蛋白酶体范文

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篇1

[关键词] 蛋白酶体抑制剂；泛素-蛋白酶体通路；肺癌；作用机制

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（b）-0038-04

[Abstract] The ubiquitin-proteasome pathway is the principle pathway for intracellular protein degradation. Research shows that ubiquitin-proteasome pathway plays a significant role in the genesis and progression of malignancy by regulating many processes of cellular biology. Proteasome inhibitors targeting the ubiquitin-proteasome pathway can inhibit tumorous cellular growth， becoming a novel class of potent and effective antitumor agents. Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths globally. The study about the effect of proteasome inhibitors on lung cancer is ongoing. The mechanisms are complicated， relating to the down-regulation of NF-κB， cell cycle control， PTEN/PI3K/AKT pathway， the regulation of P53 and others. The recent advances about proteasome inhibitors in the treatment of lung cancer is going to be reviewed in this paper.

[Key words] Proteasome inhibitor； Ubiquitin-proteasome pathway； Lung cancer； Mechanism

泛素-蛋白酶体通路（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是生物体内蛋白质降解的重要通路，此通路选择性降解细胞内受损及错误折叠的蛋白质，并对各种短寿命的功能蛋白具有快速降解作用。80%～90%的细胞内蛋白均通过此途径降解，其中包括细胞周期调控因子、基因转录因子、癌基因蛋白等[1]。UPP通过对上述蛋白的降解，调节细胞增殖、分化、存活和凋亡，在人体诸多生理过程中发挥重要作用，如信号转导、细胞周期调控、细胞凋亡调节、转录调控等，对维持细胞的稳态具有十分重要的意义，其功能的改变和异常能直接导致或诱发人类的许多重要疾病[2]。蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体活性而阻断UPP，具有抑制多种肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡的作用，目前已成为抗肿瘤治疗的研究新热点。本文就UPP、蛋白酶体抑制剂在肺癌治疗中的进展综述如下：

1 泛素-蛋白酶体通路的组成

UPP由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、26S蛋白酶体、去泛素化酶等组成。此途径的核心是26S蛋白酶体，它是一个多催化复合物，由20S核心蛋白酶和两端各一的19S调节亚基组成。20S核心蛋白酶是蛋白酶体复合物的水解核心，具有胰蛋白酶、糜蛋白酶和胱天蛋白酶活性。UPP在降解靶蛋白时，首先要实现靶蛋白的泛素化，即若干泛素经E1、E2、E3的作用与靶蛋白相连[3]。只有泛素化的靶蛋白方可被19S调节亚基识别，进而进入20S核心蛋白酶体内部，被降解成3～22个氨基酸的小肽段，在细胞内回收利用。泛素分子则被泛素解离酶从靶蛋白上解离下来，重复利用[4]。

UPP通过上述过程，上调或下调某些抑癌基因、转录因子和细胞周期素等的表达以及改变MHC-Ⅰ限制性抗原肽的生成[5]，参与恶性肿瘤多种细胞生物学过程的调节，从而参与恶性肿瘤的发生和发展。

2 蛋白酶体抑制剂

蛋白酶体抑制剂按其不同的末端亲电基团可以分为硼酸肽类、环氧酮肽类、醛基肽类和乙烯基砜肽类等多种类型，以上均属于合成化合物，此外还有天然蛋白酶体抑制剂如乳胞素、3，4-二氯异香豆素（DCI）、阿克拉霉素（Aclacinomycin）、PR-39等。按其作用方式不同，蛋白酶体抑制剂又可分为可逆性和不可逆性两种。醛基肽类是第一个被发现并广泛应用的蛋白酶体抑制剂，如MG132，是可逆性蛋白酶体抑制剂，其进入细胞速度快，能抑制ChT-L活性、半胱氨酸和丝氨酸蛋白酶活性，但醛基肽类化合物是非选择性的，会抑制其他酶类，且稳定性较差，易被氧化。

目前临床上研究最多、最完善的是硼替佐米，它属于硼酸肽类，是一种具有高选择性、可逆性的蛋白酶体抑制剂。硼替佐米（PS341、万珂）于2003年被美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，具有较广的抗肿瘤谱，除了用于治疗多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤外，它对其他肿瘤细胞，如肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌等均具有细胞毒性，可引起肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长[6]。近年来，研究者对硼替佐米进行结构改造，得到了新型硼酸肽类蛋白酶体抑制剂YSY-01A，研究表明，它在多种肿瘤细胞中均具有抑制增殖的作用[7]，其LD50值高于硼替佐米3倍，且毒副作用更低，有望成为新的研究热点。此外，环氧酮肽类化合物卡非佐米也于2012年被FDA批准用于多发性骨髓瘤的治疗。

3 蛋白酶体抑制剂与肺癌

肺癌在人类癌症死亡中居于首位，严重危害人类健康。据世界卫生组织统计，2008年，世界范围内有160万人被诊断为肺癌，同年有140万人死于此病。我国每年大约超过60万人死于此病。而其中非小细胞肺癌（NSCLC）大约占肺癌所有患者的80%。因此，为了使这个庞大的患者群体得到更好的治疗，能否制订出有效的抗肿瘤方案尤为重要。蛋白酶体抑制剂对多种血液系统肿瘤及实体瘤均有疗效，有关蛋白酶体抑制剂对肺癌，特别是NSCLC治疗研究亦不在少数，但其作用机制仍不完全明确。

3.1 作用机制

3.1.1 下调核因子κB 核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）普遍存在于真核细胞中，对超过200种基因具有调节作用，其中包括细胞黏附分子、血管内皮生长因子、凋亡调节基因如Bcl-2、Bcl-xL等，这些基因与肿瘤生长和转移息息相关。故而NF-κB的下调对抑制肿瘤的生长或促进肿瘤细胞凋亡发挥重要作用[8]。通常情况下，NF-κB以二聚体形式与其抑制蛋白IκB相结合，以无活性状态存在于细胞中。但当细胞受到细胞因子、生长因子、细菌、病毒、应激状态等刺激时，IκB被UPP降解，NF-κB从而被游离、激活[9]，发挥对其下游转录基因的调控作用，最终发生肿瘤生长因子表达增多，血管生成，细胞凋亡减少，诱发肿瘤可能[10]。蛋白酶体抑制剂可抑制IκB降解，从而阻止上述过程，调控细胞周期进程，控制细胞凋亡，抑制血管生长，对肿瘤治疗的各方面靶点均有作用。

3.1.2 对细胞周期的调控 在真核细胞中，细胞周期由细胞周期蛋白和细胞周期依赖性激酶（CDKs）调节。不同的CDK对应相应的细胞周期蛋白，调节细胞周期的各个阶段。而CDKs的抑制物（CKIs）则限制CDKs活性及细胞周期进程。P21WAF1/Cip1是众多CKIs中的一种，其在细胞周期G2/M期阻滞中发挥作用。P27Kip1是另一种CKI，可以阻止细胞从G1期到S期，上述二者都是UPP的降解底物[11]，当蛋白酶体被抑制时，CKIs不能被降解，使细胞分裂停止于各个不同时期，导致细胞凋亡而抑制肿瘤生长[1]。Ling等[12]在PS341作用于NSCLC H460细胞的研究中发现，在PS341作用下G2/M期细胞增多，研究中亦发现G2/M期阻滞与周期蛋白A1、周期蛋白B及其激酶的增加有关。

抗凋亡基因Bcl-2与肿瘤细胞凋亡抑制及化疗抑制有关，蛋白酶体抑制剂能克服Bcl-2介导的凋亡抑制，同时上调Bcl-2家族中的促凋亡分子Bax，降低Bcl-2/Bax的比值，促使肿瘤细胞凋亡。Ling等[13]在PS341作用于NSCLC的另一项研究发现，G2/M期细胞的数目与Bcl-2的磷酸化程度相一致，提示蛋白酶体抑制剂通过磷酸化作用下调NSCLS细胞中的Bcl-2水平，这也是癌细胞凋亡的机制之一。

3.1.3 P53的调控 抑癌基因P53在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。当细胞受到化学或电离辐射，DNA发生损伤时，P53经磷酸化或其他途径活化，从其抑制物MDM2中脱离，P53蛋白大量积累，诱导P21WAF1/CIP1转录，使细胞周期停滞，并阻止DNA合成，同时修复损伤的DNA。许多肿瘤中都存在P53基因突变，使P53不能表达或无法诱导下游的转录活动，DNA无法修复，异常的DNA传递给子代细胞，逐步积累，最终导致肿瘤的发生。P53通过UPP降解，故而蛋白酶体抑制剂可使P53积累，且有稳定P53的作用[14]。既往研究认为，P53诱导NSCLC停滞于G2/M期[15]，从而阻止肿瘤的发生。但有研究通过使用除P53外，其余基因完全相同的人类癌细胞，重新评估P53在PI诱导的肿瘤细胞凋亡中的作用[16]，该研究发现，硼替佐米和MG132诱导癌细胞凋亡均不依赖P53。Ling等[12]在NSCLC的研究中也发现，蛋白酶体抑制剂对细胞生长的抑制作用仅部分依赖P53功能，而细胞周期发生G2/M期停滞并不依赖P53。

3.1.4 PTEN/PI3K/Akt 通路 PI3K/Akt信号转导通路是肿瘤生长的重要通路，PI3K的激活是此通路的基础，活化的PI3K可将信息传递给通路的第二信使PIP3，接着活化Akt及PDK1，通过刺激其下游作用因子，促进肿瘤细胞的生长、增殖、浸润和转移。PTEN基因是与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，它可通过PIP3去磷酸化拮抗PI3K/Akt通路[17]。Sherwood等[18]在硼替佐米致结肠癌SW480细胞凋亡的研究中发现，PTEN蛋白表达水平与硼替佐米作用时间正相关，随PTEN蛋白表达增加，Akt蛋白表达降低，从而抑制通路活性。Sun等[19]在YSY-01A抑制NSCLC A549细胞生长的作用机制的研究中亦发现，A549细胞增殖抑制时，PTEN的表达增加，PI3K表达减少。

3.1.5 抑制血管生成 肿瘤直径达到1～2 mm后，若无新生血管生成来提供营养，则不能继续生长[20]。新生的血管不仅可以为肿瘤输注养分、排除废物，还提供了肿瘤细胞的转移途径。实验证明，蛋白酶体抑制剂通过阻碍NF-κB入细胞核的过程，降低其活性，进而下调缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的表达，使血管内皮生长因子（VEGF）减少，抑制血管生成[21-22]，从而抑制肿瘤生长和转移。

3.1.6 其他 蛋白酶体抑制剂的抗肿瘤机制复杂，除上述机制外，蛋白酶体抑制剂还可促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导的凋亡[23]，此过程与蛋白酶体抑制剂下调NF-κB，诱导caspase-8和caspase -9活化，上调死亡受体DR4/DR5有关。此外，PIs还可逆转化疗药物的耐药性、增加放化疗敏感性，缓解肿瘤恶病质，这些均为蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗提供了基础。

3.2 联合治疗

放化疗是肺癌治疗中的重要手段，但肺癌细胞对化疗药物的耐药性、毒副作用以及放疗过程的辐射及患者耐受性是治疗过程中的一大难题。上文陈述了蛋白酶体抑制剂在肺癌中的抗肿瘤机制，为肺癌的治疗提供新思路。目前关于硼替佐米对肺癌治疗的临床研究较多见，硼替佐米耐受良好，但单一用药效果较温和。Li等[24]在硼替佐米对初次化疗的已发生癌细胞转移的NSCLC患者治疗的研究中发现，虽然患者耐受良好，但未见疾病客观缓解，其疗效并不明显。另一些研究也表明，患者对硼替佐米耐受良好。Piperdi等[25]在硼替佐米联合标准剂量的卡铂及贝伐单抗治疗晚期NSCLC的研究中发现，硼替佐米剂量分为1.3、1.6、1.8 mg/m2三组，在前3周中，三组中所有16例患者均未出现与硼替佐米剂量相关的不良反应，硼替佐米与当前化疗方案相结合，则显示出令人惊喜的疗效。Davies等[26]在硼替佐米联合吉西他滨/卡铂治疗晚期NSCLC的临床研究中发现，患者生存受益，中位生存期为11个月，1年和2年生存率分别为47%和19%。Zhao等[27]在硼替佐米联合紫杉醇、卡铂及胸部放疗的治疗研究中也提示该方案可潜在获益，其中位存活期为25个月，12个月生存率为73%，但血液系统方面的副作用，如白细胞减少、中性粒细胞减少等有所增加。

4 小结与展望

蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗作用已经取得了一定的研究成果。许多体内外实验证实蛋白酶体抑制剂对肺癌细胞的杀伤作用，目前的临床实验已证实蛋白酶体抑制剂对肺癌的治疗具有很高的可行性。随着蛋白酶体抑制剂的作用机制以及在临床应用方面研究的不断深入，在肺癌方面的作用也会进一步明确，可能成为治疗肺癌的新方法。

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篇2

【关键词】核糖体核糖体S6Ks蛋白激酶;肿瘤

蛋白分子的磷酸化是细胞内信号传导过程中最重要的调节方式之一。各种蛋白激酶通过将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上,使底物蛋白磷酸化,这种磷酸化作用不仅可以调节蛋白质活性,还可以使传导信号逐级放大,最终引起细胞内反应。可以这么说,细胞内所有的活动都离不开蛋白激酶的参与,而激酶的磷酸化作用也正体现了细胞信号传导过程中最为有效的调节方式。核糖体S6Ks蛋白激酶作为cAMP-cGMP依赖性激酶和PKC激酶超家族成员之一,在细胞生长、繁殖和细胞能量代谢过程中发挥着重要的作用。激酶的活性调节首先是通过一系列丝氨酸/苏氨酸位点的磷酸化和去磷酸化作用实现的,生长因子、细胞因子、激素等细胞外刺激信号可引起激酶的快速活化,而生长抑制物如类固醇等则能抑制激酶的活性。另一方面,活化的S6Ks蛋白激酶又可以将上游信号传导给多种效应底物,其中比较著名的就是核糖体蛋白S6,后者作为真核细胞中核糖体40S亚基的组成元件,通过增加具有5’末段寡嘧啶序列结构的mRNA的翻译,达到诱导多种蛋白组分合成的作用。

1核糖体蛋白S6Ks概述

S6Ks最初分离自有丝分裂剂刺激的瑞典鼠源3T3细胞系,经纯化、克隆、表达研究发现RPS6KB1基因定位在17号染色体长臂23位,由于选择性mRNA剪切和不同的翻译起始位点得到两个激酶同工型,分别命名为S6K1和S6K2。根据核浆定位的不同又将激酶区分为核定位的S6K1 I,S6K2 I和浆定位的S6K1 II,S6K2 II,两者的主要区别在于前者的氨基末端存在有额外的核定位信号。核浆表达转换是所有胞浆型S6K激酶具有的共同特点之一,表现为在血清饥饿的细胞中S6Ks II型主要存在于胞浆内,而当有血清或生长因子刺激时,S6K II型激酶将转入细胞核内,尽管这一改变的具体机制不甚明了,但其所存在的意义已经受到多方关注。研究表明S6Ks在控制细胞大小、生长和繁殖中发挥着重要作用,通过协同作用方式达到组织器官的正常发展。

2S6Ks分子的活化机制

首先,在我们具体研究S6K1磷酸化信号通路之前,我们有必要简述一下S6K1蛋白的一级结构组成,以及每个引起激酶活化的磷酸化位点及其之间的相互作用方式。 S6K1蛋白激酶主要由三个部分组成(图1),他们分别是:位于羧基末端的自主调控区,具有高度同源性的酸性氨基末端以及位于两者之间的丝氨酸/苏氨酸激酶催化区域(1)。

2.1S6K1多磷酸化位点到目前为止,在内源性S6K1蛋白激酶中已基本确定了八个主要的磷酸化位点(1)。其中位于激酶羧基末端自主抑制区内的Ser411、Ser418、Thr421和Ser424四个磷酸化位点是最先被确定下来的,被称作S/T-P位点,在有丝分裂原刺激的S6K1活化中发挥重要作用。这些位点具有的共同特点是在他们的+1位上有一脯氨酸而在-2位上有一疏水性氨基酸残基,这一结构可以被一系列脯氨酸作用激酶,例如Erk1和Erk2、压力活化蛋白激酶和Cdc2所识别,进而使位点得以磷酸化。随后研究又发现了拥有相同结构特点的Ser371位点和Thr229、Thr389、Ser404位点(2),其中Thr229位于激酶活化环中而其余三者位于连接催化区和自主抑制区的激酶铰链区,这些后期发现的位点均表现出对免疫抑制剂rapamycin和真菌代谢产物wortmannin的高度敏感,在激酶活化过程中具有重要作用。突变分析揭示Thr229、Thr389、Ser404位点有一共同特点即在它们的侧位上均有一些庞大的芳香族氨基酸,将这三个位点转变成酸性或者中性氨基酸会发现Thr229和Thr389具有重要调控作用,而Ser404仅表现一定调节功能。同源性分析还发现Thr229、Thr389、Ser371位点以及他们所定位区域在大部分Ser/Thr激酶的AGC超家族成员中高度保守,相反地,自主抑制区以及S6K1的羧基末端结构在AGC家族的其他成员中却显著缺失。这一不同使人们对自主抑制区在S6K1活化过程中的具体作用产生了疑问,为此多种S6K1蛋白截断体和不同位点突变体被相应构建出,用以分析在各种不同结构中,S6K1蛋白活性情况的改变。比较突出的发现是当截断S6K1的氨基末端时,将严重影响到激酶的活性以及有丝分裂原诱导的Thr229和Thr389位点的磷酸化,而这种影响在同时移除掉激酶羧基末端或缺失掉自主抑制区的情况下得以解救。这些结果说明自主抑制区或者说这些磷酸化位点定位的区域在调控S6K激酶活性以及Thr229和Thr389位点磷酸化的过程中起着重要作用。

2.2磷酸化调节许多研究已表明S6K蛋白激酶的活化是由多磷酸化位点级联反应,协同作用实现的,它反映出分子水平上错综而复杂的交互关系。首先,突变掉氨基末端的p70S6KΔN54突变体,其对有丝分裂原反应活性的降低可被羧基末端同时缺失的行为所解救(3),而突变掉羧基末端四个自主抑制S/T-P位点的行为仅可部分解救其活性损失,这说明自主抑制区在调控p70S6K蛋白活性和Thr229磷酸化水平中起重要作用却又不完全(1)。其次当突变掉羧基末端104个氨基酸残基得p70S6KΔC104突变体,发现Thr229基础磷酸化水平有所升高而Thr389未受影响,但突变体本身却表现出低激酶活性,当受到血清刺激反应时,Thr229和Thr389的磷酸化水平均提高且相应的激酶被活化(3),这说明羧基末端的缺失将打破对Thr229磷酸化的调节却无法使激酶活化。进一步的Thr389位点突变反应发现由谷氨酸替代Thr389可以使基础p70S6K蛋白激酶活性和Thr229的磷酸化水平得以提高,而由丙氨酸替代Thr389后则使p70S6K活性及Thr229相对于血清的磷酸化反应完全丧失(1),这可说明在p70S6K蛋白激酶中,Thr229的磷酸化受到自主抑制区和Thr389位点的协同调节作用。此外还有相关实验发现缺失掉氨基和羧基末端的突变体p70S6KN54C104对rapamycin不再敏感,却保留了对wortmannin的敏感性,而缺失羧基末端的p70S6KΔC104突变体却仍然保持着对rapamycin的敏感性,将这些发现结合在一起可以得出这样的假设,rapamycin-FKBP12复合物增加了某种负性影响因子的活性,例如磷酸酶,而这一因子的活性作用正需要p70S6K的氨基末端执行其抑制功能。相反的,在PI3K依赖的信号通路中,则可能是某一正性影响因子受到调控,因为p70S6KN54C104仍保有对wortmannin的敏感性。综上所述,我们可为p70S6K蛋白激酶活化途径建立如下一个级联模型(如图2):首先刺激信号影响自主抑制区的S/T-P位点,使其磷酸化;他们的活化将打破激酶羧基和氨基之间的相互作用,暴露出链结构区的Thr389位点,使此位点在氨基末端功能的协调下易于被磷酸化,但此时蛋白仍处于失活状态;而后Thr389位点的磷酸化将完全暴露激酶活化环中的Thr229位点,此位点的最终磷酸化将激活S6K蛋白活性,发挥其功能。

2.3其他调节位点尽管上述结论使我们建立了一个p70S6K蛋白活化基本模型,但针对细胞内具体活化步骤仍存在有许多疑点。由于缺失掉羧基末端的p70S6KΔC104突变体仍对激酶活化和Thr389磷酸化具有严格的调控作用,这说明还存在有其他调节位点在S/T-P缺失的情况下控制Thr389磷酸化。因为AGC家族成员中多数含有与Thr389同源的位点,且在此位点周围有一些保守结构域(2),为此人们确定出一个新位点,即Ser371(4).Ser371位点的+1位和-2位上也分别有一脯氨酸和疏水性氨基酸残基,尽管其不能自身磷酸化,但他却可潜在性的调节激酶氨基末端,催化区域和自主抑制区间的相互作用(4)。实际研究中发现,将Ser371突变为谷氨酸或者天冬氨酸可封闭掉Thr389磷酸化和激酶活性,却并不影响Thr229的磷酸化(4),这可能是因为Ser371的突变打破了铰链区对Thr389和Thr229磷酸化水平的正常调节功能。要想使有关p70S6K蛋白激酶活化机制的描述更加精确,Ser371和Ser404位点在级联模型中的作用更加具体,更多的实验需要我们作进一步研究。

2.4S6K2磷酸化因为S6K2蛋白在调控区域和磷酸化位点上与S6K1高度同源,有研究估计S6K1的活化机制可能也适用于S6K2。除此之外,由于S6K2还在羧基末端含有一个潜在的核定位信号以及一个脯氨素富集区段,可以通过与SH3结构的结合,介导S6K2蛋白与其他含有SH3结构蛋白间的相互作用。因此,S6K1和S6K2的羧基末端可以使S6K1和S6K2分别结合于不同的分子内区域(3)。

3S6Ks蛋白在肿瘤中的表达

近年来有关S6K与肿瘤相关性的研究认为S6K蛋白激酶具有致癌潜能。研究发现在MCF-7乳腺癌细胞系中,基因编码的S6K1得到大量扩增且表达增加,并且有近10%预后较差的人类乳腺肿瘤与S6K1相关(5)。因此有的作者认为S6K1可以作为第一个致瘤标记物用以评判原位治疗术后的预后情况,以及在肿瘤病人诊断初期用于作为临床是否进行原位治疗的标准之一(5)。此外还有报道称S6K1蛋白在乳腺腺瘤和腺癌,甲状腺癌(6)以及子宫内膜癌(7)中均有过表达,在原发性人白血病和骨髓瘤中被结构性活化(7),在状甲状腺组织中也检测到S6K1磷酸化水平的增加(5),以上研究结果都让人意识到S6K1的表达与细胞恶性增生以及肿瘤的发生有着一定的联系。此外尽管S6K2很少被认为具有致瘤潜能,但有关报道也发现其在小细胞肺癌细胞系(8),乳腺癌及乳腺癌细胞系中过表达(5),其在上皮腺肿瘤细胞核中的聚集强于正常组织。

4展望

随着人们对S6Ks激酶活化机制诸多细节的研究以及其在各种病理状态下表达水平的改变,增加了我们对于调控S6Ks激酶功能的上游元件以及激酶在细胞生长中的具体作用机制的了解。这些研究确定了PI3K和mTOR通路为活化S6Ks激酶的两条主要通路,mTOR作为活化通路上的重要调控元件,参与了多种信号诱导的级联反应。此外免疫抑制剂rapamycin及其类似物针对mTOR功能的抑制所表现出来的抗肿瘤特性,已受到人们的广泛关注,尽管他们在一期临床实验中所表现的抗肿瘤活性并不十分普遍,但毕竟肿瘤是一个多因素多途径涉及的病理异常产物,对于它的研究及治疗亦需兼顾到多因素的协同作用。因此我们坚信,随着人们对于S6Ks如何控制蛋白翻译和细胞生长等具体功能机制研究的逐步完善,势必为我们在攻克肿瘤疾病这一艰难旅途上提供更为有效的药物治疗依据。

参考文献

[1]Dennis PB, Pullen N, Pearson RB, Kozma SC, Thomas G. (1998) Phosphorylation sites in the autoinhibitory domain participate in p70s6k activation loop phosphorylation. J Biol Chem 273: 14845-14852

[2]Pearson RB, Dennis PB, Han JW, Williamson NA, Kozma SC, Wettenhall REH, Thomas G. (1995) The principal target of rapamycin-induced p70s6k inactivation is a novel phosphorylation site within a conserved hydrophobic domain. EMBO J 21: 52795287

[3]Dennis PB, Pullen N, Kozma SC, Thomas G. (1996) The principal rapamycin-sensitive p70(s6k) phosphorylation sites, T-229 and T-389, are differentially regulated by rapamycin-insensitive kinase kinases.Mol Cell Biol,16: 62426251

[4]Moser BA, Dennis PB, Pullen N, Pearson RB, Williamson NA, Wettenhall EH, Kozma SC, Thomas G. (1997) Dual requirement for a newly identified phosphorylation site in p70s6k.Mol Cell Biol 17: 56485655

[5]Couch FJ, Wang XY, Wu GJ, Qian J, Jeneins PB, James CD. (1999) Localization of pS6K to chromosomal region 17q23 and determination of its amplification in breast cancer. Cancer Res 59: 1408-1411

[6]Barlund M, Forozan F, Kononen J, Bubendorf L, Chen Y, Bittner ML, Torhorst J, Haas P, Kallioniemi A. (2000) Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst 92: 1252-1259

篇3

鼻咽癌是我国常见恶性肿瘤之一，极易发生侵袭转移，远处转移是其治疗失败的主要原因。目前认为，癌基因异常激活和抑癌基因监控失活在鼻咽癌侵袭转移等恶性生物学行为中起着重要作用，阐明上述机制，是控制鼻咽癌的关键。蛋白酶活化受体家族pars（protease－activated receptors）是介导血栓形成的一种g蛋白耦联受体，pars家族有4 种亚型,par1是其中研究最为深入的一种。par1表达于人多种正常细胞，在调节血栓形成、细胞粘附和迁移、整合素的衔接、有丝分裂、介导过敏等多种病理生理过程中发挥作用。新近研究发现par1在多种恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌、前列腺癌等）中也高表达par1，而且这种表达与肿瘤侵袭转移等生物学行为密切相关。par1在人鼻咽癌这一高度恶性高侵袭性的肿瘤中的表达未见文献报道。本实验首次对人鼻咽癌组织及细胞系中的par1表达进行研究,并探讨par1的表达在人鼻咽癌中的意义。

1 资料及方法

1.1 标本及临床病理资料

收集武汉协和医院耳鼻喉科门诊2006年12月～2007年9月期间的鼻咽部活检标本共89例，均为初治患者，所有标本均经光镜he染色后病理学诊断：其中鼻咽良性病变28例，鼻咽癌61例。肿瘤生长模式按照显微镜下npc 癌细胞生长方式分为三型[1]即: 癌细胞巢状膨胀性生长为主的regaud型,癌细胞弥漫性浸润性生长为主的schminke型,癌细胞既膨胀性又浸润性生长的combination混合型。

1.2 药物和试剂

细胞培养试剂购自gibco公司，trizol (invitrogen公司)，逆转录试剂盒(k1621)由武汉晶美公司购自fermentas公司。par1鼠抗人单克隆抗体(购自santa cruz biotechology,sc?13503)。sp kit、hrp标记羊抗鼠igg购自、dab显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。蛋白裂解液购自pierce公司。

1.3 细胞培养

人鼻咽高分化鳞癌细胞株cne?1、低分化鳞癌细胞株cne?2由华中科技大学同济医学院附属协和医院中心实验室馈赠。细胞培养选用含有10％新生牛血清的rpmi1640培养液，置于37℃、5％ co2培养箱中培养。待细胞长满培养瓶底部70％～80％时，用含0.02% edta的胰蛋白酶消化传代，取对数生长期用于实验。

1.4 rt?pcr检测鼻咽癌细胞株中的par1mrna的表达

用trizol从细胞中提取总rna并逆转录成cdna。设计引物序列(上海生工)，见表1。pcr仪进行相应基因扩增。反应体系为：2.5μl的10×pcr缓冲液(含mg2＋)，2μl cdna，1μl dntps(2.5mmol／l)，上下游引物各0.5μl (10pmol/l)，taq聚合酶0.5μl (5u/l )，用灭菌ddho，补足至25μl。pcr循环参数为：94℃,5min，1个循环；94℃ 50s，59.8℃(par1)／56℃(β?actin) 50s，72℃ 50s，35个循环；72℃ 10min终止反应。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳,eb染色,紫外灯观察并照相。 表1 par1和内参β?actin基因引物序列

基因引物序列扩增长度par1上游：gtgctgtttgtgtctgtgct598bp下游：cctctgtggtggaagtgtgaβ?actin上游： ggcggcaacaccatgtaccct202bp下游： aggggccggactcgtcatact

1.5 western blot检测

检测细胞株中par1蛋白表达，并比较两种细胞株中的表达差异：取对数生长期的cne?1、cne?2细胞各1×107/ml（约50ml培养瓶），蛋白提取: 用预冷的pbs 洗细胞3 次, 加入细胞裂解液400μl(900μl mem?per加入100μl pmsf）裂解细胞，冰盒上刮下细胞,4℃、10000r/min离心10min,收集上清,－20℃保存，bradford比色法测定蛋白浓度定量，调蛋白浓度一致后，行sds?page电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂奶粉37℃封闭1h，与鼠抗人par1一抗（1∶200稀释）4℃孵育过夜，用tbst洗涤3次，每次15min,后加入hrp标记羊抗鼠igg（1∶5000稀释），37℃孵育1h后，用ecl发光试剂，暗室中曝光压片，检测蛋白质表达，胶片扫描保存。

1.6 免疫组织化学（sp法）检测

检测鼻咽癌标本及鼻咽良性标本中par1的蛋白表达并行亚细胞定位。标本处理：收集新鲜鼻咽部活检标本用0.9％生理盐水冲洗后立即置于100ml/l 甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚4μm，he染色进行组织学分类。免疫组化sp法,具体步骤参照试剂盒说明书。空白对照以pbs取代一抗，阳性对照为已知阳性片。阳性判断标准：阳性染色呈棕黄色颗粒状，阴性对照无着色。对每例鼻咽部活检标本的par1表达情况与患者临床资料进行分析。

1.7 统计学方法

采用spss10.0软件进行分析，相关性分析采用χ2检验,定量分析采用均数±标准差(±s)表示，行t检验。

2 结果

2.1 两种鼻咽癌细胞株中par1的mrna和蛋白的表达情况及其差异

rt?pcr检测到两种细胞株中均存在par1mrna的表达, 两种鼻咽癌细胞株中的表达存在明显差异，其中低分化鳞癌细胞株cne?2中为高表达，高分化鳞癌细胞株cne?1为中等表达，见图1。western blot检测到两种鼻咽癌细胞株中存在par1蛋白表达，par1在cne?2中的表达明显高于par1在cne?1中的表达，见图2。

2.2 免疫组化结果

免疫组化示，par1主要表达于细胞膜，28例良性鼻咽组织表达为10（+），61鼻咽癌组织中48（+），鼻咽癌组织中par1表达率明显高于良性鼻咽组织（χ2＝15.219， p<0.01）。癌细胞膜上可见阳性染色的棕黄色颗粒（图略）。

2.3 par1的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系

研究显示，par1在鼻咽癌中的表达与癌细胞

图1 rt?pcr显示两种细胞株中par1的表达

图示两种鼻咽癌细胞株中存在par1蛋白表达，t检验得出par1在cne?2细胞株中的表达明显高于par1在cne?1细胞株中的表达（条带灰值：cne?1：0.34356686±0.149120837, cne?2：0.89469757±0.100732874, p＝0.188）

图2 western blot显示两种细胞株

中par1的蛋白表达及其差异

的生长方式、局部淋巴结有无转移、tnm分期早晚相关（p<0.05），见表2。schmincke型方式生长的鼻咽癌患者中par1的表达明显高于regaud型,有局部淋巴结转移的患者,par1的表达高于无局部淋巴结转移患者，par1的表达率与原发肿瘤范围即t分期（但随t分期的提高表达率增加）无明显相关，但与tnm分期密切相关，分期越晚，par1的表达率越高。此外，男性患者中par1表达率稍高于女性患者，随着年龄的增高，par1的表达率也增高，但差异无统计学意义（p>0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤侵袭转移是其危害患者生命的主要原因，阻断恶性肿瘤的侵袭转移在恶性肿瘤的治疗中尤为关键。最新研究提示,par1在多种恶性肿瘤中高表达[2]。高表达的par1介导某些肿瘤的恶性生物学行为，主要是表现在许多肿瘤中与肿瘤的侵袭转移相关。在良性乳腺上皮及非侵袭性细胞株中par1的表达最低或无表达,而在侵袭性乳腺癌mda?mb?21细胞株中则表达高水平的功能性par1[2]。martin等[3]得出par1的表达水平与促进前列腺癌细胞的骨转移相关。

目前认为，par1主要是作为某些介导恶性肿瘤侵袭转移的物质的受体而作用，主要是与凝血酶[4]、基质金属蛋白酶家族（mmps）[5]、整合素家族[6]、血管生存[7，8]等相关。此外，研究发现par1还可能参与某些信号通路而与肿瘤形成[9]、分化[10]、凋亡逃避[11]、耐药[12]等也有关。

表2 par1的表达与鼻咽癌患者临床参数的关系par1在恶性肿瘤侵袭转移等复杂生物学行为中的具体作用及调控机制远未被阐明，par1在许多肿瘤中的作用具有明显的特征性。不同类型肿瘤在肿瘤进展的不同期别，par1发挥的作用，值得深入研究。

par1在鼻咽癌组织及细胞系中表达尚无文献报道,笔者首次采用免疫组织化学、western blot和rt?pcr方法检测par1在鼻咽癌组织及细胞系中par1的表达。结果显示,鼻咽癌组织中par1的表达水平明显高于鼻咽部良性病变。61例鼻咽癌标本中，不同性别鼻咽癌患者的par1的表达无明显差异,年龄高低与par1的表达亦无明显相关。schmincke型方式生长的鼻咽癌患者中par1的表达明显高于regaud型，par1的表达和局部淋巴结转移相关,这说明par1的表达可能增强癌细胞侵袭，影响了癌细胞间的粘附性，使癌细胞容易相互分离并向间质移动，导致向周围邻近组织侵袭。此外，par1的表达率与原发肿瘤范围无明显相关，可能有待增加病例数证实,但与tnm分期密切相关，分期越晚，par1的表达率越高。低分化鳞癌细胞株cne?2中par1表达水平显著高于高分化鳞癌细胞株cne?1，病理组织学认为，分化程度越低的肿瘤细胞恶性程度越高，侵袭性越强，提示par1在鼻咽癌中的表达水平可能与鼻咽癌细胞恶性程度及侵袭力相关，这与par1在其他恶性肿瘤中的研究一致。

综上，初步研究得出par1在鼻咽癌中的高表达与肿瘤的侵袭转移等恶性生物学行为相关。本研究尚待扩大标本数,进一步完善临床病理资料（如病理类型、治疗反应、预后）和结合细胞学功能实验,探讨par1的表达及其改变与鼻咽癌成瘤袭转移等生物学行为的关系，为今后研究鼻咽癌的发生侵袭转移等机制并进行干预打下基础。

(致谢：感谢武汉协和医院耳鼻喉科胡运梅护师，钟刚、陈沛、陈建军医师等在收集鼻咽部标本中给予的帮助。)

【参考文献】

［1］ shanmugaratnam k, sobin lh. histological typing of tumors of the upper respiratory tract and ear[m]. 2nd ed. berlin: springer?verlag,1991.32?33.

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[4] turcotte s,desrosiers rr,brand g,et al. von hippel?lindau tumor suppressor protein stimulation by thrombin involves rhoa activation[j]. int j cancer,2004,112(5) :777?786.

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[6] even?ram sc,maoz m, pokroy e,et al. tumor cell invasion is promoted by activation of protease activated receptor?1 in cooperation with t he alpha v beta 5 integrin[j]. j biol chem,2001,276(14):10952?10962.

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[8] yin yj,salah z,maoz m,et al. oncogenic transformation induces tumor angiogenesis : a role for par1 activation[j]. faseb j,2003,17(2) :163?174.

[9] yin yj，katz v, salah z, et al. mammary gland tissue targeted overexpression of human protease?activated receptor 1 reveals a novel link to b?catenin stabilization[j]. cancer res， 2006,66(10): 5224?5233.

[10]zhang x, hunt jl, chen z, et al. correlation of protease?activated receptor?1 with differentiation markers in squamous cell carcinoma of the head and neck and its implication in lymph node metastasis[j].clinical cancer research, 2004,10(24): 8451?8459.

篇4

到底这家管理了840家百货店及13家奥莱商场的美国百货零售巨头是如何做到的？我们又能从中得到什么启示，走出困境？

SoLoMoMe：零售业进入“价格透明新纪元”

市场研究机构InsightExpress的数据显示，2011年当人们在实体店购物时，有59%的智能手机用户会利用移动终端寻找更优惠的价格，这一比例比2010年增长了40%。数字营销机构ComScore的调查显示，在进入实体零售店的购物者中，有近6成会选择随后在网上购物。

零售巨头沃尔玛CEO Mike Duke称，SoLoMo正将零售业带入“价格透明新纪元”，零售商正处于SoLoMoMe(social社交+local本地化+mobile移动+personalized个性化)经济时端的起点。

为了应对这一挑战，百货业必须脱胎换骨，全渠道(Omni-channel)零售已经成为必然选择。欧美百货业已经完成了从单一渠道(singlechannel)向多渠道(multi-channel)的进化，目前正向全渠道零售阶段过渡。

全渠道零售，是指以消费者为中心，利用所有的销售渠道，将消费者在各种不同渠道的购物体验无缝链接，同时将消费过程的愉悦性最大化。因此顾客可以同时利用一切的渠道，如实体店、目录、呼叫中心、互联网以及手机等，随时随地购物。

大数据：消费者服务的纵深挖掘与探索

梅西百货在对顾客的购买行为进行分析后发现，大部分顾客并不是只在网上或者只在实体店购物，他们会根据自己的需要选择购买渠道。因此，重要的是让顾客知道，梅西百货能够满足他们的购物需要，无论是在梅西实体店里、在梅西网站、在梅西移动应用上还是在其他梅西品牌的渠道，关键是让消费者选择梅西品牌。

全渠道：关键是让消费者选择梅西品牌

梅西百货的多渠道策略有个非常明确的主题--“让购物体验简单而周到”。这些改变能够为顾客提供更快速、更高效和更轻松的购物体验，考虑到顾客在网购时的习惯(购买前喜欢在网上了解商品，并到实体店内感受商品)，梅西百货还增加了许多新的设施，尽力让顾客的购物体验完美而周到。这种双管齐下的策略，让顾客获得所有必要的产品信息的同时，不会牺牲便利性。

这充分体现了梅西百货对于多渠道的看法：购物，不论是使用哪种渠道，都应当从实体店和在线体验中吸取最好的精华。正如其CEO伦德格伦所说：“我们‘泛策略’的最终目标是与客户建立更深的关系，确保顾客无论想何时、以何种方式来梅西百货和布鲁明戴尔百货店购物，都能够如愿以偿。”

泛渠道策略：让购物体验简单而周到

在电子商务的初创期，各企业都努力在网上营造出实体店的顾客体验。当网上商城红火了以后，各大零售商们从网上购物的体验中吸取精华后移植到实体店里。而梅西百货的做法是将这两种理念结合，互取所长，以期为顾客打造出贯穿多种购物渠道的、始终如一的和无缝的购物体验，从而留住顾客，赢得竞争。梅西百货将其称之为“泛渠道(Omni-Channel)策略”。

在这一策略之下，梅西百货和布鲁明戴尔百货店开展了一系列试点项目，推出多项互动性的自助服务技术，以加速购物结算流程和“移植网上购物体验”。同时，梅西百货也努力在其网上商城加进典型的“实体店特性”，比如在网上如试穿一样精准地选择牛仔裤。具体而言，梅西百货实行的十二项O2O全渠道战略包括：

Apple Pay苹果支付：

2014年9月，梅西百货成为首批支持Apple Pay ?移动支付系统零售商，由于其指纹方案和近场通讯技术NFC芯片技术，业界纷纷看好，认为其离线化、易识别等特性使其更安全；当日送达：

梅西百货自今年秋季将开始试点，与众包当日送达服务供应商Deliv合作，在全美先期选择在几个梅西销售规模大的城市试点如芝加哥、洛杉矶等，对PC和手机端线上购物用户承诺当日购买，当日到店取货。

线上购买线下取货(BOPS)：

从2013年开始试点，现已实现梅西百货全网店通用。

线下店铺销售端的技术创新：

梅西在几家店内试点各种与销售相关的技术创新，如能帮助店员更有效地为消费者展示货品搭配和商品信息，并加快交易的新一代加强版的手持终端和平板电脑;在几家店试点设立梅西联络中心(Connect@Macy’s Centers)便于线上购物消费者取货;增加店员数量为消费者提供风格搭配建议和产品推荐;有些试点店铺内，消费者还可以在电子服务站和大型互动屏幕显示，通过手机购买产品；

加强购物APP应用：

梅西了iOS和安卓版的购物APP，并在不断改进和添加帮助人们购物体验的功能；

梅西图像搜索：

梅西网站在旧金山的创新实验室开发出此项新技术概念，并迅速研发应用，消费者可以拍摄并上传任何一件日常生活中见到的产品，系统会为消费者找到梅西网站对应或相似产品，就像在“听到”歌曲之后立即辨别出歌曲和艺术家的一样。

这个软件模拟人类视觉皮质分析图像的过程，将产品的颜色、质地、样式和形状作为参考。比如，可以照一张花或者有花的衬衣，应用就会搜索“库存里我们符合这两项的商品”，列出可供选择的带有相似图案的衬衣和裙子。“它可能没法找到一模一样的衣服，但会是类似的。”

这个功能也可用来在高档商店拍摄昂贵的服饰，然后寻找同款的平价商品。这个应用目前已上传并“吸纳”了84个品种1000多件物品，并且会每天更新库存。

梅西官网的总裁Kent Anderson表示：“当我们的消费者在他们的朋友和名人身上看到喜欢的打扮时，他们可以在macys.com上直接订购相关产品，不用花费太多力气去搜索就能买到想要的。”

梅西手机钱包：

该功能使消费者轻松存储和了解优惠及打折券信息，并为梅西的忠诚会员提供无缝全渠道的使用体验，线上线下店内外都可使用。

RFID应用和扩展：

梅西百货是首批全美范围使用该技术的零售商，自2011年至今已初见成效。RFID (射频技术或电子标签技术)提高了其库存盘点准确度，特别是帮助公司清楚了解哪些货品和尺寸在库可销售，方便及时补货。最近通过RFID技术在时尚品类的试点应用，得益于精准的实时库存盘点，梅西的正装裙，男士运动外套和休闲裤卖得更好。2015年将完成时尚品类的RFID应用；

Shopkick逛街应用：

通过与全球应用范围最广的购物应用shopkick合作，梅西在所有门店都将推广使用这个基于iBeacon?技术的位置服务应用，也将是迄今为止该技术在零售商店最大规模的一次使用，梅西各门店届时将安装4千台设备，每家门店可定制推送折扣、推荐等促销信息。设备安装将于今年秋天完成并启用；

智能试衣间：

试衣间配有壁挂平板电脑供店员和消费者扫描查询产品颜色尺寸和产品推荐等搭配信息，还可不必出门，通过一键呼叫店员帮助；

梅西数字出版：

梅西在推出了秋季时尚购物目录后，梅西网站将推出数字版，充分利用屏幕如360度图片介绍，看时尚视频，线上个人风格混搭等；

梅西桌面搭配：

篇5

泛素结合酶 E2 家族中的 UbcH10，又称周期蛋白选择性泛素载体蛋白 E2-C，是肿瘤相关的泛素结合酶，在多种恶性肿瘤中过度表达，自然成为抗肿瘤靶标之一。Wagner等报道，抑制 UbcH10 的过表达和基因扩增是肿瘤的潜在治疗方法。研究者采用siRNA 选择性沉默 UbcH10 转录导致 UbcH10 表达减少，结果显示能明显抑制肿瘤细胞但正常细胞增殖却不受影响。当结合 DR5/TRAIL 受体拮抗剂时，针对 UbcH10 转录的siRNA 增强了对肿瘤细胞的杀伤力，而不杀伤增殖中的原代人上皮细胞或成纤维细胞。Berlingieri 等发现通过 RNA 干扰封闭 UbcH10 的蛋白质合成能抑制卵巢癌细胞的生长。研究还发现，在大肠癌组织中 UbcH10 的表达明显高于非癌组织，而且它还与肿瘤分化程度和淋巴结转移相关。在体外实验中，UbcH10 能促进细胞增殖和肿瘤的侵袭，但通过 RNA 干扰封闭 UbcH10 的蛋白质合成能明显抑制细胞的增殖和降低肿瘤细胞的侵袭转移力。UbcH10 可能是一个新的肿瘤标志物，为大肠癌的治疗提供了一个新方案，在大肠癌的诊断和预后判定上也有非常重要价值。针对 UbcH10 的干扰和抑制可能成为一种新型的临床分子靶点抗癌药物。

E3 与肿瘤的相关性很大程度上是因为它们能导致癌基因或肿瘤抑制物降解。目前研究得比较清楚的是环状 E3 连接酶 HDM2(human double minute2)，HDM2 蛋白是肿瘤抑制蛋白 p53 蛋白的负调节蛋白，它同时也是能调控细胞周期的多亚基 SCF 连接酶的负40调节蛋白。针对 E3 的活性位点、或针对它们与底物间的特异性相互作用来开发出副作用小的高选择性药物，HDM2 蛋白自然成了首选药物靶标。如果使 HDM2 失活，就能够激活 p53 通路，导致细胞周期停滞、细胞凋亡。另一个药物靶标是 SKP2 蛋白，它是SCF 连接酶复合体中的底物特异性亚基，如果在细胞周期抑制蛋白 p27 表达水平较低的肿瘤细胞中的 SKP2 蛋白失活，可能也会起到一定的抑癌效果。但在一些肿瘤中，反而应该提高 E3 的活性，可这要比抑制它们的活性困难得多。如在高表达 c-Myc 或 cyclin E蛋白的肿瘤患者体内使用 Fbxw7 激动剂，就会促进上述这些癌基因产物降解;而促进VHL 连接酶的活性也能够使 HIF1α 失稳，抑制肿瘤血管的形成。近 10 年来，一直在寻求 E3 连接酶的抑制剂或激动剂，也开发出了能特异性抑制 HDM2 蛋白 E3 连接酶活性的小分子抑制剂，不过还没有一种药物在临床上表现出抗癌效果。用 HLI98 抑制剂来治疗肿瘤的作用机理就是激活了 p53 信号通路，诱导细胞发生凋亡。但这些药物的生物效价差，同时还有与 p53 无关的脱靶效应，其中最成功的是 Nutlins，该药物能针对 HDM2蛋白的沟槽(groove)结构，而该沟槽结构正是 HDM2 蛋白与 p53 蛋白相结合的部位。

但 Nutlins 药物只针对表达野生型 p53 蛋白的肿瘤细胞起作用，而对表达突变型 p53 蛋白或不表达 p53 蛋白的肿瘤细胞则无效。

还有一条开发泛素连接酶抑制剂的策略，那就是找到一种能与连接酶底物蛋白相结合的物质，从而阻止其被泛素化。以 p53 蛋白为例，发现一种名为 RITA 的小分子化合物能够与 p53 蛋白的 N 末端相结合，使得细胞生长停滞。不过 RITA 并不是通过特异性抑制 p53 蛋白与 HMD2 蛋白间的相互作用来起作用的，它还能影响好几个能与 p53 蛋白相结合的其它蛋白，而这些蛋白都能通过不同于泛素修饰途径的方法来抑制 p53 蛋白。去泛素化酶是致癌或抑癌 E3 连接酶的直接抑制物，也可作为抗癌治疗的靶标。其中最有望取得成功的是核去泛素化酶(nuclear DUB)，包括 USP1、USP28 和 USP44，它们都与癌症的发生和发展有关。USP1 蛋白通过抑制范康尼贫血互补基团 D2 蛋白(FANCD2)和 PCNA 蛋白的单泛素化作用调控 DNA 修复检查点。USP28 蛋白在结肠癌、乳腺癌患者体内都过量表达，它通过抑制 SCF–Fbxw7 连接酶的泛素化活性来稳定cyclin E1 蛋白和 c-Myc 蛋白。而 USP44 蛋白则能够通过去除 Cdc20 蛋白的泛素化修饰作用来对抗细胞分裂后期促进蛋白 APC/C 的活性，防止纺锤体检查点过早失效。

其它与肿瘤相关的去泛素化酶还能调控 NF-κB 信号通路。泛素连接酶以及去泛素化酶都参与了 NF-κB 的调控，它们可能同处于一个复合体中，甚至共同位于一条多肽链上。正因为如此，它们才能更有效地对 NF-κB 信号通路进行动态调控。这种泛素连接酶与去泛素化酶之间 “亲密关系”最为经典的范例非 A20 蛋白莫属。A20 蛋白的 OUT 结构域具有去泛素化酶活性，而 A20 蛋白的锌指结构具有 E3 连接酶的活性。A20 蛋白能催化 RIP蛋白和 NEMO 蛋白等底物蛋白上第 63 位赖氨酸位点去泛素化，也能促进靶蛋白的第 48位赖氨酸位点与泛素蛋白连接，继而靶蛋白被蛋白酶体降解。

另一种名为 CYLD 的去泛素化酶也能调控 NF-κB 信号通路。CYLD 蛋白见于一种皮肤肿瘤—圆柱瘤病的患者体内，由一种抑癌基因的突变体所编码。CYLD 蛋白在其 C末端含有一个泛素蛋白水解酶结构域，该结构域能将连接在靶蛋白第 63 位赖氨酸残基上的多聚泛素蛋白修饰物水解掉，这些靶蛋白中有许多都参与了细胞因子诱导的 NF-κB信号通路调控。在人体皮肤癌以及肾脏肿瘤、肝脏肿瘤以及宫颈肿瘤等患者体内都发现CYLD 蛋白的表达量下降，甚至被抑制，这说明 CYLD 蛋白具有普遍的抑癌作用。对敲除了 CYLD 基因的小鼠进行研究发现，BCL3 蛋白是 CYLD 蛋白的重要底物，BCL3 蛋白对于圆柱瘤病相关肿瘤的发生发展具有极其重要的作用。BCL3 蛋白是一种转录辅助激活因子，它在胞质中处于失活状态，经多泛素蛋白修饰后活化进入核内，随后与NF-κB1 蛋白或 NF-κB2 蛋白一起启动转录复合体，促进有助细胞增殖的靶基因表达。

对去泛素化酶进行更深入研究，将有助于开发出去泛素化酶抑制剂并将其作为抗癌药物。已证实，针对泛素蛋白 C 末端水解酶(UCH-L1)的小分子抑制剂具有治疗肺癌的作用。虽然这一成功案例证明，去泛素化酶抑制剂具有美好的前景，但是要将它真正应用到临床，还有很多问题需要克服。

2. 针对肿瘤细胞的蛋白酶体

蛋白酶体抑制剂通过抑制蛋白酶体的活性，阻断其对细胞蛋白的降解，以此来抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡。蛋白酶体抑制剂在体外可诱导多种肿瘤细胞的凋亡，为人类开发新的抗肿瘤药物提供了新的思路。蛋白酶体抑制剂对肿瘤细胞和正常细胞引起的反应是不相同的，它作用于正常细胞常常会造成细胞周期阻滞，而在快速增殖的肿瘤细胞则更容易诱发凋亡。

硼替佐米的成功带动了一大批蛋白酶体抑制剂的研发，比如 PR-171(carfilzomib)、NPI-0052 和 CEP-18770 等。目前各种蛋白酶体抑制剂作用机制以及作用靶点各不相同，比如有针对 20S 蛋白酶体糜蛋白酶活性位点的、针对 20S 蛋白酶体胰蛋白酶活性位点的以及针对 20S 蛋白酶体半胱天冬酶活性位点等。作用机制也分为可逆性的抑制与不可逆性的结合或共价修饰等。我们需要开发针对更多种底物、生物利用度更高、毒性更低的蛋白酶体抑制剂。argyrinA 就是这样一种新型的蛋白酶体抑制剂，它是在筛选能稳定细胞周期抑制蛋白 p27Kip1的复合物时发现的，因此其抗癌活性必须依赖 p27Kip1蛋白的正常表达，如果缺乏 p27Kip1蛋白，那么 argyrinA 也就不能起到抗癌作用。

癌霉素(Gankyrin)是一个近年发现的癌蛋白，是 19S 颗粒的组分之一，可以与细胞周期蛋白依赖性激酶 CDK4 紧密结合。19S 颗粒的 Rpt3 亚基可特异地、不稳定地结合Gankyrin，形成一个 19S 调控复合体，加速体内 pRB 的磷酸化，增强 pRB 通过蛋白酶体降解;还与 p53 的一个主要 E3 酶 MDM2 结合，提高 MDM2 的活性，利于 p53 的多聚泛素化并被 26S 蛋白酶体降解。癌霉素的过表达使 pRB 和 p53 通过泛素-蛋白酶体通路的降解增强，表达下降。

在肝癌等一些类型的肿瘤细胞发现中 Gankyrin 过表达，它能够拮抗致 DNA 损伤物质所诱发的细胞凋亡。Gankyrin 水平的下调能够诱导野生型 p53 基因的肿瘤细胞凋亡。在肿瘤生物学中，抑癌基因 Rb 与 p53 发挥核心作用，这两条通路失活是形成肿瘤的重要条件。所以说，作为 Rb 和 p53 共同的负调节物，Gankyrin 很有可能会成为肿瘤治疗的靶点。

参考文献：

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篇6

本病由于骨髓中恶性浆细胞无节制地增生、广泛浸润和大量单一的免疫球蛋白的出现及沉积，使正常的免疫球蛋白分泌受到抑制，从而引起广泛骨质破坏、高钙血症、反复感染、贫血、高黏滞综合征、肾功能不全等一系列临床表现并导致严重不良后果。根据多发性骨髓瘤研究基金会的数据统计，仅2004年一年我国就有1.1万人死于这种疾病。

由于受医学发展水平的制约，传统方法治疗多发性骨髓瘤的效果不佳，临床缓解率不高。国内部分统计数据显示，传统化疗方案M2、MP、VAD的有效率分别为55.6%、50%和66.7%，化疗总缓解率约为60%，平均生存时间仅为30~36个月。尽管大剂量化疗后自体干细胞移植等新方法使缓解率和生存期有所改善，但该病仍无法治愈，最终会出现耐药及复发。近10年来，治疗缓解率或缓解期及总生存率没有明显提高，患者急切需要新的治疗方法。

正当广大患者饱受病魔煎熬、临床医学工作者束手无策之际，硼替左米问世了。硼替左米是目前全球唯一批准用于临床治疗的蛋白酶体抑制剂，它的应用将为多发性骨髓瘤的治疗带来希望。人体细胞内的蛋白酶体可调节正常细胞的生长，但当蛋白酶体超出它的正常生理作用时，就会减弱对癌细胞的抑制，减少癌细胞的凋亡，引发各种肿瘤。硼替左米这种诞生前就与2004年诺贝尔化学奖紧密联系的药物，开启了肿瘤细胞通向凋亡的大门。科学家通过硼替左米来抑制蛋白酶体，达到抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞凋亡，促进正常细胞生长，恢复正常细胞的平稳状态的目的。

自从2003年5月在全球市场上市以来，硼替左米已广泛应用于临床，显著提高了多发性骨髓瘤患者的生存期，与接受地塞米松治疗的患者相比，患者的病死率减少了55%。此外，硼替左米对于复发性与难治性多发性骨髓瘤的治疗效果也令人折服，缓解率约为30%。也就是说，对一般化疗方案无效或曾经有效治疗一段时间后无效的患者，仍有30% 对硼替左米敏感。目前，该药已被视为治疗复发性与顽固性多发性骨髓瘤的突破性疗法，可以减缓甚至逆转患者病情恶化。该药被PrixGalien奖的评审小组称赞为“高度创新、也是多发性骨髓瘤治疗上令人振奋的独特药物”。

如今，越来越多的多发性骨髓瘤患者看到了希望，该病的治疗已不再是难题，更多患者的缓解和延长生存期将不再是幻想。

篇7

【摘要】 目的 构建含衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)的原核表达载体，经转化E.coli以表达CPAF融合蛋白，研究其生物学功能。方法 从病料中克隆得到CPAF的原始基因，将PCR产物经纯化连接到pMD18T，将重组质粒pMDCPAF经NdeI和BamHI双酶切，与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接，建立pET42b(+)CPAF表达载体，阳性克隆经鉴定后，转化大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，经亲和纯化、离子交换纯化、分子筛纯化融合蛋白，进行SDSPAGE分析，Western印迹检测。结果 经酶切鉴定和测序分析证实原核表达质粒构建正确。SDSPAGE和Western印迹结果显示在70 kD处呈现单一蛋白条带，pET42b(+)CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了CPAF天然蛋白，目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右，采用镍柱的亲和纯化后，可达70%左右。结论 经DNA测序、SDSPAGE、Western印迹检测表明成功构建了能够稳定表达可溶性CPAF的菌株，并获得纯化CPAF的方法，为今后CPAF的研究及应用奠定了基础。

【关键词】 衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF);表达;纯化;生物学功能

衣原体泌尿生殖道感染是艾滋病病毒(HIV)感染的重要危险因素，也是人状瘤病毒(HPV)致宫颈癌的协同因子。衣原体具有广泛的宿主，尽管不同种属衣原体的宿主不尽相同，然而他们却拥有极其相似的基因组序列和高度保守的细胞内生活周期。衣原体要确保完成其胞内繁殖，就必须保证受浸染细胞不被机体免疫细胞识别，从而逃逸宿主的免疫防御。衣原体拥有多种策略来逃逸宿主的免疫防御，衣原体蛋白酶样活性因子(chlamydial protease activity factor，CPAF)就是重要的一种因子，其作用的机制是通过降解形成肌球蛋白重链(MHC)所必须的转录因子，例如：调节因子X5(RFX5)和上游刺激因子1(USF1)，来达到抑制MHC合成的作用〔1〕。人类受到衣原体感染时，CPAF特异性抗体效价明显高于外膜蛋白(MOMP)和热休克蛋白60(HSP60)，这说明CPAF具有良好的免疫原性。同时，人体内针对CPAF的抗体具有良好的中和效应，并能够有效保护机体免受感染，具有抑制衣原体感染的效果〔2〕。种种迹象表明CPAF极有可能成为潜在的衣原体免疫原，运用到将来的疫苗开发中。本研究选择对CPAF进行全序列基因克隆，并在不同的载体系统中表达CPAF，获得可溶性蛋白，同时摸索出能够大量制备高纯度蛋白的纯化方法，为下一步应用奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 表达载体pET42b(+)载体及工程菌BL21(DE3)由本研究室保存;pMD18T vector购自大连宝生物公司。

1.1.2 病料 沙眼衣原体分离于病人组织。

1.1.3 主要试剂 工具酶均购自大连宝生物公司，常用试剂及质粒提取试剂盒购自Sigma公司;PCR纯化及凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司;胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxiod公司。其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 模板的制备 按照细菌基因组提取方法改进提取，在第5步之后将上清加入Sigma试剂盒中的柱子，其后步骤按照Sigma质粒提取试剂盒说明书操作。

1.2.2 PCR引物设计 应用Primer5.0设计引物，由大连宝生物公司合成。CPAF上游引物5′GCCCGGCATATGCTCCTGTACAAGGAG3′(引入NdeI位点)，下游引物5′CTTGGGATCCAAAACTACCATCTT3′(引入BamHI位点)。

1.2.3 目的基因扩增 按如下程序进行PCR循环：95℃预变性5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，共循环30次，最后72℃延伸10 min。PCR产物的纯化按照Qiagen公司PCR纯化试剂盒说明书进行。

1.2.4 基因克隆 将PCR产物经纯化连接到pMD18T后转化工程菌JM109。用PCR、双酶切筛选阳性克隆，阳性重组子命名为pMDCPAF，送公司测序。

1.2.5 构建表达载体 将pMDCPAF用NdeI和BamHI两种酶同时消化，得到目的基因CPAF。目的基因纯化按照Qiagen凝胶回收纯化试剂盒说明书进行。将CPAF与用相同酶消化的原核表达载体pET42b(+)连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)后涂布含有卡那霉素(50 mg/L)的固体培养基，经PCR、酶切进行阳性克隆筛选，将阳性重组子命名为pET42b(+)CPAF。

1.2.6 诱导表达 挑取阳性单克隆，接种于2 ml LB/Kanr液体培养基中，37℃摇床，250 r/min过夜培养。次日以1∶100比例接种至200 ml LB/Kanr液体培养基中，37℃ 250 r/min培养至OD600=0.6～1。加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L，37℃诱导5 h后，4 000 r/min离心10 min收集菌体，用40 ml TE缓冲液将沉淀重悬，超声波破碎裂解菌体，离心后收集上清，用于检测可溶性表达。

1.2.7 SDSPAGE凝胶电泳检测 常规制备13%分离胶和4.5%浓缩胶电泳，考马斯亮蓝染色后用凝胶扫描影像系统拍照，并用系统软件分析蛋白含量同时确定目的蛋白分子量。

1.2.8 CPAF的亲和纯化 将破碎上清液用0.45 μm滤膜过滤后加至经0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)平衡好的Ni2+柱，用含有0.015 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)洗去未结合的杂蛋白，然后用含有0.25 mol/L咪唑的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)将CPAF蛋白解离下来。

1.2.9 CPAF的离子交换纯化 采用蛋白液相层析纯化(AKTA)系统进行纯化，阴离子纯化柱采用Source Q，溶液A为不含NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)，溶液B含1 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)。程序如下，将上述经亲和纯化解离的样品用A液稀释5倍后，直接上用A液平衡好的QFF柱，上完样品之后用1个柱体积的A液预洗涤，之后按照程序将A、B液混合，逐渐提高B液的含量进行梯度洗涤，用自动收集器收集样品，每管收集0.5 ml。

1.2.10 CPAF的分子筛纯化 采用AKTA系统进行纯化，分子筛纯化柱采用Superdex200，溶液C为含0.15 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris缓冲液(pH8.0)。程序如下，将上述经离子纯化的样品经30 kD孔径的超滤膜进行超滤浓缩，将浓缩的样品直接上用C液平衡好的Superdex200柱，样品上完之后用1个柱体积的C液预洗涤之后开始用自动收集器收集样品，每管收集0.5 ml。

1.2.11 Western印迹检测 将初步纯化的CPAF蛋白经过SDSPAGE后，转到硝酸纤维素膜，以鼠抗组氨酸标签抗体作为一抗，进行常规Western检测。

2 结 果

2.1 目的基因PCR结果及阳性重组载体pET42b(+)CPAF的构建与鉴定 将pMDCPAF克隆载体用NdeI和BamHI两种酶同时消化，得到目的基因CPAF。用T4 DNA连接酶将目的基因与用相同酶消化的表达载体pET42b(+)连接(图1)。设计引物时在目的基因的末端不含终止密码子，表达蛋白为带有组氨酸标签的融合蛋白。见图1，图2。

图1 pET42b(+)CPAF 的构建示意图图2 CPAF的PCR扩增产物

2.2 CPAF融合蛋白表达条件的确定 经过摸索确定的最佳诱导表达条件如下：IPTG终浓度为1 mmol/L，培养菌的温度及诱导温度均为37℃，最佳诱导时间为5 h(5 h时蛋白浓度达最大，延长时间表达量没有明显变化)。取诱导前、全菌体、破碎上清、破碎沉淀进行13%浓度SDSPAGE电泳，考马斯亮蓝染色，诱导后与诱导前相比在13 kD处存在一条明显的特异带，说明pET42b(+)CPAF重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)中得以成功表达，目的蛋白绝大部分存在于破碎上清中，说明该蛋白为可溶性表达，这为以后研究其佐剂功效奠定了良好的基础。经Imagemaster VDS Pharmbta Biotech凝胶扫描影像系统分析，目的蛋白占全菌体蛋白的20%左右。

2.3 CPAF的纯化

2.3.1 CPAF的亲和纯化 融合CPAF蛋白带有6个组氨酸标签，采用镍柱的亲和纯化后，蛋白的纯度可达70%左右，这时候蛋白在含有高咪唑的环境中很不稳定，需要立即稀释并迅速进行离子交换柱的纯化。

2.3.2 CPAF的离子交换纯化 采用AKTA系统进行纯化，阴离子纯化柱采用Source Q，CPAF蛋白在pH8.0的Fris缓冲液条件下能够很好的结合在离子交换树脂上，易于分离纯化，同样也易于解离下来，见图3。

图3 CPAF经Source Q阴离子交换柱纯化图

2.3.3 CPAF的分子筛纯化 采用AKTA系统进行纯化，分子筛纯化柱采用Superdex200，该步骤的目的主要是进一步纯化CPAF蛋白，同时改变蛋白的环境，使其处在一个低盐的环境中，见图4。

2.4 Western检测结果 纯化产物在目的位置出现单一特异性条带，未诱导的表达产物未见特异性条带。见图5。

图4 CPAF经Superdex200分子筛纯化图1: pET42b(+)CPAF;2: 单纯重组CPAF;3:未诱导的表达产物

图5 重组蛋白表达产物及纯化产物的Western分析

3 讨 论

近年来，由衣原体引起的性传播疾病(STD)在许多国家已超过了淋病和梅毒。根据WHO估计，每年有9 200万新的泌尿生殖道衣原体感染病例发生，其中美国每年大约有400万新感染者。我国泌尿生殖道沙眼衣原体感染居STD第三位，并且发病率呈逐年升高趋势。衣原体具有无症状感染特性，感染后可能产生不孕、异位妊娠、盆腔炎等严重的后遗症，甚至还可以协同HPV感染和HIV经性传播。

衣原体全基因组序列分析发现编码多形态膜蛋白基因家族的存在。已发现鹦鹉热嗜衣原体至少有6个基因编码Pmp90和Pmp98蛋白家族，Cpn有21个基因编码Pmp1～Pmp21，衣原体有9个基因编码PmpAPmpH，其中Ct的PmpD(Cpn的Pmp21)引起过人们的广泛关注〔3〕。衣原体不同型别间的核苷酸差异多发生于4个VD区域，因此检测编码VDs的外膜蛋白omp l碱基序列和数目即可达到对衣原体分型的目的。根据其主要外膜蛋白抗原表位差异可将衣原体分为19个血清型，其中A、B/Ba、C型引起地方性沙眼，L1、L2 /L2a、L3型引起性病性淋巴肉芽肿，而D～K型则主要感染泌尿生殖道，是引起尿道炎和宫颈炎的重要原因〔4〕。近年来人们又将目光聚集在CPAF上，人体内针对CPAF的抗体具有良好的中和效应，并能够有效保护机体免受感染，具有抑制衣原体感染的效果〔5，6〕。这一点给了人们不少启示，认为CPAF可能成为衣原体潜在的免疫原〔7，8〕。由于衣原体只能在活细胞内生长，通过大规模培养衣原体，并分离、纯化天然的CPAF很困难，为研究CPAF的功能和其生物活性，故采用 DNA重组技术克隆和表达重组CPAF。但是CPAF具有跨膜区域，全长的CPAF表达量非常低而且常常形成不可溶的包涵体。本文根据CPAF的二级结构根据不同区域的疏水性筛选CPAF片段，最终发现从第53个氨基酸开始到596个氨基酸结束，这个片段的表达产物为可溶性的。这样仅仅减少的几个疏水部分就能导致蛋白的可溶，并提高了产物的表达量。该蛋白的纯化具有相当的难度，CPAF在纯化过程中很容易沉淀，全程均需要在4℃下进行，该蛋白对盐离子浓度非常敏感，故在经过阴离子交换柱后，蛋白应尽快过分子筛，主要目的是脱盐，保持其处在一个低盐的环境中，有利于保持其稳定性。

参考文献

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篇8

目的: 从蛇毒中获得大量高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶。方法: 采用离子交换和亲和层析技术进行纯化。结果: 从江浙蝮蛇毒中提取出了一种高纯度的具有激肽原酶活性的蛋白水解酶, 不需活化即可水解激肽原, 释放激肽, 并具有精氨酸酯酶活性。粗毒经提纯, 比活可达800 u/mg以上, 远远高于哺乳动物来源的激肽原酶, 纯度可达95%以上。对其性质考察, mr为38 000, n-末端的15个氨基酸序列分析表明, 该酶与蛇毒丝氨酸蛋白酶及胰蛋白酶——激肽释放酶同源。结论: 这种方法适合于工业化生产。 【关键词】 江浙蝮蛇 蛇毒 激肽原酶

自从有人在美洲矛头蝮蛇(bothrops jararaca)蛇毒中发现激肽原酶后, 蛇毒激肽原酶越来越受到广大学者的重视［1］。我国蛇类资源丰富, 但受提纯工艺的限制, 至今仍未开发出蛇毒激肽原酶的药物制剂。我们采用离子交换和亲和层析技术, 从江浙蝮蛇（agkistrodon halys pallas）蛇毒中提取了高纯度的激肽原酶, 并对其性质进行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料 江浙蝮蛇蛇毒冻干粉（辽宁省清源县）, deae-sepharose , 琼脂糖凝胶（瑞典pharmacia公司）, 苯甲酰精氨酸乙酯（baee）, 对甲苯磺酰精氨酸甲酯（tame）, 标准蛋白, 激肽原, 激肽等底物（sigma公司）, 低压型高效液相色谱仪（日本岛津公司）, 8823b紫外检测仪（北京宾达英创科技有限公司）, balb/c小鼠（7周龄）由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。Www.133229.Com

1.2 方法

1.2.1 蛇毒激肽原酶的分离纯化 （1）deae-sepharose离子交换色谱: 称取江浙蝮蛇毒15 g, 用0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl缓冲液溶解, 以4 000 r/min离心20 min, 取上清, 透析12 h后, 以6.0 ml/min的流速上阴离子交换柱（deae-sepharose）, 上样完毕后以0.02 mol/l ph7.8的tris-hcl缓冲液洗去未吸附的杂蛋白。（2）亲和色谱法: ①免疫抗体亲和层析柱的制备: 取少量离子交换色谱活性洗脱液, 用高效液相色谱法纯化并经定性得到蛇毒激肽原酶, 取该蛇毒激肽原酶50 μg与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物, 对7周龄的balb/c小鼠皮下注射免疫, 每次0.2 ml, 每周1次, 共免疫6次。在采集血清前3 d取0.2 ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。用抗原亲和层析柱纯化抗体。用溴化氰活化4b-sepharose琼脂糖凝胶, 把得到的蛇毒激肽原酶抗体偶联到多糖基质上, 从而制成免疫亲和层析柱。 ②亲和色谱法纯化蛇毒激肽原酶: 将经离子交换纯化的酶用平衡液透析, 上抗体亲和层析柱。用亲和层析洗脱液（0.02 mol/l tris-hcl缓冲液, ph7.2, 含0.5 mol/l nacl, 70 g/l arg）洗脱。收集洗脱峰, 冷冻干燥保存。（3）纯度检测: 取主峰组分适当稀释, 用高效液相色谱（hplc）法检测。色谱条件: tsk-2000sw凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 进样量20 μl。

1.2.2 比活性测定 ① 舒缓激肽原酶活力测定［2］: 取0.2 ml激肽原底物（20 g/l, 0.05 mol/l, ph7.8磷酸缓冲液配制）, 加0.1 ml酶液, 37℃水浴保温3 min, 立即取0.15 ml测离体豚鼠回肠平滑肌收缩幅度, 用0.1 μg激肽做对照, 以每毫升酶液3 min释放相当于1 μg激肽定为1活力单位（u）。②精氨酸酯酶活力的测定: 以baee及tame为底物测定［3］。③蛋白含量的测定: 采取凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.2.3 理化性质 ①电泳法相对分子质量（mr）测定: 以兔磷酸化酶b（mr 97 400）、 牛血清白蛋白（mr 66 200）、 兔肌动蛋白（mr 43 000）、 牛碳酸酐酶（mr 31 000）、 胰蛋白酶抑制剂（mr 20 100）、 鸡蛋清溶菌酶（mr 14 400）作标准蛋白, 用还原型sds聚丙烯酰胺电泳法测定。②高效液相色谱分析: 色谱条件（tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相）。以牛血清白蛋白第v组份（66 200）、 卵清蛋白（44 300）、 木瓜蛋白酶（mr 21 000）、 溶菌酶（mr 14 300）为标准蛋白, 测定纯度及mr。③n-末端氨基酸残基测定: pvdf膜上样, abi　procise 491型测序仪测定。

1.2.4 酶学性质 ①最适ph: 将baee配于不同ph的0.05 mol/l tris缓冲液中, 测定激肽原酶水解baee的最适ph。②不同ph值下的稳定性: 将激肽原酶分别溶于不同ph值的0.1 mol/l tris缓冲液, 于室温静置24 h后, 取样测定水解baee底物的活性。③不同温度下的稳定性: 将激肽原酶分别于不同温度下保温3 h, 测定水解baee的活性。④edta对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含0.1 mol/l edta的溶液, 测定水解baee活性。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: 将激肽原酶制成含ca2+、 zn2+ 、 co2+、 hg2+、 mg2+、 ba2+0.01~0.1 mol/l的溶液, 测定其水解baee的活性, 并用edta络合后再分别测定其水解baee活性。

2 结果

2.1 蛇毒激肽原酶的分离纯化 蝮蛇毒经deae-sepharose阴离子交换层析, 亲和层析, 可将杂质蛋白除去, 得到的样品经hplc检验, 纯度可达95%以上。

图1 deae-sepharose离子交换色谱图（略）

透过峰过后, 梯度洗脱得到5个峰, 经定性检测3, 4号峰为活性峰.

图2 蛇毒激肽原酶亲和色谱图（略）

1: 平衡液洗脱透过峰; 2: 为亲和洗脱液洗脱所得活性峰.

图3 激肽原酶纯度检验图谱（略）

色谱条件: tsk-2000凝胶柱, 280 nm检测, 流速 1.0 ml/min, 0.5 mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.0）为流动相, 对峰面积积分, 主峰面积达95%以上.

图4 激肽原酶sds聚丙烯酰胺电泳图谱（略）

m: 分子量标准品; s: 蛇毒激肽原酶样品.

2.2 活性测定 与粗毒相比, 提纯高的激肽原酶比活提高了约300倍, 活力回收率可达60%以上, 水解baee的比活可达到800 u/mg以上, 水解tame活性较低, 约是水解baee活性的5%。

2.3 理化性质 经sds聚丙烯酰胺电泳及hplc方法检测, 江浙蝮蛇毒激肽原酶的mr约为38 000, 与组织型激肽原酶相似。

2.4 江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列［4］比较 蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶具有同源性, 属丝氨酸蛋白酶的一种, 且与哺乳动物的胰蛋白酶——激肽释放酶具有同源性。

表1 江浙蝮蛇毒激肽原酶与其他蛇毒丝氨酸蛋白酶、 哺乳动物胰蛋白酶n末端氨基酸序列比较（略）

2.5 酶学性质 ①最适ph: 测定蛇毒激肽原酶水解baee底物活性的最适ph值为7.0~8.0, 这与哺乳动物的组织激肽原酶相同, ph10以上, 底物自发水解无法测定。②不同ph值下的稳定性: 蛇毒激肽原酶在ph4.0~9.0条件下, 活性基本不变, ph低于4.0或高于9.0时, 活性迅速下降, ph大于10.0时, 底物baee发生水解而无法测定。③不同温度下的稳定性: 在30℃以下时, 激肽原酶的活力基本不变, 超过40℃时, 活力迅速下降, 高于60℃时, 发生蛋白质变性而有沉淀析出。④edta对激肽原酶活性的影响: edta对激肽原酶的活力无影响, 证明蛇毒激肽原酶不是金属酶。⑤不同二价金属离子对激肽原酶活性的影响: ca2+、 mg2+、 ba2+对激肽原酶活力无影响, zn2+（0.1 mol/l）、 hg2+（0.01 mol/l）、 co2+（0.1 mol/l）可完全抑制激肽原酶活性, 且用edta络合不能使其活力恢复, 蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 故hg2+可使其活性丧失, 但zn2+ 、 co2+对其活性影响的原因尚不明确, 可能是因为与蛇毒激肽原酶不可逆性结合, 从而改变其构象使其失活。

3 讨论

激肽原酶在体内有重要的生理功能［5］, 目前临床广泛用于原性高血压、 心绞痛、 动脉硬化、 视网膜血流障碍、 肢端知觉异常, 闭塞性血栓性血管炎等疾病的治疗。但因为以往从哺乳动物的胰腺提取的胰激肽原酶纯度不高, 具有一定的抗原性, 进入人体后, 可能诱发过敏抗原抗体反应, 已有报导注射胰激肽原酶导致固定性药疹［6］及重症多形红斑药疹［7］, 且不能实现静脉给药, 使药物不能最大限度发挥效用。近年的提取工艺虽可得到高纯度激肽原酶, 但在提取过程中, 酶活力损失较大, 回收率低, 难以实现工业化生产, 因此寻找高纯度且无抗原性的激肽原酶并建立一套适合工业规模化生产的工艺方法是目前面临的新课题。

我们在传统提取工艺的基础上, 用离子交换, 亲和层析两步即可制备高纯度的蛇毒激肽原酶, 该方法设备简单, 条件温和, 产品回收率高, 产量大, 完全符合工业化生产的要求, 填补了蛇毒激肽原酶生产工艺上的一项空白。与哺乳动物来源的激肽原酶相比, 从江浙蝮蛇毒中提取的激肽原酶有如下特点: ①比活高（≥800 u/mg）, mr小（约为38 000）, 等活力单位给药蛋白含量低, 不易引起过敏反应; ②纯度高, 提纯后纯度可达95%以上。如果用于药物, 大大提高了药物的安全性; ③无病毒隐患。不携带可能同人类共同感染的病毒。④无酶原形式, 不需活化即可释放激肽, 可直接发挥作用。该蛇毒激肽原酶最适ph值为7.0~8.0, 且在ph4.0~9.0范围内, 活力基本保持不变, 有利于在人血浆环境中保持其活性。该酶在30℃以下活力基本不变, 而在冻干状态下, 37℃放置90 d, 活力下降在5%以内, 经试验, 在整个冻干制剂生产过程中, 酶活力的损失率均在10%以内, 因此可以生产出相对稳定的制剂产品。n-末端的氨基酸测序结果表明, 蛇毒激肽原酶与其他它丝氨酸蛋白酶同源, 属丝氨酸蛋白酶的一种, 可能也具备大多数蛇毒丝氨酸蛋白酶的特性具有较长的生理半衰期, 可能成为临床用药; 同时, 它与哺乳动物的胰蛋白酶激肽释放酶具有同源性, 可以部分解释其与组织激肽原酶的相似性。蛇毒激肽原酶具有一般蛋白酶的性质, 不是金属酶, 而zn2+、 co2+对酶活性的影响的机制可能与改变其构象有关, 有待进一步证明。

总之, 我们从蛇毒提取的激肽原酶将为药学领域提供一条新的途径, 应用于药物必将带来临床新的治疗方法。

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篇9

[关键词] D-二聚体；高敏C反应蛋白；抗凝血酶III；脑梗死

中图分类号：R743.3 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2016）03-076-03

DOI：10.11876/mimt201603028

随着我国人口老龄化，老年群体脑梗死人数有所增加[1]。脑梗死致残、致死率均较高，判断梗死程度，及早干预治疗是改善患者预后关键。有研究发现， D-二聚体（D-dimer，D-D）、超敏C反应蛋白（High sensitivity C reactive protein，hs-CRP）及抗凝血酶Ⅲ（Antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）是机体炎性反应、反映高凝和纤溶亢进状态的重要标志物[2]。为进一步探究其临床价值，本研究对我院2012年9月―2014年9月收治的92例脑梗死患者血浆D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平进行研究分析。

1 一般资料

1.1 病例资料

选取我院2012年9月―2014年9月收治的92例脑梗死患者纳入脑梗死组，患者均首次发病，参照全国脑血管病学术会议（1996）制定的脑梗死临床诊断标准确诊[3]。按照美国卫生研究院卒中评分（NIHSS）分为轻度组（0～15分）65例，中重度组（>15分）27例。同期80例健康体检者纳入正常对照组。2组受试者一般临床资料比较见表1，年龄、性别比例、体质量指数（BMI）、血糖水平等指标比较均未见明显统计学差异（P>0.05），脑梗死患者TC、TG、HDL-C水平显著高于正常组（P

1.2 研究方法

抽取2组受试者清晨空腹肘静脉血3 mL，于30 min内以3000 r/min离心10 min，保存于-20℃冰箱内，统一检测D-D、hs-CRP及AT-Ⅲ。D-D检测使用胶乳凝集法，试剂盒购自美国贝克曼公司。hs-CRP检测使用免疫散射比浊法，试剂盒购自德国德灵公司。AT-Ⅲ检测使用发光底物法，试剂盒购自北京科美生物技术有限公司。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS18.0进行分析，计数资料以（n/%）表示，采用χ2检验，计量资料以（x±s）表示，t检验。使用Pearson法分析D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ与脑梗死患者病情的相关性。以P

2 结果

2.1 脑梗死患者与健康体检者血浆D-D、hs-CRP及

AT-Ⅲ水平比较

脑梗死组与正常组血浆D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比较如表2所示。脑梗死组血浆D-D、hs-CRP水平显著高于正常组，AT-Ⅲ水平显著低于正常组（P

2.2 轻度与中重度脑梗死患者血浆D-D、hs-CRP及

AT-Ⅲ水平比较

轻度组与中重度组患者血浆D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平比较如表3所示。轻度组D-D水平显著低于中重度组（P

2.3 D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ与脑梗死患者病情相关性

Pearson相关分析显示，血浆D-D、hs-CRP水平与脑梗死病情呈显著正相关（P

3 讨论

动脉粥样硬化是脑梗死最常见的病因之一，斑块破裂引发的钙超载、氧自由基释放、炎性因子释放、各类酶激活是导致脑组织损伤加剧的主要病理生理过程[4]。本研究发现，虽然脑梗死患者TC、TG、HDL-C等血脂指标较正常组显著增高，但其特异性不足，无法起到有效的预警作用。D-D是纤溶过程特异性标志物之一，常用于纤溶酶和凝血酶活性的观察。在本次研究中，脑梗死患者血浆D-D水平显著升高，且中重度组患者D-D水平升高更为显著，提示D-D在脑梗死的发生发展中起到了重要作用。其机制可能为：脑梗死导致的脑组织损伤促进凝血因子释放，引发机体高凝状态，患者凝血系统的激活进一步促进了纤溶系统代偿性亢进，导致纤维蛋白单体降解产物D-D释放增加[5]。随着患者病情加剧，其凝血功能异常更为严重，抗凝纤溶系统受到抑制，D-D水平进一步上升。故血浆D-D水平与脑梗死病情呈显著正相关。Palmieri等[6]亦指出，D-D在血浆中具有较高稳定性，对体内血栓形成的评价有着良好的敏感性与特异性，且检测方法简单、迅速，可作为脑梗死病情的检测指标。

hs-CRP由肝细胞受细胞因子诱导合成，是一种急性期反应蛋白。脑梗死患者机体炎性反应明显，导致hs-CRP水平显著升高。患者梗死面积越大，局部炎性反应越严重[7]，故hs-CRP水平升高更为明显，本研究中血浆hs-CRP与脑梗死病情呈显著正相关，印证了上述结论。此外，hs-CRP还可促进单核细胞释放组织因子，加剧凝血纤溶系统失衡状态，并可通过激活补体系统损伤血管内膜、增加血管通透性，使动脉粥样硬化斑块扩大、血栓形成[8]。可以认为，hs-CRP与患者梗死面积、严重程度及预后均具有密切关联，早期积极干预hs-CRP水平有望延缓动脉粥样硬化进展，改善患者预后。

AT-Ⅲ是一种由肝脏合成的蛋白酶抑制剂，主要参与弥散性血管内凝血、肝病等各类血液障碍疾病[9]，在抗凝系统中发挥着重要作用。正常情况下，机体抗凝、凝血系统处于动态平衡状态，若机体发生凝血功能异常，往往导致凝血系统因子激活、抗凝纤溶系统抑制，血管内皮细胞受损，促进血栓形成[10]。本研究可见，脑梗死患者AT-Ⅲ水平显著低于正常组，且中重度脑梗死患者AT-Ⅲ水平下降更为明显，提示脑梗死患者凝血因子激活、凝血酶活化分泌过程消耗了大量的AT-Ⅲ。同时，机体凝血功能亢进状态亦影响了AT-Ⅲ合成[11]，导致AT-Ⅲ水平进一步下降。因此，AT-Ⅲ能够有效反映机体抗凝功能状态，动态观察血浆AT-Ⅲ水平能够明确脑梗死病程的动态变化[12]。

在本次研究中，脑梗死患者血浆D-D、hs-CRP、AT-Ⅲ水平均与健康体检者存在显著差异，且病情越严重，患者上述指标变化越明显。说明脑梗死患者存在明显的凝血功能异常、炎性因子高表达状态，据此进行临床诊断、预后评估，并实施合理的干预方案，对延缓病情进展、改善患者预后均具有重要意义。

参 考 文 献

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篇10

摘要

为探究不同热处理方式的小米蛋白质的消化情况，采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化法测定蒸制、煮制、挤压处理并经淀粉酶解的小米蛋白消化率。对从小米生粉中提取的醇溶蛋白蒸制、煮制的蛋白消化率进行测定，结果表明，经120min的胃蛋白酶和胰蛋白酶处理，蒸制、煮制和挤压处理的小米的体外蛋白消化率分别较未处理小米降低了31.00%，17.15%和11.02%。蒸煮的醇溶蛋白消化率也分别降低了35.57%和28.63%。蒸煮对小麦蛋白的消化率有不利影响，挤压处理优于蒸煮处理。蒸煮处理降低小麦蛋白体外消化率可能与醇溶蛋白消化率的降低有关。

关键词

小米；蒸制；煮制；挤压；蛋白消化率

小米隶属禾本科草本植物，是世界上主要粮食作物之一，主要种植在亚洲和非洲。我国种植的多为谷子，谷子脱壳后的种仁即小米。小米适口性好，营养丰富，深受我国北方人民的喜爱。小米的蛋白质含量较高，其干基平均含量为13.08%，高于其它禾谷类作物[1]。其中醇溶蛋白占46%，是小米中含量最多的一种蛋白，此外还有21.1%的碱溶蛋白以及5.5%的清蛋白和球蛋白[2]。通常用来评价食物蛋白好坏的最主要的2个指标是蛋白质的氨基酸组成和蛋白消化率[3]。在小米蛋白质的氨基酸组成模式中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸和天门冬氨酸是小米氨基酸的主要组成部分，赖氨酸和苏氨酸是小米中的第一、第二限制性氨基酸[4-5]。蛋白消化率是动物从食物中所消化吸收的蛋白质占总摄入量的百分比，是评价食物营养价值的重要指标[6]。对于食物蛋白质消化率的研究通常采用建立蛋白质体外消化模型模拟食物在胃和小肠中的消化情况的方法，胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化法是一种常见的方法。影响蛋白质消化性的因素可归为两类：外因主要是酚类化合物、植酸、碳水化合物、脂类及蛋白酶抑制剂等，内因主要是指蛋白质本身的结构特性[7]。蛋白质经加热处理后其结构会发生改变，从而影响其消化率。绝大多数谷物如大米、玉米、荞麦等在一定的加热处理之后的蛋白消化率都会有所提高[8-10]，但也有个别谷物如高粱，蒸煮之后的蛋白消化率反而降低[11]。小米作为一种公认的营养保健养胃米，它与高粱在蛋白质组成上非常相似。刘思思[12]研究发现，蒸煮之后打浆的小米乳蛋白质具有较低的消化率，而小米醇溶蛋白本身形成的二硫键及强烈的疏水性是导致小米蛋白抗消化的主要原因。本研究主要采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外模拟消化的方法，分析小米和小米醇溶蛋白经蒸制、煮制和挤压处理之后蛋白消化率的变化情况，探讨不同加热处理方式对小米蛋白消化率的影响，为小米蛋白的品质评价以及小米相关产品的开发提供依据。

1材料与方法

1.1材料谷子：长生07，产自山西。

1.2主要试剂胃蛋白酶（活性：800~2500U/mg），北京拜尔迪生物技术有限公司；胰蛋白酶（活性：250Umg），北京拜尔迪生物技术有限公司；α-淀粉酶（活性>6000U/mg），北京博奥拓达科技有限公司。

1.3主要设备与仪器三立式捣精机（SY88-TH），双龙机械产业；高速万能粉碎机（LD-T300A），上海顶帅电器有限公司；双螺杆试验机（DS30-Ⅲ），山东赛信机械有限公司；恒温水浴振荡器（SHA-BA），金坛市荣华仪器制造有限公司；冷冻干燥机（LGJ-2C），北京市四环科学仪器厂有限公司；高速冷冻离心机（GL-20G-Ⅱ），上海安亭科学仪器厂；控温消煮炉（KXL-1010），北京市通润源机电技术责任有限公司；电子精密天平，奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；梅特勒-托利多pH计（FE20），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；凯氏定氮仪（KDY-9820），北京市通润源机电技术责任有限公司。

1.4方法

1.4.1样品制备谷子样品经捣精机脱壳，分别做以下处理：蒸制：小米与水以1∶5（m∶V）混合，上汽后蒸制25min，于烘箱内58℃烘干8h，磨粉，糊化度为92.67%。煮制：小米与水以1∶20（m∶V）混合，水开后煮制30min，于烘箱内58℃烘干12h后磨粉，糊化度为91.88%。挤压：小米磨粉，水分调制16%，双螺杆挤压设备设定：一区温度90℃，二区150℃，三区190℃，螺杆转速120r/min，喂料速度25r/min，糊化度为92.05%。

1.4.2小米醇溶蛋白提取小米脱壳后磨粉，过40目筛，小米粉∶正己烷=1∶5（W/V）振荡4h脱脂，静止1h除去上清液，将沉淀在通风橱内风干。风干的小米粉粉碎后过60目筛，用65%乙醇溶液以料液比1∶6，75℃水浴振荡1h，浸提液8000r/min离心15min。取上清液在4℃冰箱内进行透析，2h换1次水。换水3~4次后取透析袋内溶液8000r/min离心15min，将沉淀在-20℃冰箱内速冻，于冷冻干燥机内冷冻干燥12h，获得的蛋白纯度在85%以上。

1.4.3淀粉酶处理取5g样品于150mL锥形瓶中，以料液比1∶5（m∶V）加水，37℃水浴5min，以酶与底物比例为1∶100（m∶m）加入淀粉酶，在恒温水浴振荡器上37℃水浴30min，以确保样品中的淀粉充分水解。

1.4.4蛋白质体外消化小米蛋白质的体外消化实验采用胃蛋白酶-胰蛋白酶体外消化模型。具体操作如下：准确称取一定质量的样品分散于0.1mol/LHCl中形成50g/L的溶液，置于37℃水浴中预热5min，以酶∶底物为1∶100（m∶m）加入胃蛋白酶，在37℃恒温振荡器上反应，分别在不同的消化时间（0，30，60，120min）取样，用1mol/LNaOH调节pH7.0终止消化反应。对120min时所得消化液调节pH7.0，以酶∶底物为1∶100（m∶m）加入胰蛋白酶，在消化30，60，90，120min之后煮沸停止反应，分别取样分析[13]。

1.4.5体外消化率测定体外消化率采用TCA-NSI（三氯乙酸氮溶指数）法[14]测定和计算。取5mL不同消化液于5mL10%TCA中，4000r/min离心20min，沉淀用10%TCA洗涤2次，离心得到TCA不溶组分。TCA不溶性氮含量采用凯氏定氮法测得，氮含量采用凯氏定氮法（GB5009.5-2010）测定，消化过程氮释放量由下式计算。

2结果分析

2.1不同加热处理的小米蛋白消化率经蒸制、煮制和挤压处理的小米样品蛋白消化率变化情况如图1所示。胃蛋白酶和胰蛋白酶各消化120min，未经处理的小米蛋白消化率达到66.38%，而经蒸制、煮制和挤压处理的小米蛋白消化率分别下降了41.65%，32.52%和1.94%。在胃蛋白酶消化过程中，蒸小米、煮小米和挤压小米蛋白消化率的变化率在前30min较大，之后逐渐减小，甚至趋于0，而生小米的蛋白消化率的变化率则在前30min较小，之后迅速提高。这可能与包裹小米蛋白体的其它成分如淀粉等有关。这一推测也可在后面经淀粉酶解后不同加热处理的小米蛋白的消化率的变化中得到印证。在胰蛋白酶消化过程中，除挤压小米外，生小米和蒸煮小米的蛋白消化率的变化率几乎不再变化，而挤压小米的蛋白消化率先增高后趋于0。通常在谷物蛋白体周围都存在淀粉颗粒而影响蛋白的消化。在人体消化食物的过程中，先有一个唾液淀粉酶解的过程。将经各种处理的小米先用淀粉酶解，后用胃蛋白酶和胰蛋白酶消化。由图2可看出，经淀粉酶解的各种处理的小米蛋白消化率显著提高。表1列出最终消化率的对比情况。经淀粉酶解后，生小米、蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率分别提高了29.89%，53.60%，59.48%和17.87%。生小米在经淀粉酶处理后蛋白消化率达到86.22%，比经相同条件蒸煮处理的大米蛋白消化率（75.84%和81.09%）高。几种加热处理后小米的蛋白消化率变化情况较未加淀粉酶时有一定的差异。从图2可看出，淀粉酶解后蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率较生小米分别降低了31.00%，17.15%和11.02%。在胃蛋白酶解阶段，小米蛋白消化率的变化率在前30min较大，之后减小，甚至趋近于0。在胃蛋白酶终止作用时，蒸小米、煮小米和挤压小米的蛋白消化率非常接近。在胰蛋白酶作用阶段，生小米和蒸小米的蛋白消化率几乎不再变化，挤压小米的蛋白消化率先升高后趋于平缓，煮小米的消化率则呈直线升高。

2.2不同加热处理的小米醇溶蛋白的消化率小米蛋白中约有46%为醇溶蛋白[3]，是含量最多的一种蛋白。其经不同加工处理的消化率的变化对小米总蛋白的消化率有一定影响。因本试验中采用双螺杆挤压膨化机对样品进行挤压膨化，所需物料量较大，故没有研究挤压处理的醇溶蛋白。如图3所示，蒸制和煮制的小米醇溶蛋白的消化率分别为54.21%和48.94%，较生蛋白分别降低了35.57%和28.63%。在胃蛋白酶消化阶段，前30min蒸蛋白的消化率最高，之后趋于平缓，直至胰蛋白酶消化结束。生蛋白和煮蛋白的消化率的变化趋势相同，在胃蛋白酶消化阶段，前60min消化率提高较快，之后减慢，甚至趋于平缓；在胰蛋白酶消化阶段，消化率先提高后趋于平缓。醇溶蛋白的消化率变化规律和小米蛋白消化率变化趋势相似，推测醇溶蛋白在加热过程中的变化，很可能是影响小米蛋白消化率的一个主要因素。

3讨论

湿热处理对蛋白质的影响较大，对于大多数谷物来说，适宜的热处理可提高蛋白质的消化率和必需氨基酸的生物有效性[15]。也有一些谷物在湿热处理下蛋白质的消化率反而降低。本研究发现蒸煮加工对小米蛋白的消化具有不利的影响，这与之前很多研究[10、16-18]报道的高粱蛋白质消化率因蒸煮而降低的结果类似。这些研究发现醇溶蛋白的低溶解性和二硫键的形成，很可能是造成高粱蒸煮后蛋白消化率降低的主要原因。Hamaker等[10]通过不同的溶剂对未经蒸煮和蒸煮的高粱醇溶蛋白进行提取，发现蒸煮后用酒精提取的醇溶蛋白成分明显减少，而用乙醇加2-巯基乙醇和亚硫酸钠的溶剂提取的醇溶蛋白明显增多，由此得出蒸煮之后醇溶蛋白的溶解度降低的结论。早在1991年，Shull[19]等根据分子质量将醇溶蛋白分成3类，即位于蛋白体中心的α-醇溶蛋白（24ku和26ku）以及位于的β-醇溶蛋白（20，18ku和16ku）和γ-醇溶蛋白（28ku）。Rom[17]和Oria[18]等通过电镜观察到消化过程中，经蒸煮的高粱蛋白体的很难被酶破坏，而在添加了能够破坏二硫键的还原剂后，其会出现明显的凹陷，推测是由于β-和γ-醇溶蛋白通过二硫键形成抵抗酶的聚合物，从而保护内部的α-醇溶蛋白不被消化。Hamaker[10]等通过电泳的方法也发现了类似结果。

刘思思[12]对小米所含4种蛋白进行电泳，发现含量最多的醇溶蛋白主要分布在低分子质量范围，其电泳图谱与高粱基本相同，有α-（18～21ku）、β-（15ku）、γ-（23ku）醇溶蛋白以及分布在12ku的4条谱带。通常小米蛋白在60℃左右会发生热变性。在对小米乳经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的残渣电泳后，刘思思[12]发现醇溶蛋白仅有18～21ku的少部分蛋白条带消失，进一步经亚硫酸氢钠处理消化残渣后大部分电泳条带消失，说明小米醇溶蛋白中的二硫键是影响小米蛋白消化率的一个主要的原因。小米醇溶蛋白，如高粱醇溶蛋白一样，通过二硫键在形成致密的保护结构，阻止蛋白酶与蛋白的结合，从而导致消化率低。刘思思[12]还发现，蒸煮后的小米醇溶蛋白和生的醇溶蛋白的消化残渣用亚硫酸氢钠处理后，其电泳条带无显著差异，说明亚基间未形成新的二硫键。本研究发现蒸煮后小米蛋白的消化率明显降低。湿热处理后小米蛋白质消化率的降低是否与醇溶蛋白加热后形成二硫键有关，这尚需证实。CalvinOnyango[20]等人对玉米-小米预混粉烹煮、发酵、挤压等处理后也发现，经发酵、挤压以及发酵后再挤压几种处理后，预混粉的蛋白消化率较生粉明显提高，然而经发酵再烹煮后，预混粉的蛋白消化率甚至较生粉还低，CalvinOnyango推测这可能是由于长时间加热熟化导致蛋白多聚体的形成，从而抵抗酶的作用而致。挤压作为一种高温短时的加热处理方式，在加工过程中，对谷物蛋白质有很大的影响。挤压温度和样品水分是影响蛋白质结构的重要指标。通过挤压导致的蛋白质变性可以暴露蛋白酶作用位点，从而提高蛋白消化率[20]，然而也会通过疏水作用、二硫键连同其它形式的共价键共同作用，使蛋白质发生聚集，导致溶解性降低[21]，从而降低蛋白质消化率。通过选择合适的挤压温度和样品水分来实现提高小米蛋白消化率的目的。

4结论