免疫组化范文

导语：如何才能写好一篇免疫组化，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

关键词：免疫组化；水产品；分析

中图分类号：F40 文献标识码：A

随着免疫组化技术在临床病理诊断中的不断深入和广泛应用，我们也在试图将它运用到更多领域的研究中，本文作者主要从事的就是水产动物内源性蛋白酶的免疫组化研究。由于免疫组化技术是一个复杂的生物技术，实验操作步骤也较繁琐，诸多的因素都可以影响到最终的染色结果，其中只要一步有问题就会影响最终结果的判定。笔者结合从事免疫组化研究以来的实践经验谈一下关于水产动物免疫组化的经验和体会，希望能对从事相同研究的同行有所帮助。

1 做免疫组化载玻片的准备

选用高质量的玻璃片作为免疫组化的载玻片，载玻片在使用前一定要用强酸洗液进行浸泡，之后用大量的蒸馏水冲洗干净，再用无水乙醇清洗一遍，之后用双蒸水冲洗干净，烘干后要经APES处理后使用，这样可以防止后续的处理过程中组织切片的脱落。载玻片的处理也是免疫组化中较为基础的一步，如果处理不好，最后的组织切片上会有黑点或其他不干净的东西，从而影响最终免疫组化染色切片的质量。

2 组织的取材和固定

组织的取材要根据自己的实际需要自行决定，不宜过大或者过小，因为免疫组化后续的处理过程中有高温加热抗原修复的步骤，所以组织取材不宜过大，约为0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm较为适宜，否则后续处理中组织块很容易脱落，造成后续的染色步骤无法正常进行；但是取材也不宜过小，否则显微镜下视野太小，不利于结果的判定。取材后的组织要及时的进行固定，同时还要选择适当的固定液，固定液的浓度和pH值也要把握好，我们一般选用的是10%的中性甲醛作为固定液，不恰当的固定液浓度会使组织的抗原性降低甚至消失，从而影响抗原的表达，导致检测不到阳性结果。同时，固定时间也要掌握好，时间的长短也会影响组织的抗原性。此外，固定不当还会影响到组织细胞的通透性，不利于后续染色中抗体的进入，适宜的固定时间一般是12-24小时。固定过程中还要确保组织块都浸没在固定液中。

3 石蜡切片的脱蜡处理

要想得到一张高质量的免疫组化染色切片，脱蜡处理也是其中较为关键和基础的一步。首先要在60℃下进行烤片30min，使石蜡融化，然后迅速放入60℃预热的二甲苯中，但是实践经验表明，有时在规定的温度和时间条件下，石蜡并不能很好的融化，此时要延长脱蜡时间或适当提高烤片温度，使石蜡能很好的融化，而且脱蜡的效果和室温也有很大的关系，冬天脱蜡时间相对就要长些，而夏天就可以适当短些。脱蜡后的组织切片如果发白，则说明脱蜡不彻底，这样会造成最终的免疫组化染色结果的背景过深，非特异性染色严重，影响结果的判定。

4 抗原修复

在免疫组化操作的整个过程中，抗原修复是其中一个极其关键的步骤，它的好与坏直接影响到最终结果的可靠性和真实性。由于组织经过中性甲醛或其他固定液固定和石蜡包埋后，组织内部的氨基酸残基容易形成分子内或分子间的醛键，使得抗原决定簇被封闭，抗原与抗体的结合位点减少，从而使抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。

抗原修复就是采用加热修复或高温高压的方式打破抗原决定簇之间的交联结构，使抗原决定簇重新暴露出来，以便更好的和抗体进行结合，从而提高免疫组化染色结果的阳性率。一般采用的是加0.01M，pH6.0的柠檬酸盐缓冲液，微波炉内进行抗原修复，但是微波火力要控制好，否则容易造成组织切片的破碎和脱落。个人经验认为，对于含肌原纤维较多的水产动物组织来说，微波火力可以适当高些，用中高火20～30 min即可，组织切片还可以保存的较完整；但是对于含胶原纤维较多的水产动物组织来说，由于组织比较脆弱，所以微波火力要适当降低，即先用中高火加热至微沸，之后要改用中火或中低火，时间也要减短，大概10-15 min即可。需要注意的是，加热过程中溶液不可沸腾，发现液体里有大量气泡产生应立即停止加热，稍冷片刻再继续加热。

5 抗体的稀释和保存

对于每一批新进的抗体，都应该按照厂家提供的建议稀释度，进行成倍稀释的预实验，如果厂家建议稀释度为1：50～1：100，那实验就要进行1：20，1：50，1：100，1：200的梯度实验，最终确定实验应选用的最适浓度。抗体的稀释要选用组织切片各步的清洗中的所用缓冲液进行稀释，而且要保持pH值的稳定，这样可以使抗体处于一种缓冲的状态中，更有利于抗原抗体的结合。抗体最好是现用现配，稀释后的抗体最好一次用完，而且不能反复冻融，因为这样会使抗体的效价降低，影响最终的免疫组化染色结果。

6 DAB显色

DAB显色剂的浓度和显色时间也是影响免疫组化染色结果的一个很重要的因素，浓度过高或时间过长都会使组织切片的背景加深，甚至造成假阳性结果。显色不宜过快或过慢，一般以5-10min为宜。显色时间太短（如几秒或几十秒），很可能说明抗体浓度过高或者抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短孵育时间，也可能是前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；显色时间太长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，说明抗体浓度太低或孵育时间太短，也可能是封闭时间过长。

DAB显色剂最好也是现用现配，稀释用的缓冲液要在4℃进行存放，而溶液A和溶液C要在-20℃避光保存，现配的DAB显色剂应该为无色或浅棕色，如果颜色过深，就不可以再使用了，应重新配制或检查药品是否存放不当或者是否过期等。

结语

综上所述，免疫组化操作虽然步骤繁多，其中的影响因素也较多，但是只要把握好以上几点，出现问题能够及时有效的解决，就可以做出一张背景清晰，结构完整的免疫组化切片。

参考文献

[1]倪灿荣，马大烈，戴益民.免疫组织化学实验技术及应用[M].上海：化学工业出版社，2006.

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【关键词】 儿童；幽门螺杆菌；免疫组化；检测；分析

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.34.014

Hp为消化性胃溃疡、胃炎及胃癌的主要致病原因之一。目前， 相关临床资料已经证实， 缺铁性贫血以及儿童生长发育较缓等均与儿童Hp之间存在相对紧密的联系， 因此， 采用何种方式提高Hp诊断准确率具有重要意义[1]。由此， 本研究针对儿童Hp免疫组化染色检测的价值进行分析， 现将结果报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 回顾性分析本院2013年12月～2014年12月收治的Hp感染患儿103例， 其中男女比例40：63， 年龄2～12岁， 平均年龄（7.48±1.56）岁；所有患儿在近1个月内均未接受抗生素或者抑酸制剂治疗。

1. 2 方法 所有患儿均予以免疫组化染色检测、CIM血清学检测、RUT试验以及13C-UBT试验。①RUT试验：所有患儿均予以电子胃镜（日本OLMPUS 260）检查， 于距离幽门5 cm处选取黏膜组织， 将此黏膜组织分成3块， 选取1块予以RUT实验， 严格按照说明书进行操作， 深紫色代表阳性， 未变色则为阴性[2]。②13C-UBT试验：口服13C尿素散剂（河北省协和药业有限公司生产）， 于服药前后30 min对呼出气体进行采集， 应用13C 红外光谱仪（北京华亘安邦科技有限公司）检测患儿呼出气体。③免疫组化染色检测：检测试剂均由福州迈新生物技术开发有限公司生产， 检测Hp中的抗原成分， 阳性为棕褐色。④CIM血清学检测：选用Hp快速检测试剂（上海安倍医疗器械贸易有限公司）， 利用免疫层析术对血清中Hp特异抗体进行检测。患儿需要保持空腹， 采取末梢血， 红色条带为阳性。

1. 3 观察指标 将13C-UBT试验检测结果作为黄金判定标准， 对本次检测结果进行判定：RUT试验、细菌培养、13C-UBT试验、单克隆的抗体粪便Hp抗原检测中一项阳性；Hp形态学、基因检测、免疫学两项阳性[3]。

1. 4 统计学方法 所有数据采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。 P

2 结果

2. 1 13C-UBT试验检测结果 经统计， 13C-UBT试验检测结果阳性62（60.19%）例， 阴性41（39.81%）例。

2. 2 三种检测结果对比 以13C-UBT试验检测结果作为黄金标准， 免疫组化染色检测共检出56（54.37%）例阳性， 敏感性、特异性、准确性分别为79.03%、82.93%、80.58%；RUT试验检出58（56.31%）例阳性， 敏感性、特异性、准确性分别为77.42%、75.61%、76.70%；CIM血清学检测共检出59（57.28%）例， 敏感性、特异性、准确性分别为88.71%、90.24%、89.32%。三组敏感性、特异性以及准确性比较， 差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

3 讨论

将胃黏膜标本通过石蜡包埋、乙醇固定以及切片染色进行处理的操作为组织切片染色， 将组织切片置于显微镜下进行观察， 其以Hp形态特点、分布特征作为诊断是否存在Hp感染的重要依据。临床研究证实， 采用组织学Hp进行诊断的同时可以进行病理学诊断， 其中W-S银染色法的效果尤为明显， 能够清晰地显示细菌， 但不足之处在于需要耗费较长的时间和一定的技术[4]。本研究方案将13C-UBT试验检测结果作为黄金判定标准， 发现其他三组检测结果的敏感性、特异性以及准确性之间无显著差异， 上述研究结果证实儿童Hp采用免疫组化法染色检测具有可行性。推测上述结果的产生可能与组织学免疫组化法染色检测不仅能够清晰观察黏膜表面、小凹腺腔中的Hp， 而且还能够对细胞内以及变形的Hp非菌体成分进行观察， 因而该方案检测在敏感性、特异性两方面均较强。本研究结果显示， 免疫组化法染色检查的检出率为54.37%， 阳性检出率接近于13C-UBT试验检测法， 可见该方案的Hp阳性检出率较高， 故可以作为一种可靠且稳定的检测方法。相关研究指出， 在检测胃癌或者低胃酸患者组织时， 受到其他相似细菌的影响， 可能导致误诊现象的存在， 因此更需要免疫组化染色进行辨认和诊断[5]。本研究中进行免疫组化染色采用的试剂均由福州迈新生物技术开发有限公司提供， 该试剂利于保存且能够多次使用。本研究结果中免疫组化法染色检测的敏感性相对较低， 考虑上述结果的产生可能与取材的部位以及取材的数量有关。

综上所述， 组织学免疫组化染色检测的准确性较高， 技术安全可靠， 且易于长期保存， 因此在儿童Hp的临床诊断中具有重要的应用价值。

参考文献

[1] 徐翠， 王涛， 周平.儿童幽门螺杆菌免疫组化染色检测分析.山东大学学报， 2014， 52（9）：82-84.

[2] 邹明艳， 张勇， 李锦霞， 等.儿童上消化道疾病的临床特征及与幽门螺杆菌感染的关系.实用医学杂志， 2013， 29（7）：1138-1139.

[3] 张运玲， 朱朝敏.儿童幽门螺杆菌感染的诊断与治疗.实用儿科临床杂志， 2012， 27（19）：1541-1544.

[4] 孙红霞， 张在亭， 宋建林， 等.现症感染条带检测对儿童幽门螺杆菌感染的诊断价值.山东医药， 2014， 54（37）：50-51.

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免疫组织化学技术是常规病理诊断中不可缺少的重要手段，尽管试剂盒及自动免疫组化仪的使用使免疫组化结果阳性率大幅提高但由于免疫组化染色步骤繁多，不同的实验室操作程序不同，结果都有所差异。影响免疫组化切片质量控制的几个主要因素有：组织的固定、切片的制作、适宜的温度，抗原的修复。

组织固定

组织的正确固定可以防止细胞在自身溶酶体的作用下溶解破坏。用于免疫组化染色固定的重要意义是保存组织细胞的抗原性，使抗原不发生弥散和抗原性丧失。若固定不良在以后的过程中将无法纠正。通常使用4%的中性缓冲福尔马林作为固定剂，固定液量要充足，一般为组织块总体积的4～5倍。尽快固定，时间8～48小时，穿刺活检标本应尽量固定6小时以上，条件不允许的情况也不能少于1小时。

切片的制作

免疫组化切片必须用防脱片，切片厚度以3～4um为宜，薄而平整。切片摊片时组织裱在载玻片的位置非常重要，如果试剂覆盖不到组织就会出现假阳性和阴阳“脸”的现象。组织尽量裱在载玻片中位。采用60℃恒温烤片机烤片1小时以上。时间过短会造成脱片。用于脱蜡的二甲苯要经常更换，保证脱蜡彻底。滴抗体前用免疫组化笔在组织上方下方化横线，划线时不要紧靠组织，以免染色时产生边缘效应。抗体滴量设置一般80μl，组织过大或附阳性对照是抗体滴量设置比平时量多20μl即可。

保持适宜的温度和实验室温

蜡块制备时石蜡应不超过62℃，最好用熔点低的石蜡。实验室温度以25℃为基准，空气温度在40%以上。室温过低会影响抗原、抗体的结合，导致假阴性；温度太高，室内空气干燥会导致抗体孵育过程中干片，实验失败。如果实验室温度过低，可以适当延长孵育时间，温度过高，可适当缩短时间，同时增加空气温度。为防止以上现象的发生，将整个过程把切片放在湿盒中再置于37℃恒温水浴箱中进行可以防止切片干燥而导致失败，又能解决对实验室温度难以达到要求的问题。

抗原的修复

组织经福尔马林固定经常会引起蛋白质结构的改变而导致抗原决定簇被封闭，阻碍了抗原、抗体的结合。采用适合的抗原修复技术使抗原决定簇充分暴露，可以提高抗原的敏感性，染色结果要强于不修复。常用的抗原修复技术方法有微波加热修复法、高温高压修复法、酶消化法。推荐方法：微波抗原修复法，抗原修复液以柠檬酸缓冲液(PH6.0)为佳。即微波高温加热3分钟后(加热至沸腾，92℃～95℃)，勿拿出切片待20分钟后温度降至室温，用PBS液冲洗3次后进行下一步骤。

制片质量的好坏直接影响着诊断的准确性，正确的操作是病理技术质量控制的基础。因此每位病理技术工作者都应认真对待制片的每个环节。

参考文献

1 杨莹,魏兵,等.组织固定和处理对免疫组织化学染色结果的影响及其标准化探讨.中华病理学杂志,2009,38(12):852-855.

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关键词 尖锐湿疣 HPV 原位杂交 免疫组化

doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2010.17.177

AbstractObjective:To investigate the sensitivity and specificity of in situ hybridization(ISH)and immunohistiochemistry(IHC)associated with the diagnosis of Condyloma Acuminatum(CA)and compare it with histopathological feature.To understand the HPV genotype that the CA patients infect and the distribution pattern of HPV genotypes in infected CA patients in XiangTan area.Methods:CA samples were obtained from 124 patients with pathological diagnosis or clinical diagnosis and were examined with ISH and IHC,respectively.Results:84 cases were positive for HPV-P and 82 positive for HPV-16 by IHC.Overall positive rate is 69.35%.Expression of HPV-P and HPV-16 was evident in the upper spinous and granular layer.108(87.09%)cases were positive for HPV6/11 and 14(1129%)cases were positive for HPV16/18,6 of which were positive for HPV6/11 by ISH.The overall positive rate of HPV expression by ISH is 93.5% and the positive rate of double infections(HPV6/11+HPV16/18)analyzed by ISH was 42.85%.In addition to the upper spinous and granular layer,the strongest reaction was observed in lower or middle stratum spinosum and stratum basale.Conclusion:IHC and ISH were the necessary assisted examinations for the diagnosis of CA.ISH can detect HPV sensitvity and specially,and locate positice of the Virus in histopathology of CA.And this technique can be used to detect the type of HPV.Results:Revealed that the predominant types from patients in XiangTan were HPV11 and HPV6 with mixed infection.

Key WorodsCondyloma Acuminatum(CA);Human Papilloma Virus(HPV);In Situ Hybridization(ISH);Immunohistiochemistry(IHC)

HPV(Human Papilloma Virus)的中文名称为人状瘤病毒,属于Papovaviridae家族,是一种环状双链DNA病毒,长约8kb[1]。目前发现的HPV亚型有200多种[2]。其主要通过直接或间接的接触或性传播感染人类,引起人类皮肤和黏膜的多种良性状瘤或疣,某些亚型的感染具有很强的致癌性。近年随着分子检测技术的发展,可从分子水平更早期、更准确的检测出低拷贝数下的病毒感染情况[3]。而尖锐湿疣(CA)是由HPV感染所引起的性传播疾病,其中最常见的是HPV6、11、16、18感染。现在大多数CA的病理诊断主要依靠组织形态学改变结合免疫组化来确诊,但有时并没有典型的形态学改变如诊断性挖空细胞等,或有典型的形态学改变而免疫组化表达却是阴性结果,这就给尖锐湿疣的病理诊断带来了一些困难。为了更准确地诊断CA,我科对2008年1月～2009年10月的病例用原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)方法做了如下对比实验。

材料与方法

材料:2008年1月～2009年10月收治在湘潭市各医院皮肤性病科、妇科和泌尿科就诊,经临床和/或组织学诊断尖锐湿疣的病例124例。其中男52例,女68例;年龄17～67岁,平均32.1±9.2岁。皮损表现为生殖器、会阴或部位出现单个或多个丘疹状、状、菜花状或鸡冠状赘生物;部分女性为阴道和/或宫颈赘生物,所有组织块均经10%的中尔马林固定,石蜡包埋,在做HE切片的同时,每个蜡块切6张4白片黏附在APES处理的载玻片上,以备原位杂交和免疫组化之用。原位杂交HPV6/11和HPV16/18试剂盒;免疫组化HPV-P多克隆抗体、HPV-16单克隆抗体及二抗即用型快速免疫组化Maxvision试剂盒。

方法:①IHC:步骤为切片脱蜡、水化。加3%双氧水室温10分,蒸馏水冲洗。高压锅柠檬酸修复,自然冷却。滴加一抗室温下孵育60分,PBS洗3×5分。加二抗室温下孵育15分,PBS洗3×5分。DAB显微镜下观察显色,复染,封片。②ISH:按照HPV6/11和HPV16/18试剂盒说明书操作,脱蜡和脱水,切片于二甲苯3×10分,100%酒精2×3分,干燥。增强液处理,微波加热30分。梯度酒精脱水,干燥。杂交,分别滴加25 HPV6/11和HPV16/18试剂盒探针加盖,95℃变性8分,30%湿盒增效液的湿盒中37℃孵育过夜。45℃ PBS脱盖、浸泡25分,加一抗37℃孵育30分,PBS浸泡3×5分,加二抗增强剂室温20分,PBS浸泡3×5分,加二抗室温30分,PBS浸泡3×5分,DAB显微镜下观察显色,复染,封片。两组均设阳性对照和空白对照。阳性对照为已知阳性的尖锐湿疣阳性片;空白对照为ISH用PBS代替探针,IHC用PBS代替一抗染色。

阳性结果判断标准:细胞核棕褐色着色,如病毒拷贝数较低,为细胞核内散在棕褐色点状颗粒[4]。

统计学处理:敏感性用阳性标本中原位杂交检测阳性的百分数计算,特异性用阴性标本中原位杂交检测阴性的百分数计算。分析用卡方检验检查样本差异的显著性。

结 果

所有结果均由两位高年资病理医师阅片后得出。IHC阳性以细胞核/核周棕褐色着色为准。其中HPV-P阳性84例,HPV16阳性82例,总阳性率为6935%(86/124),阳性细胞主要分布在棘细胞上层及颗粒细胞层。ISH阳性以细胞核棕褐色着色,如病毒拷贝数较低,为细胞核内散在棕褐色点状颗粒为标准[4]。其中HPV6/11阳性108例,HPV16/18阳性14例。HPV16/18阳性的14例中有6例合并有HPV6/11阳性。ISH总阳性率为93.5%(116/124),阳性细胞主要出现在棘层中上层、颗粒层及角化不全细胞核内,在角化不全层被挤压的细胞核内也可见到阳性表达可见。

讨 论

原位杂交将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,称为原位杂交。使用DNA或者RNA探针来检测与其互补的另一条链在细菌或其他真核细胞中的位置。近年来,随着免疫组织化学技术的发展和各种特异性抗体的出现,使许多疑难肿瘤得到了明确诊断。在常规肿瘤病理诊断中,5%～10%的病例单靠H.E.染色难以作出明确的形态学诊断。尤其是免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可,其在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时,准确率可达50%～75%。免疫组织化学的临床应用主要包括以下几方面:恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断;确定转移性恶性肿瘤的原发部位;对某类肿瘤进行进一步的病理分型;软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类,因其种类多、组织形态相像,有时难以区分其组织来源,应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的;发现微小转移灶,有助于临床治疗方案的确定,包括手术范围的确定。为临床提供治疗方案的选择。

尖锐湿疣(CA)是HPV感染的全球范围内广泛流行的性传播疾病之一,为全球各种性传播性疾病的第一或第二位[5],主要是HPV6、11、16、18、30～32、40、42～44、51～55等型引起。其中HPV6、11型约占90%[6],在世界各国都占绝对优势。近年来尖锐湿疣发病率逐年增加。有研究显示,近10年尖锐湿疣的发病率已增长10倍。所以CA的诊断也越来越受到病理科的重视,而一般情况下尖锐湿疣的诊断主要依赖其典型的组织形态学表现如表皮角化过度伴角化不全,棘层明显肥厚,挖空细胞伴实性或疣状、状的外生性生长。浅表有空泡的角质形成细胞(空泡化细胞)为尖锐湿疣的较为特征性的组织学表现,也成为诊断尖锐湿疣的重要形态学依据,但非典型尖锐湿疣空泡化细胞较少或无。所以单凭空泡化细胞等形态学改变来诊断尖锐湿疣是不可靠的,尤其是尖锐湿疣亚临床损害和早期损害可以不出现这一特征。因此对HPV病毒的检测就显得更为重要。HPV是双链闭环的小DNA病毒,包含约8000个碱基对,其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和一个非编码长控区。在早期开放读码框架中,E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要,E6、E7编码的E6、E7蛋白可引起子宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV的主要和次要衣壳蛋白,组装成HPV的衣壳[7]。我科用免疫组化方法对124例CA标本进行检测,其阳性率为694%(86/124),而原位杂交总阳性率为935%(116/124),其中HPV6/11型占大多数,与国内外的报道大致相似。从以上结果可以看出免疫组化检测阳性率明显低于原位杂交检测HPV的阳性率,其原因主要是由于免疫组化方法是属于HPV衣壳抗原检测,此蛋白仅在后期病毒颗粒中产生,且衣壳蛋白的合成及病毒颗粒的装配只发生在最终分化的颗粒层及棘细胞上层[8];其次免疫组化方法需要足够量的病毒颗粒才有阳性反应;另外衣壳蛋白在病理制片过程中也会受到固定、修复等因素的影响使一些抗原丧失。而原位杂交法则是利用碱基互补的原理,一种探针只能与其对应的核酸序列杂交,只要每个细胞中有50～100个病毒DNA拷贝即可获得阳性结果[9],并且不受各种影响抗原表达的因素的影响,故阳性率及阳性强度高,且背景清晰。我们原位杂交实验中的8例阴性病例我们分析有可能是细胞中病毒拷贝太少或者是除HPV6/11/16/18型外的其他型别感染所致。

综上所述,可以看出原位杂交法检测HPV6/11、HPV16/18比免疫组化法敏感性和特异性都要高,且定位准确,背景清晰,操作快速简便,更有助于HPV分型研究,给临床治疗、监测及判断预后提供重要依据。因此HPV原位杂交是诊断尖锐湿疣的一种重要辅助手段,如广泛应用,可以使尖锐湿疣的病理诊断更加准确,可靠。我们的研究发现,湘潭地区的HPV感染以HPV6/11型为主,有较高的混合感染率。

参考文献

1 Kong CS,Welton ML,Longacre TA.Role of human papillomavirus in sguamous cell matapalasia dysplasia carcinoma of the rectum.Am J Surg Pathol,2007,31:919-925.

2 Chien CY,Su CY,Fang FM,et al.Louer prevalence but favorable survial for human papillomavirus-related sgumous cell carcinoma of tonsil in Taiwan.Oral Oncol,2006,10:1016-1021.

3 Castellsague X,Bosch FX,Munoz N.Environmental cofactors in HPV carcinogenesis.Virus Res,2002,8992):191-199.

4 HPV in situ hybridization:impact of different protocols on the defection of integrated HPV.Int J Cancer,2005,115:419-428.

5 刘贞富.尖锐湿疣(修订版).武汉:湖北科学技术出版社,2004:8-82.

6 Zheng PS,Li SR,Iwasaka T,et al.Simultaneous detection by consensusmultiplex PCR of high- and low-risk and other types of human papilloma virus in clinincal samples.Gynecol Oncol,1995,58(2):922-923.

7 王鹤,乔友林.人瘤病毒型别及其相关疾病.中国医学科学院学报,2007,29(5):678-684.

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[关键词] 乳腺癌；免疫组化指标；表达；相关性

[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）05（c）-0008-03

[Abstract] Objective To explore the expressions and significance of immunohistochemical indexes including Ki67，VEGF，p53 and C-erbB-2 in breast cancer tissue. Methods 70 patients with breast cancer admitted into our hospital from April 2012 to April 2014 were selected as research objects. Pathological tissue was taken after surgery and expression levels of Ki67，VEGF，p53 and C-erbB-2 in breast cancer tissue were detected by immunohistochemical method and correlations of pathological factors in breast cancer were analyzed. Results The highest positive expression rate in breast cancer tissue was Ki67 accounting for 75.71%，and then C-erbB-2 for 67.14%.Expression level of Ki67 had an obvious correlation with neoplasm staging in breast cancer patients. The higher cancer staging was，the higher positive rate of Ki67 became in mammary tissue，expression of C-erbB-2 positive rate of breast cancer patients related to age，the younger，breast C-erbB-2 positive rate was higher，p53 and positive rate of VEFG had no embodied obvious correlation with patient age，tumor size，tumor staging. Conclusion Positive rate of Ki67 expression in mammary tissue in breast cancer patients has a positive correlation with cancer staging. C-erbB-2 expression level has a close relation with the age of patient. The positive expression of Ki67 is positively correlated with the expression of C-erbB-2 and p53，and the Ki67 can be used as an important marker for evaluating the progression of breast cancer.

[Key words] Breast cancer；Immunohistochemical index；Expression；Correlation

乳腺癌是临床常见女性恶性肿瘤之一，有较高的发病率[1]，且统计资料显示，全球范围内每年新增乳腺癌病例超过100万，超过15%的恶性肿瘤患者死于乳腺癌。当前乳腺癌已成为威胁女性身体健康的关键疾病。有报道显示，肿瘤的产生、进展均与细胞的增殖存在一定的相关性[2]。Ki67是增殖细胞相关核抗原中的一种，近年来，有大量研究证实可将Ki67作为评估乳腺癌肿瘤增殖活性的相关标志物，其有较好的灵敏度与特异度[3-4]。基于此，本组采用免疫组化法对乳腺癌组织中Ki67、VEGF、p53、C-erbB-3表达水平进行检测分析，旨在证实其在乳腺癌组织中的表达及应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将本院自2012年4月～2014年4月收治的70例乳腺癌患者作为研究对象。取患者乳腺癌术后病理组织标本作为研究标本。所有纳入研究患者均经病理学检查确诊为乳腺癌，均为女性，术前均未接受化疗、放射治疗等抗癌治疗手段，纳入前均接受血常规、肝肾功能常规、胸片、腹部超声及盆腔超声检查，排除癌症远端转移患者。年龄29～83岁，平均（48.2±1.6）岁；乳腺癌分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期39例，Ⅲ期11例；肿瘤分类：导管内癌1例，浸润性导管癌64例，黏液腺癌4例，浸润小叶癌1例。

1.2 试剂与方法

免疫组化染色一抗Ki67、VEGF、P53与C-erbB-2工作液。将所有纳入研究组织标本均给予甲醛液固定1 d，作石蜡包埋，连续切片，贴于含APES的载玻片上，在60℃条件下烘烤2 h。随后作免疫组化染色。常规石蜡切片后脱蜡，在浓度为3%的双氧水室温下孵育10 min左右，清除过氧化物酶活性，行蒸馏水冲洗，PBS洗涤，浸泡，时间为5 min。后作抗原修复，血清封闭，在室温条件下孵育10 min，弃血清，加入四种一抗工作液，在37℃温度环境下孵育2 h，作PBS洗涤，重复3次，5 min/次，滴入二抗，加入辣根酶标记物，孵育0.5 h后，作PBS洗涤，重复3次。作DAB显色处理，随后采用清水冲洗，复染，最后作封面处理。并将阳性标本作为对照标准，以PBS作为阴性对照。每张切片均至少取3个高倍视野，观察细胞颜色及比例。

1.3 阳性结果判定标准

①Ki67细胞阳性：细胞多数呈棕黄色，核着色表现，少数呈弱细胞质染色；p53细胞阳性：呈棕黄色、核着色表现，少部分呈现较弱细胞质染色表现；VEGF阳性：胞浆着色；阴性：不着色。阴性（-）：阳性细胞数低于10%。②Ki67、p53及VEGF阳性程度标准：弱阳性（+）：阳性细胞数10%～25%；阳性（++）：阳性细胞数>25%～50%；强阳性（+++）：阳性细胞数超过50%。③C-erbB-2阳性：膜着色，着色细胞数超过10%。阴性：不着色；弱阳性：着色弱，不连续；阳性：着色中等，部分不连续；强阳性：着色强，且呈连续性表现。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据。计数资料以率表示，采用χ2检验。等级资料用非参数秩和检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2在乳腺癌组织中的表达情况

Ki67在乳腺癌组织中表达阳性率最高，为75.71%，其次为C-erbB-2，为67.14%（表1）。

2.2 Ki67、VEGF、p53与C-erbB-2的表达与病理因素的关系

乳腺癌组织Ki67表达水平与乳腺癌患者年龄、肿瘤直径无明显联系，但与乳腺癌患者肿瘤分期有显著相关性，癌症分期越高，乳腺组织Ki67阳性率越高，C-erbB-2表达阳性率与乳腺癌患者年龄有相关性，年龄越轻，乳腺C-erbB-2阳性率越高，p53与VEGF阳性率与患者年龄、肿瘤直径、肿瘤分期均未体现明显相关性（表2）。

3 讨论

Ki67核抗原在细胞增殖中的表达作用最早由国外学者提出，当前已被临床上认定为核增殖的特异性标志物，主要存在于人体细胞周期中除G0期外的不同阶段，最初表达于G1期，在G2期与S期增殖明显，到M期则达到峰值[5-6]。且于细胞分裂晚期消失，其半衰期相对较短，在脱离细胞周期后可快速降解，因此可将其作为测定肿瘤细胞增殖活性的重要标志[7]。当前临床上已有大量研究报道均证实，Ki67可反馈乳腺癌患者肿瘤增殖率，可将其作为评估肿瘤进展、转移及患者预后水平的重要标志[8-9]。

本组研究结果证实，所有乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达阳性率达到75.71%，与早期研究学者报道的77.9%较为相近[10]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平同样与乳腺癌临床分期存在一定的相关性，晚期肿瘤患者阳性率明显高于早中期患者，提示乳腺组织Ki67水平与癌症组织的生长与浸润存在关联[11]。当前国内外尚无较多报道对Ki67表达与乳腺癌分期进行研究，仅有部分文献提示可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者化疗敏感性的重要标志[12]。同时本组研究证实，患者乳腺组织Ki67表达水平与其是否存在淋巴结转移无明显相关性，与早期研究报道意见尚未统一，有待下一步探究。

当前也有部分研究报道提示，肿瘤的生长、浸润、转移同样与新生血管的形成存在一定的相关性[13]。而VEGF属于调控血管生成的关键因子，可作用于血管内皮细胞，在细胞有丝分裂中起到重要的作用，可增加毛细血管通透性，进而达到促进肿瘤生长的目的[14]。且有报道证实，VEGF与Ki67在乳腺肿瘤的进展过程中有显著的协同作用，癌症细胞增殖活性提升，同样可促进新生血管的形成[15]。而本组研究结果证实，乳腺组织中VEGF与Ki67的共同表达与患者肿瘤直径、癌症分期有明显的相关性，因此认为恶性肿瘤的进展与肿瘤细胞的增殖活性及新生血管等不同的生物学因素相关。而p53位于17号染色体短臂上，其中野生型p53基因可限制细胞转化，抑制癌细胞活动，突变型p53基因则可引起细胞的癌变及转化，促进癌细胞无限增生，是引起乳腺癌患者病情进展及恶化的相关因子。有研究者表示，超过50%的肿瘤均存在p53基因突变表现，而统计显示乳腺癌患者p53蛋白阳性率在20%～60%，本组p53阳性率为62.86%，稍高于早期报道，且其与Ki67的表达呈正相关，提示两者均在乳腺癌肿瘤生长过程中发挥重要的调节与协同作用。此外，p53基因突变在一定程度上可调节促进血管增生的内皮生长因子，调控肿瘤血管生长。且p53表达阳性的肿瘤其侵袭性高，需引起重视。C-erbB-2则为来源于细胞的癌基因，一般情况下处于未激活状态，参与细胞的分化与生长调节构成，具备肿瘤转化活性。当前已公认其为与乳腺癌发生与进展相关密切的肿瘤基因。其过度表达通常提示乳腺癌肿瘤程度高，患者预后水平差。本组结果证实，乳腺癌患者C-erbB-2表达水平与患者年龄呈明显相关性，年龄越轻，其乳腺癌阳性表达率越高。进一步证实，肿瘤的发生与进展与多种基因变异及协同作用相关。

综上，乳腺癌患者乳腺组织中Ki67表达的阳性率与癌症分期呈正相关，C-erbB-2的表达水平与患者年龄有密切联系，且Ki67阳性表达与C-erbB-2及p53表达呈正相关，可将Ki67指标作为评估乳腺癌患者病情进展的重要标志。

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篇6

[关键词] 细胞涂片；细胞块切片；胸腔积液；免疫组化染色；诊断

[中图分类号] R730.48 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）01（a）-0179-02

胸腔积液的来源主要于非小细胞肺癌、肺腺癌和恶性彩胸膜间皮瘤等，长期以来，胸腔腔积液的诊断主要采用细胞涂片检查，其诊断的敏感度可达78%[1]。但单纯应用细胞涂片进行检查，无法对转移性癌和浆膜腔原发性间皮性肿瘤进行区别，这给临床治疗带来了较大的困难，目前临床研究发现，常规细胞块切片结合免疫组化染色的检测方法效果较好[2]。为探讨细胞块切片免疫组化染色在胸腔积液病理诊断中的应用价值，该研究采用常规细胞块切片结合免疫组化染色的检测方法对2010年6月―2012年7月收集82例胸腔积液患者进行诊断，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院呼吸内科收治的82例胸腔积液患者为研究对象，其中男52例，女30例，年龄16～77岁，平均年龄为（46.83±3.09）岁；纳入标准：送检标本均为胸腔积液；每1例患者均给予常规细胞涂片和细胞块切片及免疫组化染色检测。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 患者入院第2天清晨由护理人员收集患者新鲜的胸腔积液100 mL，分为4个试管进行离心，转速：2 500 r/min，离心时间：10～15 min；离心后采用移液枪吸出上清液；取部分沉渣进行常规细胞涂片学检查，合并余下的沉渣，加入戊二醛 2.5 mL 进行固定，离心，转速：2 500 r/min，离心时间：5 min；离心后采用移液枪吸出上清液，取出沉渣，滤纸包好后，常规脱水，用石蜡包埋切片，应用HE染色。

1.2.2 免疫组化 采用 Maxvision 快捷免疫组织化学 S-P法染色，Maxvision 试剂盒及二氨基联苯胺（ DAB） 显色试剂均购于福建迈新有限公司。CEA、CK7、WT-1、CR抗体均购于自基因公司，染色过程严格按照试剂盒说明书进行。

结果判断[3]：CEA 及 CK7 在胞浆或胞浆胞膜同时出现棕黄色为阳性，Calretinin在细胞浆、细胞核和细胞膜或细胞浆膜出现棕黄色为阳性，WT-1 的细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。间皮细胞或腺癌细胞达 10% 以上细胞阳性诊断为阳性。

1.3 统计方法

采用SPSS16.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 各组阳性率比较分析

细胞块切片结合免疫组化阳性82例，阳性率为100%，常规细胞学涂片的阳性46例，阳性率56.10%，细胞块切片结合免疫组化阳性率明显高于常规细胞学涂片，差异有统计学意义（P

2.2 腺癌与间皮性肿瘤细胞不同抗体表达分析

结果显示，CEA、CK7 是腺癌较为特异性的抗体，而CR 是间皮性肿瘤细胞较为特异性的抗体，各抗体在腺癌细胞和间皮性肿瘤细胞均有交叉表达，见表 2。

3 讨论

胸腔积液是胸部肿瘤的常见并发症[4]，肿瘤患者并发胸腔积液后，使间皮细胞、肿瘤细胞均浸泡于胸腔积液中，长期受胸腔积液的刺激，致使间皮细胞和肿瘤细胞均发生形态学改变，而使两种细胞应用常规方法很难鉴别是出来[5]。传统的检测方法是细胞学涂片，常规细胞学涂片操作易于掌握，且可有效保持细胞的形态特点，但其准确性及敏感性不高，尤其是对恶性胸腔积液患者的诊断准确性较低，约为60%[6]。

免疫组化染色法是利用已标记的特异性抗体来检测细胞内未知抗原，并通过酶所产生的着色反应来显示细胞的活性、定位及其分布。此方法操作易于掌握，阳性物质定位准确、特异性强。同时，细胞块的应用弥补了传统细胞涂片方法单一的缺点，使细胞标本得以保存，具有了连续切片的性质，更利于进行多项检查。

该组研究结果显示，常规细胞学涂片的诊断阳性率为56.10%，这与以往报道相似。采用CEA、CK7、WT-1、CR抗体进行免疫组化检验，结果显示，82例患者均得到了明显的诊断，其诊断阳性率为100.00%；说明细胞块切片联合免疫组化染色可显著提高胸腔积液诊断的阳性率，为临床的治疗提供了理论参考，值得临床广泛推广和应用。

[参考文献]

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篇7

关键词：细针穿刺；卵巢癌；上皮型间皮瘤；免疫组织化学；联合抗体

腹膜恶性间皮瘤（PMM）与低级别卵巢浆液性癌（OSA）细胞学形态极其相似，单纯依靠组织学鉴别二者非常困难，尤其是经后穹隆盆腔肿瘤穿刺标本，由于取材困难，穿刺过程中组织损伤，诊断更加困难，只能依靠免疫组织化学方法进行鉴别诊断。目前标记间皮瘤的抗体较多，但敏感性和特异性差异很大，找到一组简单可靠的抗体组合正成为目前研究的热点。本研究选取我院2013年1月～2014年12月卵巢低级别浆液性癌40例，腹膜上皮型恶性间皮瘤26例，应用CK5/6、CK8/18、CEA、Vim、Cal、D2-40、ER、PR、CA125九种抗体对盆腔上皮型恶性间皮瘤和卵巢浆液性癌进行检测，希望找到鉴别二者较好的抗体组合。

1资料与方法

1.1一般资料 选用我院2013年1月～2014年12月盆腔肿瘤手术标本66例，其中上皮型恶性间皮瘤26例，男性17例，女性9例，16例有石棉接触史，年龄35～72岁，平均（52.8±5.6）岁。卵巢低级别浆液性癌40例，年龄40～75岁，平均（50.5±12.4）岁。

1.2 SP法免疫组化试剂盒来源（表1）

1.3方法 所有标本均经4%中性甲醛固定，常规4μm厚度连续切片，HE染色。免疫组化采用SP法，严格按照使用说明书操作，DAB显色，苏木精复染、脱水、透明和封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4结果判定 免疫组化染色阳性信号呈棕褐色或棕黄色，ER、PR定位在细胞核；CK5/6、CK8/18、Cal、Vim定位在细胞浆；D2-40、CEA、CA125定位在细胞浆/膜，阳性细胞数

2结果

2.1病理组织学形态 40例卵巢癌病例均为低级别浆液性癌，呈腺管状、状排列，瘤细胞单层或复层，呈矮柱状或立方型，相似于间皮细胞，结构较宽，可见多级分枝，有的间质内可见砂粒体（图1，图2）。26例上皮型恶性间皮瘤光镜下组织结构多样，表现为管状、状、实性巢状等（图3）。细胞圆形或卵圆形，核通常为单个，居中或稍偏位，核仁1～2个，核分裂像少见，少数病例可伴有砂粒体形成。上皮型恶性间皮瘤在CK5/6、Cal、D2-40中高表达（图4～图6），而卵巢癌在ER、PR、CA125中高表达（图7～图9）。

2.2免疫组化表达情况（表2）

3讨论

盆腔肿瘤中，腹膜恶性间皮瘤和卵巢癌为最常见的2种肿瘤，由于组织来源不同，治疗方法也不相同，因此组织学的分型对指导临床的治疗、肿瘤的分期及预后的判断有着重要的意义。有文献报道恶性间皮瘤90%发生于胸膜[1]，3%～12%发生于腹膜[2]。

腹膜间皮瘤是腹腔内恶性度极高的肿瘤，目前尚无有效的治疗方法，大多数死于诊断后的1～2年内，男性发病多于女性，发生于儿童的病例罕见报道[3]。根据国内资料统计，间皮瘤的发病率为0.04%，且多与石棉接触有关[4]，其他原因包括职业和周围环境的接触[5]。近年其发病率有逐年增多的趋势。有研究表明，恶性间皮瘤的潜伏期为35～40年[6]，目前发病率增高的原因，可能与20世纪70年代我国大面积手纺石棉加工有关。

由于间皮细胞的组织学形态多样，在光镜下与卵巢分化好的腺癌很难鉴别，尤其是卵巢低级别浆液性癌，光镜下几乎无法鉴别。所以寻找一组有效的抗体能够鉴别恶性间皮瘤与卵巢癌的组织学类型，对病人的准确诊断和正确治疗尤为必要。由于单一抗体的敏感性、特异性不同，往往达不到鉴别诊断的作用，因此，国际间皮瘤小组建议至少同时使用2种间皮标记和2种其他癌的标记[7]。

3.1 CK5/6 通常标记鳞状上皮和导管上皮的基底细胞、部分前列腺基底细胞以及部分鳞状上皮生发层细胞，腺上皮细胞不表达。在肉瘤样恶性间皮瘤中阳性率较低，而在上皮型间皮瘤中高表达，本结果中，CK5/6在PMM中的阳性率极高（100%），而卵巢癌全部阴性。可以作为PMM的可靠标记物用于PMM和OSA的鉴别诊断中。

3.2 CK8/18 是单层腺上皮来源肿瘤的首选标记物，鳞状上皮不表达，由于间皮细胞多潜能分化的特性，CK8/18在间皮肿瘤也高表达，通常和CK5/6联合使用标记间皮细胞。

3.3 CEA 是腺癌常用的标记物，在少部分间皮瘤中有局灶弱的阳性表达，腺癌细胞分化越低则CEA含量越高。本结果CEA在OSA中表达（87.5%）明显高于PMM中的表达（3.8%），因此CEA是鉴别腺癌和间皮瘤的重要标记物，可作为二者鉴别的一线抗体使用。

3.4 Vim 在梭形细胞为主型恶性间皮瘤呈阳性表达，国外的研究也表明，Vim在间皮瘤的阳性率较高，而在腺癌为阴性，虽然Vim在本结果中的表达率仅为76.9%。而在卵巢腺癌中全部为阴性表达，二者之间阳性率差异仍十分显著。

3.5 Calretinin是一种钙结合蛋白，表达于神经组织、脂肪组织、间皮细胞，腺癌极少表达，因此，Calretinin是上皮样间皮瘤最敏感和特异的抗体，在鉴别腺癌和间皮瘤中有较强的特异性。

3.6 D2-40 是一种分子量为40kDa的糖蛋白，主要存在于胚胎和生殖细胞肿瘤中，近几年的研究表明，D2-40在上皮型间皮瘤中亦高表达，本研究D2-40在间皮瘤中表达率为95.2%，与文献报道一致。因此可作为间皮瘤鉴别诊断有用的标记物。

3.7 ER 雌激素受体存在于正常子宫内膜、平滑肌细胞以及正常乳腺的上皮细胞中 ，在间皮瘤中阴性表达，在卵巢浆液性肿瘤中阳性表达，此抗体识别雌激素受体的N端功能区（A/B区），研究表明ER表达阳性的病人对其进行激素治疗往往有效，预后较好。

3.8 PR 孕激素受体表达有两个异构体PRA（94KDa）和PRB（114 Kda），其功能是作为配体活化后转录因子存在于子宫内膜、卵巢及乳腺上皮细胞中，间皮瘤阴性表达。PR也可作为鉴别间皮瘤的有用标记物之一。

3.9 CA125 几乎在所有的卵巢浆液性癌中阳性表达，宫颈、子宫内膜、乳腺、胃肠道及甲状腺腺瘤均有少数表达。而卵巢粘液性肿瘤和间皮瘤阳性率很低，对鉴别诊断有重要的参考价值。单纯的形态学诊断间皮瘤非常困难，目前对于间皮瘤的诊断基本依赖于免疫组化的辅助诊断，迄今为止尚无一种抗体对间皮瘤完全特异，都是依靠一组抗体的联合应用。以往用于间皮瘤的抗体组还有HBME、WT1、P-CK等，但由于抗体昂贵或敏感性、特异性、稳定性差等原因没有广泛的推广使用。本研究抗体组试剂便宜、操作简单，特异性、敏感性较高，使间皮瘤的诊断与鉴别诊断水平有了很大提高。

综上所述，由于恶性间皮瘤的病理形态多样，对于临床影像学和组织学鉴别困难的病例，需要依赖于免疫组织化学抗体的联合检测。抗体组CK5/6、Vim、D2-40和 Cal对间皮瘤具有较强的敏感性和特异性，而CK8/18、CEA、ER、PR、CA125对腺癌敏感，两组抗体的联合应用对PMM和OSA的鉴别诊断有重要意义。

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篇8

概述：当前，经过权威资料认证的免疫组化实验方法，已经对免疫组化的最基本问题做出了解答，并可以作为免疫组化技术中一种相对的标准。本文对免疫组化的操作步骤作出了一些具体的描述，提出了一些注意事项，并且对当前、今后的免疫组化自动化和标准化作出了评价和展望。

免疫组织化学在病理诊断中的作用已得到广泛的认同，具有特异性高、敏感性高、程序相对一致等特点，并已成为病理诊断中不可或缺的重要辅助技术。尽管免疫组化的理论比较简单，但方法与步骤却比较繁琐，在实际应用中还存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断。要想达到可靠的实验结果，最重要的是将免疫组化技术的全部程序形成一种概念上的标准化。本文就免疫组化技术的标准化进行一些浅显地探讨。

1 标本的固定

为了使细胞和组织保持原有的形态结构，防止组织自溶和抗原性丢失，固定是关键。标本离体后要求在15分钟内用10%中性缓冲甲醛固定，在常温下时间为8-24小时，避免过度固定，固定时间过长，切片中容易产生甲醛色素颗粒，会影响结果观察以及抗原的破坏。固定组织的固定液为标本体积的5-10倍，脱钙液对抗原也有较强的破坏，所以浓度和脱钙时间不易太长。

2 防脱片的制备

目前通用的是Sigma多聚左旋赖氨酸（Poly-L-ly-sine）或硅化片，具有很理想的防脱片效果。

3 包埋与切片

用过高温度的石蜡包埋组织会破坏抗原，对于固定不太好的组织影响更大，包埋用的石蜡应选用低熔点的石蜡，切片的厚度在3-4微米，以利于观察，太厚的切片会影响染色结果和诊断。

4 烤片

切片在50-60℃的恒温箱里烤片2小时，至少1小时才不至于脱片，烤片时间过短易脱片，时间过长或温度过高会破坏抗原。

5 脱蜡

免疫组化的脱蜡应与常规HE脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，脱蜡不彻底会影响组化染色结果，切片脱蜡后进入梯度乙醇脱水至水化。

6 抗原修复

6.1 抗原修复是组化的关键技术

免疫组化染色中最关键的步骤可以说是抗原修复了，组化染色结果的表达与抗原修复直接相关。因组织被甲醛固定后蛋白质发生交联，抗原决定簇封闭，只有恢复抗原的免疫原性才能完成免疫化学反应。抗原修复方法有多种，主要是酶消化法与加热修复两种方法，现在由于加热抗原修复方法的广泛应用，酶消化法在免疫组化中的应用已很少。免疫组化的加热抗原修复方法包含微波法、水煮法、高压法，现在比较公认的修复效果是高压法大于水煮法，水煮法大于微波法。

6.2 抗原修复液的选择

抗原修复液有多种，有柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）、EDTA（PH8.0）、Tris（PH7-8）等，目前柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）可作为首选的常规使用的抗原修复液，它适合于大多数种类抗体，染色背景清晰。一般抗原难以表达的可以选择EDTA和Tris缓冲液，这两种修复液对一部分抗原修复效果较强，但染色背景较深。

6.3 抗原修复实例

在全国，有多家实验室对ER、PR进行了反复实验，得出的结论是强力推荐使用高压抗原修复方法。

我们单位在最近的免疫组化测评赛中，对参赛的5个待测抗原进行抗原修复，取得了比较满意的结果。根据我们得出的经验，检测CD10、CD30这两项抗原，我们推荐使用高温水煮修复，修复液为tris-EDTA(PH9.0)，检测ER、PR、CK这三项抗原，推荐使用压力锅，修复液为柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），各单位可根据实验室的具体条件和经验选用微波、水煮、高压修复以及抗原修复液。

6.4 高压抗原修复方法

组织切片经二甲苯脱蜡至水，浸泡于蒸馏水中待用，取一定量抗原修复液于压力锅中，修复液必须浸没整张切片，加热沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的修复液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气（整个时间约需4-5分钟），开始计时1-2分钟后，压力锅离开热源，室温冷却15分钟，取下气阀，打开锅盖，切片冷却至室温后，蒸馏水洗，PBS洗2min×3次。

7 生物素封闭

一般进行抗原修复处理的切片都需要进行内源性生物素封闭处理；

7.1 3%H2O2浸泡切片10min

在免疫组化染色中如果采用过氧化物酶检测系统，必须进行封闭处理，这样可以消除组织中的红细胞、粒细胞对染色结果的干扰。虽然3%的H2O2对抗原有轻微的损害，但封闭效果非常显著。

7.2 血清封闭

一般在加载一抗之前使用封闭血清（室温15-20分钟），可以减少非特异性显色。血清的种属一般与二抗的种属相同，一抗中若含正常血清则可以免去此步骤。

实验中通常用的冲洗缓冲液为PBS和TBS，加入Tween20可以加强冲洗效果，在组化染色中严格的冲洗可防止背景着色。

8 一抗孵育

加载一抗50-100ul，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时，如4℃过夜后需在37℃复温45分钟，PBS洗3次各2分钟。

9． 加一滴（50ul-100ul）检测试剂（二抗），室温或37℃放置30分钟， PBS洗三次，每次2分钟。

10. DAB显色5-10分钟

11. 苏木素复染、脱水、透明、封片。

衬染的步骤十分简单，但衬染的好坏对染色质量的影响很大，不易太深或太浅。首选的是Harris苏木素衬染，它在水中洗涤后可以呈鲜亮的兰色，与DAB染色对照效果很好，使用简单方便。

对于即用型抗体，厂商已进行多种实验条件的检测，可以直接使用，而浓缩性抗体，可按照供应厂商提供的稀释度进行预实验，一般在厂家提供的滴度前后各加一个滴度做预实验，抗体的最佳稀释度为在无背景染色的情况下获得最强阳性信号。

通用的检测系统是生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法，有SP、LSAB、ABC等方法，都是目前实验室广泛采用的检测方法，其方法简便易行且试剂稳定。SP三步法和Envision二步法高效经济，为国内免疫组化首选的检测系统。

显色系统通常采用的是辣根过氧化物酶系统，因此选择DAB（棕色）和AEC（红色）酶底物，常规组化显色首选的是DAB，它定位清晰，易于保存。

在免疫组化的质量控制中，最重要的是设立阳性和阴性对照，每批实验中最好有一张阳性对照和阴性对照，这样才能确保实验的可靠性，虽然很多医院病理科的工作量很大，但是不要怕麻烦，可以每月进行一次室间质控，以保证免疫组化染色结果的可靠性和准确性。

自动染色仪，它是一种各种试剂高度通用的仪器，可使用大多数免疫组化染色的抗体、检测系统和其他试剂，是当今最流行的开放式的自动染色仪。它利用电脑控制代替技术人员手工操作，大大地减少了手工操作出现的误差。自动染色仪能精确泵出每次滴加试剂的量，以及将每一步的染色时间精确到秒，空气压缩泵能均匀地吹掉切片上多余的液体，这一切彻底避免了免疫组化染色过程中人工操作的误差，染色仪将所有的染色步骤存储在电脑里，这些优点保证了染色结果的一致性，不同单位的实验室选择相同的试剂及染色过程就可以达到相同的染色结果。

近年来，随着免疫组化标准化的逐步实行，免疫组化自动染色仪将逐步进入病理科，技术人员将从烦琐的人工操作中解脱出来，会极大提高免疫组化的工作效率，同时也将免疫组化标准化推上了一个新的台阶。

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【关键词】

胃肠间质瘤;病理学;免疫组化;CD117;CD34;S-100

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GISTs)分化尚未明确,以往根据发生的部位和形态学的多样性表现被诊断为平滑肌瘤、神经纤维瘤、神经鞘瘤等。近年应用免疫组化法对其特定抗原和基因表达产物进行标记,研究结果对胃肠间质瘤的组织起源、病理诊断标准和生物学行为仍然存在分歧。1983年Mazur和Clark首先命名胃肠间质瘤(GIST)并描述了这是一组位于胃肠道和肠系膜上具有明确病理和免疫组化特征的胃肠道肉瘤[1]。本文通过对一组胃肠间质瘤的回顾研究,以提高对间质瘤的认识。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本院2005年2月至2009年11月经手术后病理诊断证实的24例胃肠道间质瘤(GIST)的临床和病理资料进行分析。患者为男16例,女8例,中位年龄 51(29~72岁)。胃 13例,小肠及结肠 8例,肠系膜3例,临床表现为腹痛、腹胀及发现腹部包块等。

1.2 病理学标准 GIST良、恶性判别采用 Lewin[2]的标准:即将 GIST的恶性指标分为肯定恶性指标和潜在恶性指标,从而将 GIST分为良性间质瘤(无恶性指标)、潜在恶性间质瘤(仅具备 1项潜在恶性指标)、恶性间质瘤(具备 1项肯定恶性指标或 2项以上潜在恶性指标)。肯定恶性指标为:①远处转移(经病理证实);②浸润邻近脏器。潜在恶性指标包括:①胃间质瘤>5.5 cm,肠间质瘤>4 cm;②胃间质瘤核分

裂数>5/50 HPF,肠间质瘤只要出现核分裂,就具有潜在恶性;③肿瘤坏死明显;④核异性大;⑤细胞密度大;⑥镜下可见黏膜固有层或血管浸润;⑦上皮样间质瘤中出现腺泡状结构或细胞球结构。24例中良性 3例,潜在恶性 7例,恶性 14例。

1.3 方法HE染色 甲醛固定,常规切片,HE染色,镜下观察。免疫组化染色:采用北京中衫公司即用型第二代免疫组化EliVision plus广谱试剂盒。免疫组化二代二步染色法标记CD117、CD34、SMA、S-100 蛋白。

2 结果

2.1 病理组织学观察 ①大体形态:GISTs 肿块可单发或多发,体积大小不等,小者为黏膜下或肌壁间结节,大者为肌壁内肿块或向腔内生长,可继发黏膜溃疡,也可向浆膜侧生长形成浆膜下肿块。肿块边界较清,但无真包膜,多呈膨胀性生长。良性间质瘤3例,瘤体一般较小,直径 2~4.6 cm,平均直径约3.5 cm 切面实性灰白,质地韧。潜在恶性间质瘤7例,体积较大,直径3.5~10 cm,平均直径约6.5 cm,切面实性灰白或灰红色,或伴出血囊性变,质地较韧;多数瘤组织边界较清楚,有 2例与 周围组织有粘连。14例恶性间质瘤瘤体大,最大直径20.5 cm,最小瘤体直径4.5 cm,平均直径约11.5 cm,5例累计浆膜外、肠系膜或大网膜多发瘤结节,切面灰白灰红色,质地细腻呈鱼肉状或脑回状,可见出血、坏死及囊性变;②组织学形态:GISTs瘤细胞形态主要为梭形和上皮样形。大部分梭形瘤细胞排列呈束状或交织状,灶性可呈车辐状、栅栏状及围绕血管呈器官样排列。上皮样形瘤细胞主要成弥漫片状、巢状和腺泡状排列,多数瘤细胞胞 界较清楚,细胞呈圆形、卵圆形、不规则形或呈镰刀形,可出现胞质空泡化,似印戒样细胞。本研究 24例肿瘤中梭形细胞型 13例(54.2%),上皮样细胞型5例(20.8%),混合型 6例(25%)。

2.2 免疫组化染色表型 免疫组织化学抗体 CD117阳性定位于肿瘤细胞细胞质或细胞膜呈棕黄色或棕褐色,CD34定位于细胞膜、SMA定位于细胞质、S-100 蛋白定位于细胞核和细胞质。CD117 与 CD34 阳性瘤细胞一般呈弥漫或片状分布,而SMA与 S-100 阳性瘤细胞大部分为散在或小灶状分布。24例GISTs 的 CD117 阳性21例(87.5%),CD34 阳性19例(79.2%),SMA阳性10例(41.7%),提示平滑肌分化。S-100蛋白阳性2例(8.3%),提示神经分化。CD117 和 CD34 共同表达 16例(66.7%),CD117 单项表达4例,CD34 单项表达3例。

3 讨论

1998年,GIST的分子研究有了重大突破。Hirota[3]等发现大部分 GIST表达 C-kit基因蛋白KIT(CD117),C-kit基因有功能获得性突变,而真正的平滑肌肿瘤和雪旺氏细胞肿瘤无 C-kit基因突变和 CD117蛋白表达。故 GIST的概念迅速发生重大改变,现在 GIST特指胃肠道间叶肿瘤(GIMT)中C-kit基因蛋白(CD117)表达阳性,组织学呈梭形和上皮样细胞的肿瘤。目前对 GIST的认识是:GIST只是 GIMT的其中一种类型,是最常见的一种类型,与平滑肌肿瘤、神经鞘瘤、脂肪瘤、脉管肿瘤等 GIMT并列。

由于 Cajal细胞与 GIST体同样表达 CD117和/(或)CD34,两者在超微结构上具有相似性,有学者认为 GIST起源于[4]Cajal细胞。但有学者认为[5]GIST来源于更原始的,具有多潜能分化的中胚叶的间质干细胞,其理由主要是间叶干细胞广泛存在于消化系统的各部位,具有多向分化潜能,这样可以较好地解释 GIST不仅可以发生在胃肠道,也可以发生在肠系膜、网膜和腹膜后等消化道外,而且有如此高的发病率,免疫表型的表达多样化。

C-kit基因是 H24猫科肉瘤病毒 kit癌基因的同源物,位于人染色体 4q12-13。C-kit基因的产物是 Ⅲ型酪氨酸激酶,编码 47kD的跨膜糖蛋白-酪氨酸激酶受体,即 C-kit受体(CD117)。研究发现几乎所有的 Cajal细胞都表达 C-kit,黑色素细胞、生殖细胞及造血细胞也有表达[6]。CD34 是一种骨髓造血前体细胞标记物,内皮细胞和肌纤维母细胞可阳性表达。

近年来,大量的免疫组化研究发现CD34和CD117在GIST中均有高表达,本组病例CD117阳性表达率为87.5%,且其阳性表达不受组织学类型,良恶性及部位不同的影响。CD34阳性表达率79.2%。本组所研究的大部分病例(87.5%)表达CD117,且CD34阴性的GIST病例CD117几乎全部阳性表达,提示CD117是比CD34更敏感的指标,CD34及CD117的阳性率并不能对判断间质瘤的良、恶性起决定作用。但也有报导CD34在鉴别中间性及恶性GIST方面较CD117更为敏感[7]。本组病例SMA, S-100只在恶性,潜在恶性病例中散在表达而良性无一例表达(见表1),提示SMA,S-100免疫表型可作为鉴别GIST良、恶性参考指标,即间质瘤向平滑肌或神经分化多恶性度高。

参 考 文 献

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篇10

[关键词] 免疫组织化学；肿瘤；肿瘤分子；靶向治疗

[中图分类号] R730.4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）09（b）-0188-03

Immunohistochemical clinical pathological application and tumor molecular significance

GUAN Lei

Department of Pathology，Jiangdu People′s Hospital of Yangzhou City in Jiangsu Province，Yangzhou 225200，China

[Abstract] Medical technology is changing rapidly，in the 1970s with the development of monoclonal antibody technology，immunohistochemistry （IHC） is developed in pathology，IHC brings people from the traditional pathological histology （morphology） into protein levels （qualitative and positioning of antigen and antibody） and it is widely applied increasingly in modern pathological diagnosis，and plays a very important role in tumor diagnosis and differential and has a great influence on diagnosis of tumor，tumor classification，prognosis estimation，and expandes people′s understanding of the various diseases and tumor formation，improve the level of the pathological diagnosis and research.Recent molecular pathological diagnosis of tumor and the significance of targeted therapy becoms a hot research topic.

[Key words] Immunohistochemistry；Tumor；Tumor molecular；Targeted therapy

免疫组织化学（immunohistochemistry， IHC）是利用免疫学基本原理，即抗原抗体的特异性结合，标记显色剂的抗体和组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）发生化学反应，是免疫学和组织化学相结合而形成的[1]。它具有较高的灵敏度、特异度，操作比较简便，能将形态和功能代谢相结合，定性、定位和定量相结合，细胞水平和超微结构水平相结合，基因水平和蛋白质水平检测相结合，其特点是形态学改变与功能、代谢变化结合起来。分子病理的发展只能是完善补充之，而不能取而代之。对疑难病例的诊断和分型、指导临床治疗、了解肿瘤预后发挥重要作用，已成为病理科不可缺少的技术支持。

1 IHC的一般临床病理应用

1.1 判断肿瘤的组织起源及确定转移性恶性肿瘤的原发部位

如上皮性标记常用HCK （34βE12）、LCK、CK-pan、CK7、CK19、CK20、EMA、CEA、TG、TTF-1等；软组织标记常用Vimentin、Desmin、SMA、MyoD1、CD31、CD34、CR等；神经组织标记常用GFAP、NF、S-100、CgA、SY、NSE、MBP等；对于某些转移性腺癌可以通过CK7、CK20、TTF-1、CA125、CA15-3、E-Cadherin等来确定癌的来源。

1.2 确定肿瘤及分期

肿瘤相关抗原有利于临床病理诊断和鉴别诊断，常用的有AFP、CEA、CA15-3、CA19-9、CA125、Melan-A、HMB45等。判断肿瘤是原位或浸润，有无血管、淋巴管或神经侵犯与肿瘤分期密切相关。如用层粘连蛋白（laminin）和Ⅳ型胶原抗体（collagen Ⅳ）可以显示基底膜受损破坏情况，用于区分原位癌和浸润癌。有研究发现，IHC检测胃癌标本的CD34、D2-40有助于判别血管浸润和淋巴结转移[2]。

1.3 判断肿瘤良恶性以及淋巴瘤的分型

如用免疫球蛋白（Ig）的轻链抗体检测B淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别是肿瘤性增生还是反应性增生。淋巴系统、髓系统的细胞在分化成熟的不同阶段和外周淋巴细胞活化的过程中细胞表达的抗原是不尽相同的，因此各种恶性淋巴瘤和白血病也可通过IHC检测肿瘤细胞所表达的抗原来诊断与鉴别诊断[3]。通常采用CD3、CD45RO、CD43、CD20、CD79a、CD10、Bcl-2等，一组抗体有时作几个T系及几个B系，IHC几乎已成为常规开展的工作项目。

1.4 发现微小转移灶

常规病理组织学方法要在一个组织中认出单个转移性肿瘤或几个瘤细胞是困难的，采用IHC则有助于发现微小转移灶，如胃黏膜活检中的印戒细胞癌，淋巴结内极少转移性瘤细胞的寻找，骨髓内个别转移性瘤细胞的认定等，使微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓）、甚至不易察觉的病变得以确诊，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定等。

1.5 检测肿瘤增殖活性

肿瘤增殖活性的高低直接影响临床治疗与预后，用IHC检测增殖细胞抗原（PCNA）、Ki-67最为简便、可靠。标记指数高者常淋巴结转移率高，无瘤缓解期和存活时间短，预后不良。Ki-67高表达与乳腺癌的ER阴性、人类表皮生长因子受体-2（HER-2）阳性、高级别及淋巴结转移相关，是其重要的预后与预测标记[4-5]。其他预后指标如p53、Bcl-2等也常应用于临床。

1.6 诊断感染性疾病

可以识别组织切片中的病原体而用于感染性疾病的诊断[6]。IHC应用特异性抗体检测结核分枝杆菌、幽门螺杆菌、梅毒螺旋体、乙型肝炎病毒（HBV）、巨细胞病毒（CMV）、人状瘤病毒（HPV）、疱疹病毒（HSV）等，这样病理医生就可以在病毒感染导致的可识别的细胞形态病理改变之前或病毒培养结果之前明确发现病原体抗原的部位及定量。

2 几种常见癌基因检测及肿瘤分子靶向治疗

2.1 HER-2

HER-2基因位于17号染色体q12～q21，是具有受体酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体家族，具有促进肿瘤细胞增殖、增强侵袭力及抑制细胞凋亡的作用，HER-2受体蛋白介导的信号转导有RAS/RAF/MEK/ERK途径和PI3K/PIP2/PIP3/PDK1/AKT途径[7]。20%～30%的乳腺癌患者有HER-2的扩增和蛋白过表达，其阳性与乳腺癌分级和淋巴结转移正相关，提示预后差。HER-2基因高扩增与ER、PR阴性表达相关，对内分泌治疗的反应差及生存率低[8]。近年来一种新型分子靶向治疗药物――曲妥珠单抗，已被成功应用于治疗HER-2基因扩增或过表达伴或不伴腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者。临床最常用的HER-2基因检测方法是IHC和荧光原位杂交（FISH），IHC操作简便、价格低廉，与FISH符合率高，HER-2蛋白高强度表达（3+）与基因扩增有极好的一致性，而中等强度表达（2+）必须进一步行FISH法基因检测，IHC可用作临床治疗是否应用曲妥珠单抗的初筛[9]。

2.2 拓扑异构酶Ⅱ（TOP2）A

与HER-2基因相邻，参与DNA的重组、修复、转录与复制过程，可促进癌发生。TOP2A的异常分为扩增与缺失。三阴性乳腺癌（TNBC）预后差、缺少特异治疗，TOP2A蛋白过表达可见于TNBC，它是细胞内蒽环类药物治疗的靶点，蒽环类药物给TNBC患者带来福音[10-11]。胃癌的发病率和死亡率很高，但尚未建立可靠的诊断和预后的标志物，用IHC法检测胃癌组织样本中HER-2和TOP2A的表达均高于癌旁正常胃组织，与胃癌的发生、发展、远处转移和肿瘤分期相关，但两者表达无相关性，HER-2与胃癌的淋巴结转移相关，TOP2A与胃癌的浸润深度相关，它们可作为评价胃癌患者预后的有用标记[12]。

2.3 表皮生长因子受体（EGFR）

EGFR是HER家族成员之一，其高表达与肿瘤细胞的增殖、血管生成以及转移相关。在全球范围内，肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占80%，存在EGFR的异常高表达，用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）（gefitinib 或erlotinib）单药治疗NSCLC，可增加患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS），特别是不吸烟、腺癌和EGFR基因突变患者[13]。用IHC方法分析肺癌组织中EGFR突变蛋白，观察染色肿瘤细胞的比例和染色的深度，以此标准量化NSCLC 患者EGFR突变阳性，并可用以预测EGFR- TKIs的治疗效应[14]。

2.4 p53

p53位于人类第17号染色体短臂上（17p13.1），是一种抑癌基因，在肿瘤代谢过程中发挥重要作用。野生型p53为细胞周期调节蛋白，当DNA或染色体损伤严重时，触发凋亡机制，抑制细胞增殖，而突变型p53则具有致癌活性，与许多肿瘤的发生、发展密切相关[15]，具有泛瘤性。p53突变率高的乳腺癌细胞增殖活力强、分化差、恶性度高和淋巴结转移率高，用IHC检测p53蛋白表达，可作为评判乳腺癌生物学行为的一个独立因素。近来报道[16]利用二氧化硅纳米颗粒的p53基因治疗，对人乳腺癌细胞有明显的抑制效应。不断增加对p53调节机制的理解，在此基础上加强对新药的研究，以期在癌症发展时通过重新激活p53的疗法让患者获益[17]。研究发现在24例NSCLC患者体内注射rAd-p53并联合顺铂治疗，17例患者达到病情稳定，提高了生活质量并延缓了病情发展[18]。

2.5 间变性淋巴瘤激酶（ALK）

棘皮动物微管相关类蛋白4（EML4）与ALK融合基因存在于3%～5%的NSCLC，EML4-ALK融合基因激活了ALK酪氨酸激酶，引发凋亡抑制和促进肿瘤细胞增殖，ALK融合基因作为NSCLC一个特殊的分子类型，该患者具有独特的临床特点，诸如肺腺癌、从不吸烟或少吸烟、通常与EGFR突变不同时存在。IHC法检测ALK基因重排灵敏度、特异度及可重复性均佳，个别检测结果不确定可结合FISH和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法[19-20]。Crizotimib是一种新型靶向抗癌药，被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于ALK阳性的晚期NSCLC效果明显，能改善肿瘤患者症状、延长患者的PFS，且毒性低，患者耐受性较好，受到临床关注[21-22]。

3 结语

石蜡切片是制作标本最常用、最基本的方法，IHC首选之，对组织形态保存好，能连续切片，便于各种染色观察，还能长期存档，供回顾性研究，但甲醛固定法封闭了细胞内部分抗原决定簇以及蛋白发生交联使抗原决定簇隐蔽，因此IHC首先要行抗原修复或暴露，还强调做好组织前期的处理以及阳性对照和阴性对照，避免假阳性和假阴性，严格做好IHC质量控制，才能得到可靠的IHC染色[23]。IHC便于在大部分基层医院开展，满足基层患者疾病诊治的需求，提高了病理诊断的水平。

在常规肿瘤病理诊断中，大约10%的肿瘤诊断是疑难的，随着IHC技术的发展和各种特异性抗体的涌现，使越来越多的疑难肿瘤得以明确诊断。在低分化或未分化肿瘤的鉴别诊断时，准确率可达50%～75%。

正如所有的事物都有两面性，IHC亦如此。迄今为止特异性单抗比较少，目前没有一种抗体只对其相应的组织或细胞是绝对特异的，病理医生选择抗体及判断结果都要客观谨慎地以HE形态为依据，这是一个重要原则，IHC结果判断的正确性和可靠性体现病理医技人员的综合水平。

随着分子病理学的发展，靶向治疗在肿瘤治疗中有了很大进展[24-25]，为一些细胞毒类药物疗效不佳的恶性肿瘤患者带来了希望，选择合适个体化治疗的药物正成为一种发展方向和趋势，IHC则发挥着不可小觑的作用。

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