牛血清白蛋白范文
时间：2023-03-31 08:35:51
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篇1
【摘要】 目的： 应用光谱技术研究曲克芦丁(troxerutin， TRO)与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 间结合作用机制。方法： 通过荧光光谱法确定曲克芦丁对BSA的荧光猝灭机制。依据热力学参数讨论两者之间的主要作用力类型。利用同步荧光光谱考察曲克芦丁对BSA构象的影响。结果： 曲克芦丁对BSA的荧光猝灭机制为静态猝灭;反应的热力学参数ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K)。结论： 曲克芦丁与BSA之间的主要作用力是范德华力;曲克芦丁的加入使BSA构象发生了变化。
【关键词】 牛血清白蛋白; 曲克芦丁; 荧光猝灭; 同步荧光光谱
[Abstract] Objective: Applied spectroscopy to study the interaction mechanism of troxerutin and bovine serum albumin(BSA).Methods： Fluorescence spectroscopy method was used to determine the fluorescence quenching mechanism of BSA caused by troxerutin.According to the thermodynamic parameters the major force types between troxerutin and BSA was discussd.The effect of troxerutin on bovine serum albumin was also studied by synchronous fluorescence spectrometry.Results： The quenching mechanism of troxerutin to bovine serum albumin was static quenching.The thermodynamic parameters of the reaction was ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K).Conclusion： The main binding force between troxerutin and BSA was Van derWaals interaction.Troxerutin binding on the bovine serum albumin could change the serum protein conformation.
[Key words] bovine serum albumin; troxerutin; fluorescence quenching;synchronous fluorescence spectroscopy
曲克芦丁(troxerutin，TRO)系芦丁经羟乙基化制成的半成品黄酮化合物。具有抑制红细胞和血小板凝结，防止血栓形成的作用;同时能增加血中氧的含量，改善微循环，促进新生血管形成以增进侧支循环的开放[1]。结构见图1。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能和许多内源性物质广泛结合。各种药物进入人体一般都要通过血浆的贮存和运输，而后才能到达受体部位并发生药理作用。
研究药物与血清白蛋白的相互作用具有重要的理论意义[2]。蛋白质的功能与其结构密切相关，研究中药有效成分对蛋白质结构的影响，不仅能为确定中草药有效成分及作用强度提供一定信息，而且对全面阐明小分子化合物与蛋白质的结合机制也有重要意义，同时也有利于了解中药的作用机制。本文研究了TRO与牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的作用机制以及温度对结合常数的影响。分析了TRO与BSA的结合模式，从分子水平认识该反应的作用机制。
图1 曲克芦丁的结构
Fig 1 The structure of troxerutin
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
TU1901PC型分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，LS50B型荧光分光光度计(美国PerkinElmer公司)，PHS25型PH计(上海雷磁仪器厂);TRO(中国药品生物制品检定所)，牛血清白蛋白(Sigma公司);三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸、氯化钠等试剂均为分析纯;实验用水为二次蒸馏水。
1.2 溶液配制
用0.9%NaCl配成pH=7.4的TrisHCl缓冲液来配制浓度为1.0×10-3 mol/L的TRO储备液备用;以TrisHCl缓冲溶液(pH=7.4，含0.1 mol/L NaCl 以维持溶液的离子强度)为溶剂配制1.0×10-4 mol/L 的BSA储备液备用。
1.3 实验方法
荧光光谱的测定：取3 ml 1.0×10-6 mol/L的BSA溶液于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐次加入浓度为1.626×10-3 mol/L的TRO溶液进行滴定，加样体积由实验点浓度计算确定(滴定剂累加体积小于100 μl)。以278 nm为激发波长，绘制300～500 nm波长范围的荧光光谱;同步荧光光谱实验中同时扫描激发和发射单色器，固定激发和发射波长差分别为60 nm和20 nm，其他同荧光光谱测量。
紫外吸收光谱的测定：移取10 ml 1×10-4 mol/ L 的曲克芦丁溶液于10 ml比色管中，加入pH=7.4 的TrisHCl缓冲溶液定容至刻度，以TrisHCl 缓冲溶液做参比，测定紫外吸收光谱。
2 结 果
2.1 紫外光谱的研究
由BSA，TRO及TROBSA(1∶1)复合体系的紫外吸收光谱(图2)可以看出，TROBSA复合体系的吸收光谱与单独TRO，BSA的吸收光谱相比，发生了明显的减色效应。吸收光谱的变化表明TRO和BSA之间的相互作用是在基态分子中发生的。
2.2 TRO对BSA的荧光猝灭研究
蛋白质能够发出荧光是因为蛋白质中存在三种芳香族氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。由于这些氨基酸结构不同，其荧光强度之比为100∶9∶0.5，因此大多数情况下可以认为蛋白质所显示的荧光主要由色氨酸残基贡献[3]。而当激发波长为278 nm时，TRO在300～500 nm范围内几乎无荧光。固定BSA的量，不断增加TRO浓度时，BSA内源荧光强度有规律地降低，不同温度时的荧光猝灭曲线如图3，4所示。
C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;λ=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5×10-6 mol/L
图3 25℃时TRO对BSA的荧光猝灭光谱
Fig 3 Effect of TRO on fluorescence spectrum
of BSA at 25℃
C(BSA)=1.0×10-6 mol/L;λ=278 nm;pH=7.4;C(TRO)(AF)：0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5×10-6 mol/L
图4 37℃时TRO对BSA的荧光猝灭光谱
Fig 4 Effect of TRO on fluorescence spectrum
of BSA at 37℃
荧光猝灭通常可分为动态猝灭和静态猝灭。一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度的升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度升高而增大;若是静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。为了进一步阐明其荧光猝灭机制，分别作出25 ℃和37 ℃时BSA猝灭的荧光光谱，根据SternVolmer方程[4]
F0F=1+Kqτ0[Q ]=1+KSV[Q ]
式中F0和F分别为加入猝灭物质前后所测得的荧光强度值，τ0为没有猝灭物质存在时荧光分子的平均寿命。Kq为双分子碰撞猝灭常数，[Q ]为猝灭物质的浓度， KSV为SternVolmer猝灭常数，且有KSV=Kqτ0。绘制F0/F-1对[Q ]关系图，见图5。
图5 25℃和 37℃时BSA 的SternVolmer图
Fig 5 SternVolumer curve of BSA with TRO at
25℃ and 37℃
从图5可以看出，曲线呈良好的线性关系，且随着温度的升高BSA猝灭曲线的斜率降低，可判断药物与BSA之间形成了复合物，猝灭过程为静态猝灭。
2.3 结合位点和结合常数的确定
药物分子和蛋白质分子间的相互作用一般采用位点结合模型来描述，设蛋白质分子(P)上对药物分子(Q)有N个等同独立的结合部位。蛋白质总浓度为[Pt]，药物总浓度为[Qt]，蛋白质和药物的游离浓度分别为[P]和[Q]，生成物为QnP，其浓度为[QnP]，则与蛋白质结合的药物当量数为n[QnP]，设结合常数为K，依据Scatchard方程[5]可知，确定猝灭机制后，再将所测得的各个荧光光谱，按349 nm处的相对荧光强度F0/F对C(TRO)F0/(F0-F)作线性拟合，得到弱碱性条件下TRO与BSA形成复合物的结合常数、结合位点数和相应的直线相关系数，见表1。结果表明，TRO与BSA作用时只有1个结合点。表1 BSA和TRO的结合常数及方程的相关系数
2.4 TRO与BSA作用力的确定
药物与生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等。药物不同，与蛋白质作用类型也不相同。根据热力学参数与作用力间的关系，可以确定其作用力类型。热力学参数与主要作用力间的相互关系如下[6]：ΔH=0，ΔS>0，为疏水作用力;ΔH0，为静电作用力;ΔH
lnK2K1=ΔH(1T1-1T2)R
ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnK
可求得25 ℃时TRO与BSA反应的热力学参数ΔH=-77.06 KJ/mol，ΔS=-152.20 J/(mol·K)，ΔG=-31.70 KJ/mol。所以可认为TRO与BSA之间的作用力主要为范德华力。
2.5 TRO对BSA构象的影响
同步荧光光谱经常被用来研究药物分子对蛋白质构象的影响。当同步扫描波长差Δλ为60 nm时，BSA的同步荧光主要是色氨酸残基发射的荧光，Δλ为20 nm时只表现出酪氨酸残基的荧光。而色氨酸的最大荧光发射波长与其所处的介质环境有关。因为氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的疏水性有关，所以由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。
BSA的空间结构由3个结构域组成，每个结构域由2个亚结构以槽口相对的方式形成圆筒状结构，几乎所有疏水性氨基酸残基都包埋在圆筒内部构成疏水腔[5]。固定BSA浓度，逐渐增大TRO的浓度，记录Δλ=60 nm和Δλ=20 nm时的同步荧光光谱图，发现最大发射波长略有移动(图6)。表明TRO的加入导致了BSA构象的改变，色氨酸残基所处环境的疏水性降低，BSA 内部的疏水结构有所瓦解， 肽链的伸展程度增加[7 ]。
C(BSA)=1.0×10-6 mol/L; pH=7.4
a：Δλ=20 nm; C(TRO)(A-E)：0，1，2，3，4，×10-6 mol/L
b：Δλ=60 nm; C(TRO)(A-E)：0，1，2，3，4×10-6 mol/L
图6 BSA的同步荧光光谱
Fig 6 Synchronous fluorescence spectrum of BSA
3 讨 论
TRO对BSA产生荧光猝灭，且猝灭过程是由于形成化合物而引起的静态猝灭。因为动态猝灭是由分子的扩散碰撞导致的，随着温度的升高，分子的扩散速度加快，荧光猝灭会更严重，猝灭常数应更大。而静态猝灭温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。另外，据文献报道，生物大分子的荧光寿命约为10-8 s[8]，各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数为2.0×1010 L·(mol·s)-1，根据实验所得KSV值及SternVolmer方程，可以计算TRO对BSA的荧光猝灭速率常数Kq远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数。由此进一步证明，TRO对BSA的猝灭是由于形成了配合物而引起的静态猝灭。
通过TRO与BSA荧光光谱的研究发现，不存在药物时的BSA荧光强度比存在药物时的BSA荧光强度强，表明BSA内色氨酸残基与TRO之间存 在能量转移。
通过对TRO与BSA荧光光谱测定，发现BSA的内源荧光有规律地降低且略有红移现象。有研究[9] 认为色氨酸的最大荧光发射峰位对环境很敏感， 在疏水环境中其最大峰位约为332 nm，完全显露于水相中时约为352 nm，部分显露于水相中时则约为342 nm，由此可以认为TRO 与BSA 结合后， 使BSA 的螺旋结构逐渐舒展开来， 从而使色氨酸残基逐渐从白蛋白的疏水环境中显露出来而进入水相中， 导致BSA分子的空间构象发生了变化。
参考文献
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篇2
【摘要】
目的 研究新型光敏剂五聚赖氨酸2羰基酞菁锌（ZnPc(Lys)5）与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用。方法 从BSA角度采用荧光光谱法和紫外可见光谱法通过荧光猝灭实验探讨ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的猝灭机制、结合常数及结合位点；从ZnPc(Lys)5角度采用胶束荧光增敏法测定ZnPc(Lys)5浓度通过Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数。结果 荧光猝灭实验结果表明ZnPc(Lys)5对BSA的荧光有强烈的猝灭作用，猝灭机制主要是静态猝灭形成基态配合物。不同温度（298，303，308，313，318 K）的结合常数K1分别为12.1×104 L/mol，7.69×104 L/mol，6.12×104 L/mol，4.57×104 L/mol，3.76×104 L/mol，结合位点数分别为0.93，1.02，1.07，1.13，1.17。Scatchard方程计算出298 K结合常数K2为1.557×105 L/mol，结合位点数位1.07。结论 从两个方面计算的结合常数和结合位点数基本一致， ZnPc(Lys)5与血清白蛋白之间主要通过形成基态配合物的方式相互作用，进入血清白蛋白中1个结合位点。
【关键词】 光敏感药； 光谱法，荧光； 分光光度法，紫外线； 锌； 聚赖氨酸； 吲哚类； 血清白蛋白，牛
Interaction of Pentalysine βcarbonylphthalocyanine Zinc with Bovine Serum Albumin: Two Methods
LI Chunyan ， RUAN Guanyu， SHAN Li， CHEN Jincan， HUANG Mingdong
School of Pharmacy， Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China;Department of pharmacy，Fujian Maternal and Child Health Hospital，Fuzhou， 350001， China;State Key Laboratory of Structural Chemistry， Fujian Institute of Structure of Matter，
Chinese Academy of Sciences， Fuzhou， 350002， China
ABSTRACT: Objective To investigate the interaction of pentalysine βcarbonylphthalocyanine zinc (ZnPc(Lys)5) with bovine serum albumin (BSA) by two methods. Methods From the point of BSA， the quenching mechanism， binding constants and sites of the interaction between ZnPc(Lys)5 and BSA was investigated through the fluorescence quenching experiment by fluorescence spectrometry and UVvisible spectroscopy. From the point of ZnPc(Lys)5， the constants and sites of the interaction were calculated through micellar enhanced spectrofluorometric determination of ZnPc(Lys)5 concentration with Scatchard equation. Results The mechanism of fluorescence quenching is static quenching process. The binding constants and the number of binding sites were calculated at different temperatures (298， 303， 308， 313， 318 K): 12.1， 7.69， 6.12， 4.57， 3.76×104 L/mol and 0.93， 1.02， 1.07， 1.13， 1.17， respectively. The binding constant and the number of binding sites calculated from Scatchard equation at 298 K were 1.557×105 L/mol and 1.07， respectively. Conclusion The two methods produce approximately identical data of the binding constant and sites. The results indicate that ZnPc(Lys)5 strongly binds to BSA at a molar ratio of 1∶1.
KEY WORDS: photosensitizing agents; spectrometry， fluorescence; spectrophotometry， ultraviolet; zinc; polylysine; indoles; serum albumin，bovine
已有文献报道血清白蛋白在运输光敏剂酞菁过程中扮演着重要的角色，但其与血清白蛋白的相互作用的分子机制仍未彻底研究［1］。药物与血清白蛋白相互作用的研究方法有荧光分析法、紫外－可见光谱法、平衡透析法、圆二色谱法、超过滤法、傅立叶变换红外光谱法、核磁共振波谱及高效亲和色谱法等。国内外文献中大多采用荧光光谱法研究药物与白蛋白的相互作用，该法具有灵敏度高、选择性强、分析速度快、方法简单、操作方便、仪器价廉等优点［2］。本文采用荧光方法从两个不同的角度研究ZnPc(Lys)5与BSA相互作用：（1）从BSA角度通过荧光猝灭法应用著名的SternVolmer方程研究加入不同浓度ZnPc(Lys)5导致BSA中色氨酸（Trp）残基荧光猝灭，进而计算出表观猝灭常数并探讨了可能的猝灭机制和相互作用方式，然后通过双导数方程计算出ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点；（2）从ZnPc(Lys)5角度通过胶束增敏荧光法分别测定结合态和游离态的ZnPc(Lys)5浓度，采用Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
荧光光度计（Cary Eclipse，美国Varian公司）；多功能酶标仪（Synergy 4，美国BioTek公司）；ZnPc(Lys)5由中国科学院福建物质结构研究所黄明东课题组合成，纯度>99.5%；BSA（美国Amerosco公司进口分装）；SDS（美国Sigma公司）；考马斯亮蓝蛋白质浓度定量试剂盒（福建泰京公司）；其他试剂纯度均为分析纯以上；实验用水均为Millipore Q超纯去离子水（18.20 mΩ）。
1.2 方法
1.2.1 荧光猝灭法
在离心管中分别加入终浓度2.5 μL/mol的脱脂BSA储备液，分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，取200 μL加入96孔荧光板中，以290 nm作为激发波长，测定300～500 nm荧光发射光谱。
1.2.2 丙酮沉淀BSA和结合态ZnPc(Lys)5
ZnPc(Lys)5游离浓度：在离心管中加入2.5 μmol/L的脱脂BSA储备液，分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。
ZnPc(Lys)5总浓度：在离心管中分别精确加入10 μL ZnPc(Lys)5系列标准溶液，用Tris缓冲液补足至500 μL，摇匀、静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。
空白对照组：在离心管中加入2.5 μmol/L的脱脂BSA储备液后，用Tris缓冲液补足到500 μL，振荡摇匀，静置10 min后，立即加入冰丙酮500 μL，132 000 r/min离心5 min，分别取上清液800 μL，SDS储备液200 μL，用Tris缓冲液定容至5 mL，待测。
1.2.3 胶束荧光光谱测定ZnPc(Lys)5浓度
室温条件下用Cary Eclipse荧光光度计进行荧光光谱的扫描，10 mm石英比色皿进行测定。激发波长：610 nm，发射波长：692 nm；激发和发射狭缝均为5 nm，使用仪器自带滤光片；PTM电压：600 V，扫描速度：600 nm/min。
ZnPc(Lys)5结合浓度=ZnPc(Lys)5总浓度-ZnPc(Lys)5游离浓度
实际ZnPc(Lys)5游离浓度=ZnPc(Lys)5游离浓度-空白对照组
2 结果
2.1 ZnPc(Lys)5对BSA内源荧光的猝灭
固定BSA的浓度（2.5 μmol/L），改变ZnPc(Lys)5的浓度，在pH=7.4的Tris缓冲体系中测得不同浓度ZnPc(Lys)5时BSA的荧光光谱，结果见图1。
2.2 ZnPc(Lys)5引起BSA内源荧光的猝灭机制
荧光猝灭过程通常可分为动态猝灭和静态猝灭两种。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间发生相互碰撞而导致荧光物质的荧光量子产率下降的过程。静态猝灭是猝灭剂和荧光物质分子在基态时生成不发荧光或弱荧光的配合物，从而导致荧光物质荧光强度减小。其中动态猝灭遵循SternVolmer方程［2］：
F0/F=1+Ksv［ZnPc(Lys)5］=1+Kqτ0［ZnPc(Lys)5］（1-1）
式（1-1）中，F0 为未加入ZnPc(Lys)5时荧光分子BSA的荧光强度，F 为加入ZnPc(Lys)5后BSA的荧光强度，［ZnPc(Lys)5］ 为ZnPc(Lys)5游离浓度，Kq为双分子猝灭过程的速率常数，τ0为无ZnPc(Lys)5存在下荧光分子的平均寿命，生物大分子的荧光寿命τ0约为108s，Ksv为SternVolmer猝灭常数，通过F0 /F对 ［ZnPc(Lys)5］作图，可由回归方程的斜率求出Ksv。
按1.2.1项方法测定不同温度（298，303，308，313，318 K）下ZnPc(Lys)5对BSA作用后BSA荧光强度强度，其SternVolmer曲线结果见图2。由图2可知，ZnPc(Lys)5在4～50 μmol/L浓度范围中F0/F与 ［ZnPc(Lys)5］之间存在线性关系。通过式（1-1）计算得猝灭常数结果见表1。为了进一步确证上述结果，本文还观察了猝灭剂ZnPc(Lys)5的紫外可见光谱的变化情况，结果见图3。表1 不同温度下（298，303，308，313，318 K）荧光猝灭法计算的ZnPc(Lys)5与BSA相互作用结合参数和结合位点数（略），Tab 1 The binding parameters and sites for the interaction of ZnPc(Lys)5 and BSA by the fluorescence quenching method at five temperatures（298， 303， 308， 313， 318 K）（略）。
2.3 ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点数的计算
对于静态猝灭，假设生物大分子有n个相互独立的结合位点，并且位点之间不存在相互作用［3］，则：
n(ZnPc(Lys)5+BSA（ZnPc(Lys)5）nBSA(1-2)
(ZnPc(Lys)5)nBSA为生成的配合物，则其结合常数Ks为：
Ks=［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-3)
［BSA］为体系中BSA游离浓度，设［BSAt］为BSA的总浓度则［BSAt］＝［(ZnPc(Lys)5)nBSA］+［BSA］代入式（13）可得
Ks=(［BSAt］-［BSA］)/［ZnPc(Lys)5)］n［BSA］(1-4)
在一定的波长范围内，若体系的荧光仅由BSA所产生，即猝灭剂和配合物不发荧光，则有
F0/F=［BSAt］/［BSA］(1-5)
式中，F0和F分别表示未加入ZnPc(Lys)5和加入ZnPc(Lys)5后BSA的荧光强度。将式（1-5）代入（1-4）经变化后得：
lg(F0-F)/F=lgK1+nlg［ZnPc(Lys)5］(1-6)
当ZnPc(Lys)5总浓度大大于BSA浓度时，ZnPc(Lys)5总浓度可近似看作其游离浓度代入式（1-6）计算。通过lg(F0-F)/F对lg［ZnPc(Lys)5］作回归曲线，结果见图4，由斜率和截距求出ZnPc(Lys)5与BSA结合常数K1及结合位点数n，结果见表1。
2.4 Scatchard方程计算ZnPc(Lys)5与BSA结合常数和结合位点数
药物与蛋白质分子间的相互作用采用位点结合模型解释，即
r=nK1［ZnPc(Lys)5］/(1+K2ZnPc(Lys)5］)（1-7）
式（1-7）中，［ZnPc(Lys)5为溶液中ZnPc(Lys)5的游离浓度，r为平均每摩尔BSA分子结合ZnPc(Lys)5的物质量，K2为结合常数，n为结合位点数，即一个BSA分子能结合的ZnPc(Lys)5数目。
式（1-7）可变换成著名的Scatchard方程：
r［ZnPc(Lys)5］=nK2-rK2（1-8）
按“1.2.2”项方法计算ZnPc(Lys)5结合浓度和游离浓度，根据方程（1-8）通过r/［ZnPc(Lys)5］对r作线性回归，求得结合常数K2为1.557 × 105 L/mol，结合位点数位为1.07（r= 0.9963）。
3 讨论
ZnPc(Lys)5［4］（图5）是通过β单取代羧基酞菁锌（βZnPc）［5］与水溶性聚赖氨酸多肽连接得到的一种新型两亲性酞菁锌。侧链上聚赖氨酸富含阳离子，对具有比正常细胞表面更多负电荷的肿瘤细胞表面具有选择性吸附和电中和作用［6］，增加酞菁在肿瘤组织的富集，降低活性光敏剂在正常组织的富集，从而提高靶向性。因此，ZnPc(Lys)5有望成为一种理想的抗癌光敏剂，进行ZnPc(Lys)5与白蛋白相互作用研究具有重要意义。
由于血清白蛋白中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有内源荧光。以280 nm为激发波长时，主要激发白蛋白中色氨酸和酪氨酸残基的荧光，本文选择激发波长为290 nm， BSA发射的内源性荧光则来源于色氨酸。由图1可见，ZnPc(Lys)5对BSA内源荧光产生强烈猝灭作用，当浓度达50 μmol/L时，BSA荧光强度仅约为未加入ZnPc(Lys)5时BSA荧光强度的35%，但最大发射波长没有明显位移。表明ZnPc(Lys)5使得BSA中色氨酸残基的荧光量子产率大幅下降，但对色氨酸所处的内环境极性没有明显影响。
目前认为动态与静态猝灭可以依据猝灭常数随温度的变化来区别。对于动态猝灭，温度升高，将增加有效碰撞的粒子数目，加剧电子的转移，使荧光物质的猝灭常数随着温度的升高而增大；若是静态猝灭，温度升高将降低复合物的稳定性，使结合常数减小。此外，还可以通过观察荧光分子的吸收光谱的变化情况来区别二者。动态猝灭主要影响荧光分子的激发态，一般不改变荧光分子的吸收光谱；而静态猝灭是基态猝灭剂与荧光分子形成配合物的结果，通常荧光分子或猝灭剂吸收光谱会有所变化［2］。由表1可以看出，随着温度的升高，猝灭常数减小，表明ZnPc(Lys)5与对BSA的荧光猝灭可能主要是静态猝灭。另外，假设ZnPc(Lys)5与BSA猝灭方式为动态猝灭，根据式（1-1）计算得不同温度下的猝灭速率常数Kq数量级在1012～1013 L·mol-1·s-1，这些数值都远大于生物分子的最大碰撞扩散猝灭速率常数2.0×1010 L· mol-1·s-1［7］，也表明ZnPc(Lys)5对BSA的荧光猝灭可能是静态猝灭。为进一步区分两种猝灭机制，图3的ZnPc(Lys)5的紫外可见光谱的变化情况在没有BSA存在下ZnPc(Lys)5在633 nm有聚集态的吸收峰，几乎没有673 nm的单体吸收峰［8］。在体系中逐渐加入BSA 后，峰形发生变化，在673 nm出现单体的吸收峰并伴随着BSA浓度的增大而增强，在633 nm的聚集态特征吸收峰却随着BSA浓度的增大反而减弱，表明ZnPc(Lys)5与BSA之间存在相互作用形成基态配合物［9］，从而导致ZnPc(Lys)5解聚，进一步验证了ZnPc(Lys)5引起BSA的荧光猝灭的机制主要是静态猝灭，而不是动态猝灭。
从测定BSA荧光强度角度，当ZnPc(Lys)5与BSA以形成基态配合物方式相互作用时，可以通过双导数方法计算二者结合常数。由图4看出，每一温度下双导数图同样都得到线性关系良好的回归曲线（R>0.99）。由表1看出，通过双导数和SternVolmer两种方程得到的结合常数比较接近，均在同一数量级，各温度平均结合位点数n为1.1，表明ZnPc(Lys)5与BSA有一个结合位点。从测定ZnPc(Lys)5荧光强度角度，采用Scatchard方程计算的298 K下ZnPc(Lys)5与BSA相互作用的结合常数和结合位点数与同温度下双导数和SternVolmer两种方程得到的结合常数和结合位点数基本一致。采用Scatchard方程计算结合常数和结合位点数需要测定药物的游离浓度，由于药物的游离浓度通常较难测定，所以国内文献大多采用双导数和SternVolmer两种方程计算结合常数和结合位点数。国外文献中有采用Scatchard方程计算结合常数和结合位点数的报道，但文中对于药物游离浓度的测定方法没有明确指出，丹麦学者van de Weert最近专门发文指出这个缺陷［10］。本文明确阐述了测定BSA中ZnPc(Lys)5游离浓度的方法。
到底ZnPc(Lys)5作用在BSA的哪一位点上，可以通过建立分子模型来预测，进一步用竞争络合法确认［3］。
参考文献
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篇3
目的 研究叶酸偶联牛血清白蛋白的合成工艺，制备包裹砒霜的白蛋白纳米粒并检验其对靶细胞的杀伤作用。方法叶酸在缩合剂的作用下与牛血清白蛋白偶联，通过正交设计选择最佳配方；用去溶剂法制备包裹砒霜的纳米粒，并观察其对靶细胞特异性杀伤作用。结果采用最佳条件合成的叶酸偶联牛血清白蛋白的偶联率为30.31 μg/mg，纳米粒的砒霜包封率为10.3%，对靶细胞杀伤率为97%，对非靶细胞的杀伤力仅为23%。结论 包裹有砒霜的叶酸偶联牛血清白蛋白纳米粒（简称F-BSANP）对靶细胞有特异性杀伤作用。
【关键词】 砒霜；纳米粒；叶酸；牛血清白蛋白
Abstract：ObjectiveTo study the synthetic procedure of folate-conjugated bovine serum albumin (F-BSA) and preparation of albumin nanoparticles entrapping arsenic trioxide，and to examine the peculiar toxicity of nanoparticles on targeting cells.MethodsFolic acid was conjugated to bovine serum albumin via condensing agent，we studied the best synthetic formula of F-BSA by the orthogonal test design．The nanoparticles were prepared by desolvation method，and the peculiar toxicity of F-BSANP on A549 was studied．ResultsThe average conjugating rate of folate in F-BSA made in the best formula was 30.31μg/mg．The entrapping rate of arsenic trioxide was 8.34%．We examined the peculiar toxicity of F-BSANP on targeting cells and control group cells，respectively，and the death rate of targeting cells was 97 percent ，whereas that of control group was only 23 percent．ConclusionF-BSANP is peculiar to their targeting-cells．
Key words：Arsenic trioxide； Nanoparticles； Folate； Bovine serum albumin
肿瘤是严重危害人类生命和健康的常见病和多发病，是导致残疾和早死的主要疾病之一。目前，临床使用的抗肿瘤化疗药物均有较大的毒副作用，有些严重的毒副反应是限制药物剂量或使用的直接原因。研究发现，在多种肿瘤细胞(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌等)膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞，这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础［1］ 。
中药砒霜（三氧化二砷）是中药中的传统毒药，近年来有关其抗肿瘤作用，尤其是在我国率先开展的三氧化二砷治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)的研究引起了人们的广泛兴趣；研究已发现砒霜能显著抑制人肺癌的细胞生长并诱导其凋亡［2］ 。但是，在治疗过程中的严重毒副作用是影响其抗癌疗效的主要原因。
本实验以传统中药砒霜为治疗药物，将其包裹在用叶酸偶联白蛋白制成的纳米粒中，并进行其对靶细胞杀伤作用的研究。为以后制备其它抗癌药靶向制剂作铺垫。
1 材料
人肺癌细胞株A549（购于武汉大学生命科学院中国典型培养物保藏中心）；人骨髓间充质干细胞；分离自正常人骨髓血（骨髓血样由南昌大学医学院一附院血液科提供）；牛血清白蛋白（上海新量化工试剂有限公司）；叶酸（上海新量化工试剂有限公司）；1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（简称EDC·HCl）（上海三杰生物技术有限公司）；Sephadex G-25 （Pharmacia）；三氧化二砷（购自上海化学试剂采购供应站，CP）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI 1640 培养基（Gibco）；胰蛋白酶 1∶250（Amresco）。
2 方法和结果
2.1 叶酸偶联白蛋白的合成
2.1.1 叶酸偶联白蛋白的合成与分离
将叶酸溶于pH7.4的磷酸缓冲液(PBS)中，加入EDC·HCl后搅拌活化5 min，再加入50 mg/ml牛血清白蛋白的PBS溶液，搅拌下反应数小时即得［3］。将反应液过Sephadex G-25柱，收集前段淡黄色有乳光部分［4］。
2.1.2 因素和水平的确定
经过查阅相关文献资料和大量的预实验最终确定叶酸用量、EDC·HCl与叶酸摩尔比、反应时间3因素各取3水平优化工艺。见表1。表1 因素水平（略）
2.1.3 评价指标的选取与测定
叶酸与牛血清白蛋白偶联越多，纳米粒对肿瘤的靶向性就越高。因此选择叶酸与牛血清白蛋白偶联率作为评价指标。
偶联率的测定，将叶酸偶联白蛋白溶于pH7.4的PBS中，用2.5%的胰蛋白酶消化2 h后离心取上清液于358 nm处测紫外吸收。标准曲线法定量，计算偶联率。
偶联率=被偶联的叶酸量/μg被偶联的牛血清白蛋白量/mg
2.1.4 正交实验结果
按正交设计表L9(34)进行实验，计算偶联率（见表2），方差分析结果见表3。表2 正交设计（略）表3 方差分析表（略）
X1，X2和X3分别是各因素水平1、水平2、水平3偶联率之和；X是各因素内部水平1、水平2、水平3偶联率之和的最大差距
由表3～4可见，在考察的3个因素中， EDC/folate影响最大(P0.05)，叶酸偶联白蛋白合成工艺最佳水平组合为A3B3C1，以该工艺制备的叶酸偶联白蛋白的叶酸偶联率为30.31μg/mg。
2.2 纳米粒的制备
2.2.1 砷标准曲线的测定
按新银盐法［5］测定并计算砷标准曲线，C=9.106A+0.908 3，r=0.993 9，RSD为2.41%。在1～6μg浓度范围内，线性良好。
2.2.2 载药纳米粒的制备［6］
As2O3溶于牛血清白蛋白溶液中，调节pH值微碱性，室温下缓缓加入无水乙醇，搅拌30 min后再缓缓加入戊二醛溶液［7］ ，固化12 h即得。制得包封率为10.3%的纳米粒。
2.2.3 包封率的测定
取载药纳米粒用pH7.4的PBS分散，加入2.5%的胰蛋白酶消化2 h，离心后取上清液新银盐法测定其吸光度A值，计算出砷含量。
包封率（%）=纳米粒中所包裹的As2O3量投入As2O3的量×100%
2.2.3 空白回收率和加样回收率的测定
经测定，空白回收率为100.8%，加样回收率为97.9%。
2.2.4 纳米粒的形态观察和粒径
纳米粒分散于蒸馏水中，用HITACHI H-600透射电子显微镜观察粒子形态，并拍摄照片。纳米粒形态圆整，分布均匀，粒径大约200 nm左右。见图1～2。
2.3 细胞毒性实验［8］
将A549细胞培养于10%小牛血清的1640培养基中。设立空白对照组（加生理盐水）、载药叶酸偶联白蛋白纳米粒3个剂量组（10，1，0.1 μg/ml）、阻断组(载药1 μg/ml的叶酸偶联白蛋白纳米粒+叶酸)、载药白蛋白纳米粒(BSANP)组（1μg/ml）、砒霜组（1μg/ml）。培养24 h后，MTT法测定各孔及本底A490，计算细胞抑制率。
取正常人骨髓血3 ml，培养数天后分离贴壁细胞即得人骨髓间充质干细胞［9］。同法操作计算细胞抑制率。结果见表4。表4 靶细胞与非靶细胞的抑制率(略)
用t检验对实验结果进行分析，结果显示包裹砒霜的F-BSANP对靶细胞的抑制作用较非靶细胞明显；较BSANP组，叶酸阻断组与砒霜组也显示出非常高的抑制作用，差异具有显著性。
3 讨论
本实验中选择人骨髓间充质干细胞作为对照用的非靶细胞，主要是因为人骨髓间充质干细胞具有很强的增殖分化能力，与肿瘤细胞有相似之处。
包裹有砒霜的F-BSANP组对靶细胞的杀伤作用较非靶细胞、BSANP组和砒霜组明显，证明F-BSANP对靶细胞具有特异性杀伤作用；而包裹有砒霜的F-BSANP组对靶细胞的杀伤作用较叶酸阻断组明显也从侧面证明纳米粒的靶向性是通过叶酸介导入细胞而发挥作用；叶酸阻断组和BSANP组也存在显著差异，这可能是因为叶酸和叶酸偶联白蛋白纳米粒与叶酸受体是竞争性结合，在这个过程中也有部分叶酸偶联白蛋白纳米粒与叶酸受体结合而把药物介导入细胞内。
本实验中，在温和的条件下成功合成叶酸偶联牛血清白蛋白；在保证生理活性的前提下制备的偶联物可以做为靶向制剂的一种高分子材料，对传统中药砒霜进行包裹制成的纳米粒具有明显的主动靶向性，并且安全性高；在体内的过程及体内的药效有待于进一步的研究。另外，以叶酸偶联白蛋白纳米粒做为载体将市场上的抗肿瘤药物进行二次开发，应用前景广阔。
参考文献
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篇4
【关键词】综合实验；中空纤维膜；聚偏氟乙烯
在环境与化工相关学科中开展综合实验是目前化学实验教学改革的一个重要趋势。通过综合实验的开展，不仅可以培养学生发现问题、分析问题、解决问题的能力，而且还能培养学生的创新能力。我校在中空纤维膜的研究方面已有三十多年的历史，在全市乃至全国都有重要的影响力，其所属环境科学与工程是天津市重点学科，签于此我院于2012年在环境工程、应用化学和化学工程与工艺三个本科专业中开设了“膜材料与膜过程”课程，拓展了学生的知识面，取得了非常好的效果。为了巩固课堂教学成果，强化学生对膜技术的认识，特开设了“中空纤维膜的制备及性能研究”综合实验。本文以此综合实验为例，以应用实践型人才培养模式为目标，设计新的综合实验项目，培养学生应用膜技术解决环境、化工领域中相关问题的能力，为今后从事相关领域的工作奠定了基础。
1. 实验目的与原理
1.1 实验目的
通过纺丝液的制备、脱泡、中空纤维的成型、后处理以及性能检测等一系列实验过程，使学生充分了解相转化法制备中空纤维膜的工艺过程，掌握制备中空纤维膜的基本原理及实验操作技术，熟练实验室用中空纤维膜组件的制作方法以及水通量的测试方法。
该实验涉及材料学、化工分离、机械工程、环境工程等多个学科，重点掌握中空纤维膜制备过程中相平衡、相分离、相转化引发膜孔形成的过程，最终可完成对学生综合化学实践应用技能的训练和培养。
1.2 实验原理
中空纤维膜的制备方法有：湿法、干-湿法、熔融法和热致相法。本综合实验采用干-湿法，过程如下：首先将过滤后的由聚合物、溶剂和致孔剂组成的铸膜液用计量泵从釜中料液抽出，从环行喷丝头（常用喷丝头的断面结构如图1所示）的缝隙中挤出，同时将芯液注入喷丝头插入管中，经过一段空气浴后，铸膜液浸入凝固浴中发生双扩散：铸膜液中的溶剂向凝固浴扩散以及凝固浴中的凝固剂（非溶剂）向铸膜液中的细流扩散。膜的内侧和外侧同时发生凝胶化过程，首先形成皮层，随着双扩散的进一步进行，铸膜液内部的组成不断变化，当达到临界浓度时，膜完全固化从凝固浴中沉析出来，将膜中溶剂和成孔剂萃取出，最终得到中空纤维膜。
图1 喷丝头断面结构示意图
（a）插入管式；（b）插入柱式；（c）异形喷丝板
2. 化学试剂与仪器
试剂：聚偏氟乙烯（PVDF）；聚乙二醇（相对分子质量400和6000）；N-甲基吡咯烷酮；甘油（工业级）。
仪器：中空纤维膜纺丝机一台（包括如下附件：计量泵为1.2ml/r，喷丝头，氮气钢瓶等）、膜通量测试装置、紫外-可见分光光度计、电动搅拌器、电加热套、三口烧瓶、玻璃棒、烧杯、量筒。
3.实验步骤
3.1 聚偏氟乙烯中空纤维膜的制备
将适量的聚偏氟乙烯树脂和大分子亲水性添加剂于105℃下经过真空干燥20h，然后移入三口烧瓶，加入溶剂NMP和致孔剂PEG，在70℃下充分搅拌24h，随后静置脱泡24h。将纺丝液移入纺丝设备。控制纺丝罐的压力、芯液的流量、凝固浴的温度、空气间隙的距离，过滤器和喷丝板的温度、卷绕速率等参数进行纺丝。实验完成后，将聚醚砜膜丝妥善保存，供后续分析和检测。
3.2 膜组件的封装
（1）剪取 4-5cm 的塑料管两根，用哥俩好胶将其一端粘在纸上，两根塑料 管的距离 10-15cm，晾干备用。
（2）取长度约 30cm 中空纤维膜 5-10 根，剪齐，在膜两端涂覆705硅橡胶进行封端，晾干后（约 6小时）在膜两端套上尼龙管（4-5cm）。
（3）组件浇铸：将膜组件专用树脂（两组份）在一次性纸杯中按一定比例混匀，倒入（1）中的塑料管中（充满塑料管体积的 2/3） ，然后将（2）中的尼龙管插入到塑料管中（注意：尼龙管不能插到底，膜要插到底；在操作的过程中尽量防止气泡的产生），等树脂完全固化后（约12 小时），进行修整（拨去塑料管，将膜长出尼龙管的部分割去），得到实验室用简易的膜组件，并检验膜组件是否漏。
3.3 水通量的测试
图2中空纤维膜测试装置
将PVDF中空纤维膜组件按照图2所示进行连接，进口压力恒定为 0.10MPa，经过膜分离，用量筒接取渗透液，记录一定时间内渗透过膜的水量，多余的水则回流到水槽中。测试三次，取其平均值，计算得到水通量。
3.4 截留率的测试
标准溶液的配制：牛血清白蛋白在105℃下真空干燥至恒重。精确称取牛血清白蛋白1.000g溶于1000mL容量瓶中，分别吸取牛血清白蛋白溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中加蒸馏水稀释至刻度，配制成溶度为20、40、60、80、100mg/L的牛血清白蛋白标准溶液。
标准曲线的制作：蛋白质对280nm的紫外线有最大吸收，蛋白质溶液280nm吸收值与其溶度成正比。将牛血清白蛋白标准溶液于波长280nm下，用1cm比色皿，在紫外分光光度计上测定光密度，蒸馏水为空白。以蛋白质浓度为横坐标，光密度为纵坐标作图，制出标准曲线。
牛血清白蛋白截留率的测定：将分子量为67000道尔顿的BSA用蒸馏水配置成1000mg/L的溶液，将待测PVDF中空纤维膜样品在0.1MPa下预压30min后，过滤1000mg/L的牛血清白蛋白溶液，然后用UV-2450型紫外分光光度计在280nm处测定透过液和原液的光密度，从标准曲线上查得相应的浓度，按如下公式计算截留率Ru：
其中：Ru-截留率；c1-原液中的BSA浓度（mg/L）；c2-透过液中的BSA浓度（mg/L）。
4. 实验的组织实施
在实验的过程中引入学生自主实验的教学方法：①将学生按学号分组；②教师在实验的前一周讲解综合实验的整体要求、实验达到的目标效果以及学生需要准备的工作；③各组通过查阅资料和文献，参考实验讲义，制定自己的实验方案；④实验前1～2天，教师对学生实验方案加以评阅，引导学生改进方案，指导学生拿出切实可行的方案后，即可进行实际操作；⑤鼓励学生采用不同的实验方案开展实验，实验完成后，组织学生讨论不同方案对实验结果的影响，并综合不同方案的实验结果撰写综合实验报告；⑥评阅实验报告，找出学生犯错之处并反馈给学生。
篇5
【关键词】 脑缺血
关键词: 脑缺血;DNA损伤;Klenow片段
1 材料和方法
1.1 材料 雄性4mo龄左右SD大鼠36只，体质量250～350g，本校实验动物中心提供;DNA聚合酶-I Klenow大片段、biotin-dATP，dGTP，dCTP，dTTP购自美国Gibco公司.
1.2 脑缺血模型 按文献［1］方法建立前脑缺血模型.
篇6
【关键词】黄精蜗牛胶囊；考马斯亮蓝法；分光光度法
蛋白质是一切生命的物质基础，是机体细胞的重要组成部分。蜗牛是陆地上最常见的软体动物之一，含有大量的蛋白质，具有很高的食用和药用价值。本公司研制的黄精蜗牛胶囊以蜗牛为主料，佐以黄精、党参等药材，产品可以调节机体代谢，增加人体免疫功能。
本文使用考马斯亮蓝法测定黄精蜗牛胶囊中蛋白质含量，以确定产品质量标准，控制产品质量。
实验方法：
1、仪器与试药
1.1仪器：紫外分光光度计，岛津UX-2450；
分析天平，FA2004，上海方瑞仪器有限公司
1.2试药：牛血清白蛋白标准品，中国药品生物制品检定所；
考马斯亮蓝G-250，国药集团化学试剂有限公司。
黄精蜗牛胶囊由上海新亚药业邗江有限公司提供。
2、试液配制
2.1蛋白标准溶液的制备
将牛血清白蛋白标准品溶于蒸馏水，配成浓度为100μg/ml的蛋白标准溶液，精密量取浓度为100μg/ml的蛋白标准溶液10ml、20ml、30ml、40ml加蒸馏水定容于50ml容量瓶，浓度分别为20、40、60、80μg/ml。
2.2考马斯亮蓝G-250溶液的制备
精确称取考马斯亮蓝G-250 100mg，溶于50ml90%的乙醇，加入85%（W/V）磷酸100ml，用蒸馏水定容于1000ml容量瓶，浓度为100μg/ml。
2.3供试品溶液的制备
精确称取2g供试品，充分溶于蒸馏水，滤过，用蒸馏水冲洗滤纸，合并滤液定容于100ml容量瓶；精密吸取2ml，定容于1000ml容量瓶，配成浓度为40μg/ml的供试品溶液。
3、蛋白标准曲线及回归方程
精密量取浓度为20、40、60、80、100μg/ml蛋白标准溶液0.5ml分别于5支10ml具塞试管，再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，放置5～10min，待其充分反应后，用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，对牛血清白蛋白溶液浓度和吸光度进行线性回归，建立回归方程。
用紫外分光光度计，在595nm处测定不同浓度蛋白标准溶液的吸光度。以蛋白溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，线性回归，绘制标准曲线，线性回归方程为：C=2.756+318.374*A，相关系数R=0.9983，表明蛋白标准溶液在20～100μg/ml范围内浓度与吸光度具有良好的正相关性。结果见表1。
4、供试品中蛋白含量的测定
精密量取供试品溶液0.5ml于10ml具塞试管，再加入2.5ml考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀后，放置5～10min充分反应，用紫外分光光度计于595nm处测定吸光度，代入回归方程计算浓度。结果如表2所示。
5、稳定性实验
取供试品溶液，按实验方法4中的方法，在60min内的，每隔10min测定一次供试品的吸光度值，观测其稳定性，在20min内，RSD=2.44%，在60min内，RSD=4.83%，皆
6、加样回收率实验结果
精密量取浓度为40μg/ml的供试品溶液0.25ml加入10ml具塞试管，分为三组，每组6个重复，再加入与供试品溶液相同体积的蛋白标准溶液，分别浓度为16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml。按实验方法4中方法，测定吸光度，代入回归方程，计算加样回收率。三组不同浓度的供试品加样回收率在100%～110%之间，平均值为106.57%，RSD=3.26%，表明用考马斯亮蓝法测定黄精蜗牛胶囊的蛋白含量结果较准确，方法可行，结果见表4。
7、讨论
考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，能与蛋白质通过范德华力相互作用形成蛋白质―考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，在595nm处有最大吸收，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质―考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。用此法测定蛋白质含量灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少。
本实验显示在加考马斯亮蓝溶液后10min～20min内完成测定样品的吸光度，数据稳定；实验结果表明用考马斯亮蓝法测定黄精蜗牛胶囊的蛋白质含量结果较准确，方法可行，可以有效控制产品质量。
参考文献
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篇7
【关键词】 IgA肾病;模型;血尿;免疫荧光;小鼠
Abstract: Objective To establish mouse model of IgA nephropathy in order to provide experiment basis for the clinical research of IgA nephropathy. Methods 30 Kunming mice were randomly assigned into the control group (n=10) and the model group (n=20). Mouse model of IgA nephropathy was established by the method of oral intake of bovine serum albumin (BSA) together with injection of staphylococcus enterotoxin B (SEB) via the caudal vein. At the end of the 12 weeks， fresh urine was gathered for the quantitative test of hematuria; blood was taken through orbital sinus after eyeball extirpation to determine the serum creatinine (Scr) and blood urea nitrogen (BUN); the changes of mesangial cells and matrix in the kidneys were observed by light microscopy; electron microscopy was employed to detect electron-dense deposits in the mesangial area; the expression of IgA deposition was measured by immunofluorescence staining in the mesangial area. Results By the end of 12 weeks， there were different degrees of hematuria in model group mice. BUN and Scr levels in model group were significantly higher than in the normal control group (P
Key words: IgA nephropathy; model; hematuria; immunofluoresence staining; mice
IgA肾病世界范围内广发的一种系膜增生型肾小球肾炎，占原发性肾小球疾病的10%～20%，中国、日本、新加坡等发病率较高，其中有20%～30%的患者进展到肾衰[1]。建立与人类临床病理生理相似的IgA肾病动物模型，对研究IgA肾病的发病机理、临床治疗等具有重要的作用。本实验采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素的方法制作IgA肾病小鼠模型，为进一步探索IgA肾病提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 昆明种小鼠30只，鼠龄(10-12)周，体重20～26 g，雄性，动物编号SCXK(苏)2005-0005，由徐州医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要实验试剂和设备 牛血清白蛋白(BSA，上海明睿生物有限公司，产品批号RF101-010);葡萄球菌肠毒素B(SEB，北京博迈世纪生物技术有限公司);兔抗小鼠IgA抗体(北京博奥森生物技术有限公司，抗体货号bs-0774R); 异硫氰酸荧光素(FITC)-标记的羊抗兔IgG(Millipore corporation); MicromHM340石蜡切片机;光学显微镜(日本Carton);日本Sysmex CA-1500自动生化分析仪;电镜(H-600)，切片机(LKBV型)。
1.2 实验方法
1.2.1 酸化水的制备 新鲜的双蒸水中加入盐酸，浓度为8.5 mmol/L。即1 000 ml双蒸水中加入10%盐酸3.2 ml。1%BSA酸化水的制备，1 g BSA加入100 ml酸化水。
1.2.2 造模方法 适应性喂养1周后，取新鲜尿液进行显微镜下尿红细胞检测，均为阴性，将30只小鼠随机分为正常对照组(10只)、模型组(20只)。正常对照组小鼠自由饮水与饮食;模型组小鼠除自由饮水和饮食外，前5周隔日予BSA(200 mg/kg)灌胃;第6周起予BSA(20 mg/kg，500 mg BSA溶于500 ml无菌生理盐水中)尾静脉注射，每天1次，连续3天;第8周起予SEB(0.5 mg/kg， 1 mg SEB溶于25 ml无菌生理盐水中)尾静脉注射，每周1次，连续3周，观察至第12周末。
1.2.3 IgA肾病小鼠模型的鉴定
1.2.3.1 血、尿液检测 第12周末留取小鼠新鲜尿液，行尿红细胞定性检测;经摘眼球取血(待测Scr，BUN)后，处死小鼠，留取右侧肾脏分别固定于10%甲醛及戊二醛中，行病理(光镜和电镜)及免疫荧光检查。
1.2.3.2 光镜检查 小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片，苏木精-伊红染色(H-E)，光镜下观察系膜区系膜细胞及基质有无增生。
1.2.3.3 电镜检查 取材，前固定，漂洗，后固定，漂洗，脱水，置换及浸透，包埋及聚合，修块及切片，染色，电镜观察。
1.2.3.4 免疫荧光 小鼠肾组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，5 μm切片依次经二甲苯Ⅰ 20 min，二甲苯Ⅱ 20 min，95%乙醇5 min，95%乙醇Ⅱ 5 min，双蒸水5 min×3次，3%H2O2 10 min，PBS 5 min×3次，抗原修复(微波炉中高火5 min，低火15 min)，自然冷却，PBS 5 min×3次，5%羊血清1 h，兔抗小鼠IgA(1∶100)，4℃过夜，PBS 5 min×3，FITC标记羊抗兔IgG(1∶100) 4℃过夜，PBS 5 min×3，甘油封片，荧光显微镜下观察摄像。
免疫荧光半定量标准:
半定量标准参照目前国内通用的5级法(±～++++)分级:±：低倍镜下不能显示;+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见;++:低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见;+++：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼;++++: 高倍镜下刺眼。
1.3 统计学处理 全部数据采用SPSS 13.0医学统计软件进行处理，计数资料用±s差表示，采用两独立样本t检验;等级资料用两独立样本非参数检验。P
2 结 果
2.1 一般情况 造模过程中，正常对照组小鼠无死亡，模型组小鼠先后死亡3只，分析原因可能是灌胃器误插入气管，或插入过深导致小鼠食管及胃黏膜损伤。尾静脉注射SEB后，小鼠出现倦怠、少吃﹑少动等现象，2 h后恢复正常。
2.2 血、尿指标检测 12周末，采集新鲜尿液光镜下尿红细胞计数。结果显示模型组小鼠明显高于正常对照组(P
2.3 镜下结构改变
2.3.1 光镜 模型组小鼠肾组织主要表现为肾小球毛细血管襻扩张，系膜细胞及基质明显增生，毛细血管腔部分闭锁，部分小管扩张;光镜下正常对照组小鼠肾小球，肾小管，及间质组织形态结构未见异常，系膜细胞及细胞基质未见增多(图1)。图1 12周末，各组小鼠光镜下肾组织病理变化的比较(H-E染色，×400)
A.模型组，肾小球系膜细胞及基质增生，毛细血管腔部分闭锁，部分小管扩张;B.正常对照组，肾小球系膜细胞及基质未见增生，毛细血管开放良好
2.3.2 电镜 模型组小鼠肾小球系膜区有大量电子致密物沉积，而正常组小鼠肾小球系膜区无或有少量的电子致密物沉积(图2)。图2 12周末，各组小鼠电镜下肾组织病理变化的比较(×10 000)
A.模型组，系膜区大量的电子致密物沉积;B.正常对照组，系膜区无电子致密物沉积
2.4 免疫荧光检测 12周末，免疫荧光可以看到，系膜区IgA荧光强度大多为+++～++++，而正常组系膜区IgA荧光强度为±～+，差异有统计学意义(表3、图3)。表3 2组小鼠肾脏系膜区IgA荧光半定量比较
3 讨 论
自Rifai等于1979年首次用BALB/c小鼠成功制作IgA肾病模型以来，许多学者基于IgA肾病已知的发病机制成功复制了许多IgA肾病模型[2-6]。主要包括:免疫诱导型、继发病变型、自发病变型。但由于存在种种问题，与人的IgA肾病病理变化差距很大，模型建立的滞后导致对IgA肾病的研究较少，对IgA肾病的治疗未获得新的手段。
国内常用的IgA肾病为异种蛋白所诱导的免疫诱导型，即口服牛血清白蛋白(BSA)联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素(SEB)。由于部分患者对某些上呼吸道病原体、肠道菌群、食物抗原有较高的血清抗体滴度， 认为黏膜免疫在发病中起到一定作用[7]。故口服免疫原如BSA及静脉注射葡萄球菌、大肠杆菌、呼吸道病毒等病原微生物成分或免疫复合物常用于诱导主动性IgA 肾病模型。BSA口服免疫可使机体IgA抗体的产生，SEB的具体机制目前还不十分明确，大多数认为SEB还可破环肝脏网状内皮系统，引起IgA清除不完全，进而引起免疫复合物在系膜区的沉积。17只模型小鼠荧光证实全部有IgA沉积;光镜下肾小球系膜细胞和系膜基质增生;电镜下肾小球系膜区可见大量的高电子密度的致密物沉积;临床的尿、血检测随着肾脏病理变化的加重而逐渐加重，且与正常组比较差异有统计学意义，说明造模成功。此方法操作简单，重复性好，成功率高，应该是目前理想的、有研究价值的动物模型，能为进一步研究IgA肾病的发病机制及治疗提供基础平台。
参考文献
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篇8
关键词：紫苏（Perilla frutescens）；碱溶酸沉法；蛋白质提取工艺
中图分类号：TQ936.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3951-03
紫苏（Perilla frutescens）是一种独特的油料保健作物，含油率一般为30%～51%，粗蛋白含量约为20%～23%，主要用于榨取紫苏油[1]。随着紫苏的大面积种植和紫苏产品的开发利用，人们对紫苏的研究范围越来越广泛。目前对紫苏成分的研究主要集中在紫苏氨基酸组成、药理作用、产品的开发利用等方面，而对于紫苏蛋白质分离提取的研究却少有报道，紫苏中含有大量的蛋白质却未被好好地加以利用。紫苏中的氨基酸组成比较全面，种类达18种，除含硫氨基酸（蛋氨酸、胱氨酸）偏低外，其他氨基酸组成与其他植物没有差别[2，3]。紫苏作为一种新兴的植物蛋白质资源，研究其提取工艺是有效开发利用紫苏蛋白质的前提条件。试验以用石油醚脱脂后的紫苏叶以及茎为原料，采用单因素试验和正交试验研究紫苏蛋白质提取的最佳提取工艺条件，充分利用了紫苏中的蛋白质，为进一步开发利用紫苏资源提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料与试剂 紫苏由中华大药房提供，蛋白质含量为27.8%。牛血清白蛋白（BSA），95%的乙醇，85%的磷酸，考马斯亮蓝溶液，石油醚（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）、浓盐酸等（分析纯）。
1.1.2 仪器与设备 PHS-3C型数显酸度计、TDL-40B台式离心机、22型可见光分光光度计、SHZ-D（Ⅲ）循环式真空泵、TDA温度控制仪（恒温水浴锅）、电热恒温干燥箱、FA2104S电子分析天平、容量瓶等。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制 以牛血清白蛋白（BSA）为标准蛋白质绘制标准曲线[4]。标准蛋白质溶液：称取0.25 g牛血清白蛋白溶于25 mL去离子水中，即为10 mg/mL的原液。考马斯亮蓝G-250试剂：称取100 mg考马斯亮蓝G-250试剂，溶于50 mL 95%的乙醇中，加入85%的磷酸100 mL，最后用去离子水定容到1 000 mL。取7支试管，使蛋白质浓度分别为0、1、2、4、6、8、10 mg/mL，向每支试管中加入5 mL考马斯亮蓝溶液，静置2 min后测定各组蛋白质溶液的吸光度，并记录数据。
1.2.2 紫苏叶分离蛋白的制取工艺 干紫苏叶低温冷冻研磨加石油醚脱脂滤渣自然风干加碱浸提过滤、离心蛋白质提取液酸沉水洗中和沉淀干燥粗蛋白[5]。
1.2.3 蛋白质提取率的计算 蛋白质提取率=分离的蛋白质的质量/原料的质量×100%。
1.2.4 超声波对紫苏蛋白质提取率的影响 在最佳工艺条件下，将装有溶液的小烧杯放在100 W、50 ℃下超声波清洗器中振荡提取30 min，确定超声波对紫苏蛋白质提取率的影响。
1.2.5 单因素试验 ①碱提pH对紫苏蛋白质提取率的影响。准确称取1 g脱脂紫苏叶，按1∶15（m/V，g∶mL）的料液比分别加入pH 7.0、8.0、9.0、10.0的氢氧化钠溶液，在50 ℃条件下搅拌浸提30 min，后将溶液进行抽滤得滤液，将滤液用1 mol/L的HCl溶液沉淀静置30 min，再离心得粗蛋白，烘干后再称量，考察最佳碱提pH对蛋白质提取率的影响。②料液比对紫苏蛋白质提取率的影响。准确称取1 g脱脂紫苏叶，分别按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（m/V，g∶mL，下同）的料液比加入pH 9.0的氢氧化钠溶液，在50 ℃条件下制备粗蛋白，获得料液比对蛋白质提取率的影响。③碱提温度对紫苏蛋白质提取率的影响。准确称取1 g脱脂紫苏叶，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氢氧化钠溶液，分别在碱提温度为30、40、50、60 ℃的条件下制备粗蛋白，研究碱提温度对蛋白质提取率的影响。④酸沉pH对紫苏蛋白质提取率的影响。准确称取1 g脱脂紫苏叶，按1∶15的料液比加入pH 9.0的氢氧化钠溶液，在50 ℃条件下搅拌浸提30 min，在pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0的条件下制备粗蛋白，研究酸沉pH对蛋白质提取率的影响。
1.2.6 正交试验 在上述单因素试验的基础上进行四因素三水平正交试验，以溶液中蛋白质提取率作为衡量指标，研究采用碱溶酸沉法提取紫苏蛋白质的最佳工艺条件，因素与水平见表1。
2 结果与分析
2.1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
试验过程中在波长为595 nm下测得蛋白质浓度与吸光度的关系见表2。依此绘制牛血清白蛋白标准曲线（图1），得到标准方程为■=0.051 4x+0.055 9，r=0.990 4。
2.2 单因素试验结果
2.2.1 碱提pH对紫苏蛋白质提取率的影响 由图2可知，随着pH的增加，蛋白质提取率先增加。当溶液的pH为9.0时，紫苏叶分离蛋白质的提取率为16.23%，达到最大。此后再增加提取液的pH，蛋白质提取率降低。因此用碱溶酸沉法提取紫苏蛋白质的最佳碱提pH为9.0。
2.2.2 料液比对紫苏蛋白质提取率的影响 由图3可知，随着料液比的减小，蛋白质提取率先增加后降低。合适的料液比可降低体系的黏度、增大浓度梯度、加快传质过程，因而提取率高；但料液比过低，紫苏叶分离蛋白质的提取率并没有明显增加，反而会增加后处理的负担。因此用碱溶酸沉法提取紫苏蛋白质的最佳料液比为1∶15。
2.2.3 碱提温度对紫苏蛋白质提取率的影响 由图4可知，在一定的碱提温度范围内，随着碱提温度升高，紫苏蛋白质的提取率也随之升高，50 ℃时提取率最高，为16.22%，但是当碱提温度超过50 ℃，蛋白质的提取率反而下降。因为碱提温度越高，越有利于蛋白质的溶出，当碱提温度超过50 ℃，由于淀粉糊化作用反而会降低蛋白质的提取率；另外，碱提温度过高容易使蛋白质发生变性，影响最终产品的特性。因此用碱溶酸沉法提取紫苏蛋白质的最佳碱提温度为50 ℃。
2.2.4 酸沉pH对紫苏蛋白质提取率的影响 由图5可知，酸沉阶段紫苏蛋白质的提取率随pH的增加呈先增大后减小的趋势，在pH 5.0时提取率达到最大。蛋白质是两性电解质，在某一种pH的溶液中，它所带的正电荷数与负电荷数恰好相等，即净电荷数为零，此时蛋白质间静电荷排斥作用最低，蛋白质聚集、沉淀，溶解度最低，从溶液中析出。因此用碱溶酸沉法提取紫苏蛋白质的最佳酸沉pH为5.0。
2.3 正交试验结果
正交试验结果见表3。由表3可知，各因素对紫苏蛋白质提取率的影响主次为料液比>酸沉pH>碱提温度>碱提pH，即在碱提过程中料液比影响最大，其次为酸沉pH和碱提温度，碱提pH对提取率的影响最小。从试验结果来看，最优组合为A1B1C1D1。综合各因素的作用，得出适于本工艺的最佳浸提条件是碱提pH 8.0、碱提温度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0。在上述条件下蛋白质提取率可达到20.51%。
2.4 超声波对蛋白质提取率的影响
采用紫苏叶分离蛋白质的最佳提取工艺条件为碱提pH 8.0、碱提温度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在浸提过程中增加100 W的超声波振荡提取，做两组平行试验，紫苏叶分离蛋白质的提取率最高可达22.41%。超声波的“空化效应”增加了紫苏蛋白质的提取率；超声波引起溶剂的机械振动，可以加快热传递，使溶剂受热均匀，使溶质整体受热均匀，同时加快了溶质分散，也加快了溶解。
3 结论
影响紫苏中蛋白质提取率的因素的影响程度由大到小依次是料液比、酸沉pH、碱提温度、碱提pH。其中碱提温度、料液比和酸沉pH对蛋白质提取率影响显著，碱提pH对紫苏叶中蛋白质的提取率影响不显著。紫苏叶蛋白质的最佳提取条件是碱提pH 8.0、碱提温度40 ℃、料液比1∶10、酸沉pH 4.0，在此条件下蛋白质提取率可达到20.51%。在提取过程中添加100 W的超声波处理会明显增加蛋白质的提取率，此条件下紫苏蛋白质的提取率可达到22.41%。
参考文献：
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篇9
[关键词]脱氧土大黄苷；人血清白蛋白；光谱实验；分子模拟
血清白蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子等重要生理功能[1]。血清白蛋白相对分子质量较小，溶解性较大、稳定性较好、与配体具有较好的亲和性，易于分离、提纯且其三级结构已知，是理想的模型蛋白质分子。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）[2]为585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸全序列含有35个半胱氨酸残基，形成17对二硫键和一个自由的半胱氨酸残基，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是单个二硫键。HSA含有18个酪氨酸残基，在214位上含有一个色氨酸残基，N端为天冬氨酸残基，C端为亮氨酸残基。分析生理条件下药物与HSA的相互作用可以获得药物的药效学信息，深入阐明药物输送机制，也有助于为药物分析提供理论参考，此是具有意义的工作。
脱氧土大黄苷（desoxyrhaponticin，DES），分子式为C21H24O8，是天山大黄的有效成分之一，具有降血脂、降血糖、抗肿瘤、调节机体免疫系统、抗血栓和抗氧化等作用[3]。当前，脱氧土大黄苷与人血清白蛋白的相互作用研究未见文献报道。本文基于光谱法结合分子模拟技术研究了DES结合HSA的相互作用，获得了结合反应常数、热力学函数等并考察了药物对蛋白质构象的影响，从分子水平上阐释DES与HSA的相互作用机制。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 人血清白蛋白（HSA， ≥98%）、脱氧土大黄苷（DES， ≥98%）、三羟甲基氨基甲烷 （Tris， GR）均购于上海华美生物工程公司；其他试剂均为分析纯试剂，实验用水为亚沸蒸馏去离子水。配制浓度为0.1 mol・L-1，pH 7.4的Tris-HCl缓冲溶液（内含0.10 mol・L-1NaCl维持离子强度），用此缓冲溶液配制1.0×10-5 mol・L-1的HSA，乙醇溶液配制1.0×10-3 mol・L-1 DES溶液。
F-4500型荧光光度计（日本Hitachi公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；ZD-2型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；SGI O2计算机图形工作站，DOCK软件（4.02版本）。
1.2 分子模拟 利用SGI O2工作站上的DOCK 4.02程序包建立药物与蛋白质相互作用模型，进行分子模拟计算。HSA晶体结构的PDB代码：1h9z。ChemDraw工具构建DES分子结构，然后基于分子力学MM2力场优化后生成实验分子模型，分子对接预处理时使用AutoDock Toolkit（ADT）进行受体与配体的优化处理。分子对接技术确认HSA活性部位，选择配体为中心的10范围为对接的活性中心。确定活性部位步骤：①确定DES结合活性位点；②在配体结合位点填充球簇以映射受体结合腔穴的性质；③尝试匹配不同小球中心的距离和配体中不同原子的距离，进行配体在受体活性位点处的构象搜索；④以经验势能函数作为评价函数，找到配体与受体的最佳结合方式[4]。程序的打分函数选择程序默认的输入和退火参数。针对建立的HSA-DES分子对接体系进行re-dock验证，去除DES后重新对接生成新的HSA-RWF（R-warfine）分子对接体系并比对PDB库数据中原对接体系以确证可靠性。
1.3 方法 HSA与DES溶液的荧光光谱及DES溶液的吸收光谱测定：移取2.5 mL HSA溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器逐次加入1.0×10-3 mol・L-1DES溶液进行荧光滴定（滴定剂累加体积≤100 μL），缓冲溶液做荧光空白校正，荧光发射与激发狭缝宽度均为2.5 nm，波长扫速1 200 nm・min-1，固定激发波长282 nm，室温下绘制250～900 nm的发射谱；荧光光谱仪扫描激发波长和发射波长之间的波长差分别为Δλ 15 nm和Δλ 60 nm上述溶液体系的同步荧光光谱。发射与激发狭缝宽度同上，扫速240 nm・min-1，Tris-HCl缓冲溶液做荧光空白校正。移取2.5 mL Tris-HCl缓冲溶液于1 cm石英比色皿中，微量进样器加入1.0×10-3 mol・L-1 DES溶液，使其浓度为1.0×10-5 mol・L-1，测定500～190 nm紫外吸收光谱，中速扫描，狭缝宽度2.5 nm，缓冲溶液定基线。
1.4 理论基础 蛋白质-药物相互作用的荧光猝灭机制：蛋白质-药物相互作用的动态荧光猝灭过程遵循Stern-Volmer方程[5]。
F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]（1）
式中：Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ0为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命，[D]为猝灭剂（DES）的浓度，Ksv为Stern-Volmer猝灭常数。
蛋白质-药物相互作用的理论方程：药物-蛋白质相互作用采用方程（2）获得相应的结合参数[6]。
lg[（F0-F）/F]=lgK+nlg[Df]（2）
F0与F分别为猝灭剂加入前后荧光分子的相对强度，K是结合常数，n是结合位点数，[Df]为猝灭剂的游离浓度。
Fōrster非辐射能量转移理论：Fōrster非辐射能量转移理论[7]求算药物-蛋白质能量转移效率E，结合距离r及临界能量转移距离R0方程如下。
E=R06/（R06+r6）（3）
E为能量转移效率；R0为能量转移效率E为50%时的临界能量距离。
R06=8.8×10-25K2N-4ΦJ（4）
式中：K2为偶极空间取向因子；N为介质的折射指数；Φ为蛋白质分子的光量子效率；J为蛋白质分子荧光发射光谱与药物吸收光谱间的光谱重叠积分。
2 结果与讨论
2.1 分子模拟结果 分子对接模拟计算时，考虑HSA的Sudlow′s sites I，sites II[9]，6个脂肪酸结合位点及warfarin结合位点进行DES分子对接的模拟计算，分子对接通过参数的对比来寻找药物分子的最优结合位点与模式。分子对接DES与HSA的结合模型见图1 （显示配体周围10.0范围内的氨基酸残基）。DES分子结合在HSA的表面活性口袋处，整个分子处于被包围状态。DES分子距HSA色氨酸残基（Trp214）及苯丙氨酸残基（Phe206，Phe211，Phe330）很近，这很好解释了DES能够猝灭HSA内源荧光的现象。同时，DES分子与HSA结合过程中，DES分子中苯环上羟基的氧原子与Leu481发生氢键相互作用，且DES环氧环上23号位和25号位羟基的氧原子分别与Lys199，Ser202发生氢键相互作用；另一方面，DES非共价结合在HSA活性位点域，其结合口袋周围主要由Leu198，Leu203，Leu327，Leu331，Leu347，Leu349，Leu481，Ala201，Ala210，Ala213，Ala215，Phe206，Phe211，Phe330，Trp214，Val343，Val344，Val482氨基酸残基形成一个疏水区域，可以清楚观察到DES结合位点处的疏水相互作用，即疏水作用在DES-HSA复合物形成中起重要作用，疏水作用是药物和蛋白质分子结合的主要驱动力。分子模拟结果进行re-dock验证，发现AutoDock对此体系可靠。
由分子模拟结果可知DES与HSA的主要作用力为疏水作用力，兼有氢键的存在，为验证DES与HSA的键合机制和键合方式，通过光谱实验进一步证实分子模拟的合理性。
2.2 HSA与DES相互作用的荧光光谱及结合反应机制 HAS，DES及二者以等物质的量混合体系的荧光光谱见图2。在282 nm激发波长下，DES的最大发射波长为 393 nm左右，HSA最大发射波长为339 nm，而由DES-HSA体系的荧光光谱可以看出，药物的加入使HSA的荧光强度降低，表明药物与HSA之间存在着相互作用，发生了能量转移。
DES-HSA的紫外吸收差谱见图3，可以发现HSA的紫外吸收曲线及DES-HSA等摩尔混合物与DES的差谱几乎完全重合，表明DES的加入并未使HSA的紫外吸收发生变化，可以初步确定DES与HSA分子的荧光猝灭机制为动态猝灭。同时由图3可见，DES在282 nm激发波长及339 nm发射波长下没有吸收，因此，可不考虑内滤光效应。
分析图4可知，a峰为HSA的一级荧光峰，可以看出随着药物的加入，a峰逐渐降低；b峰为DES的一级荧光发射峰；c峰为激发峰的二级倍频荧光峰；d峰为HSA的二级倍频荧光峰。固定HSA浓度，随着药物浓度增大，HSA的荧光强度呈规律性的降低，这表明药物对血清白蛋白有猝灭作用。荧光最大发射峰位置出现20 nm的红移（A，B两图均如此），说明DES和HSA确实存在相互作用，造成HSA分子中与DES相互作用的氨基酸残基的微区环境发生一定变化。
为确定药物对蛋白质荧光的猝灭机制，由实验测得DES与HSA相互作用的荧光光谱数据，按方程（1）处理可得图5。
由于无猝灭剂时生物大分子的平均荧光寿命τ0=1×10-8 s[10]，则由实验数据可以通过Stern-Volmer方程计算不同温度下DES-HSA相互作用的猝灭常数Ksv，Kq，计算结果见表1。
目前生物大分子与活性小分子相互作用研究中，常用2种方法判定荧光猝灭机制，一种方法是比较双分子猝灭过程速率常数与猝灭剂对生物大分子最大扩散碰撞猝灭速率常数来间接判断[11]；另一种方法是通过变温实验直接推断[12]。本实验为确定DES对HSA的猝灭机制，在不同温度下作DES对HSA荧光猝灭的Stern-Volmer图见图5。从图5可见，在选定的浓度范围内，随着温度升高，猝灭常数呈增大趋势，初步表明DES对HSA的猝灭机制为动态猝灭。另外，判断静态猝灭和动态猝灭的另一个方法是考察荧光物质的吸收光谱。静态猝灭中，基态配合物的形成会引起荧光物质的吸收光谱不断变化，而动态猝灭仅仅影响荧光物质的激发态，不影响荧光物质的吸收光谱，据此可判断该体系是否属于动态猝灭[13]。考察DES-HSA体系的吸收光谱（图3），发现HSA的紫外吸收谱和DES-HSA混合物的紫外吸收谱与DES紫外吸收差谱几乎完全重合，表明药物的加入并未使HSA的紫外吸收发生变化，由此2个结果可以确定DES与HSA的荧光猝灭机制为动态猝灭。
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Molecular action mechanism of desoxyrhaponticin and serum albumin
characterized by spectroscopy combined with molecular modelling
GUO Ming*， FAN Wen-xiang， HU Run-huai
（School of Science， Zhejiang Agriculture & Forestry University， Lin′an 311300， China）
[Abstract] Objective： To study the molecular action mechanism of active constituents desoxyrhaponticin （DES） and human serum albumin （HSA）. Method： Under the simulated physiological condition， computer analog technology， fluorescent spectrometry and ultraviolet spectrum were combined to study the binding mechanism between drug and protein. Result： Molecular modeling was adopted to establish the binding model between DES and HSA， suggesting that the interaction force maintaining drug and protein is mainly the hydrophobic interaction with a hydrogen-bond interaction. The results from spectroscopy indicated that the interaction between DES and HSA is a dynamic binding process with a high intensity. The value of the binding distance （r） between DES and HSA was low， which demonstrate the occurrence of energy transfer. DES made an impact on HSA′ structural domain microcell conformation， which resulted in hydrophobic changes in binding areas. According to the fluorescent phase diagram technical analysis， the changes in the DES-HSA reaction conformational pattern showed a "two-state" model. According to the obtained thermodynamic parameters for the DES-HSA interaction， the interactional force between DES and HSA was mainly a hydrophobic interaction. The fluorescence polarization proved that a non-covalent compound was generated during the interaction between DES and HSA. Conclusion： The spectrum experiment showed consistent results with the computer analog technology， which could provided certain reference for studies on the interaction between DES and HSA.
篇10
【关键词】 小牛血清去蛋白注射液； 神经节苷脂； 新生儿缺氧缺血性脑病
Clinical Therapeutic Effect of Deproteinised Calf Blood Injection and Ganglioside in Treatment of Neonatal Hypoxic Ischemicencephalopathy/CAI Li-jun.//Medical Innovation of China，2013，10（14）：003-005
【Abstract】 Objective：To compare the therapeutic effect of deproteinised calf blood injection and ganglioside in the treatment of neonatal hypoxic ischemic encephalopathy （NHIE）.Method：90 cases of NHIE newborns were divided randomly into three groups：the C group was treated routinely with only support， sedation and lowering intracranial pressure.The A group was treaded additionally with ganglioside and support sedation and lowering intracranial pressure.The B group was treated additionally with deproteinised calf blood injection and support sedation and lowering intracranial pressure. Objective NBNA and statistics treat.Result：The effect of the A and B group was significantly better than that of the C group （P0.05） between A group and B group.Conclusion：Both of deproteinised calf blood injection and ganglioside had good therapeutic effect on NHIE； and The therapeutic effect of deproteinised calf blood injection and ganglioside are equal.
【Key words】 Deproteinised calf blood injection； Ganglioside； Hypoxic ischemic encephalopathy
First-author’s address： Shizhongqu People’s Hospital， Zaozhuang 277100， China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2013.14.002
新生儿缺氧缺血性脑病是由于产前、产时或产后的各种缺氧缺血原因导致的脑损伤，部分留有一定的后遗症，是新生儿致残的主要原因之一[1]。经过多年来的实践发现神经节苷脂对HIE的疗效肯定，广大同仁已达成共识，但其价格昂贵，广大农民经济承受能力有限，因此寻找疗效好、价格低廉的脑细胞营养药物实有必要。本科2008年10月-2012年10月应用小牛血清去蛋白注射液（锦州奥鸿药业有限责任公司）或单唾液酸四己糖神经节苷脂（黑龙江哈尔滨医大药业有限公司）治疗新生儿缺氧缺血性脑病，对比其疗效，发现两种药物疗效相当。现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 病例选择标准：根据中华儿科学会新生儿学组1996年10月制订的《新生儿缺氧缺血性脑病诊断依据和临床分度》[2]，选择本科及协作科室2008年10月-2012年10月收治的新生儿缺氧缺血脑病患儿90例，其中男51例，女39例，年龄30 min～7 d，其中小于胎龄儿7例，2.5～4.0 kg
之间的43例，巨大儿17例；均有宫内窘迫及产时窒息史，生后均有不同程度的脑损害症状，出现异常神经精神症状，包括意识障碍、抽搐、肌张力改变及原始反射异常，呼吸不规则或暂停，不吃、不哭、不动、喷射性呕吐等。90例均行头颅CT或头颅MRI扫描检查：轻度HIE 66例， 中-重度24例。其中合并颅内出血13例（蛛网膜下腔出血9例， 脑室出血4例）。早产儿除外。均排除先天畸形和产伤引起的颅内出血。把上述90例患儿按简单随机抽样法分为神经节苷脂组（A组）、小牛血清去蛋白注射液组（B组）、对照组（C组）。其中A、B、C三组轻度HIE病例 均为22例，中-重度病例均为8例；其病情及一般情况比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
表1 三组病情比较 例
组别 抽搐 意识障碍 呼吸节律改变 肌张力改变
A组（n=30） 6 7 5 30
B组（n=30） 7 6 6 30
C组（n=30） 6 7 6 30
1.2 治疗方法 三组均采用新生儿缺氧缺血脑病的综合治疗方案，主要包括：（1）控制脑水肿，入院后3 d内严格限制液体的入量50～60 ml/（kg・d），同时给呋塞米0.5～1 mg/kg，地塞米松0.2～0.5 mg/kg，甘露醇0.25～0.5 g/（kg・次），每6小时一次或每8小时一次，合并颅内出血者给予白蛋白1 g/kg。（2）控制惊厥：苯巴比妥钠静注或水合氯醛保留灌肠。（3）维持内环境的稳定，包括血气和pH稳定，维持重要组织器官的血液灌注，维持电解质及血糖在正常范围内，及时纠正酸中毒。于生后48 h后A组给予神经节苷脂20 mg/d加入5%葡萄糖注射液20 ml静脉点滴，1次/d；B组予小牛血清去蛋白注射液5 ml加入5%葡萄糖注射液20ml静脉点滴，1次/d；C组仅给予常规综合治疗。10～14 d为1个疗程。
1.3 疗效判断 所有患儿均采用新生儿神经行为测定评分，分别于用药前、3 d、7 d按照20项新生儿行为评分法（NBNA评分）进行检查（从睡眠开始，10 min结束）。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行统计处理，计量资料比较采用u检验，P
2 结果
各组治疗前、3 d、7 d的神经行为测定评分见表2。
结果显示：（1）治疗前C组与B组NBNA评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗3 d、7 d，两组轻度病例NBNA评分比较差异有统计学意义（P0.05）；（2）治疗前C组与A组NBNA评分比较差异无统计学意义（P>0.05）；治疗3 d、7 d，两组轻度病例NBNA评分比较差异有统计学意义（P0.05），说明两者对新生儿缺氧缺血性脑病治疗均有效。
3 讨论
新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）系因脐带异常、妊娠期高血压疾病、胎盘异常、生后窒息等产前、产时原因，导致脑组织损伤而出现的综合征，常表现为兴奋激惹，如尖叫、呕吐、抽搐等，转为抑制甚至昏迷；有的表现为吸吮、吞咽和舌运动障碍；或不自主嘴嚼、呵欠等不典型症状[3]。其机理主要由缺氧缺血损害与再灌注损伤等共同引起：缺血缺氧期，脑组织含氧量减少；再灌注恢复脑组织氧供应，使氧自由基在短时间内爆发性增多，氧自由基与各种细胞成分发生反应，造成脑细胞结构损伤和功能代谢障碍。
小牛血清去蛋白注射液具有保护大脑神经、减轻脑缺氧再灌注损伤、改善脑供氧和能量供应、清除自由基、促进神经细胞修复等作用[4]。其作用机制有以下几点：（1）小牛血清去蛋白注射液能够提高缺氧诱导神经细胞活力，小牛血清去蛋白注射液主要成分为磷酸肌醇寡糖（IPOS）和小分子激活肽。药理研究表明：小分子激活肽是神经细胞蛋白质合成的主要成分，通过激活细胞代谢S6激活酶的活性，促进缺氧状态下神经细胞的修复和再生[5]。（2）另外一个成分磷酸肌醇寡糖能够激活葡萄糖载体，从而促进葡萄糖向细胞内转运，并且通过特殊的IPOS载体使得IPOS也可以进入细胞内，纠正能量代谢障碍；可以增加线粒体的呼吸能力和高能磷酸的合成，从而促进细胞对氧的利用，促进能量物质ATP的生成[5]。保护神经元正常的生理功能。同时它能使神经细胞由无氧代谢糖酵解的代谢途径转变为糖有氧氧化的途径，纠正缺血神经细胞的酸中毒，增强脑代谢的储备能力，延长细胞的生存时间。（3）小牛血清去蛋白还可以减轻脑缺血后再灌注损伤。其机制为通过抑制一氧化氮合成酶的活性，从而降低NO的过多形成，进而延迟脑缺血后的细胞毒性水肿，延缓脑缺血损伤的进程[6]。有试验表明：小牛血清去蛋白能够显著减少大脑皮层含水量，使氧自由基破坏反应的产物丙二醛显著减少[7]，说明小牛血清去蛋白注射液不仅能够使缺氧状态下神经细胞的修复和再生，纠正缺血神经细胞的酸中毒，增强脑代谢的储备能力，延长细胞的生存时间；而且能够减少氧自由基的生成，延缓脑缺血损伤的进程，对缺氧缺血性脑病有确切的治疗作用。
而神经节苷脂作为神经损伤修复药，机理为：可以保护细胞膜完整性，稳定各种酶的活性；防止细胞凋亡，维持细胞内外离子平衡、防止细胞内钙积聚，增强抗氧化酶的活性，降低脂质过氧化反应，消除自由基对细胞膜的损害等[8]。可促进由于各种原因引起的中枢神经系统损伤后神经功能的再生及修复，从而达到治疗目的。其对缺氧缺血性脑病的治疗作用已被广大同仁认可。
总之，本研究表明，小牛血清去蛋白注射液与神经节苷脂对轻度缺氧缺血性脑病均有治疗作用，与有关文献报道相符；而两者对中-重度HIE疗效均较差，差异无统计学意义，而价格低廉小牛血清去蛋白注射液对应用神经节苷脂过敏、或在广大基层更有优势，具有更高的性价比，易为广大家长接受。经1～3年的随访，4例死亡、6例失访，轻度HIE患儿中未发现有明显后遗症；中度HIE患儿中仅2例遗留有脑瘫，存活重度HIE小儿中4例留有不同程度的后遗症如癫痫、脑瘫、多动症等。因而继续寻找更有效药物，提高患儿的生活质量、降低致残率仍是广大同仁的共同目标。
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