化学发光免疫范文
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导语：如何才能写好一篇化学发光免疫，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
免疫分析的发展伴随着抗体制备技术的改进而不断提高。美国科学家Yalow等人首先将标记技术引入免疫分析，他们首先用放射免疫分析法(RIA)进行测定胰岛素。由于这种试验方法限制了试剂的寿命，难以获得长期稳定的检测标准，同时由于存在同位素的使用，不仅会损害操作人员身体健康，也会带来污物处理困难的问题。为了找到更为合理的免疫分析法成为以后20年来研究的热点。直到70年代末，国外有学者将免疫反应与化学发光测定技术相结合，这种集高灵敏度和高特异性的技术称之为化学发光免疫分析法，化学发光免疫技术优势比较明显，主要有以下几点：第一，灵敏度高，检测限范围更精准;第二，自动化程度高，并且没有放射性辐射危害;第三，发光标记物稳定，有效期长，同时应用范围宽，对于分子大小不同的抗原、半抗原及抗体都可检测。因此，化学发光免疫分析在临床、卫生、食品、环保和军事等领域正被越来越多地用于激素、蛋白质、肿瘤、毒物、病毒等成分检测。
2 免疫分析基本原理
由免疫反应系统和化学发光分析系统两个关键部分组成了化学发光免疫分析的基本原理，化学发光分析系统主要氧化以及催化的作用于化学发光物质，产生一个激发态的中间体，在处于稳定状态时，发射出光子，然后通过测量仪器测量光量子。通过标记物与发光强度的关系，进而测出被测物质含量。而免疫反应系统是将发光物质在抗原或抗体上直接标记。
3 化学免疫分析分类
化学发光免疫分析法主要以标记法的不同来进行分类，目前习惯上将免疫分析法主要分为两类，第一主要是标记免疫分析法，其次是酶免疫分析法，前者是以化学发光标记，后者是以酶标记，以化学发光底物作为信号试剂来进行发光，其原理是不相同的。除此之外，包括荧光免疫分析法以及电化学发光免疫分析法也是目前存在的化学免疫法分析方法。
3.1 化学发光标记免疫分析
将化学发光剂如吖啶酯类化合物，直接标记在抗原上或抗体上，其基本原理是启动发光剂发光，快速闪烁。这种标记物其化学反应简单、快速、无须催化剂;夹心法用于大分子抗原，竞争法主要用于检测小分子抗原，另外本底低，非特异性结合相对较少光量不会因为分子大小而受影响，因此能增加灵敏度，一般常用的化学发光物质主要是通过启动发光试剂NaOH-H2O2作用而发光，其发光非常迅速，小分子物质多采用竞争法，夹心法主要用于大分子物质。
3.2 化学发光酶免疫分析
通过酶标记生物活性物质，再作用于发光底物，在信号剂的作用下发光，然后用发光测定仪进行测定。化学发光酶免疫分析酶反应的底物是发光剂，按照标记免疫分析，应属酶免疫分析，其操作步骤与酶免分析完全相同。目前常用的标记酶为碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们有各自的发光底物。化学发光酶免疫分析法种类大致有三种，首先是HRP标记CLEIA，一般常用3-氨基邻苯二甲酰肼作为底物，也即是鲁米诺或者用其衍生物4-氨基邻苯二甲酰肼也是可以的，这两种都是重要的发光试剂。需要注意的是该底物需要在碱性缓冲溶液中进行氧化反应，生成激发态中间体，当然这需要在过氧化物酶及活性氧存在的条件下进行，中间体回到基态时就可以发光，此时的波长一般在425nm。曾经先前有人用该标记底物标记抗原或抗体，但后来发现其发光强度多受灵敏度的影响。目前用过氧化物酶进行标记，其发光强度主要依赖酶免疫反应中的酶的浓度大小;其次增强发光酶免疫分析也是化学发光酶免疫分析的一种，它主要是在将增强的发光剂加入到发光系统中，加强发光的信号强度，并且能够保持长时间的稳定性，在一定程度上提高了该分析方法的准确性和灵敏度，便于多次测定。目前在一些现代化的设备上，还可以由计算机进行精确控制操作，比如，往系统中加入发光试剂以及混合、温育、洗涤等，甚至后期的数据处理，进而绘制标准曲线，最终完成患者血清样品的分析并打印出结果;最后一种就是用ALP标记的CLEIA，这种分析方法一般多用环-1，22-二氧乙烷衍生物作为发光底物，它的发光原理主要是其用化学发光酶免疫分析底物而设计的分子结构稳固，其中的芳香基作为发光基团和酶作用，在发光试剂的作用下发光，该底物在碱性磷酸酶的作用下，磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基，就会产生一个稳定的中间体，然后中间体发生裂解会产生金刚烷酮和激发态的物质，这种常见底物是AMPPD，其作为磷酸酯酶的直接化学发光底物，多用来检测碱性磷酸酯酶和一些配基的结合物。
4 应用
4.1 激素、蛋白质和肿瘤检测
该系统使反应物形成均相混悬液，顺磁微粒作为固定相，增大反应面积，加速免疫反应，快速分离，自动洗涤，减少酶和催化剂的使用，pH调整即可，避免了许多影响因素，广泛应用于甲状腺功能、药物检测、肿瘤标志物及心血管等项目。
4.2 病毒、毒物检测
杨秀岑等用ABEI标记兔抗大肠杆菌lgG，试样温育、离心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 发光体系测定;章竹君等测定了粪样中的轮状病毒以HRP酶标记;为研究TNT对人体的毒害作用提供方法，张丽民等以HRP标记免疫测定了血清中4-氨基-2，6-二硝基甲苯，效果非常显著。
4.3 其他方面的应用
被越来越多地用于免疫测定中的HRP酶标记生成核酸探针，主要采用两种形式，一种是靶DNA杂交，将HRP直接标记在探针上，同时增强的鲁米诺试剂检测加入分离后的杂交体。另外一种是将DNA探针标记在生物素及地高辛上，然后与靶DNA杂交，再用HRP标记的亲和素和抗地高辛与分离后的杂交体结合，最后加入鲁米诺试剂氧化发光。
篇2
【关键词】 化学发光免疫分析技术;基本原理;分类;应用
近10多年来,当代生物技术的研究和应用取得高速发展的同时,也大大推动了化学发光免疫分析方法(CLIA))的更新换代速度。化学发光免疫分析法(CLIA)是建立在放射免疫分析技术(RIA)理论的基础上,以标记发光剂为示踪物信号建立起来的一种非放射标记免疫分析法,具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单、操作方便、分析速度快和容易实现自动化和不污染环境等优点,特别是能在较短的时间内得到实验结果,因此深受检验医学工作者和临床医师的好评。
1 化学发光免疫分析的原理
化学发光免疫分析技术的基本原理,化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析两个系统[1]。免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原-抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化学发光物质经氧化剂的氧化后,形成一个处于激发态的中间体,会发射光子释放能量以回到稳定的基态,发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测[2]。根据化学发光标记物与发光强度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的含量。
2 化学发光免疫分析的分类
化学发光免疫分析根据应用发光体系应用于免疫分析中的方式不同可分为直接标记发光物质的免疫分析,酶催化化学发光免疫分析,电化学发光免疫分析(ECLIA)。直接标记发光物质的免疫分析,目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
3 化学发光免疫分析的临床应用
CLIA已广泛应用于基础和临床医学的各个领域,成为替代RIA的首选技术。Amersham公司针对AmerliteTM发光增强酶免疫分析系统研制出的试剂盒项目有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。Amersham公司虽然研制出这10余种试剂盒,但因操作不够简便,检测项目仅限于蛋白质类大分子化合物,未能广泛应用于临床医学检测。
美国Ciba Corning公司研制的ACS:180自动CLIA系统能非常精确测量闪光。经过不断的改进,实现了ACS:180CLIA系统的全自动化,推出全新产品"ADVIA系列"。现有检测项目47项,更多的项目还在开发之中。主要有甲状腺系统、性腺系统、血液系统、肿瘤标记物、心血管系统、血药浓度及其他一些检测项目。
经过改良后,金刚烷衍生物在碱性磷酸酶作用下可发出高强度的辉光,光信号可持续1～2 h。随后国外生产厂家研制出以碱性磷酸酶为标记物的试剂盒,与之相匹配的有DPC的IMMULITE全自动CLIA系统和Beckman的ACCESS全自动微粒子CLIA系统。IMMULITE全自动CLIA系统可检测项目有心脏病、甲状腺功能、性腺激素、传染病、药物、血清学、血液病、成瘾药物、糖尿病、过敏检测和肿瘤标志物。ACCESS全自动微粒子CLIA系统主要可检测甲状腺功能、血液系统、内分泌激素、药物、肿瘤因子、心血管系统和糖尿病等项目。
目前商品化的ECLIA分析系统只有Roche公司的ECLIA全自动分析系统。主要特点是本底信号极微,特异性更高,最小检出值可达1 pmol以下,操作十分简便快速,是CLIA优点较为集中的完美分析技术。已提供试剂盒的项目有肿瘤标志物、甲状腺功能、内分泌、传染病、心肌标志物和维生素类等项目。
王阳[3]运用了电化学免疫分析技术,检测了3种肿瘤标志物癌胚抗原(Carcinoem-bryonic Antigen,CEA)、细胞角蛋白l9片段(Cytokeratin 19fragments,CYFRA21,1)和神经元特异性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)水平,对肺癌诊断有实际应用价值。张忠英[4]等利用电化学发光免疫分析技术检测尿CK19片段,结果显示尿CK19检测对膀胱癌等泌尿系统肿瘤诊断和复发监测具有敏感性高、无创伤性的优点,优于血清CK19和尿细胞学检查。动态观察尿CK19片段含量的变化可降低急性尿感患者的假阳性率。王利娜[5]等应用ECLIA测定和酶免疫测定(EIA)检测乙肝标志物。结果:应用ECLIA方法检测HBsAg精密度,最大批内变异≤8.30%,最大日间变异≤15.33%,HBsAg灵敏度0.05 ng/ml,HBeAg灵敏度0.03NCU/ml。HBsAg检测范围0.01～7 000 COI。显示ECLIA检测HBsAg灵敏度高,重复性好,检测范围宽。检测HBeAg灵敏度可能更高。李锦洲[6]等采用ECLIA法对卵巢癌、良性卵巢肿瘤及健康妇女血清CA125分别进行测定,ECLIA用于第二代CA125(CA125-Ⅱ)测定,使CA125测定更加敏感恒定,每日之间差异较小。黄琛,汤汉红等[7]在ECLIA法检测与蛋白质芯片法多肿瘤标志物结果差异的研究中显示:两种方法有较好的相关性(P
化学发光免疫分析技术在医学的临床应用已非常成熟,有取代放射免疫分析技术和酶联免疫分析技术而成为诊断市场上的主流产品的趋势。国外的化学发光免疫分析检测系统价格昂贵,普及有一定的困难;国内的化学发光免疫分析检测系统虽然价格较国外产品便宜很多,但其检测的灵敏度和可靠性,还有待进一提高。研究者在如何提高免疫诊断的敏感性和特异性、发展新的分析体系和检测技术便携化等方面仍需要不断努力。
参 考 文 献
[1] 李美佳.当代免疫学技术与应用.北京:北京医科大学国协和医科大学联合出版社,1998:549-561.
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[3] 王阳.电化学发光免疫分析技术检测3种肿瘤标志物对肺癌的诊断意义.Chin J Lab Diagn,2006,10(3):294-296.
[4] 张忠英.电化学发光免疫分析技术检测尿CK19片段的临床应用及其评价.中华检验医学杂志,2005,28(1):50-53.
[5] 王利娜,姚智.电化学发光免疫分析技术检测乙肝标志物的应用.天津医科大学学报,2008,14(1):48-50.
[6] 李锦洲,洪锡田,吕晓娴.肿瘤标志物CA125检测在卵巢癌诊断中的价值.中国误诊学杂志,2005,5(8):1456-1457.
[7] 黄琛,汤汉红,王敏民.蛋白质芯片技术与电化学发光技术检测多肿瘤标志物结果的评价.天津医药,2008,36(12):942-944.
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[9] 田润华,郑春喜,王士珍.电化学发光免疫分析与临床应用.齐鲁医学杂志,2004,19(5):464-465.
[10] 周建光,杨梅.电化学发光免疫分析技术与临床应用.医疗装备,2010,23(5):23-24.
篇3
关键词:游离前列腺特异抗原,磁微粒化学发光酶免疫分析法,肿瘤标志物
Key words: prostate specific antigen,microbeads-based chemiluminescence immunoassay. Tumor marker
Gao wei
Kaifeng City Maternity Hospital
[Abstract]A sensitive chemiluminescence enzyme immunoassay based on magnetic micro-beads was established to detect the free prostate specific antigen (f-PSA) in human serum. One antigen was coated on the magnetic micro-beads and the other was labled with horseradish peroxidase(HRP), with the highly sensitive Luminol chemiluminescence reaction as the detection system. The linear range of this method for PSA was 0.02~50ng/ml with the limit detection of 0.02 ng. The intra-assay coefficients of variation is lower than 4.7% and the percent recovery was in the range of 90%~110%. F-PSA in 510 clinical samples were detected with this method. Compared with Roche chemiluminescence immunoassays, the correlation coefficient of 0.995 was obtained. The results demonstrated that this method is reliable and shows proposed potential application in the clinical analysis of f-PSA for prostate cancer diagnosis.
前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen, PSA)是人体前列腺上皮组织细胞分泌的一种分子量为30～33 kDa的单链糖蛋白分子[1～3]。前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)病人血清中PSA浓度升高;良性前列腺增生(Benign Prostate Hyperplasia, BPH)病人血清中,PSA浓度也会升高;随着年龄的增加,血清中PSA浓度也有不同程度的升高,在4～10 ng/ml的浓度范围就形成了诊断灰区[4~6]。PCa病人血清中f-PSA浓度水平与BPH病人以及正常人相比,明显偏低,游离前列腺特异抗原百分率对PCa的特异性更高,可降低临床检验筛查的假阳性率。建立特异性强、检测灵敏度高的新型f-PSA检测试剂将会对前列腺相关疾病的检测具有较高的临床应用价值。
1.材料及方法
1.1试剂: PSA、fPSA单克隆抗体购自美国Seradyn公司;辣根过氧化物酶、鲁米诺购自sigma公司;f-PSA化学发光免疫分析(CLIA)试剂盒购自Roche公司。
1.2仪器:LUMO微孔板化学发光检测仪、IWO型洗板机(郑州安图生物工程有限公司);罗氏ELESYS2010电化学发光仪。
1.3临床样本:临床样本由肿瘤医院提供。
2.实验方法
2.1 方法学原理:选用一步反应双抗体夹心法检测f-PSA抗原。磁微粒表面结合PSA单克隆抗体;加入待检测校准品、临床血清和酶标记抗体;温浴反应后形成固相抗体-抗原-酶结合抗体的复合物,通过洗涤分离游离的抗原和酶标记抗体,加入发光底物,使用化学发光检测仪检测信号强度,结合标准曲线来实现对待测样品的定量分析。
2.2 抗体包被磁微粒:将300mg磁微粒分散于2ml包被液(0.05Mol/L pH 9.5碳酸盐缓冲液)中,室温下振荡4h,用20ml封闭液(0.5%BSA,pH 7.5磷酸盐缓冲液)封闭4h,最终使用封闭保存液调整磁微粒浓度30mg/ml,密封置于冰箱2～8℃保存备用。
2.2HRP抗体酶结合物的制备:采用改良过碘酸钠法完成HRP对f-PSA单克隆抗体的标记,酶结合物保持单克隆抗体的免疫反应活性和酶的催化活性。
2.3f-PSA校准品的配制:校准品经由国家标准标定,分装,冷冻保存。
2.4血清f-PSA的化学发光酶免疫分析方法:向微孔板中每孔加入校准品或样品50μL,磁微粒50μL,酶结合物溶液100μL,37℃温育30min,使用磁分离洗涤设备洗涤4次,加入发光底物100μL,室温避光反应5 min,测量相对发光强度单位(RLU),通过标准曲线对血清中f-PSA实现定量分析。
3.结果分析
3.1 包被浓度的影响:比较不同的包被浓度(1.0、2.0、3.0和5.0 ug/ml)对体系的影响。随着包被浓度的提高,校准品信号值升高,浓度达到3ug/ml后,校准品对应发光值开始下降,认为3ug/ml的包被浓度已经达到饱和。
3.2酶结合物浓溶优选:将酶结合物分别以1∶1000、1∶2000、1∶3000进行稀释,比较不同分析结果的影响。结果表明,在1∶2000稀释比条件下,校准品信号值、灵敏度、线性、HOOK值检出均达到最佳。
3.3温育时间:考察了不同温育时间对反应体系的影响,温育时间超过30min后,校准品信号值不再升高,表明免疫反应达到饱和,最终确定温浴时间为30min。
3.4温浴条件:考察了三种不同的温育方式,即4度、室温和37℃对反应体系的影响。37度时RLU较室温反应提高57%,同时考虑37℃恒温温育的条件更容易控制,选择37℃恒温温育作为温育条件。
3.5 性能评价
根据国家相关化学发光检测试剂质量标准,对建立的磁微粒化学发光f-PSA进行评价,结果如下:
临床考核研究选用本院电化学发光检测试剂为对照组。自2009年7月以来,收集经病理中心确诊前列腺患者血清样本43份、前列腺炎患者血清样本142份,随机收集正常男性血清样本325份。血清按照检测试剂盒要求采集的非抗凝血清,样本需清亮不混浊、样本量不少于300μl。采集后2~8 ºC冷藏,如1天内不检测,则应冷冻(-20ºC)保存,不得反复冻融。其测定值相关性及相关系数分别为:Y(磁发光) = 1.0075x (Roche)+ 0.0386R= 0.9953
4 讨论
本方法为化学发光酶联免疫系统与磁性微粒分离技术相结合的一种测定方法,它使双抗体夹心酶联免疫技术在游离标记抗体和抗原复合物中具有分离完全和快速的优点。建立的f-PSA检测方法重复性良好,线性范围宽,具有较高的精密性和准确度,特异性强。经过对510份临床血清研究表明与电化学发光检测结果符合程度达到0.99以上。
此方法操作简便、快捷,全部测定时间仅需40分钟,显著提高工作效率,满足医生及病人即刻出结果的要求。
参考文献:
1.Vessella RL , Lange PH , Partin AW, et al . Probability of prostate cancer detection based on results of a multicenter study using the Ax SYM freePSA and total PAS assay. Urology 2000 Jun ; 55 (6) :909
2.Djavan B , Zlotta A , Kratzik C , et al . PSA , PAS density , PSA density of transition zone , free/ total PSA ratio , and PSA velocity for early detection of prostate cancer in men with serum PSA 2. 5 to 4. 0ng/ ml . Urology 1999 Sep ;54(3) :517
3.张灵, 计国义, 李晓萌等. fPSA/ tPSA比值优化前列腺癌早期诊断作用的研究[J],中华男科学杂志,2004,8(10):582-585
篇4
2月-2016年2月笔者所在医院门诊妇科收治的疑似梅毒患者200例为试验对象。所有患者均取晨起空腹静脉血检测，初筛试验采用CLIA法展开特异性梅毒螺旋体抗体试验，再将标本经TPPA与梅毒甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）进行复检。比较不同S/CO值标本TPPA与TRUST复检结果。结果：S/CO值12.00标本符合率分别为91.30%、94.87%、97.14%、96.43%、100%，均明显高于TRUST的63.04%、69.23%、68.57%、75.00%、77.78%，差异有统计学意义（P
【关键词】 化学发光免疫分析法； 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验； 梅毒； 血清学筛查
doi：10.14033/ki.cfmr.2017.15.023 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2017）15-0042-02
梅毒是一种传染性较强、病程较长的性传播疾病，可严重损害心血管、神经等多系统，对人们健康危害极大，尤其威胁临床输血安全[1]。此外，梅毒可通过母婴传播这一途径将梅毒传染至胎儿，进而造成先天梅毒、自发性流产。故早期诊治梅毒显得尤为重要。目前临床常用的检测方式为血清学筛查，包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、CLIA、TPPA、TRUST等。其中ELISA、CLIA、TPPA属于特异性梅毒抗体试验，而TRUST属于非特异性梅毒抗体试验[2]。多数医院采用上述其中的两种方式筛查梅毒，但因选用不同的方式可能导致检测结果产生差异。本研究拟用CLIA法联合TPPA法进行梅毒血清学筛查，探讨其临床应用价值，为梅毒早期诊断提供合理借鉴，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2014年2月-2016年2月笔者所在医院门诊妇科收治的疑似梅毒患者200例为试验对象，年龄23～70岁，平均（36.84±3.26）岁。
1.2 仪器与设备
微量U形反应板、平板混合器、微量滴管（25 μl/滴）、微量加样器（25 μl）。CLIA法采用Chem cline全自动化学发光仪，应用北京科美生物技术有限公司提供的配套试剂盒。TPPA试剂盒由日本富士瑞必欧株式会社提供，包括血清稀释液、阳性对照血清、致敏粒子、溶解液等。TRUST试剂购自上海荣盛生物药业有限公司。
1.3 方法
所有患者均取3 ml晨起空腹状态下静脉血，行离心处理15 min，转速为3000 r/min，血清分离后，制作血清标本，于4 ℃保存。采用全自动分析仪进行CLIA测试，并读取结果。参照实际说明书，S为待测样品发光值，阴性对照品平均发光值的2.1倍为临界值（CO）。S/CO
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0软件进行数据处理，计量资料用（x±s）表示，计数资料以率（%）表示，比较用字2检验，P
2 结果
S/CO值12.00标本符合率均明显高于TRUST，差异有统计学意义（P
3 讨论
梅毒是由苍白密螺旋体感染导致的性传播疾病，其病原体可累及全身所有脏器，引起多器官病变、破坏组织，从而导致功能失常。近年来，随着人们行为观念及生活方式的变化，梅毒发病率呈明显上升趋势，逐渐引起临床重点关注[3]。由于梅毒螺旋体仅存在于人体内，故人是唯一的梅毒传染源。文献[4]显示，95%～98%左右的患者是通过性接触而感染，梅毒螺旋体通过穿透人体正常皮肤及黏膜，从而使健康者感染梅毒。患者染上梅毒后其心血管系统与神经系统严重受损，生命安全受到威胁，同时该病具有较强的传染性，因而积极防治梅毒对维护社会公共卫生安全具有重要意义。
传统上梅毒筛查方式主要有两种，一是初筛以特异性梅毒螺旋体试验，复检应用非特异性梅毒螺旋体试验；另外一种方式中初筛与复检分别应用非特异性与特异性梅毒螺旋体试验。在梅毒血清学筛查中，较高的敏感度是对检查方式的重点要求，目前，CLIA是梅毒初筛试验中应用较为普遍的一种方式，制备梅毒螺旋体抗原，并以辣根过氧化物酶进行标记，与标本中抗体形成双抗原夹心后，洗涤添加化学发光底物，发光强度测定后，依据S/CO值判断标本有无梅毒螺旋体特异性抗体[5]。由于整个检测过程中采用全自动分析仪读取结果，从而充分发挥高自动化的优势，减少认为误差，并避免携带污染。故该检测方法能够对大批量标本进行筛查。但因其敏感度较高，在检测低S/CO值标本时易发生假阳性现象，进而造成误诊，增加临床确诊难度[6]。本研究中，46例S/CO值为1.00～2.99患者中，经TPPA确证为阴性4例，而TRUST复检出17例阴性。该标本多来自肿瘤或透析患者，因此，针对S/CO值较低的患者需谨慎处理，并采用TPPA进行确证，减少假阳性的存在。另外，在CLIA初筛后，TPPA复检符合率为96.00%，明显高于TRUST的74.50%，表明TPPA联合CLIA检测梅毒可有效提高检测准确度，减少漏诊、误诊现象。这是由于TPPA采用人工载体明胶粒子与梅毒螺旋体抗体形成凝集，发生粒子凝聚反应，进而有效检测出血清中梅毒螺旋体抗体，其灵敏度与特异度均具有较高水平。而本研究中CLIA检出率高于TPPA，可能是由药物干扰所致，或是梅毒螺旋体隐性感染。TRUST作为非特异性梅毒螺旋w，可通过观察滴度的变化，以判断梅毒感染情况。但在复检试验中发现，阳性率偏低，存在漏诊率高等问题。故本研究认为，CLIA联合TPPA检测梅毒更具临床应用价值。但需注意的是，TPPA法在实际操作过程中存在检测时间长、操作繁杂、自动化水平低等问题，判读结果时易受人为因素影响，尤其是标本介于阳性与阴性之间，难免出现误差[7]。而CLIA能够实现高通量、高自动化、重复性检测，客观的判读结果，敏感度更高，故更适合应用于初筛试验[8]。由于各检测方式均存在一定的漏诊、误诊现象，临床实际筛查中应注重采用联合的方式进行检测，尤其是对于S/CO值较低的标本，经CLIA法初筛后，应给予TPPA法确证，以确保检测准确度，尽可能的减少误诊、漏诊现象，从而避免医疗纠纷，构建和谐的医患关系。
综上所述，CLIA联合TPPA法在梅毒血清学筛查中具有显著的应用价值，临床可充分发挥CLIA敏感度高的优势，在初筛后应用TPPA法对检测结果进行确证，提高诊断准确度，为临床治疗提供科学依据。
参考文献
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篇5
关键词：乙肝血清标志物；化学发光免疫分析系统；性能评价
乙型肝炎（hepatitis B）是由HBV感染引起的传染病，世界范围内均有流行，我国则是乙型肝炎病毒感染的高发区[1]，所有乙肝患者中有15%～25%将死于慢性肝病（肝癌，肝硬化），因此，HBV感染是一个严重的公共卫生问题。及时准确的实验室诊断方法对效控制HBV传播显得尤为重要。随着对乙肝研究的深入和新的抗病毒药物的问世，仅仅定性检测己经满足不了临床需求。近年来，随着定量免疫检测技术平台的完善和新的检测技术化学发光技术的发展和成熟[2，4]，乙型肝炎定量检测己经成为不少实验室的选择。随着实验室规范化建设的发展以及对检验质量的追求，对于实验室检测系统的性能评价己经越来越受到人们重视。我们对本科室目前新投入使用的LIAISON XL化学发光免疫分析系统及配套乙肝两对半检测试剂盒进行了初步性能评价，现报告如下。
1资料与方法
1.1一般资料 索林LIAISON XL化学发光免疫分析系统，乙肝两对半检测试剂盒及配套校准品，上海市临床检验中心提供的室内质控物（批号1401）。
1.2标本来源 本院门诊及住院患者血清以及各项目临床异常高值标本。
1.3方法
1.3.1实验准备 对仪器进行维护保养及校准，连续观察仪器运行状态一周，运行稳定且状态良好，熟悉仪器操作及实验步骤后进行各项性能评价。所有实验运行均在仪器状态良好，质控在控前提下进行。
1.3.2实验设计
1.3.2.1 批内及批间不精密度 依据NCCLS-EP15A文件，将患者混合血清分别分装5管放置于-20℃冷冻保存，每天解冻1管上机重复检测4次，连续5d。
1.3.2.2 线性评价 按照NCCLS-EP6要求：各选取一份高值（H）和低值（L）患者标本（必须接近检测高限和低限），用于线性范围参数验证实验。样本分别按H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、L的比例进行稀释，每个稀释度重复测定2次，计算均值。
1.3.2.3分析灵敏度 使用接近检测下限的患者标本， 将样本上机后连续检测20次，计算该浓度下光信号的检测数据，统计平均值（mean）、标准偏差（SD）、变异系数（CV）。变异在20%内为可接受。
1.3.2.4符合率 按照NCCLS-EP12-A2文件要求，HBeAb、HBcAb的检测结果是以index的形式表达定性结果，符合率采用阴阳性样品各50份与原先使用的LIAISON发光分析仪检测结果做比对。
1.3.2.5数据处理 所有数据均使用Microsoft office Excel 2003软件处理。
2结果
2.1批内及批间不精密度评价 见表1所示，本实验室检测乙肝标志物所得CV均在厂家声明的范围之内，为可接受水平。
2.2 LIAISON X检测乙肝标志物线性评价 将实测值与理论值作比较，计算 y=bx+a，验证线性范围。斜率b值在1±0.05范围内，相关系数r≥0.975即线性符合要求。HBsAg线性测试结果分别见表2及图1所示。用相同方法分别验证HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb检测线性结果见表3。
2.3分析灵敏度验证 厂家提供的HBsAg、HBsAb 、HBeAg的检出下限分别为 0.03IU/ml、5 mlU/ml、0.01PEIU/ml。采用接近检出下限的患者标本，连续检测20次，得到该浓度下光信号的检测数据，平均值（mean）分别为716.9、545.05、402.45；标准偏差（SD） 分别为72.2123、94.5696、52.1864；变异系数（CV） 分别为10.07%、17.35%、12.97%，变异系数均在20%以下，为可接受范围。
2.4符合率 用患者血清样本对两测试系统进行方法学比对， HBeAb、HBcAb的检测结果是以index的形式表达定性结果，符合率采用阴阳性样品各50份与原先使用的LIAISON发光分析仪检测结果做比对。两种测试结果完全相同，符合率100%，即敏感性和特异性均为100%，敏感性差值（D）=0%；特异性差值（D）=0%。两个系统检测结果有很好地一致性（Kappa值=1）。
3讨论
HBV血清标志物的检测方法包括酶联免疫分析法（EIA）、放射免疫分析法（RIA）、微球酶免分析法（MEIA）、以及化学发光免疫分析法等。全自动化学发光免疫分析方法极大地改善了HBV标志物检测的灵敏度和特异性。然而，由于免疫分析方法难以标准化，导致不同免疫分析系统测定结果之间存在差异，因此为保证检验结果的准确可靠，对全自动免疫分析系统进行客观的性能评估非常重要[3-5]。
检测结果的重复性对乙肝标志物检测非常重要，可用精密度来评价结果的重复性。本文依据NCCLS-EP15A文件[6]，将患者混合血清分别分装5管放置于-20℃冷冻保存，每天解冻1管上机重复检测4次，连续5d。结果表明LIAISON XL化学发光免疫分析系统进行乙肝两对半检测时很好的重复性，，批内不精密度CV在 1.56～3.07%，总不精密度在2.64～5.44%。
检测患者标本时，当标本中乙肝标志物浓度在检测系统的线性范围时，检测结果更接近于被测物的真值，此谓检测结果的可靠性。对于LIAISON XL检测乙肝标志物的线性范围，未见有文献进行相关评价，厂家提供的申明认为线性斜率b值在1±0.05范围内，相关系数r≥0.975即线性符合要求。本验证试验所得HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb均有良好的线性范围（斜率b在0.9608～1.0190 之间， r2 为0.9963～0.9998），能够确保高值样在稀释的条件下，得到较高可信度的检测结果。使用接近检测下限的患者标本， 将样本上机后连续检测20次，得到该浓度下光信号的检测数据，计算变异系数（CV）均在20%以下，表明该检测系统的分析灵敏度符合厂家的申明。
目前，国内乙肝标志物的检测主要采用ELISA法和各种化学发光法。检测试剂、仪器、操作人员等的差异，同一检测标本在不同实验室、不同检测方法、不同检测系统之间检测结果的一致性难以得到保证。LIAISON XL化学发光免疫分析系统是LIAISON升级版，反应仓位增加，加样的独立性及一次性使用的吸样头避免了交叉污染的可能。按照NCCLS-EP12-A2文件要求[7]，HBeAb、HBcAb的检测结果是以index的形式表达定性结果，本研究采用阴阳性样品各50份与原先使用的LIAISON发光分析仪检测结果作比对，计算符合率，两者测试结果完全相同，符合率100%，确保了检测结果的一致性。
随着实验室规范化建设的发展以及对检验质量的追求，对于实验室检测系统的性能评价己经越来越受到人们重视。综合本研究对LIAISON XL化学发光免疫分析系统检测乙肝标志物HBsAg、 HBsAb、 HBeAg、HBeAb、HBcAb精密度、线性范围、符合率、分析灵敏度等的系统评价，表明该系统测定样本快速，各方面性能良好，能适应医院临床样本的检测需要。
参考文献：
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篇6
[关键词] 梅毒；作用；化学发光免疫测定法
[中图分类号] R446.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）02（b）-0010-03
梅毒是感染梅毒螺旋体后引起的一种易传染的性传播疾病[1]。梅毒是一种易传染、危害性大的人类性传播疾病[2-4]。血清学检测梅毒螺旋体抗体的方法已经被我国卫生部列为手术前、孕妇产前的必检项目，血清学检测梅毒螺旋体抗体的方法是诊断梅毒的重要依据之一[5-6]。因此，选择特异性强、敏感性高的实验方法非常有助于梅毒的诊治。为探讨化学发光免疫测定法在梅毒螺旋体抗体检测中所起的作用，该研究选择该院临床中心2012―2013年收治的160例梅毒患者为研究对象，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择该院临床中心的160例梅毒患者血清与135例非梅毒患者的血清为实验标本，梅毒患者血清标本通过真空促凝管采集静血浆3 mL，将血清分离，保存在4～8 ℃的冰箱，待检测[7-9]。
1.2 仪器与试剂
CLIA试剂盒、TPPA试剂盒均为日本富士瑞必欧生物技术有限公司，RPR试剂盒为上海荣盛生物科技有限公司。
1.3 方法
将160份梅毒患者血清与135例非梅毒患者血清标本分别同时进行CLIA和TPPA检测，比较两种方法的不同之处。
将160份梅毒患者血清与135例非梅毒患者血清，进行CLIA检测结果显示为阳性时，再进行TPPA和RPR检测，探讨TPPA阳性结果的S/CO值与TPPA、RPR之间有何联系。所有进行检测的试剂均达到实验要求，且操作均按照操作说明书操作[10]。
1.4 统计方法
采用SPSS14.2软件对数据进行统计学分析，计数资料进行χ2检验。
2 结果
①160份梅毒患者血清中，CLIA法检测阳性151份，TPPA阳性130份，以回归分析结果为参考，CLIA法的阳性率为93.75%，TPPA法的阳性率为82.50%，两种方法差异无统计学意义（χ2=3.8，P
②135份非梅毒患者血清中，CLIA法检测阳性率为2.28%，TPPA法检测阳性率为9.28%，RPR阳性法检测阳性率为10.37%。CLIA的S/CO值在2～11有3份，其中TTPA阳性12份，RPR阳性14份；7
③CLIA与TPPA结果不一致的21份，经RPR法检测，阳性4份，1份含TP31、TP47条带，3份含TP32、TP47条带，1份 含TP17、TP32、TP47条 带，检测结果未显示出的4份，为TP45阳性。14份RPR法检测阴性的标本，通过CLIA法验证也均为阴性 [11]。
3 讨论
梅毒对人体的危害多种多样，越早对梅毒的确诊，有利于患者得到全面有效的治疗，有利于患者疾病的快速康复。梅毒临床确诊按照梅毒病毒的特异性抗体的检测和患者的临床症状作为判断依据[12]。TP-ELISA适合数量较大的操作，但测量结果经常遇到假阳性的情况[13]。CLIA技术是ELISA技术的更新技术，以敏感的化学发光底物代替原始的底物，其特点是信号模式可被酶增强，而且发光信号时间被保持和拉长了，一方面保留了发光免疫分析超高的敏感性，另一方面也避免了传统光信号持续时间较短等缺点。过氧化物酶催化鲁米诺发光和碱性磷酸酶催化金刚烷衍生物的方法是当今较为常用的两种方法。CLIA法对各期梅毒的灵敏性和特异性均>97.5%，因此其也成为一种新兴的检测梅毒的方法[14]。
该研究发现， CLIA法的阳性符合率高于TPPA法。研究发现，CLIA法为阳性结果时，S/CO值较低时TPPA会出现阴性结果， RPR法发现14份为阴性，CLIA法验证结果也为阴性，由此可说明CLIA法的灵敏度明显高于TPPA法；此外，实验中出现假阳性的结果可能是标本处理不当导致的。
采用RPR法检测结果为阳性的为4份，1份为TP17、TP45条带，2份为TP45、TP47条带，1份为TP32、TP45、TP47条带。这是由于CLIA包被的梅毒抗原特异性导致的，而TPPA采用的抗原是提纯后的致病性梅毒螺旋体菌体，对TP15、TP17、的抗体选择性较强，当仅有TP15、TP17抗体时，TPPA只会出现阴性。有研究发现梅毒早期诊断的指标之一为TP47 [15]，活动期梅毒标志的抗体之一是TP15 [16]。因此推测，9份抗体梅毒标本可能属于早期感染或隐性感染的患者，在早期或隐性梅毒感染中的检测CLIA法比TPPA具有更高的灵敏度。
综上，CLIA作为一种新开发的梅毒抗体检测试剂，相比TPPA具有非常明显的优势，且容易操作、自动化技术高、结果判断准确且重复性较好等优势，有望成为临床上广泛使用的一种方法。
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【关键词】 ARCHITECT—i2000SR；梅毒螺旋体特异性抗体；性能评价
i2000SR运用的是化学发光微粒子免疫检测法，它能对多项免疫项目进行定性或定量分析。由于在不同的运行环境下相同仪器有可能出现性能差异，本科新仪器投入临床使用前要对该仪器检测系统中的进行性能评价。
1 材 料
1.1 仪器 ARCHITECT—i2000SR全自动免疫分析仪。
1.2 试剂 原装配套试剂盒。
1.3 标本 2012年本院的住院或健康体检者。
2 方 法
2.1 空白实验 使用PBS作为样本测定三次，记录结果。
2.2 精密度 ①日间精密度：使用高、中、低质控品连续测定15天，计算CV值。②批内精密度：使用高、中、低3个水平的血清重复测定15次，计算CV值。
2.3 线性范围 收集略高于线性范围下限的低值血清（L）和略低于线性范围上限的高值血清（H），按5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L梯度进行混合并检测1，对不同浓度的实测值与预测值进行线性回归分析。
2.4 污染携带率 先取一份H值标本，连续测定3次，随后立即取一份L值标本连续测定3次：携带污染率=（L1—L3）/（H3—L3）×100%。
2.5 参考区间验证 按照NCCLS2推荐的要求进行验证，选择经体检排除其他疾病的正常血清标本男女性标本各20名，观察检测结果是否在参考范围内。
3 结 果
3.1 精密度试验结果 高、中、低3个水平血清的批内精密度CV分别为5.54%、7.04%和3.54%，用厂家配套低、高水平质控品测定结果的批间精密度CV分别为8.92%及6.69%，均小于10%。
3.2 空白试验结果 PBS三次结果分别为0.01、0.02和0.01。
3.3 线性试验结果 Y=0.9963X+0.0029，相关系数R2=0.9965。由结果可知，仪器的线性良好，达到说明书的要求。
3.4 携带污染率 携带污染率为0.29%
3.5 参考区间验证 经过验证，检测值均落在厂家给定的参考范围之内，符合率为100%。
4 讨 论
近年来全自动免疫化学发光仪在梅毒特异性抗体定量检测中的应用逐渐受到重视，i2000SR采用微粒子化学发光免疫技术定量测定梅毒特异性抗体。为保证检验质量，实验室对新装的仪器在用于检测临床标本前都应该要做性能评价。通过性能评价发现，该仪器检测梅毒螺旋体特异性抗体的空白试验良好；批内精密度和日间精密度均小于10%，试验表明仪器测定结果稳定，能满足临床应用的要求；通过线性范围的验证发现仪器在厂家给定的范围内线性良好、能满足临床要求；标本的携带污染率低，证明该仪器的自动冲洗管道能力强，能够有效控制交叉污染3；对参考区间的验证结果都在仪器说明书给出的参考范围内。
总之，通过对ARCHITECT—i2000SR全自动免疫分析仪是临床实验室较理想仪器。
参考文献
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篇8
【摘要】 将磁性微粒与抗体的偶联，通过优化偶联条件提高了偶联效率，制备了高灵敏度的磁微粒生物探针；采用3(2螺旋金刚烷)4甲氧基4(3邻氧酰苯基)1，2二氧杂环丁烷(AMPPD)碱性磷酸酶(ALP)化学发光体系，建立了化学发光磁酶免疫检测方法；对检测方法进行了优化和改进，提高了系统的灵敏度和检测速度，并对HCG样品进行相关检测。结果表明，HCG浓度在0.15～150 IU/L范围内，光强随HCG浓度增大而增加，两者之间线性关系良好，相关系数r为0.960；检出限可达0.15 IU/L; 相对标准偏差(RSD)小于5％; 检测总时间少于1 h。本方法可以应用于其它免疫分子的检测，在临床免疫检测方面具有广阔的应用前景。
【关键词】 化学发光，磁性微球免疫分析，人绒毛膜促性腺激素
Abstract A highly sensitive magnetic enzymelinked chemiluminescent immunoassay method was developed for the detection of human chorionic gonadotropin(HCG). The monoclonal antibody was covalently coupled on the surface of carboxylated magnetic beads to generate magneticbiotargeting; Alkaline phosphatase(ALP) was utilized as a labeled reagent of another monoclonal antibody， whereas 3(2spimadamantane) 4methoxy4(3phosphoryloxy)phenyl1，2dioxetane(AMPPD) was utilized as the chemiluminescent substrate. Based on this concept， a highly sensitive chemiluminescent immunoassay method was established to test HCG. Then， several modifications were made to optimize the method， and the detection sensitivity and procedure were improved accordingly. The detection of the assay could be fulfilled within 60 min and the test result of HCG concentration was linear over the range of 0.15 150 IU/L with good relativity(r=0.960). The relative standard deviation(RSD) were below 5% and the sensitivity of this method was 0.15 IU/L. The proposed method with wide linear range， simple operation and fast detection showed good prospect in practical application onsite.
Keywords Chemiluminescence， magnetic immunoassay， human chorionic gonadotropin
1 引 言
人绒毛膜促性腺激素(HCG)是由滋养叶层的合体滋养细胞分泌的一种糖蛋白激素，存在于孕妇的血液、尿、初乳、羊水和胎儿体内，对维持正常妊娠有重要意义[1，2]。妇女怀孕后，HCG浓度会按一定规律变化。医生可根据异常情况判断是否先兆流产、异位妊娠、葡萄胎等。某些妇产科疾病、术后治疗过程等都需要跟踪HCG指标变化[3]。目前，临床诊断中HCG检测方法有放射免疫分析[4]、电化学免疫分析[5] 、荧光免疫分析和化学发光免疫分析等[6，7]。其中化学发光磁酶免疫分析法将磁性分离技术、化学发光检测技术与免疫学方法三者相结合，综合了化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快以及免疫法的特异性高、准确性好等优点，还利用了磁性微粒在磁场可控运动的特点，可实现待测物的快速富集，具有更快的检测速度[8，9]。国外已经相继开发出了基于化学发光磁酶免疫分析法的试剂盒，成功地应用于多种免疫分子的临床检测，但试剂价格昂贵，其配套装置也多为大型检测仪。
本研究将磁酶免疫与化学发光的高灵敏度优势相结合，利用3(2螺旋金刚烷)4甲氧基4(3邻氧酰苯基)1，2二氧杂环丁烷(AMPPD)碱性磷酸酶(ALP)化学发光体系，建立了HCG化学发光磁酶免疫检测方法。其中发光底物AMPPD是一种新型二氧杂环丁烷类化学发光试剂，可在碱性磷酸酶（ALP）的催化下发光。与传统的化学发光试剂相比，性能稳定，几乎无背景干扰，试剂存放时间较长，具有极高的检测灵敏度[10]。磁性纳米材料经过相应的化学修饰后，将一种抗体结合到固相载体磁性微粒上作为捕获抗体，将另外一种抗体用碱性磷酸酶（ALP）进行标记，加入待测物后，发生免疫反应，形成双抗体夹心物。利用磁分离技术，经过清洗去除多余抗体后，加入底物AMPPD，根据发光强度检测待测物的量。本研究优化和改进了磁性微粒与抗体的偶联和免疫分析条件，可以采用本实验室自制的小型微弱光检测仪[11]进行检测，成功实现了对HCG的快速、灵敏检测。
本方法也可应用于其它免疫分子的检测，在临床检测方面具有良好的应用前景。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
F4500荧光分光光度计（日本Hitachi公司）； 尼康TE2000U荧光显微镜（日本Nikon公司）；磁分离架（天津倍尔乐生物公司）；JQ1型免疫反应振荡器（上海强运科技有限公司）。
HCG抗原（青岛康原药业）；抗HCG抗体（杭州隆基生物有限公司）；碱性磷酸酶标记抗HCG抗体（ALPHCG）； AMPPD（福建波生生物有限公司）；羧基末端磁性微球（粒径3 μm，陕西北美基因股份有限公司）；碳二亚胺（EDC）、甘氨酸（上海共价科技有限公司）；牛血清蛋白（BSA）、乙磺酸（MES）和土温20（Tween20）均购自北京欣京科生物技术有限公司；0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.4），0.1 mol/L乙磺酸缓冲液（MES， pH=6.0），清洗液PBST（0.1 mol/L PBS， 0.1% Tween20， pH=6.5），保存液（0.1 mol/L PBS， 1% BSA， pH=7.4）均由实验室配制；实验用水均为去离子水；其它试剂均为分析纯。
2.2 实验方法
2.2.1 羧基末端磁性微球与抗体的偶联
取羧基末端磁性微球1 mg，置于磁分离架上2 min，弃去上清液；加入PBS缓冲液 400 μL，吹打均匀，置于磁分离架上分离，弃去上清液，如此清洗2次。清洗完毕后，加入6 g/L EDC溶液(pH 6.0) 400 μL进行磁性微球活化，吹打均匀后，置于振荡器上，反应30 min。然后加入抗体进行偶联，向活化后的磁微粒中加入1 g/L抗体溶液400 μL，置于振荡器上反应6 h；偶联完成后，加入1 mol/L 甘氨酸400 μL封闭磁性微球表面的活性基团，混匀后，置于振荡器上反应30 min；加入PBST缓冲液 400 μL，吹打均匀，置于磁分离架上分离，弃去上清液，如此清洗2次；最后加入1 mL保存液，混匀后置于4 ℃备用。
2.2.2 偶联效率的检测
为了考察偶联条件对偶联效果的影响，本研究采用荧光素标记的抗体作为捕获抗体与磁性微球进行偶联。首先利用F4500对偶联抗体的激发光与发射光进行分析，获得光谱特性。然后将配置不同浓度的偶联抗体，利用F4500进行荧光光强检测，求得抗体浓度与光强的线性关系。依照上述偶联方法进行抗体偶联，抗体偶联完毕后，取上清液检测其荧光光强；将光强值代入求得的线性方程中，可求得上清液的抗体浓度。由于偶联时加入的抗体浓度已知，据此可以求得偶联到磁性微球上的抗体的量，计算抗体的偶联效率。
2.2.3 化学发光光强的检测
采用了实验室自制的微弱光检测仪[11]进行检测，将发光底物与酶混合后加入微量光学反应池中，光强信号通过弱光采集模块被放大并转化为电信号输出。电信号与光强信号成正比，可以作为光强输出值进行分析。
2.3.4 HCG样品的检测
取50 μL羧基末端磁性微球抗体复合物加入150 μL HCG溶液，再加入70 μL碱磷酶标记的抗体，37 ℃反应20 min；将反应产物置于磁分离架2 min，弃去上清液；然后加入去离子水250 μL，吹打均匀，置于磁分离架2 min，弃去上清液，如此清洗2次；加入100 μL 0.01 mol/L Na2CO3溶液，再加入50 μL AMPPD，混匀后置于微弱光检测仪中检测光强。
3 结果与讨论
3．1 羧基末端磁性微球与抗体偶联
偶联体系pH的选择 本研究采用羧基末端磁性微球作为捕获抗体的固相载体，以碳二亚胺EDC为缩合偶联剂，使磁性微球表面的羧基与蛋白质的氨基脱水形成酰胺键，从而实现抗体与磁性微球的偶联。EDC是一种化学性质非常活泼的双功能试剂，受反应体系的pH值影响较大。
实验采用MES缓冲液，加入不同浓度的K2CO3或HCl调节偶联反应体系的pH，研究体系pH对偶联效率的影响，结果如图1曲线a所示。结果表明，偶联体系在pH=4时，偶联效率6 时，偶联效率开始降低。因此，本实验中反应体系的pH值为6。
3．1．2 偶联时间的影响
在其它条件不变的情况下，进行磁性微球与抗体偶联，然后在不同时间终止反应，研究反应时间对偶联效率的影响，结果如图1曲线b所示。结果表明：随着时间的增加，偶联效率不断增加，在0～2 h内，偶联效率从0迅速增长到50%；2～6 h时偶联效率从50%迅速增长到70%，增速变缓；反应6 h后，反应趋于平衡，偶联效率基本保持不变。因此偶联时间选择6 h，这样既保证偶联效率较高，又避免了反应时间过长造成抗体失活。
3．2 HCG检测实验条件的优化
3．2．1 化学发光检测时间的选择
取0.1 μmol/L AMPPD 50 μL，加入100 μL 3 mg/L ALPHCG(pH=9.5)，于检测皿中进行发光强度时间扫描(图2)。结果表明，光强随反应时间的延长逐渐升高，0～30 min内化学发光光强随时间的延迟而不断增长，这是因为ALP催化AMPPD发光过程分为两个阶段：首先，AMPPD在ALP的催化裂解下脱去1个磷酸基，得到1个阴离子AMPD，然后AMPD经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时会产生光子，而AMPD在一定环境下有2～30 min的半衰期；当反应30 min时光强基本稳定，继续延长时间，光强基本保持不变。因此，为了提高检测速度，检测时间选择30 min较理想。
3．2．2 羧基末端磁性微球量的选择
取50 μL ALPHCG，150 μL 150 IU/L HCG溶液，然后加入不同量的羧基末端磁性微球抗体复合物进行孵育后，清洗3次，然后加入发光底物检测发光光强，研究羧基末端磁性微球浓度对发光强度的影响，结果如图3所示。结果表明，磁微球量为20 μg时，捕获抗体浓度较低，免疫反应效率低，最终产物发光强度较低。随着磁性微球量的增加，发光强度迅速增加。当磁微球的量达到50 μg时，发光强度达到最大。磁微球悬浊液会吸收穿过溶液的光，浓度越高吸收得越多，磁微球的量超过50 μg后，发光光强开始减弱。因此，为保证检测时的发光强度，实验中选择磁性微球的量为50 μg。
3．2．3 ALPHCG浓度的影响
取50 μg羧基末端磁性微球抗体复合物，加入75 IU/L HCG溶液150 μL，然后加入不同浓度的ALPHCG进行孵育后，清洗3次，然后加入发光底物检测发光光强，研究ALPHCG浓度对发光强度的影响，结果如图4所示。结果表明，当反应体系中无ALPHCG时，发光强度为零，随着ALPHCG浓度的增加，发光强度迅速增加。当ALPHCG浓度高于7.5 mg/L，发光强度增加趋于平缓。考虑到检测试剂的成本，实验中选择ALPHCG的浓度为7.5 mg/L。
3．3 HCG检测结果
3．3．1 HCG样品检测
用PBS溶液对HCG原液进行梯度稀释，形成不同浓度的HCG溶液；在最优化的配比和检测条件下，对0.15～150 IU/L的HCG样品进行检测得知，HCG浓度与检测发光强度呈线性关系。线性回归方程为：y=6.455x+122.36，相关系数r＝0.960。检出限可达0.15 IU/L，每个样品测定总时间少于1 h，可以满足对微量HCG进行快速灵敏检测的需求。
3．3．2 重现性
对75 IU/L HCG溶液连续检测6次，检测结果的相对标准偏差为4.9%（见表1），说明本方法重现性良好。结果表明，本方法操作简便、灵敏度高，检测速度快，适用于检测血清中的HCG。表1 系统重现性测试结果（略）
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篇9
【关键词】发光；功能化；纳米材料
纳米材料在实际应用中，其主要特点是比表面积大、化学反应活性强以及具有良好的尺寸效应，能够和生物体产生特殊的相互作用。在生物标记以及分析检测中则主要是作为生物探针应用，同时纳米技术、生物技术以及分析技术的良好结合，也进一步促进了功能性纳米材料的发展及应用。本文则从发光功能化角度，对纳米材料的发展及应用探讨。
1纳米材料在电化学和电化学发光生物传感中的应用
其中将CdTe量子点作为标志物的免疫传感器，能够同时测定人IgG抗原作为模型蛋白的荧光及电化学。首先借助于聚阳离子电解质PDDA能够在导电玻璃上将金胶纳米粒子在ITO芯片上被成功吸附，之后在金胶纳米离子上固定羊抗人IgG抗体，再实施封闭处理之后芯片则能够和检测出现抗原反应，并和量子点标记的鼠抗人IgG抗体反应。在以上反应结束后可以进行荧光及电化学方式检测。其中电致化学发光则是有效结合电化学和化学发光的检测方法，应用也比较广泛。量子点特点则为荧光特性独特以及生物相容性好，在其应用过程中将硫基乙酸作为稳定剂，则能够成功合成水溶性Cds纳米晶体。在对进行分析过程中，发现水溶液中会出现电致化学发光行为。采用自组装方式和纳米金放大技术相结合，在金电极上修饰Cds纳米晶，则能够构建新型ECL免疫传感器，主要是在低浓度脂蛋白检测中应用。这一材料在实际应用中具有良好的电化学发光以及生物相容性，能够进一步构建量子点电化学发光免疫传感器，主要应用在人免疫球蛋白灵敏性检测工作中。
2纳米材料在聚合物电致发光中的应用
聚合物电致发光在应用中主要优势为：主动发光，并且效率高、宽视角、能耗低、厚度小、操作简单等等，在照明及平板显示领域中具有良好的应用发展前景，目前已经在全世界科学界及工业界得到普遍关注。聚合物电致发光二极管的首次研究则是在1990年，英国机剑桥大学首次报道关于聚对苯乙烯的聚合物电致发光二极管，在采用溶液法将聚合物前驱体进行成膜之后，放置在2500C真空高温环境中进行处理，最终为均匀、致密的PPV薄膜，器件的阴阳极分别是Al和ITO，在＜14V电压环境下则能够实现外量子效率0.05%黄绿光发光。PPV则属于是难溶性共轭聚合物，在其处理过程中一定要选用前驱体方式进行旋涂成膜，在操作过程中工艺复杂，同时薄膜质量也比较差。在1991年美国加州大学则提出可通行的甲氧基异辛氧基对聚对苯乙烯进行取代，能够在ITO上旋涂MEH-PPV溶液成膜，从而实现发光层，即将金属Ca作为阴极则能够得到1%橘红色发光二极管，这一工艺在操作中简单，同时具有高发光率聚合物电致发光二极管。1992年则进一步采用柔性塑料基底则可弯曲聚合物电致发光二极管，从而呈现出聚合物电致发光二极管最为迷人一面。在近些年来，世界对聚合物电致发光材料及期间的研究一直都比较重视，并取得显著进步，但是就目前而言不管是聚合物电致发光器件稳定性还是效率上均还有进步空间，因此还需要进一步加大研究。
3纳米材料在化学发光免疫分析中的应用
化学发光免疫分析则是化学发光法和免疫分析法两者的结合产物，在纳米技术迅速发展进程中，纳米材料的无机有机自组装复合研究也发展迅速。其中在研究过程中将纳米材料作为新型免疫标记物，和高效液相色谱分析法、分子印迹法以及毛细管电泳分析法等一系列现代分离技术及分析方法相结合，则能够有效构建具有良好灵敏度及特异度的纳米材料化学发光免疫分析法，不但能够广泛应用在药物检测中，同时也能够应用在蛋白质、DNA以及疾病病原体等一系列检验中。同时在研究过程中纳米标记探针的出现，则进一步让人们在纳米尺度上分析及检测生命机体痕量物质，在生命活动机理以及疾病早期诊断预防中均具有重要应用价值。和纳米材料在鲁米诺体系化学发光免疫反应中的参与作用具有差异，其应用则可以将其分成：催化增敏型、标记溶出型、能量受体型以及负载平台型四种，不同类型均具有不同作用。
4结语
具有发光功能化的纳米材料的研究越来越全面深入，在此过程中我们能够发现在纳米材料及其技术发展进程中，不管是药物、医学，还是食品以及环境等领域，化学发光免疫分析法已经广泛应用在有机物和无机物微量及痕量分析工作中。在化学发光免疫分析法中，纳米材料的参与作用则是高效催化剂，不管是纳米生物探针还是量子点荧光剂等方面均具有广阔应用前景。同时在其发展进程中和一系列现代分析技术结合应用之后，则能够对化学发光分析方法的灵敏度、稳定性以及选择性显著提升，同时还能够进一步扩大其检测方法的应用范围。同时在采用以上一系列方法制成的化学发光分析仪，具有良好的自动化水平，同时操作简单，能够有效实现实时监测，特别是在环境监测、医学监测以及食品安全监测等方面具有良好的应用前景，也有助于进一步促进化学发光免疫分析法的研究及发展。以上本文关于发光功能性纳米材料的应用有简要分析，以能够为同行工作研究者提供一定的参考资料，
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篇10
关键词 石英毛细管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析
1 引 言
随着我国医疗卫生事业的快速发展和人们对健康保健的日益重视， 社会对实用性的检测技术需求越来越多， 体外诊断的新方法、新技术已成为生物分析检测的热点和重点研发方向。目前， 低成本、操作简便、小型化的体外诊断方法和装备的研究正受到科研机构和医疗检测市场的广泛关注。
现有的体外诊断产品中， 免疫检测类产品占比很大， 主要采用酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光法、放射免疫法以及胶体金免疫层析法[1～3]。前两者以微孔板为检测载体， 技术较成熟， 但检测时间较长， 一般需要2～3 h； 电化学发光法主要基于磁珠捕获抗原进行检测， 检测速度快， 一般可在30 min内完成， 但检测成本较高， 约为酶联免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫检测灵敏度高， 但对操作环境及操作人员要求很高； 胶体金免疫层析检测速度快， 可实现现场检测， 但难以实现定量分析。近年来， 一些学者报道了基于纳米材料及微流控技术的新型体外免疫诊断方法， 但纳米材料的制备较难控制其稳定性， 真正实现临床应用的并不多见[4，5]。本课题组多年从事毛细管电泳生物医药分析研究， 所用的分离载体是熔融石英毛细管， 其性质稳定， 透光性好， 表面易进行物理、化学修饰， 加工工艺成熟， 成本低廉[6～10]。本实验将熔融石英毛细管用于免疫检测的载体材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫检测方法， 目的是实现基于石英毛细管材料和灰度分析的定量免疫检测。传统的化学发光免疫分析检测器大多采用光电倍增管， 检测区域有限， 分析速度慢， 而以电感耦合器件（CCD）为代表的图像传感器则可以提供更加广泛的检测区域， 具有光电转换效率高、动态线性范围宽、多通道同时分析等优点， 成为未来生物传感器的一个发展方向[11，12]。实验中使用的便携式化学发光成像仪采用制冷CCD， 灵敏度高， 体积小， 仅有0.006 m3， 能够高效捕获化学发光信号， 形成图片。灰度是指黑白图像中点的颜色深度， 灰度分析法具有结果直观， 分析快速等优点， 在生物学、医学、图像识别领域有广泛的用途[13]， 很多体外诊断试剂的检测应用也采用灰度值分析方法[14]。
本研究以熔融石英毛细管为载体， 建立了基于灰度分析的免疫检测方法。以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白， 通过双抗体夹心方式进行检测， 与抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光底物液发光， 产生的光信号通过成像仪转化为图片[12，15，16]， 进行灰度值分析。研究结果表明， 毛细管免疫检测和灰度分析结合， 实际使用的样本量仅为0.8 μL， 而ELISA检测一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了样本使用量。检测过程中仅需石英毛细管、医用注射器等常用耗材， 操作简单， 不依赖大型仪器。所建方法具有普适性， 可用于基于化学发光免疫分析的生物标志物的快速检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂：
便携式化学发光成像仪（国家纳米科学中心研制）； 熔融石英毛细管（北京华阳利民仪器有限公司）； 医用注射器（北京科龙生物医学技术有限公司）； 表面活化剂（美国Anteo Technologies公司）； 磷酸盐缓冲液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德国Merck公司）； AFP捕获抗体、AFP的HRP酶标抗体及AFP标准液（北京科跃中楷生物技术有限公司）； 癌胚抗原（CEA）标准液、前列腺特异性抗原（PSA）标准液、糖类抗原125（CA125）标准液及糖类抗原199（CA199）标准液（北京沫之东生物技术有限公司）； 化学发光底物液（美国Millipore公司）； 实验用水由Millipore纯水仪制备。
2.2 分析方法
2.2.1 实验操作步骤 实验步骤如图1所示：（1）活化毛细管 将毛细管裁剪为10 cm长， 使用医用注射器将表面活化剂注入毛细管， 室温静置30 min， 对毛细管内壁进行活化后， 用水冲洗。（2）固定捕获抗体及封闭 将AFP的捕获抗体按照一定比例用PBS稀释， 将稀释液注入毛细管内部， 室温静置1 h后再用PBS清洗， 将含5% BSA的PBS溶液注入毛细管中， 室温静置30 min进行封闭。（3）注入待测蛋白 将待测蛋白AFP溶液注入到毛细管， 室温孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶标抗体及化学发光底物液 将稀释为一定浓度的HRP酶标抗体注入毛细管， 室温孵育30 min， PBS冲洗后注入化学发光底物液。
2.2.2 成像分析 将化学发光信号转化为图片形式， 进行成像灰度分析。毛细管置于成像仪中， 选择一定的曝光时间， 检测化学发光信号。毛细管中的化学发光底物在酶标抗体上HRP酶的催化作用下产生的光信号转化为图片。图片上的灰度值表示待测蛋白AFP抗原的浓度。通过ImageJ软件分析图片， Origin 8.0软件处理数据。
3 结果与讨论
3.1 毛细管内径对检测的影响
市售毛细管有多种内径， 考察了不同内径毛细管对检测的影响。毛细管内径不同， 可提供抗体结合的位点面积不同。内径较小的毛细管， 可节省样品， 但内壁表面积较小， 可吸附的捕获抗体的量较小， 因而后续可结合的抗原以及酶标抗体也较少， 故化学发光信号较弱， 灰度低， 不利于灵敏检测。较大内径的毛细管所提供的内壁表面积大， 可吸附的捕获抗体量增加， 可结合的抗原及酶标抗体也增加， 化学发光信号增强。考察了50， 75， 100， 150和200 μm内径的毛细管， 分别检测相同浓度的AFP， 比较其灰度强度。结果表明， 灰度强度所指示的化学发光信号与AFP浓度呈正相关（图2和图3）。灰度照片和灰度强度均显示毛细管内径对AFP检测有明显影响。使用50 μm毛细管， 灰度强度较弱； 内径增加到75 μm， 灰度强度增大； 使用100 μm内径毛细管， 灰度较强且均匀； 当内径大于100 μm时， 信号强度降低， 且在横截面方向上信号分布不均。理论上， 大内径的毛细管可提供的内壁表面积大， 可吸附的捕获抗体量多， 可结合的抗原及酶标抗体也多， 可使信号线性增强， 直至趋于饱和。然而由图2可见， 150 μm内径时信号不均。 可能是由于与拍摄方向相切的内壁上下沿区域光程较长， 出现内壁上下沿信号较强， 中部信号偏弱的现象。灰度信号不均匀不利于准确分析， 且增加了各种试剂和样品用量。因此， 实验选择内径100 μm的毛细管。
3.2 免疫分析的条件优化
3.2.1 捕获抗体浓度 捕获抗体在毛细管内的固定效果很大程度上决定了检测的灵敏度。通常捕获抗体在毛细管内壁的密度越高， 检测灵敏度越高， 但过高浓度的捕获抗体， 会造成过饱和， 浪费抗体试剂。本实验中， 固定AFP浓度和酶标抗体浓度， 对捕获抗体浓度进行优化， 将所购的捕获抗体稀释， 稀释倍数为25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比较检测的灰度值。当捕获抗体的稀释倍数为150， 200， 250和300倍时， 随稀释倍数增大， 溶液浓度降低， 灰度值即化学发光信号逐渐减小， 说明溶液中的捕获抗体浓度偏低， 固定到毛细管内壁的捕获抗体量较少， 不能充分结合抗原， 故化学发光值随稀释倍数增大而降低， 灰度值减小； 当稀释倍数为50和25倍时， 捕获抗体的浓度因稀释比例小而保持较高的水平， 但其化学发光信号却与捕获抗体稀释100倍时相当， 并未增强， 说明当捕获抗体稀释倍数为100时， 灰度值即化学发光信号趋于饱和， 增加浓度不再使抗体在毛细管内壁的分布密度增加， 且当稀释倍数为100时， 结合到毛细管内壁上的捕获抗体能够完全结合抗原。因此， 选择稀释100倍为捕获抗体最佳的稀释比例（图4）。
3.2.2 酶标抗体溶度
酶标抗体的浓度也直接影响检测结果。如果酶标抗体浓度偏低， 不能与抗原充分结合， 就会造成实际检测信号值偏低。如果酶标抗体浓度偏高， 虽然反应充分， 但是可能浪费试剂。实验中， 固定捕获抗体稀释倍数和AFP抗原浓度， 对检测抗体浓度进行优化。将所购的酶标抗体稀释， 稀释倍数为100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比较不同稀释浓度的灰度值。结果表明， 酶标抗体稀释倍数为250， 300， 350倍时， 随稀释比例增大， 酶标抗体浓度降低， 灰度值即化学发光信号逐渐减小， 说明酶标抗体浓度偏低， 反应不充分； 稀释倍数为150和100倍时， 酶标抗体浓度随稀释比例减小而增大， 但灰度值与稀释倍数200时相比未见增加。说明稀释倍数为200时， 灰度值趋于饱和， 抗原抗体结合较为充分。因此， 酶标抗体最佳的稀释倍数为200倍。
3.2.3 孵育时间
孵育时间是免疫检测的重要参数。如孵育时间过短， 反应进行不充分， 影响检测的灵敏度。若孵育时间过长， 则耗时过长。本实验对孵育时间进行优化。室温下， 将AFP抗原及AFP酶标抗体的孵育时间分别设定为5， 15， 30， 60和90 min， 比较灰度值变化。结果表明， 孵育15 min 的灰度值即化学发光信号比孵育5 min时明显升高， 说明5和15 min的孵育时间偏短， 反应尚不充分； 孵育时间设为30， 60和90 min时， 灰度值没有增加。说明孵育时间为30 min时， 灰度值趋于饱和， 免疫反应较为充分。因此， 选择最佳孵育时间30 min（图5）。
3.2.4 曝光时间优化 曝光时间是化学发光免疫检测的重要参数。曝光时间过长， 会造成高浓度AFP检测信号过饱和； 曝光时间过短， 会造成低浓度AFP检测信号微弱， 都不利于图像分析， 因此有必要对曝光时间进行优化。固定捕获抗体及酶标抗体浓度， 对高浓度（100 ng/mL）和低浓度（3 ng/mL）的AFP分别进行检测， 曝光时间为5， 10， 15， 20 和25 s， 选择同时满足高浓度和低浓度AFP抗原检测的合适曝光时间。当曝光时间为15 s时， 3 ng/mL AFP抗原灰度值较弱， 无法进行图像分析， 增加曝光时间， 灰度值增加。当曝光时间为25 s时， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出现过饱和， 不利于分析。因此， 20 s为最佳曝光时间， 能够满足检测需求。
3.3 灰度分析的标准曲线
选择3.1～50 ng/mL浓度范围的AFP样品溶液， 测定其灰度值。 灰度值Y与AFP浓度X的关系为：
Y=
42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2
式中， X的单位为ng/mL。Y与X二者呈现较好的线性关系（图6）， R=0.992。稀释AFP样品， 通过灰度分析， 测定方法的检出限为2.7 ng/mL。
在目前的临床检验中， 只有当AFP浓度超过20 ng/mL时， 该结果才具有一定的临床诊断意义[17，18]。本方法对AFP的检测范围在3.1～50 ng/mL之间， 为进一步临床应用奠定了基础。
3.4 检测特异性
特异性是评价免疫检测的重要指标之一， 通常用交叉反应率表示。实验中， 分别在血清加入中可能存在的干扰物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳条件下测定。结果表明， 交叉反应率均小于0.5%， 说明上述潜在的干扰组分对检测结果影响小， 方法的检测特异性好[19]， 抗干扰能力强。
3.5 检测准确性
评估体外诊断试剂准确性的方法主要有方法学比对和回收实验两种。方法学比对是将两种不同的检测体系所得结果进行比较， 在临床化学文献报道中较为常见[20～22]。将本方法与目前大型医院广泛使用的Roche电化学发光方法进行方法学比对。实际临床样本来源于总医院， 使用采血管收集人全血， 在室温中沉降30 min后， 3000 r/min离心5 min， 收集上层血清， 4℃储存备用。获取的20例血清样本分别采用两种方法进行分析检测， 结果见图7。两种方法的线性回归方程为y=0.148+11095x， R=0.980， 说明两种方法的相关性良好， 本方法具有较高准确性， 能够满足临床检测要求。通过回收实验评价本方法的准确性。选用3份人血清， 在最佳实验条件下测定其AFP浓度， 然后分别向血清中加入AFP标准液， 再次测定其AFP浓度。重复5次， 计算得回收率在96.0%～106.7%之间（表1）， 说明本检测方法的准确性较好[20]。
4 结 论
以熔融石英毛细管为免疫分析载体材料， 通过化学发光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析检测方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 浓度范围实现甲胎蛋白检测， 覆盖了临床应用的关键浓度， 为本方法的进一步临床应用奠定了基础。基于毛细管为载体的灰度分析免疫检测方法的样本消耗少、载体材料简单、检测成本低廉， 且不依赖大型仪器， 适用化学发光免疫分析， 具有普适性和较好的临床检验应用前景。
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