809，5 mg，Sigma公司）；弗氏完全佐剂（098K8729-CAS9007-81-2，10 mL，Sigma公司）；流式细胞仪抗体PE-CD34。甲氨喋呤（MTX），上海医药集团有限公司信通制药厂，产品批号002091。

1.1.2 实验动物

近交系雌性Wistar大鼠120只，动物年龄45～50 d，体重（180±20）g，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.1.3 脐血

选择辽宁中医药大学附属医院（以下简称“我院”）妇产科排除了HIV、HBV、HCV、CMV、EBV、梅毒等急、慢性感染，无血液系统疾患及其他系统疾病的非高危妊娠健康足月产妇，新生儿为经阴道顺产且生后皮肤红润，四肢活动良好，无感染征象的脐血。本研究经我院伦理委员会通过，所有产妇及家属知情同意，并签署知情同意书。

1.2 实验方法

1.2.1 脐血干细胞分离

将采集到的新鲜脐血用HES沉淀法分离脐血单个核细胞，制成MNC悬液，用台盼蓝拒染色试验测细胞存活率，若细胞存活率>95%，则进行下一步实验。用MiniMACS磁性吸附性分离装置，进行CD34+细胞的分离与纯化，用台盼蓝拒染色试验测细胞存活率，流式细胞仪测定CD34+细胞百分比[4]。将处理完毕的采集物低温冻存以备回输。

1.2.2 分组、造模与给药

1.2.2.1 实验分组 将近交系Wistar大鼠120只随机分为六组：正常对照组（A组）、模型组（B组）、hUCBSCs腕关节注射治疗组（C组）、hUCBSCs尾静脉注射治疗组（D组）、hUCBSCs外关穴注射治疗组（E组）、MTX灌胃治疗组（F组），每组20只。

1.2.2.2 建立CIA动物模型 实验模型采用邓安梅法[5]。除A组外，寒冷刺激10 d后，将10 mg牛Ⅱ型胶原（BⅡC）与5 mL完全氟氏佐剂研磨后，以每只100 μL于大鼠背部、踝部、尾根部皮内注射免疫，免疫注射20 d后，于第21天按上述方法20 μL再次腹腔内注射，作为激发注射免疫。A组在寒冷刺激10 d后，按上述方法及相同部位注射等量的注射用水。

1.2.2.3 hUCBSCs输注途径及剂量 CIA大鼠免疫接种后第31天（除A组及B组用蒸馏水），开始hUCBSCs移植治疗。C、D、E组分别向腕关节腔、尾静脉、外关穴注射0.5 mL 0.9%氯化钠溶液和0.5 mL hUCBSCs悬液（含干细胞2×107/mL），F组MTX灌胃治疗（MTX研成细末，加生理盐水配成悬浊液灌胃0.0175 g/kg），每周1次。

1.2.2.4 指标检测 在hUCBSCs输注4周后ELISA法测定CIA大鼠外周血细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10的含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验或方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 A、B两组大鼠血清中各指标比较

由于实验操作等原因，在实验过程中有3只死亡，其中B组死亡2只，F组死亡1只。B组大鼠血清细胞因子IL-1β、TNF-α明显高于A组，而IL-4、IL-10明显低于A组（P < 0.05）。见表1。

表1 A、B两组大鼠血清中各指标比较（μg/L，x±s）

注：与A组比较，P < 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

2.2 B组与各治疗组各项指标的比较

与B组比较，各个治疗组IL-1β、TNF-α明显降低，IL-4、IL-10明显升高（P < 0.05）。与F组比较，C、D组IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-10无明显变化（P > 0.05）。与F组比较，E组IL-1β、TNF-α明显降低，IL-4、IL-10明显升高（P < 0.05）。见表2。

表2 B组与各治疗组各项指标的比较（μg/L，x±s）

注：与B组比较，*P < 0.05；与F组比较，#P < 0.05；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-4：白介素-4；IL-10：白介素-10

3 讨论

造血干细胞移植是通过异体或自体的造血干细胞植入受者体内，使受者获得造血和免疫功能重建的方法[6]。大量实验及临床资料已经证明脐带血是极有潜力的造血干细胞来源[7-9]。脐带血干细胞具有多向分化能力、免疫调节性能以及组织修复能力和低风险特性，并且其疗效肯定，不需要组织配型，移植后没有排斥反应。王秦等[10]在临床上已经成功地应用异基因脐带干细胞静脉输注的移植方法治疗3例难治性RA，移植后能显著改善病情，减少免疫抑制剂的用量。

穴位注射是在中医理论的指导下，通过针刺与药物注射相结合的一种注射方法[11-12]。针刺腧穴达到疏通经气、调节脏腑气血功能，同时又与药物相结合发挥药物治疗作用，从而达到腧穴、针刺、药物三者相结合的治疗效果。药物注入穴位后激发了腧穴的良性调整作用，具有吸收快和放大药物治疗作用的效应。这样就可以减少药物的用量，提高疗效。外关穴为手少阳三焦经之络穴，是八脉交会穴，通阳维脉[13]。外关穴注射异基因hUCBSCs治疗RA，一方面具有针刺效应，调节阴阳，刺激神经-内分泌-免疫网络，调节紊乱的免疫功能，另一方面发挥异基因hUCBSCs的作用，调节RA患者机体免疫紊乱，阻止病情进展。

本实验研究hUCBSCs穴位移植治疗CIA大鼠，在实验中采用外关穴注射、腕关节腔注射及尾静脉注射三种方法，结果显示，三种治疗方法对RA大鼠均有明显的治疗作用，外关穴位移植对RA大鼠细胞因子的影响更大，作用明显优于MTX。这可能与穴位的作用不可分离[14-15]。异基因脐血干细胞外关穴位移植治疗的特点就是调整机体的免疫功能，表现在能恢复和促进IL-4、IL-10含量使Th2升高，降低TNF-α、IL-1β的量使Th1降低，使失衡的Th1/Th2趋向平衡，可能是通过抑制炎症细胞迁移、抑制内皮细胞黏附分子的表达、抑制滑膜细胞过度分泌细胞因子及炎症介质[16-17]，从而减轻了临床症状，延缓了病理进展，防止了关节畸变和功能破坏。

综上所述，本项目是将传统医学的穴位疗法与现代医学的干细胞移植技术相结合，以期开辟一条新的移植途径，可以使干细胞更为简单、无创、准确地运送到目的地，探求对RA新的治疗方法，并通过此进一步分析RA的发病机制。

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篇6

山东省济南市济阳县人民医院，山东济南 251400

[摘要] 流式细胞仪被广泛的应用于光学、生物学、流体学和免疫学等领域。其中流式细胞术是其检测的关键性技术，具有灵敏、快速的特点，在细菌的快速检测中得到较为广阔的应用。本文就流式细胞术在环境样品细菌检测、临床细菌检测和趋磁细菌研究中的应用前景进行分析，以促进流式细胞技术的发展和完善。

[

关键词 ] 流式细胞术;细菌;快速检测;应用

[中图分类号] R446.5　[文献标识码] A　[文章编号] 1672-5654（2014）04（b）-0194-02

流式细胞术于90年代末期被创建，最初仅用于临床检验和科学研究，由于微生物的粒子或细胞较小，因此在微生物领域应用的较晚。但在近几年来，随着荧光染料的改良和丰富、光学科技的不断完善，以及流式细胞检测仪自身的不断发展进步。在如今，流式细胞术在微生物领域得到较为广泛的应用，尤其是对于细菌学问题的解决具有多参数测量精确，并且迅速的特点。

1流式细胞术在环境样品细菌检测中的应用

以往对环境样品通常应用的方法为平板法，对微生物的多样性和总菌数的深入研究具有严重的制约性，常会给检测结果带来较大的误差，并且其他传统的检测方法，具有操作复杂繁琐的特点。但流式细胞是在环境样品中的推广应用，具有测定精准、制备简单、可快速的对多参数数据进行采集，以及可对多元数据进行分析。如今，流式细胞术已广泛的应用于土壤、水和空气等环境中的微生物研究的重要工具，图1为流式细胞术的样品制备技术。

曾有学者应用荧光原位杂交技术结合流式细胞检测仪对猪谷仓空气和实验室空气中的微生物进行测定。先用液化收集器获取样品，然后用荧光染料染色后，应用流式细胞术辨别样品粉尘杂质中的菌体，并且可通过计数处理，获取细菌总数。流式细胞术还可用以土壤样品的检测，Jean Christophe等学者应用流式细胞术对土壤样品中的微生物进行定量和定性检测。应用溴化乙锭和跟16SrRNA具有互补作用的荧光探针结合光散射参数对菌体的大小进行限定，然后从土壤微生物的粉尘碎片和群落中区分出絮凝剂产生菌检测菌[1]。

另外，还有学者应用该术对水环境进行细胞的快速检测,采用流式细胞术和FISH对新加坡压舱水的肠道菌数、弧菌数、细菌总数和大肠杆菌属进行检测。经检测结果发现，应用不同取样点的压舱水，其检测结果会存在较大的差异，该种现象说明航运业的压舱水的水质情况较为复杂，并且受到多种因素的制约和影响。这些检测实验表明，应用流式细胞术能够进行水质检测和污染监测，在工业不断发展的今天，对于生态文明建设，该监测方法的应用具有极为重大的意义。

2流式细胞术在临床细菌检测中的应用

流式细胞术在最初主要应用为哺乳类动物的检测，在临床上的应用极为少见。但目前在临床中，已得到广泛的应用，并且样品的检测范围也从最初的的真核细胞检测扩展到原核生物的细胞检测中，甚至可对更小的病毒进行检测。具有快速、灵敏的特点，对促进病症的及时确诊具有重要的作用。较为常用，并且效果最佳的是对于菌血症的诊断。在临床检查中，异质性和药敏性极为常见，并且两者间具有紧密的联系，流式细胞术在临床细菌检测中的应用，最初始于对药敏性的检测。

Suller曾应用流式细胞术检测氨苄青霉素、万古霉素和头孢他啶，分别对其金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的药敏性反应进行检测。其结果表明，应用流式细胞术能够灵敏、快速的对抗生素的抗菌效应进行检测，同时应用细胞氧化活性燃料CTC，可检测出多个不同的细胞亚群，由于不同的细菌亚群对于抗生素敏感性并不相同，因此能够较为直观的反映细胞的异质性[2]。付亮等学者应用临床分离出的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，结合流式细胞术和确证实验两种方法进行两种药物敏感性的检测。其检测结果表明，流式细胞术和传统的检测结果具有一致性的特征，但更富有客观、自动化和快速的特性，能够联合应用于药敏性的实验研究。流式细胞技术还可获取异质性和药敏性的相关信息，属于有效的检测手段。该技术在临床疾病诊断中的优势，在于其检测结果能够帮助对疾病进行及时的诊断，特别是对于急性病的诊断，具有较大的应用价值。

流式细胞术在临床医学中的应用，还可应用于其他病菌的检测。有学者曾应用结合分支杆菌采用荧光素SYBR Green I和二氧化硅纳米颗粒两种燃料标记后，结合流式细胞术进行检测。其检测的菌浓度可低至3.5×103~3.0×104 个/mL，相对于单纯使用FITC 染色的流式细胞术应用更为明显[3]。此外，据有关实验表明，流式细胞术的临床细菌诊断，并不仅仅是局限于普通的细菌检测，还可用于休眠体的检测，能够在其活化前，对疾病作出诊断，进行尽早的诊断，对于患者的康复具有重要作用。

3流式细胞术在趋磁细菌研究中的应用前景

趋磁细菌于1975年由美国科学家Blakemore首次发现，因为其体内据有较小的次磁小体，受到诸多科学家的关注。在目前，对于趋磁细菌磁小体的合成机理并没有明确的文献指出，在研究中，依然存在较多的问题。其中的关键性问题在于对磁小体合成量的检测，也即磁性的表征，对于优化磁小体的合成培养条件形成了限制，制约磁小体的大量合成[4]。在近几年来，有学者曾应用流式细胞仪对趋磁细菌进行检测应用，但文献较少，并且缺乏深层次的研究。

结合流式细胞仪的应用原理，以及检测微粒时可应用荧光染料标记定量测量的特点，初步推断流式细胞术能够应用于检测趋磁细菌磁小体合成量。因为趋磁细菌结合体的体内合成磁体较小，并且数量不相等，致使胞内粒度的大小直接受到磁小体多寡的影响。根据流式细胞术侧向散射光信息能够表示细胞胞内粒度的具体情况,因此，流式细胞术在未来的发展研究中，应能够用于趋磁细菌磁小体量的检测，但在目前仍未找合适的磁小体荧光探针，所以还有待于进一步的深入研究。此外，流式细胞术还可以应用于趋磁细菌非趋磁标准珠和突变株的检测研究，据有关研究观察发现趋磁细菌的非区磁性的突变体能够自发的形成[5]。但在目前的研究中，流式细胞仪应用于趋磁细菌还存在一定的局限性，需要对其仪器精度的提升深入研究，方能进一步的促进流式细胞术在趋磁细菌中的应用。

4结语

流式细胞术在微生物领域中的应用较广，只要可进行荧光分子标记的微粒和细胞，均可应用流式细胞仪检测。尤其是用以形体较为微小的粒子，具有灵敏度高、迅捷、逐个检测、多参数分析等优点。但由于其前期的应用成本较高，并且在样品处理和荧光染料的选择方面仍然存在一定的局限性，还需进一步的研究。但在现代科技不断进步发展下，流式细胞术会有更为广阔的应用前景。

[

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篇7

作者：韩兆东 阮月芹 安新业 孔祥华 陈佳荣 周玉明

【关键词】 细胞

【关键词】 流式细胞仪；临床应用；流式细胞术

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对细胞等生物粒子的理、化及生物特性进行分析的方法。流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的综合结晶。在免疫学、血液学、肿瘤学等学科及临床研究方面得到广泛应用［1］。

FC500是由美国贝克曼库尔特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的临床及科研型流式细胞仪系统。该仪器可同时测定前向散射光（FORWARD SCATTER）、侧向散射光（SIDE SCATTER）及利用一个488 nm单束激光激发五个荧光染科所产生的荧光信号。因此，该仪器可对各个细胞进行相关的多参量的分析。

FCM的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞的分子水平的研究，随着对FCM研究的日益深入，其价值已经从科学研究走入了临床应用阶段，在我国临床医学领域里已有着广泛的应用。

1 FCM在免疫学中的应用

FCM广泛地应用于检测各种免疫细胞的表面标志及细胞内各种细胞因子等，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，指导治疗。有大量文献介绍了淋巴细胞在各种疾病中的变化。正常人群T淋巴细胞CD4/CD8比值大约为2∶1，但在人体细胞免疫力低下时可出现比例下降甚至倒置。B细胞CD19与机体免疫球蛋白呈正相关。NK细胞反应机体对病毒感染的细胞和肿瘤细胞的杀伤能力及巨噬细胞的杀菌活性。FCM通过对人白细胞抗原（HLA）配型的测定可以为异体干细胞移植病人选择出最合适的供体并进行骨髓或器官移植后免疫状态的监测。外周血HLAB27的表达及其表达程度与强直性脊髓炎的发生有很大程度的相关性，运用HLAB27/HLAB7双标记特异性单克隆抗体检测抗原，可同时排除交叉反应，其敏感性较传统的微量细胞毒实验大大提高［2］。用FCM检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者血细胞细胞膜上的CD55、CD59已能从病理上提供直接的证据，比传统的溶血试验具有更高的特异性和灵敏度。用FCM检测红细胞、粒细胞抗体及血小板表面的相关抗体，对确诊自身免疫性贫血、粒细胞减少症及血小板减少性疾病，均具有检测速度快、灵敏度高、特异性好的优点［2］。

2 FCM在血液学中的应用

白血病分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充；是对白血病诊断、选择化疗方案和判断预后的重要依据；对白血病发病机制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化阶段血细胞膜表面及浆内表达不同的分化抗原，且与相应正常骨髓细胞的表达存在差异，故应用FCM能很好的对白血病进行免疫分型，并能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程中细胞基因及抗原标志发生变化的信息，而这种变化常常是细微的，以至于常规FAB方法不能分辨。这使我们对血液肿瘤细胞的生物学特征有了更深入和更精确的认识。FCM还可用于血小板膜糖蛋白异常所致疾病的诊断，包括先天性或获得性血小板的疾病，评价活化血小板程度在血栓疾病和血栓前状态发生发展中的作用。用FCM通过对外周血网织血小板的测定，有助于血小板减少症的病因学诊断。可作为骨髓移植、造血促进因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢复有用的监控指标。

应用FCM检测某些免疫指标，能对再生障碍性贫血的发病机制进行研究。再障是一组由不同发病机制介导的骨髓造血功能障碍综合征。其发病机制复杂，目前尚未完全明了，但越来越多的临床和实验室证据表明免疫介导的造血抑制，是再生障碍性贫血最常见的病理之一。而且，具有免疫表型异常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T细胞或TCRγ，δ等异常增高）的患者临床表现相对严重，但免疫治疗相对有较好的疗效。

微小残留病灶（MRD）检查：白血病病人在获得血液学缓解后，体内还存在1010以下的白血病细胞。这样少量的白血病细胞常规的显微镜不能检出。在强化治疗和维持治疗后可逐步减少，但难以彻底清除，这是复发的根源。检测MRD是决定进一步治疗策略和选择采集外周血造血干/祖细胞自体移植及异基因骨髓移植时机的依据。

多发性骨髓瘤（MM）：多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生性疾病，正常浆细胞为CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45双标记检测外周血和骨髓标本，可以准确划定浆细胞群。通常使用CD38和CD45，结合轻链检查，对多发性骨髓瘤细胞进行分析。另外，正常浆细胞的表面标记为CD19+/CD56-，而多发性骨髓瘤细胞通过为CD19-/CD56+。这样，使用流式细胞仪对外周血或骨髓标本进行多参数分析，并计算浆细胞含量，对于多发性骨髓瘤的诊断和治疗评估有重要意义。

CD34的绝对计数：造血干/祖细胞移植加强烈化疗是治愈某些难治性疾病的有效方法；它不仅可以用于某些恶性血液病的治疗，而且还可以用于其他恶性实体瘤的治疗。骨髓移植（BMT）或外周血造血干细胞移植（PBSCT）的成功与否，除了与是否合并并发症有关外，移植物中CD34+细胞的数量和质量是快速成功植活的重要因素。精确测定CD34对于判断移植后的植活和选择GCSF动员外周血干细胞的采集时间，有着重要指导意义。

3 FCM在肿瘤学中的应用

流式细胞术利用实体瘤标本或穿刺标本、胸腹腔液体、膀胱冲洗液、尿液、食道镜及支气管镜钳取的少量活检组织等对肿瘤细胞DNA会计师测定，解析细胞周期，通过肿瘤细胞异倍体测定，鉴别良性与恶性肿瘤，预测各种癌的预后，并能在化疗中对药物的选择，放疗中强度、时间的决定等起主要作用［5］。根据细胞周期分析结果，适当选用周期特异性药物或非周期特异性药物，可协助拟定治疗方案；根据化疗过程中肿瘤细胞DNA会计师分布直方图的变化，可了解细胞动力学变化，以此评估药物疗效。

多药耐药（MDR）的研究：白血病治疗及肿瘤化疗的失败在很大程度上是由于白血病细胞及肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。因此，对白血病和肿瘤细胞耐药机制的研究具有重要的意义。但耐药的形成过程很多，主要有几个方面，包括药物吸收减少、细胞解毒作用增强、靶分子改变、DNA损伤修复能力增强、细胞内药物溢出增多、细胞凋亡的抑制等。多药耐药基因编码的P糖蛋白，是白血病细胞及肿瘤细胞抗药性的分子学基础，也是影响化疗疗效的主要障碍。利用FCM检测多药耐药基因，则可为药理学研究提供依据。

参 考 文 献

1左边富流式细胞术与生物医学［M］沈阳：辽宁科学技术出版社，1996129~422

2单卫民，冯萍，俞秋兴流式细胞仪检测HLAB27［J］临床检验杂志，2000，18（6），366

3Jennnings CD，Foon KARecent advances in flow cytometry;application to the diagnosis of hematologic malignancy［J］Blood，1997，90(8);2863

篇8

关键词：IPS细胞；分化；造血干细胞

0 引言

目前，临床上普遍使用造血干细胞移植，用于白血病、非霍奇金淋巴瘤、地中海贫血等病的治疗。造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓。如果直接进行骨髓移植，则需要进行人体的白细胞抗原配型，否则发生免疫排异会危及患者生命。现有脐带血库储存的造血干细胞免疫原性弱，但数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限制。随着诱导性多能干细胞（IPS）提取技术的出现，使分化自身细胞变为了现实，不但避免了伦理问题，解决了免疫排斥问题，造血干细胞的数量也能满足临床需求。下面将分化研究过程报道如下：

1 材料和方法

1.1细胞株的来源

小鼠骨髓基质细胞OP9购于美国ATCC，诱导性多能干细胞IPS由中科院广州生物医药与健康研究院提供。

1.2试剂和仪器

小鼠骨髓基质细胞OP9的培养基为α-MEM，内含20%的胎牛血清，OP9细胞诱导干细胞分化培养基为α-MEM（15%的DFBS、0.25%胰酶、0.1%明胶），CD34来自MACS公司。抗体为APS-TRA-1-85，半固体培养基购于SCT公司。流式细胞仪为美国AccuriC6型，定量PCR仪为CFX96型。

1.3方法

在六孔板中先铺好1%的metrigel进行细胞培养，每三天添加0.5mmol/L的EDTA，以保持对照组细胞的未分化状态，OP9用细胞培养液培养，培养时放在大小为10cm且铺有0.1%的明胶的盘里，，每隔四天用胰酶消化传代。细胞培养温度为37℃，CO2浓度为0.5，湿度饱和。

OP9细胞进行传代培养4天后，将OP9的培养液换成诱导干细胞分化的培养液，将UC013细胞洗两遍后，再对边缘部位细胞进行消化，将细胞吸出后加入Dispace，再用枪头吹吸混匀细胞后，将其转移到加有分化培养液的细胞盘中摇匀，在与上述培养的温度、空气CO2浓度和湿度相同的条件下进行培养，培养的第二天将培养液换为共培养液，第四天开始每隔一天半换一次培养液，第九天收样品。

免疫磁珠法分选CD34+细胞，将细胞用PBS洗两遍，接着用胰蛋白酶进行消化，制备单细胞悬液，再将细胞收集到离心管中进行离心，收集沉淀，再向其中加入2%血清吹打均匀。过滤后，向其中加入FCR和 CD34标记细胞，30秒后加入流式细胞缓冲液，再离心，然后吸取上清，加入流式细胞缓冲液重悬。将制备好的细胞悬液加入流式细胞仪进行分离，通过流式细胞仪分离柱的CD34-细胞被移出分离柱弃之，最终，通过加压洗脱分离柱上黏附的细胞，即得到CD34+细胞。

用流式细胞术进行检测，将共培养9天后的细胞用PBS清洗、胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，收集到离心管中，静置五秒后，用加有2%血清的流式缓冲液重悬，细胞过滤后，加入FCR和抗体，孵育15min，再用流式缓冲液清洗，重悬，最后用流式细胞仪进行检测。

集落形成实验。将分选的CD34+细胞接种到半固体培养基中，放于培养皿中进行培养，每孔接种1万个细胞，培养14-16天。然后，在显微镜下根据集落成的血细胞形成特征，对集落细胞进行分类和计数。同时，提取共培养2、4、6、8、10和12天的细胞的RNA，用RT-PCR法检测各基因在细胞中的相对表达量。

2 结果

2.1细胞培养与观察

观察培养的细胞，结果显示，对照组未分化的人体细胞集落状生长，呈扁平状，排列紧密，没有分化的迹象。实验组培养2天后的细胞，表面布满细胞集落，已进行造血干细胞分化。OP9细胞贴着细胞壁生长，细胞为三角形，周围向外出伸出像纤维状的伪足，细胞排列规则，生长迅速，培养4天后细胞铺满了培养皿底。

2.2诱导造血干细胞分化

通过在本实验组的诱导分化条件下，对实验组和对照组细胞的培养，实验组细胞分化到一定程度后，便开始大量克隆，细胞的形态也发生了分化，接着，OP9细胞开始出现老化迹象。

2.3流式细胞术检测

共培养9天后用流式细胞仪检测细胞造血表面标志物表达情况，用流式细胞仪分析培养细胞的CD34、CD43、CD31的表达情况，结果显示表达上述表面标志物的细胞分别占有比例为20%、2%和7.1%。

2.4 4RT-PCR检测

运用RT-PCR对共培养的细胞进行基因表达检测，结果显示，IPS细胞发生造血分化时，Oct-4基因的表达慢慢消失；造血转录因子基因表达缓慢升高；Runx-1基因在造血干细胞分化12天当中的表达呈波浪式变化，其中分化第二天表达量最高，第四天开始下降，第八天开始升高；CD34在造血分化过程中的基因表达量逐渐增高。

2.5 CD34+细胞集落实验

CD34+细胞在半固体培养基中进行培养，根据造血干细胞的形态特征，对细胞集落进行分类和计数。结果显示，红系集落（CFU-E）、粒系集落（CFU-G）、巨核系集落（CFU-M）、粒―巨核系集落（CFU-GM）集落数量持续升高，混合系集落（CFU-GEMM）的集落数量逐渐降至最低。

3 讨论

随着干细胞技术的发展，通过诱导分化得到造血干细胞已经成为事实。相对于多能干细胞而言，IPS通过导入转录因子以及重编程进行定向分化的比例较低，，但是IPS的获得方法比较简单稳定，避免了胚胎干细胞面临的伦理和法律等问题，使IPS可以应用于细胞替代性治疗，并可以进行疾病的机理研究和肿瘤治疗药物的筛选。IPS细胞分化得到的造血干细胞免疫原性较低，解决了移植排斥的问题。

在本文的研究中，没有外加细胞因子，直接将IPS细胞诱导分化为造血干细胞，结果获得了20%的CD34+细胞，即造血干细胞，CD34是表达于造血干细胞的表面标志物，表明IPS可以分化为造血干细胞，但是转化率比较低。Runx1是调控造血干细胞分化的转录因子，期基因的表达量在分化过程中呈现波浪式的变化，Gata-2的表达则逐渐升高。体外分化得到的造血干细胞在半固体培养基中成集落状态，说明IPS可以向各细胞系进行分化。

现在多能干细胞分化为造血干细胞的方法主要有：一是形成胚状体后再进行诱导生成造血干细胞；二是基质细胞与多能干细胞共培养；三是形成EB后与OP9进行共培养；四是单层诱导ESC生成造血干细胞。利用OP9细胞与胚胎干细胞共培养，可以模拟体内的造血微环境，为研究细胞定向分化为造血干细胞创造了可能性，OP9细胞主要支持早期的造血干细胞分化，并协助B淋巴细胞增殖。基质细胞通过释放的细胞因子支持造血干细胞的分化。这种诱导方法分化时间短，为临床造血干细胞的移植提供了便利。诱导分化过程中不用添加细胞因子，比较经济。但该诱导方法也存在着一定的缺点，即存在鼠源性污染细胞的可能性，加之所用血清的成分的不明确性，限制了其在临床应用。

目前临床上移植造血干细胞主要是用脐血和骨髓来源的造血干细胞，而体外分化和扩增得到造血干细胞只能通过动物试验来获得。将造血干细胞植入重建小鼠体内，可以评价造血干细胞的功能。体外分化获得的造血干细胞和脐血中的造血干细胞与重建小鼠体内造血系统差异较大，需要进一步优化体外诱导多能干细胞分化为造血干细胞的过程，才能满足该实验需求

4 小结

通过将IPS定向分化为造血干细胞的研究，成功诱导了造血干细胞，分化得到的细胞在体外培养中形成了所需的各系集落，本文的研究所采用的技术方法希望可以为IPS细胞在造血疾病中的应用提供一定的实验依据。

参考文献：

[1]张坤等.体外诱导人类诱导性多能干细胞分化为造血干/祖细胞的研究，中国实验血液杂志，2014.01.

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关键词：槲皮素；抑制；膀胱癌

【中图分类号】R735.2 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783(2012)06-0277-01

槲皮素(quercetin，Que)是一种天然的黄酮类化合物，广泛存在于多种植物中，尤以红麻叶和湖南连翘中含量较高，具有抗感染、抗过敏、清除氧自由基、降血脂等多种药理作用[1]。最近也发现其具有广泛的抗肿瘤的作用[2]。本实验主要探讨了槲皮素抑制人膀胱癌细胞增殖的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料来源:槲皮素购自Sigma公司，用DMSO(上海生物试剂厂)配成1000×储存液，-20℃保存。BIU-87人膀胱癌细胞株购自武汉大学典藏中心。

1.2 实验方法

1.2.1 分组培养:将膀胱癌细胞株培养于RPMI-1640培养基中，在对数生长期时，收集细胞并调整细胞浓度为 4×104个／ml，接种于96孔板，每孔加100μl细胞悬液。24h后，实验组分别加入终浓度分别为 0、70、140、210μmol／L的槲皮素，另一孔只加培养液，作为空白对照，每组分别设5个复孔。

1.2.2 活性检测:分别在24、48和72h后，加入20μl (5mg／ml)的MTT，4h后弃上清。再加入200μl 的DMSO，用酶标仪(波长570nm)测定各孔吸光度(A值)，并计算细胞生长抑制率。

1.2.3 细胞凋亡率检测:取对数期膀胱癌细胞，接种于6孔板，培养24h后，再加入槲皮素至终浓度70、140和210μmol／L，然后在流式细胞仪(FACS-Calibur)上进行细胞凋亡分析检测。

2 实验结果

2.1 形态观察:对照组膀胱癌细胞呈长梭形，边缘比较光滑整齐，核大。而经槲皮素处理的膀胱癌细胞开始变圆，核部分碎裂，并有部分细胞脱离培养板。

2.2 细胞活性检测:与对照组相比，各浓度间的增殖抑制率差异显著（p

2.3 流式细胞仪检测凋亡结果:分别是0、70μmol/L、 140μmol/L 和210μmol/L槲皮素浓度作用结果。槲皮素作用24h后凋亡率分别为0.58%、12.28%、15.14%和24.31%；作用48h后凋亡率分别为0.77%、14.15%、23.32%和37.39%；作用72h后凋亡率分别为14.24%、55.48%、57.81%和62.57%。

3 讨论

研究发现，槲皮素可诱导多种恶性肿瘤细胞的生长，但槲皮素作用于人膀胱癌细胞的研究报道较少。结果显示，终浓度为70-210μmol/L 的槲皮素对膀胱癌细胞有显著地抑制作用，通过流式细胞仪检测其凋亡，随着时间和浓度的增加，凋亡率也增加，作用48h凋亡率最大达到37.39%，而到72h凋亡率达到了62.57%。其凋亡机制可能与下列因素有关：阻滞细胞周期[3]、下调热休克蛋白、诱发Bcl-2的表达等导致细胞增殖抑制。本研究建立了槲皮素抑制膀胱癌细胞生长的细胞模型，并且槲皮素还可抑制肿瘤血管生成和转移等多种途径来发挥其抗肿瘤的作用，因而推测它将是很有应用前景的治疗肿瘤的天然药物。

参考文献

[1] Nijveldt R J，Van Nood E，Van Hoorn D，et a1．F1avonoids：a review of probable mechanisms of action and potentials applications[J]．AMJ Clin Nutr，2001，74：418-425

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    【关键词】 粉防己碱 ;卵巢癌 ;增殖; 凋亡

    粉防己碱(Tetrandrine)别名称汉防己甲素,是从中草药粉防己的块根中提取的双苄基异喹啉类生物碱,对高血压、心律失常、肺纤维化等疾病具有较好的疗效。近年来的研究表明,粉防己碱可抑制多种肿瘤细胞生长,作为一种潜在的抗肿瘤药物,其相关研究颇受关注。卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一,其死亡率高居妇科肿瘤之首,术后化疗仍是卵巢癌最重要的辅助治疗措施,但由于化疗的毒副作用及肿瘤抗药性的增加其疗效显着降低,我们从抗肿瘤的植物药中,筛选出粉防己碱,观察其对卵巢癌HO-8910细胞的作用。

    1 材料与方法

    1.1 材料 人卵巢癌细胞株HO-8910(中科院上海细胞所提供);粉防己碱(江西银涛药业有限公司),25℃溶于DMSO中;胰蛋白酶、RPMI-1640、吖啶橙、胎牛血清(华美生物公司);MTT及二甲亚砜DMSO(sigma公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 人卵巢癌HO-8910细胞株,培养基为RPMI-1640内含10%灭活胎牛血清、37℃、5%二氧化碳的饱和湿度培养传代。

    1.2.2 实验分组 共分5组:实验组:加入粉防己碱,终浓度分别为1.0mg/L,5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L组;对照组:加入等量的RPMI-1640培养液(每组设6个复孔)。

    1.3 实验指标的检测

    1.3.1 MTT试验

    取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×105个/mL的单细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μL,过夜贴壁后;实验组加入1.0mg/L, 5.0 mg/L,10.0 mg/L及20.0 mg/L的粉防己碱,对照组加等量的RPMI-1640。每组设6个复孔,继续培养24、48h后加入MTT(5mg/mL) 20μL/孔,4h后吸净上清液,加入DMSO 20μL/孔,震荡10min,用酶标记光仪在波长为560nm时测定每孔的吸光度(A)值,计算不同浓度抗体对细胞增殖的抑制率[抑制率=(对照组A均值-实验组的A均值) /对照组A均值 [1]]。

    1.3.2 AO染色

    取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为5×105个/mL的单细胞悬液,按上述粉防己碱浓度培养48h后,离心弃上清,用PBS洗3次,95%乙醇固定15~30min;1%醋酸酸化30s;加入0.01%AO染色1~5min,封片,镜下观察并摄影。

    1.3.3 流式细胞仪检测细胞周期

    取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,按上述浓度培养24h后,收集细胞,PBS洗涤,制成单细胞悬液,用70%的冰乙醇4℃固定12h,用含核糖核酸酶及碘化丙锭的染液染30min,上流式细胞仪进行检测。

    1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率

    取对数生长期的HO-8910细胞,制成浓度为1×106个/mL的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,按上述浓度培养24h后,收集细胞,用AnnexinV-FITC/PI双标记染色后做流式细胞仪双色分析。

    1.4 统计学处理

    采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,所有数据均用±s表示,统计方法采用方差分析,组间比较采用q检验。

    2 结 果

    2.1 MTT试验结果

    实验结果显示:粉防己碱对HO-8910细胞的生长具有明显的抑制作用, 实验范围内最大抑制率达61.35%,且抑制作用随药物浓度增加、作用时间延长而增强,呈现剂量、时间依赖性作用, 经统计学检验差异具有显着性意义(P< 0.01,见表1)。

    表1 实验组和对照组卵巢癌细胞内的吸光度值和增殖抑制率(±s)组别粉防己碱

    (mg/L)24h吸光度值(±s)抑制率(%)48h吸光度值(±s)抑制率(%)对照组00.605±0.00600.608±0.0050实验组10.562±0.004*7.110.535±0.003*12.0150.508±0.009*16.030.420±0.005*30.92100.450±0.008*25.620.325±0.003*46.55200.333±0.008*44.960.235±0.003*61.35

    注:同一作用时间采用方差分析及q检验*P<0.01;同一浓度组采用t检验P<0.05

    2.2 AO染色

    凋亡细胞体积明显缩小,核碎裂,核内可见浓缩边集的染色质,呈新月形或肾形致密浓染的黄绿色染色,荧光亢进 (图1)。

    2.3 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响

    不同浓度粉防己碱作用卵巢癌细胞24h后,与对照组相比,细胞周期分布、凋亡率均发生改变,即G1/G0期细胞比例数上升,S期和G2/M期下降,细胞凋亡率上升,均有显着差异(P<0.05),且与粉防己碱浓度之间具有剂量依赖性(P<0.05,见表2)。

    表2 粉防己碱对卵巢癌细胞周期分布和凋亡率的影响(±s)注:采用方差分析*P<0.01

    3 讨 论

    粉防己碱是一种具有广泛药理学作用的双苄基异喹啉类生物碱,是粉防己的主要有效成分。早期研究表明粉防己碱具有消炎、镇痛、降压、抗纤维化等广泛的药理作用。近年来的研究证实粉防己碱是天然的非选择性的钙通道阻滞剂,又是钙调蛋白的拮抗剂,具有直接抗肿瘤的作用。Kuo等[2]发现,粉防己碱不仅抑制人肝癌Hep G2细胞株的生长,还可诱发凋亡。何琪扬[3]等采用台盼蓝计数法发现粉防己碱对敏感急性白血病细胞株HL260和抗三尖杉酯碱的HL-60细胞均有生长抑制作用。王瑞珍[4]等用粉防己碱处理人食管癌细胞,观察到肿瘤细胞分裂指数低于对照组约50%。Dong Y[5]等观察到粉防己碱可抑制HL260细胞生长,认为粉防己碱可通过诱导肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长。