巨噬细胞范文
时间：2023-03-14 21:46:06
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篇1
【关键词】 巨噬细胞；视神经再生；视网膜小胶质细胞
［Abstract］ The meaning of optic nerve regeneration is the regrowth reaction after optic nerve amputation.People has attached importance to the effect of macrophages in optic nerve regeneration.Retinal neural microglia/macrophages have multiple functions of phagocytosis and destruction，synthesis and secretion of a variety of factors which are closely related to the optic nerve regeneration environment.Injection of macrophages and macrophage conditional medium can promote the optic nerve regeneration.
［Key words］ macrophage;optic nerve regeneration;retinal neural microglia
视神经再生是指存活的视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）生长出新的轴突到中枢神经系统的特定靶位置并恢复正常功能，它包含四层含义：神经保护、轴突延长、与靶组织再联系、功能恢复。视神经切断以后的再生反应表现为“芽生”通过损伤的部位到达远端的靶区。功能再生是指再生的纤维进入原来的或新的靶组织，重新建立突触联系，恢复失去的功能。20世纪80年代以前，人们普遍认为哺乳动物成熟的中枢神经细胞和周围神经不同，损伤后无法再生，作为中枢神经系统一部分的视神经也不例外。直到1980年Richardson等［1］研究发现绝大多数哺乳动物的中枢神经细胞能够再生长入被埋植于大脑，脊髓或视神经内的周围神经移植物中，并经过移植物到达靶区。这一发现推翻了以往的观点，显示了中枢神经系统的神经细胞能够再生，成为中枢神经再生研究历史上的里程碑。从此，人们对视神经再生的可能性和条件性进行了广泛而深入的研究。
普遍认同的观点是，中枢神经系统受损后内环境的改变阻止了神经细胞的再生。据推测［2~4］，这可能与神经细胞如星形胶质细胞和少突细胞等受损后所引起的不适当反应有关，而此不当反应被认为与巨噬细胞募集和增殖活化的延迟及受限所致。周围神经受损后往往能引发有效的巨噬细胞激活与募集，从而自发地再生。Schwartz等［5］指出其他组织恢复的原则同样适用于CNS包括视神经，他认为，巨噬细胞在任何受损组织中都能发挥维持、恢复和防御的基础作用，而巨噬细胞的募集（可能也包括激活）在导致再生的一系列事件中居于最上游的位置。在损伤的周围神经系统，再生可自然发生。其变性和再生似乎是由巨噬细胞介导和控制的。实验［6，7］发现大鼠晶状体受损后能使视网膜神经节细胞（RGC）的存活数量增加8倍，视神经新生轴突数增加100倍，并使得轴突生长入通常被抑制禁止的区域，其机制与神经营养因子（neurotrophic factors，NTFs）无关，而与激活的巨噬细胞有关。晶状体受损能刺激巨噬细胞激活和聚集，且在晶状体未受损时注射能激活巨噬细胞酵母聚糖A（Zymosan A）也促进了RGC轴突再生并长入远处视神经断端。因此，巨噬细胞在视神经再生中的作用开始受到人们的重视，巨噬细胞激活与聚集很可能是神经再生的关键步骤之一，对再生和成长支持的许多继发步骤有重大的作用。
1 巨噬细胞的起源和视网膜中的分布
1.1 起源 早在19世纪末俄国人Metchnikoff就观察到从海星幼体中胚层分离的一种具有阿米巴变形运动特点的细胞能够将颗粒性异物吞入细胞内，因此提出了吞噬（phagocytosis）这个概念，至20世纪70年代Van Furth以单核吞噬细胞系统（mononuclear phagocytic systen，MPS）这一概念取代了网状内皮系统，而单核/巨噬细胞则是MPS的基本组成部分。单核/巨噬细胞是骨髓造血干细胞发育分化而来，在骨髓中经历多能干细胞-定向干细胞（髓样干细胞）-单核母细胞（monoblast）-前单核细胞（promonocyte）-单核细胞的发育过程。骨髓中的单核细胞成熟后进入外周血，血肿的单核细胞穿过学馆内皮细胞间隙进入组织则进一步发育分化为巨噬细胞，广泛分布于全身所有表皮和黏膜下组织，在防御感染，自身稳定和免疫监视中都起着重要作用，可抵抗细菌、真菌和病毒等病原体的感染以及清除凋亡细胞和突变细胞。
1.2 分布 巨噬细胞广泛分布于机体内，包括干的Kupffer细胞、结缔组织的巨噬细胞、肺的尘细胞、骨组织的破骨细胞及表皮的Langerhans细胞等。目前许多证据［8］表明小胶质细胞可能是从血液中单核细胞或多能单核前体细胞演变而来，是分布于神经组织包括视神经内的属于神经系统游走巨噬细胞中的一群。
视网膜小胶质细胞有两种类型：基质小胶质细胞和血管周围小胶质细胞。前者是在哺乳动物胚胎约第10周由血液单核细胞或其前体经睫状体扁平部进入视网膜转变而成，表面标志为CD45，MHCⅠ，MHCⅡ；后者是小胶质细胞在胚胎第14周从视神经进驻视网膜后在血管周围形成，具有巨噬细胞表面抗原S22，CD68［9］。
2 巨噬细胞在视神经再生中的功能和作用
视神经再生的困难很多，主要有三个:（1）视神经横断伤后RGC会死亡。将成年大鼠的视神经在近眼球处横断，1周后RGC死亡50%，在1个月末时则达90%。（2）大部分成熟的横断后的RGC不会程序性地再开始轴突延长。（3）视神经内环境中的很多因子在横断伤后表达增加，对轴突生长起抑制作用;而且，许多营养因子缺乏也使轴突难以生长。因此，在神经保护使RGC存活的前提下，视神经再生的研究集中于制造一个适合的环境，主要有三方面［10］:（1）移除髓鞘及其产物如髓鞘相关糖蛋白等对轴突再生的抑制作用。（2）提供额外的神经营养因子，如:脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophin factor，BDNF），神经营养因子4/5（neurotrophin-4/5，NT-4/5），睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor，CNTF），酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）等。（3）促进轴突内在的生长潜能。
像所有吞噬细胞一样，视神经小胶质细胞具有吞噬和杀伤，合成和分泌多种活性因子等主要功能。而这些功能无一不与营造上述适合视神经再生的内环境有密切关系。
2.1 巨噬细胞的主要功能
2.1.1 吞噬功能 小胶质细胞在正常视网膜内一般处于静止状态，此时其氧耗量比较低，表面MHC-Ⅱ类分子水平较低，很少甚至不分泌细胞因子。在损伤早期小胶质细胞即被微小的病理变化所激活后，如中枢神经系统炎症时小胶质细胞接受损伤信号刺激后立即以较快的速度向损伤部位迁移，并附着于受损神经元表面。若损伤轻微易修复则小胶质细胞不转变为吞噬型；若损伤严重则小胶质细胞将转变为吞噬细胞行使吞噬功能［11］。部分小胶质细胞在贴近受损神经细胞后会处于一种介于静止和激活之间的中间状态，它们会很快增殖，消化和降解微小生物，死亡的细胞及其他组织碎片，促进组织修复［12］。
视网膜小胶质细胞转变为吞噬型后能吞噬鞘磷脂［13］包括MAG，并将其分解后进入脂质降解产物的循环［14］。CNS髓磷脂是髓鞘的化学成分，是由成熟少突胶质细胞的质膜生长形成的，未成熟的少突胶质细胞无形成髓鞘的能力，发育过程中其在阻止神经发芽及稳定视通路的神经纤维轴突数中起了一定作用。用X线照射或用有丝分裂抑制剂有效抑制新生大鼠脊髓内少突胶质细胞的发生和形成髓鞘，则大鼠损伤后视神经可获成功再生［15］。体外实验证实髓磷脂连接蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）也具抑制神经细胞轴突生长的作用。MAG是含量很高的一种髓磷脂蛋白。1994年，Mclerracher等指出在试管内MAG能抑制神经突生长。Eric等［16］用挤压后的15d鸡胚的视网膜-视神经移植物做实验。采用CALI法消除MAG的作用，使视网膜轴突明显再生越过了包含CNS髓磷脂的损伤区。电子显微镜观察到神经横断处有大量再生轴突越过断端裂口。在神经残端用衰退性标记横断的视神经，未发现有被标记的视网膜神经元，与未被切断的神经几乎毫无区别。这些结果表明CNM是一种重要的髓磷脂源性神经再生抑制成分。除去MAG作用可显著促轴突生长越过CNS损伤区。视网膜小胶质细胞可能是通过吞噬鞘磷脂包括MAG来促进轴突生长。
2.1.2 分泌神经营养因子 大量研究证实补充神经营养因子能改善神经再生的微环境，使视网膜神经元细胞避免损伤或死亡，促进神经再生及功能恢复。体外研究揭示，小胶质细胞/巨噬细胞可分泌生长因子如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF），神经营养因子-3（neurotropM 3，NT-3）、转移生长因子（transfroming growth factor，TGF）等。Batchelor等［17］在体内实验中发现，激活的小胶质细胞能表达BDNF和胶质细胞源性神经营养因子。体外研究［18］表明，巨噬细胞分泌的物质有促进纤维增生和血管再生功能，然而未激活的巨噬细胞上清液并没有这种功能。激活的巨噬细胞可分泌100多种蛋白质分子，其生物活性影响到细胞生长与死亡以及免疫炎症反应的每一个方面。其分泌血小板衍生生长因子（PDGF），表皮生长因子（EGF），和胰岛素样生长因子（IGF-I）等能促进视网膜色素上皮细胞（RPE）增生［20］。Chamak等［21］发现鼠脑损伤早期会出现凝血酶致敏蛋白（一种细胞外基质蛋白）的积聚。它是由脑巨噬细胞合成和分泌的。从胚胎鼠脑分离的巨噬细胞可促进培养的CNS神经元的神经轴突生长和再生，这种作用可被凝血酶致敏蛋白抗体所抑制。他们认为，在发育或在病理情况下，巨噬细胞有助于轴突的生长或再生。Lotan等［22］发现视神经损伤后TNF和集落刺激因子1能明显增加侵入视神经的巨噬细胞的数量，而且TNF-α可改变视神经黏附神经元的性质，增强培养的PCJ 2细胞在其上的黏附。而这种神经元的黏附与轴突的再生能力相关。这些结果提示。在CNS损伤部位增加激活的巨噬细胞小胶质细胞的数量可能有助于增强一些有利于生长的神经营养因子、细胞因子和细胞外基质（如层粘连蛋白、凝血酶致敏蛋白）的分泌，提供一个有益于促进轴突再生的环境。Lin等［23］通过体内体外实验均发现在大鼠视神经损伤处聚集的巨噬细胞能分泌编码EphB3的mRNA并表达可组成EphB的蛋白分子，而EphB分子能提高大鼠视神经的再生功能。
2.2 巨噬细胞抑制因子 一些研究已指出与身体内的其他组织相比（包括周围神经），中枢神经受损后，巨噬细胞的募集功能受限，表现为巨噬细胞的缺乏和活性的抑制。事实上，在中枢神经系统内存在一个抑制巨噬细胞募集和激活的因子，而这可能是中枢神经不能再生的一个因素［24~27］，我们称之为内在的巨噬细胞抑制因子［28］。在正常视神经，星形胶质细胞和少突胶质细胞均表达阿朴脂蛋白E，在视神经横断后1周星形胶质细胞的阿朴脂蛋白E表达减少，而且侵入的巨噬细胞很少，可能的原因就是因为存在这种可溶性巨噬细胞抑制因子［29］。
2.3 与雪旺细胞的相互作用 神经生长因子（NGF）是神经系统最重要的生物活性分子之一，是参与损伤神经再生和功能恢复的重要因素。如果能提高神经损伤后局部合成、分泌NGF的水平，必将有利于神经再生。神经损伤后局部趋化的巨噬细胞能促进雪旺细胞分泌NGF，Heumann等［30］发现神经损伤后在体内试验中出现了NGF及NGFR-mRNA水平不同程度的增加，但在培养坐骨神经段则仅出现了NGFR-mRNA水平的增加，未出现NGF mttNA增加，但当在培养基中加入激活的巨噬细胞或应用巨噬细胞调理液进行培养时，NGFmRNA出现了类似于体内的增加合成，这提示NGF-mRNA在雪旺细胞内的表达增加是由巨噬细胞分泌的某种因子来进行调节的。Lindlaolm等［31］在培养基中加入白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1），得到了与加入激活巨噬细胞相同的结果，而巨噬细胞可以分泌IL-1，所以神经损伤后局部NGF的合成增加是由巨噬细胞分泌IL-1作用于雪旺细胞，从而引起NGF-mRNA增加合成并进行翻译而完成的。近年来研究发现，向培养雪旺细胞中加入转移生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF- β1），结果NGF和NGFR-mRNA的水平均明显下降，并能激发雪旺细胞增生。巨噬细胞能合成和分泌TGF-β1，说明巨噬细胞除可对NGR-mRNA进行上调外，还可通过分泌TGF-β1对NcFmRNA进行下调，这进一步说明巨噬细胞对神经再生具有重要影响。
3 注射巨噬细胞以及巨噬细胞调理液
3.1 注射巨噬细胞 Schwartz［32~33］研究小组的一系列研究提示移植激活的自体巨噬细胞可有助于克服CNS再生障碍，促进轴突的再生，有利于脊髓功能的改善和视神经的再生。血管的形成和雪旺氏细胞的渗入也更明显，这使层粘连蛋白增高，为轴突再生提供了一个合适的基质。Lazarov等［34］通过实验证实在横断处植入活化的巨噬细胞可促进RGC轴突长入远端的视神经，他们切断视神经，但保留血供和神经鞘的完整，巨噬细胞在体外孵育时用坐骨神经碎片活化后以混悬液植入横断处，7~8周后4Di-10ASP逆行标记发现有轴突再生。Yuqin等［35］将雄性大鼠在视处钳压2 mm，5 s后制成视神经损伤模型。在其伤眼内损伤当日（A组）和3天后（B组）分别注射安慰剂PBS（n=4/每组）作为对照组，实验组在实验前7天（a组）和3天（b组），损伤当日（c组）和损伤后3天（d组），7天（e组）分别都注射酵母聚糖A（n=4/组）。提前7天注射酵母聚糖即可使局噬细胞水平大量增高并维持一至两个礼拜，而a组和b组未见能明显改善视神经再生水平，c组，d组平均能使受损侧神经生长4.7 mm，是a，b组的2倍，这提示并非巨噬细胞的数量决定了RGCs能否被刺激产生新的轴突和程度。d组是c组提高神经轴突再生水平的1.6倍（P=0.06），是B组的9倍（P
3.2 巨噬细胞调理液（macrophage conditional medium，MCM） 将生后2~3天Swagae-Dawley大鼠视网膜组织经胰蛋白酶消化后进行培养，并设对照组。结果培养在鼠尾胶原上的视网膜神经细胞（retinal Neurol，RN）生长良好，且部分细胞伸出突起培养1、3、5天，MCM促RN存活率分别为40.7％、39.9％和51.2％。故认为MCM能明显促进培养RN的存活和生长，表明MCM中存在某些促进RN存活的营养物质［37］。
4 展望
一些动物实验在一定程度上说明了适度激活的小胶质细胞/巨噬细胞有利于CNS损伤后结构和功能的修复。调控小胶质细胞/巨噬细胞的功能将是未来应用小胶质细胞/巨噬细胞作为一种治疗视神经损伤手段的方向。
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篇2
【关键词】巨噬细胞；小鼠；吞噬功能；检测方法
细胞吞噬作用最早是单细胞动物摄取营养物质的方式，也是原始防御作用。通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察，可使学生加深理解细胞吞噬作用的过程及意义。本项目通过改用酵母菌作为吞噬颗粒，希望可以得到更全面、直观、生动的巨噬细胞吞噬观测效果。同时，改用体外吞噬法来检测巨噬细胞的吞噬功能，使实验更加简便、易行、经济。通过以上优化及改进，旨在探讨建立一种更为经济，简便直观的观察小鼠巨噬细胞吞噬效果的实验改良法。
一、材料
1．小白鼠腹腔注射液
6%淀粉肉汤。在100mL蒸馏水中加入牛肉膏0.3g，蛋白栋1g，氯化钠0.5g，加热后加入可溶性淀粉6g，促使溶解后煮沸灭菌，置4℃冰箱保存。用时水溶融化即可。
2．吞噬物
酵母菌菌液。将酵母菌接种于麦汁斜面培养基上，培养24小时后，用生理盐水反复吹打冲洗斜面培养基上的酵母菌，离心收集菌体，制成菌悬液后加热杀死菌体。用1％美蓝染色，反复生理盐水洗涤离心3次后，制成菌悬液，可长期4℃冰箱保存备用。
二、方法
在实验前一天，给小白鼠腹腔注射6%淀粉肉汤1mL/只，轻按小白鼠腹部，使悬液分散。24h后将注射过淀粉肉汤的小白鼠腹腔注射10亿/mL的酵母菌菌液1mL/只，颈椎脱臼法处死小鼠，用注射器从小鼠腹腔吸出腹腔液。在eppendorf管中各加入巨噬细胞悬液和酵母菌菌液各300µL，置37℃温箱保温20min。用滴管吸取混合液滴片，加盖玻片后直接用高倍镜观察，并随时滴片继续观察不同时期的吞噬状态。
三、效果
本实验与常规体内吞噬鸡红细胞法相比，具有以下特点：①改选酵母菌作为吞噬颗粒来观察巨噬细胞的吞噬效果。酵母菌体积极较小，与鸡红细胞相比更易被巨噬细胞吞噬，因此在有限的实验时间内更易观察到吞噬现象的三种阶段，吞噬现象观察更为生动全面。酵母菌还可预先被染色，与其它细胞区分明显，在显微镜下有更加直观、生动的观察，在室温适宜时，还可作吞噬过程的连续摄影，增加了实验的直观性。另外，酵母菌可长期保存，活化方法简易可行，较血细胞而言大大节省了实验费用；②改用直观简便的体外eppendorf管法来达到实验效果。在此法中，巨噬细胞和酵母菌各取适量于eppendorf管中，两者完全处于自由悬浮状态，有充分的接触机会，比在体内注入酵母菌更易全面接触，所以检测的吞噬指数更高，观察更为清晰直接。还可避免学生在注射鸡红细胞时常因注射部位的偏差，吸取腹腔液观察时常有鸡红细胞量过少的等问题出现，导致实验结果观察失败。③优化后实验可与动物免疫血清制备及其检测的实验相结合，使得老鼠实验成本大为降低，从而更加经济。总之，希望采用这种方法后，使巨噬细胞吞噬实验变得操作简单，易于掌握，费用降低，观察时清晰可辨，以达到较好的教学效果。
作者简介：
篇3
关键词：SRT1720 动脉粥样硬化 泡沫化程度 氧化低密度脂蛋白
Experimental Study on the Optimal Administration Time of SRT1720 in Inhibiting the Foaming of Macrophages
JIANG Yi-hua WANG Qian CAI Jin-yu LYU Xue-yang WANG Qi ZHOU Xiao LI Jing-jing
School of Medical Imaging,Xuzhou Medical University;
Abstract：Objective To investigate the relationship between the suppression of macrophage foaming by SRT1720 and the administration time.Methods Macrophage RAW264.7 was planted on three 24 well cell culture plates. Each plate was divided into three groups to culture cells. Control group only added medium and oxLDL group added 60 μ g/ml ox-LDL, ox-LDL + srt1720 group, 60 μg/ml ox-LDL, cultured for different times(0,12, 24 h) and then added 10 μmol/L SRT1720 intervention, oil red O staining and cholesterol determination, compared macrophage foam inhibition situation. Results Compared with the control group, the cholesterol content in ox-LDL group increased at 0, 12 and 24 hours, the difference was statistically significant(P <0.05); Compared with ox-LDL group, the ratio of oil red O staining at 0 and 12 hours in ox-LDL + SRT1720 group decreased, the difference was statistically significant(P<0.05), and the ratio of oil red staining at 24 hours decreased slightly, but the difference was not statistically significant(P>0.05); The cholesterol content in ox-LDL + SRT1720 group decreased at 0 h, the difference was statistically significant(P <0.05), and decreased slightly at 12 and 24 h, but the difference was not statistically significant(P >0.05).Conclusion SRT1720 has a better inhibitory effect when administered in the early stage of atherosclerosis.
Keyword：SRT1720; Atherosclerosis; Degree of foaming; Oxidized low-density lipoprotein;
巨噬细胞泡沫化（macrophage foam）是动脉粥样硬化的重要因素，脂质的过量存积则是泡沫化的主要原因，减少细胞内己经存积的脂质对抑制泡沫化有重要作用[1-3]。去乙酰化酶1(SIRT1）通过减少泡沫细胞的形成阻止动脉粥样硬化[4-6]，使肝X受体（LXR）去乙酰化后可以上调后者的活性，促进胆固醇逆转运将胆固醇从细胞内排出，通过抑制早衰防止内皮功能紊乱。已证实SIRT1在巨噬细胞中可以降低动脉粥样硬化的发生。此外，还有研究发现SIRT1通过抑制NF-k B信号通路[7]降低凝集素样ox-LDL受体-1(Lox-1）的表达，从而降低氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的摄取[8,9]。SIRT1在稳定斑块、降低胆固醇摄取、抑制巨噬细胞泡沫化以及减轻炎症反应等方面的积极作用，使其成为防治动脉粥样硬化的新靶标。SRT1720是人工合成的SIRT1特异性激活剂，SRT1720通过与氨基末端催化区的变构位点结合，连接到SIRT1酶-肽底物复合物上，降低乙酰化底物的米氏常数值，从而激活SIRT1[10-13]。已有研究表明[14],SRT1720可以抑制巨噬细胞泡沫化，但是对于SRT1720的干预时间对巨噬细胞的泡沫化的抑制效果的影响报道罕见，本研究分别在巨噬细胞经ox-LDL干预不同时间后加入SRT1720，观察SRT1720的干预时间对治疗效果的影响，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物及材料
小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购于中国科学院细胞库（上海），氧化低密度脂蛋白ox-LDL购于上海源叶生物科技有限公司（上海），SIRT1激活剂SRT1720购于大连美伦生物科技有限公司（大连），油红O购于上海索桥生物科技有限公司（上海），总胆固醇测试盒购于南京建成生物工程研究所（南京）。
1.2 方法
将巨噬细胞RAW264.7种植于3个24孔细胞培养板，每个培养板分3组培养细胞，Control组只加培养基，ox-LDL组加60μg/ml ox-LDL,oxLDL+SRT1720组先加60μg/ml ox-LDL，分别培养不同时间（0、12、24 h）后再加入10μmol/L SRT1720干预，采用油红O染色和胆固醇测定，比较巨噬细胞泡沫化抑制情况。
1.2.1 油红O染色
细胞培养终止后，去掉原细胞培养液，PBS漂洗3次，5 min/次；用4%多聚甲醛室温下固定15 min，固定结束后PBS漂洗5 min×2次；取油红O储备液6 ml，加入蒸馏水4 ml配成油红O工作液，混合后静置10 min，滤纸避光过滤后配成油红O工作液，每孔加入油红O工作液200μl，避光染色40 min；蒸馏水洗10 s×2次，光镜下观察并拍照。
1.2.2 胆固醇含量测定
细胞培养结束，光镜下带200μm标尺拍照，随机取10个细胞，通过细胞与标尺的比例关系计算平均细胞直径，细胞密度取水的密度，由球体体积计算公式和细胞质量计算公式算出细胞质量；对细胞进行消化分离，制备细胞悬液并取出，1000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；用PBS清洗2次，取少量细胞悬液计数，计算每孔的细胞数量，计算细胞质量；清洗后以1000 r/min离心速度离心10 min；弃上清液，留细胞沉淀；加入0.2 ml无水乙醇进行匀浆，冰水浴条件下超声破碎（功率300 W,3 s/次，间隔9 s，重复5次），制备好的匀浆直接测定；准备96孔板，以样本工作液为1∶100比例混匀，每个样本3个平行组加入96孔板中；37℃孵育10 min，设置分光光度计波长510 nm，测定各管吸光度值；胆固醇含量（mmol/g组织）=（样本OD值-空白OD值）/（校准OD值-空白OD值）×校准品浓度（mmol/L）/待测样本质量浓度（g/L）。
1.3 统计学方法
油红O染色拍照结束后，采用Image J分析软件计算出染红区域面积和细胞总面积的比值，对油红O染色的巨噬细胞进行定量分析；采用spss 25.0统计软件进行统计学分析，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，用沃勒-邓肯（W）法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 光镜下观察油红O染色处理组巨噬细胞泡沫化情况
o-x LDL组及ox-LDL+SRT1720组0、12、24 h细胞泡沫化程度均高于Control组，其中0 h加入SRT1720对巨噬细胞泡沫化的抑制效果最佳，见图1～图3。
2.2 油红O染色
2.2.1 ox-LDL处理不同时间加入SRT1720的巨噬细胞油红染色比
SRT1720直接干预可以显著抑制巨噬细胞的泡沫化，随着泡沫化程度的增加，药物的抑制效果呈递减趋势，见图4。
图1 ox-LDL与SRT1720同时干预后巨噬细胞的脂质沉积
图2 ox-LDL处理12 h后加入SRT1720干预后巨噬细胞的脂质沉积
图3 ox-LDL处理24 h后加入SRT1720干预后巨噬细胞的脂质沉积
图4 ox-LDL处理不同时间加入SRT1720的巨噬细胞油红染色比
2.2.2 各组细胞中油红染色脂质沉积比较
与Control组比较，ox-LDL组0、12、24 h油红染色比均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与ox-LDL组比较，oxLDL+SRT1720组0、12 h油红染色比降低，差异有统计学意义（P<0.05),24 h组油红染色比略降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；巨噬细胞泡沫化后，SRT1720越早期给药其抑制效果越佳，见表1。
2.3 胆固醇测定
与Control组比较，ox-LDL组0、12、24胆固醇含量均增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与ox-LDL组比较，ox-LDL+SRT1720组0 h胆固醇含量减少，差异有统计学意义（P<0.05),12、24 h胆固醇含量均略减少，但差异无统计学意义（P>0.05）；在巨噬细胞刚开始泡沫化时SRT1720给药有抑制效果，见表2。
表1 各组细胞中油红染色脂质沉积比较（±s,%)
表2 各组细胞中胆固醇含量比较（±s,mmol/g)
3 讨论
动脉粥样硬化是慢性炎症性、严重危害人类健康的疾病，而脂质氧化在动脉粥样硬化的形成与发展过程中起着重要作用。有研究表明[2]，巨噬细胞参与了动脉粥样硬化的全过程，是泡沫细胞形成过程中的关键因素；另有研究报道[14]，在兔主动脉晚期动脉粥样硬化病灶中大约45%的细胞，在人冠状动脉粥样硬化病灶中超过50%的细胞属于VSMC来源，且多于巨噬细胞。血液中的单核细胞会在血管内皮受损的情况下通过内皮间隙，然后在内膜下转化为巨噬细胞，巨噬细胞可以介导渗入血管内皮下的低密度脂蛋白（LDL）发生氧化修饰，最终形成氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）。巨噬细胞吞噬大量ox-LDL，导致细胞内脂质堆积，最终形成泡沫细胞。因此，减少胆固醇的流入或增加其流出对减少动脉粥样硬化的发生具有十分重要的意义。
已有研究表明，SIRT1是去乙酰化酶家族（SIRT1-7）的一员，在维持细胞能量、脂质代谢及葡萄糖稳态等方面发挥重要作用[7]。近年来，SIRT1在动脉粥样硬化防治方面的保护作用逐渐受到研究者的关注。SRT1720是人工合成的SIRT1特异性激活剂，通过与氨基末端催化区的变构位点结合，连接到SIRT1酶-肽底物复合物上，降低乙酰化底物的米氏常数值，从而激活SIRT1。曹小洁等[7]的研究已证明SRT1720可以抑制ox-LDL诱导的泡沫细胞的形成，但是对其最佳的给药时间尚无研究。为了提高药物的利用率和降低药物对人体的伤害，不同时期的动脉粥样硬化治疗应该对应不同的药物。SRT1720具有一定的毒性，因此通过设定准确的服药时间，不仅可以给获得较好的治疗效果，还能降低不必要用药给人体带来的危害。
本研究采用在同等操作环境下，巨噬细胞经ox-LDL处理不同时间SRT1720给药，比较巨噬细胞泡沫化的抑制情况。油红O染色和胆固醇测定结果显示，ox-LDL干预时间越久，其泡沫化程度越高，ox-LDL与SRT1720同时加入可以显著抑制巨噬细胞的泡沫化，由此推测动脉粥样硬化在此时期给予SRT1720治疗，几乎可以完全抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取。而随着泡沫化程度的增加，相同量的SRT1720抑制巨噬细胞泡沫化的效能有所降低。因此推测SRT1720可以抑制巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄入，对已经泡沫化的巨噬细胞发生逆向转变的效果并不明显。
研究显示[15]，在动脉粥样硬化早期发现疾病的患者较少，动脉粥样硬化疾病早期病理变化和特征性标志是斑块内泡沫巨噬细胞的浸润，泡沫细胞的数量和分布是引起斑块不稳定性的重要发病基础，与临床急性心血管事件的发生呈显著相关。有研究试图通过影像学手段，实现对动脉粥样硬化易损斑块形态和成分性质的早期可视化诊断[16]，经过诊疗一体化纳米粒子[17]的预治疗，可以降低血管完全堵塞的风险。尤其是对斑块内泡沫巨噬细胞进行早期识别及动态定量监测，对于预防急性心脑血管事件的发生具有重要意义，因此诊疗一体化纳米探针的制备在预防动脉粥样硬化斑块形成的研究具有重要意义。
综上所述，SRT1720对于动脉粥样硬化的早期治疗效果最好。如果可将其制成纳米探针，对斑块内泡沫巨噬细胞进行早期靶向诊断治疗。由于研究表明对于中晚期的动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫化抑制情况并不明显，因此其治疗方法及加药量尚不明确。SRT1720对巨噬细胞泡沫化的影响还有待进一步研究，可能对于提高其临床的治疗效果具有重要意义。
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篇4
【摘要】
目的： 检测小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达情况及糖皮质激素甲基强的松龙对TLRs mRNA表达的影响. 方法： 应用RTPCR检测正常小鼠腹腔巨噬细胞TLR113的表达；并以甲基强地松龙为免疫抑制剂，诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达变化. 结果： 已发现的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达；小鼠腹腔巨噬细胞经糖皮质激素处理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上调. 结论： Toll样受体是抗真菌先天免疫的重要组成部分. 甲基强的松龙对巨噬细胞有毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少.
【关键词】 小鼠；泼尼松龙；免疫抑制法；Toll样受体
【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
0引言
Toll受体在果蝇的发育和抗真菌免疫中具有显著作用. 实验证实TLRs(tolllike receptors)表达异常会使免疫炎症反应不能正常发生，降低机体对病原微生物的清除能力［1］. 糖皮质激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎症和抑制免疫反应［2］. 近20年来，由于应用糖皮质激素而致机体免疫机能低下的患者患侵袭性曲霉菌病日趋增多. 体内外实验显示糖皮质激素在免疫和炎症应答中有促进和抑制作用，甚至出现双向作用［3］. 为了解糖皮质激素对TLRs表达的影响，我们以甲基强地松龙为免疫抑制剂，在诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA的表达情况.
1材料和方法
1.1材料
Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周龄，体质量20～25g（第四军医大学实验动物中心）. 总RNA提取试剂TRIZOL Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基强的松龙，40 mg/支(比利时法玛西亚普强公司).
1.2方法
1.2.1糖皮质激素诱导小鼠免疫抑制及腹腔巨噬细胞计数
将免疫抑制组小鼠12只皮下注射甲基强的松龙100 mg/kg·d， 共3 d. 正常对照组小鼠12只皮下注射同体积注射用水. 第4日脱颈处死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪开腹部皮肤，暴露腹部，用注射器吸取5 mL无血清RPMI1640培养液注入腹腔，轻揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬细胞悬液，移入离心管中计数.
1.2.2细胞总RNA的提取
收集腹腔巨噬细胞悬液，2000 g离心10 min，弃上清，RPMI1640洗涤1次. 用TRIZOL Reagent一步法提取巨噬细胞总RNA.
1.2.3TLR1~13 PCR引物
根据GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成（表1）. 表1基因名称和序列（略）
1.2.4RTPCR扩增TLR1～13基因及内参照βactin基因按照说明书，以Random Primers为引物，将从小鼠腹腔巨噬细胞中提取的总RNA逆转录合成cDNA. 分别用TLR及内参照βactin两组引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循环32次，延伸7 min.
1.2.5扩增产物检测取10 μL PCR产物，15 g/L 琼脂糖凝胶电泳40 min，随后在凝胶成像系统中分析电泳带的吸光度值. TLRs的相对含量为TLRs与内参βactin吸光度比值表示.
统计学处理：实验结果以x±s表示，两组间差异比较用t检验，多组间比较采用KruskalWallis H检验.
2结果
2.1小鼠腹腔巨噬细胞数量变化将甲基强的松龙注射后，小鼠腹腔巨噬细胞数量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比较有统计学差异（P
2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞的表达经RTPCR检测，TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达(图1).
2.3免疫抑制状态下小鼠腹腔巨噬细胞TLRs的表达变化糖皮质激素可上调巨噬细胞上部分TLRs mRNA表达(图1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表达量增加约1.2～2.0倍(表2). 若
3讨论
TLRs在不同组织细胞的表达各异 ，可分为广泛表达、限制性表达或特异性表达［4］，如TLR1分布于各类免疫细胞，TLR2，4，5只在髓源性细胞表达，TLR3则主要表达于树突状细胞. 小鼠腹腔巨噬细胞为常驻巨噬细胞，是防御病原微生物入侵的第一道防线. Muzio 等［5］研究显示， 单核/巨噬细胞在发育成熟的不同阶段表达大多数TLRs，但不表达TLR3. 我们的结果证明TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达，包括TLR3. 当局部受到细菌、真菌及病毒感染时，巨噬细胞上的TLRs可识别不同的病原体相关分子模式如细菌脂肽、dsRNA，LPS和细菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫应答并启动获得性免疫应答.
多种病原微生物成分或细胞因子可上调或下调TLRs表达，如LPS可诱导TLR2，TLR4及TLR9的表达，IL6可使TLR7的表达明显升高，INFγ可上调TLR9的表达. Renshaw等［6］研究证实，老龄小鼠的脾细胞和腹腔巨噬细胞TLR1～9的表达显著减少，且TLRs功能下降，这可能部分解释老年人对各种病原菌感染的易感性增加. 糖皮质激素是广泛应用的抗炎剂，其抗炎效应的发挥是通过下调依赖NFκB的大量炎症应答相关基因的转录，而TLRs的上调可诱导NFκB的活化［7］. 研究发现，大剂量应用糖皮质激素是机会性真菌易感的主要危险因素之一，理论上推测糖皮质激素可能下调TLRs表达. 我们的结果显示，甲基强的松龙在mRNA水平上调巨噬细胞部分TLRs表达，其调节机制还不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松对呼吸道上皮细胞TLRs家族成员表达的调节，发现地塞米松可上调TLR2～6的表达，与我们的研究结果相一致. Shuto等［7］研究证实，地塞米松协同增强非典型流感嗜血杆菌诱导的TLR2上调，是通过p38MAPK信号途径的负调节. Franchimont等［9］将地塞米松加入LPS刺激的全血细胞培养中，发现地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，证明了糖皮质激素可强烈抑制Th1细胞促炎因子的分泌，而对Th2细胞抗炎因子的分泌有正调节作用. 糖皮质激素对巨噬细胞部分TLRs有上调作用，免疫功能低下患者易发生机会性感染，但究竟是通过对Toll样受体信号通路中哪些环节的抑制而发挥作用的？糖皮质激素上调部分TLRs表达的准确分子机制是什么？这将有待于进一步研究.
以往研究认为，糖皮质激素可明显改变单核巨噬细胞的功能，能抑制巨噬细胞的吞噬和加工处理抗原功能，阻止单核细胞分化为巨噬细胞. 我们在实验中观察到糖皮质激素甲基强的松龙对巨噬细胞的毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少，RAW264.7细胞经甲基强的松龙作用后细胞生长受到抑制甚至死亡. 尚未见文献报道糖皮质激素对巨噬细胞的直接毒性作用，甲基强的松龙抑制巨噬细胞生长或诱导死亡可能是免疫抑制小鼠对烟曲霉菌易感的机制之一.
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篇5
巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是一种重要的前炎症因子，主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，还能促进多种炎性细胞因子的生成。MIF广泛参与机体多种生理及病理生理学反应，包括炎性反应、肿瘤生成和皮肤创伤修复等。MIF在病毒性心肌炎发病机制中起重要作用。近年来，随着克隆MIF cDNA的成功及其结构的阐明，MIF的特殊生物功能及其在不同炎症性疾病中的重要作用已日益为人们所重视。病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是由亲心肌病毒感染所致以心肌炎症病变为主的疾病，MIF是一种重要的促炎因子，MIF在VMC发病机制及治疗中的作用成为目前研究的热点。因此，本文将MIF的最新进展及其与VM的关系作一综述。
1 MIF的细胞和组织学来源
MIF既产生于激活的T细胞、单核巨噬细胞及脑垂体前叶，也产生于多种组织细胞，哺乳动物的MIF mRNA和蛋白广泛表达于各种各样的造血细胞、中枢和外周神经细胞、具有内分泌和外分泌功能的上皮细胞、脂肪细胞、表皮细胞、汗腺细胞、肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞及内皮细胞、皮肤角质细胞、肝细胞、肺、前列腺及等[1]。单核巨噬细胞是血液中MIF的主要来源。
2 MIF的膜受体
细胞因子通常需要与其相应的受体结合，活化信号传导途径而发挥生理作用。目前大量研究证实MIF激活丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）家族成员之一的细胞外信号调节激酶（ERK1/ERK2）传导通路，而对其激活方式是受体依赖型还是非受体依赖型的研究也是近年来的热点。2003年Leng等[2]研究发现，CD74是MIF的可能膜受体。MIF可能通过与细胞膜表面蛋白CD74的细胞外基团结合而发挥作用。CD74为MHCⅡ类相关恒定链，是一种跨膜蛋白。MIF与CD74分子的胞外部分即73-232位氨基酸残基高亲和力结合后，激活ERK磷酸化级联反应，从而引起各种细胞的增生及炎性介质的合成与释放，产生各种生理效应，而两种抗CD74抗体（LN2或M-B741）可明显阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473-232及抗CD74 中和性抗体均可抑制细胞膜上的CD74分子与MIF的结合，从而阻抑MIF的促炎作用。
3 MIF的基因与蛋白结构
人类基因组中MIF定位于21号染色体(21q22，3)，为单拷贝基因。但在小鼠基因组中，则是由10个以上假基因组成的多拷贝基因，定位于10号染色体上。MIF的基因较小，人和小鼠的MIF mRNA长度大约为0.8 kb。1995年，美国Duke大学医学中心Picower医学研究所Mitchell等人首次克隆了人MIF基因。人MIF基因全长约2 119 bp，其编码区由3个外显子和2个内含子组成，启动子区域有几个保守的DNA序列可以和转录因子AP1、NF-κB、ETS、GATA、SP1、cAMP结合元件反应蛋白等结合，从而受其调控。在MIF cDNA序列中，第173位碱基G或C的变化构成了MIF的单核苷酸多态性。MIF蛋白结构独特，为α/β结构，以同源三聚体形式存在，通过单体内的β2片层及α2螺旋C末端之间氢键相互作用加以稳定[3]。人和啮齿类动物MIF蛋白质的一级结构为115位氨基酸残基，相对分子量为12.5 kD。不同种动物的MIF蛋白质分子的氨基酸序列同源性大于80%，同源性最高的为大鼠和小鼠的MIF蛋白质，仅差1个氨基酸，人和小鼠的同源性也高达90%。人和大鼠的MIF蛋白质三维结构基本相似，差别仅在于C末端的11氨基酸碱基上。
4 MIF的生物学功能
4.1 免疫调节功能：MIF是先天性免疫和获得性免疫的重要调节因子，是宿主抵抗致病微生物免疫防御系统和应激反应系统中不可缺少的成员。在免疫过程中，MIF不仅有抑制巨噬细胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，还促进其在炎症局部浸润、增生、激活及通过调节细胞信号转导，促进某些细胞因子的表达，分泌细胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ，同时使NO释放增加和磷脂酶A2的表达增强，产生促炎作用[4~5]；而抗MIF中和性抗体则对过度炎症反应具有显著的保护作用；反义MIF可以下调Toll蛋白样受体4-LPS受体复合物的信号转导分子，减少Gˉ细菌LPS诱导的TNF-α产生，同时负性调节NF-κB调节的相关细胞因子基因的转录。
4.2 对肿瘤的作用：有报道发现肺癌、鼻咽癌、膀胱癌、神经母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌以及颅咽管瘤等细胞上有MIF mRNA及蛋白表达，并且多数呈高表达[6]。进一步研究可证实转移生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor， PDGF）均可上调MIFmRNA及蛋白表达，说明MIF可直接或通过协助其它生长因子而间接地促进肿瘤细胞生长。近期又有发现，抗MIF抗体可有效地抑制肿瘤细胞在淋巴细胞系和血管内皮细胞系中的生长及新血管的形成，从而有效地减慢肿瘤的生长速度。另外，有研究提示，癌细胞的MIF高表达可能影响了肿瘤细胞间的黏附性，使肿瘤细胞更加容易相互分离移动，并向周围邻近组织侵袭，从而促进恶性肿瘤的浸润转移。目前，关于MIF促进肿瘤发生发展的机制还不清楚，有研究认为MIF对抑癌基因P53的抑制作用可能与其致癌作用有关[7，8]。另外，MIF也可以通过促进基质金属蛋白酶MMP-9的表达增加，从而促进癌细胞向淋巴结的转移。
4.3 神经内分泌功能：MIF作为垂体激素和糖皮质激素的一种负反馈调节剂。某些促甲状腺素垂体细胞通过下丘脑-垂体-肾上腺轴起始宿主应答时伴有MIF的释放，在下丘脑切除的裸鼠里注射脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）后发现垂体细胞释放MIF的量与血清中MIF的量基本接近。在下丘脑-垂体-肾上腺轴受刺激后，垂体以“激素样”方式分泌MIF。MIF可能是一种对糖皮质激素起负调节作用的细胞因子。
4.4 酶学功能：MIF能催化互变异构反应和氧化还原反应，具有3种催化活性作用[9]：为多巴色素异构酶；羟苯丙酮酸互变异构酶，能催化羟苯丙酮和羟苯丙酮酸的酮基-烯酸的互变异构；谷光甘肽（GSH）和二羟酯酰胺作为MIF生理性氧化还原底物，并且它还作为一种新型蛋白质-巯基氧化还原酶参与氧化还原反应。但MIF明确的生理和病理生理功能与催化特性间的关系并未确定。
4.5 损伤修复功能：有研究发现在角膜损伤的愈合过程中，伴随着角膜细胞浸润和内皮细胞的分化，MIFmRNA的表达水平也相应增加。随后发现，在小鼠皮肤损伤愈合过程中，MIF表达有增加趋势，而应用抗MIF抗体可推迟损伤的愈合。近期Mitchell 等发现内源性、外源性MIF均可刺激NIH/3T3成纤维细胞的增殖，MIF的这种促增殖效应与P44/P42有丝分裂原激活的蛋白激酶的活性有关。此外，他们还发现MIF可通过蛋白激酶A来调节胞质中磷脂酶的活性；而外源性增加的rMIF还可逆转糖皮质激素对胞质中磷脂酶A2的抑制作用，
5 MIF与VM
VM是临床较常见的疾病之一，患病率达21.83/10万，且年龄越小，发病率越高。病毒感染后所致的心脏炎症可累及心肌细胞、间质组织、血管成分及心包，而导致急性、亚急性和慢性病变。VM急性期可引起心衰、心律失常等症状，极少数患者因严重心律失常、心力衰竭和心源性休克而死亡。部分患者由于急性期后炎症持续，转为慢性心肌炎，出现进行性心脏扩大、心功能减退、顽固性心律失常，经过数年或更长时间后死于并发症。引起VM的病原体有20余种，但最常见的为柯萨奇病毒B组（coxsackievirus B，CVB），有50%以上的VM与之有关，其次为腺病毒（adenovirus，ADV）。VM的发病机制至今尚未完全阐明，目前多数认为是病毒直接损害和免疫变态反应所致。目前临床上VM常采用支持治疗、中药、抗心力衰竭和抗病毒药物、免疫抑制剂等治疗方法，但疗效欠佳，部分预后不良[10]。因此，深入研究该病的发病机制，阐明其病理生理过程，寻找有效的药物治疗和生物治疗靶点，成为国内外学者研究的热点和难点。
近年来VM发病率呈增长趋势，现已知CVB是VM的主要病原，并认为CVB诱导的心肌炎可能在感染过程中依赖细胞因子的释放，细胞因子在VM发病机制中占有主导地位。MIF是新发现的一种多效型细胞因子，是一种重要的前炎症因子，由单核巨噬细胞、激活的T细胞、角质细胞等产生，其主要作用为抑制巨噬细胞的游走移动，促进巨噬细胞在炎症局部浸润、聚集、增生、活化，增强其黏附、吞噬作用，此外，还能促进IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ等多种细胞因子的生成，从而间接增强巨噬细胞的功能，参与机体炎性反应和免疫应答。最近，MIF在心肌炎中的作用受到广泛关注。Matsui等[11]在实验性自身免疫性心肌炎中发现，心肌组织MIF mRNA和蛋白水平明显增加，此外，血清MIF浓度也显著升高，而通过MIF中和抗体阻断MIF的表达则可以明显减轻心肌的病变程度，以及降低心肌中VCAM-1（血管细胞间黏附分子）、IL-1β、TNF-α的表达。同样，Shioji等[12]在研究自身免疫性巨细胞性心肌炎时发现，当注射MIF中和抗体后，心肌炎症病变也显著减轻。郭富强等[13]的研究亦发现，MIF在柯萨奇病毒性心肌炎小鼠心肌表达上调，与心肌损害程度密切相关。张小佛等[14]报道急性VM患儿血清MIF水平明显升高，并与CK-MB呈正相关。这些研究提示，MIF可能与VM的形成有密切关系，有望成为治疗和预防VM的一种关键靶分子。
6 展望
MIF作为机体的一种多效性的细胞因子，在炎症应答、免疫调节、神经内分泌和细胞增殖中发挥作用，近年来其在VM发生中的致病作用倍受人们关注。尽管目前对其致病机制还不完全清楚，但MIF的中和抗体已经在动物实验和临床上取得较好的疗效，另外，其他拮抗MIF的药物也相继被发现，如维生素E和西替利嗪等。因此，随着研究的深入，针对MIF的干预治疗将为临床治疗VM提供一个新的思路和方法。
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篇6
【关键词】 β葡聚糖 胞内游离钙 环磷酸腺苷 RAW264.7细胞系 增殖
［Abstract］ Objective: To explore the effect of βglucan on proliferation， intracellular calcium and cAMP levels of RAW264.7 macrophage cell line.Methods： Cell growth and proliferation were detected by neutral red colorimetric assay， protein synthesis by Lowry′s test， and the concentration of cytosolic calcium and cAMP were determined continuously. Results： Cell growth and protein synthesis were enhanced by βglucan; the concentration of cytosolic calcium was elevated 3～5 min after treatment with βglucan cAMP level increased 1 min after the treatment and maintained at high level. Conclusion： Cytosolic calcium and cAMP were important signal molecules in evaluating effect of βglucan on RAW264.7 cell line.
［Key words］ βglucan; intracellular calcium; cAMP; RAW264.7 cell line; proliferation
随着免疫抑制剂、激素、广谱抗生素的大量应用，器官移植技术的广泛开展、各种导管的广泛应用及肿瘤治疗的广泛应用，真菌感染尤其深部真菌性医院感染日益增多。 β葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖。本研究以小鼠巨噬细胞RAW264.7为观察对象，观察不同浓度及不同时间的β葡聚糖对RAW264.7细胞的直接影响， 特别是对细胞内第二信使传递的影响， 以探讨β葡聚糖对RAW264.7细胞的作用机制。
1 材料与方法
1.1 试 剂
RPMI1640、胎牛血清购自Gibco公司；Fura2 AM 购自中国科学院药物所；β葡聚糖和EGTA购自Sigma公司；其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 细胞培养
小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院。于37℃，5%CO2湿润环境中培养， 每3天更换1次培养液， 细胞生长汇合成单层细胞时及时传代， 常规培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640。
1.3 细胞生长曲线和蛋白质含量的测定
取对数生长期的细胞按3×103 个/孔接种于96孔板(Cellstar)，共接种16板。待细胞贴壁后，吸出孔内的培养液和未贴壁的细胞。各给药组分别给予含12.5，25，50，100，200和400 μg/ml β葡聚糖的培养液200 μl，进行培养。每板上作对照，每个β葡聚糖浓度作3个平行孔。每天定时取上述培养板2块， 于倒置相差显微镜下观察细胞生长情况， 然后将其中1块板以中性红比色法［1］检测细胞生长情况，另1板用lowry法测定蛋白质含量［2］。以培养时间(d)为横坐标， 中性红比色法测得的D值和蛋白质含量为纵坐标， 分别绘制细胞生长曲线和蛋白质变化曲线。
1.4 胞内游离钙浓度测定
细胞内游离钙浓度的测定按文献［3］方法进行。
1.5 cAMP浓度测定
于100 ml培养瓶内接种RAW264.7细胞， 待细胞生长接近汇合时给予不同浓度β葡聚糖刺激， 分别于刺激后1，5和15 min 3个时间点取样。取样时弃培养液， 立即向瓶内加入1 ml 预冷的0.24 mol/L 高氯酸溶液， 用橡皮刮收集细胞，冰浴下超声破碎细胞， 离心取上清， 以KOH中和至pH 6.3左右， 去除沉淀的高氯酸钾， 取上清液冷冻干燥后于-20℃保存备用。cAMP浓度测定按试剂盒(上海中医药大学)说明书进行。
1.6 数据处理
实验结果用±s表示， 以方差分析作统计学处理。
2 结 果
2.1 β葡聚糖对RAW264.7细胞生长的影响
在相差显微镜下观察， β葡聚糖对RAW264.7细胞形态无明显影响。对生长曲线和培养液内蛋白质含量的作用均呈双相性(图1，图2)。低浓度β葡聚糖对RAW264.7细胞具有促进作用， 随着β葡聚糖浓度的逐渐增大， D值也不断升高， 至β葡聚糖浓度100 μg/ml时达最高峰， 与对照组(不加β葡聚糖)比较差异有统计学意义(P
2.2 β葡聚糖对RAW264.7细胞游离钙的影响
加入β葡聚糖刺激后胞内游离钙迅速上升， 在5 min时反应达高峰， 游离钙上升幅度与β葡聚糖浓度有关(图3)。以EGTA螯合培养环境中钙离子的结果显示，细胞外钙离子存在与否对β葡聚糖刺激引起的细胞游离钙波动有明显影响(图4)。提示升高的游离钙来自细胞外Ca2+的内流。
2.3 β葡聚糖对RAW264.7细胞内cAMP含量的影响
β葡聚糖刺激1 min时细胞内cAMP明显增高(P
3 讨 论
巨噬细胞是机体免疫系统专职吞噬细胞之一，源自血液单核细胞，广泛分布于所有组织中，成为机体抗入侵微生物的第一道防线，在机体抗真菌感染中也起着重要作用。它通过免疫球蛋白受体和补体受体识别并吞噬受调理素作用的微生物;对于未经调理作用的微生物，则通过一组胚系编码的蛋白-模式识别受体(PRRs)［4］迅速识别表达于微生物表面的称作病原相关微生物模式（PAMPs)的保守微生物分子，如主要存在于革兰阴性菌的脂多糖、革兰阳性菌的磷脂酸以及真菌的葡聚糖等［5］ 。β葡聚糖是真菌细胞壁含量最高的多糖， 具有广泛的生物学效用。已有研究表明， β葡聚糖可促进多种细胞活化［6］。我们注意到微量β葡聚糖虽可促进RAW264.7细胞增生， 但对细胞结构形态无明显作用。通过对细胞内第二信使传递系统的观察发现，β葡聚糖可明显增加细胞内游离钙和cAMP。胞内游离钙和cAMP是细胞内重要的信使分子， 介导许多重要的生理功能。通过观察细胞游离钙和cAMP的变化， 可以了解β葡聚糖信号在靶细胞内的传导机制。
本实验结果表明，β葡聚糖刺激可在2～5 min内使细胞内游离钙迅速升高， 而且在一定范围内其上升幅度与β葡聚糖剂量相关。细胞外Ca2+存在与否对β葡聚糖刺激后胞内游离钙波动有明显影响， 提示胞内游离钙的升高主要来源于细胞外Ca2+的内流而非细胞内钙库的动员。β葡聚糖使细胞内cAMP浓度升高是否与β葡聚糖促细胞增生作用有关， 尚有待进一步研究， 但我们的实验结果提示， cAMP含量变化与细胞蛋白合成的量相关。
参考文献
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篇7
作者：王燕 邓正照 郭艳红 于海奕 高炜
【摘要】 目的： 探讨晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products， AGE)及葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA表达的影响. 方法： ①选择合适的培养时间；②不同浓度的AGE与THP1巨噬细胞共同孵育；③不同浓度葡萄糖与THP1巨噬细胞共同孵育；分别用AGE、葡萄糖及同时加入AGE和葡萄糖与THP1巨噬细胞孵育；⑤采用RTPCR检测孵育后CXCL16及CD36mRNA的表达量，观察和比较各组孵育后CXCL16及CD36 mRNA的表达情况. 结果： ①随着培养液中AGE浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；②随培养液中葡萄糖浓度的增加CXCL16及CD36 mRNA的表达增加；③AGE及葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞时，对CXCL16及CD36 mRNA的表达上调作用大于AGE或葡萄糖单一因素的影响. 结论： AGE及葡萄糖呈时间和浓度依赖性上调THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA的表达，并且AGE及葡萄糖两者合用可以进一步增加这种表达. 这可能为糖尿病动脉粥样硬化机制的探讨提供新的线索.
【关键词】 CXCL16；糖基化终产物，高级；葡萄糖；糖尿病
0引言
结合磷脂酰丝氨酸和氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein， oxLDL）的清道夫受体（scavenger receptor for phosphatidylserine and oxidized lipoprotein， SRPSOX)是一种新发现的清道夫受体， 克隆分析证实其在分子结构上与趋化因子CXCL16是同一分子［1］. 作为清道夫受体，CXCL16可以介导巨噬细胞吞噬oxLDL，形成泡沫细胞，促进动脉粥样硬化的发生. 作为趋化因子，它可以参与炎症细胞的趋化及炎症细胞间的相互作用［2］. CXCL16的这种双重作用增强了炎症与动脉粥样硬化间的直接联系，也预示其在动脉粥样硬化性疾病中的重要作用. 多种炎性刺激因子如脂多糖、白介素18、干扰素γ及肿瘤坏死因子α等可使巨噬细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞的CXCL16表达增加 ［3］，同时也有报道AGE及高葡萄糖对其他清道夫受体如CD36的表达有上调作用［4-5］，但AGE或高葡萄糖是否影响CXCL16的表达国内外少见报道. 我们通过研究AGE及高葡萄糖对巨噬细胞表达CXCL16的影响，同时对AGE及高葡萄糖上调巨噬细胞表达CD36的作用加以验证，为糖尿病动脉粥样硬化并发症的发病机制的探讨提供新的线索.
1材料和方法
1.1材料佛波酯（PMA）、AGE购自美国Sigma 公司；葡萄糖购自北京泛基诺科技有限公司；TRIzol及其它RNA提取试剂为Gibco公司产品；所有引物由上海生工公司合成；cDNA 合成酶（MMLV）及Taq酶购自北京天为时代公司；其他试剂均为进口或国产分析纯.
1.2方法
1.2.1THP1细胞株培养人单核细胞系THP1株购于中科院上海细胞生物所细胞中心. THP1细胞生长于含有低糖（5.6 mmol/L），100 mL/L 胎牛血清，10 mmol/L HEPES，1×105 U /L青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640 完全培养基中，置于37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度培养箱内培养.
1.2.2实验分组取对数生长期THP1细胞（1×106个/皿）进行实验，每次实验前用100 nmol/L PMA孵育THP1细胞48 h，使其诱导分化为巨噬细胞［6］. ①单独AGE处理组：首先确定合适的培养时间，即用100 mg/L AGE与THP1巨噬细胞孵育不同时间（0，6，12，24，48，72 h），根据培养结果，选择72 h为合适孵育时间，不同浓度的AGE（ 0，50，100，150 mg/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；②单独葡萄糖处理组：用高浓度葡萄糖培养液（30 mmol/L）与THP1巨噬细胞孵育不同时间（ 0，6，12，24，48，72，96 h），确定72 h为合适培养时间后，用不同浓度葡萄糖（5.6，10，20，30 mmol/L）与THP1巨噬细胞共同孵育72 h；③AGE和葡萄糖联合作用组：分别用AGE(100 mg/L)、高浓度葡萄糖（20 mmol/L）及同时加入AGE(100 mg/L)和葡萄糖（20 mmol/L）与THP 1巨噬细胞孵育72 h.
1.2.3逆转录 聚合酶链反应检测CXCL16及CD36 mRNA的表达TRIzol试剂提取细胞总RNA，cDNA反应总体系为20 μL：10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.1 mol/L DTT 1 μL，500 mg/L Random primer 0.25 μL，6.7×108 nkat/L RNasin 0.5 μL， 3.3×107 nkat/L MMLV 1 μL，5×缓冲液2.0 μL. 以cDNA为模板，分别使用下述3对引物进行PCR，扩增CXCL16基因的引物序列为：上游5′ACTCAGCCAGGCAATGGCAAC 3′，下游5′GGTATTAGAGTCAGGTGCCAC 3′，扩增片段长度为693 bp. 扩增CD36基因的引物序列为：上游5′CTCCCAAAGTGCTGGGATTA 3′，下游5′AGCCTTTGGGGGTCTTTCTA 3′，扩增片段长度为246 bp. 扩增内参照磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的引物序列为：上游5′CTGGTCACCAGGGCTGCTTTT 3′，下游5′CATGAGGTCCACCACCCTGTT3′，扩增片段长度为936 bp. PCR反应条件为：95℃ 5 min 预变性，95℃ 30 s 变性，60℃ 30 s 退火，72℃ 30 s延伸，30 个循环，72℃ 继续延伸10 min. PCR反应总体系为20 μL： 无RNA酶水14.75 μL，10×缓冲液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL， 100 g/L引物各1μL，8.3×107 nkat/L Taq酶0.25 μL，cDNA模板1 μL.
1.2.4RT PCR产物检测及半定量分析反应结束后，取5 μL PCR产物用10 g/L的琼脂糖凝胶恒压80 V电泳30 min， 溴化乙锭染色. 利用紫外投射分析仪对电泳结果进行观察并拍照. 运用软件SynGene Tools Analysis Software对PCR电泳结果进行灰度值扫描并半定量分析. 每例样品的CXCL16和CD36基因PCR产物的灰度值分别除以它们相应的内参GADPH基因PCR产物的灰度值， 从而得到上述两种受体基因mRNA的相对表达水平.
统计学处理：由SPSS13.0 统计软件完成，组内比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用StudentNewmanKeuls (q) 检验，P
2结果
2.1AGE作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36mRNA表达的影响THP1巨噬细胞与100 mg/L AGE孵育不同时间（ 0，6， 12，24，48，72 h），RTPCR 检测THP1巨噬细胞CXCL16及CD36 mRNA的表达. 随着孵育时间的延长，THP1巨噬细胞中CXCL16及CD36 mRNA的表达上调，孵育72 h CXCL16及CD36 mRNA表达与孵育0 h相比上调最明显（P
图1AGE作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36 mRNA表达的影响(n=4)
2.2不同浓度AGE对THP1巨噬细胞中CXCL16，CD36 mRNA表达的影响THP1巨噬细胞与不同浓度AGE（ 0，50，100，150 mg/L）孵育72 h后，RT PCR检测THP1巨噬细胞中CXCL16及CD36 mRNA的表达. 各浓度组CXCL16 mRNA的表达除在50 mg/L组与未加刺激因素的对照组（0 mg/L组）之间差异无统计学意义（P> 0.05）之外，其他各组之间的差异均具有统计学意义(P
aP
图2不同浓度AGE对THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响
2.3葡萄糖作用于THP1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36mRNA表达的影响THP1巨噬细胞用30 mmol/L的高浓度葡萄糖培养液孵育不同时间（0，6，12，24，48，72，96 h），RTPCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. 随培养时间的延长，THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达上调，与孵育0 h相比，孵育72 h时THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达上调最明显（P
2.4不同葡萄糖浓度对THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响THP 1巨噬细胞与不同葡萄糖浓度（5.6，10，20，30 mmol/L）培养液孵育72 h后，RT PCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. CXCL16 mRNA的表达除在20 mmol/L组与30 mmol/L组之间的差异无显著性（P>0.05）之外，其他各组之间的差异均具有显著性(P
图3葡萄糖作用于THP 1巨噬细胞不同时间对CXCL16，CD36 mRNA表达的影响(n=4)
aP
图4不同葡萄糖浓度对THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达的影响
2.5AGE和葡萄糖同时作用于THP1巨噬细胞对CXCL16，CD36mRNA 表达的影响THP1巨噬细胞分别与葡萄糖（20 mmol/L）、AGE(100 mg/L)、同时加入葡萄糖（20 mmol/L）和AGE(100 mg/L)孵育72 h，RTPCR检测THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达. 高葡萄糖和AGE分别作用于THP1巨噬细胞时均可使CXCL16，CD36 mRNA表达上调. 二者同时作用时THP 1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA表达上调的程度大于单一因素的作用（P
3讨论
CXCL16是一种新发现的清道夫受体，表达在巨噬细胞、血管平滑肌细胞和血管内皮细胞上. 它是继CX3CL1之后发现的第二个既能以膜结合形式存在又能以分泌型的可溶性分子存在的趋化因子. 以膜结合的形式存在时，CXCL16发挥清道夫受体的功能，结合并吞噬磷脂酰丝氨酸包被的颗粒如凋亡小体和oxLDL ［7］. 在金属蛋白酶10(metalloproteinase 10)的水解作用下CXCL16的细胞膜外部分脱离细胞膜表面成为游离的分子，发挥趋化因子的功能［8-9］.
我们的实验结果表明AGE和高葡萄糖对THP1巨噬细胞CXCL16 mRNA的表达有上调作用，且二者共同作用可使CXCL16 mRNA表达进一步增加. 是否影响蛋白的表达（包括膜结合形式和分泌形式）还需要进一步的研究. 我们同时观察了AGE和高葡萄糖对CD36 mRNA的表达，结果与文献报道的结果基本是一致的，能够上调CD36 mRNA的表达［4-5］. 已有研究证明巨噬细胞CXCL16表达的增加促进了对oxLDL的吞噬和泡沫细胞的形成，组化分析也表明CXCL16主要表达在动脉粥样硬化的斑块处，而无动脉粥样硬化斑块的血管未见有表达［10］. 由此可见AGE和高葡萄糖能够刺激巨噬细胞CXCL16表达的增加，对解释糖尿病患者过高的动脉粥样硬化疾病危险性有重要意义.
AGE及高葡萄糖促进CXCL16mRNA表达的机制尚不清楚. AGE可以上调多个清道夫受体的表达，包括清道夫受体A、清道夫受体B1，CD36和血凝素样氧化低密度脂蛋白受体1（ lectinlike oxidized lowdensity lipoprotein receptor1，LOX1，对不同受体AGE调控机制不同. 就CD36来说，AGE与其特异性受体（晚期糖基化终末产物受体）结合，通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ而促进CD36的表达［4］. 高葡萄糖对CD36表达的上调作用可能是通过影响巨噬细胞内的氧化应激张力，增加脂质过氧化实现的［5］. 高葡萄糖也可以上调LOX1的表达，可能的机制是高葡萄糖增加细胞内活性氧基，启动蛋白激酶C/促分裂原活化蛋白激酶通路，最后通过激活核因子κB和活化蛋白1上调 LOX1的表达［11］. 本研究发现AGE和高葡萄糖同时刺激THP1巨噬细胞时，使CXCL16，CD36mRNA表达上调的程度大于两种因素单独作用也提示AGE和高葡萄糖可能是通过不同的作用机制上调THP1巨噬细胞CXCL16，CD36 mRNA的表达.
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篇8
摘要：目的探讨二至丸免疫调节作用的活性组分构件。方法运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，观察女贞子、墨旱莲系列提取物及其组合物对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的作用。结果女贞子乙醇提取物、墨旱莲乙醇提取物、女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物（1∶1）具有较强的丝裂原样作用，可以促进小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬功能。结论二至丸对小鼠淋巴细胞和巨噬细胞作用的活性组分构件是女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物（1∶1）。
关键词：二至丸； 中药复方组合化学； 血清药理学； 细胞药理学； 免疫调节； 活性组分构件
Study of Active Components with Immunoregulation from Erzhi Pill on Lymphocytes and Macrophages in Mice
Abstract：ObjectiveTo study the active components with immunoregulation from Erzhi Pill.MethodsDifferent extractions were extracted from Ligustrum lucidum Ait.（LLA）or Eclipta prostrata L.（EPL） with different solvents such as water，alcohol etc.The effect on lymphocytes and macrophages in mice was observed with the methods of Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions， blood serum pharmacology and cytopharmacology.ResultsDifferent extraction showed different effects on mice lymphocytes and macrophages in vitro.The alcohol extraction from LLA (NYC)，the alcohol extraction from EPL (HYC) or both (1∶1) could stimulate the mouse lymphocytes proliferation of peripheral blood and spleen and enhance the phagocyteses of mice macrophages.ConclusionThe active components with immunoregulation from Erzhi Pill on lymphocytes and macrophages in mice was the mixture of NYC and HYC (1∶1).
Key words：Erzhi Pill;
Combinatorial Chemical research of Traditional Chinese Prescriptions; Blood serum pharmacology; Cytopharmacology; Immunoregulation; Active components
二至丸是中医临床的经典名方，《医便》（明・王三才）记载：“二至丸，清上补下第一方，价廉而功极大。”［1］它由女贞子、墨旱莲各等份组成，组方简单，药性平和，功效确切，作为补益肝肾良药。数百年来，倍受历代医家推崇。现代还用于衰老、神经衰弱、疲劳综合症及更年期综合症等疾病的治疗。中成药二至丸先后被历版《中国药典》（Ⅰ部）和“第二批国家非处方药目录”收载。一些学者相继从现代药理学角度对其进行了研究，证明二至丸对机体免疫功能具有多方面的调节作用，但研究中多以水煎剂、女贞子多糖及方中单味药提取物给药［2～5］。由于目前对其复方药效物质基础及作用机理还缺乏系统规范的研究，致使制剂工艺粗放，日用剂量过大［6］，剂型落后，不符合现代中药要求，影响了它的公众认知度。作者在遵从复方配伍规律的前提下，以活性评价为导向，运用中药复方组合化学、血清药理学和细胞药理学方法，对其免疫调节作用的有效组分构件进行探讨，以期进一步组成精简方剂，从而为二至丸的二次开发和临床应用提供科学实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物普通级 KM种小鼠，8周龄，体重22～24 g，购于重庆市中药研究院实验动物研究室（许可证号：310101001）。
1.1.2 试剂RPMIl640培养液 (Gibco产品)、无酚红 RPMIl640培养液 (Sigma产品)，配制时加青霉素1×105 IU/L、链霉素100 mg/L，过滤，使用时加体积分数为15% 的胎牛血清（FBS，超级，杭州四季青生物工程材料研究所）。ConA(刀豆蛋白A)，Fluka产品；LPS(脂多糖)，Sigma产品，用 RPMI1640配成1 mg/ml，0.22 μm过滤，分装，20℃冻存，临用前稀释。MTT(噻唑蓝)，Sigma产品，使用前用 PBS配制成5 mg/ml，过滤，4℃避光保存。硫代羟基乙酸钠 (thioglyc011ate，TG)，北京生物制品所产品。其余试剂均为市售分析纯。
1.1.3 仪器Napco6lOO型CO2培养箱，美国。96孔板，Nunclon，丹麦。微量可调加样器，Labsystems，芬兰。多头细胞收集仪，ZTⅢ型，上海医科大学。550型酶标仪，BioRad，美国。恒温水浴摇床，Yamato，日本。
1.1.4 药物女贞子 Ligustrum lucidum Ait.（LLA）、墨旱莲 E clipta prostrata L.（EPL），购于重庆市中药材公司，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部规定。
1.2 方法
1.2.1 女贞子、墨旱莲提取物的制备取女贞子或墨旱莲药材，粉碎，过20目筛，依次用不同溶剂，10倍量提取2次，2 h/次，过滤，合并提取液，回收溶剂，制备女贞子或墨旱莲的石油醚提取物（简称 NSYM或 HSYM）、醋酸乙酯提取物（简称 NYSYZ或 HYSYZ）、乙醇提取物（简称 NYC或 HYC）和水煎煮提取物（简称 NSJZ或 HSJZ）。临用前，分别用生理盐水（NS）制备药液，必要时可加少量 Tween80助溶，浓度相当于1 mg生药/ml。
1.2.2 含药血清的制备［7］小鼠按体重随机分组，每组10只，雌、雄各半。ig给药，给药2次，间隔2 h。ig容积10 ml/kg，空白血清组ig NS，各含药血清组 ig相应组分6.7 g生药 /kg（组合组分13.4 g生药 /kg）。末次给药1 h，深度麻醉，心脏无菌采血，3000 r/min离心10 min，收集血清。同组分血清混合，56℃水浴30 min，-20℃冻存，临用前4℃冻融。
1.2.3 细胞悬液的制备［8］小鼠腹腔注射3% TG溶液（2 ml/只），72h后眼眶采血（肝素500 IU/ml抗凝），随即脱颈椎处死小鼠，ip PBS 5ml，收集腹腔洗液，同时无菌取脾。常规方法制备细胞悬液，PBS液洗涤，离心，细胞沉淀加入 RPMI164010% FBS培养液，调整浓度为2×106 cells/ml，台盼兰排除法检查细胞存活率大于95%。
1.2.4 淋巴细胞增殖（lymphocytes proliferation，LP）实验［9］96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50μl淋巴细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl RPMI164010%FBS培养液（对照组、刺激组分别用20 μl空白血清），混匀后预孵1 h，再加入10 μl ConA或 LPS（终浓度为5 μg/ml）刺激（对照组用10 μl PBS），各设8个复孔。5% CO2培养箱（Forma.USA）37℃培养48 h后，加入 MTT 10 μl/孔（10 mg/ml）培养8 h，弃上清，加入 DMSO 100 μl/孔，MTT结晶充分溶解后，酶标仪570 nm处测定A值。
1.2.5 腹腔巨噬细胞（PMф）吞噬活性实验［10］96孔细胞培养板，各给药组每孔加入50 μl腹腔巨噬细胞悬液、20 μl含药血清和120 μl无酚红 RPMI164010% FBS培养液（对照组用20 μl空白血清），各设8个复孔。5% CO2培养箱（Forma.USA）37℃培养24 h，弃孔内培养基，加0.075%中性红溶液100 μl/孔，培养1 h，弃上清液，预温的 PBS液洗3遍，加入细胞溶解液（0.1 mol/L乙酸：无水乙醇）100 μl/孔，室温放置，过夜。次日，取上清液于酶标板中，酶标仪540 nm处测定A值。
1.2.6
统计学处理采用 SPSS11.0统计软件包。运用单向方差分析（OneWay ANOVA），选用 Dunnett法进行组间显著性分析。实验数据以±s表示。
2 结果
2.1
女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响结果见表1。
表1 女贞子或墨旱莲提取物对小鼠 LP和PMφ活性的影响（略）
与正常对照组比较，1）P＜0.01，2) P＜0.05；与刺激剂组比较，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖从表1可以看出，女贞子或墨旱莲提取物对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为，NYC＞NYSYZ＞NSJZ＞NSYM；HYC＞HYSYZ＞HSJZ＞HSYM。提示，女贞子或墨旱莲促进小鼠LP和PMф活性作用最强的组分分别是 NYC或 HYC，即女贞子乙醇提取物或墨旱莲乙醇提取物。
表2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和PMφ活性的影响（略）
与正常对照组比较，1) P＜0.01，2) P＜0.05；与刺激剂组比较，3) P＜0.01，4) P＜0.05；刺激剂指刀豆蛋白 A或脂多糖
2.2 女贞子墨旱莲提取物组合对小鼠 LP和 PMφ活性的影响结果见表2。从表2可以看出，女贞子墨旱莲不同提取物交叉组合后，对 ConA或 LPS诱导的小鼠外周血和脾淋巴细胞增殖、对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性均有较明显的促进作用。强度顺序依次为 NYC+HYC＞NYC+HYSYZ＞HYC+NYSYZ＞NYC+HSJZ＞HYC+NSJZ＞NYC+HSYM＞HYC+NSYM。提示，二至丸（女贞子和墨旱莲的组合复方）促进小鼠LP和PMφ活性作用最强的组分构件是NYC+HYC，即女贞子乙醇提取物和墨旱莲乙醇提取物。
3 讨论
免疫功能低下常常与一些疾病的发生、发展密切相关，已经对人类社会构成了巨大威胁。对于疾病、衰老或治疗药物引起的免疫功能低下，现代惯用生物制剂，如胸腺素、转移因子、干扰素等，或化学制剂如左旋咪唑等，增强细胞免疫功能，但这些药物容易引起发热、呕吐、粒细胞减少及肝肾功能异常等不良反应，而中药在这方面具有独特的优势［11］。在人用疫苗佐剂相对缺乏、人们日益注重改善生命质量的今天，具有高活性免疫调节作用的中药有效成分被认为是理想的生物反应调节剂［12］。近年来通过临床或实验研究发现四君子汤、生脉散、六味地黄丸、当归补血汤、肾气丸等补益方剂有很强的免疫调节作用，二至丸在改善机体免疫功能方面疗效显著［13］。目前国内对六味地黄丸的药效物质基础及作用机理研究较为深入，相继研制成功了六味地黄口服液、胶囊、软胶囊及滴丸等新剂型，取得了巨大的经济效益和社会效益，而对二至丸的相关研究却极为薄弱。中药复方本身的分子多样性决定了其“有用分子”不明确，无用或诱发毒副作用的分子占绝大多数，从而表现出多成分、多途径、多靶点的作用特点，这在客观上增加了中药复方药效物质基础及作用机理研究的难度。目前，关于其方法学研究，观点和构思较多，如三元设计方案、霰弹理论、血清药理学及天然组合化学库与多靶作用机理等［14］，对于实际工作具有一定的启发和参考价值。作者在实际研究工作中发现，中药复方组合化学方法在中药复方活性成分群研究中具有明显的优势。该方法借鉴现代药学组合化学研究方法，选择能代表方剂主治病症病理生理和治则的药理学指标，通过组分或单体成分的组合，采用排除筛选法，找出其活性最强的组份构件，即确定“有用分子”组合的精简方剂［15］。它与直接测定成分法不同，既可充分体现中药复方多组分协同的特点，又可简化中药复方的分子多样性，符合中医药整体观和辩证分析的理论精髓。考虑到二至丸原方及其中成药均采用方中药味单独处理后再组合制剂的工艺路线，故本文运用中药复方组合化学方法进行活性部位研究。本研究结果表明，女贞子乙醇提取物+墨旱莲乙醇提取物（1∶1）是二至丸复方最强的免疫调节作用活性部位，能够协同LPS、ConA等有丝分裂原诱导的小鼠外周血、脾淋巴细胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬细胞活性。提示这些组分均能激活T细胞及B细胞，具有丝裂原样作用，可以增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能。据此推测，女贞子、墨旱莲以水做溶媒提取活性成分可能提取不充分，故二至煎剂的药理作用还不能完全反映二至丸的药理作用，因此古代医家用二至丸而不用二至汤。随着对上述组分的进一步分离、纯化及其作用机理的阐明，获得由有效成分组成的精简方剂将成为现实，无疑会为现代中药的研究注入新的内容。
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篇9
[关键词]压力性溃疡；rhGM-CSF；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
[中图分类号]R62 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2014）04-0332-04
压疮是临床常见的并发症之一，压疮一旦发生，不仅会给患者带来新的痛苦，若继发感染还会加重病情导致死亡。随着基因工程的进步，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（recombinant human GM-CSF，rhGM-CSF）在创面修复中得到越来越广泛的应用。rhGM-CSF是一种多功能细胞因子，已证实在皮肤组织的创面愈合中发挥着重要作用[1]。我院自2011年2月开始，应用rhGM-CSF凝胶治疗护理Ⅱ～Ⅲ期压疮患者，效果满意，现报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料：选择2011年2月～2013年2月入我院治疗的压疮患者，按照美国国家压疮咨询工作组（National Pressure Ulcer Advisory Panel，NPUAP）2007压疮分级标准[2]，入选Ⅱ～Ⅲ期压疮。纳入标准：年龄≥18岁，患者或家属有治疗愿望。排除标准：①最近3个月内参加过其他新药临床试验；②过敏体质者及对药物成分过敏者；③孕妇及哺乳期妇女；④糖尿病及全身严重感染患者。共计入选85例（98处）Ⅱ～Ⅲ期压疮。其中男性54例（66处），女性31例（32处）。Ⅱ期压疮54处，Ⅲ期压疮44处。年龄18～72岁，平均（53.64±15.80）。压疮存在的时间为（58.64±43.68）天。压疮面积（22.9±7.0）cm2。将患者随机分为试验组47例（57处）和对照组38例（41处），两组患者基线资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
1.2.1 创面处理：操作者为取得资质的造口治疗师，统一专门培训操作方法及评估标准。处理创面时必须遵守无菌操作原则，避免二次污染。首先用生理盐水清洗创面，将压疮内的坏死组织、脓液及异物彻底清除[3]，再用碘伏涂抹，随后用生理盐水棉球擦净。试验组采用小纱布将rhGM-CSF凝胶（金扶宁，长春金赛药业股份有限公司提供，国药准字号：S20100601）搓揉均匀，覆盖压疮创面，对于皮下潜行区域，将凝胶纱条填塞于间隙内，外用无菌干纱加压包扎，隔天换药。对照组采用传统方法，即磺胺嘧啶银（SD-Ag）霜（鄂药准字H20110728），用法同试验组。
1.2.2 全身干预：压疮以局部受到摩擦力、剪切力和压力等导致皮肤破损或溃疡为主要原因，同时消瘦、恶液质等特殊体质也是发生压疮的基础原因[4]。所以，从患者初诊至治疗结束护士均应进行全身干预。内容包括：①基础护理：保持床单位清洁、干燥、平整，嘱家属为患者穿戴透气性好的纯棉衣物，经常换洗；②定时翻身：鼓励和协助患者每2～3h翻身一次，翻身时采用无张力手法，即将手放到患者身体下受力较大部位向身体正中线方向用力托起患者，取左或右斜30°轴线翻身，防止危险部位皮肤紧绷[5]，③营养支持：纠正贫血及低蛋白血症，予以高蛋白、高维生素、高热量、易消化的食物，对不能进食者给予鼻饲，遵医嘱进行补液、输血、静脉滴注高能营养物质等支持疗法，以增强组织修复能力；④预防感染：定时开窗通风，保持病室空气流通，减少人员探视，以防止上呼吸道感染，避免因感冒发热使压疮迅速扩大或愈后复发；⑤心理护理：压疮患者通常久治不愈，家属及本人容易失去信心，为此护理人员应对患者表示同情及理解，给予心理疏导及健康宣教，对待患者提出的疑问要耐心一一解答，争取早日康复。
1.3 伦理学研究要求：患者知情同意，并随机分组，但不告知患者被分入哪一组（单盲）。本研究经医院伦理委员会批准，征得患者同意并在知情同意书上签字，昏迷患者由家属代签。患者可以随时退出本研究，并保证其隐私不被泄露。
2 评价指标
2.1疗效评价：①创面愈合时间：为每处压疮从治疗开始至愈合所需的时间为愈合时间；②愈合分级：治愈为压疮闭合，3%过氧化氢涂抹无泡沫产生；好转指创面减小，部分创面干燥、红润，新生肉芽组织长出，炎性渗出液减少；无效为创面无明显变化，炎性渗出液仍较多。治愈加好转计为总有效。
2.2 伤口内细菌培养结果：分别于换药前、换药第7天、换药第14天戴无菌手套，使用棉棒釆集伤口内的分泌物做细菌培养，有细菌计为阳性，无细菌计为阴性。愈合的伤口，按无细菌感染计算。
2.3 压疮愈合评分：采用压疮愈合量表（Pressure ulcer scale of healing， PUSH）[6]进行评分。分别于换药前及换药第7、14天对创面面积、创面渗液量、压疮组织类型3项计分汇总，总分下降为有效，总分上升为恶化，总分无变化为无效，用于综合评估压疮处理各阶段的疗效。评分标准见表1。
3 统计学方法
将全部资料录入SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，服从正态分布时两组均数比较采用配对t检验；两组创面愈合率和疗效比较采用Wileoxon秩和检验，两组总有效率的比较采用χ2检验；当P
4 结果
4.1疗效比较：对照组41处压疮中，32处（78.05%）治疗有效，试验组57处压疮中，55处（96.49%）治疗有效；试验组总有效率明显高于对照组，差异具有统计学意义（P
4.2细菌培养结果：换药前、换药7天、换药14天感染细菌情况比较采用χ2检验。换药前两组创面感染细菌情况比较差异无统计学意义（P=0.932），有可比性；换药7、14天两组创面感染细菌情况比较差异具有统计学意义（P=0.000），见表3。
4.3换药前及换药7、14天PUSH评分：两组患者换药前PUSH评分差异无统计学意义（P>0.05），显示具有可比性；换药7、14天两组患者创面PUSH评分差异具有统计学意义（P
5 讨论
从全球范围来看，压疮的发生率与15年前比较并没有明显的下降，预防和护理压疮仍是难题。随着人口老龄化，慢性疾病患者群体的增多，压疮的发生严重降低了患者的生活质量。Ⅱ期以上压疮通常伴随感染，细菌可分泌蛋白水解酶分解纤维蛋白，抑制成纤维细胞等的迁移，故细菌感染可明显抑制创面上皮再生[7]。而且，压疮患者在治疗疾病的过程中，一般都经历过多次换药及高档抗生素的应用，存在一定程度的耐药性。因此，理想的压疮外用药应该具有抗菌谱广、作用性强、减少渗出、促进上皮生长、无毒性的特点。本研究采用的rhGM-CSF凝胶可增强中性粒细胞、单核细胞趋经及其活性，参与并且对创面愈合过程中炎症反应环节进行调节[8]。从本研究可以看出，换药第7天和14天时，试验组细菌清除情况明显优于对照组，差异具有统计学意义，说明rhGM-CSF相比SD-Ag更具有明显抗菌优势。
在整个治疗过程中，造口治疗师采用PUSH计分表跟踪评分（“直至压疮闭合”去掉），从表4结果可以看出，应用rhGM-CSF凝胶治疗后，患者7、14天评分呈明显下降趋势，远远快于SD-Ag组。试验组有效率为96.49%，对照组有效率为84.93%。试验组愈合时间为（16.75±1.22）天，对照组为（21.73±4.55）天。以上数据综合显示rhGM-CSF能促进组织修复和再生（“减少渗液”去掉），加速伤口愈合。试验组大部分患者在使用rhGM-CSF治疗后的第5～7天，组织学检查发现新生表皮细胞出现明显角化，后续观察也未发现引起红肿、过敏等不良反应，证实rhGM-CSF在创面修复中的可靠性和安全性。而且，我们发现部分患者在使用AD-Ag霜换药过程中，创面有加深的现象，可能和霜剂在创面上应用形成薄痂易导致创面加深有关。而凝胶制剂不粘连伤口，换药时患者疼痛感明显优于对照组。
综上所述，笔者认为除积极消除病因，加强翻身，保持皮肤清洁干燥及全身营养支持外，护理人员遵医嘱采用rhGM-CSF凝胶换药，能促使压疮部位的上皮细胞在无菌、湿润的环境下形成，促进肉芽再生，能达到加速创面愈合的作用。但对于直径大于5cm的压疮创面，则建议采取手术植皮治疗，这不仅能缩短病程，也利于功能康复。
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篇10
关键词：同型半胱氨酸；THP-1单核细胞源性巨噬细胞；内质网应激；动脉粥样硬化
动脉粥样硬化（Atherosclerosis， AS）是一类以脂代谢异常和炎症反应为主的复杂性病变，其与脂质沉积、炎性细胞浸润、局部血栓形成及氧自由基产生增多有关。本研究以THP-1单核细胞源性的巨噬细胞为研究对象，用不同浓度的Hcy干预后观察胆固醇流出和ox-LDL的含量，并检测ERS相关蛋白的表达，为进一步揭示Hcy在动脉粥样硬化中的作用提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 THP-1单核细胞株由本实验室保存；RPMI1640培养基、胎牛血清为Hyclone公司产品；总胆固醇检测试剂盒为北京北化康泰临床试剂有限公司产品；GRP78、CHOP、XBP-1 及ox-LDL检测试剂盒为Groundwork Biotechnology Diagnosticate 公司产品；Hcy、佛波酯（PMA）为Sigma公司产品，其余试剂为国产分析纯[1]。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及分组 取本实验室液氮中冻存的THP-1单核细胞株复苏后，用含15%小牛血清的RPMI-1640培养基，置37℃、5%CO2孵育箱培养。待细胞融合到80%～90%时，每瓶加入含500nM 佛波酯（PMA）的培养液孵育48h，诱导单核细胞分化成巨噬细胞。实验分组：①对照组：以不加Hcy巨噬细胞为空白对照组（0 M Hcy）。②实验组：在巨噬细胞中分别以50、100、200、500 M Hcy处理细胞，③干预组：100 M Hcy+叶酸+维生素B12（VB12），各组分别培养24 h后检测后续指标。
1.2.2 TC的测定 采用酶法测定巨噬细胞TC含量，按照试剂盒说明书操作，分别检测各组TC水平。
1.2.3 内质网应激反应蛋白的测定 各组细胞孵育后，收取并裂解细胞，取细胞上清液后，按照ELISA试剂盒说明书测定各组内质网应激反应蛋白（CHOP、XBP-1、GRP78）的含量。
1.2.4 ox-LDL含量的测定 反复冻融细胞，离心后取细胞上清液用ELISA法测定细胞内ox-LDL 的含量，按照ELISA试剂盒说明书依次测量各孔OD值，记录并分析数据。
1.2.5 统计学处理 结果以x±s表示，应用SPSS11.0统计学软件进行统计学分析，两样本均数间比较采用Student's t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，以P
2 结果
2.1 THP-1单核细胞源性巨噬细胞的培养 THP-1单核细胞是悬浮生长的细胞，细胞形态规则、大小均一、胞膜完整（图1A）。经PMA诱导48h后在显微镜下观察显示此时细胞呈贴壁状态，形状不规则并有伪足伸出的巨噬细胞（图1B）。
2.2 Hcy对巨噬细胞内总胆固醇含量变化 不同浓度的Hcy干预人THP-1单核细胞源性巨噬细胞24h后，与对照组相比，各实验组巨噬细胞内胆固醇聚集显著增加，尤其是以100 M Hcy组TC升高最明显，差异有显著性（P
2.3 Hcy 对巨噬细胞内ox-LDL 的影响 与对照组比较，不同浓度Hcy干预后THP-1巨噬细胞内ox-LDL的含量均有所增加，以100 MHcy组最明显，差异有显著性 （P
3 讨论
同型半胱氨酸 （Homocysteine，Hcy）被认为是AS的独立危险因素，其机制与内皮细胞损伤、氧化应激、脂代谢紊乱等有关。不同浓度Hcy干预THP-1源性巨噬细胞后发现，随着Hcy浓度升高，巨噬细胞内TC含量升高，表明Hcy也可以促使巨噬细胞发生泡沫化，推测Hcy抑制了巨噬细胞内胆固醇的流出，使细胞内胆固醇异常增加并导致脂质的堆积，从而介导了泡沫细胞的形成和AS的发生发展。
Hcy不仅影响脂代谢，它本身是蛋氨酸循环过程的中间代谢产物，含有活泼而自由的巯基，容易发生氧化还原反应，产生大量的H2O2和O2-，过量的活性氧使LDL氧化生成ox-LDL。ox-LDL通过增加炎性细胞因子的表达、增强细胞毒性反应、抑制诱导型一氧化氮合酶的产生。本实验探讨了Hcy对巨噬细胞胆固醇流出的影响及内质网应激的作用机制，进一步补充和完善了Hcy引起动脉粥样硬化的机制。