免疫组化染色范文

导语：如何才能写好一篇免疫组化染色，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

【关键词】Tween-20；免疫组化；非特异性染色

表面活性剂Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物，亲水性强，为一种非离子型去污剂，能增加乳剂的稳定性。也可作 2006―2012年龙里县流行性腮腺炎疫情资料分析 神经阻滞联合甲钴胺注射液治疗带状疱疹后神经痛效果观察 保定市2004～2011年急性弛缓性麻痹病例监测系统运转情况分析 早产儿经下肢置入PICC20例的方法探讨 129例2型糖尿病患者合并恶性消化道肿瘤临床分析 绝经后妇女取宫内节育器92例临床分析 高血压性脑出血156例临床分析 蒙古族老年人慢性房颤（AF）319例抗凝治疗分析 浅谈产后出血的原因及防治措施 80例老年口腔修复临床分析 不育不孕症夫妇生殖道分泌物衣原体和支原体检测结果分析 头静脉修剪高位重建动静脉内瘘11例 老年获得性肺炎的临床特点及预后分析 2012年昆明市五华区居民死亡原因分析 探讨钞票对健康促进的影响 呼吸内科感染常见病原菌与相关因素 南宁市吴圩镇健康人丙氨酸氨基转移酶参考值的制订 老年恶性骨肿瘤54例误诊原因分析 带状疱疹病人的健康教育方式及效果评价 承┮┪锏脑鋈芗痢＞匝榉⑾置庖咦榛讨屑尤肓ween-20的PBS缓冲液冲洗切片，能够使切片更清洁，非特异性染色减少。本文对分别经过PBS-Tween-20缓冲液及PBS缓冲液冲洗的免疫组化切片进行对照，并将应用体会介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

PBS磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，PH7.2-7.4）、Tween-20、500ml容量瓶、

吸水纸，均购自福建迈新试剂有限公司。

1.2 方法

取500ml已配制好的PBS磷酸盐缓冲液置容量瓶中，加入250μl Tween-20，充分混匀，待用。现将经抗原修复后的组织切片分成3组（A、B、C）放入蒸馏水中备用。

A组：常规PBS磷酸盐缓冲液冲洗后，专用免疫组化油笔划圈。

B组：PBS-Tween-20缓冲液冲洗后，专用免疫组化油笔划圈。

C组：专用免疫组化油笔划圈后，PBS-Tween-20缓冲液冲洗。

将3组处理过的切片进行同样的免疫组化后续操作。

2 结果

A组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏多，无需用吸水纸擦拭，同时还有个别组织边缘干燥，发生了边缘效应。

B组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，但每次滴加抗体前均需用吸水纸擦拭，未发生组织边缘干燥。

C 组 在抗体孵育过程中，抗体用量偏少，无需用吸水纸擦拭，未发生组织边缘干燥。

3 讨论

本实验室免疫组化染色标本例数多，量大，半个工作日出片，由于一抗、二抗的孵育时间以及显色时间比较固定，这就要求在操作过程中尽量减少操作时间，并且尽可能地降低非特异性染色。A组虽然免疫组化油笔的使用节省了时间，但只能防止滴加的试剂不向四周流失，如果组织偏大就无法保证一次性将滴加的试剂完全覆盖整个组织，只有增加抗体用量将组织全部覆盖，抗体用量偏多，并且可能导致抗体覆盖不均，增加边缘效应、非特异性染色等。B组PBS-Tween-20缓冲液冲洗后，玻片上含有Tween-20，用吸水纸擦拭后使用免疫组化油笔划的圈不能与玻片充分结合，再次冲洗后划痕被Tween-20溶解，不能保持完整性，需用吸水纸另外擦拭干水分，耽误时间。相比之下C组划圈后和玻片充分结合，再用PBS-Tween-20缓冲液冲洗，划痕不被溶解，将其倾斜在吸水纸上，划痕能保持完整性，不用吸水纸另外擦拭，节省不少时间。

Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸脂和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸脂的混合物。由于其分子中有较多的亲水性基团（聚氧乙烯基），故亲水性强，具有乳化、扩散、增溶、稳定等性能，是一种常用的非离子性去垢剂和表面活性剂，对人体无害、无刺激性，常用为医药品的乳化剂、扩散剂和稳定剂。用其多次冲洗能够均匀覆盖整张切片，如同在切片上增加了一层液体膜，不会使组织和切片空白区形成明显的分界线，在离组织边缘

该方法在本实验室已使用1年余，与不加Tween-20的PBS缓冲液做过多次对照实验，发现Tween-20对免疫组化染色结果无影响，可以放心使用。且PBS-Tween-20缓冲液配制方法简单，2000ml每包的PBS加入1ml的Tween-20，浓度不太高，价格也便宜，同时各种抗体的价格昂贵，这样节省了抗体的用量，节约医疗成本，值得推广。

参考文献：

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关键词：免疫组织化学染色；抗体；组织固定；抗原修复

免疫组织化学染色方法是目前生命领域研究最常用的实验方法之一，也是临床病理诊断从细胞形态水平提高到分子水平的关键技术环节。免疫组织化学染色方法主要应用免疫学中抗原抗体结合的实验原理检测特定抗原在细胞或组织中的表达和分布。影响免疫组织化学染色的因素有很多，而抗体孵育条件、设置合理对照、固定液的洗脱、抗原修复和洗片等可能是做好免疫组织化学染色的关键注意点。

1基本原理及特点

免疫组织化学染色方法是根据免疫学中抗原抗体特异性结合，通过荧光或化学显色检测细胞或组织中抗原的含量和分布。免疫组织化学染色法具有特异性强、灵敏度高和定位准确等特点。目前最常用的几种免疫组织化学染色方法主要包括免疫荧光法、免疫酶标法和免疫胶体金技术等。免疫荧光法是将荧光素标记的二抗和一抗结合，可在荧光显微镜下直接观察细胞或组织内相应抗原的表达和分布。免疫酶标法与免疫荧光法不同之处在于二抗的标记方式，它用酶标二抗代替荧光素标记的二抗，然后通过加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，然后通过光镜或电镜，观察细胞或组织内抗原的含量和分布。免疫酶标法包括二步法、ABC法、SP三步法等多种方法，由于其组织形态较为完整，在抗原定位上对免疫荧光法具有更大的优势。

2几个关键注意点

2.1抗体孵育条件 抗体孵育是免疫组织化学染色中最关键的步骤，也是最核心的步骤。一个失败的免疫组化实验结果大部分都与抗体孵育条件不佳有关。抗体孵育条件包括抗体稀释浓度、孵育时间和温度、抗体稀释液等因素。即便是同一个抗原，在不同组织中表达丰度也有很大的差异，因此一定要根据浓度梯度选择合适的抗体稀释浓度。一抗孵育温度包括4℃、室温和37℃，4℃反应较为温和，效果最好。一般可选择4℃过夜，然后37℃复温30min～1h。二抗孵育条件一般室温2h。室温一般定义为25℃，如果在夏天或冬天选择室温孵育，需要注意室温的温度。可以用添加5%二抗来源血清的PBS稀释抗体，如果抗原位于细胞质或细胞核，建议用含5%二抗来源血清的TBST稀释抗体。由于弱碱性条件有利于抗原抗体结合，因此一定要注意抗体稀释液的PH值在7.2～7.4之间。此外，为了防止抗原抗体反应时液体的蒸发，可在擦干组织周围的液体后，使用免疫组化笔在组织周围画圈，使抗体不易流失，抗原抗体的反应过程中不干片，保证结合效率。

2.2设置合理对照 由于免疫组织化学染色中影响抗原和抗体结合的因素很多，因此必须设置对照组才能做出正确的判断。常用的对照包括：阳性对照、阴性对照和空白对照等。阳性对照是用已证实含用待测抗原的组织进行同样操作，结果应为阳性。通过阳性对照可排除染色步骤以及所用的试剂的问题。用确知不存在待检抗原的组织切片染色为阴性对照，可排除在染色过程中由于非特异性染色或交叉反应等因素造成的"假阳性"结果。空白对照是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的的非特异性显色或荧光。

2.3固定液的洗脱 取材新鲜、固定及时，不仅可保存组织细胞形态结构的完整，而且可保留组织细胞的抗原性。固定液的选择将直接影响免疫组化标记的结果及病理诊断的准确性[1]。然而，因固定液渗到组织中，所以必须彻底冲洗，除去固定液，否则会影响下一步的脱水和染色。由于免疫组织化学染色需要组织保存较高的抗原活性，因此一般选用PBS对固定的组织进行浸洗，30min/次，连续浸洗3次。

2.4抗原修复固定和石蜡包埋 可使组织部分抗原决定簇与核酸或其他蛋白发生交联，如果不进行抗原修复可能会得到"假阴性"实验结果。常用的修复方法包括高压修复、微波处理法和酶消化法等。通过微波抗原修复，充分暴露抗原决定簇，有利于抗原抗体结合，提高实验结果的准确性。一般可用微波中火修复4次，5min/次，抗原修复液需预热至修复时所需的温度。在微波修复过程中，应注意抗原修复液的蒸发，必须保证组织浸于液面以下，否则易造成假阴性结果。如果液体蒸发较多，可在中间及时加入预热的抗原修复液。微波修复后需自然冷却至室温，一般需要30min～1h。抗原修复液的pH值对染色结果有很大影响[2，3]。抗原修复液一般采用酸性的柠檬酸修复液，酸性pH值的抗原修复液效果要好于碱性修复液，并且不易造成脱片。此外，丙酮简单处理标本是一种方法简单、又能使组织免疫反应活性得到明显加强的方法，有时可替代复杂的抗原修复技术[3]。

2.5洗片 一般来说可用PBST在摇床上浸洗3次，10min/次，具体浸洗时间和次数可根据染色背景进行调整。前面已提到，弱碱性条件有利于抗原抗体结合，因此也要要注意切片漂洗液的pH值应在7.2～7.4。对于干片对染色结果的影响，余光银等[4]发现，在冲洗步骤造成的干片，对染色结果无明显影响；而滴加抗体和抗原修复时需防止干片，否则易造成假阴性及背景染色。

影响免疫组织化学染色结果的因素有很多，除了以上几点需要特别关注的地方外，还有其他步骤或细节都要注意，比如组织低温固定和脱水、固定液的选择、石蜡切片的烤片温度和时间、切片的低温保存等每个细节都会影响免疫组织化学染色结果的好坏。

参考文献：

[1]周会芹，杨江辉，余琦，等.不同组织固定液对免疫组化结果的影响[J].诊断病理学杂志，2009，16（6）：478.

[2] Shi SR， Cote RJ， Taylor CR. Antigen retrieval immunohistochemistry： past， present， and future[J]. J Histochem Cytochem， 1997， 45（3）：327-43.

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概述：当前，经过权威资料认证的免疫组化实验方法，已经对免疫组化的最基本问题做出了解答，并可以作为免疫组化技术中一种相对的标准。本文对免疫组化的操作步骤作出了一些具体的描述，提出了一些注意事项，并且对当前、今后的免疫组化自动化和标准化作出了评价和展望。

免疫组织化学在病理诊断中的作用已得到广泛的认同，具有特异性高、敏感性高、程序相对一致等特点，并已成为病理诊断中不可或缺的重要辅助技术。尽管免疫组化的理论比较简单，但方法与步骤却比较繁琐，在实际应用中还存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断。要想达到可靠的实验结果，最重要的是将免疫组化技术的全部程序形成一种概念上的标准化。本文就免疫组化技术的标准化进行一些浅显地探讨。

1 标本的固定

为了使细胞和组织保持原有的形态结构，防止组织自溶和抗原性丢失，固定是关键。标本离体后要求在15分钟内用10%中性缓冲甲醛固定，在常温下时间为8-24小时，避免过度固定，固定时间过长，切片中容易产生甲醛色素颗粒，会影响结果观察以及抗原的破坏。固定组织的固定液为标本体积的5-10倍，脱钙液对抗原也有较强的破坏，所以浓度和脱钙时间不易太长。

2 防脱片的制备

目前通用的是Sigma多聚左旋赖氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脱片效果。

3 包埋与切片

用过高温度的石蜡包埋组织会破坏抗原，对于固定不太好的组织影响更大，包埋用的石蜡应选用低熔点的石蜡，切片的厚度在3-4微米，以利于观察，太厚的切片会影响染色结果和诊断。

4 烤片

切片在50-60℃的恒温箱里烤片2小时，至少1小时才不至于脱片，烤片时间过短易脱片，时间过长或温度过高会破坏抗原。

5 脱蜡

免疫组化的脱蜡应与常规HE脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，脱蜡不彻底会影响组化染色结果，切片脱蜡后进入梯度乙醇脱水至水化。

6 抗原修复

6.1 抗原修复是组化的关键技术

免疫组化染色中最关键的步骤可以说是抗原修复了，组化染色结果的表达与抗原修复直接相关。因组织被甲醛固定后蛋白质发生交联，抗原决定簇封闭，只有恢复抗原的免疫原性才能完成免疫化学反应。抗原修复方法有多种，主要是酶消化法与加热修复两种方法，现在由于加热抗原修复方法的广泛应用，酶消化法在免疫组化中的应用已很少。免疫组化的加热抗原修复方法包含微波法、水煮法、高压法，现在比较公认的修复效果是高压法大于水煮法，水煮法大于微波法。

6.2 抗原修复液的选择

抗原修复液有多种，有柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）可作为首选的常规使用的抗原修复液，它适合于大多数种类抗体，染色背景清晰。一般抗原难以表达的可以选择EDTA和Tris缓冲液，这两种修复液对一部分抗原修复效果较强，但染色背景较深。

6.3 抗原修复实例

在全国，有多家实验室对ER、PR进行了反复实验，得出的结论是强力推荐使用高压抗原修复方法。

我们单位在最近的免疫组化测评赛中，对参赛的5个待测抗原进行抗原修复，取得了比较满意的结果。根据我们得出的经验，检测CD10、CD30这两项抗原，我们推荐使用高温水煮修复，修复液为tris-EDTA(PH9.0)，检测ER、PR、CK这三项抗原，推荐使用压力锅，修复液为柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），各单位可根据实验室的具体条件和经验选用微波、水煮、高压修复以及抗原修复液。

6.4 高压抗原修复方法

组织切片经二甲苯脱蜡至水，浸泡于蒸馏水中待用，取一定量抗原修复液于压力锅中，修复液必须浸没整张切片，加热沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气（整个时间约需4-5分钟），开始计时1-2分钟后，压力锅离开热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗，PBS洗2min×3次。

7 生物素封闭

一般进行抗原修复处理的切片都需要进行内源性生物素封闭处理；

7.1 3%H2O2浸泡切片10min

在免疫组化染色中如果采用过氧化物酶检测系统，必须进行封闭处理，这样可以消除组织中的红细胞、粒细胞对染色结果的干扰。虽然3%的H2O2对抗原有轻微的损害，但封闭效果非常显著。

7.2 血清封闭

一般在加载一抗之前使用封闭血清（室温15-20分钟），可以减少非特异性显色。血清的种属一般与二抗的种属相同，一抗中若含正常血清则可以免去此步骤。

实验中通常用的冲洗缓冲液为PBS和TBS，加入Tween20可以加强冲洗效果，在组化染色中严格的冲洗可防止背景着色。

8 一抗孵育

加载一抗50-100ul，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时，如4℃过夜后需在37℃复温45分钟，PBS洗3次各2分钟。

9． 加一滴（50ul-100ul）检测试剂（二抗），室温或37℃放置30分钟， PBS洗三次，每次2分钟。

10. DAB显色5-10分钟

11. 苏木素复染、脱水、透明、封片。

衬染的步骤十分简单，但衬染的好坏对染色质量的影响很大，不易太深或太浅。首选的是Harris苏木素衬染，它在水中洗涤后可以呈鲜亮的兰色，与DAB染色对照效果很好，使用简单方便。

对于即用型抗体，厂商已进行多种实验条件的检测，可以直接使用，而浓缩性抗体，可按照供应厂商提供的稀释度进行预实验，一般在厂家提供的滴度前后各加一个滴度做预实验，抗体的最佳稀释度为在无背景染色的情况下获得最强阳性信号。

通用的检测系统是生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行且试剂稳定。SP三步法和Envision二步法高效经济，为国内免疫组化首选的检测系统。

显色系统通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）酶底物，常规组化显色首选的是DAB，它定位清晰，易于保存。

在免疫组化的质量控制中，最重要的是设立阳性和阴性对照，每批实验中最好有一张阳性对照和阴性对照，这样才能确保实验的可靠性，虽然很多医院病理科的工作量很大，但是不要怕麻烦，可以每月进行一次室间质控，以保证免疫组化染色结果的可靠性和准确性。

自动染色仪，它是一种各种试剂高度通用的仪器，可使用大多数免疫组化染色的抗体、检测系统和其他试剂，是当今最流行的开放式的自动染色仪。它利用电脑控制代替技术人员手工操作，大大地减少了手工操作出现的误差。自动染色仪能精确泵出每次滴加试剂的量，以及将每一步的染色时间精确到秒，空气压缩泵能均匀地吹掉切片上多余的液体，这一切彻底避免了免疫组化染色过程中人工操作的误差，染色仪将所有的染色步骤存储在电脑里，这些优点保证了染色结果的一致性，不同单位的实验室选择相同的试剂及染色过程就可以达到相同的染色结果。

近年来，随着免疫组化标准化的逐步实行，免疫组化自动染色仪将逐步进入病理科，技术人员将从烦琐的人工操作中解脱出来，会极大提高免疫组化的工作效率，同时也将免疫组化标准化推上了一个新的台阶。

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【关键词】 抗原修复液；固定时间；免疫组化

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2012.08.089 文章编号：1004-7484（2012）-08-2487-02

随着医学技术和相关领域的不断发展，免疫组织化学技术作为一门新兴的学科出现了。它是一门基于免疫和分子生物学与病理形态学等学科综合的技术，主要是通过已知抗体或抗原进行对实验中的组织细胞中探测的抗原或抗体检测。典型特征包括操作易于实现，准确性高和特异性强，并且能够将形态和机能相互整合。该种技术已在实际中能够进行病理和鉴别诊断，组织胚胎和神经解剖等相关领域的实验研究[1]。通常情况下，只有在正确及时的固定离体组织前提下，免疫组化技术才能得出精确度高的实验结果。但是，由于实际操作中存在大量的影响因素造成不能正确及时的固定离体组织，特别是在进行尸检标本时，对实验的要求更高。本文的研究重点就是考察这些组织是否能够做免疫组化实验，对于不同抗原修复液和固定时间对免疫组化结果的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 采集本院在2008年1月至2009年12月手术中送检，并且确诊为乳腺浸润性导管癌的26例标本。在实验中，每一标本中选取4块肿块部位，其中的四个时间点分别是：t1，t2，t3和t4。t1，t2，t3和t4分别代表立即固定组，延迟12小时固定组，延迟24小时固定组，延迟48小时固定组。将其中的1块标本马上置于10%的中尔马林液中进行固定，并将实验中的其余3块分别于延迟12、24、48小时后放入10%中尔马林液进行固定。然后对于以上标本固定满24小时后进行脱水、透明、浸蜡和包埋相关操作，再进行切片行HE染色验证肿瘤组织。并且将染色结果为阴性者立即固定组免疫组化，同时不再做与其相应延迟固定组的标本标记染色。

1.2 试剂与方法 采用的试剂包括：鼠抗人CK7单抗，抗人C-erbB-2，单抗兔抗人ER单抗和鼠及ElivisionTM plus（即用型检测试剂盒和DAB试剂盒均购于福建迈新生物技术开发有限公司）。采用两步法进行免疫组化，即分别用柠檬酸高压热修复和胃酶修复，并且严格按照ElivisionTM plus试剂盒要求的操作步骤进行操作。其中，脱水透明，中性树胶封片，DAB显色和苏木素轻度复染，并且用PBS进行替换一抗作为阴性对照。其中，不同抗原修复液分组：pH为9.0的高温高压EDTA缓冲液修复（A），pH为8.0高温高压EDTA缓冲液修复（B），pH为6.0高温高压柠檬酸盐缓冲液修复（C），pH为9.0微波炉EDTA缓冲液修复（D），pH为8.0微波炉EDTA缓冲液修复（E），pH为6.0微波炉柠檬酸盐修复法（F）。

1.3 结果判定 进行阳性定位在细胞浆和阳性定位在细胞核的免疫组化切片，将其中具有特征代表的10个在400倍视野中观察，对其中的阳性细胞占整体细胞的比例进行计数如下：计阳性细胞数占整体细胞比例在25%以下记做（±），占整体细胞比例在25%-50%记做（+），占整体细胞比例在50%-75%记为（++），占整体细胞比例在75%以上记为（+++），并且相应的评价分为1，2，3，4分；同样的，以（±），（+），（++）表示染色强度，并且相应的评价分为1，2，3分。最后，将两种记分乘积作为染色效果指数。另外，对阳性定位于细胞膜的免疫组化进行切片，其中的染色效果参照文献[2]标准判定，同样的以符号±，+，++，+++，++++进行评价，并且相应的评价分为1，2，3，4，5分，将两种分数的乘积作为染色效果指数。

1.4 统计学分析 基于统计软件SPSS13.0进行数字统计处理。在进行统计中，进行随机区间设计的秩和检验，并将检验结果在P

2 结 果

2.1 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，CK7的表现结果如下：在乳癌组织中，CK7的阳性显示为黄褐色的颗粒，其定位于细胞浆中，在总共26例标本中立即固定组均阳性。并且，在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数差异，有统计学意义（P

2.2 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，ER的表现结果如下：在乳癌组织，ER的阳性显示为黄褐色颗粒，其定位于细胞核中，在所有的标本中有22例立即固定组标本呈现出了阳性。在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数之间的差异P

2.3 通过在A-F抗原修复液以及固定时间不同乳癌组织中，C-erbB-2的表现结果如下：在乳癌组织，C-erbB-2阳性显示为黄褐色颗粒，并且阳性定位在细胞膜中，在所有的标本中有18例立即固定组标本呈现阳性。在立即固定组、12小时后固定组、24小时后固定组和48小时后固定组间的染色效果指数之间的差异P

3 讨 论

由组织病理学基本理论可知，无论在组织切片活着进行电镜大体标本的保存，应该及时适当进行有效的固定。通过这种操作，才能达到使组织和细胞内蛋白凝固并能够在特定位置保留，进而可以防止破坏及自溶内外源性酶，从而最大程度的对组织和细胞的固有形态、结构实施了保护。当出现组织内没未能进行有效的固定时，内外源性酶将能够造成组织细胞结构破坏，甚至使某些特定部位的蛋白向周围扩散并出现降解。在本实验中，通过采用不同抗原修复液，并采用在延迟时间不等的固定组织，进行特定部位的蛋白免疫组化检测，在结果中可以看到特定阳性部位周围有不同的化程度的阳性背景。并且，在进行CK7免疫标记时，癌巢周围阳性背景随着抗原修复液A到F，固定时间的增长而逐渐加深；在进行ER免疫标记过程中，在核阳性减弱的同时出现胞浆的阳性背景；在进行C-erbB-2免疫标记过程中，胞膜阳性同时胞膜两侧均出现阳性背景。并且，从统计学角度，在CK7、ER和C-erbB-2在4组固定时间不等的乳癌组织间的表达效果具有统计意义。

免疫组织化学技术基本原理：基于抗原抗体反应或者组织化学的呈色反应，通过借助显色剂来标记特异性抗体在组织细胞原位，从而能够对相应抗原进行定性、定位和定量诊断。其中，组织固定不理想对于免疫组化染色结果有非常大的关系，其固定的结果程度和抗原保存有直接关系，因此应该进行尽快组织固定。在进行大标本和有包膜的标本实验时，由文献[3，4]应该进行切开固定。在其中的组织细胞不能及时有效固定，就会导致细胞内蛋白破坏降解，甚至导致免疫组化检测失败[5，6]。免疫组化染色中，组织结构的保存和抗原性等的改变程度有多方面的影响因素，主要包括：温度、抗原、固定液的pH值、固定剂种类、灌注速度和进行固定后处理方法等方面。

在本实验中，所选用得CK7、ER和C-erbB-2抗体，进行了在不同抗原修复液，在立即固定、延迟12小时固定、延迟24小时固定和延迟48小时固定的4组乳癌组织中，并且最终标记了细胞浆、细胞核和细胞膜等部位的相应蛋白。通过实验看出，在抗原修复液E和F及在延迟48小时中的不到明确的膜阳性。因此，延迟固定对膜蛋白免疫组化效果的影响更明显。延迟固定大幅弱化了免疫组化效果，其中的原因可能是延迟固定和内外源性蛋白酶对部分蛋白的降解，以及部分蛋白向周围扩散造成。抗原修复液E和F延迟固定太长，不太适宜进行检测，而抗原修复液A、B、C和D可以进行延迟固定组织免疫组化检测。可以得出，尽管在实验中免疫组化效果变差，但是可以分辨出特定部位的阳性结果。因此，对延迟固定组织只要充分固定和选用抗原修复液抗原修复液A、修复液B、修复液C和修复液D可以做免疫组化检测的，同时应注意减少实验延迟固定时间。

综上所述，对于那些客观因素造导致延迟固定标本，在其延迟时间未达到48小时之前，并且没有进行免疫组化辅助诊断，可以选用抗原修复液A、B、C和D进行免疫组化检测。应当注意的，判定检测结果应充分考虑到延迟固定带来的影响。因此，只要通过有效的措施排除了延迟固定产生的不良影响，免疫组化在一定意义上能够起到辅助诊断的作用。

参考文献

[1] 杨美娟.组织标本固定方法与免疫组织化学染色效果的关系[J].解剖科学进展，2003，9（1）：89-90.

[2] D'Alfonso T，Liu YF，Monni S，et al.Accurately assessing her-2/neu status in needle core biopsies of breast cancer patients in the era of neoadjuvant therapy： emerging questions and considerations addressed[J].Am J Surg Pathol，2010，34（4）：575-581.

[3] 吴秉铨，刘彦仿.免疫组织化学病理诊断[M].北京：北京科学技术出版社，2007：10.

[4] 杨红.免疫组化质量控制中的3个基本影响因素[J].临床与实验病理学杂志，2001，17（2）：183-185.

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[关键词] 纤支镜毛刷；细胞块；常规HE染色；免疫组化；10%中尔马林

[中图分类号] R446.6；R361.3 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）36-075-03

The application methods and value of fiber lens brush cell block technique

ZHANG Guizhen ZHU Zhenda CHEN Cheng

Department of Pathology， Yuhang District Traditional Chinese Medicine Hospital of Hangzhou City in Zhejiang Province， Hangzhou 311106， China

[Abstract] Objective To study the application methods and value of fiber lens brush cell block technique. Methods For 32 cases of fiber lens brush after conventional smear in the remaining cells again fixed with 10% formaldehyde wax block made from cells （cell block， CB）， the first routine HE staining， again to choose according to the need to enzyme immunohistochemical marking line. Results CB routine HE staining cells clear， histologic structure to a certain extent， was conducive to clear diagnosis； Immunohistochemical positive for accurate positioning， color clear， has good effect for tumor classification. Two dyeing methods were better than regular smear dyeing effect， so the significant difference of statistically was significant （P < 0.01）， and the lung biopsy and postoperative biopsy difference was not significant （P > 0.05）. Conclusion The production method of the fiber lens brush CB fixed with 10% of formaldehyde is simple， economic and The dyeing effect is good， in the diagnosis of pulmonary diseases， especially lung cancer has a high practical value and broad application prospect， the production method is worth promoting.

[Key words] Fiber lens brush； Cell block； Routine HE staining； Immunohistochemical； 10% formaldehyde

纤支镜毛刷细胞学检查是诊断肺疾病、特别是肺肿瘤的重要手段之一，已被广泛用于临床，当纤支镜活检和经皮肺穿刺活检由于多种因素被迫放弃，此时的纤支镜毛刷细胞学检查是术前最佳的病理检查方法，显得尤为重要，并对已不适合手术治疗的老弱患者和晚期癌症患者来说也是较佳的病理检查方法。笔者对32例纤支镜毛刷常规涂片后再将剩余细胞制成细胞蜡块（cell block，CB），先行常规HE染色镜下观察，再根据需要选择酶标行免疫组化（如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等），两者结合观察，对肺疾病进行病理诊断，特别是对肺肿瘤进行组织学上的分型，效果较好，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料

50 mL尖底塑料试管1支，直立平衡离心机1台，盛10 mL 10%中尔马林的小瓶1只，老虎钳1把，震荡器1台。

1.2 方法

1.2.1 毛刷处理 毛刷刷取细胞后快速涂片2张，95%乙醇迅速固定，常规HE染色。涂片后马上用老虎钳剪断毛刷放入盛有10 mL的10%中尔马林的瓶内固定。

1.2.2 制片方法 毛刷在10%中尔马林液固定1 h后用干净的镊子取出，用针尖挑（或刮）出刷内物，尽量挑干净，再把毛刷在固定液内漂洗，而后把固定液倒入试管内。再重新倒入10 mL左右的10%中尔马林在瓶内，在震荡器上震下刷内残余的细胞，再把这10 mL的中尔马林倒入同试管内，再加一定的量，使试管内的福尔马林总量达30～40 mL，离心3000 r/min、15 min，取出放在试管架上固定2～4 h左右，如标本上午送来的则当天即可与常规组织同脱水，如下午两三点后送来则固定过夜。固定好后倒去固定液，此时沉淀物已结块，小心取出，放在滤纸上滴入伊红包好，与常规组织同时进行脱水、包埋予0.4 mm厚连续切片8张左右，其中1张常规HE染色镜下观察，再根据需要选择酶标行免疫组化。

1.2.3 染色合格标准 将常规HE合格标准定为：细胞清晰，核浆对比分明，组织学结构可有（或无），有利于明确诊断。将免疫组化合格标准定为：阳性定位准确，着色清晰，有助于肿瘤的分型。

1.2.4 免疫组化方法 CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、 34βE12、TTF-1等单克隆抗体购于北京中杉公司，实验流程采用EnVision二步法。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS16.0统计学软件处理。用Kolmegorov-Smirnov方法进行正态性检验，使用χ2检验对正态分布的构成比进行比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

40例肺纤支镜毛刷，先直接常规涂片，再将剩余细胞用10%中尔马林固定制成细胞蜡块（CB），除8例由于细胞数量过少或血过多等原因使CB制作失败外，成功的32例常规HE染色效果较好，细胞较清晰，有一定的组织结构；免疫组化则阳性定位准确、着色较清晰，与常规涂片相比差异有统计学意义（P < 0.01）、与肺活检（或术后组织切片）相比差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 三种不同方法检测结果比较[n（%）]

图1、2 CB中的片状异型鳞状上皮组织，HE，×10与×40

图3 CB中的正常腺管状结构，HE，×40

图4 CB中的支气管黏膜，×10

图5 活检中的支气管黏膜，×10

图6 术后常规切片对照，HE，×40

图7 直接常规涂片对照，HE，×40

图8 34βE12在CB中的（与图1同片）阳性表达，Envision法，×10

图9 34βE12在直接常规涂片中的阳性表达，Envision法，×10

图10 34βE12在术后常规切片中的阳性表达，Envision法，×10

图11 CB中的片状鳞状上皮（右下）与坏死组织（左上）分界清，×10

图12 术后切片中的鳞状上皮（上）与坏死组织（下）分界清，×10

3 讨论

3.1 纤支镜毛刷细胞块的HE染色效果

本方法制作的CB在HE染色上与文献报道[1]的相似：细胞境界、核膜、核染质、核仁清楚；也有一定的巢状、片状、管状结构组织学结构和排列方式[2]（图1、2、3、4），等同活检（图5）和术后切片（图6）的图像，两者染色效果对比差异无统计学意义（P > 0.05）。而直接常规涂片最大的缺陷是细胞量少，很难看到组织学结构[3]，我们观察的病例大多似此，且常伴有细胞退变（图7），常与坏死物、血细胞混合，干扰细胞的分辨，给诊断带来一定的困难，两者染色效果对比差异有统计学意义（P < 0.01）。

3.2 纤支镜毛刷细胞块的免疫组化效果

本方法制作的CB在免疫组化上阳性定位准确，着色清晰，背景也清晰无干扰（图8），与活检和术后切片（图10）相似，两者染色效果对比差异无统计学意义（P > 0.05）。而常规涂片免疫组化出现高背景染色，细胞集群呈三维结构，尤其是膜着色的更难判断[4]，着色有模糊朦胧（图9）的感觉，给判断带来一定的困难，两者染色效果对比差异有统计学意义（P < 0.01）。

3.3 纤支镜毛刷细胞块的制作体会

纤支镜毛刷常规涂片后再把毛刷内残留的物质挑（或刮）出再离心制成细胞块，优良的纤支镜毛刷技术和小心、耐心挑（或刮）出刷内残留物使有足够量的肿瘤细胞是成功制成CB的主要环节。毛刷内物固定1 h左右后有一定硬度，易于挑（或刮）出，刷内物直接挑（或刮）出，对成小片状、小粒状刷下组织的破坏较小，很好地保存了原有的组织学结构（图4），再利用离心机的离心力把漂下、震下的分散细胞经过高度浓缩压紧，也一定程度地显示了组织学模式，并能显示涂片中不能显示的特征性组织结构，如鳞癌的角化珠、状结构、肿瘤的组织间质等[5]，又如我们观察到的片状上皮成分与坏死组织分界清（图11）及较完整的黏膜结构（图4）的图像，与活检（图5）和术后切片（图6、图12）极其相似，且又不浪费所刷取的任何材料。而直接常规涂片最大的缺陷是材料浪费，细胞量少，又很难看到组织学结构。现虽有较先进的液基细胞学技术，但经过振荡，标本中组织学结构大部分被离散，涂片中也很难看到组织学结构，又经过膜式过滤后，细胞量也相应减少，对刷取的材料仍有浪费。

我们不用95%乙醇固定，用10%中尔马林固定，是因为高浓度的乙醇可使组织细胞收缩和变脆，难以切片外，还可溶解红细胞中的血红蛋白[6]，在免疫组化染色时会干扰背景加重背景着色。有文献报道脱落细胞有完整的细胞膜，虽经乙醇固定，其包膜上的类脂质不能充分溶解，影响试剂的渗透造成真正的阳性细胞着色不良，影响结果判断[7，8]。10%中尔马林对组织渗透作用强，固定均匀、稳定，使组织具有一定的弹性，不仅易于切片外，还能很好地保存组织细胞的形态结构、保存大部分组织细胞内的物质如糖类、无机盐、色素、蛋白抗原等，使抗原定位更加清晰，尤其是对细胞核的抗原固定最佳[9]，利于进行免疫组化染色和分子生物学检验。我们制作和观察的病例大多有类似的结果，免疫组化效果较佳（图10）。但福尔马林渗透速度较乙醇慢，所以固定时间较长，一般要2～4 h[10]，如果急需加快，也可采用付海洋等[9]介绍的方法：在前固定的基础上再利用超声波进行后固定，加速福尔马林对细胞的渗透和固定。另有文献报道常规涂片免疫组化细胞成分复杂，除有较强的非特异性背景着色外，三维细胞团免疫试剂容易进入产生假阳性[11]；CB免疫组化染色则背景干净，几乎没有假阳性[12]。

3.4 纤支镜毛刷细胞块的应用前景

细胞块作为细胞学诊断中重要的辅助手段最初应用于胸腹水、心包积液等液体标本，在国外该技术已经成为脱落细胞学的常规操作技术，并已应用很久，目前国外普遍采用自动化制作细胞蜡块，但该方法设备成本较高且技术较为复杂[13]。传统的细胞块制作方法有琼脂或生物胶水包埋法、固定沉降法、血浆凝血酶凝集法、鸡蛋清凝集法和医用脱脂棉吸附法，不仅操作复杂，且通透性较差，影响脱水、透明和浸蜡，造成制片困难和染色效果差[14，15]。我们制作的方法较为简便，只需1台离心机用10%中尔马林固定，2～3 d即可完成常规HE染色和免疫组化染色，并因未用任何媒介物，干扰图像较少，染色效果较佳，更易于镜下观察。CB还有优点是可以连续切片，用于多种酶标检测，如CEA、LCA、CK5/6、CK7、CgA、Syn、P63、34βE12、TTF-1等诊断肺肿瘤的酶标均可用上，以满足诊断需要。并可长期保存，其成本对实验而言也是最经济的。已有文献报道CB用于原位杂交检测定位准[16]，因条件限制，我们尚未开展，但是我们以后努力的方向。所以用10%中尔马林固定的纤支镜毛刷CB方法简便、经济、效果好，在诊断肺疾病、特别是肺肿瘤中有广阔的应用前景，值得推广。

[参考文献]

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篇6

【关键词】 妊娠期肝内胆汁淤积症 肿瘤坏死因子-α 免疫组织化学

Abstract: Objective To study the significance of TNF-α expression in the placenta in patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy （ICP）. Methods The expression of TNF-α in placenta was investigated in 37 patients with ICP and 33 normal pregnant women by immunohistochemical method. Results The level of TNF-α expressed in ICP patients was higher than that in normal pregnant women （P

Key words: intrahepatic cholestasis of pregnancy； tumor necrosis factor-alpha; immunohistochemistry

妊娠期肝内胆汁淤积症（intrahepatic cholestasis of pregnancy， ICP） 是好发于妊娠中、晚期的妊娠并发症，表现为孕妇肝内胆汁淤积、血胆汁酸增高、皮肤瘙痒和（或）黄疸， 在分娩后迅速消失，通常被认为是产科高危因素。细胞因子在ICP的研究中越来越受到人们的重视。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor， TNF） 系统，特别是TNF-α是近年来被认识的一种重要的细胞因子，参与多种生理与免疫过程。为进一步了解TNF-α在ICP中的作用，本实验采用免疫组织化学（免疫组化）染色技术进行了胎盘组织中TNF-α表达的研究， 现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 病例及分组 ICP组共37例，纳入标准参照参考文献［1］:①妊娠中、晚期出现局部或全身皮肤瘙痒，排除皮肤病;②血清甘胆酸水平升高，转氨酶轻、中度升高;③妊娠是引起皮肤疾病及生化异常的惟一原因;④排除乙肝、丙肝等造成的转氨酶升高;⑤症状、体征及生化异常在产后迅速消失或恢复正常。对照组为33例正常孕妇。2组孕妇均在我院就诊，其年龄、分娩孕周无显著性差异，排除了感染、血液病、肿瘤及肝肾疾病等。

1.2 方法

1.2.1 胎盘标本的采集 胎盘娩出后立即在直视下剪取胎盘中央母体面、血管少的一小块组织（约30 mm×30 mm），生理盐水冲洗干净后，切成约15 mm×15 mm 组织块，常规固定。

1.2.2 制片 将固定的标本石蜡包埋，制成5 μm厚的切片，TNF-α免疫组化试剂盒由上海天呈生物技术有限公司提供，严格按说明书操作进行免疫组化染色。TNF-α在细胞质中表达，染色后呈现棕黄色颗粒。

1.2.3 TNF-α的阳性判断及分级标准 阴性对照用PBS代替一抗进行对照。TNF-α表达阴性和阳性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积，即两者积分之和来判断。染色强度分为:不染色= 0，轻度染色=1，中度染色=2，强染色=3。染色面积分为:无细胞染色=0，50%细胞染色=3。若积分之和=0，则表达为（-）；积分之和=1、2 则为（+）；积分之和=3、4，则为（++）；积分之和=5、6，则为（+++）。

1.3 统计学处理 应用SPSS软件包进行统计学检验，临床资料进行配对t检验，TNF-α免疫组化数据进行Wilcoxon秩和检验，P

2 结 果

正常妊娠组及ICP组胎盘组织TNF-α的免疫组化检测结果见表1和图1、2。表1 2组胎盘组织TNF-α的免疫组化检测结果

3 讨 论

ICP是妊娠期特有并发症， 因其可导致早产、胎儿宫内窘迫增加围生儿死亡率，而备受关注［2］。ICP的发生、发展及临床过程较为复杂，至今其母婴死亡率仍较高。国外许多学者从不同方面对其发病机制进行探讨，目前仍无明确的结果［3］。妊娠时胎盘作为内分泌器官产生大量重要的细胞因子，这些细胞因子进入母体及胎儿血液循环，对代谢、免疫、血管等系统发挥多种作用。在整个妊娠期，这些细胞因子进行着复杂的平衡调节，维持了正常妊娠的过程。近年来研究表明，细胞因子作为参与免疫反应的重要介质，在ICP的发生、发展过程中起重要的作用［4-5］。TNF-α主要是由单核-巨噬细胞分泌，其他类型的细胞，如淋巴细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等在一定条件下也具有产生和释放TNF-α的能力，其主要通过受体发挥作用，参与多种生理与免疫过程。妊娠期TNF-α主要由胎盘和脂肪组织合成和分泌［6］。

本实验结果提示，TNF-α在ICP胎盘中的表达较正常胎盘组织明显增强，TNF-α在ICP胎盘中表达上调。是何种原因导致TNF-α在ICP胎盘中表达升高尚不清楚。推测，TNF-α可能引起胎盘滋养细胞凋亡增加，使螺旋动脉受损，导致胎盘缺血缺氧，进而引起胎盘代谢障碍；ICP患者胎盘合成和分泌TNF-α功能失调， 可能是ICP的发病原因之一。

【参考文献】

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篇7

【关键词】抗原修复；免疫组化

【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0294-01

在病理诊断和科研中，免疫组织化学越来越为人们认识和接受，应用也越来越广泛。它能提供抗原特异性表达和准确定位，有助于一些疑难病理诊断问题的解决。但目前所进行的常规石蜡切片标本均用甲醛固定，使抗原性物质或由于形成醛、羧甲键等原因而被封闭了部分抗原决定簇，或由于蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽，从而影响免疫组织化学结果，为解决这些问题需要做抗原修复[1]。目前，基层医院病理科常用的抗原修复方法有两种：高压锅修复和微波炉修复。我们选择了15种常用抗体用高压锅、微波炉两种修复方法进行免疫组化试验，现将结果总结如下。

1 材料与方法

1.1仪器设备

OLYMPUS CX―41显微镜、市售家用微波炉、高压锅、电磁炉。

1.2 试剂：15种抗体、即用型二步法（非生物素）检测试剂盒、DAB显色剂、PBS磷酸盐缓冲液（0.01M PH7.2―7.4）、柠檬酸盐缓冲液（0.01M PH6.0）均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 组织材料：病理组织来自我院病理科，经10%中尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，厚约4μm 。

1.4 高压锅法：15张切片脱蜡、水洗后置于0.01mmol柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，加热至喷汽，开始计时，2.5分钟后，离开热源，自然冷却。PBS冲洗2次，每次约3分钟。后按试剂盒操作步骤进行。

1.5 微波炉法：15张切片脱蜡、水洗后置于盛有0.01mmol柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的耐热容器中加热至沸腾（98 -100℃），持续10分钟。自然冷却， PBS冲洗2次，每次约3分钟。后按试剂盒操作步骤进行。

2 结果

光镜下，细胞质（细胞核）内出现棕黄色颗粒为阳性，阳性细胞数占1%-10%为（+），11%-50%为（ ++），51% -80%为（ +++） [2]。从表中可以看出：15种抗体中，有10种抗体显色结果相同，2种微波修复比高压修复染色效果提高了一个（+），3种高压修复比微波修复染色效果提高了一个（+）。

3 讨论

用微波进行抗原修复，时间短时染色较浅，时间长时背景深[2]。因此，抗原修复时间的掌握很重要。在本次试验中，部分膜、浆标记的抗原，微波修复要比高压修复显色效果满意；高压处理检测细胞核抗原，较为满意。总之，在日常工作中，利用本科的仪器设备和技术条件，选择合适的抗原修复技术能够改善免疫组化染色结果，我们要根据抗原的不同表达部位，选择合适的抗原修复方法，提高免疫组化染色的效果，使反应结果更加准确可靠。

参考文献：

篇8

【摘要】

目的 探讨支配女性尿道括约肌神经纤维的定位、定量及定性。方法 12例21周至40周的女性胎儿尿道，分别进行石蜡包埋、胆碱乙酰基转移酶(choline acetylcatransferase， CHAT)及神经肽Y(neuropeptide Y， NPY)免疫组化染色，并对其结果进行半定量和定量分析。结果 从尿道内口至外口，神经肽Y阳性区域显色范围逐渐变小、强度减弱，胆碱乙酰基转移酶阳性区域主要位于尿道中三分之一，统计学上具有显著性差异。结论 尿道括约肌的胆碱乙酰基转移酶及神经肽Y免疫组化染色对理解参与控尿的尿道括约肌神经支配提供了很有价值的帮助。

【关键词】 控尿　神经支配　尿道括约肌　免疫组织化学

Innervation of the female human fetus urethral sphincter by immunohistochemical studies

ABSTRACT: Objective To explore the location， quantity and nature of nerve fibers innervating the urethral sphincter. Methods Urethra of 12 female human fetuses between 21 and 40 weeks of gestation were treated by paraffin embedded with choline acetylcatransferase (CHAT) and neuropeptide Y(NPY) immunohistochemical staining. The staining results were analyzed quantitatively and semiquantitatively. Results From the urethra internal orifice to external orifice， the positive region of NPY became smaller and the density thinner; the positive region of CHAT was mainly located in the middle part of arethra， and there was statistically significant difference between them. Conclusion The immunohistochemical staining of choline acetylcatransferase and neuropeptide Y in the anatomical structures of the urethral sphincter provides a better understanding of the origin and nature of the innervation participating in urinary continence.

KEY WORDS: urinary continence; innervation; urethral sphincter; immunohistochemitry

女性尿道括约肌的内在机制是由平滑肌和横纹肌成分组成，它们各自接受相互独立的神经支配，这些机制目前尚不十分清楚[1]。大多数学者认为女性尿道括约肌是由来自神经(躯体神经)和盆丛(自主神经)的神经纤维共同支配[2]，但有关女性尿道括约肌及其支配神经精确的定位、定量及定性方面的研究在国内外报道较少。本实验采用免疫组织化学染色及显微图像分析技术，对国人正常女性胎儿尿道的胆碱能及肾上腺素能神经进行定位、定量研究，从而探讨它们在控尿方面的作用。

1 资料与方法

1.1 资料 选取12个正常女性胎儿，21-40周胎龄。测其冠臀长度为165-340mm，胎儿死亡1h内完整取下尿道，尿道长度为9-15mm，另取成人新鲜大脑皮质及肾上腺髓质标本做阳性对照，以上标本均经40g/L多聚甲醛固定后石蜡包埋。

我们应用12个21-40周胎龄的女性胎儿尿道，是因为胎儿在妊娠15周时横纹肌和平滑肌之间已显示出明显的区别[3]，这个阶段的胎儿能够在肉眼下解剖，括约肌的基本类型已经建立[4]。

1.2 试剂和仪器 NPY多克隆抗体购自武汉博士德生物制药有限公司，CHAT多克隆抗体及ABC检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，Biogenex i6000全自动免疫组化染色系统由广州新捷仪器有限公司生产，Quantimet970型显微图像分析仪产自英国剑桥仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 制作切片 将石蜡包埋的女性尿道标本从内口至外口做连续切片，片厚4μm，根据尿道长度平均分成8个截面，加之内、外口，每个截面各取2张切片，分别做CHAT和NPY染色。

1.3.2 免疫组化染色 常规ABC法。切片脱蜡至80%(体积分数)乙醇，甲醇H2O2溶液中震荡10min，置于枸橼酸盐缓冲液中，微波炉加热12min，温度在96℃左右，取出后自然冷却(抗原修复)。一抗分别为多克隆抗CHAT抗体及多克隆抗NPY抗体，湿盒内孵育60min，二抗37℃ 30min，三抗37℃ 50min，DAB液显色约8min。以成人大脑皮质作CHAT的阳性对照，成人肾上腺髓质作NPY的阳性对照，以TBS缓冲液代替一抗作阴性对照。一抗稀释度为1∶200。

1.4 观察指标 采用半定量的方法根据免疫组化反应呈色深浅及反应颗粒多少，将酶活性反应强度分为：(-)阴性，(+)阳性，()中等阳性，()强阳性，四个级度，将其用数字化表示分别为0-3，进行统计学处理。

切片中CHAT及NPY阳性区域显色为棕黄色至棕褐色，经显微摄像扫描后，将图像输入计算机，采用显微图像分析技术对计算机图像进行定量分析。

1.5 统计学分析 实验数据用±s表示，统计分析采用SPSS11.5软件包，两样本均数差别应用t检验，P

2 结果

观察21-40周女性胎儿尿道的组成，可见胎儿尿道已具有三层基本结构，发育良好：内层为充满皱折的黏膜，中间为黏膜下血管组织，外层为纤维肌肉鞘，由平滑肌和横纹肌弹性组织组成。

2.1 肾上腺素能神经的分布 NPY免疫组化染色分析提示，交感神经介质NPY免疫组化阳性纤维呈棕黄色，多位于血管壁中层平滑肌细胞间和神经束中，在部分细小动脉壁可观察到较粗大的阳性纤维。从尿道内口至外口，NPY染色阳性区域(尿道平滑肌)逐渐变小，颜色变浅，至外口处几乎完全消失(图1)。将NPY免疫组化反应强度“0-3”数字化后结果可见：近1/3与远1/3，中1/3与远1/3之间差异均有显著性(P0.05，表1)。

图1 12例女性胎儿尿道免疫组化染色分析(半定量)（略）

2.2 胆碱能神经的分布 从CHAT免疫组化反应染色分析可见女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，近端1/3次之，远端1/3最弱。将CHAT免疫组化反应强度“0-3”数字化后结果可见：远、中、近端三者差异均具有显著性(P

表1 女性尿道NPY与CHAT免疫组化分析结果（略）

注：近1/3是指图1中从内口至2；中1/3是图1中从3至5；远1/3是图1中从6至8. 与远1/3比较*P

3 讨论

关于此项研究内容，国外的研究结果并不完全相符，甚至结论互相矛盾。女性尿道的复杂结构组成了混合的神经支配：自主神经支配平滑肌，躯体神经支配横纹肌，自主神经和感觉神经支配黏膜和黏膜下组织。平滑肌和横纹肌的连接也非常紧密，使得识别支配每种肌肉结构的神经纤维变得非常困难[5]。

女性尿道的尿道内括约肌主要由交感、副交感神经支配，尿道外括约肌主要由躯体神经支配，其中交感神经和副交感神经节前纤维为肾上腺素能神经，副交感神经节后纤维和躯体神经为胆碱能神经，其神经纤维末稍释放乙酰胆碱，作用于尿道外括约肌的N型胆碱能受体，引起该肌收缩，阻止尿液排出。

乙酰胆碱作为神经递质，作用于靶受体发挥作用。胆碱乙酰基转移酶是胆碱能神经元的标志酶，是乙酰胆碱的合成酶，分布在胆碱能神经元和纤维内；肾上腺素能神经释放单胺类递质，故可以用显示单胺类递质的方法来研究肾上腺素能神经纤维的分布，神经肽Y(NPY)是肾上腺素能神经的标志性神经肽。应用免疫组化染色来研究两种神经递质含量的多少，可说明神经的兴奋性高低，能充分反映神经的功能， 是了解胆碱能、肾上腺素能神经及其所支配器官的重要方法。

本实验研究对尿道肌肉组织进行组织学和免疫组织化学分析显示，在女性胎儿尿道的膀胱颈及近端三分之一，横纹肌纤维相对较少，这与Borirakchanyavat等[6]的观点相矛盾，他们发现胎儿的横纹肌纤维出现在尿道的近端及中间三分之一处，认为胎儿尿道的横纹括约肌向近端延伸，这些纤维在后侧表面是不完整的。

Stolzenburg等[7]认为女性膀胱逼尿肌止于尿道内口，与尿道无任何延续，尿道平滑肌的内纵肌在近端三分之一开始变薄，远端三分之二逐渐消失，外纵肌多数在尿道内口处消失，中间环形肌则在近端三分之一形成强大的环形平滑肌括约肌。本实验经过平滑肌标志性抗体(NPY)免疫组织化学染色证实，该括约肌向远端尿道逐渐减少，开始减少处恰好为横纹括约肌可检测的部位。在中间三分之一尿道平滑肌和横纹括约肌环绕整个尿道，平滑肌在尿道远端三分之一处消失。横纹括约肌开始于尿道近端三分之一的远端，位于平滑肌的外侧，向远端逐渐增厚。

本实验研究还从CHAT及 NPY免疫组化染色分析中发现女性胎儿尿道的中间1/3染色最强，在女性胎儿尿道的平滑肌与横纹括约肌之间并没有明显的界限，在尿道中三分之一处可清楚地看到平滑肌和横纹肌纤维互相交错分布，逐渐过渡，形成所谓的尿道括约肌复合体，是女性重要的控尿机制。Stein等[8]通过尿动力学检查发现，女性患者全膀胱切除术后施行原位尿流改道，其控尿功能完全依靠横纹括约肌，虽然尿道长度缩短了1.3cm，最大尿道压下降12cm H2O，却仍能有效地控制排尿。

Rother等[9]认为女性尿道的平滑肌具有括约肌作用，主要在持续控尿过程中发挥作用，能够控制尿道的关闭。横纹括约肌可以随意中断排尿、对抗压力性尿失禁，横纹括约肌在中间三分之一处最厚并且环绕尿道，并可见到平滑肌纤维与横纹肌纤维交错移行。

本实验应用免疫组化方法研究了12例21-40周胎龄的正常女性胎儿尿道，结果表明胆碱乙酰基转移酶及神经肽Y阳性区域主要位于尿道中三分之一，是胆碱能及肾上腺素能神经递质集中的部位，在女性尿道的控尿功能中发挥着极其重要的作用。这些知识有助于提高膀胱切除手术后保留尿道的控尿功能质量，也有助于理解控尿机制、对女性尿失禁进行更有效的管理。

【参考文献】

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篇9

【关键词】 乳腺肿瘤;外科学；放射性核素成像；前哨淋巴结;活组织检查

1 对象和方法

1.1 对象 200005/200705我院完成乳腺癌前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)活检150例（均为女性），年龄29～71（平均47）岁. 其中T1期：58例，T2期：92例；绝经前：90例，绝经后：60例；肿物位于内上象限28例，内下象限6例，外上象限104例，外下象限12例；病理检查证实：浸润性导管癌134例，导管内癌14例，髓样癌2例.

1.2 方法 术前2～4 h于肿瘤周围表面皮肤上均匀地选取4点，每点皮内注射99m锝标记的右旋糖酐（北京森科公司产品）0.25 mCi／0.25 mL，利用γ探测仪（美国泰科公司产品）测量注射点以外胸壁的放射性作为放射背景，而后进行乳腺癌改良根治术或保留乳房手术，当腋窝解剖到第一水平时，再用γ探测仪寻找放射性背景计数10倍以上的SLN，将SLN切除并单独送检. 对常规病理检查SLN(-)的59例， 在SLN原蜡块平面基础上于100 μm，200 μm和300 μm三个层面上各切2张切片，分别行HE染色和免疫组化染色，所用抗体为角蛋白mAb AE1／3（美国Zymed公司产品）.

2 结果

150例患者中成功进行SLN活检144例，每例检出SLN 1～4个不等，平均2.3个，成功率为96.0％，灵敏度为93.4％，假阴性率为6.6％，准确性为97.2％，阳性结果预测值为100.0％，阴性结果预测值为95.4％，尤登指数(正确指数)为0.934. 59例SLN(-)患者的切片同时在三个层面上行免疫组化染色结果发现了14例微小转移；在两个层面上发现11例微小转移；在一个层面上发现7例微小转移（图1），而与免疫组化染色对应的HE染色切片上均未发现微小转移.

3 讨论

SLN活检是一项预测腋窝淋巴结转移的新技术，严格掌握适应症是活检成功率的先决条件. 有文献报道SLN活检主要适用于T1-2N0M0患者［1］. 本组病例均为T1-2N0M0，这是本组成功率较高的基础. 其次，为了能够准确找到SLN，应严格掌握注射同位素示踪剂与手术的间隔时间，这与示踪剂颗粒大小和同位素的半衰期有关. 文献报道间隔时间为2～4 h［2］. 本研究使用的示踪剂是99m锝标记的右旋糖酐，半衰期为6 h左右，于手术前2 h注射则更加清晰（一般在注射后半小时左右SLN即可初步显示）. 本组中有2例患者由于间隔时间达5 h左右，因同位素衰变，探测SLN未获成功.

图1 乳腺癌前哨淋巴结免疫组化染色（AE1/3） ×400（略）

示踪剂的注射部位主要有肿瘤周围表面的皮内和皮下、肿瘤周围、肿瘤内、乳晕下等［1，3］，由于皮肤的浅表淋巴网密度较大，因此选择皮内或皮下注射似乎更容易发现SLN［4-5］. 从本组病例看，在研究初期我们比较了皮内、皮下和肿瘤内注射的效果，发现皮内注射时，示踪剂进入淋巴流很快，SLN较易发现，而在皮下和肿瘤内注射时，情况不够理想. 因此我们认为皮内注射优于皮下和肿瘤内注射，在后续的研究中一直采用皮内注射法.

要实现SLN预测腋窝淋巴结转移的最终目标，还要对SLN进行详细的病理学检查以发现更小的转移灶，避免漏诊. Fortunato等［6］报道对于确诊SLN(+)的病例，其中一半是通过连续切片和免疫组化方法发现的. 本研究也证实通过免疫组化染色可以提高转移灶的检出率，我们应用免疫组化染色发现59例SLN(-)患者中的14例存在微小转移，这些微小转移在HE染色切片中未被发现.

综上所述，我们的研究证实了SLN的确可以准确反映腋窝淋巴结的转移状况，为了成功进行SLN活检，需要严格掌握适应症、注射时间、剂量以及部位等，并对SLN进行详细的病理学检查，才可使SLN活检的成功率和假阴性率达到较为理想的水平.

【参考文献】

［1］ 张保宁，白月奎，陈国际，等. 乳腺癌前哨淋巴结活检的临床意义（附30例报告）［J］. 中华肿瘤杂志，2000，22（5）：395-397.

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篇10

Application of ex vivo sentinel lymph node biopsy in the staging of colorectal cancer

【Abstract】 AIM: To explore whether ex vivo sentinel lymph node (SLN) biopsy can be easily applied in improving the accuracy of pathologic staging for colorectal cancer （CRC）. METHODS: The specimens from 26 patients (14 males， 12 females) with CRC were freshly (within 5 min) delivered to pathological examination and underwent ex vivo SLN biopsy. SLNs were identified as the 1st to 4th blue stained nodes after ex vivo submucosal peritumoral injection of 10 g/L isosulfan blue (IB) dye. The SLNs were sectioned and examined histologically by HE staining. Additional immunohistochemical staining for cytokeratins was performed when bluestained lymph nodes were negative by HE staining. RESULTS: Of the 26 specimens， SLNs were identified by ex vivo SLN biopsy in 23 (88.5%). In the 11 cases where the SLNs were negative in HE staining for micrometastases and in immunohistochemical staining for cytokeratins， all other nonSLNs in the specimens were also negative (0% false negative rate). The SLN was positive for micrometastases by HE staining in only 8 (30.7%) cases; the other 4 (15.3%) cases with negative nodes by HE staining were demonstrated positive for micrometastases through immunohistochemical staining for cytokeratins. CONCLUSION: Ex vivo SLN biopsy mapping is a feasible technique for the staging of CRC， especially in combination with immunohistochemical staining for cytokeratins， which offers reference for the assisted chemotherapy of CRC patients.

【Keywords】 colorectal neoplasms; in vivo; lymph node; micrometastases; immunohistochemistry

【摘要】 目的：探讨体外法结直肠癌前哨淋巴结(SLN)定位活检的可行性及其对肿瘤分期的影响. 方法：结直肠癌患者26 (男14，女12)例，年龄37～83岁，应用10 g/L异硫蓝(IB)染料于肿瘤离体5 min内用体外定位的方法对其SLN进行定位，蓝染的第1~4个淋巴结为SLN. 常规HE染色蓝染的SLN行组织病理学检查;对常规检查为阴性的SLN进行抗细胞角蛋白免疫组织化学染色，检测阳性染色的淋巴结. 结果：体外SLN定位法共检测出SLN者23例(88.5%， 23/26); 其中11例患者SLN微转移灶常规HE染色及抗细胞角蛋白免疫组织化学染色检测均为阴性，其根治性切除的标本中非SLN的区域淋巴结亦均为阴性(假阴性率为0)；常规HE染色在8例患者SLN中检测出微转移灶(30.7%)，另4例患者为HE染色阴性而抗细胞角蛋白免疫组化染色证实存在微转移灶(15.3%). 结论：体外结直肠癌SLN定位活检术准确性高，同时联合应用抗细胞角蛋白免疫组化染色可以提高肿瘤分期，为应用辅助化疗改善患者预后提供依据.

【关键词】 结直肠癌；体外研究；淋巴结；免疫组化

0　引言

结直肠癌(colorectal cancer， CRC)隐匿性微转移灶(micrometastasis， MM)的漏诊而未行化疗是影响结直肠癌患者预后的因素［1-5］. 前哨淋巴结(sentinel lymph node， SLN)定位活检技术可明显提高淋巴结检出数量［6-8］及MM的诊断率［4-8］. 我们探讨体外SLN定位活检技术的可行性及其临床意义，特别是对于肿瘤分期的影响，为辅助化疗，改善患者预后提供理论依据.

1　对象和方法

1.1对象

200406/200603，经西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科确诊的CRC，有手术根治可能且无手术禁忌证患者26（男14，女12）例，年龄37～83平均（60. 2，中位60）岁. 其中结肠癌17例，直肠癌9例. 所有患者术前皆经内镜检查活检确诊.

1.2方法

所有患者行标准的根治术，联合区域淋巴结清扫术，标本移出5 min内，沿肠管长轴于对系膜缘切开，于肿瘤周围分4点黏膜下或浆膜下注射10 g/L异硫蓝染料共2 mL，轻柔按摩注射点约2～5 min，以促进淋巴回流［7-9］. 追踪辨认蓝染的第1~4个淋巴结为SLN （图1），标本用100 g/L甲醛固定. 首先常规HE染色检查上述甲醛固定的各淋巴结及SLN，确定SLN与区域淋巴结的转移情况. 对常规病理学检查为阴性的SLN进行免疫组化法染色：链霉亲和素生物素免疫过氧化物酶方法（SP法）. MM按国际抗癌联盟的推荐定义为单个转移肿瘤细胞或细胞团φ≤2 mm.

2　结果

在26例患者中，右半结肠癌9 例，左半结肠癌7例，横结肠癌1例，直肠癌9例. 17例结肠癌中，均成功定位活检到SLN，成功率100%; 9例直肠癌中， 6例获得成功，成功率66.7%; 3例不成功者为低位直肠癌，行腹会阴联合切除术. 根据美国癌症联合委员会（AJCC） TNM进行分期. 0期2例，I期6例，II期8例，III期8例，IV期2例. 体外SLN定位法共成功检测出SLN者23例（88.5%，23/26); 其中11例SLN常规HE染色及抗细胞角蛋白免疫组化染色检测均阴性患者，其根治性切除的标本中非SLN的区域淋巴结亦均为阴性 (0%假阴性率)；常规HE染色在8例患者SLN中检测出微转移灶(30.7%)，另4例患者为HE染色阴性而抗细胞角蛋白免疫组化染色证实存在微转移灶(15.3%，图2).

3　讨论

淋巴结转移是CRC最重要的独立预后因素，与分期密切相关. 为准确分期，常规检查标本内所有的淋巴结是不切实际的. SLN示踪技术则有望通过病理学家集中对有限的几枚(1~4)淋巴结进行详细检查、分析，准确评估区域SLN状态而明确分期. 大约有30%经常规病理学诊断为I，II期的CRC患者最后可能出现全身性转移. 这些患者的淋巴结内存在微转移，常规病理学检查由于未能检查这一淋巴结或是切片数量不够等原因而未能发现［2-6］. 有淋巴结转移的结肠癌患者其SLN 的检出阳性率为83%［3］，根据SLN对区域淋巴结状况预测的敏感性为88%～100%［3-7］， 因此，对SLN进行定位检测可以更准确地反映区域淋巴结状况，从而使CRC的术后病理分期更准确，有利于评估预后，制订合理的治疗方案，提高治愈率.

既往关于CRC患者SLN的检测，大多数学者多采用手术中异硫蓝于肿瘤周围浆膜下注射，曾被认为是CRC的金标准［10］. 但新近的研究发现，手术中检测SLN的方法可能延长手术时间，增加转移几率，有些患者会对染料出现过敏反应等一系列副作用［11］. 因此该方法客观有效及安全性也被提出了质疑. 为了克服手术中检测SLN的弊端，Wood等［4］提出了体外法SLN定位活检. 术后30 min内或5～10 min内，切开肠管于肿瘤周围分4点黏膜下注射异硫蓝共2 mL或肿瘤周围浆膜下注射1～2 mL，轻柔按摩注射点约2～5 min，以促进淋巴流动［7-9］. Smith等［9］认为体外法假阴性较高，与区域淋巴结的一致性较低，我们的研究结果显示，在结肠癌中，SLN定位活检成功率和预测区域转移的准确性很高，敏感性100%，假阴性率为0; 而直肠癌中，成功率和准确性则较低，假阴性率高达33.3%. 提示，SLN定位活检在直肠癌中并未显示出很好的应用价值; 这表明SLN定位活检在直肠癌中存在一定的困难和复杂性. Saha等［2］报道失败的1例也是直肠癌. 这可能与直肠癌的特殊解剖部位和较为复杂的淋巴引流有关. 体外SLN定位活检技术临床意义主要体现在，发现那些隐蔽的MM，改善分期. 体外法可在不增加手术时间、不增加转移风险、无副作用的前提下提高病理检出率.

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