nk细胞范文
时间：2023-04-04 06:45:57
导语：如何才能写好一篇nk细胞，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
1.概述：nk细胞是一种非T细胞性、非B细胞性、非吞噬细胞性的具有细胞毒性效应的淋巴细胞。NK细胞是机体免疫系统的重要组成部分，在抗病毒感染免疫、肿瘤免疫、移植排斥反应以及免疫调节中起着十分重要的作用。
2001年WHO淋巴组织肿瘤分类将NK细胞肿瘤分为：（1）前体NK细胞肿瘤，即原始NK细胞淋巴瘤；（2）成熟NK细胞肿瘤，包括T-LGLL、ANKL、结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（NK/TCL）。
侵袭性NK细胞白血病（ANKL）是起源于成熟NK细胞的恶性肿瘤，突出特点是NK大颗粒淋巴细胞（LGL，large granular lymphocyte）系统性增生（1），肿瘤细胞表达CD56，而表面CD3阴性。ANKL为高度侵袭性疾病，病程进展迅速，常伴有肝、肾、心等多器官功能衰竭，大部分患者诊断后数日或数周后死亡（2，3，4） 。ANKL最早由Imamura等于1990年发现，多见于亚洲和欧洲高加索地区，多在中青年发病，中位发病年龄30岁，男女发病率无差异，同时发现CD56作为NK细胞的标志。该病发病率低，但恶性程度高，侵袭性强，早期症状不典型，易误诊（5），治疗效果及预后极差。
2.病因及发病机制：本病的病因及发病机制尚未明确（6）。但多数病例报道（7，8，9）中发现，EB病毒感染的检测多数阳性，提示EB病毒感染与本病存在相关性（10），但目前EBV如何引起NK细胞克隆性生长知之不多。有部分研究表明ANKL的发生可能与癌基因的激活与抑癌基因的失活有关（11）。ANKL引起MOF（多器官功能衰竭）的机制除了白血病细胞浸润直接破坏器官功能外，是否与肿瘤细胞大量释放炎症因子、细胞因子、凋亡蛋白有关尚待进一步研究（12），Makishima等（13）研究发现，ANKL细胞中趋化因子CXCRI、CCR5和细胞因子IL一8、MIP一12、MIP―lB及 FasL呈阳性表达，血清可溶性FasL水平显著升高，提示细胞因子系统在ANKL细胞的迁移、侵袭中起到了重要作用，Fas和FasL的相互作用被认为是肝功能衰竭的机制之一。
3.临床表现及实验室检查：
3.1 临床症状：70%的ANKL患者起病时即可表现B症状：发热，体温>38.5℃，盗汗，体重下降。最常见的累及部位是骨髓、外周血、肝和脾，其次为淋巴结（约37%）。但任何器官均可累及，如皮肤、肾脏、肺、浆膜腔、中枢神经系统、扁桃体、纵隔及等。大多数患者呈侵袭性、爆发性的临床过程，短期内可出现多脏器功能衰竭。以肝功能衰竭为主，逐渐累及到其他脏器。病程中常出现弥散性血管内凝血和噬血细胞综合征，尤其是在终末期。噬血细胞综合征主要表现为：①发热>7 d，体温>38.5cC；②肝脾肿大；③外周血两系或三系减少，且非骨髓造血功能减低所致；④高甘油三脂血症和或低纤维蛋白原血症；⑤骨髓、淋巴结、脾脏内组织细胞增生并伴噬血细胞现象，无恶性肿瘤证据。
3.2 实验室检查：ANKL患者白细胞可表现为异常增高，以淋巴细胞为主，也有表现为白细胞减少。部分患者可出现血红蛋白及血小板减少。常出现凝血功能异常。疾病后期，几乎所有患者都会有肝功能异常和全血细胞减少。乳酸脱氢酶通常升高。
3.3 骨髓象：该病与一般白血病是有区别的，其在外周血和骨髓中的肿瘤细胞数量可能是有限的，所以在过去亦称为“侵袭性NK细胞自血病，淋巴瘤”。骨髓涂片中可见白血病细胞广泛或局灶性浸润，表现为LGL（NK大颗粒淋巴细胞），形态不规则，胞核也不规则，大多数胞质内可见粗大的嗜天青颗粒，伴有反应性噬血细胞增多，伴有髓系成熟障碍。同时可见大片坏死，中间混有正常骨髓组织，以及不典型的单个核细胞。骨髓活检可见异常细胞常呈簇状或片状分布，核圆形或不规则，染色质致密，有小核仁，常见凋亡小体和坏死。
3.4 免疫分型：ANKL典型的免疫分型（14，15，16，17）为CD2+，sCD3-，CD7+，CD16+，CD19-，CD20-，CD33-，CD34-，CD38+，CD56+，
HLA-DR+，TCR-，CD10-，CD4-。
3.5 EB病毒抗体阳性。
4.诊断：要求满足下列条件：①常有发热、黄疸及肝、脾肿大，部分患者可有淋巴结肿大、胸腔积液、腹腔积液等。②发病急，进展快，临床呈侵袭性及爆发性的过程，预后差。③外周血或骨髓中出现轻度不成熟的大淋巴细胞，胞质淡染、可见嗜苯胺蓝颗粒，核染色质较细，偶见核仁，免疫表型提示为成熟NK 细胞。④免疫表型：sCD3（-）、cCD3（-/+）及CD16（+/-）、CD56（+）、CD57（-）；TCRβ和IgH基因为胚系构型。⑤有EB 病毒感染的证据支持该诊断，但不能作为诊断的必要条件。⑥没有特异性染色体异常（18）。⑦排除其他大颗粒性淋巴细胞增殖性疾病。
5.鉴别诊断：
需与下列疾病鉴别：
（1）慢性NK淋巴细胞增多症：以外周血中成熟NK细胞的慢性扩增为特点。当外周血中sCD3（-），CD56（+/-），CD16（+）NK细胞数>0.6×109/L，并持续至少6个月时可作出诊断。该病多见于成人，不具有侵袭性临床病程，大多数患者无症状。
篇2
关键词：侵袭性NK细胞白血病；诊断；免疫分型
ANKL是一种预后很差的血液系统恶性肿瘤，临床发病率低，病情进展迅速，中位生存时间短，目前国内外文献有散发报道。现将我院近期收治的2例患者报道如下，并对相关文献进行复习，探讨该病的临床特点及有效的治疗方案。
1临床资料
病例1，患者，男，39岁。因"发热10d，咳嗽6d，下肢浮肿2d"入院，血常规：WBC 4.5×109/L，NC2.3×10^9/L,HB 87g/L，PLT 41×109/L；骨髓细胞学检查：骨髓增生活跃，G=32.5%，E=10%，G/E=5.55；可见23％分类不明细胞，该类细胞大小不等，胞浆深蓝，核染色质偏粗，可见清晰巨大核仁，从形态上看与组织细胞及淋巴瘤细胞均有相似之处。涂片偶见噬血细胞。该类细胞组化染色：NAE和NBE染色：部分细胞弱阳性； POX、AS-DCE染色和PAS染色：阴性。粒系增生尚活跃，以成熟粒细胞为主。红系增生减低。成熟红细胞中央淡染区扩大。全片未见巨核细胞。血小板散在分布。流式细胞术分析：骨髓有核细胞中淋巴细胞约占61％，其中NK细胞约占73.1％，淋巴细胞表达CD2+ CD7-为83.2％，CD3-CD16+CD56+为73.1％，HLA-DR+为54.2％。T细胞亚群在正常范围。染色体分析：正常核型（46，XY）。诊断：ANKL。予长春新碱2mg d1，8，15；地塞米松9 mg d1-15；吡柔比星30 mg d1-3联合化疗。化疗效果不佳，第20d加用环磷酰胺1g，出现高热而无明确感染征象，消瘦，全血减少，肝功能损害，因经济原因第28d出院回家，后死亡。
病例2，患者，女，41岁，因"反复发热1月，头晕、双下肢乏力1w"入院，血常规：WBC5.12×109/L，NC3.2×109/L，HB98g/L，PLT73×109/L；骨髓细胞学检查：有核细胞增生减低，G=45%，E=10%，G/E=4.5；可见16%原始细胞，此类细胞大小似淋巴系细胞，核染色质粗，核仁1-2个，形态上有些似原、幼淋巴细胞，易见涂抹细胞。POX染色阴性，粒系增生受抑，红系增生受抑，单核细胞无特殊。CD56(+)/CD2(+)/TIA1(+)/穿孔素（+）/GrB(+)/CD99(+)/CD34部分（+）；EBER(+)，结合免疫组化结果，组织改变符合ANKL。流式细胞术分析：骨髓有一群细胞占有核细胞24.3%，其表达CD2+为82.5%，CD38+为95%，CD56+为85.5%。染色体分析：43（X,-X）-3，-15，4q-，inv(12)。诊断：ANKL。予VTLP方案化疗"THP 30mg d1-3 +VCR 2mg d1，8，15,22 +DXM 10mg d1-28逐渐减量+L-ASP1万U d19-28"。门冬酰胺酶使用第4d因感染家属拒绝进一步使用，化疗第26d摔倒后出现幕上脑积水，加强脱水治疗仍有高热伴神志不清。于化疗第28d死亡。
2讨论
ANKL又称NK细胞大颗粒淋巴细胞白血病，1990年Immamura等首次提出ANKL[1]。一般发病年龄小于40岁，以发热、肝脾肿大和淋巴结肿大常见。病程进展迅速，预后差，总生存期2个月。目前国内外对ANKL尚无统一的诊断标准，较公认的诊断标准为[2]：①常有发热及肝、脾、淋巴结肿大；②中性粒细胞减低、贫血和血小板减少，外周血淋巴细胞增多，多为大颗粒淋巴细胞，但大颗粒淋巴细胞不是诊断的必要条件；③骨髓穿刺和病理活检可见大颗粒淋巴细胞浸润；④免疫表型为CD2+、表面CD3-、胞质CD3+、CD16+、CD56+和CD57-，无TCR重排；⑤EB病毒抗体阳性，或原位杂交显示大颗粒淋巴细胞中可见EB病毒mRNA；⑥没有特异染色体异常，del(6)(q21q25)是较多见的核型异常。⑦排除其他反应性大颗粒淋巴细胞增多症。
目前ANKL以化疗为主，尚无标准治疗方案，多数采用以蒽环类、烷化剂、长春碱类和糖皮质激素为基础的联合化疗，包括CHOP和DVLP等方案。但疗效很不理想，许多患者在化疗后数天至数月内死亡。本文病例2加用左旋门冬酰胺酶似乎有一定效果。国外文献报道中位生存期为58d，本文2例患者均在1个月内死亡。
总之，ANKL是一种罕见的致命性恶性肿瘤，目前对其病因、发病机制及细胞遗传学特点及理想治疗方案尚待进一步研究。
参考文献：
篇3
中图分类号：R733.4 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2017.03.029
NK/T细胞淋巴瘤是一组发生于淋巴结外，伴以坏死为主的血管损伤和破坏，细胞毒表型，和EB病毒（EBV）相关为特征的淋巴瘤。因为多数病例为NK细胞肿瘤，少数为T细胞毒表型而命名为NK/T细胞淋巴瘤[1]。NK/T细胞淋巴瘤分布有明显的区域性，在亚洲地区占到T细胞淋巴瘤的22.4%，远远高于欧美地区[2]。NK/T细胞淋巴瘤与EB病毒感染关系密切，尤其是鼻腔病例，80%～100%都存在EB病毒感染，而鼻外部位NK/T细胞淋巴瘤EB病毒的检出率则相对较低（15%～50%）[3]。既往采用传统的CHOP（环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松）类化疗方案，NK/T细胞淋巴瘤的预后很差。对于Ⅰ/Ⅱ期的早期患者，其完全缓解（complete response，CR）率多数低于40%，长期生存率仅13%～29%；对于Ⅲ/Ⅳ期的晚期患者，预后更差，长期生存率仅为10%左右[4]。研究表明，NK/T细胞淋巴瘤细胞高表达P糖蛋白，导致进入细胞的化疗药被泵出，是传统化疗方案疗效不佳的主要原因[5]。因此探索新的化疗方案治疗NK/T细胞淋巴瘤成为一个热点。我国勇威本等[6]最早提出采用门冬酰胺酶治疗，明显改善了难治复发患者的预后，使得NK/T细胞淋巴瘤的治疗进入一个新时代。笔者现将门冬酰胺酶治疗NK/T细胞淋巴瘤的进展作一综述。
1 T冬酰胺酶对早期患者治疗的影响
通常将Ⅰ/Ⅱ期的NK/T细胞淋巴瘤定义为早期患者。含门冬酰胺酶的方案显著改善了早期患者的预后。Wang L等[7]回顾性分析321例NK/T细胞淋巴瘤早期患者，其中85例采用含门冬酰胺酶的方案治疗，其余236例采用传统方案，其5年无进展生存（progress free survival，PFS）分别为69.2%和44.1%，总体生存率（overall survival，OS）分别为81%和58%。另一项大规模的多中心研究则观察了1273例早期患者，其中单纯化疗170例，单纯放疗253例，放化疗结合850例。观察表明，采用门冬酰胺酶为主的化疗方案较传统化疗方案有明显的优势，5年生存率分别为69.6%和33.9%，进一步证实了门冬酰胺酶在早期患者治疗中的意义[8]。
为进一步提高疗效，降低不良反应，有学者以门冬酰胺酶联合吉西他滨、奥沙利铂和地塞米松的GELOX方案治疗早期患者，结果表明，27例患者中总体反应率（overall response rate，ORR）高达96.3%，其中20例患者达CR，取得满意的疗效[9]。虽然含门冬酰胺酶方案极大地改善了早期NK/T细胞淋巴瘤患者的预后，但放疗在早期患者中仍然十分重要。Zang等[10]观察了早期放疗对NK/T细胞淋巴瘤治疗的影响，64例局限期鼻型NK/T均接受以门冬酰胺酶为基础的化疗联合放疗，其中34例采用晚期放疗（定义为6周期化疗后），30例患者接受早期放疗（定义为不晚于3周期化疗后接受放疗），两组平均开始放疗的时间均为26周，平均随访35个月。结果显示3年OS和PFS早期放疗组分别为84.2%、74.3%，晚期放疗组分别为57.6%、55.9%；早期放疗组CR和ORR分别为80%和93.3%，而晚期放疗组分别为50%和67.6%。58例患者在治疗2周期时有反应，对这58例患者，早期和晚期放疗3年OS（94.4%和58%）和PFS（82.9%和56.3%）仍有区别。22例进展者，4例局部复发，18例远处复发。因此，即使使用含LASP方案的Ⅰ/Ⅱ期NK/T细胞淋巴瘤，仍有必要早期放疗；即使是初始治疗有效，仍有必要早期放疗。同步放化疗对早期患者也是可行的选择，30例患者中有26例通过同步放化疗达CR[11]。Jing等[12]则在门冬酰胺酶为基础的化疗方案（培门冬酶、吉西他滨、奥沙利铂，P-GeMox）上，采用放疗-化疗-放疗的三明治法治疗，共观察38例患者，其中34例为早期患者，其1年OS和PFS分别达到86.7%和86.6%。
总之，由于以门冬酰胺酶为主的新药引入，早期NK/T细胞淋巴瘤的预后有了明显改善，多数患者可以治愈。但是放疗的地位仍然十分重要，除少数患者外，并不推荐单纯的化疗。
2 门冬酰胺酶对晚期患者治疗的影响
对晚期患者，门冬酰胺酶同样可以改善患者的治疗反应。Bi等[13]回顾性分析73例Ⅲ/Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者，其中11例为Ⅲ期，62例为Ⅳ期；4例接受支持治疗，其余69例进入分析。46例患者主要接受以CHOP方案为主的化疗，23例在此基础上联合门冬酰胺酶治疗，增加门冬酰胺酶使得总体反应率由32.6%上升至56%，遗憾的是，这一改善并未转化成生存优势，两组患者的2年OS分别为25.4%和14.9%。提示在CHOP方案为基础的化疗方案上单纯地增加门冬酰胺酶可能并不足以改善晚期患者的长期生存。
由于在传统的蒽环类化疗方案基础上联合应用门冬酰胺酶，晚期患者的获益并不明显，因此需要探索更多的新药组合。Wang等[14]观察了以吉西他滨联合门冬酰胺酶、异环磷酰胺和足叶乙甙（GLIDE）的化疗方案治疗Ⅳ期或者难治复发NK/T淋巴瘤，21例患者中17例完成预定化疗，分别有12例和5例达CR和PR，ORR为80.9%，平均随访24个月，估计3年OS和PFS分别为56%和35.8%。Kim等[15]在异环磷酰胺、甲胺蝶呤、足叶乙甙（IMEP）的基础上联合门冬酰胺酶，使得总体治疗反应率从34.8%提升到90.0%，CR率从21.7%提升到65%，并带来OS和PFS的收益。表明在强烈化疗方案的基础上，门冬酰胺酶能够改善患者长期生存。更为强烈的化疗方案如SMILE方案（地塞米松、异环磷酰胺、足乙叶甙、门冬酰胺酶）也能够使晚期患者获得较好的长期生存，但治疗过程中几乎所有的患者都会出现粒细胞缺乏，约三分之二的患者会合并感染[16]。小样本的观察表明，SMILE方案治疗中感染是仅次于复发的死亡原因[17]。因此对晚期患者如何在保证疗效的同时，减轻化疗的不良反应，值得进一步探索。
Lei等[18]根据体外实验NK/T细胞的药敏结果，选择药敏试验中最敏感的几个药物，包括吉西他滨、顺铂、地塞米松和培门冬酶组成DDPG方案治疗进展期NK/T细胞淋巴瘤。结果表明，25例患者中21例（84%）获得反应，其中CR 17例（70.8%），2年的OS和PFS分别达到68.50% 和 61.8%。值得注意的是，该方案的毒副作用较SMILE方案有明显的改善，粒细胞缺乏的患者只有58.3%，耐受性要明显优于SMILE方案。对于难治复发的患者，该方案也能达到87.5%的总体有效率，2年PFS可达81.4%[18]。Wang等[19]则观察了P-gemox（培门冬酶、吉西他滨、澳沙利铂）的疗效和不良反应，表明该方案Ⅲ到Ⅳ期粒细胞减少仅为30%，远远低于SMILE方案。
如前所述，EB病毒在NK/T细胞淋巴瘤的发病中有重要的作用。因此有学者观察了采用含门冬酰胺酶方案（SMILE）治疗时患者EB病毒含量对疗效的影响，表明第一疗程结束时EBV含量与预后相关，化疗前EB病毒拷贝数高、化疗后拷贝数不能下降者，预后最差[20]。
3 含门冬酰胺酶方案序贯移植治疗NK/T细胞淋巴瘤
由于传统化疗方案并不理想，在引入门冬酰胺酶前，即使是早期NK/T细胞淋巴瘤，也有进行自体造血干细胞移植的探索。小样本的研究表明，在以CHOP方案为主的化疗基础上，增加自体造血干细胞移植可以改善早期患者的预后，5年的OS和PFS可达100%和88.9%[21]。在化疗方案中引入门冬酰胺酶后，早期患者的长期生存已经达到80%以上，低危患者则接近100%[7]。因此自体移植在早期患者中的应用不再那么重要，可能需根据患者的危险分度、治疗反应去选择。
对于晚期患者，采用传统方案化疗时，增加自体移植可使患者获益，2年OS可达71%[22]。引入了以门冬酰胺酶为主的新的化疗方案改善了患者的预后，仍有相当部分患者疗效不满意，自体移植的地位仍然颇为重要。Kim等[17]对27例Ⅳ期NK/T淋巴瘤患者采用SMILE序贯自体移植治疗，16例患者达到CR或PR，其中11例按计划完成了自体移植，7例存活；5例未接受自体移植者，仅2例存活。分析表明，治疗前EBV是唯一的预后相关因素，治疗前EBV在60拷贝/μL以上者预后差。因此对初治患者若EBV拷贝数高，需首先考虑异基因移植。BM受累者预后差于BM未受累者，长期生存分别为10%和30%。另一项研究则表明，对于进展期患者，自体移植前是否达CR，是影响移植预后的独立危险因素，接受SMILE类方案者，更易获得CR，从而获得较好的生存[23]。
自体造血干细胞移植中仍有部分患者不能获益，对于部分高危患者需探索异基因造血干细胞移植一线治疗。Wen等[24]对18例晚期患者进行了异基因移植，移植m应证包括：60岁以下、Ⅳ期且在CR1时有BM侵犯、或化疗敏感的复发或难治患者。移植后5年OS为57%，EFS为51%，多因素相关分析表明，诱导方案与移植预后相关，以SMILE方案诱导能够获得更好的疗效。笔者同时观察到CR1与CR2时移植其预后无明显区别，提示CR1患者不一定需要一线进行异基因移植。
4 结语
以门冬酰胺酶为主的新药对NK/T细胞淋巴瘤的治疗是划时代的改变。对于早期患者，多数可以通过以门冬酰胺酶为基础的化疗联合放疗达到长期生存，自体移植可能只适合于高危和难治的患者。对于晚期患者，以门冬酰胺酶为基础的强烈化疗方案可使患者获益，基于体外药敏实验的新药组合在提高疗效的同时，减轻了化疗相关的不良反应，值得进一步去探索。自体移植可使晚期患者进一步获益，但是对化疗未达CR者，化疗前EB病毒负荷高者，以及骨髓受侵犯者，异基因移植可能是更好的选择。
参 考 文 献
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篇4
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Detection of the influence of T-cell subpopulation and Natural killer cells activity of microwave treatment for patients with basal cell carcinoma by flow cytometry
ZHANG Yuan，ZHONG Yi-ping，SUN Le-dong
（Department of Dermatology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）
Abstract： Objective To study the influence of the cellular immune function on The microwave therapy for patients with basal cell carcinoma（BCC）. Methods T-cell subpopulation and percentage of NK cells in peripheral blood of 32 cases with BCC were tested by flow cytometry before and after microwave therapy. Results The percentage of CD3 cells，CD4 cells and NK cells decreased and that of CD8 cells increased in BCC patients，with significant difference from those of controls. After microwave therapy，the percentage of CD4 cells and NK cells in patients with BCC were higher than that of before treatment，the percentage of CD8 cells were lower than that of before treatment. Conclusion BCC patients exist cellular immune function defect，Microwave therapy can enhance the immune function of the BCCpatients.
Key words：basal cell carcinoma；T-cell subpopulation；natural killer cells；flow cytometry；microwave therapy
基底细胞癌（basal cell carcinoma， BCC）是最常见的皮肤癌之一，以往多采用手术、放疗、化疗及免疫治疗等传统治疗方法，虽然这些方法效果尚可，但在美容和副作用方面存在一定的局限性。微波治疗BCC效果满意，复发率低，副作用少[1]，但其治疗机制尚未完全明了。恶性肿瘤的发生、发展和转归与机体的免疫功能密切相关，我们以前的研究证实BCC患者存在细胞免疫功能受损，并与BCC的发生、发展和转归有关，提示可从提高机体的免疫功能来寻找有效的治疗方法[2]。为了进一步了解微波治疗BCC癌的机制，我们应用流式细胞仪技术检测了32例BCC患者微波治疗前后的T细胞亚群及NK细胞，现报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料：32例患者均经组织病理学检查证实为基底细胞癌并接受微波治疗，其中男20例，女12例，平均年龄56.8岁（15～68岁），平均病程3.7年（2个月～18年），但具有下列情况之一者不列入研究范围：①伴有自身免疫性疾病、过敏性疾病、严重的系统性疾病、病毒感染性疾病者；②1年内用过免疫增强剂或免疫抑制剂者。微波的具体治疗方法为先将局部清洁、消毒，予2%利多卡因局部麻醉后，选用双极触头对准癌组织进行多点热化凝固，然后清除已凝固的坏死组织，反复多次对癌组织进行热化凝固，直到暴露出基底正常组织。治疗范围超出癌灶边缘5 mm。对范围特别大的基底细胞癌，可分次治疗。经过上述方法治疗后，接着按下微波机的热疗档，选用直径为7 cm的圆形发热器对准创面进行照射，输出功率为40～50W，发热器距创面10～15 cm，以患者有温热感为度。照射时注意充分暴露创面，照射完毕局部外涂复方红汞溶液。每日1次，每次20min，1个疗程为7～10天[1]。对照组32例，均为我院健康体检者，其中男19例，女13例，平均年龄57.3岁（16～69岁）。两组年龄和性别方面无统计学差异。
1.2 方法：用流式细胞仪技术检测32例BCC患者微波治疗前、疗程结束后及32例健康对照组外周血T细胞亚群及NK细胞百分率。具体方法为：2只试管中各加入100μl EDTA抗凝静脉血，再分别加入20μl的双标单克隆抗体CD3/CD16+56和CD4/CD8，室温避光副孵育20min后，加500μl红细胞溶解液溶解红细胞15min，1 000r/min 离心5 min，弃上清，用PBS缓冲液冲洗2次，再以0.5ml PBS缓冲液悬浮细胞，流式细胞仪分析5 000个细胞（双标记单克隆抗体CD3/CD16+56，CD4/CD8及红细胞溶解均购自法国国际免疫公司）。
1.3 统计学方法：使用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，采用配对t检验，以P
2 结果
32例BCC患者与对照组比较，CD3、CD4细胞百分率、CD4/CD8的比值和NK细胞的百分率均明显降低，CD8细胞百分率明显增高，差异均有显著性（P
3 讨论
检测外周血T淋巴细胞亚群及其比值是反映机体细胞免疫状态的重要参数之一[3]。我们应用流式细胞仪检测了BCC患者的外周血T淋巴细胞亚群，并与健康正常对照组比较，发现BCC患者CD3、CD4、CD4/CD8值及NK细胞百分率明显低于对照组，而CD8却明显高于对照组，差异均有显著性。BCC患者CD3、CD4细胞降低和CD8细胞的增高，再次证实BCC患者细胞免疫功能有明显下降，且以免疫抑制现象和自身免疫监视能力下降为突出，与我们以前的研究结果相符[2]，其与BCC的发生、发展和转归有关。
微波治疗BCC时，在微波能量较高时，可使蛋白质变性、凝固、坏死，从而达到去除病灶的目的，且其能有效地解决创面出血的问题，便于在治疗过程中观察病变组织是否清除“干净”[3]。此外，热疗能加快局部血液循环及代谢，提高局部免疫力，有利于伤口愈合。值得我们关注的是微波治疗后BCC患者的CD4细胞百分率、CD4/CD8的比值和NK细胞的百分率均明显上升，CD8细胞百分率明显下降。提示微波治疗BCC除了物理治疗作用外，还有可能是通过提高机体的免疫功能途径来实现治疗效果。与以往采取的手术、放疗、化疗及免疫治疗等传统治疗方法相比，微波疗法具有经济、方便、安全、可靠、美观及促进创面恢复和增强患者细胞免疫功能等优点，值得临床推广应用[1，3]。
[参考文献]
[1]孙乐栋，江丽芬，刁友涛，等.微波治疗基底细胞癌疗效观察[J].临床皮肤科杂志，2004，33（7）：446.
篇5
【关键词】鼻腔NK/T细胞淋巴瘤；放化疗；护理
【中图分类号】R47 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0293-02
鼻腔NK/T细胞淋巴瘤是除韦氏环外[1]中国最常见的结外非霍奇金淋巴瘤之一，占全部恶性淋巴瘤的2%--10%[2]。鼻腔NK/T细胞淋巴瘤有超出鼻腔侵犯邻近组织和器官的倾向，病情进展快，治疗上多根据不同的分期合理选用放化疗为主的综合治疗方案。我院自2000年1月至2010年12月共有60例确诊鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者在放疗科行放化疗综合治疗，现就临床中的护理干预措施报告如下：
1 资料和方法
1.1 一般资料 60例鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者，其中男性39例、女性21例，男性多于女性，男女比例为2∶1，年龄15～75岁，平均45岁， 病程3～20个月，平均病程4个月。病变局限于鼻腔者41例，超出鼻腔累及邻近结构者19例。
1.2临床表现 首发症状常为鼻塞、流稀黄水样涕，病人误以为“感冒”、“鼻炎”而未引起注意。后期出现持续鼻塞、血涕、鼻臭、头痛等，很多病人至此就诊。病情进一步发展，常有一个以上病变部位受累，可因累及鼻旁各部位而出现咽痛、面部肿胀、鼻咽部肿块等。全身症状常有发热，一般在38℃以上，伴体重下降、疲倦等，部分病人可出现噬血细胞综合症，以发热、全血细胞减少、骨髓中出现吞噬血细胞的组织细胞及肝功能迅速衰竭为特点，是病人死亡的一个重要原因。本组患者主要临床表现为进行性鼻塞45例，涕血30例，鼻及鼻窦部隆起25例，恶臭15例，颈部淋巴瘤肿大12例，硬腭溃烂穿孔8例，鼻黏膜糜烂坏死20例。
1.3治疗方法：全组60例中，4例Ⅰ期患者行手术切除后行放化综合治疗，51例确诊后行放化综合治疗，5例单纯放疗。放射治疗方法：医生根据患者的肿瘤情况，在模拟机定位下确定照射野，原发灶采用高能χ线或电子线照射，以鼻前“凸”字野或“L”型野为主，辅以单或双侧耳前野，肿瘤累及后鼻孔和/或鼻咽、颈部淋巴结者用面颈联合野放疗，照射30～36Gy后改野保护脊髓加量放疗，颈部淋巴结受侵时采取颈部切线野照射。靶区总剂量50Gy，单次剂量为180～200CGY，5次/周。化疗方法：一线化疗方案多采用CHOP（环磷酰胺、吡柔比星、长春新碱、泼尼松）为基础的联合化疗，55例行CHOP方案，CHOPE或MAcop-B等方案化疗2-6周期，其中30例放化疗同时进行，20例先放疗后化疗，10例先化疗后放疗。
2 护理
2.1心理评估与护理
护士为患者进行心理护理是非常重要的，因为有了战胜病魔的信心，才可能有奇迹出现。患者入院后要及时进行心理评估并给予相应的护理措施。
2.1.1 怀疑心理：患者一旦得知自己患了癌症，立即坐立不安，多方求证，心情紧张，猜疑不定。因此，医务人员应言行谨慎，要探明患者询问的目的，科学而委婉地回答患者所提的问题，不可直言，减轻患者的受打击程度，以免对治疗失去信心。
2.1.2恐惧心理：患者确切知道自己患有癌症，常表现为害怕、绝望，失去生的希望，牵挂亲人。护士应同情患者，给予安慰，鼓励患者积极接受治疗，以免贻误病情，并强调心理对病情的作用，鼓励患者以积极的心态接受治疗。
2.1.3悲观心理：证实自己患癌症时，会产生悲观、失望情绪，表现为失望多于期待，抑郁不乐，落落寡欢。此时护士应给予关怀，说明疾病正在得到治疗，同时强调心情舒畅有利于疾病预后。
2.1.4认可心理：患者经过一段时间后，开始接受自己患有此病的事实，心情渐平稳，愿意接受治疗，并寄希望于治疗。护士应及时应用“暗示”疗法，宣传治疗的意义，排除对治疗的不利因素，如社会因素、家庭因素等。
2.1.5失望或乐观心理：因为个人的体质和适应程度不一样，治疗效果也不尽相同，有的患者病情得到控制，善于调适自己的心情，同时生活在和谐感情的环境中，患者长期处于一种乐观状态。有的逐渐恶化，治疗反应大，经济负担重，体力难支，精神委靡，消极地等待死亡。护士对消极的患者要分析原因，做好心理安慰，及时调整患者的心态，做好生活指导；对乐观的患者，要做好康复指导。留心观察心理变化，以便发现问题及时解决。另外，护士也要有娴熟的护理技术和良好的心理品质，使患者感到心理满足，情绪愉快。护士要富有同情心，冷静热情，耐心和果断，有敏锐的观察力，对不同年龄、性格和地位的患者应一律平等，公平公正，取得患者的信赖建立良好的护患关系，善于谅解患者的过失，不与患者顶撞，宽宏大量。在语言上，应亲切耐心，关怀和体谅，语气温和，交谈时要认真倾听，不随意打断，并注意观察病情，了解思想，接受合理建议。在交谈过程中，要注意保护性语言，对患者的诊断、治疗和预后，要严谨，要有科学依据，切不可主观武断，胡乱猜想。
2.2 放化疗前的护理干预措施
篇6
【关键词】
宫颈癌；外周血T淋巴细胞；NK细胞检测；临床意义
The Clinical significane of peripheral blood T lymphocytes and NK cells in cervical cancer patients
WANG Hongning.
Zongnan Womens Hospital, Chengdu 610041, China
【Abstract】 Objective To investigate peripheral blood T lymphocytes in patients with cervical cancer and NK cells and its clinical significance Methods From Jan.2009 to Jan.2011,214 cases of cervical cancer patients were admitted, selected over the same period 200 cases of physical examination (medical group), peripheral blood T lymphocytes and NK cells were detected and compared Results The cervical cancer group and medical group significant difference(P
【Key words】
Cervical cancer；Peripheral blood T lymphocytes；NK cell detection；Clinical significance
T细胞亚群是反映细胞免疫功能的重要指标之一，肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫功能，特别是与T淋巴细胞功能有密切的关系，在肿瘤免疫监测中起着重要的作用［1］。而肿瘤患者以T细胞介导的细胞免疫存在不同程度的紊乱与缺陷。宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康，近年来其发病率有明显上升趋势，我们对宫颈癌患者外周血T淋巴细胞及NK细胞进行检测，了解其临床意义，具体汇报如下。
1 资料与方法
11 一般资料 选取2009年1月至2011年1月收治的宫颈癌患者214例，年龄38~71岁，平均658岁。所有病例检测前均未经放疗或化疗。依据《新编常见恶性肿瘤诊治规范》
对214例宫颈癌患者(宫颈癌组)进行肿瘤分期，Ⅰ期102例，Ⅲ期68例，Ⅲ期30例，IV期14例。选取同期进行健康体检200例(体检组)，进行外周血T淋巴细胞及NK细胞检测两组在年龄上比较，差异无统计学意义，具有可比性。
12 检测方法 仪器和试剂荧光标记单克隆抗体：鼠抗人CD3PC5/CD4FITC/CD8PE三色标记和同型对照鼠抗人IgG1PC5/IgGlFITC/IgGPE均购自法国Immunotech公司。BeckmanCouIter EPICS XL型流式细胞仪购自美国BeckmCruIter公司。采集晨起空腹新鲜抗凝静脉血2 ml，肝素抗凝；取外周血100 μl，加入上述单抗20 μl，混匀，室温避光20 rain染色；加入15 ml红细胞裂解液，混匀后室温避光放置10 min，破坏红细胞；1 500 r/min离心5 min，弃上清；每管加入2 ml 01％叠氮钠的磷酸盐缓冲液混匀，1 000 r/rain离心5 min，弃上清；加PBS 1 ml，混匀，2 h内上机检测。FCM激光为冷亚激光，波长488 nm，采用flowcheck调整光路，用同型对照
调电压，以SSC为横座标，FSC为纵座标，构建散点图，在散点图上采用设门技术分析淋巴细胞群中CD+3，CD+3CD+4和CD+3CD+8抗原表达情况，每份标本计数1×105细胞。
13 统计学方法 使用SPSS 130统计学软件进行统计学分
析，因数据不符合正态分布，故采用秩和检验，P
2 结果
对两组病例进行外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测，观察体检组、宫颈癌组(Ⅰ期 、Ⅲ期、 Ⅲ期、IV期)变化并比较，具体见表1.
表1
3 讨论
机体的免疫系统是在生物进化中逐步建立起来的，其存在与功能的正常建立在机体稳定性的基础上。在正常情况下，机体的自身免疫功能可以防御病原微生物的侵袭，消除体内损伤或变老的自身细胞，处理体内出现的少量异常细胞。在抗肿瘤免疫中，细胞免疫占据着重要的地位。细胞免疫应答主要是T细胞介导的特异性细胞免疫，已证明T细胞具有有效的抗肿瘤作用［2］。对于T淋巴细胞和NK细胞等细胞免疫的主要效应细胞的研究已经成为现代肿瘤免疫学研究的重点。
胸腺依赖性淋巴细胞即T淋巴细胞又是细胞免疫系统的关键组成部分。机体内的T淋巴细胞能识别肿瘤细胞，在接受肿瘤细胞刺激后，转化为能攻击和杀伤肿瘤细胞的致敏淋巴细胞，有着免疫监视机能。一旦这种监视机能遭到破坏，患肿瘤的危险就将增加。
CD+3抗原分子通常分布在成熟T细胞表面，故CD+3T细胞数量可代表机体总T细胞数量，而CD+4T细胞通常代表T辅助细胞，CD+8T细胞通常代表T抑制细胞，CD+4/CD+8比值反映了机体细胞免疫功能状态是否稳定，比值降低代表细胞免疫功能降低。NK细胞是在肿瘤早期发挥作用的效应细胞，不需要预先接触抗原，无组织相容性复合体(MHC)限制性，不依赖抗体或补体即可直接杀伤MHCl类基因表达低下或缺如的肿瘤细胞，被称为抵抗肿瘤生长的第一道防线，其表面标志是CD+16CD+56［3］。
宫颈癌患者的T细胞亚群与正常人相比，当具有免疫反应活性的CD+4细胞减少，而具有免疫抑制功能的CD+8细胞升高时，可能引起机体的免疫平衡失调，造成恶性肿瘤患者的免疫功能减退或受到肿瘤细胞产生大量的免疫抑制因子(TDSF)，可广泛抑制杀伤细胞的活性，同时在肿瘤抗原的刺激下，脾细胞免疫抑制细胞前体被激活，分泌免疫抑制因子，造成宫颈癌患者免疫功能低下［4］。NK细胞在杀伤肿瘤细胞的过程中消耗了大量的NK细胞，以及TDSF使NK活性降低，NK细胞在血液循环中再分布等原因导致宫颈癌患者NK细胞降低［5］。
通过对两组进行观察宫颈癌患者的T细胞亚群与正常人相比差异有统计学意义，CD+4细胞减少、CD+8细胞升高。并且随着宫颈癌患者病情的发展，Ⅰ期 、Ⅲ期与Ⅲ期、IV期外周血T淋巴细胞及NK细胞的检测比较差异有统计学意义（P
参考文献
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篇7
【关键词】鼻腔NK/T细胞淋巴瘤；放射治疗；皮肤过敏
放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，约70%的肿瘤患者需要进行放疗[1]。但放射治疗是一把双刃剑，在治疗肿瘤的同时也会对周围正常组织造成损伤。在放疗过程中，随着放射剂量的增加，患者照射野皮肤因放射线的影响会出现一定的放射性反应。急性放射性皮炎是放射治疗中常见的并发症，约占头颈部恶性肿瘤放疗患者中的90%以上[2]。但非照射野部位出现皮肤过敏的报道较少。
我科于2012年6月收治了一例鼻腔NK/T细胞淋巴瘤患者，在放射治疗过程中，2次出现照射野皮肤（颜面部、鼻翼）及非照射野皮肤（颈部、胸部、右上肢）皮肤过敏（皮疹、渗液、破溃、结痂），通过治疗与护理，患者住院70天，好转出院。现将护理体会报告如下。
1病例介绍
患者女性，36岁，鼻腔NK/T细胞淋巴瘤，于2012年3月至5月在外院行4周期“健择+培门冬酶”方案化疗，具体“健择1.2g，第1、8天静滴”过程顺利，出现Ⅲ°骨髓抑制，经对症治疗恢复正常，化疗完毕复查鼻咽MRI：鼻腔病变较前明显缩小，双侧咽喉淋巴结较前稍缩小，鼻咽、颅底未见明显异常。建议行局部补量放疗DT56Gy，于2012年6月11日为行放射治疗而来我院就诊。实验室检查：白细胞2.5×10^9/L：中性粒细胞0.9×10^9/L：红细胞3.27×10^12/L：血红蛋白99g/L：血小板136×10^9/L：肝功能示：谷丙转氨酶41U/L：谷草转氨酶55U/L：肾功能，电解质，心肌酶，免疫球蛋白基本正常范围，EB病毒阴性，大小便常规正常。无放疗禁忌症，予设野放疗，因患者鼻腔及咽后淋巴结均有病灶，采用三维适形调强放疗，靶区为鼻腔、筛窦、患侧上颌窦、鼻咽、上腭、咽后淋巴结等部位，因放疗范围较大，皮肤、口咽反应会较重，放疗期间加强健康教育嘱患者做好皮肤、口腔、饮食护理。保持放射野皮肤清洁干燥，避免刺激，充分暴露颈部皮肤，不要穿质硬的高领衣服，勿用肥皂、刺激性药物等，给予皮肤防护剂外涂。嘱患者保持口腔清洁，勤漱口，予维生素B12注射液20mg+0.9%NS250ml注射液含漱。放疗至10次，剂量为PTV18Gy，PGTV20Gy时，患者诉稍口干，鼻腔干燥，放疗野皮肤色素轻度沉着；放疗至18次，剂量为PTV32.4Gy，PGTV36Gy时，患者诉咽喉及鼻腔干燥，疼痛不适，口腔黏膜反应Ⅱ级，皮肤色素沉着；放疗至22次，剂量为PTV39.4Gy，PGTV44Gy，放疗野范围鼻翼及两侧皮肤出现皮疹，呈片状，瘙痒，予抗过敏药物治疗。次日，症状未缓解，患者颜面部、颈部、胸部及右上肢均出现片状皮疹，其中颜面部、鼻翼皮疹反应较大，皮肤红肿，眼睑水肿，皮温升高，出现渗液、破溃。予抗过敏、保肝药物治疗及皮疹清洗、换药护理，暂停放疗。10天后患者皮疹消退，局部结痂已脱落，恢复放疗。放疗次日，颈部皮肤再次出现红疹，给予抗过敏治疗后能顺利完成治疗。患者病情好转，于2012年8月20日出院。
2护理
2.1病情观察29/7患者放疗至22次，剂量为PTV39.4Gy，PGTV44Gy，照射部位急性放射损伤表现为放射性皮炎2级：为色素沉着，皮肤稍有色素沉着，微黑，有时瘙痒[3]。咽喉及鼻腔干燥，疼痛不适，口腔黏膜反应Ⅱ级。鼻腔咽喉干燥疼痛主要为放疗皮肤黏膜反应，遵医嘱予地塞米松及核黄素减轻反应治疗，同时使用核糖核酸提高免疫治疗，配合放疗顺利进行。30/7护士晨间交接班时，患者诉放疗野范围出现皮疹，瘙痒较明显，查体：生命征平稳，鼻翼及两侧皮肤可见片状皮疹，略高出皮肤表面，皮疹无化脓点，局部皮肤无红肿，皮温不高。医师查房后指出：患者放疗中，抵抗力较差，容易发生过敏等症状，遵医嘱给予盐酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康复新液10ml含服，复方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，抗过敏药物治疗。效果无明显好转，31/7患者颜面部、颈部、胸部及右上肢出现片状皮疹，颜面部及鼻翼两侧皮肤红肿，眼睑水肿，皮温升高，有灼热感，出现渗液、破溃，有少许黄色分泌物流出，伴轻度瘙痒。查白细胞3×10^9/L，中性粒细胞比率65.9%：淋巴细胞比率16.9%，红细胞3.55×10^12/L，血小板180×10^9/L，患者白细胞稍低，因患者目前皮炎较重，故暂时不予升白治疗，定期复查血常规。肝功能：谷丙转氨酶10U/L：谷草转氨酶17U/L：碱性磷酸酶48U/L：亮氨酰转肽酶11U/L：谷氨酰转肽酶11U/L：胆碱脂酶8150IU/L：提示肝功能正常。遵医嘱给予维生素C注射液3g、维生素B6注射液100mg+0.9%NS100ml注射液；复方甘草酸苷注射液60mg+0.9%NS250ml注射液；地塞米松磷酸钠注射液5mg+0.9%NS100ml注射液；西咪替丁注射液0.6g+0.9%NS100ml注射液，50滴/min静脉滴入1次/d，螺内酯0.4g，3次/d口服等保肝治疗。治疗过程中严密监测患者病情变化，3d后患者颜面部、颈部、胸部及右上肢的片状皮疹明显消退，颜面部皮肤见散在分布皮疹，无渗出液，结痂基本脱落，颜面部肿胀明显好转，无瘙痒。7d后患者颜面部皮疹基本消退，无渗出，局部结痂已脱落，右上肢皮疹减少，无瘙痒，无发热。第10d遵医嘱给予再次放射治疗，剂量为，次日查房，患者主诉今日颈部皮肤再次出现红疹，较昨日增多，不排除患者对放射线过敏，继续给予抗过敏治疗后能顺利完成治疗。病情好转，于8月20号出院。
2.2皮疹护理患者放疗期间颜面部、颈部、胸部及右上肢出现片状、大小、形态不一的淡红色皮疹，颜面部及鼻翼两侧皮肤红肿，有少许黄色分泌物流出，眼睑水肿，皮温升高，有灼热感，伴轻度瘙痒，无发热。严密观察病情变化，特别是观察：是否有新发生的皮疹，部位、范围、程度、时间、数量，速度、瘙痒、疼痛程度及其他过敏症状。①遵医嘱给予盐酸西替利嗪片5mg，氯雷他定分散片10mg，康复新液10ml含服。②护士用无菌医用棉签取复方地塞米松乳膏涂擦皮疹部位，2-3次/d。③加强健康教育，指导患者选择棉质、柔软的衣服及毛巾，可用32-34°C温水进行皮肤擦浴（颜面部及鼻翼两侧皮肤有分泌物处禁止擦洗），动作轻柔，忌用碱性肥皂等洗剂。④颜面部及鼻翼两侧皮肤给予0.9%NS清洗分泌物3次/d。⑤给予修剪指甲，并告知患者不要抓挠皮疹，防止皮疹感染，同时观察患者皮疹消退情况，10d后患者皮疹消失未留下瘢痕。
2.3心理护理患者从发病到确诊及化学、放射治疗阶段辗转了全国4所医院，其经历了复杂的心理变化。焦虑、抑郁等消极情绪反应，加之放射治疗导致的患者皮肤过敏损伤，当出现皮肤破溃后，患者表现为更加焦虑、恐惧、悲观，对放射治疗产生了强烈的焦虑、恐惧心理，怀疑疾病治疗和护理的有效性，进而自信心下降，自我认同出现障碍。因此，我们与患者及家属及时沟通，对其皮肤反应请皮肤科专家给予会诊，并让患者及家属参与到治疗中来，有助于消除患者紧张、恐惧感，使患者得到家庭温暖和情感上的支持，增加安全感。给予优质护理，与患者建立良好的护患关系，增强患者的信任感。加强巡视，严密观察病情变化，做好各项护理记录，及时告知治疗护理过程中好转的信息，让患者振作起来以乐观积极心态配合治疗。
2.4出院时健康指导患者出院前心理既觉得治疗终于结束，熬出头了，但又担心治疗的效果及预后，开心同时又焦虑。我们给患者和家属进行健康宣教。①预防感染患者放疗后会出现骨髓抑制，机体抵抗力下降，很容易感染，嘱患者必须注意保暖，预防感冒。进食高蛋白、高维生素、高热量的食物。②皮肤护理嘱患者需保护好照射野皮肤，避免冷热刺激，如热敷冰袋等，外出防止日光直接照射，局部皮肤不要用手搔抓，皮肤脱屑切忌用手撕剥，平时不能用手抠鼻及用力挤鼻。③口腔护理头颈部病人放疗后唾液腺分泌少、质变粘稠、口腔酸度增加，口腔自洁能力下降利于细菌繁殖，多存在口腔黏膜充血、口臭、咽痛、声嘶。护理措施是保持口腔清洁，可用淡盐水（500ml温开水加熟盐3-4g）或碱性漱口液饭前、饭后漱口，稀释口腔内有害菌群浓度。用软毛牙刷及含氟牙膏刷牙。若口干，可常使用滋阴生津药物，如使用金银花、、麦冬等泡茶饮用。④告知患者一个月后按时复查，患者来院复查时，照射野皮肤恢复正常，无红肿、瘙痒。
3讨论
鼻腔NK/T细胞淋巴瘤是一种特殊类型的恶性淋巴瘤，其瘤组织常侵犯鼻腔、上呼吸道和消化道，进展较快，预后差，5年生存率小于50%。放射治疗仍然是治疗鼻型NK/T细胞淋巴瘤的主要手段，但放射治疗会使患者发生不同程度的放射性皮炎，发病机理为受照射部位皮肤发生毛细血管反应性扩张，局部充血，出现红斑、色素沉着及干性脱屑[4]。发生放射性皮炎的部位为照射野及对穿射线辐射到范围，而全身皮肤出现对射线反应导致皮肤过敏的反应较少，考虑外因由放射治疗致皮肤受损引起，内因为过敏体质，个体差异，免疫系统不平衡，与患鼻腔NK/T细胞淋巴瘤导致免疫力下降有关。当人体免疫功能和皮肤新陈代谢紊乱时，外界刺激会对皮肤造成严重的伤害，这时皮肤就会变薄，而且释放大量的组织胺，导致皮肤泛红、红肿、瘙痒、脱皮等。由于放射性皮炎复杂的发病机制，做好患者放射野皮肤的护理，是减轻放射性皮炎的最关键环节[5]。在患者放疗期间给予优质、精心护理，能降低并发症的发生率，使病人顺利完成全程放疗。
参考文献
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篇8
【摘要】
本研究探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的优化技术。先用miniMACS及阴性免疫磁珠分选方法，从外周血单个核细胞（PBMNC）得到纯化的NK细胞，随后在干细胞培液基条件下，通过IL2、IL12和IL15等细胞因子的不同组合将培养体系分为IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组和对照组（不加任何细胞因子），分别培养15天，每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后（CD3-CD56+）NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组在不同效靶比下的杀伤率。结果显示经：miniMACS阴性免疫磁珠分选后（CD3-CD56+）NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除对照组（CD3-CD56+）NK细胞纯度略下降外，其余4组与扩增前无显著性差异（P＞0.05）。在IL2、IL2+IL12、IL2+IL15、IL2+IL15+IL12培养体系中， NK细胞扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01），但IL2+IL15与IL2+IL15+IL12组间未见显著差异（P＞0.05）。各组扩增的NK细胞对K562细胞的杀伤率均较扩增前增强，在不同效靶比下IL2+IL15、IL2+IL15+ IL12组对K562细胞的杀伤率显著高于其他组，但两组间无显著性差异（P＞0.05）。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量NK细胞后，应用IL2+IL15培养条件是获得高纯度NK细胞的简单有效方法。
【关键词】 NK细胞； miniMACS； 白介素2； 白介素12； 白介素15
Ex Vivo Expansion of Highly Purified NK Cells from Human Peripheral Blood
Abstract
Adoptive immunotherapy using allogeneic natural killer (NK) cells provides to be useful in recipients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AlloHSCT)， but its application has been limited by the inability to obtain sufficient numbers of pure NK cells. This study was aimed to optimize the expansion of high purity NK cells from human peripheral blood. First， the NK cells were isolated from PBMNC by using miniMACS (magnetic cellselection) and NK Cell Isolation Kit Ⅱ. Then the isolated cells were cultured in SCEM (Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium， Sigma) supplemented with 10% human AB serum and different combinations of IL2 and/or IL12， IL15 for 15 days. Cultures were fed with fresh media and cytokines every 3 days， and were evaluated for cell expansion， phenotype， and cytotoxicity at the end of the culture period. The results showed that in group IL2+IL15 and IL2+IL15+IL12， cells were expanded 50.46±4.31 and 52.35±6.72fold respectively， much higher than others（P＜0.01)， but no significant difference between themselves (P＞0.05). And the purity of CD3-CD56+ NK cells was over 94% in all groups except the control. The cytotoxicity of expanded NK cells cultured with cytokines was significantly higher than the starting population at different E:T ratio（P＜0.01)， although the cytotoxicity of IL2+IL15+IL12 group was slightly higher than that of IL2+IL15 group， but no significant difference between themselves (P＞0.05). It is concluded that high purity of NK cells can be efficiently expanded in culture with IL2+IL15.
Key words
natural killer cell; miniMACS ; IL2， IL12， IL1
NK细胞作为机体固有免疫的重要组成部分是机体抗肿瘤、抗感染的第一道天然防线。随着对NK细胞生物功能及活化机制的了解，NK细胞在造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫治疗方面的作用倍受关注。最近在异基因造血干细胞移植中发现供者异源反应性NK细胞可以发挥移植物抗白血病(graftversusleukemia，GVL)效应，并减少移植物抗宿主病(graftversushost disease，GVHD)的发生［1-3］，故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植辅助治疗的新策略［4，5］。然而，外周血中NK细胞含量少（约占淋巴细胞的5%-7%），且目前尚缺乏有效的体外扩增体系，所以NK细胞的广泛临床应用受到了限制。目前的许多体外研究均显示IL2、IL12、IL15对促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。本研究从方法学角度探索提高NK细胞纯度并采用IL2、IL12、IL15等细胞因子的不同组合，以期优化NK细胞体外扩增的效率及纯度，为NK细胞的进一步临床应用奠定基础。
材料
NK细胞分选试剂盒（NK Cell Isolation Kit Ⅱ，包括荧光标记抗体、磁珠）及miniMACS磁珠分选系统、分离柱（MS Column）均购自德国美天意公司（Miltenyi Biotec，Germany）。造血干细胞扩增培养基(Stemline Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium，SCEM)为Sigma公司产品，RPMI 1640培养液为Gibco公司产品。人AB血清购自杭州四季青生物制品公司。IL2、IL12、IL15为Cytolab公司产品。左旋谷氨酰胺（Lglutamine）为 Sigma公司产品。流式细胞仪及荧光抗体FITCCD3、PECD56、FITCIgG1、PEIgG1均为Becton Dickinson公司产品。CCK8 试剂盒（Cell Counting Kit8，新型细胞检测MTT法改良试剂）购自日本同仁化工。K562细胞为我科实验室长期保存。外周血来源于我院健康献血者。
外周血采集与单个核细胞分离
健康献血者10名，采集肘静脉外周血20 ml，肝素抗凝，用PBS等体积稀释后，用淋巴细胞分离液以密度梯度离心法分离得到单个核细胞（PBMNC），PBS洗涤1次。
NK细胞分离纯化
将上述PBMNC用溶红素处理，然后用MACS buffer洗涤1次，血细胞计数板计数。每107个细胞重悬于40 μl MACS buffer，加入10 μl NK cell biotinantibody cocktail，4-8℃孵育10分钟，然后依次加入30 μl MACS buffer、20 μl antibiotin micro beads，4-8℃孵育15分钟，再次用MACS buffer洗涤标记好的细胞，重悬于500 μl MACS buffer中。选用MS分离柱，安放于miniMACS分离器磁场中，使用前润湿分离柱，将分离柱放置于合适的细胞收集管上。将细胞悬液上柱，用3×500 μl MACS buffer洗柱，收集细胞。纯化前后计数单个核细胞，并以CD3、CD56荧光标记抗体分析NK细胞数，计算细胞回收效率和纯化效率。
细胞培养
将分离纯化的NK细胞加入含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺、青、链霉素（各100 U/ml）及细胞因子的SCEM培养体系内，调至细胞终浓度2×105/ml，然后接种于24孔板，每孔终体积为1 ml；培养体系按细胞因子的不同组合分为4组： A组：IL2（200 U/ml），B组： IL2(200 U/ml)+IL12(10 ng/ml)，C组：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)，D组：IL2(200 U/ml)+IL15(20 ng/ml)+IL12(10 ng/ml)，E组：不加任何细胞因子为对照组。每组复种3孔，置37℃、5% CO2、饱和温度培养箱中培养，每3天半量换液并全量补充上述细胞因子。于培养第0、5、10、15天通过台盼蓝染色法计数并检测细胞活性。
免疫表型分析
将取自不同来源的细胞用荧光抗体CD3FITC、CD56PE标记，流式细胞仪检测及分析，了解NK细胞纯度。
白血病细胞系的培养
K562细胞种于含有10%FCS的 RPMI 1640培养体系中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。
NK细胞杀伤活性检测
收集对数生长期K562细胞及培养第0、15天NK细胞。以K562细胞为靶细胞，调整细胞密度为1×105 /ml；NK细胞为效应细胞，根据不同效靶比分别调整细胞密度为1×105 /ml、5×105 /ml、1×106 /ml。按不同效/靶比（1∶1、5∶1、10∶1 ）将效应细胞与靶细胞混合，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养12小时后每孔加入10 μl CCK8（ Cell Counting Kit8：新型细胞检测MTT法改良试剂），混匀，于37℃、5% CO2培养箱中继续培养4小时后用酶标仪测定每孔450 nm波长处的OD值。细胞毒活性的计算方法：求出3个平行孔的平均值，按以下方法计算NK细胞毒活性，以杀伤率%表示。
细胞毒活性=［1-（效靶细胞作用孔OD值-效应
细胞孔OD值）/靶细胞孔OD值］×100%
统计学处理
所有数据均以（±SD）表示，组间比较采用方差分析，所有统计学分析均采用CHISS 2004统计软件进行。
结
果
NK细胞纯化效率
10名献血者标本显示，2×107个外周血单个核细胞经分选后可获得（2.56±1.23）×106个CD3-CD56+细胞，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%（图1）。
NK细胞增殖情况
各组实验条件下NK细胞计数情况见图2。培养期内台盼蓝染色示细胞存活率均为95%以上。培养前5天，各组细胞增殖均较缓慢；最快增殖时间出现于培养第2周，即第7-15天，此阶段各组培养条件下NK细胞均较培养初期显著扩增。培养至第15天IL2组、IL2+ IL12组、IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组NK细胞的扩增倍数分别为15.43±1.08，19.87±3.87，50.46±4.31和52.35±6.72，均显著高于对照组6.14±1.0（P＜0.01）。IL2+IL15组及IL2+IL15+IL12组细胞的扩增倍数显著高于IL2组、IL2+ IL12组（P＜0.01）。在这10例标本中，IL2+IL15+IL12组虽然曾获得一次最大扩增倍数60.8倍，同时平均扩增倍数也略高于IL2+IL15组，但统计学分析显示它们的扩增效率无显著差异（P＞0.05）。
NK细胞扩增前后免疫表型分析
取自于培养第15天的细胞分别标记CD3、CD56抗体，结果显示在含有细胞因子的4组培养体系中，CD3-CD56+NK细胞纯度均大于94%，与开始培养时（0天）NK细胞纯度无显著差异（P＞0.05）。对照组CD3-CD56+NK细胞纯度为83.26±6.39%，较其余各组及培养初始时略有下降（P＜0.05）（图2）。
NK细胞对K562细胞的杀伤作用
分别比较培养15天后各细胞因子组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞（E0组）对K562细胞的杀伤率的变化。如图3所示：各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且NK细胞对K562 细胞的杀伤活性呈C组≈D组（P＞0.05）＞B组＞A组＞E组（P＜0.01）。随着效靶比从1∶1、5∶1到10∶1，各组NK细胞对K562细胞的杀伤率均逐步提高（P＜0.01）（图3）。
讨
论
目前的研究证实，NK细胞是造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及抗肿瘤免疫中非常有应用价值的效应细胞之一。尤其在造血干细胞/骨髓移植方面，许多的动物实验和临床观察均提示异基因造血干细胞移植后，供者的异源反应性NK细胞可促进植入，阻止T细胞介导的GVHD，攻击宿主白血病细胞发挥GVL效应。故输注供者异源反应性NK细胞已成为临床移植辅助治疗的新策略。如何获得高纯度、足够数量的NK细胞是临床应用的前提条件。虽然国内外有应用ClinMACS直接从供者外周血中分选NK细胞，但用血量大，分选费用昂贵，获得的NK细胞量仍不能满足临床需要，往往需要体外进一步扩增［6］，这些问题均大大限制其临床应用。近年来Carlens［7］、Klingemann［8］、黎阳等［9］国内外学者都曾尝试建立人NK细胞体外扩增体系，但仍存在细胞纯度低、扩增效率不高，应用饲养细胞等问题，这些研究虽然部分的满足了科研的需要，但临床应用问题尚未解决。尤其对于移植免疫中对NK细胞的需要，由于移植前后受者处于特殊的免疫状态中，不同免疫细胞对患者影响不同，故输注时NK细胞的纯度直接关系到输注后的疗效。本研究在前人研究的基础上，先采用miniMACS免疫磁珠分选方法，从正常人外周血中得到高纯度的NK细胞，随后优化NK细胞培养体系进行体外扩增，以降低大量分选NK细胞的昂贵费用。从我们NK细胞分选的实验结果看，流式细胞仪检测NK细胞（CD3-CD56+）含量由分选前的（11.19±5.25）%提高到（94.23±3.50）%，肯定了经miniMACS高梯度磁场的NK细胞阴性免疫磁珠分选方法的分选效果。
进一步优化NK细胞体外扩增体系时，在选用，含有10%人AB血清、2 mmol/L左旋谷氨酰胺的SCEM培养体系基础上，我们又选择细胞因子IL2、IL12、IL15组成不同的组合。文献报道IL2，IL12，IL15均对于促进NK细胞的分化成熟、活化、增殖及细胞毒活性有重要作用。IL2是一种多功能的炎性细胞因子，能够激活NK细胞，诱导NK细胞增殖及细胞因子的产生［10］。IL12最先从人B淋巴母细胞系的培养上清液中发现，它不仅可促进NK细胞的杀伤活性和分泌功能，而且可在体外促进NK细胞的增殖，同时可协同IL2诱导健康成人NK的细胞因子激活的细胞毒作用［11］。IL15在刺激NK细胞增殖及活化等方面与IL2有许多相似性。当然，这与二者都可与IL2受体复合体的β、γ链结合有关。然而，IL15还可结合于1个新的α链，即IL15受体［12，13］，故IL15还在促进造血干细胞定向分化为NK细胞，并对NK细胞的发育分化及维持长期体外存活等方面有显著作用。另外IL2与IL15也具有协同作用。所以，我们根据不同细胞因子组合将培养体系分为4组：IL2组、IL2+IL12组、IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组，以期筛选出最佳组合。实验结果显示：经过15天的培养，与对照组相比，上述细胞因子均能促进NK细胞的体外扩增，并能保持扩增体系中NK细胞的高纯度；其中IL2+ IL12组虽较IL2组添加了IL12，但增殖效果的提高并不明显，同样情况也可在上述分组的后2组中看到，这说明IL12在体外对NK细胞增殖的促进作用远不及IL2，两者结合并不比单独使用IL2更有效，这与前人的一些实验结果吻合；同时在IL2组与IL2+IL15组的比较中我们看到，IL15与IL2的组合大大提高了扩增倍数，由单独使用IL2 时的15.43±1.08倍增至50.46±4.31倍，说明IL15能显著促进NK细胞的体外扩增，并可协同IL2大大提高扩增效率；而IL2+IL15+IL12组在实验中虽然有1例标本获得了最大增值倍数60.8倍，但统计学结果显示其并不比IL2+IL15组有更好的扩增效率。
为了检测所得NK细胞的活性，我们在进一步的实验中分别比较了培养15天后实验组不同扩增体系的NK细胞及其与扩增前的NK细胞对K562细胞的杀伤率的变化。结果各组效靶比与杀伤率呈正比，从1∶1、5∶1到10∶1对K562细胞的杀伤率逐步提高（P＜0.01），这说明在一定条件下，NK细胞杀伤活性存在量效关系。其次，各细胞因子组NK细胞杀伤活性均较扩增前明显增强（P＜0.01），且杀伤活性呈IL2+IL15组≈IL2+IL15+IL12组（P＞0.05）＞IL2+ IL12组＞IL2组＞对照组（P＜0.01）；体外扩增后当效靶比为10∶1时，各组对K562 细胞的杀伤率均在60% 以上，其中IL2+IL15组、IL2+IL15+IL12组接近100%。即使当效靶比1∶1时，这两组NK细胞对K562细胞的杀伤率也从扩增前的17%提高到45%，NK细胞活性显著增强（P＜0.01）。另外结果还显示，虽然IL12可增强NK细胞的细胞毒活性，但其效果略逊于IL2及IL15，尤其后二者的组合可在效靶比为10∶1时达到近乎100%的杀伤率。
总之，经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后，在含IL2(200 U/ml)+ IL15(20 ng/ml)的SCEM（含10%人AB血清的）培养条件下，我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增殖倍数较高的NK细胞，同时培养扩增条件简单，成本较低，为NK细胞用于造血干细胞/骨髓移植的辅助治疗及肿瘤过继免疫生物治疗奠定了良好基础。
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篇9
【摘要】 目的： 研究急性白血病患者外周血T淋巴细胞亚群、NK细胞水平变化及临床意义。方法： 采用流式细胞仪对32例急性白血病患者 (急性髓细胞性白血病23例、急性淋巴细胞性白血病9例)及18例正常人外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞水平进行检测。结果： 初治急性白血病组与正常对照组比较，CD3+细胞、CD4+细胞、CD4+/CD8+比值及NK细胞下降（P0.05）。化疗后12例取得完全缓解，再次检测上述指标接近正常对照组（P>0.05）。初诊急性淋巴细胞性白血病组CD4+细胞及CD4+/CD8+比值低于初诊急性髓细胞性白血病组（P
【关键词】 急性白血病； T细胞亚群； NK细胞
［Abstract］ Objective: To study the changes of T lymphocyte subsets，NK cells in peripheral blood of patients with acute leukemia and its clinical significance.Methods： The different level of peripheral blood T lymphocyte subsets， NK cells of 32 acute leukemia patients and 18 normal controls were detected with flow cytometry. Results： Compared with the normal controls， the number of CD3+ T cell， CD4+T cell， NK cell and CD4+/CD8+ ratio reduced in newly diagnosed acute leukemia group(P0.05).Twelve of 32 patients achieved complete remission after chemotherapy.Their level of T lymphocyte subsets，NK cells near those of normal controls（P>0.05）.The number of CD3+ T cell and CD4+/CD8+ ratio in newly diagnosed acute lymphoblastic leukemia group were lower than those in newly diagnosed acute myelogenous leukemia group(P
［Key words］ acute leukemia; T lymphocyte subsets; NK cell
急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干细胞的恶性克隆性疾病，其发生及发展与机体免疫紊乱有着密切的关系。在抗肿瘤免疫效应中，细胞免疫比体液免疫起着更为重要的作用。T淋巴细胞和NK细胞执行细胞免疫功能，是机体抗肿瘤免疫的重要活性细胞。本文采用流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测急性白血病患者及健康人群外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的水平，并探讨其临床意义。
1 材料和方法
1.1 材 料
32例急性白血病（AL）外周血标本均来自我院住院患者。其中男14例，女18例，年龄15～72岁，中位年龄41岁；急性髓细胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)23例，急性淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)9例。初诊患者分别于化疗前、完全缓解后采集外周静脉血2 ml，枸橼酸钠抗凝。18例正常对照外周血标本采自健康体检者。
1.2 方 法
取100 μl上述抗凝血分别加入4个试管中，每管加入抗CD45PerCP 10 μl。各管再依次加入抗CD3-FITC+CD19-PE、抗CD3-FITC+CD4-PE、抗CD3-FITC+CD8-PE、抗CD3-FITC+CD16CD56-PE各10 μl，避光室温充分结合20 min后，每管加入溶血素2 m1，避光放置至透明后1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液体，加入2 m1 PBS在混合器上使试管底部的细胞与PBS溶液混匀，1 000 r/min离心5 min，最后加入0.4 ml PBS溶液混匀直接上流式细胞仪（美国BD公司）检测。
1.3 统计学处理
应用SPSS12.0处理数据，结果以±s表示，用t检验方法比较各组间差异。
2 结 果
32例急性白血病患者T淋巴细胞亚群及NK细胞的水平变化见表1。由表1可见: 与缓解AL组相比较，初诊AL组外周血CD3+细胞、CD4+细胞、CD16+CD56+细胞及CD4+/CD8+比值降低，差异有统计学意义(P0.05)。初诊AL组与对照组相比较有类似的结果。而缓解AL组外周血CD3+细胞，CD4+细胞，CD8+细胞、CD4+/CD8+比值及CD16+CD56+细胞与对照组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。初治ALL组与AML组相比较，ALL组CD4+细胞及CD4+/CD8+比值低于AML组，两者间差异有统计学意义(P0.05)。表1 急性白血病患者及正常对照组外周血T细胞亚群及NK细胞水平
3 讨 论
机体的细胞免疫异常可使肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，最终发生肿瘤。CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞在体内抗肿瘤免疫中具有重要的作用。
CD4+细胞能辅助T细胞、B细胞活化，后两者活化释放的大量细胞因子能促进CD8+T细胞及吞噬细胞的活性，并影响B细胞抗体的产生，从多方面调节和增强抗肿瘤效应。CD8+细胞常在免疫应答后期增多，除可对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用（ADCC）外，还能识别可溶性抗原，分泌抑制因子，减弱或抑制免疫应答，对CD4+细胞有调节性抑制作用。CD4+/CD8+比例平衡是维持免疫内环境稳定的一个中心环节，是机体免疫网络调控的重要枢纽，反映了机体免疫反应的调节能力［1］。这种免疫平衡紊乱时，可引起继发性免疫缺陷。本组资料分析了32例不同类型急性白血病患者的T淋巴细胞亚群，发现初治AL患者CD3+、CD4+细胞以及CD4+ /CD8+比值明显降低。其他恶性血液病如非霍奇金氏淋巴瘤中有类似的变化［2，3］，在儿童急性白血病中也有类似报道［4，5］。这些提示白血病患者辅T细胞数量或功能低下，机体识别和杀伤白血病细胞的能力下降，与白血病的发生发展有一定的关系。本组资料还提示，化疗后缓解的患者，T淋巴细胞各亚群抗原表达接近正常，细胞免疫功能得到一定程度恢复。通过分析我们还发现，与AML比较，ALL患者CD4+细胞、CD4+/CD8+比值降低程度更显著，提示原发于淋巴系统肿瘤的细胞免疫功能更低下。
CD16+CD56+是自然杀伤细胞（NK细胞）的标志物，表达的量可能与NK细胞的数量或功能有关。NK是重要的天然免疫细胞， 起源于CD34+造血细胞，在骨髓微环境内发育，形成具有免疫活性的成熟型细胞。它不需预先致敏，无MHC限制性，即可自发地杀伤MHC1类分子缺陷或低表达的肿瘤细胞， 具有广谱的抗肿瘤、抗感染、免疫调节等作用，在机体免疫监视过程中发挥重要功能。分析本组资料发现AL患者化疗前CD16+CD56+细胞明显降低，与楼瑾［6］等的研究结果相似，而化疗后完全缓解者CD16+CD56+细胞又恢复到正常水平，进一步说明初发急性白血病NK细胞免疫功能明显受损。
由于初治AL与缓解AL的T淋巴细胞亚群及NK细胞的水平有明显差异，检测T淋巴细胞亚群和NK细胞水平在评价AL疗效及判断预后方面具有一定的临床价值。其临床意义还有待积累更多病例进行深入研究。
参考文献
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篇10
【关键词】 双歧杆菌DNA;，巨噬细胞;，蛋白激酶C;，核因子
Influence of bifidobacterium DNA on PKC and NFκB in murine macrophages
[Abstract] AIM: To explore the influence of DNA of bifidobacteriua adolescence on PKC and NKκB of murine macrophages. METHODS: The fluorescent intensity of PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε and PKCζ in murine peritoneal macrophages was detected by using laser confocal microscope. The density of NKκB+ macrophages was detected by immunocytochemical staining. RESULTS: The average fluorescent intensity of PKCα and PKCβII produced by mouse peritoneal macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P0.05）. The density of NKκB+ macrophages in bifidobacterium DNA injection group was markedly higher than that in control group（P
[Keywords]bifidobacterium DNA; macrophage; protein kinase C; nuclear factorκB
[摘 要] 目的: 探讨青春型双歧杆菌的DNA对巨噬细胞中6种PKC和NFκB的影响。方法: 通过激光共聚焦显微镜观察小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度， 以免疫细胞化学染色法检测巨噬细胞中NFκB+细胞的密度。结果: 双歧杆菌DNA注射组小鼠腹腔巨噬细胞中， PKCα和PKCβII的平均荧光强度明显高于对照组（P0.05）。双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中， NFκB+细胞的密度显著高于对照组（P
[关键词]双歧杆菌DNA; 巨噬细胞; 蛋白激酶C; 核因子κB
双歧杆菌是人体和动物肠道内数量最多的生理性厌氧菌， 能调节肠道的微生态平衡， 也有抗肿瘤、 抗感染和免疫激活等多种重要的功能[1]。目前研究发现， 双歧杆菌的DNA中含有非甲基化的胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序(cytidinephosphateguanosine， CpG DNA)， 可作为免疫刺激序列(immunostimulatory sequence)激活树突状细胞(DC)， 上调其表面分子和共刺激分子(如CD69、 MHCI、 MHCII类分子、 CD80以及CD86等)的表达。同时， 其还能激活NK细胞和B细胞， 使之产生较多量的IFNγ和抗体[2]。此外，其亦可激活巨噬细胞， 增强其吞噬和细胞毒作用， 并分泌较多量的IL1及IL6， 但其具体的作用机制目前仍不清楚[3]。本研究中应用激光共聚焦显微镜和免疫细胞化学染色法， 检测了青春型双歧杆菌的DNA对小鼠腹腔巨噬细胞中PKC和NFκB的影响， 旨在探讨其激活巨噬细胞的信号途径。
1 材料和方法
1.1 材料 BALB/c小鼠， 6~8周龄， 雌雄各半， 体质量为18~23 g， 购于南方医科大学实验动物中心。兔抗鼠PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ， 购自New England Biolab公司。FITC标记的羊抗兔IgG、 兔抗p65抗体和生物素化的羊抗兔IgG， 均购自北京中山生物技术有限公司。溶菌酶和LPS为Sigma公司产品。其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌种来源及其培养 双歧杆菌由本室从健康婴儿粪便中分离培养获得， 经API20A及TAB系统和多次生化反应鉴定为青春型。实验时， 将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中， 置厌氧培养箱， 于37℃培养72 h。将含菌培养液以3000 r/min离心10 min， 去上清， 沉渣以PBS液洗3次， 并调整细菌数为1×1013/L。
1.2.2 双歧杆菌DNA的制备和鉴定 将双歧杆菌接种于硫乙醇酸盐肉汤中， 置厌氧培养箱中于37℃培养72 h。收集细菌， 加入溶菌酶（1 g/L）与SDS（终浓度为10 g/L）裂解菌体后， 用饱和酚抽提去除菌体蛋白并透析。用紫外分光光度计测定所提取的双歧杆菌基因组DNA的A260/A280为1.976。测定DNA的浓度后， 经薄板层析证实，所制备的双歧杆菌DNA中无脂多糖存在， 冷冻干燥后备用[4]。
1.2.3 实验分组及双歧杆菌DNA的处理 实验动物分为两组， 即(1)双歧杆菌DNA注射组: 20只小鼠， 于实验的第1天向小鼠腹腔注射100 g/L硫乙醇酸盐肉汤2 mL， 第2天起腹腔注射双歧杆菌DNA 0.2 μg， 每天1次， 连续5 d。 (2)对照组: 动物的数量及第1天的处理措施均同双歧杆菌DNA注射组， 不同之处为第2天起向其腹腔注射PBS液0.2 mL， 每天1次， 连续5 d。
1.2.4 巨噬细胞的收集及培养 于实验的第7天， 常规消毒小鼠腹部的皮肤， 以冷的Hank’s液灌洗腹腔。洗出液以1000 r/min离心10 min， 去上清， 沉渣以无血清的RPMI1640培养液重悬2次， 并调整细胞数为1×109/L。吸取100 μL细胞悬液加至孔底铺有盖玻片的24孔细胞培养板中， 置37℃、 50 mL/L CO2 孵箱中培养2 h。弃去未贴壁的细胞， 即得巨噬细胞。再加入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液及LPS(终浓度为10 μg/L)， 500 μL/孔， 继续诱导培养24 h。
1.2.5 巨噬细胞PKC含量的检测 通过激光共聚焦显微镜观察PKC的荧光强度反映PKC的含量。具体操作步骤为: ①倾去培养孔内的培养液， 取出爬有巨噬细胞的盖玻片， 滴加3 mL/L H2O2甲醇封闭内源性过氧化物酶活性; ②以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ③滴加100 g/L非特异性牛血清白蛋白， 室温孵育10 min; ④以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑤分别滴加兔抗鼠PKCα、 抗PKCβI、 抗PKCβII、 抗PKCγ、 抗PKCε和抗PKCζ抗体各100 μL， 工作浓度均为1∶200， 于37℃温育60 min; ⑥以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次×5 min; ⑦滴加1∶100 FITC标记的羊抗兔IgG100 μL， 于37℃温育30 min; ⑧以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液充分洗涤5次×5 min; ⑨用激光共聚焦显微镜逐个观察巨噬细胞中的荧光强度。所用激发波长为488 nm， 发射波长为475 nm， 每孔于不同视野计数100个细胞以上， 取其平均荧光值作为定量参数。
1.2.6 NFκB的免疫细胞化学染色 取出细胞培养板孔内爬有巨噬细胞的盖玻片， 以0.01 mol/L PBS(pH7.2)液洗涤3次， 干燥。染色程序按免疫细胞化学SP法常规进行。一抗为兔抗p65抗体， 二抗为生物素化的羊抗兔IgG。以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.2.7 观察指标及统计学处理 对每张盖玻片以16D目镜测微网在400倍放大下计数网格中细胞核着色的阳性细胞数， 每例计数10个网格， 取其均值作为该样本中NFκB+细胞的密度， 以t检验行统计学处理。其余各组间的比较也采用t检验。
2 结果
2.1 巨噬细胞中6种PKC含量的检测 以激光共聚焦显微镜观测巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的荧光强度。结果显示， 小鼠腹腔巨噬细胞被青春型双歧杆菌的DNA刺激后， 其PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组（P0.05， 表1、 图1）。
表1 巨噬细胞中PKCα、 PKCβI、 PKCβII、 PKCγ、 PKCε及PKCζ含量的检测 略
图1 小鼠腹腔巨噬细胞中PKCα表达的激光扫描共聚焦显微镜观测 略
2.2 双歧杆菌DNA对巨噬细胞中NFκB表达的影响 NFκB主要是由p50和p65组成的异源二聚体。实验用兔抗p65抗体作为免疫细胞化学染色中的一抗， 其结果即可反映NFκB的存在。实验结果中， NFκB阳性产物表现为黄褐色颗粒状物。双歧杆菌的DNA注射组巨噬细胞中， NFκB阳性产物存在于胞浆和胞核， 但以胞核为主， 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（17563±1020）个; 对照组巨噬细胞中NFκB的阳性产物主要位于胞浆， 其胞核上NFκB阳性产物的密度为（8398±764）个， 两组比较差异具有统计学意义(P
3 讨论
PKC是结构相近、 依赖钙、 磷脂和二酰基甘油激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的多基因超家族，对细胞生长和转化的调节起重要作用。目前已阐明， 很多巨噬细胞的激活剂均能使其胞内PKC的浓度上升。Lin等[5]证实， UTP可激活小鼠RAW264.7巨噬细胞， 提高磷脂酶A2及花生四烯酸的水平依赖的磷酯酰胆碱磷脂酶 C（PIPLC）的活化以及胞内[Ca2+]i浓度的升高， 并证实 PKC的激活亦参与了这一过程。Kumar等[6]报道， 催乳素能激活小鼠腹腔巨噬细胞，使之分泌大量的IL1和NO， 其机制主要是激活PKC。Shishodia和Um等[7， 8]则分别报道， 顺铂和II 型肺炎链球菌细胞壁多糖能激活巨噬细胞， 产生多量的TNFα， 这一过程需要PKC的活化。本研究表明， 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞中PKCα和PKCβII的荧光强度明显高于对照组; 而PKCβI、 PKCγ、 PKCε及PKCζ的荧光强度在两组间无统计学意义， 提示青春型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞中的PKCα和PKCβII; 而对PKCβI、 PKCγ、 PKCε和PKCζ的活性无明显影响。静息状态下， NFκB的同源或异源二聚体与抑制性蛋白IκB结合而存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时， 可通过信号转导激活IκB激酶（IKK）， 导致IκB发生磷酸并被降解， 于是NFκB释放出来并被激活， 接着发生核易位， 和靶基因的特定位点相结合， 从而调控靶基因的转录。已知NFκB的活化是巨噬细胞的激活机制之一。von Knethen等[9]发现， 亚致死量的H2O2 能活化小鼠 RAW264.7巨噬细胞中的NFκB， 进而增强环氧合酶 2 的表达。Darieva等[10]证实， BCG能激活小鼠J774巨噬细胞， 使之分泌多量的IL6、 NO 和TNFα等具有杀瘤活性的效应分子， 其机制主要是增强NFκB DNA的结合。Liu等[11]报道， 乳酸杆菌细胞壁中的肽聚糖（peptidoglycan， PG）可作用于小鼠RAW264.7巨噬细胞的Tolllike 受体2(Tolllike receptor 2， TLR 2)， 进而激活NFκB， 最终增强其细胞毒活性。Mandrika等[12]也发现， 具有抗炎和免疫调节作用的黑色素细胞刺激激素α(alphamelanocytestimulating hormone， αMSH)能促使巨噬细胞中的NFκB核转位， 进而上调诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达， 最终催化底物精氨酸产生多量的NO。李义军等[13]则证实， 细菌内毒素能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞NFκB的活性。本研究表明， 双歧杆菌DNA注射组巨噬细胞细胞核表达NFκB+细胞的密度显著高于对照组， 提示青春型双歧杆菌的DNA能有效地促进巨噬细胞中NFκB的转位和活化。已知双歧杆菌的DNA能激活机体免疫系统中的巨噬细胞。宋文刚等[14]报道， 婴儿型双歧杆菌的DNA能活化巨噬细胞， 增强其吞噬功能， 并使之分泌多量的IL1和TNFα。Stacey等[15]证实， 分叉双歧杆菌的DNA能刺激巨噬细胞释放多量的IL6和 IL12。目前认为， 细菌DNA激活巨噬细胞的途径主要为刺激性CpG DNA与巨噬细胞Toll 样受体9(Toll like receptor 9， TLR 9)的结合， 接着诱导细胞内产生多量的活性氧(ROS)。ROS作为第二信使， 进一步可活化MAPK和AP1等信号分子， 最终调节相关基因的表达[16]。结合本研究的结果， 我们认为， 活化PKCα、 PKCβII及 NFκB是青春型双歧杆菌DNA激活巨噬细胞的另一途径。
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