免疫组化技术范文
时间：2023-03-22 20:13:37
导语：如何才能写好一篇免疫组化技术，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
【中图分类号】R392.33【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-034-1
医学研究和科研领域经常会应用动物模型来进行研究,以此来探索人类疾病的模拟反应。在过去一个世纪的研究中,小鼠已经成为建立人类疾病的动物模型的最佳实验材料。当科研人员应用小鼠做为研究对象时,往往采用免疫组织化学的方法对小鼠组织进行鉴定和分析。但是由于免疫组化操作的影响因素诸多,免疫组化效果不稳定等因素常常困扰着免疫组化操作者。本文就以上相关问题进行了简单的总结和分析。
1小鼠组织的应用
小鼠经常被用作动物模型进行科学研究,因为现在小鼠的基因改造技术越来越成熟,并且它的生理生化及发育过程类似于人类,基因组也和人类有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真实模拟人类的功能活动和反应;小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成[1]。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。
2免疫组化的原理及优点
免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术,能将形态、代谢和功能密切结合起来。简单地说,用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体,其结合后经一系列方法的处理,出现呈色反应,这样在光镜下就可以确定组织的来源属性和部位。免疫组化技术还有着以下的优点。(1)特异性强,抗原抗体的结合具有高度特异性;(2)敏感性高。由于ABC发或SP法的出现时抗原抗体的结合更敏感;(3)定位准确,免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位。
3实验中存在的问题及注意事项
3.1组织的预处理
因为小鼠模型都十分珍贵,所以我们在试验中应尽量减少失败的几率。首先,小鼠组织的剥离要迅速,固定要及时,否则很多组织比如脑组织很容易被破坏。其次,固定时间要适当。固定时间以常温下6-12小时为宜。过度固定可能导致组织抗原的损失,影响实验效果[2,3]。最后,组织的脱水时间要适当。拿裸鼠为例,因为其组织比较柔嫩,所以脱水时应该从低浓度乙醇开始,比如50%乙醇梯度开始,并且适当缩短脱水,透明的时间,防止小鼠组织变形,变脆变硬,影响后面的切片和形态观察。
3.2免疫组化实验步骤
免疫组织化学技术是多步骤、多因素决定的实验方法,任何一个环节稍有不慎,都直接影响免疫组化的结果。下面从以下几个方面进行阐述:(1)抗原修复。由于小鼠组织在福尔马林或其他固定液中会引起蛋白内或蛋白间亚甲基桥的桥连,导致许多抗原簇被封闭。所以,需要先进行抗原修复或暴露。试验中应该根据具体组织和抗体选择最佳的修复方法。(2)减少或消除非特异染色。一般小鼠组织中免疫组化的非特异染色较深,常常干扰实验结果的观察。我们应该从以下方面尽量避免:①抗体浓度要适合。试验中通过设计梯度稀释抗体来确定最佳抗体稀释浓度。抗体浓度过高也会产生非特异染色。②PBS洗涤要充分。试验中尽量使用新鲜的PBS,每次的洗涤时间也要严格按照说明书进行。③实验用的封阻血清要确保与一抗同源,封阻时间也要足够。④实验的整个过程中都要确保组织不能干掉。(3)DAB显色:对二甲胺基偶氮苯(DAB)显色的时间也不同程度影响免疫组化的最终效果。最好显微镜下控制显色,所以操作者应具备一定的常用抗体定位的知识,不要显色时间太长,如果无阳性物质,显色时间过长无益,只能使假阳性的机率倍增。
3.3结果的判断和分析
免疫组化染色结果的判断应该是阳性染色强而非特异染色很淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性标记物的位置准确(核、质、膜、血管壁或间质等),细胞边界清楚。判断根据:根据阳性细胞的染色强度:(无着色细胞)(一),(+),(+ +),(卅)。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。另外实验的进行还必须设有对照,比如阳性对照,阴性对照,自身对照等,这对结果的分析很重要。
4总结
总之免疫组化是一项很精确的实验技术。它在小鼠组织研究上的应用有着很重要的科研价值和潜力。近年来,由于检测技术敏感性的不断增强;单克隆抗体的制备;基因库的建立;以及修复抗原性的各种措施、特别是热预处理法的出现与发展,使得免疫组化技术的使用迈出了崭新的一步。虽然该技术也同时存在很多困难,但是只要我们认真操作每一个步骤,一定能做出高质量的小鼠的免疫组化切片并且得到有用的实验结果。
参考文献
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篇2
【摘要】 目的 通过观察左归丸与右归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型大鼠脑、脊髓组织淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响，探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗EAE作用机制。方法 应用髓鞘碱性蛋白与完全福氏佐剂，按体积比1∶1制成抗原并于Lewis大鼠双后足垫下注射，建立EAE模型。120只Lewis大鼠随机分为正常组、模型组、激素组、左归丸组及右归丸组，每组24只，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，3 mL/(只·d);激素组免疫后给予生理盐水灌胃，3 mL/(只·d)，发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃，5 mg/(kg·d);左归丸组免疫后给予左归丸混悬液，2 g/(kg·d);右归丸组免疫后给予右归丸混悬液，3 g/(kg·d)。直至处死。分别于急性期(免疫后15 d)和缓解期(免疫后27 d)随机选取各组大鼠，取脑和脊髓组织切片进行CD4+、CD8+、CD3+、CD19+免疫组化染色。结果 造模后第15日及第27日，模型组脑和脊髓组织中CD4+免疫组化表达均较正常组升高(P
【关键词】 实验性自身免疫性脑脊髓炎;左归丸;右归丸;多发性硬化
Abstract：Objective To observe the immunohistochemical expression of lymphocyte subpopulationin in brain and spinal cord tissue， and explore the mechanism of Zuogui wan and Yougui wan on rats with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods Lewis rats were immunized with the myelin basic protein (MBP). 120 rats were grouping randomly into normal group， EAE group， prednisone group， Zuoguiwan group and Youguiwan group after post immunization (PI). Rats in normal group and EAE group were administered normal soline， each 3 mL/d. Rats in prednisone group were administered suspension of prednisone after developed clinical signs， each 5 mg/kg. Rats in Zuoguiwan group were administered suspension of Zuoguiwan， each 2 g/kg， and rats in Youguiwan group were administered suspension of Youguiwan， each 3 g/kg. On 15th and 27th day after PI， rats were killed and the immunohistochemical staining was performed on the sections of brain and spinal cord. Results On 15th and 27th day after PI， the expression of CD4+ in brain and spinal cord tissue of EAE group were significantly higher than that in normal group (P
Key words：experimental autoimmune encephalomyelitis;Zuoguiwan;Youguiwan;multiple sclerosis
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种慢性自身免疫性中枢神经系统疾病，病理特点为病灶区域的血脑屏障(blood brain barrier，BBB)损害、炎症和髓鞘脱失。细胞免疫调节异常在其发生和发展中起重要作用[1-2]。虽然实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis， EAE)动物模型在临床和病理方面上与MS有许多相似之处，但是EAE由髓鞘碱性蛋白(MBP)致敏产生，故抗原是已知的，但MS的致敏抗原仍不明确，发病机制与EAE还不完全一样。典型的MS早期病变，淋巴细胞包括浆细胞未出现在血管周围腔，故可肯定淋巴细胞未直接参与脱髓鞘过程。尽管EAE不能完全代替MS，但对于研究MS病理形成过程、发病机制及观察各种治疗效果仍是有价值的[3]。在前期研究中药二黄方(胶囊)、左归丸、右归丸对EAE大鼠外周血T淋巴细胞影响的基础上[4]，本实验研究左归丸与右归丸对EAE大鼠模型中枢神经系统中淋巴细胞亚群免疫组化表达的影响，探讨滋阴补肾法与温阳补肾法治疗MS的作用机制。
1 材料与方法
1.1 动物
SPF级Lewis大鼠，雄性，体重200～250 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2007-0001]，饲养于首都医科大学实验动物中心国家标准实验室[许可证号：SYXK(京)2005-0022]。
1.2 抗原、药物及试剂
左归丸由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、川牛膝和龟胶组成，右归丸由熟地黄、山药、山茱萸、枸杞子、鹿角胶、菟丝子、杜仲、当归、肉桂和附子组成，北京同仁堂制药厂提供;醋酸泼尼松，5 mg/片，批号060802，天津力生制药厂提供;完全福氏佐剂(complete Freund’s adjuvant， CFA)，批号F7881，美国Sigma公司提供;髓鞘碱性蛋白(MBP87-99，human，bovine，rat)由美国ALEXIS生物化学公司提供，批号16752/a;RAT CD4-PE抗体(MR5104)、RAT CD8-TC抗体(MR5206)、RAT NKTR-PE抗体(MR6804)，由美国Caltag公司提供。CD3(批号bs-0550R)、CD4(批号bs-0647R)、CD8(批号bs-0648R)、CD19(批号bs-0079R)免疫组化试剂盒，购于北京博奥森生物技术有限公司。
1.3 造模
将125 ?L MBP87-99水溶液(含MBP87-99150 ?g)与125 ?L CFA混合，充分乳化制成抗原配剂。当天给予Lewis大鼠双后足垫皮下多点注射250 ?L抗原配剂，诱导EAE。对照组则予足垫皮下注射CFA与生理盐水的混合液。
1.4 分组及药物干预
120只Lewis大鼠随即分为5组，每组24只。按组别分别作以下处理：①正常组每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只);②模型组免疫后每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只);③激素组免疫后每日给予生理盐水灌胃(3 mL/只)，发病后改为醋酸泼尼松混悬液灌胃(5 mg/kg);④左归丸组免疫后每日给予左归丸混悬液灌胃(2 g/kg);⑤右归丸组免疫后每日给予右归丸混悬液灌胃(3 g/kg)。
1.5 取材
分别于造模后第15日(急性期)和第27日(缓解期)处死大鼠取材。用10%的水合氯醛以4 mL/kg的剂量腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后，将大鼠仰卧位置于托盘内，打开腹腔，从大鼠肋骨两侧剪断肋骨，打开胸腔，暴露心脏，用钝针经心尖部略左(左心室)进针，插入至主动脉，用止血钳将针头固定好，剪开右心耳，立即用生理盐水冲洗，直至右心耳流出液体清亮，约200～300 mL;关闭灌注泵开关，换为4%多聚甲醛灌注固定，先快后慢，直至大鼠变硬，每只约用多聚甲醛200～300 mL，剥离脑和脊髓，放入4%多聚甲醛液中固定。
1.6 免疫组化染色
按照试剂盒说明书操作。将组织冲洗干净，梯度酒精脱水，二甲苯透明，再以纯净石蜡将脑组织包埋，石蜡切片机做连续切片，片厚5 ?m。石蜡切片脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10 min， PBS冲洗5 min，共3次。滴加适当比例稀释的CD4+、CD8+、CD3+、CD19抗体，37 ℃孵育2 h，PBS冲洗5 min，共3次。25 ℃孵育2 h，4 ℃过夜，PBS洗2 min，共3次。滴加生物素标记羊抗兔IgG，室温下20 min，PBS洗2 min，共3次;滴加SABC复合物，室温20 min，PBS洗5 min，共4次。DAB显色10 min左右，蒸馏水多次洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，中性树胶封片，显微镜下观察。阴性对照不加一抗，以正常山羊血清和PBS代替CD4+、CD8+、CD3+、CD19+抗体作孵育。
1.7 病理图像分析
采用MIAS医学图像分析管理系统对免疫组化染色结果进行定量分析，每组选取3张切片，每张切片在大脑及脊髓白质区域随机选取6个高倍视野(×400)，阳性结果用积分光密度(Integral Optical Density，IOD)表示。
1.8 统计学方法
所有数据均以—(—数)±s表示，采用SPSS11.5软件进行方差分析。
2 结果
(见表1、表2)表1 各组大鼠不同时点脑组织淋巴细胞亚群免疫组化IOD值变化(—(—化)±s，%)注：与正常组比较，*P
3 讨论
MS发病机制尚不完全清楚，目前认为是由于机体免疫调节功能紊乱，造成Ts细胞及NK细胞数量减少和功能缺陷，Th细胞功能相对亢进，最终致B细胞过度活化而产生以抗髓鞘碱性蛋白为主的自身抗体所致[5]。细胞免疫在MS的发病机制中起重要作用，CD4+、CD8+被抗原刺激活化后，可随机进入中枢神经系统形成获得性免疫监视功能[6]。有报道，急性发作期CD8+T细胞和对照组相比下降，这提示MS发作期CD4+/CD8+比值可能升高[7]。Ionen等[8]对25名确诊MS患者的研究表明，MS发作期患者CD8+细胞比例显著下降，CD4+T细胞比例无明显下降，CD4+/CD8+T细胞比例显著增加，均提示在MS发作期可能存在CD4+/CD8+T细胞比例增高[9]。我国学者的研究表明，MS患者外周血中CD8+细胞显著降低，CD4+/CD8+比值明显升高;脑脊液中CD3+、CD4+细胞明显升高，CD8+细胞显著低于对照组及外周血，而CD4+/CD8+比值明显高于对照组及外周血[10]。MS患者脑脊液中CD4+/CD8+高比率，在其经受大剂量甲基强的松龙治疗后，病情趋于缓解，EDSS评分下降后也逐步降低，说明CD4+/CD8+比率是一个较为敏感的指标，可用于MS辅助诊断、病情的动态观察及药物疗效判断等[11]。
左归丸、右归丸是滋补肾阴和温补肾阳法治疗MS的重要代表方剂，我们使用流式细胞仪技术观察左归丸和右归丸对EAE大鼠外周血淋巴细胞亚群水平的影响。结果造模后第15日，左归丸组CD4+细胞显著升高(P
本实验中，无论是急性期还是缓解期，模型组脑和脊髓组织中CD4+免疫组化表达均较正常组升高(P
参考文献
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篇3
【摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。
【关键词】组织病理学；技术；运动人体科学
【中图分类号】 R818.02【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0045-01
1免疫组织化学实验技术
随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心――抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。
1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCA）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素―生物素（ABC）法和链酶素―过氧化物酶连接（SP）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。
2原位杂交实验技术
原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的DNA或RNA，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等。
2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRNA转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒DNA/RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。
2.2原位杂交技术与免疫组化的比较
2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。
2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测DNA或RNA的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DEPC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。
参考文献
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篇4
【关键词】 肿瘤；免疫组化法；活检穿刺法；病理诊断
DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.11.017
肿瘤是临床常见疾病， 近年来的发病率逐渐增高。无论是良性肿瘤还是恶性肿瘤， 早期临床症状均不典型， 尤其是恶性肿瘤患者往往在中晚期才能确诊， 此时已经错过了最佳治疗时机， 影响了患者的预后[1]。因此， 对于早期肿瘤的诊断是目前临床所关注的一大重点。目前早期肿瘤尚缺乏理想的诊断方案， 常规方案包括CT、超声弹性成像、MRI等影像学检查， 但此类方案的漏诊、误诊率较高[2]。病理诊断作为肿瘤诊断的重要检测标准， 虽然具有准确度高的特点， 但具有一定损伤性， 患者体验较差， 此外， 对于病理诊断中的不同技术应用价值尚存在争议。一般的病理检验多以活检穿刺诊断为主， 该方案虽然能够确定疾病类型及分期， 但患者体验较差[3]。随着医疗技术的进步， 免疫组化技术融入了抗原修复、敏感检测及自动免疫染色系统， 不但提高了诊断准确率， 更改善了检查体验。本文就免疫组化法用于肿瘤患者病理诊断的临床效果进行了研究分析， 现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 研究对象选取2014年1月～2015年4月本院收治的112例肿瘤患者， 男61例， 女51例， 年龄25～70岁， 平均年龄（43.9±11.4）岁；肺癌22例， 肝癌37例， 转移性肿瘤51例， 血管瘤2例。根据病理诊断方案不同将患者分为观察组和对照组， 各56例。
1. 2 方法
1. 2. 1 对照组采用穿刺活检法进行诊断， 根据影像学显示的病灶部位进行穿刺， 超声下取出组织进行活检， 与标准组织进行对比。
1. 2. 2 观察组采用免疫组化法进行诊断， 主要试剂包括脱水剂、固定剂、蒸馏水、透明液、浸蜡液、树胶等。取患者0.2 cm×1.0 cm×2.0 cm的1块组织置于甲醛溶液中充分浸泡2 h， 置于透明液1 h， 之后用脱水剂脱水1 h， 置于浸蜡液1 h， 埋于石蜡中常规切片， 层厚2 μm， 将组织切片进行免疫组化染色， 在37℃下置于3%过氧化氢溶液中孵育10 min， 蒸馏水冲洗3 min， 高压修复2 min， PBS洗涤5 min， 常温孵育2 h， PBS洗涤5 min， 加入UltrasenSitive SP试剂， 孵育后DBA显色， 树胶封固。
1. 3 观察指标及评定标准 对比两组检测结果， 包括甲胎蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3等， 染色呈棕黄色为阳性， 否则为阴性。采用问卷调查形式了解患者的诊断体验， 主要包括心理顾虑、生理问题、信任感3个维度， 每个维度10个条目， 每个条目根据患者回答情况赋分0～10分， 分值越高这说明患者对该检验方案的体验度越好， 总分≥200分为满意。
1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P
2 结果
2. 1 阳性率对比 观察组染色后细胞结构为变异型， 甲胎蛋白及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3异常表达48例， 阳性率85.7%、满意度82.1%， 对照组的阳性率50.0%、满意度57.1%， 两组对比差异具有统计学意义 （P
2. 2 患者体验对比 诊断体验调查结果显示， 观察组患者的心理顾虑、生理问题、信任感评分均显著高于对照组， 差异具有统计学意义（P
3 讨论
随着医疗技术的进步， 免疫组化技术被越来越广泛的应用于肿瘤患者的诊断， 并取得了理想的效果。免疫组化技术诊断的准确率必须以可靠的免疫组化切片为基础， 因此在诊断中要加强医生和技术人员之间的协调性， 确保免疫组化切片顺利完成， 但由于技术仍不够成熟， 目前免疫组化技术也不能排除假阳性和假阴性的几率[4]。
为了提高诊断准确率， 免疫组化法的使用过程中要遵循以下几点：①固定， 在对组织进行固定时要采用10%的甲醛固定液， 能够更好、更长时间的固定组织， 能够确保目标组织3个月内具有稳定的阳性率[5]；②烤片， 在烤片过程中要注意温度的把握， 通常在65℃左右的恒温箱中进行加热烤片， 但要避免温度过高；③修复， 对目标组织进行抗原修复的时间应该控制在8 min， 然后让切片自然冷却并染色；④染色， 既要对组织进行反复染色， 又要避免染色过深影响观察。而免疫组化法的基本机制依赖于酶促反应， 主要是通过酶联反应来使过氧化物酶形成有颜色的复合物， 但是由于肿瘤类型较多， 不同组织标本也存在抗原含量的差异， 因此显色时间不同[6]， 要充分显色才能便于准确观察。
本次研究结果显示， 观察组染色后细胞结构为变异型， 甲胎蛋白及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3异常表达48例， 阳性率85.7%、满意度82.1%， 显著优于对照组的阳性率50.0%、满意度57.1%（P
综上所述， 免疫组化法应用于肿瘤患者的病理诊断临床应用价值更高， 患者体验度更好， 值得在临床上推广和应用。
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篇5
【关键词】病理技术；无醛固定液；甲醛固定液
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.060文章编号：1004-7484（2014）-05-2453-02在病理诊断中传统应用较多的是甲醛固定液，但是甲醛固定液的毒性较大，对人体危害严重。无醛固定液是近年来病理诊断中逐渐应用的新型固定液，其免疫组化染色效果较好，且能保证组织细胞的完整性，是病理诊断中较为理想的固定液。为了探讨无醛固定液在病理技术中的应用价值，本文选择我院临床送检的61例组织标本，分别用甲醛固定液和无醛固定液固定后，对免疫组化染色效果进行对比，报告如下：
1资料和方法
1.1一般资料选择我院2009年――2012年临床送检的组织活体标本61例进行研究，其中11例结肠癌组织，9肺癌组织，13例乳腺癌组织，12例淋巴癌组织，10例卵巢癌组织，6例前列腺癌组织。
1.2方法
1.2.1试剂每种组织分别取2块，组织大小为2×1×0.2cm，将每种组织分别纳入两组中，采用甲醛固定液和GS无醛固定液固定组织。试剂：GS无醛固定液、脱水液、浸蜡液、无苯透明液全部由（哈尔滨格林标本技术开发有效公司）提供。甲醛、二甲苯试剂则由（北京益利精细化学品有限公司）提供。另外，在试验中所需的RPR、HER-2、CAl99、LCA、CD20、CD45RO、EGFR、CK、p53、CAl25等即用型单克隆抗体由（福州迈新生物技术开发有限公司）提供。
1.2.2固定方法①GS无醛固定液固定方法：无醛固定液Ⅰ和无醛固定液Ⅱ分别固定1h和3h，之后用脱水液脱水1h，无苯透明液透明1.5h，浸蜡液1.5h，石蜡包埋，常规切片，切片厚度为5μm。②甲醛固定：采用4%的甲醛液将组织分别固定2h，之后用80%的乙醇脱水1h，无水乙醇脱水1h，二甲苯透明1.5h，浸蜡液1h，石蜡包埋后常规切片，厚度为5μm。
1.2.3免疫组化染色将两种固定液固定的切片各取一张，切片先进行脱蜡，然后用3%的H2O2室温孵育10min，用蒸馏水洗3次，每次3min，用高压锅修复，温度为140℃，时间为2.5min，之后PBS洗3次，每次5min，加抗工作液1滴，在37℃下孵育2h，再次PBS洗3次，每次5min，加入Max VisionTM试剂，37℃下孵育30min，再次PBS洗3次，DAB显色，用蒸馏水冲洗，苏木精复染核1min后，分化返蓝，乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封固。根据组织标本进行免疫组化染色。对同一种组织采用不同固定液固定方法得到切片的免疫组化染色效果进行对比。
2结果
经对比，采用传统甲醛固定液固定的一组，液面较浑浊，且组织上浮，而采用GS无醛固定液固定的一组，液面清亮，组织沉底，且变硬、变白，具有较好的连续性；免疫组化染色效果显示，无醛固定液的标本组织细胞抗原性保存较好，背景清晰，且阳性结果定位较准确。
3讨论
在病理诊断中免疫组化染色是非常重要的工具，当前大部分的病理诊断均需要通过免疫组化染色。在以往免疫组化染色过程中，结果不稳定情况经常出现，近年来随着免疫试剂质量的提高和免疫组化染色操作自动化的发展，该状况有了一定改善，但是结果不稳定情况依然存在。对免疫组化染色结果稳定性产生影响的重要方面就是组织的固定质量，该步骤是实验室检测中的最初的一步，也是最关键的一步，通过对病理切片制作质量的影响来影响免疫组化的结果，固定液是该操作中必不可少的，而固定液的质量和性质对切片质量产生影响[1]。
在以往病理组织切片制作过程中应用较多的是甲醛固定液，除了具有较高的毒性之外，它具有较强的渗透性，组织收缩小，固定均匀，廉价以及保存组织结构好的优点，因此在病理诊断中应用较多，但是甲醛固定液也存在较大的缺点：首先其挥发性较强，保存要求高，具有强烈的腐蚀性和刺激性，释放到空气中对环境的污染严重，根据相关的医学研究，人体直接接触甲醛可能会引发湿疹、过敏和皮炎，另外众所周知，甲醛具有致癌性，人长期生活在甲醛环境中，则罹患各种癌症和呼吸道疾病的可能性增高；甲醛的存放要求高，当存放时间够长，则会产生白色沉淀，在标本制作中应用会影响固定效果；甲醛氧化活性较高，容易氧化为甲酸，导致整个溶液呈酸性，固定后标本也变为酸性，在细胞核染色时，对其效果产生影响，同时在固定肝、脾等的陈旧组织时，甲醛容易形成甲醛色素，与含铁血黄色混合，直接影响到病理诊断效果；甲醛固定液用完之后的处理难度较大，需要特殊处理，废液不能直接从下水管道排出，处理成本较高[2]。
鉴于甲醛固定液存在的缺陷，在医学研究中，研究人员在不断寻找甲醛固定液的替代品，我国研究人员经过长期的研究，研制出了GS无醛固定液，该固定液最明显的特点就是环保，除了无色、无刺激性、低挥发性、对环境危害较小之外，还具有如下优点：具有较强的渗透性，有效缩短了切片制作中脱水时间；具有较好的固定、脱水、脱脂、硬化等作用，减少了组织在制作中出现收缩、空泡、核固缩等；除了能保护组织形态学结构之外，还能保证细胞膜的完整性；用无醛固定液制作的标本易于分离，能有效清除脂肪组织，无需过多的清洁；减少了组织中抗原和核酸被破坏；能较为完整的保存RNA和DNA，可清除显示细胞的内部结构，便于进行标本精细化研究；无醛固定液的处理较为简单，以乙醇废液处理方法相似[3]。
在本组研究中，同一标本采用无醛固定液和甲醛固定液，在相同的免疫组化条件下，在免疫组化染色效果中两者基本一致，在部分切片中，无醛固定液组的免疫组化染色效果要优于甲醛固定液组。另外在部分研究中对甲醛固定液和无醛固定液的固定时间进行了研究，当固定时间在30d以内，甲醛固定液与无醛固定液的免疫组化染色效果无差异（p>0.05），但是当固定时间超过60d后，相比于甲醛固定液组，无醛固定液组的免疫组化阳性结果呈现较大的优势（p0.05），说明了无醛固定液固定时间在120d内不会对免疫组化染色效果产生影响，而甲醛固定液则只在60d内不会对免疫组化染色效果产生影响。
综上所述，无醛固定液的免疫组化染色效果与甲醛固定液基本一致，在某些组织中还优于甲醛固定液，同时固定有效时间要长于甲醛固定液，因此在病理检查中可用无醛固定液代替甲醛固定液。
参考文献
[1]潘黎明.环保型无醛固定液与甲醛固定液对免疫组化染色的效果比较[J].现代实用医学，2013，25（5）：583.
篇6
【摘要】目的对皮肤交界痣的诊断进一步的探讨。方法用组织病理学及免疫组化，对比复发及无复发皮肤交界痣的区别，来明确皮肤交界痣的诊断。结果两者的组织病理学及免疫组化几乎无差别。结论诊断和治疗皮肤交界痣，不能单纯依靠组织病理学和免疫组化，还应当根据临床，并加强随访，观察复况，以便及时进行下一步治疗。
【关键词】交界痣；免疫组化；复发；随访
皮肤交界痣，是皮肤的一种瘤样病变，一般为良性经过。但近年来常有复发病例。对本院2000-2007年31例交界痣(其中4例有复发)进行研究和分析，并进行总结，现报告如下。
1资料和方法
1.1研究对象
1.1.1一般资料挑取本院2000-2007年病理诊断为“皮肤交界痣”的病例31例。临床检查为皮肤色素性肿物(部位各不相同)，稍突起于皮肤表面，不分病例表面长有毛发。临床局麻下行切除手术，将肿物标本送病理检查。
1.1.2检查方法标本经10%甲醛溶液固定，石蜡切片后，分别进行HE染色和免疫组化SP法染色，一抗CK,S-100,GFAP,HMB45,试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。
1.2病理检查与诊断
1.2.1组织学病理大体取材：大多数为球形肿物，直径0.8~1.2cm，表面覆以少量毛发或无毛发，肿物褐色或黑色，切面质韧。
镜下所见:表皮及其下延的上皮角的基底层细胞与真皮之间，被增生的痣细胞团所取代，并与表皮相连，形成所谓的“滴落现象”。痣细胞为梭形或立方状。部分细胞透明，胞浆含有色素。核圆形或椭圆，无异型性，核分裂少见，不见炎细胞浸润。痣细胞在表皮和真皮交界处，呈多个巢团状，边界清楚，分布距离均匀；每个巢内的上一半在表皮的底层内，下一半则在真皮浅层内。这些痣细胞为大痣细胞，色素较深。
1.2免疫组化瘤细胞显示S-100(+)HMB45(+-)GFAP(-)CK(-)。
1.3对比把4例复发的病例同其他27例组织病理及免疫组化进行对比，发现复发与不复发的病例，在组织病理学及免疫组化方面均无明显差异。
2结果
经过组织病理学及免疫组化分析，得出最后诊断为“皮肤交界痣”。大部分患者切除肿物后，均治愈。只少数病例(4例)于手术后3~5年内复发，占所有病例的12.9%。继续切除复发肿物，经过组织病理学及免疫组化检查，并进一步会诊，仍诊断为“皮肤交界痣”。
3讨论
交界痣(junctionalnevus)可发生于任何年龄。常见于皮肤表面，也可见于结合膜、外耳道、子宫颈等处。临床常表现为体积较小，孤立性半球形小结节，大多直径<1cm。一般呈单发，极少数为多发。表面较光滑，与皮肤纹理相似，质地韧，呈棕色或黑褐色，几乎是对称性的，界限清楚的病变,表面光滑、无毛，平坦或稍高于表皮。一般不出现自觉症状。突起于皮肤表面的交界痣容易受到洗脸、刮须、摩擦与损伤的此外，并由此可能发生恶性变症状：如局部轻微痒、灼热和疼痛；痣的体积迅速增大；色泽加深；表面出现感染、破溃、出血，或痣捉为皮肤出现卫星小点、放射黑线、黑色素环；以及痣所在部位的引流区淋巴结肿大等。恶性黑色素瘤多来自交界痣。痣细胞分布，由表皮到与表皮相连的真皮内。细胞呈梭形或立方状，部分细胞胞浆透明，偶见核分裂，罕见病理性核分裂。
皮肤交界痣一直被认为皮肤非肿瘤性病变，属良性范畴，切除后即可治愈，完全切除后不复发。但近些年来，对此病诊断标准似乎应该有所改变。因部分患者在肿物完全切除后，仍出现复发，这一点值得慎重。本文经过对31例病例对比分析，发现复发组织的瘤细胞并无明显的异型性，但这种生物学行为则属低度恶性经过。很多病理学家也因此提出：诊断皮肤交界痣，应主要注意痣细胞侵及表皮的程度，越接近皮肤的表面，越应该注意复发。因此，病理学上认为，对于皮肤交界痣的治疗，除了完全切除肿物外，临床上还应建立严格的随诊制度，以便观察是否复发和下一步治疗。
参考文献
［1］范郎绨.肿瘤诊断病理学.天津科学技术出版社.
篇7
[关键词] 胃肠间质瘤；免疫组化；c-kit；血小板源性生长受体α基因
[中图分类号] R735
[文献标识码] A
[文章编号] 1674-0742（2015）07（b）-0008-02
胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，CISTs）是消化道最常见的间叶源性肿瘤，组织学上由梭形细胞、上皮样细胞、偶或多形性细胞排列成束状或弥漫状，由突变的c-kit或PDGFRA基因驱动，可见于消化道的任何位置。过去，多数CISTs被诊断为平滑肌或神经源性肿瘤，1983年Mazur等首次提出CISTs的概念。目前，CISTs的诊断依赖于结合组织形态学、CD117和DOG1免疫组化检测以及c-kit和PDCFRA基因突变的检测。该研究回顾性分析2013年1月-2015年1月收集的南京中医药大学附属医院的110例CISTs的临床病理特点，并运用免疫组化方法检测Dog-l、CD117、CD34、SMA、Sl00的表达，其中8例包含c-kit、PDGFRA基因突变检测结果，探讨免疫组化结合基因检测对CISTs的诊疗价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集南京中医药大学附属医院白2013年1月-2015年1月经手术或内镜下切除的资料完整、诊断明确的原发性GISTs患者组织标本110例。
1.2 免疫组化检测
所有标本均经10%甲醉固定，常规石蜡包埋，切片。免疫组化采用sP两步法，试剂均购白福州迈新生物技术开发有限公司。参照产品说明书进行实验，常规设置阳性和阴性对照。结果判定：阳性表达部位定位准确，Dog-1、CD117、CD34阳性细胞数平均≥10%为阳性。
1.3 基因突变检测
按照试剂盒（OMEGA，USA）说明提取石蜡组织中的基因组DNA，运用合适的引物PCR（聚合酶链式反应）扩增c-kit基因外显子9、11、13、17和PDCFRA基因外显子12、18。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳确定后，用ABI 3500测序仪行序列分析。应用SeqScape v2.7软件判断基因突变情况。
2 结果
2.1 临床及病理特征
110例患者中，男56例，女54例。年龄22～89岁，中位年龄59岁。肿瘤发生部位：胃74例（67.3%），小肠2l例（19.1%），结直肠6例（5.5%），食管6例（5.5%），胃肠外（腹膜后、盆腔）3例（2.7%）。根据文献将肿瘤行危险度分级：极低组47例（42.7%），低组25例（22.7%），中等组10例（9.1%），高组28例（25.5%）。肿块最大直径范围0.3～20cm，平均直径4.6cm。110例患者中梭形细胞型92例（83.6%），上皮样型7例（6.4%），混合细胞型11例（10%）。
2.2 免疫组化结果
110例中CD117、Dog-l、CD34、SMA、Sl00的阳性例数分别为102（92.7%）、103（93.6%）、87（79.1%）、49（44.5%）、9（8.2%）（表1）。CD117、Dog-1、CD34大部分为弥漫性表达。8例CD117阴性病例中，7例Dog-l阳性。SMA、Sl00大部分为局部或局灶阳性。
2.3 基因检测结果
8例GIST（中等风险1例，高风险7例；胃4例，小肠3例，直肠1例）行c-kit、PDCFRA基因突变检测，总体突变率100%（8/8）。其中c-kit突变率75%，PDGFRA突变率100%（表2）。c-kit突变结果提示4例应用伊马替尼可能有积极疗效，2例可能产生耐药或敏感性降低，2例疗效不明确。PDGFRA检测结果对伊马替尼疗效预测尚需要进一步临床观察。8例GIST中，6例CD117阳性。其中一例CD117、Dog-l双阴性，c-kit第9外显子插入突变。3讨论
GISTs是消化道最常见的间叶源性肿瘤，在中国，估计年发病率约为10-20/100万，其中10%～30%为恶性。本研究中，中高等风险组占34.6%。CIST可发生于消化道任何部位，部分患者可发生于消化道外。该研究中，胃部发生率最高（67.3%），小肠其次（19.1%）。
GISTs具有非定向分化特征，因不同瘤体的组织分化程度存在差异，故其表现出的形态学以及组织学特征也不同。该研究中梭形细胞型占83.6%，上皮样型占6.4%，混合细胞型占10%。在组织学上，GISTs与其他间叶源性肿瘤相似，难以与平滑肌肿瘤、神经纤维瘤等鉴别。免疫组化诊断以往依赖CD117、CD34的表达。近年来，随着研究的进展，DOC1已成为GISTs诊断的重要分子标记物。在该研究的110个病例中，CD117、Dog-1、CD34的阳性率分别为92.7%、93.6%、79.1%，在8例CD117阴性的病例中，7例Dog-1阳性。CD117、Dog-l、CD34三者联合应用可区分出绝大部分的GISTs。
篇8
【关键词】胃癌;Plkl基因;表达
【中图分类号】R735.2【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0040-01
Relationship Between the expression of Plkl Gene and Pathobiological Behaviors of Gastric Carcinoma
ZOU Chonggao XIA Heshun
(1.Hospital of workers,HU bei,WU Han,430021;2.Cancer Hospital,HU bei,WU Han,430021）
【Abstract】 Objective :To detect the expression of Plkl gene in gastric carcinoma , and to investigate the significance of Plkl gene expression in progression of gastric carcinoma. Methods : The expressions of Plkl were evaluated by immunohistochemistry in 49 cases of gastric carcinoma and the adjacent normal mucosa. Results : The positive rates of Plkl gene expression were 0 and 83.67% in adjacent normal mucosa and gastric carcinoma , respectively. And significant difference in expression of Plkl was found between gastric carcinomas and the adjacent normal mucosa ( P
【Keywords】gastric carcinoma ;Plkl gene ; expression
胃癌为我国常见的恶性肿瘤，根治性手术后有5%的早期胃癌和50%的进展期胃癌患者在5年内死亡，死因多为原癌复发[1]。因此，早期发现肿瘤细胞播散，有效估计肿瘤的复发及预后，在胃癌的治疗上意义重大，我们应用免疫组化SP法检技术,探讨Plkl在胃癌组织中的表达特点及其与临床病理分期、组织学分型和淋巴结转移的关系。
1临床材料
1.1研究对象选取我院1993年1月至2005年1月胃癌术后或活检标本49例。入选条件为:第一次手术、术前未接受化疗和放疗及免疫治疗的胃癌患者;均具有完整的临床资料和病理资料。其中男性29例，女性20例:中位年龄63岁(26~84)岁; 组织学分期早期胃癌11 例,进展期胃癌38 例。另取15例同期正常胃组织标本作为对照组，取自胃癌切除标本的远端组织，距肿瘤边缘>5cm经病理检查确认为正常胃粘膜上皮为对照组。
1.2免疫组化SP法检第一抗体Plkl为鼠抗人单克隆抗体;购自美国SnataCurze生物技术公司，SP免疫组化超敏染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。采用免疫组化SP法检测胃癌及癌旁正常胃粘膜的Plkl的表达，免疫组化染色步骤按试剂盒说明书进行，用己知的Plkl阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。由两位资深病理科医生独立观察每张切片后一起做出判断。每张切片随机观察10个具有代表性的高倍视野，Plkl以在细胞膜和/或细胞质着棕色颗粒为阳性染色。依照各自染色程度及染色细胞数进行综合分析评分量化。不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分。着色细胞占计数细胞百分率75%为3分。每张切片染色程度得分与阳性细胞百分率得分各自相乘为最后得分。0～1为(－)，2～3分为(+)，4～6为(++)，>6分为(+++)。
1.3统计学处理采用χ 检验比较各组间率及配对资料的差异。所有数据均利用SPSS 12.0统计学软件分析处理。
2结果
2.1Plkl在胃癌中的表达见表1。Plkl阳性表达定位于胃癌细胞质与细胞膜中，呈棕色颗粒或团块。在49例胃癌组织中，41例有不同程度的阳性表达，阳性率为83.67%:15例癌旁正常胃组织中未见阳性表达，二者差异具有统计学意义(P
2.2Plkl表达与胃癌病理组织学类型关系见表2。Plkl的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期密切相关(P0.05)。
3讨论
胃癌的发病率和死亡率居我国恶性肿瘤的前列，多数病例在确诊时己属中晚期。目前多采用以手术为主的综合治疗，但许多病人最终死于局部复发和远处转移，5年生存率仅为30%~40%，治疗效果仍不理想。研究表明，胃癌不良的预后与胃癌细胞的无限增殖有关，而究其原因则可能是诸多与细胞增殖相关的基因发生了改变，找出这些与肿瘤细胞增殖有关的基因并阐明其在癌发生及发展中的作用对肿瘤防治具有重要意义。保罗样激酶1(Poofhkekinaes，Plkl)是一类广泛存在于真核细胞中的呈周期依赖性表达的丝/苏氨酸激酶，其结构及功能均十分保守。本研究发现plkl的表达状态与浸润程度、TNM分期、淋巴结的转移相关（均P
参考文献
[1]张文范，张荫昌，陈峻青.胃癌[M].上海：上海科学技术出版社，2001
[2]Weiehert W，Deknert C，Schmidt M，et al.Polo-like kinase isoform experssion is a prognostic factor in ovarian careinoma[J].BrJCnaeer.2004;90(4):815-821.
篇9
关键词：弥漫性大B细胞淋巴瘤；病理诊断；免疫组化
【中图分类号】R733.4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）05-0083-02
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的非霍奇金淋巴瘤类型，在2008年WHO淋巴造血组织肿瘤分类中，将弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）分为非特指型（DLBCL-NOS）?特殊亚型和其它大B细胞淋巴瘤?掌握其临床病理诊断特征及免疫学分型，在临床治疗?判断预后中具有重要意义?
1 材料及方法
1.1 材料收集2009.1-2011.9我院资料完整的DLBCL共36例，男13例，女23例，年龄最小18岁，最大85岁，平均年龄57.6岁?发生于淋巴结19例，胃肠道11例，扁桃体及咽部4例，骨2例?
1.2 方法标本经10%中尔马林固定，石蜡包埋，3-4um切片，HE染色，光镜观察?选用福州迈新生物技术开发有限公司即用型工作液，高温高压组织抗原修复，免疫组化MaxVision二步法，检测肿瘤细胞免疫表型?根据病情及鉴别诊断需要，选用CD20?CD3?CD30?CD10?CD5 ?bcl-6?MUM1?Ki67等抗体?根据文献记载，染色模式正确并>20%瘤细胞表达记为阳性?
2 结果
近2年多来，我们科共诊断淋巴瘤66例，DLBCL36例，占同期非霍奇金淋巴瘤54.5%（36/66），是最常见的淋巴瘤类型?淋巴结19例（颈部9例?腹股沟3例?腋窝2例?腹股沟2例?腹膜后3例），占52.8%（19/36），结外17例，占47.2%（17/36）其中11例发生于胃肠道，而且以胃DLBCL多见，占结外淋巴瘤52.9%（9/17），扁桃体及咽部4例，骨2例?发病部位不同，患者的临床表现不一，表现为颈部包块15例，腹痛?恶心?呕吐?食欲减退等胃炎样症状10例，肠梗阻1例，发热?乏力?消瘦6例?结内DLBCL19例中，淋巴结正常结构消失，瘤细胞弥漫分布，以中心母细胞及免疫母细胞为主，细胞大小?形态较一致，核大?空泡状?核膜厚?核仁清楚1-3个，除一例破坏淋巴结浸润周围软组织伴弥漫性纤维化外，多数间质薄壁血管增生，无纤维结缔组织增生?结外以胃DLBCL多见，占结外淋巴瘤52.9%（9/17），病变以胃窦为主，呈结节息肉状2例?弥漫浸润型4例?溃疡型3例，胃DLBCL以弥漫浸润性生长为主，破坏黏膜及腺体，替代固有间质，晚期浸润肌层及胃壁全层形成包块或溃疡?瘤细胞体积大?核大?核仁清楚?核分裂像易见，细胞凋亡多见，细胞粘附力差，排列松散，瘤细胞不表达CEA 及CK而表达CD45，不同于未分化癌?免疫组化结果：36例全部表达B细胞标记，CD20呈细胞质?细胞膜弥漫阳性，83.3%（30/36）病例Ki67>40%，36.1%（13/36）表达MUM1，69.4%（25/36）表达bcl-2，38.8%（14/36）表达 bcl-6，13.8%（5/36）病例表达CD10，少数病例表达CD5（1例），CD30（2例），瘤细胞不表达 CK ?CEA ?CD3?ALK?依据Hans分型方法GCB型13例（36.1%），non-GCB型23例（63.9%），与文献报道一致?临床采用CHOP（环磷酰胺+多柔比星+长春新碱+泼尼松）及 R-CHOP（美罗华加CHOP）化疗方案治疗，随访2-34月，17例建在，病情稳定，9例死亡，10例失去联系?
3 结论
弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是一组临床表现?形态学?免疫表型及分子生物学各异的淋巴瘤，西方国家占成人25-30%，发展中国家比例更高40%-43.3%为最常见的NHL类型?各年龄段均可发病，好发于老年人，中位年龄70岁，但青少年也可发生，淋巴结及结外均可发生，约40%发生于结外，而且以胃肠道最为常见?也可以发生于骨??脾脏?咽淋巴环?涎腺?肝?肾?皮肤?中枢神经系统?女生殖道?肺等?因此临床病理诊断及免疫组化在鉴别诊断及淋巴瘤分类中具有重要意义?
参考文献
篇10
关键词：纤支镜；活检；小细胞；肿瘤；免疫组化；病理诊断
肺癌是我国最常见恶性肿瘤之一，近年来其发病率和病死率不断上升。小细胞肺癌（SCLC）占全部肺癌的15%～20%，是一种高度恶性肿瘤，生长迅速，可早期发生转移，目前主要采取以化疗和放疗为主的综合治疗措施[1]。随着医学科学的不断进步和临床需求，纤支镜活检技术在肺部疾患如肿瘤病理诊断中的应用越来越广泛。多数情况下，SCLC经过病理医师光镜下阅片就能得到确诊。少数情况下因肿瘤细胞量少、坏死及受机械挤压变形等因素的影响，难于仅凭HE切片确诊，此时需借助免疫组化标记进行辅助诊断，并与肺原发系列小细胞性恶性肿瘤及转移瘤鉴别。
1资料与方法
1.1一般资料 选择2010年1月～2012年1月我院收治的经纤支镜活检确诊的小细胞恶性肿瘤患者，共35例，其中住院患者33例，门诊2例，男性25例，女性10例。确诊为SCLC的31例，经典型类癌1例，不典型类癌1例，转移性肾透明细胞癌（RCC）1例，ALK+间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）1例。临床表现根据发生频率高低依次为咳嗽、气促、痰血或咯血、胸痛、胸闷，个别伴发热、声嘶，无明显肺部症状2例。临床首诊为肺癌的22例，结核3例，炎症6例；"高血压病"、"四肢乏力"、颈部肿块各1例，因反复上腹痛伴黑便而诊断为"消化性溃疡"1例。上述所有不同类型肺原发癌的患者年龄40～78岁，平均60.53岁，伴有不同程度胸腔积液的5例。肺癌TNM分期，30例处于Ⅲ、Ⅳ期，3例Ⅱ期（含经典型和不典型类癌各1例）；RCC和ALCL患者均为男性，年龄分别76和49岁。
胸部CT：多表现为肺部团块状、斑片状或大片密度增高影或占位，伴或不伴支气管闭塞或狭窄及肺不张。部分病例纵膈或肺门淋巴结增大考虑转移；影像学提示肝转移的2例，其中1例同时伴右肾上腺转移。支气管活检部位：右上叶3例，右中叶2例，右下叶6例，右中下叶3例，右主1例，左上叶3例，左下叶6例，左舌叶4例，左主4例。表现为新生物生长的20例，其中伴支气管堵塞者8例，伴管腔狭窄者12例；粘膜颗粒状或粗糙者11例。活检易出血者14例。
1.2方法 标本均经过4%的中性甲醛固定、石蜡包埋及常规连续切片。切片经脱蜡、水化后放入PBS冲洗，柠檬酸缓冲液中微波处理修复；以3%的过氧化氢室温孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，依次加入抗体室温孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，光镜下观察。用已知的阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为空白对照。全部单克隆抗体SP法试剂盒均购自福州迈新生物技术开发公司。
1.3免疫组化判读 结果由两位病理医师独立观察每张免疫组化切片后做出判断。CD56、CgA、Syn、CD10、CD30、RCC的阳性表达均为细胞膜和（或）胞浆出现棕黄色颗粒沉积；ALK阳性定位于胞质/胞核；LCA、CD20、CD3阳性定位于包膜；Vim阳性定位于胞质；TTF-1、Ki67阳性定位于细胞核。阳性表达判断标准见文献[2]。
2结果
2.1巨检 组织1～8粒，每粒组织直径0.01～0.1 cm，灰白色或灰白灰褐色。
2.2镜检 31例确诊的SCLC活检标本，光镜下最突出的特征：粘膜下纤维间质或平滑肌束中见胞核深染、异型、小的瘤细胞呈不规则巢状、条索状或片状浸润性生长，胞核圆形或卵圆形淋巴细胞样、雀麦形或因受挤压而成不规则形，挤压严重的牵拉呈深蓝色丝状，染色质致密、细颗粒状，核仁不明显，瘤细胞仅2～3倍淋巴细胞大小。少数病例可见瘤细胞围绕血管排列和菊形团结构，或伴有不同程度肿瘤性凝固性坏死。间质改变有瘤组织中可见较多血管增生，多为扩张的毛细血管或血窦，并伴有癌性纤维间质反应。因染色较深，核分裂像计数不易判断。上述患者均同时进行纤支镜刷片细胞学检查作为对照，涂片发现SCLC的有16例，高疑11例；发现癌细胞，倾向鳞癌的1例；未发现癌细胞的3例。阳性率90.3%。
经典型类癌患者，光镜下见瘤组织排列呈缎带样、条索状，小的玫瑰花环样微小腺泡状或器官样，间质富于血窦，瘤细胞形态温和、单形性明显，胞浆较丰富、透明或粉红色颗粒样；胞核圆形、多角形或梭形，染色质粗糙点彩状（椒盐状），偶见小的核仁。核分裂像1～2个/10 HPF，肿瘤坏死不明显。
不典型类癌患者镜检：瘤组织呈不规则巢状、片状浸润性生长，或围绕血管排列，瘤细胞异型性比经典型类癌更明显，核浆比更高，可见明显核仁。瘤巢中央见小灶粉刺样坏死。核分裂像多>5个/10 HPF。
肺转移性肾细胞癌患者镜检：瘤组织呈不规则巢状、腺泡状、条索状或片状排列，瘤细胞胞浆透亮，胞核中位，圆形或卵圆形，淋巴细胞大小，无明显异型性。无肿瘤坏死，核分裂不易见，间质富于血管或血窦，并见较多新生血管。
恶性淋巴瘤患者镜检：粘膜下见深染明显异型淋巴样细胞弥漫性浸润，没有成巢的特点，瘤细胞大、胞界清楚，核圆形或肾形，核仁显著，伴有小血管增生，部分瘤细胞已挤压变形。该病例除了发现双肺部多发结节、右肺门及纵膈淋巴结肿大外，同时发现左颌下肿大淋巴结一枚，约1.5 cm×2.0 cm大小，请耳鼻喉科会诊，取活检证实为恶性淋巴瘤，与纤支镜活检病变一致。
2.3免疫组化结果 SCLC组别中，4例未做免疫组化标记，因光镜下形态学典型而直接诊断为SCLC，余27例均行免疫组化检测，结果为CK、CD56恒定阳性；TTF1除了1例弱（+），2例阴性外均弥漫强（+），阳性率92.6%；Syn仅1例阴性表达，阳性率96.3%；CgA阴性者4例，弱阳性3例，阳性率85.2%；Ki67核增殖指数多数病例>50%，少数病例30%左右。
经典型和不典型类癌细胞CD56、Syn、CgA、CK均（+）和TTF1（-），Ki67阳性率分别为1%和15%；转移性肾透明细胞癌表达RCC、CD10、Vim、AE1/AE3；ALCL阳性表达CD3，CD30和ALK。
2.4病理诊断 确诊SCLC共31例，经典型类癌和不典型类癌各1例，转移性肾透明细胞癌1例，ALK阳性间变性大细胞淋巴瘤1例。
2.5随访 经典型和不典型类癌患者均行手术根治性切除，随访2年无复发；SCLC多为患者20例转入肿瘤内科进行正规辅助放、化疗，5例进行了姑息性手术切除，6例放弃治疗，随访时间9～24个月，死于恶病质或广泛转移的23例，5例仍健在，3例因家属拒绝而失访。转移性RCC患者随访2年已全身广泛转移仍健在，ALCL正规化疗5周期肿瘤无进展。
3讨论
纤支镜活检适用于中央型肺癌的诊断，SCLC诊断的确立，多数情况下有经验的病理医生通过光镜观察HE切片就能得到确诊。少数情况下因为送检组织少，组织严重挤压变形或因坏死多而影响诊断。此时通过免疫组化标记往往能帮助确诊。常用抗体有TTF1，Syn，CgA，CD56，AE1/AE3，Ki-67和LCA。SCLC多为前5项抗体阳性，Ki-67核增殖指数高表达，LCA阴性。根据本实验组免疫组化检测结果分析，SCLC恒定阳性的抗体有CD56和AE1/AE3，个别也有TTF1、Syn、CgA阴性表达的情况，此时联合此五项抗体检测有助于确诊，而且阳性抗体项目越多越支持诊断。KOTOGIANNI等[3]研究20例SCLC活检标本结果显示，该组织中CD56均呈阳性表达，甚至受挤压部分的肿瘤组织中CD56也有较高的表达。HIROSHIMA等[4]研究显示，TTF1是SCLC的一种敏感而特异的免疫标记物，其阳性表达率为80%～90%。本组为92.6%，略高于上述水平。作为传统的神经内分泌标志物，本研究中Syn、CgA的阳性表达率要比以往文献报道的水平偏高，且由于此两项抗体表达的高特异性，应用Syn及CgA对SCLC的协助诊断很有帮助。此外，纤支镜刷片配合活检，能相互补充，提高SCLC诊断准确率。经典型类癌、不典型类癌和小细胞癌同属于神经内分泌肿瘤，分别相当于神经内分泌肿瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级（或高、中、低分化神经内分泌癌），上述3种肿瘤具有恶性程度和侵袭性生物学行为由低到高，核分裂像由少到多，肿瘤坏死有少或局限到广泛的特点。
肺转移性肾细胞癌的诊断的确立，光镜下组织学形态是基础，比如透明细胞巢，瘤细胞异型性小，血窦丰富。追问病史，本例患者既往有肾癌肾切除病史，影像学提示双肺、双侧胸膜多发结节改变，考虑转移瘤，结合免疫组化RCC，CD10，Vim，AE1/AE3表达，最终确诊为肺转移性肾透明细胞癌。
复习文献，绝大多数肺恶性淋巴瘤为B细胞来源的低度恶性MALT淋巴瘤，其次为淋巴瘤样肉芽肿病，弥漫性大B细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤极其少见。间变性大细胞淋巴瘤极罕见，至2011年3月，报道仅10多例。患者年龄27～58岁，无性别差异[5]。临床表现多为肺实质单个结节，亦可为双侧多结节，结节大小1.1～5.0 cm，有的在支气管内形成息肉样包块。患者可有发热、咳嗽、体重减轻。病理改变为大的淋巴样瘤细胞在肺实质呈浸润性生长，肺泡壁增宽，并在肺泡腔内播散。瘤细胞大，间变明显，胞界清楚，胞质嗜酸性或嗜碱性，似上皮细胞，核呈圆形或肾形，核仁显著，亦可见双核及多核瘤细胞。其间可混杂多少不等的小淋巴细胞、浆细胞、组织细胞、嗜酸性和中性粒细胞。ALCL免疫组化特征：瘤细胞LCA大多（+） ，T细胞标记CD3大多（+），CD30100%强阳性（细胞膜及Golgi区），ALK（+），CD20及CD15（-），CK（-）。
总之，免疫组化在协助诊断肺小细胞性恶性肿瘤特别是SCLC方面起到举足轻重的作用。确诊依赖于病理医生扎实的病理形态学基础，适当的免疫组化抗体的选择。免疫组化运用得当，将极大地提高肿瘤病理诊断准确率和有效进行鉴别诊断。
参考文献：
[1]张雯雯，孔庆暖，韩增磊，等.小细胞肺癌组织CD56、CgA、Syn及TTF1表达及联合诊断意义[J].齐鲁医学杂志，2013，28（2）：109-111.
[2]赵海滨，杨树东，周志华，等.肾原发性神经内分泌癌临床病理观察[J].诊断病理学杂志，2011，18（2）：121-123.
[3]KONTOGIANNI K，NICHOLSON A G， BUTCHER D， et al.CD56 a useful tool for lung carcinoma on biopsies with extensive crush artifact[J]. Clin Pathol，2005，58，（9）：978-980.
