上皮细胞范文
时间：2023-03-28 19:59:27
导语：如何才能写好一篇上皮细胞，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
患者，女，62岁，农民，因左侧腮腺区无痛性肿块，于2006年10月入院。1年前发现左侧腮腺区有一肿物，无痛，缓慢生长，一直未作特殊处理。入院查体：生命体征正常，全身重要脏器检查未见异常。专科检查：左侧腮腺区隆起，可触及一3cm×2cm×2cm大小肿块，边界不清质中滑动无触痛，无周围性面瘫征，颈部浅表淋巴结无肿大。辅助检查：左侧腮腺肿块穿刺细胞学检查提示：瘤样腺上皮细胞及泡沫细胞。入院诊断：左侧腮腺混合瘤。入院后在全麻插管下行左腮腺浅叶及混合瘤切除术，术中见肿物3cm×2cm×1cm大小，呈结节状，位于浅叶与深叶之间，包膜完整，质中，面神经分支均从包块表面穿过，尚无明显粘连，手术顺利。病理学检查：灰红色不规则组织3cm×2cm×1cm大小的肿物一个，无明显包膜，切面灰白灰褐色，质中。镜下检查：肿瘤呈浸润性生长，由两种细胞构成典型双套管状结构，管腔内层为立方细胞，管腔外层为透明细胞，瘤细胞轻度异型。免疫组织化学：ck、ema内层腺上皮呈阳性反应；s100、sma外层肌上皮呈阳性反应。病理诊断：左侧腮腺上皮肌上皮细胞癌,见图1～3。
2 讨论
上皮肌上皮癌（epithelialmyoepithdial carcinoma，emc)，又称闰管癌，是一种极少见的双细胞型、低度恶性涎腺肿瘤，患病率仅占涎腺肿瘤的0.5％[1]。临床上较少见。emc好发于老年人，女性稍多见，腮腺为最常见部位[2]。其组织病理学上可见肿瘤由内层的腺上皮细胞和外层的透明肌上皮细胞构成。腺上皮细胞立方形或矮柱状，胞浆嗜酸性红染，核圆形位于中央，此细胞形成腺管，其外层为透明的肌上皮细胞围绕，胞浆透明，瘤细胞核均有一定异型性，核分裂罕见。上述两种细胞构成典型的同心圆或双管样结构，瘤细胞均有不同程度包膜侵犯。免疫组化染色结果示细胞角蛋白、s100蛋白及肌动蛋白反应阳性，表明上皮—肌上皮癌与正常组织的肌上皮细胞和涎腺肌上皮瘤具有相同的免疫特性，含有相同的抗原成分[3]，可作为与其他涎腺肿瘤鉴别的标志物。此癌的生物学行为以往大部分文献均将其列为低度恶性肿瘤之一，但李浩等[4]认为涎腺上皮肌上皮癌属中高度恶性肿瘤，因为肿瘤呈浸润性生长，边界不清楚，局部复发率高，血行转移率高，预后较差。涎腺上皮肌上皮癌的治疗以手术为主，首次手术非常关键，应有足够的边界；如果腮腺肿瘤范围大，紧贴面神经或复发性肿瘤者，常需牺牲面神经。本例因为腮腺肿瘤位于浅叶与深叶之间，边界清楚，面神经分支均从包块表面穿过，尚无明显粘连，而行保留面神经的腺体浅叶及肿瘤切除术，并给予术后辅助放射治疗，以达到临床治愈，本例目前尚在随访中。如何降低局部复发率，改善患者的预后是近年来对涎腺上皮—肌上皮癌研究的热点。
【参考文献】
[1] nagao t,sugano i,ishida y,et al.salivary gland malignant myoepithelioma:a clinicopathologic and immunohistochemical study of ten cases［j］.cancer,1998,83(7):12921299.
篇2
【Abstract】 AIM: To study the injuring effect of lipopolysaccharide(LPS) on alveolar type Ⅱ cells (ATⅡ) in acute lung injury (ALI). METHODS: Sixteen rats were evenly randomized into 2 groups: control group and LPS group. Control group were injected physiological saline through jugular vein; LPS group were injected LPS through jugular vein. Four hours later， the rats were sacrificed to collect the bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Surface tension， total phospholipids(TPL)， total protein(TP) and maleic dialdehyde(MDA) contents in the BALF were measured; the activities of lactate dehydrogenase(LDH) and alkaline phosphatase(AKP) in BALF were detected. The pathological features of right lungs were observed under an optical microscope. RESULTS: Compared with control group， LPS could increase the TP content ［(28±17) vs (100±32) g/L， P
【Keywords】 lipopolysaccharides; pulmonary surfactants; acute lung/injuries
【摘要】 目的： 研究急性肺损伤时脂多糖(LPS)对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)的损伤作用. 方法： 将16只SD大鼠随机等分为生理盐水对照组、LPS模型组. 通过颈外静脉给药4 h后处死动物，收集肺泡灌洗液(BALF)，测定BALF表面张力、总磷脂含量(TPL)、乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)、丙二醛(MDA)及总蛋白(TP)含量；取右肺下叶，行HE染色光镜观察. 结果： 与对照组相比，LPS可提高BALF中LDH活性［（8.4±1.9） vs (4.8±1.9) μkat /L， P
【关键词】 脂多糖类；肺表面活性剂；急性病，肺/损伤
急性肺损伤(ALI)由各种肺内外致病因素所致. 发病机制复杂、治疗手段有限，尤其是在急性呼吸窘迫综合征阶段，死亡率高达50%以上. 肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ) 不仅可合成、分泌肺表面活性物质(PS)，还具有修复肺泡上皮、肺水转运、局部免疫等多种重要生理功能［1-3］，该细胞损伤是ALI发病过程中的重要环节之一. 脂多糖(LPS)是内毒素的主要生物活性成分，具有极强的生物活性，且肺是内毒素的主要靶器官之一. 现已明确革兰阴性菌感染、内毒素血症是ALI主要致病原因之一. 但是LPS是否对ATⅡ有损伤作用还存在较大争议，我们拟通过动物实验证实LPS对ATⅡ的损伤作用，进一步揭示ALI的发病机制.
1材料和方法
1.1材料成年SD大鼠16只，体质量200～250 g，雌雄各半（第四军医大学实验动物中心）；LPS（美国Sigma公司）；碱性磷酸酶(AKP)，乳酸脱氢酶(LDH)，丙二醛(MDA)试剂盒（南京建成生物工程研究所）；磷标准溶液由第四军医大学预防系营养与食品卫生学教研室高双斌高级实验师惠赠；725C型紫外可见分光光度计（上海第三分析仪器厂）.1.2方法
1.2.1动物分组将动物随机分为2组： ① 对照组(n=8)，经颈外静脉导管注入与LPS组等容积生理盐水; ② 模型组(n=8)，经颈外静脉导管注射2 mg/kg LPS，以复制ALI动物模型.
1.2.2手术及标本采集将大鼠腹腔注射200 g/L乌拉坦5 mL/kg，麻醉后固定于鼠板;沿颈部正中切开皮肤，分离一侧颈外静脉，插入导管给药，给药后4 h行颈椎脱臼处死并行气管插管术，以20 mL/kg生理盐水进行支气管肺泡灌洗，连续3次，取第1次灌洗所得肺泡灌洗液(BALF) 0.2 mL用于表面张力的测量，收集所有BALF并记录BALF回收量，1000 r/min离心10 min，取上清，取其中1.4 mL用于测AKP， MDA， LDH，总蛋白(TP)等，剩余上清用于磷脂的提取.
1.2.3肺组织的光镜观察取右肺下叶，以40 mL/L甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜观察.
1.2.4BALF中AKP， MDA， LDH， TP的测量根据试剂盒说明书测量BALF中AKP， MDA， LDH的含量. 考马斯亮蓝G250染色法测定TP含量.
1.2.5总磷脂(TPL)的测定采用Bartlett法［4］略有改进. BALF中加入2倍体积的氯仿-甲醇（2∶1， V/V）萃取液，震荡1 min， 2500 r/min离心10 min，弃上层液体但不弃界面杂质. 加入1/4体积的甲醇-水（1∶1， V/V）萃取液，震荡1 min， 2500 r/min离心10 min. 弃去上层液及界面杂质，氮气吹干，即得到TPL， -20℃保存待测. 将TPL加入1 mL高氯酸加热，温度由低到高逐渐上升，直至颜色由黑变白表示磷脂完全氧化为无机磷，继续加热蒸干高氯酸. 磷钼蓝比色法测定样本中无机磷含量. 根据磷脂中磷含量约为4%算出磷脂含量，再计算出每公斤体质量的磷脂含量.
转贴于
1.2.6表面张力的测定用毛细管法测定肺泡BALF表面相对张力，即将毛细玻璃管垂直插入到BALF中，测量毛细管内外液面高度差，然后根据拉普拉斯方程σ=rρg(h+r/3)/2计算出BALF的表面张力，以此来反映PS的含量及功能. 其中，σ为表面张力(单位为N/cm)，r为毛细管的半径，ρ为液体密度，g为重力加速度，h为液体上升高度.
统计学处理： 数据均以x±s表示， 组间差别以两样本t检验进行统计学处理，P
2结果
2.1LPS对肺组织的损伤作用LPS可使BALF中TP含量、LDH活性升高，使BALF中MDA含量升高(表1). 光镜下可见LPS组大鼠肺间质较对照组明显增宽，有白细胞浸润，肺泡萎陷，肺不张，肺泡腔偶见红细胞，表现为间质性肺水肿（图1）.表1脂多糖对肺组织及肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用
2.2LPS对ATⅡ的损伤作用LPS可使BALF中AKP活性升高近4倍，使BALF中TPL含量明显下降，表面张力明显升高(表1).
3讨论
革兰氏阴性菌感染、内毒素血症是引发ALI的常见原因. ATⅡ具有合成、分泌PS、增殖和修复、肺水转运及局部免疫等多种重要生理功能［1-3］，该细胞损伤是ALI发病过程中的重要环节之一［5-6］. ALI时LPS是否对ATⅡ有损伤作用还存在较大争议. 郑闵琴等［7］研究证明，LPS能使PS含量及活性下降，ATⅡ肿胀、变性、板层小体减少，肺组织面积密度增加. Romeron等［8］研究表明，LPS不仅对ATⅡ无损伤作用，还可以促进ATⅡ分泌PS. 本实验中，LPS可使BALF中TP含量升高，表明肺泡渗出增加； LDH是胞内酶，LPS组BALF中LDH活性增加表明细胞损伤加重；LPS组BALF中MDA含量升高，提示脂质过氧化作用增强. 上述3项指标变化符合急性肺损伤表现，表明LPS性急性肺损伤模型复制成功. AKP是ATⅡ的特异性分化标志，当ATⅡ损伤时被释放入BALF，LPS使BALF中AKP活性增强，表明其对ATⅡ有损伤作用；磷脂是PS的主要成分，TPL能反映PS含量变化，我们利用定磷法测量BALF中TPL含量，结果表明LPS可使BALF中TPL含量降低；表面张力反映了PS降低肺泡表面张力的功能，是ATⅡ合成、分泌PS的质和量的综合体现. 综合TPL及表面张力的变化，说表明LPS可以抑制PS的合成、分泌，其机制可能为内毒素血症时，肺血流阻力增加，肺组织缺血、缺氧，引起ATⅡ损伤，进而影响PS的合成、分泌，也可能是LPS对ATⅡ有直接损伤作用，进而使PS合成和分泌减少，具体作用机制尚有待于进一步研究.
参考文献
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［4］ Bartlett GR. Phosphorus assay in column chromatography［J］. Biol Chem， 1959，234(3):466-468.
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［6］ Hall SB， Venkitaraman AR， Whitsett JA， et al. Importance of hydrophobic apoproteins as constituents of clinical exogenous surfactants［J］. Am Rev Respir Dis， 1992，145(1):24-30.
篇3
微绒毛、纤毛。上皮细胞游离面的特化上皮组织的游离面是直接与外环境相接触的，常分化形成适应其特殊生理功能的结构，形式多样。
除陆生动物皮肤的表面接触的外环境为空气外，一般上皮组织接触的都是湿润的环境。陆生脊椎动物皮肤的表面为复层上皮，表层细胞角质化形成角质蛋白防止水分蒸发，并有保护作用。
（来源：文章屋网 ）
篇4
【关键词】 氯化锰
锰是一种较常见的职业毒物。近年来，随着现代工业的发展，锰的生产和消费日益增多，锰与生殖健康的关系逐渐引起人们的重视〔1〕。有研究表明，若机体摄入过量的锰，会导致组织发生病理学改变，性功能障碍及组织生化酶学的改变〔2〕。本实验采用氯化锰染毒小鼠，动态观察小鼠脏器系数；检测小鼠染锰56d生育指数及生殖指标的变化；定量组织学分析生精上皮细胞数的变化，以探讨锰对雄性小鼠生殖毒性的剂量-效应关系。
1 材料与方法
11 动物 6～8周雄性昆明种小鼠140只，体重23～28g(贵阳医学院实验动物中心)，均为普通级动物，合格证号为scxk 2002-0001。普通饲料饲养。
12 主要试剂及仪器 MnCl2·4H2O(分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；电子称（武汉自动化仪器厂）；BI2000图像分析系统（成都泰盟公司产品）。
13 方法
131 动物分组 雄性昆明种小鼠140只，随机分成3个染锰组和1个对照组，每组35只。
132 染锰方法 3个染锰组分别给予腹腔注射氯化锰（75，150和300mg/kg）。对照组采用等容生理盐水腹腔注射，每周5d，1次/d。每周测小鼠的体重1次，以调整用药量。
133 标本收集 分别于染锰3，7，14，28，56d每组随机抽取5只小鼠，脱臼法处死，立即分离双侧，生理盐水冲洗，用滤纸吸干后称重，用于测定脏器系数。取小鼠左侧迅速置于10%甲醛溶液内固定，常规方法脱水，石蜡包埋。
14 观察指标及方法
141 脏器系数 称重后按照公式：脏器系数=重（g）/小鼠体重（g）×100%。
142 生殖实验 于染锰第56d，将剩余各组小鼠（每组10只），分别与未经处理的成熟雌性小鼠1：1合笼一周后，取出雄鼠。雌鼠以合笼第1d为妊娠0d，于妊娠第19d处死，计录妊娠母鼠数、活胎数、死胎数。计算：(1)雄鼠生育指数（使雌鼠受孕的雄鼠数/总的雄鼠数×100%）；(2)每窝平均活胎数（活胎总数/受孕母鼠总数）；(3)平均着床数（胎鼠总数/受孕母鼠总数）；(4)总死胎数（死胎总数/胎鼠总数×100%）〔3〕。
143 定量组织学分析 取染锰56d用苏木素-伊红(HE)染色，每例切片一张，在图象分析仪下每例测定10个曲细精管的横截面积及管内生精上皮细胞数量。
15 统计分析 采用SPSS110统计软件进行分析。用方差分析进行检验。生育指数、总死胎率采用χ2检验。
2 结果
21 染锰剂量与时间对小鼠脏器系数的影响(表1) 由表1可见，于染锰第28d，30mg/kg组脏器系数开始降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜005）；染锰第56d，15与30mg/kg组脏器系数均与对照组比较差异有统计学意义（P＜005，P＜001）。
表1 染锰剂量与时间对小鼠脏器系数的影响（略）
注：与对照组比较，a P
22 染锰对雄性小鼠生育能力的影响(表2) 染锰56d，75，15mg/kg组生育指数低于对照组，但差异无统计学意义（P>005）；30mg/kg组生育指数低于对照组（P
表2 染锰对雄性小鼠生殖能力的影响（略）
注：与对照组比较，a P
23 染锰对小鼠曲细精管横截面积及管内生精上皮细胞数量的影响(表3) 定量组织学分析结果表明，染锰可使小鼠曲细精管横截面积明显减少，管内发育各阶段的生精细胞数量降低。染锰56d，各染锰组与对照组比较，其曲细精管横截面积及生精上皮细胞定量测定数值均明显减少（P
表3 染锰56d小鼠曲细精管横截面积和生精上皮细胞数量的变化（略）
注：与对照组比较，b P
3 讨论
锰作为机体内某些代谢酶的组成部分或酶的激动剂，参与了许多生物化学反应，是机体必需的微量元素之一〔4〕。但过量的锰在体内蓄积，会对机体产生不良作用。本实验发现，随染锰剂量的增加和时间的延长，小鼠重量下降，脏器系数明显降低，提示锰可通过血睾屏障，损害的正常结构，干扰的生长和发育过程〔5〕。有研究发现，锰能使多巴胺（DA）和5-羟色胺（5-HT）含量减少，从而降低了DA和5-HT对垂体促性腺激素（LH、FSH）的抑制，导致FSH和LH水平升高〔6〕。下丘脑血循环中性激素水平的负反馈调节作用而使睾酮浓度下降，从而使数量减少。锰还可抑制乳酸脱氢酶（LDH），阻碍能量来源，干扰粗线期初级精母细胞的减数分裂及分化为的过程，从而影响的数量和活力。锰最先抑制曲细精管生精上皮细胞的琥珀酸脱氢酶，干扰曲细精管细胞的能量合成，导致细胞代谢降低，使曲细精管生精细胞、Sertoli细胞受损〔7〕。研究证实，锰是一种较强的染色体断裂剂〔5〕。氯化锰可使生精细胞发生基因突变和染色体畸变，从而导致小鼠畸形率升高。Gavin等认为锰可直接作用于线粒体呼吸链而影响线粒体的氧化磷酸化，对线粒体功能具有抑制作用〔8〕。Galvani等〔9〕利用嗜镉细胞瘤(PCI2)细胞进行体外研究表明，MnCl2可抑制呼吸链中的还原型烟酰胺腺膘呤二核苷酸(NADH)脱氢酶和NADH细胞色素还原酶的活性。从而影响电子传递和线粒体的呼吸功能，使三磷酸腺苷(ATP)生成减少，影响生精细胞供能，使活动度降低。数量减少、畸形率升高和活动度的降低，可引起的运动能力和穿透卵细胞的能力下降，使母鼠受孕率下降；由于畸形和染色体畸变，基因发生突变，受精卵在植入后的发育过程中胚胎可在早期死亡或胚胎在发育过程中出现死亡，因而死胎率增加。
参考文献
〔1〕 才秀莲，李兴升，李季蓉，等.染锰鼠增殖细胞核抗原与热休克蛋白表达［J］.中国公共卫生，2005，21(11):1331-1333.
〔2〕 吴卫平，胡万达，纪淑琴.锰的雄性生殖毒性［J］.国外医学：卫生学分册，1990，17(6)：324-327.
〔3〕 吴鑫，钟先玖，范卫，等.丙烯腈对雄性大鼠生殖功能的影响［J］.中华劳动卫生职业杂志，2001，9 (5)：357-359.
〔4〕 苗健，高琦，许恩来.微量元素与相关疾病［M］.郑州：河南医科大学出版社，1997：127-128.
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〔8〕 Gavin CE，Gunter KK，Gunter TE.Mn2+ sequestration by mitochondria and inhibition of oxidative phosphorylation［J］.Toxicol Appl Pharmacol，1992，115(1):1-5.
篇5
【摘要】 目的：探讨大鼠肾小管上皮细胞的体外培养及鉴定方法，为肾结石病的研究提供实验平台。方法：采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段，在含10%胎牛血清和1%上皮细胞生长因子的上皮细胞培养基中培养，0.25%胰蛋白酶消化后传代培养，并用原代和传1代细胞做免疫细胞化学染色鉴定。结果：细胞培养至第3天完全贴壁，4～7 d处于对数生长期，为多边鹅卵石样;免疫细胞化学染色显示cytokeratin 18表达阳性。结论:机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法结合使用上皮细胞培养基可以培养得到较纯的肾小管，是大鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法，为进一步研究泌尿系结石病因和机制提供了实验基础。
【关键词】 肾小管上皮细胞; 原代培养; CK18; 大鼠
[Abstract] Objective： To discuss the method of the primary culture and identification of SD rats renal tubular epithelial cells， thus to supply an experimental platform for the study of renal calculi.Methods： The renal tubular segments were isolated by mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion. The collected cells were cultured with EpiCM，which contained 10% FBS and 1% EpicGs， in incubation with 5% CO2 at 37 ℃， and subcultured with 0.25% trypsin.The cultured cells were identified by immunocytochemistry. Results: The cultured cells were completely adhered after 3 days， the logarithmic growth phase was beween 4 and 7 days. The cells were large， displaying the typical cobblestone appearance.Immunocytochemistry suggested that the expressions of cytokeratin 18 in renal tubular epithelial cells were positive. Conclusion: Mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion combined with EpiCM is an ideal method to collect and culture the renal tubular epithelial cells，and it provides the experimental basis for further study of the etiology and mechanism of urinary tract stones.
[Key words] renal tubular epithelial cells; primary culture; CK18; rats
尿石症是泌尿外科最常见的疾病之一，主要病因包括遗传、环境、饮食、代谢等。一般认为，它的形成是一系列化学的、生化的、生理的及分子调节等因素综合作用的结果[1]，其早期病变是微小晶体黏附在肾小管上皮细胞表面并引起损伤。可见，肾小管上皮细胞可以作为进一步研究尿石症病因及发病机制的一个实验平台。目前，国外已建立部分种属的肾小管上皮细胞株，但价格昂贵且不易获得。本实验旨在探讨一种理想的肾小管上皮细胞原代培养方法。
1 材料和方法
1.1 材料
实验动物：SD大鼠2只，一雄一雌，体重分别为220 g和200 g，由广州中医药大学动物实验中心提供[许可证号为SCXK(粤)20080020粤监证字2008A002]。主要试剂：胎牛血清(Gibco公司)、上皮细胞培养基EpiCM(美国ScienCell公司)、Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/链霉素(Sigma公司)、cytokeratin 18一抗(美国Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奥森公司)、上皮细胞生长因子EpicGs(美国ScienCell公司)、PV9005小鼠超敏二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)、ZLI9017浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥)。主要仪器：80和100目不锈钢筛网(广州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)、CO2细胞培养箱(Thermo公司)。
1.2 方法
1.2.1 肾小管节段的分离提取 大鼠实验前禁食12 h，水摄入不限。颈椎脱臼后于70%酒精中浸泡2～3 min后取出，在超净台上无菌取下两侧肾脏。在盛有PBS培养皿中去除肾蒂和包膜，剪碎肾皮质至约1 mm3大小(冰上操作)，PBS反复冲洗3遍去除血质后转移到80目筛网上，研磨并以PBS充分冲洗，网下液体倒至100目筛网上，收集网上物于培养皿中，反复吹打转至15 ml离心管，1 200转·min-1离心10 min。
1.2.2 肾小管节段的消化和肾小管上皮细胞的原代培养 离心后弃上清，加入1 mg·ml-1的Ⅰ型胶原酶2 ml，0.1 mg·ml-1的DNase 0.1 ml，充分混匀，37 ℃水浴震荡消化约30 min，加入不含血清的EpiCM 2 ml终止消化，混匀，1 600转·min-1离心6 min，弃去上清，加入4 ml含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，吸管充分轻轻混匀后移入25 cm2培养瓶中，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。
1.2.3 肾小管上皮细胞的传代培养 原代培养至第3天首次换液，以后每两天换1次，至第6天细胞基本铺满整个瓶底，吸去瓶内全部培养液，用PBS洗涤3次，分两组进行消化，各滴加0.25%胰蛋白酶(A组)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA复合液(B组)1.5～2.0 ml(以刚好能全部覆盖瓶底细胞为标准)，37 ℃消化1～2 min，镜下见约85%细胞收缩、变圆，少许脱落，此时立即加入双倍的含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，用吸管顺瓶底轻轻吹打使细胞完全脱落、充分混匀，细胞计数后以1∶2的比例传代培养。
1.2.4 肾小管上皮细胞的鉴定 形态学：倒置显微镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强，各细胞紧密相连。免疫细胞化学：将传1代的肾小管上皮细胞接种于装有盖玻片(经泡酸、灭菌处理)的24孔细胞培养板中，待细胞约长满时取出盖玻片。PBS冲洗2次，4%冷多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2次后加3% H2O2去离子水孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，cytokeratin 18一抗(1∶400)4 ℃过夜(阴性对照用PBS替代一抗)，二抗(即用型)37 ℃孵育1.5 h，再DAB显色、自来水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。普通光学显微镜下观察结果。
2 结 果
刚提取的肾小管节段如图1所示。原代培养的肾小管上皮细胞12 h左右即有贴壁，24～36 h后可见上皮样细胞从贴壁的节段外周爬出，使得此时整个培养瓶底的细胞呈“岛屿状”(图2)，培养第3天后首次换液。第4～7天是对数生长期，约6～7 d基本长满瓶底(图3)。镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强。传代细胞A组第2天贴壁，第5～6天呈指数性生长，形态多为短梭形，少数呈多边形鹅卵石样;B组3 d后少量细胞贴壁，形态不一，细胞连接不紧密，折光性较差，至第7天左右细胞全部漂浮、死亡。免疫细胞化学染色检测肾小管上皮细胞特异性表达的cytokeratin 18，在镜下可见肾小管上皮细胞的胞核周围及胞质内有不均匀分布的棕褐色颗粒(图4、5)，而阴性对照组未见到(图6)，证明培养的是肾小管上皮细胞。
3 讨 论
尽管关于泌尿系结石的形成机制在国内外已有不少研究，但仍存在一些未曾阐明的问题。目前已有多种学说，如肾钙斑学说、过饱和结晶学说、基质学说等[2]。总而言之，肾结石的形成是一个多因素参与的过程，包括尿液的过饱和、微小晶体的形成及结晶的生长和成熟等。其中，微小晶体黏附于肾小管上皮细胞表面并引起损害被认为是肾结石形成过程中关键的一个环节[3-4]。由此可见，利用体外培养的肾小管细胞作为一个实验平台，可以更进一步研究阐述泌尿系结石的形成机制。
目前，国内外已建立了猪、兔、大鼠和人等多种不同种属的肾小管上皮细胞株，虽然可以在短时间内获得数量足够的细胞，但价格昂贵且不易获得。况且，在反复传代过程中细胞株会丧失某些功能甚至发生转分化等[5]，不能完全代表其正常的生理状况，且可能还具一些致瘤性[6]，因此不适合研究的需要。肾小管上皮细胞的培养方法除应用细胞株培养外，还有另外两种方法。其一是先分离筛选出肾小管节段，然后进行培养;其二是van Kooten等报道的通过选择性培养基促进上皮细胞的生长，同时抑制其他细胞的生长[7]。虽然原代培养技术要求高、传代次数有限，但它更接近生理状况，细胞的变化相对稳定，既没有损伤也没有严格的研究时间限制[8]。目前，国内外有报道用Percoll密度梯度离心法分离肾小管细胞，Percoll为一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，它具有不穿透生物膜，对细胞无毒害的作用，其密度为1.130 g·ml-1，可根据活细胞、接近死亡的细胞以及细胞碎片密度不同而将其分离开，以获得活性较好的细胞[5，9-10]。但是，用此法大大增加了细胞提取的操作时间，也会影响细胞的活性，另外Percoll密度梯度离心法所获得的肾小管节段数量少。Mattila等报道，采用研磨、筛网过滤的方法能达到分离肾小管节段和肾小球的目的[11]。本研究应用80目和100目孔径的不锈钢筛网分离肾小管，可以排除肾小球上皮细胞的混杂，肾小管细胞的纯度可达到90%以上，且与Percoll密度梯度离心法相比，研磨消化法获得的细胞数量较多。对于肾小管上皮细胞的消化，国内报道多采用胰蛋白酶，但是浓度难以确定，过高(>0.25%)会影响细胞贴壁和生长，甚至无法传代;过低又不能很好地消化细胞[12-13]。用1 g·L-1的Ⅰ型胶原酶消化20～30 min效果佳，培养的细胞贴壁率高，长势良好。在原代培养中，本实验应用上皮细胞培养基和上皮细胞生长因子，可以使成纤维细胞和其他一些杂细胞的增殖大部分甚至完全被抑制，从而有利于上皮细胞的生长，得到的细胞纯度高[7，14]。在原代细胞生长至第6天传代培养时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代后的细胞贴壁和生长情况良好;而用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA复合液消化，肾小管细胞贴壁需要时间长且数量少，无法继续生长，原因可能是肾小管上皮细胞对EDTA敏感，EDTA对其有抑制性。
上皮细胞中间纤维结构中含有角蛋白成分，是上皮细胞的特异性标志。肾小管上皮细胞主要表达cytokeratin 18[15]，尽管有报道肾小球足细胞、球囊上皮细胞也有角蛋白表达(未明确是否为18型)，但使用研磨、分离方法已将肾小管和肾小球细胞分离纯化，故不会对实验造成影响。本实验采用原代和传一代的细胞进行免疫细胞化学染色，选择cytokeratin18一抗(浓度为1∶400)进行特异性鉴定。镜下均发现细胞质和细胞核周围有棕褐色不均匀散在分布、强度不一的阳性颗粒，再结合上皮细胞的镜下特点(典型的多边鹅卵石状，细胞间相连紧密)，证实培养的细胞是肾小管上皮细胞。
肾小管上皮细胞的原代培养较难，各方面要求较高，通过多次培养，在实验过程中我们体会到以下几点的重要性：(1) 肾小管节段的获取必须严格无菌。(2) 肾小管细胞的消化尽量选用Ⅰ型胶原酶，效果佳。对于使用胰蛋白酶，没有明确的推荐浓度。国内王东等提出胰蛋白酶的浓度为0.2%～0.25%时对肾小管细胞消化较好[12]。而廖晓星等报道0.2%以上的浓度将明显影响肾小管细胞的贴壁和生长，并建议以0.15%为宜[13]。(3) 在分离培养后的前3 d内，由于组织块粘贴不牢，尽量不要移动培养瓶。(4) 72 h后首次换液，若细胞贴壁不理想可以半换液，但在操作中注意动作轻巧，避免因液体震荡对细胞的冲击引起其漂浮。以后依据细胞生长情况及时换液，一般每两天1次，否则漂浮物会对细胞有毒性作用。(5) 使用一次性塑料培养瓶的肾小管细胞贴壁所需时间比用玻璃培养瓶短，且生长更好。
本实验证明，采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离肾小管节段，结合使用含EpicGs的上皮细胞培养基原代培养肾小管上皮细胞是一种理想的方法，为进一步研究泌尿系结石的病因及机制奠定了实验基础。
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[13] 廖晓星，唐洪林，孙庭，等. 肾小管上皮细胞原代培养及鉴定[J].中国现代医药杂志， 2004，(6):1214.
篇6
[关键词] 呼吸道上皮细胞；纤毛摆动频率；培养模式；纤毛分化
[中图分类号] R56 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）03（b）-0040-04
[Abstract] Respiratory epithelial cell plays an important role in the development of respiratory diseases. The respiratory epithelial surface of mammalian airway were covered with cilia. The beat of the cilia can protect the respiratory system from bacteria， virus and other harmful factors. Therefore， cilia beat frequency （CBF） became a crucial element of regulating the progress of many kinds of respiratory diseases. It can be used to research inflammation， smoke， infection and respiratory tumor. The technologies of respiratory epithelial cell culture and separation of epithelium in vivo were applied to research CBF. These culture methods， however， had many problems which include low differentiation of cilia and many mixed cells. With the culture mode developed continuously， this paper focused on the major culture mode of respiratory epithelial cells and the culture methods which were improved constantly under relevant culture mode. It also summarized the detection of differentiation of cilia and the CBF， defined the influence on the culture cycle， culture process， especially the differentiation of cilia which were subject to the culture mode， laid the foundation of improving the technology of respiratory epithelial cell culture.
[Key words] Respiratory epithelial cells； Cilia beat frequency； culture mode； Cilia differentiation
呼吸道上皮是呼吸系统的重要组成部分，是抵御外界环境中细菌、病毒、小分子粉尘等有害危险致病因素的首道防线，一旦呼吸道上皮受到损伤，各种有害微生物以及其他危险致病因素很快就侵入到下呼吸道，直接引发各类急性呼吸系统疾病，除此之外，在失去具有正常功能的呼吸道上皮保护下，危险致病因素也可对呼吸系统深部组织呈现慢性刺激，导致发生诸如慢性阻塞性气道疾病、肿瘤、硅肺、慢性气道炎症等各类呼吸系统慢性疾病的可能性升高。呼吸道上皮组织学结构主要由包括以呼吸道上皮细胞为主的各类细胞所构成，在鼻黏膜以及诸如气管、主支气管、段支气管等呼吸道，呼吸道上皮层被密集的纤毛所覆盖，这主要是由于构成呼吸道上皮的气道上皮细胞多为具有纤毛分化能力的纤毛上皮细胞，覆盖在细胞表面的纤毛摆动可以保护深部呼吸系统免于各类细菌、病毒、粉尘、烟雾的在呼吸道的滞留引发的慢性损伤，同时纤毛的定向节律运动也可以推动呼吸道分泌黏液排除体外[1-2]，纤毛的摆动快慢及其密度与呼吸道的黏液运输系统密切相关[3]，纤毛每秒的摆动次数称之为纤毛摆动频率（CBF），是判断呼吸道上皮纤毛排除异物，保护呼吸系统的重要指标之一，CBF的调控是许多呼吸系统疾病的关键因素，其中研究发现钙离子在调节纤毛运动中被认为发挥了很大的作用[4]，同时在临床上也有研究表明鼻部药物的给药方式及药物溶解方式对CBF的影响很大[5]，在过敏性鼻炎的急性期，组胺能够调节呼吸道纤毛的摆动频率[6]，近期也有研究表明，生物的年龄是影响呼吸道上皮纤毛摆动的一个重要因素，且受到蛋白激酶Cε（PKCε）的调节[7]。因此，基于以上原因，在体外构建呼吸道上皮细胞纤毛摆动模型显得至关重要，体外研究呼吸道上皮细胞以及CBF的方法主要是借助于呼吸道上皮细胞的原代培养以及活体急性分离呼吸道组织体外培养，但由于呼吸道上皮细胞的培养本身具有杂细胞多，细胞培养周期短，细胞表面不易分化纤毛等特点，随着其培养模式不断发展，众多学者不断探索更好的培养模式，以便于培养的细胞纯度以及细胞功能与在人体呼吸道的上皮细胞更具相似性，能够更好地分化纤毛，观测到纤毛的摆动，检测到CBF。至今为止，关于呼吸道纤毛上皮细胞的培养模式的研究并不多，本文简述了呼吸道上皮细胞两种主要的原代培养模式及各自的主要培养方法及改进发展情况，同时介绍并总结了呼吸道上皮细胞纤毛分化的鉴定及其摆动频率的检测，明确了各类培养模式对操作流程、培养周期，尤其是纤毛分化及摆动频率的影响，为在现有培养模式下改进技术得到能够诱导纤毛分化的有效培养方法奠定了基础。
1 呼吸道上皮细胞的原代培养模式
虽然在以往的研究中众多学者建立的培养方式有很多，但根据其培养原理的差异性，呼吸道上皮细胞的培养可以归纳起来分为两大类，一类是借助呼吸道组织活性，利用快速处理过的急性分离的呼吸道组织，培养呼吸道细胞，这类方法的特点是爬出的细胞具有高度的组织活性，根据技术手段的不同，操作时间一般在数十分钟至两小时之内，但根据处理方式及培养条件的各异，培养的上皮细胞可能含有较多的杂细胞甚至杂细胞含量过高抑制了上皮细胞的生长，这一类方法可归纳为活性组织培养模式。另一类培养模式是借助不同种类的蛋白酶将呼吸道上皮表面的细胞从呼吸道骨架上消化下来，将消化下来的细胞处理后重悬浮培养，这一类培养方法由于采用了各种不同的蛋白酶，气道上皮细胞的活性受到了破坏，细胞的分化功能会受到损伤，细胞的纯度也会根据所使用酶的种类不同也有所区别，且细胞培养周期一般较长，操作过程根据酶消化的条件不同可达2～24 h不等，这一类方法被归纳为酶消化细胞培养模式，也是目前报道较多的一类培养模式。
1.1 酶消化细胞培养模式
酶消化细胞培养是首例呼吸道上皮细胞原代培养，其上皮组织取材来源于人的主支气管，研究者利用型蛋白酶溶解在磷酸盐缓冲液中，在4℃环境下对主支气管的上皮细胞进行消化，消化时间为24 h，结果通过透射电镜与免疫组化等方法对培养的细胞的纤毛分化进行检测，该方法培养的气道上皮细胞纤毛分化较好，但由于过夜消化使得操作时间较长，且消化的细胞贴壁生长不好，对细胞的纤毛分化功能有一定的影响[8]。在此培养模式的基础上，众多学者在操作流程及培养材料及细节上进行了修改，有学者使用人的主支气管以及小鼠的鼻黏膜作为取材来源，同时采用了改良的气液相联合培养的方法，在使用相似的蛋白酶消化后，将消化下的细胞离心后重悬浮置于气液相培养皿装置中，该装置模拟哺乳动物气道上皮层的生理解剖学环境，装置中加入适量的上皮细胞培养基，使得细胞浸没在含有上皮细胞培养基的溶液中，而同时又可以暴露在空气环境中，这种模拟人体气道上皮层的气液相环境可以有效地在体外刺激并诱导上皮细胞的纤毛分化[9-10]。近期又有国内学者利用类似的方法使用特殊培养基和鼠尾胶原包被的培养器皿成功培养了人鼻黏膜以及小鼠呼吸道上皮细胞，并详细记录了其生长情况，同时使用免疫组化和高速数码摄像机检测了纤毛的分化，培养的上皮细胞的CBF对ATP刺激的反应性很好，特殊培养基和胶原包被的培养器皿可以增强上皮细胞的贴壁能力，对细胞的生长和分化起到促进作用[11-13]。不仅如此，该方法在改进后还可以建立纤毛运动障碍模型，用以研究原发性纤毛运动障碍（primary ciliary dyskinesia，PCD）等疾病[14]。气液相培养结合酶消化细胞培养模式可以在体外快速获取大量上皮细胞并且容易建立细胞的生长以及细胞表面纤毛分化的模型，但该方法培养的上皮细胞的纤毛分化也能受到多种因素的调控，有学者发现诸如4-Methylnitrosamino-1-3-pyridyl-1-butanone（NNK）的化学试剂对于体外气液相培养气道上皮具有重要的调控作用，能在短时间内影响细胞的正常生长与纤毛分化[15]，以上这些研究也为如何精准调控体外酶消化法培养的细胞生长及纤毛分化垫定了基础。
1.2 活性组织培养模式
运用活性组织法培养模式的学者最早可追溯到1995年Dirksen ER，在他的研究中采用了分离的活性气道上皮组织，并依靠其组织活性进行体外培养，同时使用鼠尾胶原作为其培养的铺垫底物，利用了特殊的上皮细胞培养基，成功在体外培养出呼吸道上皮细胞，该方法虽然能获得大量气道上皮细胞，但操作过程繁琐且精细，需要在显微操作下完成气道上皮层的分离，培养者在一定的训练后方能完成[16]。国内部分学者在此方法的基础上加以改进，分别从兔、人的主支气道及鼻黏膜取材，使用鼠尾胶原包被培养器皿，将有活性的气道上皮组织或鼻黏膜组织剪碎，使其固定在培养器皿上，在培养的第4～7天，上皮细胞爬出并融合，可观察到纤毛分化及稳定的节律性摆动[17-18]，研究者同时对纤毛的特定标记蛋白黏蛋白5AC（mucin-5AC，MUC5AC）进行了检测，其表达呈阳性，扫描电镜也可以观察到浓密的纤毛分化[19]，充分肯定了这种培养模式可成功诱导有纤毛分化的细胞从组织周围爬出。在近期，又有学者比较了采用呼吸道组织体外直接种植培养以及在体外培养后将组织分离开，发现前者培养的气道上皮细胞纤毛分化丰富，但后者纤毛分化较少，细胞在第7～10天时生长达到最佳状态，且二者分化的纤毛摆动频率也较好，且对ATP的刺激反应性也均较好[20]，这些研究为如何在体外选择性构建研究所需要的模型提供了基础；与此同时，研究者检测了纤毛上皮细胞的特定标志物β-tubulin Ⅳ以及ZO-1的表达，表达呈阳性，结果显示了培养的细胞纤毛分化丰富，且密度较高。活性组织培养成功的关键主要在于取材的离体组织上皮活性是否完好，组织取下后能否在显微镜下直接观察到组织上纤毛的摆动；除此以外，培养器皿的胶原包被、特殊培养基的使用，这些都是诱导具有纤毛分化细胞爬出的关键因素。
2 呼吸道上皮细胞的纤毛分化
在通过以上培养模式获取了大量的呼吸道上皮细胞或是活体取出了具有纤毛的气道组织后，要检测细胞的纤毛分化或组织的纤毛分化情况，目前常用的检测方法包括免疫组织化学检测上皮细胞特定蛋白表达、扫描电子显微镜（SEM）观察细胞或组织表面纤毛的生长密度及高度，以及采用高速显微摄像技术观察CBF并直接记录纤毛摆动情况。免疫组织化学法检测的特定标记蛋白主要包括前面所提到的β-tubulin Ⅳ以及mucin-5AC，这两种蛋白为纤毛上皮细胞所特定的表达，而ZO-1则是用来反映上皮细胞融合程度的标志物，除此以外，角蛋白也可以作为上皮细胞的特定表达蛋白用以检测细胞的生长情况。SEM则可以通过扫描上皮细胞表面或气道组织表面的超微结构，直接观察上皮细胞或组织表面纤毛的生长情况，但SEM样本的制样过程繁琐，且样本经固定脱水后，细胞及表面的纤毛均已死亡，不能在活体状态下反映出纤毛的运动状态。相比之下，高速显微摄像技术则可以让研究人员通过连接高速电荷耦合元件（CCD）的显微镜，并通过可视化的视频分析软件直接地观察到纤毛的摆动，是判断细胞纤毛分化以及检测CBF最直接可靠的方法，然而由于哺乳动物CBF较快，且不同种属来源的呼吸道上皮纤毛摆动有所区别，小鼠的摆动频率最高，而人的相对较慢，但均高达8～15次/s，因此需要使用专门的仪器设备以及软件系统才可以记录并检测其摆动频率。随着呼吸道上皮细胞培养模式的发展以及光学数码显微技术的进步，纤毛摆动的记录及检测方法也不断发生变化。在记录纤毛高速摆动时，高速影像系统是记录纤毛高速摆动所必须的，为保证其客观提交相同，其记录条件一般在标准体内温度37℃，将细胞或组织浸没在磷酸盐缓冲液中；而影像系统的采集帧数多为60～100帧/s，这样可以保证上皮细胞纤毛的有效摆动均被记录下来[21]。对于采集的图像信息，利用Hcimage等图像分析软件，详细分析纤毛摆动区域的灰度值，由于纤毛的定向节律摆动，引起了区域内灰度值的变化，因此通过分析单位时间帧数内灰度曲线的周期变化情况，可以准确地反映出纤毛每秒摆动的次数[22]。
3 小结与展望
呼吸道上皮的纤毛摆动及其调控和呼吸道黏液运输、临床给药以及多种呼吸系统重大疾病的发生发展均具有密不可分的关系，在体外构造简便快速可靠的培养模式以诱导气道上皮细胞的纤毛分化并检测其摆动频率在分析气道上皮细胞功能上显得至关重要。但由于气道上皮细胞培养以及检测的复杂性，目前对这方面的研究相对较少，在目前主要的两种培养模式下，操作流程及培养周期均较长，但各自的操作流程及对诱导细胞纤毛分化的能力均各具特点，最可靠的检测方法主要是通过连接高速CCD的显微镜直接记录纤毛摆动情况并间接分析纤毛摆动导致的图像灰度变化从而计算CBF。但随着细胞生物学以及光学显微摄像技术的进一步发展，在未来，将会探索出更加便捷可靠的培养模式，为研究呼吸系统重大疾病、寻找呼吸道上皮纤毛摆动参与的呼吸系统疾病的发病机制奠定基础。
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篇7
[关键词] 2-脱氧葡萄糖；常染色体显性多囊肾病；肾囊肿衬里上皮细胞；增殖
[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（c）-0004-05
[Abstract] Objective To investigate the effect of 2-DG on the proliferation of cyst lining epithelial cells WT9-12 and its possible action mechanism. Methods Cyst lining epithelial cells WT9-12 in vitro were divided into control group and 2-DG treatment group with different concentrations （5， 10， 20， 40 mmol/L）. CCK-8 method was used to screen the optimal concentration and the best time for the growth inhabition of polycystic kidney epithelial cells after drug treatment for different concentrations and different time （12， 24， 36， 48 h）. EdU Imaging Kit and Western blot were used to observe the proliferation rate and the levels of metabolism-related phosphorylated AMPKα， and proliferation-related phosphorylated mTOR， phosphorylated p70S6K， phosphorylated 4E-BP1 in the mTOR signal pathway of cyst lining epithelial cells exposed to 15 mmol/L 2-DG for 48 h. Flow cytometry and Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit were used to detect the apoptosis rate of cyst lining epithelial cells treated by 2-DG of different concentrations for 48 h. Results The results showed that 2-DG can significantly inhibit the proliferation of polycystic kidney epithelial cells， compared with the control group， and the anti-proliferative effects in time-dependent and dose-dependent modes （P < 0.05）. The level of metabolic related molecule P-AMPKα was obviously increased （P < 0.05）， but the expression activity of the proliferation related molecule P-mTOR， P-p70S6K and P-4E-BP1 were markedly decreased （P < 0.05）. Compared with the control group， the early apoptosis rate of polycystic kidney cells was promoted by the different concentrations of 2-DG， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion 2-DG may inhibit the growth of WT9-12 cyst lining epithelial cells through regulate the AMPK-mTOR signal pathway and promote apoptosis.
[Key words] 2-deoxyglucose； Autosomal dominant polycystic kidney disease； Cystic lining epithelial cells；Proliferation
常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）是一种常见的遗传性肾脏疾病[1]。由于具体的发病机制仍未明确，目前尚无能够阻止囊泡形成和生长的有效药物[2]。研究发现，多囊肾上皮细胞与肿瘤细胞类似，主要通过糖酵解产生ATP，且细胞中ATP/AMP比值升高，能量感受器AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性下降，雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性增加，细胞增殖显著增强[3]。2-脱氧葡萄糖（2-deoxyglucose，2-DG）是一种人工合成的葡萄糖类似物，可抑制糖酵解、减少ATP产生，已被用于肿瘤的治疗研究[4-5]。本研究观察了2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的抑制作用及其可能的作用机制。
1 对象与方法
1.1 试剂
人ADPKD 囊肿衬里上皮细胞系WT9-12与DMEM完全培养基，购自ATCC公司；胎牛血清购自Gibco公司；2-脱氧葡萄糖购自Med Chem Express（MCE）公司；Cell Counting Kit-8购自DOJINDO公司；Click-iTEdU Imaging Kits购自InvitrogenTM Thermo Fisher Scientific公司；Caspase-3/CPP32 Colorimetric Assay Kit购自BioVision公司；Annexin V/PI双染色流式法细胞凋亡检测试剂盒购自Bender公司；抗Phospho-（AMPKα、mTOR、p70S6K、4E-BP1）抗体购自Cell Signaling Technology公司。
1.2 分组方法
配制含10%胎牛血清（FBS）的DMEM完全培养基。多囊肾上皮细胞复苏后，在37℃ 5% CO2的孵箱中培养，隔天换液，每2～3天传代，细胞呈贴壁生长状态。2-DG溶解于去离子水中配置为1 mol/L的终浓度。将传代好的细胞分为5组：对照组，2-DG处理组（5、10、20、40 mmol/L），行CCK-8细胞增殖检测实验和细胞凋亡检测实验。选取2-DG浓度为15 mmol/L进行EdU核酸标记实验及Western blot检测实验。
1.3. CCK-8法检测2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的影响
将多囊肾上皮细胞悬液浓度调整为3×107/L，每孔100 μL接种于96孔板，分为6组：空白组、对照组和2-DG处理组（5、10、20、40 mmol/L），每组设6个复孔，培养24 h，换液为含0.1% FBS的完全培养基同步化24 h，之后每组给予不同浓度2-DG（空白对照无细胞只加培养基）培养12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL Cell Couning Kit-8试剂，在37℃孵箱中孵育4 h，使用酶标仪读取 450 nm波长下每孔的吸光度值（A）。增殖抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。
1.4 EdU法检测2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的影响
选择15 mmol/L浓度2-DG治疗的多囊肾上皮细胞作为处理组，培养48 h后，在培养基中加入0.02 μmol EdU，孵育4 h，按EdU核酸标记试剂盒实验步骤操作后用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，能够与DNA强力结合的荧光染料）试剂染细胞核，最后用激光共聚焦显微镜采集图片，其中蓝色代表所有细胞核，粉色代表新增殖的细胞核。
1.5 Western blot 检测蛋白表达
收集对照组与处理组（15 mmol/L 2-DG干预48 h的多囊肾上皮细胞）细胞的蛋白，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，取50 μg样本蛋白按顺序加样，SDS-PAGE电泳后，I=250 mA恒流转移至NC膜，5%BSA封闭1 h，分别予以不同的一抗孵育24 h，HRP标记的二抗（1∶1000）常温孵育1.5 h，ECL显影，Image-J 凝胶图像分析软件对各组蛋白条带进行灰度分析。
1.6 流式细胞仪及Caspase-3试剂盒检测多囊肾上皮细胞的凋亡情况
1.6.1 Annexin V/PI双染色流式法 用0、5、10、20、40 mmol/L的2-DG处理多囊肾上皮细胞48 h后，收集细胞，制备为单细胞悬液，用细胞计数器调整每组细胞数为1×106/mL。每组取100 μL细胞悬液于流式小管，加入200 μL Annexin V/PI Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后室温避光孵育15 min后上机检测各药物处理组与对照组中细胞的坏死和晚期凋亡率（D1、D2：PI+/Annexin V-FITC+）、活细胞率（D3：PI-/Annexin V-FITC-）和早期凋亡率（D4：PI-/Annexin V-FITC+）。
1.6.2 Caspase-3比色测定法 不同浓度（0、5、10、20、40 mmol/L）的2-DG处理多囊肾上皮细胞48 h后收集蛋白，测定每组蛋白的浓度，调整各组蛋白为相同浓度，每组取50 μL蛋白，加入50 μL Reaction Buffer和5 μL DEVD-pNA（caspase-3探针）后在37℃孵箱内避光孵育2 h，使用酶标仪检测405 nm波长的吸光度值（A）。
1.7 统计学方法
所有实验均重复3次，采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的影响
CCK-8结果显示：在同一时间内，随着2-DG浓度的增加，存活细胞数逐渐减少（P < 0.05），提示2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的抑制作用具有剂量依赖性，其中40 mmol/L浓度的2-DG对多囊肾上皮细胞增殖的抑制作用最强；对同一浓度而言，随着时间的延长，2-DG对多囊肾上皮细胞的增殖抑制效果也逐渐增强，具有时间依赖性，48 h的抑制率最高，与对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）（见图1A）。使用不同浓度（5、10、20、40 mmol/L）的2-DG处理细胞48 h后，细胞的增殖抑制率分别是（30.7±2.3）%、（46.5±2.5）%、（54.8±1.9）%、（68.5±1.7）%，计算得到半数抑制浓度（IC50）为（14.61±2.1）mmol/L。故在后续的增殖实验中设定2-DG的最适给药浓度为15 mmol/L（见图1B）。
EdU核酸标记技术检测结果显示：15 mmol/L 2-DG处理组中EdU阳性细胞率为（45.36±4.26）%，而对照组中EdU阳性细胞率为（16.12±1.26）%，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封三）。
2.2 2-DG对多囊肾上皮细胞中代谢相关分子AMPK及增殖相关信号通路分子活化的影响
多囊肾上皮细胞内代谢相关信号通路活化型分子P-AMPKα的表达升高（P < 0.05）；增殖相关信号通路活化型分子P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表达降低（P < 0.05）。见图3。
2.3 2-DG对多囊肾上皮细胞凋亡的影响
与对照组比较，各浓度2-DG处理组的多囊肾上皮细胞早期凋亡率（D4）均增加，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与对照组比较，20 mmol/L 2-DG处理组细胞晚期凋亡率（D2）明显增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。各组坏死率及活细胞率比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图4。
2.4 2-DG对多囊肾上皮细胞中凋亡执行酶caspase-3活性的影响
与对照组比较，2-DG各处理组中caspase-3酶活性均明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。
3 讨论
ADPKD是人类常见的遗传性疾病，发病率为1/1000～1/500，85%的ADPKD由于PKD1基因突变导致，而15%的患者由于PKD2基因突变所致[6]。其病变特点为双肾充满多个进行性增长的液性囊泡，随着病变的进展，囊泡逐渐增多增大，压迫正常肾组织，最终发展为终末期肾脏病。临床中除对症治疗及应用肾移植和透析治疗终末期肾脏病外，尚无有效的靶向治疗药物[7-8]。近年来，在多种PKD啮齿动物模型中的研究发现，免疫抑制剂雷帕霉素、PPAR-γ激动剂罗格列酮、生长抑素类似物奥曲肽、加压素V2受体拮抗剂托伐普坦等药物可以抑制多囊肾上皮细胞异常增殖及囊液过度分泌，显示出良好的疗效。但是，之后的临床研究结果显示，雷帕霉素、奥曲肽和托伐普坦在人体中的治疗效果并不理想[9-12]，因此急需新的治疗方法。
研究发现，PKD1突变小鼠模型中多囊肾上皮细胞的代谢方式与肿瘤细胞相似，存在瓦氏效应，即在氧气充足的条件下，也主要依赖有氧糖酵解途径产生ATP，而正常细胞主要通过线粒体氧化磷酸化产生ATP[3，13]。根据瓦氏效应学说，肿瘤细胞能量代谢调控失常影响了细胞增殖和凋亡等生物学过程[14]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一种细胞内能量代谢感受器，是调节能量代谢的关键分子。当细胞内ATP/AMP比例降低时，可以激活AMPK，从而激活一系列能量代谢相关基因的表达，促进ATP合成。反之，当ATP升高时，可抑制AMPK的活性。在肿瘤细胞中，通过糖酵解途径大量消耗葡萄糖产生高水平ATP，AMP/ATP 比例下降，AMPK活性被明显抑制[15]。在多囊肾上皮细胞中发现，细胞内ATP/AMP的比例升高，AMP相对下降，AMPK的活性被明显抑制[3]。雷帕霉素哺乳靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）不仅在调控能量代谢方面发挥重要作用，而且是调控细胞生长与增殖的一个关键性蛋白激酶，mTOR下游信号通路分子包括p70S6K和4E-BP1，可促进细胞增殖。研究表明AMPK可特异性抑制mTOR的活性[16-17]。
2-DG是一种可竞争性抑制糖酵解过程的新型化学药物，目前用于肿瘤的实验治疗研究。在多个肿瘤动物模型中发现2-DG都具有良好的抗增殖效应[18-20]。
本研究使用CCK-8及EdU核酸标记技术（DNA合成过程中，EdU可取代胸腺嘧啶整合到DNA链中，体外螯合荧光染料的叠氮化钠与EdU中乙炔基反应后，使新合成的DNA在激光照射下发出荧光）检测发现不同浓度的2-DG对多囊肾上皮细胞有明显的抗增殖作用，且抗增殖效应具有时间和剂量依赖性。Western blot结果显示在2-DG处理后的多囊肾上皮细胞内，P-AMPKα表达上调，P-mTOR、P-p70S6K和P-4E-BP1的表达均明显下调。
细胞凋亡是细胞的程序性死亡，其最终的共同途径都是激活凋亡执行酶Caspase-3。本研究通过Annexin V-FITC/PI双染法及Caspase-3/CPP32比色测定法，发现2-DG能促进多囊肾上皮细胞发生凋亡，提示凋亡也可能参与了多囊肾上皮细胞的生长抑制作用。
本研究提示，2-DG可能主要通过靶向抑制多囊肾上皮细胞的糖代谢，使多囊肾上皮细胞内ATP/AMP比值降低，AMP相对升高，激活能量感受器AMPK，从而抑制增殖相关的mTOR信号通路分子的活化，进而抑制多囊肾上皮细胞的增殖，提示2-DG今后可能作为多囊肾脏病的潜在治疗药物。
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篇8
【摘要】 目的 制作去细胞肌肉组织工程支架，并检测其与人羊膜上皮细胞的生物相容性。方法 采用三硝基甲苯和十二烷基磺酸钠结合的化学萃取方法制作去细胞肌肉组织工程支架，冰冻切片观察其结构。将人羊膜上皮细胞种入支架培养7 d后，用免疫组化检测羊膜上皮细胞的增殖活性、NT3及BDNF的表达，扫描电子显微镜观察其超微结构。结果 支架中细胞去除完全，其主要结构为平行排列的管状结构。细胞外基质的主要成分弹性纤维和胶原纤维保持完好。羊膜上皮细胞在支架里有增殖活性，并呈现NT3、BDNF免疫反应阳性。扫描电镜显示，羊膜上皮细胞在支架中分布均匀，生长良好。结论 成功的制作了去细胞肌肉组织工程支架，其与人羊膜上皮细胞有良好的相容性。
【关键词】 去细胞肌肉;人羊膜上皮细胞;生物相容性
【Abstract】 Objective To produce the acellular muscle as biomaterial scaffold and to observe its biocompatibility with the human amniotic epithelial cell. Methods The acellular muscle scaffolds were made by extraction with 3% Triton X100 and 1% sodium dodecyl sulfate. The histological structure of acellular muscle was observed in frozen section. Then the cultured human amniotic cells were implanted into acellular muscle scaffolds. After cultured 1 w， the scaffolds with cells were sectioned， and BrdU，NT3 and BDNF immunohistochemical staining were performed to observe the proliferating capacity and the expressions of NT3 and BDNF of amniotic cells in scaffold. SEM was performed to examine the distribution of human amniotic epithelial cells growing in scaffold. Results The cells in scaffold completely disappeared after the muscle had been extracted. The scaffold of acellular muscle was arranged in parallel tubules composed of collagen fibers and elastic fibers which were left intact. In scaffold the human amnion cells could proliferate and synthesize NT3 and BDNF. Scanning electron microscopy demonstrated a uniform distribution of cells in scaffold. Conclusions The cells in rat skeletal muscle are successfully removed by chemical extraction. The acellular muscle scaffold made in this way possess good compatibility with human amniotic cells.
【Key words】 Acellular muscle; Human amniotic cell; Biocompatibility
近年来组织工程研究的重要进展之一就是采用自体或异体移植物制作天然生物降解材料的组织工程支架。其中去细胞移植物与机体有良好的生物相容性。去细胞肌肉支架可作为生物工程支架支持神经细胞轴突再生。Mligiliche等〔1〕把去细胞肌肉移植入大鼠坐骨神经缺损处，4 w后发现有大量神经轴突长入去细胞肌肉支架中。由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限，去细胞肌肉支架要发挥更大的作用往往需要向支架中植入种子细胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮细胞可分泌多种神经因子〔4，5〕，促进神经元轴突的生长，是一种良好的治疗神经系统疾病的种子细胞。本研究利用化学去细胞的方法制成去细胞肌肉支架，并把羊膜上皮细胞种入去细胞肌肉支架内，探究两者的相容性，为开展组织工程治疗神经系统方面的疾病提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Wistar 大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。
1.1.2 试剂 IMDM培养基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 单克隆抗体购自Neomarker公司;神经营养素(NT)3，脑源性神经营养因子(BDNF)兔抗人多克隆抗体购自武汉博士德公司，SABC免疫组化试剂盒购自福州迈新生物公司。人羊膜上皮细胞株为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 去细胞肌肉支架的制备 参考 Brown等〔6〕去细胞膀胱的制作方法制备去细胞肌肉支架，简述如下：取Wistar大鼠腹锯肌，放入蒸馏水中，在摇床中以37℃、50 r/min摇48 h后，转入3%的TritonX100溶液，摇床中37℃、50 r/min摇48 h。然后放入蒸馏水中，摇床37℃、50 r/min摇48 h。换成1% SDS溶液，摇床37℃，50 r/min摇48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存备用。
1.2.2 支架形态结构的观察及成分鉴定 肉眼观察去细胞肌肉的形态。去细胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖过夜以梯度脱水，OCT包埋，冷丙酮速冻，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片机切片，HE 染色，观察其内部结构。此外对切片进行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)检测支架的细胞外基质成分。
1.2.3 人羊膜上皮细胞的培养 人羊膜上皮细胞在DMEM培养液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml链霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，待单层培养细胞生长至80%汇合后，传代培养。
1.2.4 人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架相容性的鉴定
1.2.4.1 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合，弃去培养液，0.25%胰蛋白酶消化，当胞体回缩，细胞间隙变宽时，用血清终止消化，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液于离心管中，1 000 r/min，离心3 min。用DMEM重悬细胞。用1 ml注射器吸入细胞悬液，以2×106/ml 密度注入去细胞肌肉支架中分装至24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养，隔天换液，培养1 w。掺入Brdu(终浓度为10 mg/L)，继续培养1 d后，恒冷箱切片机切片(方法同前)。切片经PBS 洗后，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，血清封闭20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀释)单克隆抗体，BDNF和NT3多克隆抗体(1∶100稀释)4℃孵育过夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB显色。光镜下观察。
1.2.4.2 扫描电子显微镜鉴定羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架上的生长情况 取生长良好的人羊膜上皮细胞，80%细胞接近融合时，用上述方法消化下来后，把羊膜上皮细胞种植到去细胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，镀膜，采用扫描电子显微镜观察并拍照。
2 结 果
2.1 支架的组织结构与成分 去细胞肌肉外观呈乳白色，半透明，质地柔软。从大体上看，肌肉去细胞前后整体大小与形状无显著变化。支架纵切面的HE染色观察可见骨骼肌细胞成分消失，而纤维网架结构保持完整，支架内主要为平行管道。VG+ET染色证明支架成分主要为胶原纤维和弹力纤维等细胞外基质成分，胶原纤维为红色波浪状结构，弹性纤维为蓝色丝状结构，见图1。
2.2 羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架的兼容性 见图2，HE染色显示人羊膜上皮细胞在支架中生长良好，分布均匀(图
图1 去细胞肌肉支架大体与组织切片染色
图2 去细胞肌肉支架的病理图片2A)。免疫组化染色显示，BrdU阳性细胞数目多，提示支架中的人羊膜上皮细胞有增殖能力(图2B)。抗NT3和BDNF染色显示，支架中的人羊膜上皮细胞含有NT3、BDNF阳性颗粒，呈棕褐色分布在细胞质中(图2C，2D)。JSM5600LV扫描电子显微镜显示，在支架内部分布有大量细胞，细胞在支架中分布比较均匀，生长状态良好(图2E)。
3 讨 论
理想的支架材料应与细胞外基质类似，与活体细胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去细胞肌肉作为治疗神经损伤的生物工程支架材料有如下优势：(1)去细胞肌肉的细胞外基质成分对组织细胞的迁移、黏附、生长代谢都有重要作用，研究表明再生的轴突可以很好的黏附在去细胞肌肉支架上〔9〕。(2)去细胞肌肉的排列结构与神经膜管类似，仅在直径上略大于神经膜管〔10〕，它们提供了轴突可生长穿过的足够空间〔9〕，该结构对于诱导神经轴突再生是十分重要的。 Fansa等比较了接种施万细胞的不同去细胞生物材料(肌肉，静脉，神经外膜)桥接缺损的外周神经的结果，发现缺乏神经膜管样结构的去细胞肌肉支架(静脉和神经外膜支架)中的再生轴突是无序和排列混乱的，而有神经膜管样结构的去细胞肌肉支架中的再生轴突是有序排列的〔11〕。这种轴突再生的有序性对神经损伤的轴突再生同样也是十分重要的。(3)去细胞肌肉引起的免疫排斥反应较小〔9，12〕。这些优势都说明去细胞肌肉可作为治疗神经损伤的理想的材料。本研究采用的制作去细胞肌肉的方法主要用来减少异种移植材料的免疫排斥反应。该方法能有效的去除脂膜和膜相关抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留细胞外基质成分的原始空间结构。肌细胞正常呈平行分布，其细胞外基质成分也是平行分布的，从支架纵切面的结果看支架的纤维成分也是平行排布的，VG+ET染色结果显示细胞外基质的主要成分胶原纤维和弹性纤维保持完好。这些结果进一步证实此方法可成功制备去细胞肌肉支架。
由于单独应用去细胞肌肉支架治疗神经系统疾病的效果有限〔13〕，去细胞肌肉的生物相容性也有待验证。本研究用人羊膜上皮细胞作为种子细胞种入去细胞肌肉支架以探讨其相容性。研究表明，羊膜上皮细胞中含有多种生物活性因子，包括胰岛素样生长因子、层黏蛋白、转移生长因子、前列腺素E、表皮生长因子样物质，IL1，IL8 等因子，另外，还可分泌BDNF和NT3等重要的神经营养因子〔4〕。其中层黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子对神经损伤的治疗具有十分重要的作用。羊膜上皮细胞可作为一种较理想的种子细胞，与去细胞肌肉支架结合可能成为治疗神经系统疾病的一个理想的组织工程材料。本实验观察到人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中分布均匀，抗BrdU、BDNF及NT3免疫组化显示去细胞肌肉支架中羊膜上皮细胞有良好的增殖能力，并能表达BDNF和NT3，说明羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中保持了良好的生物学活性。以上结果一方面证明了本研究制作的去细胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面为应用羊膜上皮细胞和去细胞肌肉支架结合治疗神经系统疾病提供了理论和实验基础。
总之 ，本研究成功制备了去细胞肌肉支架，并证实人羊膜上皮细胞在去细胞肌肉支架中能分泌重要的神经营养因子，人羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体为神经缺损再生提供了基底膜、神经营养因子等种种有利因素，构成了良好的神经再生微环境，有利于使神经缺损得到较好地修复，为进一步研究羊膜上皮细胞与去细胞肌肉支架桥接体治疗神经损伤奠定了一定的实验基础。
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篇9
[关键词]c-Met;外泌汗腺;上皮细胞;增殖
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Inhibitory effects of knockdown of c-Met by Adenovirus-delivered siRNA on growth of human eccrine sweat gland epithelial cells
LEI Xia1, LIU Bo2, WU Jin-jin1, LU Yuan-gang1, Yang Ya-dong1
(1. Department of Dermatology, Daping Hospital,Third Military Medical University, Chongqing, 400042,China;2. Department of Orthopadics, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University)
Abstract: ObjectiveTo investigate the effect of siRNA c-Met adenovirus on proliferation of cultured hESGc.Methods The recombinant adenoviral vector containing siRNA targeting c-Met gene was successfully constructed. Adenovirus with high titer was harvested. Fluorescence microscope observation and westernblot test were used to confirm the effectiveness of adenovirus. MTT assay was used to detect the growth of the cells.ResultsRed fluorescence was observed in hESGc infected with siRNA c-Met adenovirus under fluorescence microscopy.The infected cells were harvested for westernblot test. It is observed that c-Met was inhibited in siRNA c-Met adenovirus infected cell group. The transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc by MTT assay.The inhibition rate were 16.8% in 2 days and 34.5% in 4 days.ConclusionThe transfection of siRNA c-Met adenovirus can inhibit the growth of hESGc.
Key words:c-Met; eccrine sweat gland; epithelial cell; proliferation
C-Met是至今唯一被认识的肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor,HGF)高亲和力受体,由c-Met基因编码,HGF与c-Met结合后,可诱导其发生构像变化,进而激活磷酸化通路,逐级放大信号,从而发挥HGF的生物学效应。不少实验表明,HGF/c-Met信号通路与多种细胞增殖,器官发生,肿瘤生长和转移等生物学行为有关[1]。已有实验表明,人外泌汗腺上皮细胞(Human Eccrine Sweat Gland Epithelial Cells,hESGc)上存在c-Met受体,加入HGF能促进hESGc增殖[2],但下调c-Met表达对hESGc的影响尚不明确。RNA干扰是一种新兴的基因抑制技术,原理是通过设计小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA),介导序列高度同源的靶基因mRNA降解,下调靶基因表达[3]。本文拟利用重组腺病毒介导的siRNA技术下调c-Met表达对hESGc体外增殖的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料与试剂:无血清角质形成细胞培养基(keratinocyte serum free medium,KSFM)和DMEM培养基购自美国Gibco 公司, FITC-Annexin V试剂盒购自美国Trevigen公司,抗Marker 相对分子质量标准品和兔抗c-Met多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司,鼠抗β-actin 抗体购自美国Novus 公司,其他分子生物学试剂购自美国Sigma 公司,pSES-HUS及腺病毒骨架质粒pAdEasy-1, 由美国芝加哥大学分子肿瘤实验室TC. He教授惠赠;限制性内切酶Sfi I, EcoRV, KanI, PmeI,PacI和T4 DNA连接酶 购自美国TaKaRa 公司和New England Biolabs(NEB)公司,Wizard Plus质粒纯化系统购自美国Promega 公司;Bio-Tek多功能读板机购自美国Bio-Tek Synergy HT公司,CKX41-32PH 型倒置相差显微镜及照相系统购自日本Olympus 公司,BioImaging Systems购自美国UVP 公司,FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。
1.2实验方法
1.2.1 细胞培养:hESGc在KSFM 中按我科已经建立的方法培养和鉴定[2],取第1代细胞备用。
1.2.2 重组腺病毒载体的构建:从GenBank中检索到c-Met的cDNA序列(登录号:NM-000245),按照siRNA设计的原则选取靶序列。正义链5'-AGGACAATGATGGCAAGAAATTTT-3',反义链5'-ATTTCTTGCCATCATTGTCCTTTT--3'。参照He等[4-5]的方法先构建腺病毒穿梭质粒pSES-siRNA-c-Met,经Pme I 酶切线性化后,与病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再经Pac I酶切纯化后转染HEK293细胞包装出重组腺病毒,经荧光显微镜下观察红色荧光表达,即为构建成功,命名为AdR-siRNA c-Met,于HEK293细胞中扩增。取仅含有红色荧光蛋白RFP的空病毒(Ad-RFP)做对照。
1.2.3 SiRNA met腺病毒转染hESGc细胞:第1代的hESGc细胞接种于6孔板,KSFM培养,细胞的密度约60%～80%时,测定hESGc细胞的最适感染复数,每孔分别加入AdR-siRNA c-Met 0μl、2μl、4μl、8μl、16μl、48h后,在荧光显微镜下观察,统计表达RFP的细胞百分比(感染效率),取感染效率80%以上,同时细胞没有明显由病毒本身引起的细胞毒现象的病毒量,最终确定为4μl AdR-siRNA c-Met病毒液/孔。同理对照组Ad-RFP合适的病毒量亦为4μl Ad-RFP病毒液/孔。由于培养hESGc细胞时,6孔板每孔中培养基约1ml,故适合用于转染的病毒浓度为4μl病毒原液/ml培养基。
1.2.4 Westernblot检测: 培养14h后,细胞用PBS洗两遍后,加入新鲜的KSFM培养基,转染后48h,取细胞做westernblot检验,明确AdR-siRNA c-Met的有效性。设置对照组(无影响因素),阳性对照组(Ad-RFP转染)和实验组(AdR-siRNA c-Met转染),在转染后48h收集各组细胞,加入RIPA细胞裂解液,超声破碎细胞,提取各组细胞总蛋白并采用BCA定量,取等量总蛋白(40μg)上样,电泳,电转, 5%脱脂牛奶封闭3h, 加一抗(兔抗c-Met多克隆抗体,小鼠抗β-actin 抗体),室温孵育2h,洗膜,加二抗(抗兔IgG-HRP,抗小鼠IgG-HRP),室温孵育1h,洗膜,化学发光法检测,曝光,显影,定影,记录实验结果,Western blot 法测得所有数据均采用UVP BioImaging Systems 采集,将X 线片扫描后的图像数据输入LabWork 3.0 软件进行图像分析,将内参β-actin 作为标准积分吸光度(standard integral absorbance,SIA),各目的条带相对积分吸光度值(relativeintegral absorbance,RIA)=样本积分吸光度值(integral absorbance,IA)/ SIA。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖: 实验分成4组,空白组,对照组,阳性对照组和实验组。空白组不含细胞,仅于96孔板加入200μl KSFM,对照组,阳性对照组和实验组均于96孔板按 2×103个/孔接种hESGc,对照组每孔加入200μl KSFM,阳性对照组每孔加入含4μl /mL Ad-RFP 腺病毒的KSFM 200?l,实验组每孔加入含4μl /ml AdR-siRNA c-Met 的KSFM 200μl 。每一组每一时相点设六复孔。各组在0天,2天,4天时采用MTT法检测细胞增殖情况。从孵箱中取出待测96 孔板,每孔加入MTT 溶液(5g/L)20μl,继续培养4h,弃上清,每孔加入DMSO 100μl,振荡10min,在Bio-Tek 多功能读板机570 nm 波长测定吸光度(A)值,并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(阳性对照组A 值-实验组A 值)/ 阳性对照组A值×100%。
1.2.6 统计学方法:采用SPSS11.0 统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK,P值
2结果
2.1 SiRNA c-Met重组腺病毒转染hESGc:所构建的pSES-HUS-siRNA c-Met干扰序列由美国芝加哥大学医学中心测序中心测序,包含目的基因在内的序列正确。hESGc细胞转染了AdR-siRNA c-Met后,荧光显微镜下可见红色荧光蛋白表达(见图1)。
2.2 Westernblot检测:hESGc细胞转染AdR-siRNA c-Met后48h,收集细胞进行westernblot检测,结果发现,AdR-siRNA c-Met转染能抑制hESGc细胞中c-Met蛋白的表达(见图2),通过UVP BioImaging Systems 采集图像后分析发现,对细胞中c-Met蛋白的抑制能达到70%以上。
2.3 MTT 法检测细胞活力:在加入腺病毒转染之前,各组间A 值比较差异无统计学意义(P>0.05)。腺病毒转染hESGc后,2天,4天均能抑制细胞的增殖,实验组A值与阳性对照组和对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。
3讨论
HGF是一个多效应生长因子,具有多种生物活性,参与机体多种器官组织细胞生长、再生和重塑,研究表明,HGF对多种细胞均有促进增殖和运动的作用,如BMSCs、平滑肌细胞、牙髓细胞、肾小管上皮细胞、角膜上皮细胞以及视网膜上皮细胞等[6-8]。c-Met是HGF特异性受体,其在组织中广泛存在,但是上皮细胞中表达浓度最高[9]。HGF与c-Met结合后,可诱导其发生构像变化,激活受体胞内蛋白激酶结构域中的蛋白酪氨酸激酶(PTK) ,使受体自身的酪氨酸残基磷酸化而激活受体[10]。除自身磷酸化外,c-Met 蛋白的酪氨酸激酶活性可导致多种底物蛋白的酪氨酸磷酸化,经瀑布式磷酸化反应,将信号逐级放大,最终转入细胞核内的转录机构,导致细胞的增殖、分化[11]。
汗腺起着排汗,调节体温,物质交换等重要作用,深入研究汗腺细胞的生物学行为的影响因素,对揭示汗腺及其他管状系统的发育和功能有着重要的意义,我们既往的研究表明[12],hESGc上有HGF特异性受体c-Met表达,含40～80ng/ml的HGF的培养基能明显促进hESGc的增殖,20～40ng/ml HGF可促进hESGc细胞移行(P
RNA干扰技术具有高效、稳定且易操作等特点,Shinomiya等用腺病毒介导的siRNA技术研究发现下调c-Met表达可抑制多种细胞的体外生长,器官发生和体内成瘤[13]。本研究构建了含siRNA c-Met的腺病毒,感染hESGc后能有效的抑制c-Met的表达,下调70%,能明显抑制hESGc的增殖,2天抑制率为16.8% 4天抑制率为34.5%(P
本实验通过基因转染和RNA 干扰技术, 将针对c-Met 基因的靶向siRNA转染入体外培养的hESGc,探讨其对细胞c-Met的表达及细胞增殖能力的影响,为汗腺疾病的基因治疗和汗腺发生发育研究提供新的思路和理论依据。
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篇10
目的：探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表达的影响。方法：刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞，传代培养接种于35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上。实验分为4组，Ⅰ组(对照组)：无血清的DMEM培养液，Ⅱ组：去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组：未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组：将细胞直接接种于无上皮羊膜。作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA，进行RTPCR一步法反应检测各组VEGF mRNA表达并与βactin比较。结果：正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达，在Ⅲ，Ⅳ组中表达受到明显抑制（P＜0.01，n=5）。结论：羊膜培养液明显抑制VEGF mRNA在角膜上皮细胞中的表达。
【关键词】 羊膜；角膜新生血管；血管内皮生长因子；角膜上皮细胞
Abstract AIM: To detect the suppression effects of culture supernatant of human amniotic membrane on the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) in rabbit corneal epithelial (RCE) cells.METHODS: The normal RCE cells were cultured for 7 days until there were confluences on the cultures. The cells were subcultured to plastic(3 groups，ⅠⅢ， Ⅰ was control) and naked amniotic membrane (Ⅳ group) cultures respectively. Then one of plastic group (Ⅱ group) was cultured by culture supernatant of human amniotic membrane without epithelial layer as its medium; another plastic group (Ⅲ group) was cultured by culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium; the other two groups (Ⅰand Ⅳgroup) were still cultured by DMEM (free from FBS components ).After 48 hours， the total RNAs of these cultures were extracted and detected by RTPCR.RESULTS:There were expressions of VEGF mRNA from Ⅰ group and Ⅱ group， however， the expressions were significantly suppressed in Ⅲ group(using culture supernatant of human amniotic membrane with epithelial layer as its medium) and Ⅳ group (RCE cultered directly on naked amniotic membrane) （P＜0.01， n=5）.CONCLUSION: Amniotic membrane transplantation is partly through depressing the mRNA expression of VEGF in corneal cells to reduce the corneal neovascularization of injuried corneal surface. And it may be an efficient method of curing corneal neovascularization in clinic.
KEYWORDS: amniotic membrane; corneal neovascularization; vascular endothelial growth factor; corneal epithelial cell
0 引言
正常的角膜无血管，角膜新生血管（corneal neovascularization， CNV）常由损伤及各种炎症刺激诱导产生。严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；随着新生血管的长入，角膜的免疫赦免地位丧失。虽然目前有多种方法用于治疗角膜新生血管，但均未获得满意疗效。临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用[1]，虽然已知羊膜的细胞外基质及可溶性细胞因子可能参与这一作用机制[2，3]，然而具体作用机制仍不明。最近研究表明，羊膜培养液可明显地抑制角膜新生血管化[4]，为进一步理解这一作用机制，我们应用可能释放多种细胞因子的羊膜培养液，对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响进行研究。
1 材料和方法
1.1 材料
羊膜取自于健康剖腹产孕妇的胎盘，无菌条件下钝性剥离羊膜，用含有抗生素的PBS液（1×105U/L青链霉素）清洗羊膜3次，将羊膜上皮面向上贴附于无菌的醋酸纤维素膜上，放入15cm的玻璃培养皿中，加入DMEM培养基+甘油（V/V，1∶1）混合液，80℃低温冰箱冷冻保存。使用时，将羊膜置于室温解冻，PBS液水化30min，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min，用细胞刮刀轻轻刮除羊膜的上皮层后，用PBS液漂洗3次，剪成4cm×4cm大小备用。将35mm培养皿的底钻掉，消毒后备用。将剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于35mm培养皿上，用手术缝线固定。将羊膜为底的培养皿置于60mm培养皿中，加入少量DMEM培养基（含有150mL/L胎牛血清），于CO2细胞培养恒温箱中过夜。取经无菌处理的新鲜羊膜，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA混合液在37℃消化30min。以细胞刮刀将羊膜的上皮层细胞成分刮掉，将去上皮成分的4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。取经无菌处理的新鲜羊膜，保留其上皮层，将4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中。作用48h后取其上清液待用。
1.2 方法
兔处死后，立即将眼球取出，共30眼。用加有双抗的生理盐水漂洗3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理盐水中，漂洗1次。用手术刀片去掉角膜的内皮层，其余组织上皮面向上移入7.5cm玻璃平皿中，加入2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液，37℃下消化25min后，用刀片将角膜的上皮层轻轻刮下，离心收集上皮细胞接种到25mL培养瓶中，以含150mL/L FBS的DMEM培养基培养，2～3d换液1次。培养7d致形成融合性生长，用2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA的混合液消化后，分别传代接种于35mm培养皿和单纯去上皮羊膜为底物的培养皿组。用含150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养传代细胞形成70%融合性生长后，将各组中的培养液换为无血清的DMEM培养液继续培养12h，以去除其它活性成分的影响。实验分为4组，即Ⅰ组(对照组)：无血清的DMEM培养液，Ⅱ组：去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组：未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组：将细胞直接接种于无上皮羊膜。每组设5个平行孔。12h后，接种于35mm培养皿的Ⅱ组中加入去上皮的羊膜培养上清液作为培养液，向Ⅲ组中加入未去上皮的羊膜培养上清液作为培养液，其余2组仍用无血清的DMEM培养基培养，培养48h后，去除各样本中的多余培养液，并向每个35mm培养皿样品中加入Trizol提取液1mL，最终RNA沉淀物加入DEPC水20μL充分溶解，80℃冷冻保存。PCR引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司设计并合成，用灭菌水配成20μmol/L的溶液，4℃保存。引物序列：VEGF 130bp，Sense TATTCAAGCCTTCCTGCGTG，Antisense TGAGGTTTGATCCGCAT；βactin 320bp Sense GCTGTCCCTGTACGCCTCTG，Antisense TGCCGATGGTGATGACCTGG，将RTPCR反应产物各取5μL，加样于20g/L浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳，80V电压下电泳35min。照相记录结果经扫描通过QuantiScan分析软件处理，以内参照βactin为基准分析计算各条带的相对含量（图1）。
2 结果
正常角膜上皮细胞有VEGF mRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示VEGF mRNA在无血清的DMEM培养基培养组（Ⅰ组）和去上皮的羊膜培养液组（Ⅱ组）中均有表达，在以未去上皮的羊膜培养液组（Ⅲ组）及单纯去上皮羊膜底物培养皿接种组（Ⅳ组）中表达均受到了明显的抑制（P＜0.01，n=5）。
3 讨论
角膜新生血管（neovascularization， NV）常由损伤、炎症、感染、多次角膜眼表手术及各种病理原因所致，这包括各种热化学烧伤及各种炎症刺激。随着眼表重建术的广泛开展，一些严重结角膜疾病所致眼表损伤后的角膜新生血管，已经逐渐成为困扰人们的主要问题。新生血管的形成，为创面的愈合提供了有利的条件，然而大量的新生血管在损伤愈合后，会使角膜失去其特有的光学特性，严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；新生血管的长入使角膜失去相对免疫赦免地位，增加了角膜移植手术排斥反应的发生几率。目前虽有多种治疗方法，但效果均不理想。因而寻找简单、有效的治疗方法，是目前眼科面临的课题之一。临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用[1]，然而具体作用机制仍不十分明确。最近，我们的研究表明[4]，培养羊膜的上清液可明显地抑制角膜新生血管化，并观察到其可能通过抑制血管内皮细胞的生长和迁徙来抑制角膜新生血管形成。另外，Tseng等[5]的一项研究显示，羊膜基质可以抑制角膜和角膜缘成纤维细胞中TGF家族及其受体的表达，提示羊膜可以调控培养于其上角膜细胞的基因表达与行为。我们对体外培养的角膜上皮细胞研究发现，血管活化因子VEGF在正常角膜上皮细胞中均有表达，提示兔角膜上皮细胞可能参与了角膜新生血管的形成或调控。血管内皮细胞生长因子VEGF可刺激多种血管内皮细胞的生长、增殖、迁徙移行，并刺激血管基质细胞分泌细胞外基质，刺激新生血管增生[6]。参与调控多种新生血管形成与增殖，如角膜新生血管化、视网膜下新生血管化的形成及在各种肿瘤的新生血管化的形成中均起着非常重要的作用。其在活跃的新生血管组织及器官，活性也明显增强。在临床中，Tseng等[5]提倡使用保存的羊膜作为移植物，保存的羊膜上的上皮细胞经过反复处理其所具有的作用会大大下降，而临床羊膜移植物一般自然溶解可能需要2wk左右。这样一段时间，羊膜细胞中产生的那些抗炎抗血管形成的物质会被消耗掉。但据临床观察，用保存的羊膜进行移植一样也可获得较好的疗效。为了说明这种现象，我们设计了Ⅳ组，即将兔角膜上皮细胞直接培养在去掉上皮层的羊膜上(羊膜已冷冻保存6mo)，考察其对角膜上皮细胞中VEGF mRNA表达影响。我们发现其与前几组比较，VEGF的表达则受到了明显的抑制。这可能与羊膜基底膜和致密层的生物学特性有很大关系。羊膜的基底膜主要由Ⅳ型胶原，Ⅶ型胶原和层粘连蛋白组成。虽然基底膜中Ⅳ型胶原的α2链与结膜基底膜相同，而无角膜上皮基底膜中Ⅳ型胶原的α5链，但层粘连蛋白1，层粘连蛋白5，纤维连接蛋白和Ⅶ型胶原的成分与角膜基质中的成分是相同的[2]。因此，羊膜的基底膜提供了一个远比其它媒介物质更接近正常眼表成分的微环境，这不但可以促进角膜上皮的生长，而且基底膜中的细胞外基质成分具有抗新生血管形成及抗炎的作用，这也可能是为什么Ⅳ组的角膜上皮细胞中VEGF的表达受到明显抑制的原因。
由于羊膜细胞（尤其是羊膜上皮细胞）能够产生大量的生长因子及抗炎、抗血管生成因子成分，具有抗炎、抗新生血管的作用，因此，我们建议可以在羊膜移植中尽量保留其上皮细胞成分，也许这更有利于羊膜移植后的眼表功能重建。另外，羊膜培养液对角膜新生血管的抑制作用可能为目前眼科临床提供一种简单，有效的治疗方法。 参考文献
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精品范文
1上皮细胞