蛋白酶抑制剂范文

导语：如何才能写好一篇蛋白酶抑制剂，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

 

关键词：  胰蛋白酶抑制剂； 鱼腥草； 分离纯化

   

胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor ,TI)除了在临床上用来治疗急性胰腺炎、肺气肿、脑水肿和脑缺血外，目前还发现它在HIV和肿瘤的治疗中也有重要意义［1］。化学合成的TI生物利用度低、副作用大以及产生耐药性等缺点，植物来源的TI具有兼容性好、安全和特殊的药物特性等优点。因此，从传统中药中筛选具有TI有活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一。本文在前期研究的基础上，对鱼腥草中TI进行了分离纯化，获得的结果对开发植物来源的TI具有重要意义。

1  材料与仪器

1.1   试剂胰蛋白酶(北京麒麟宏伟公司) ，苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(上海三杰生物技术有限公司)，DEAE-纤维素(Sigma)，三-羟甲基-氨基甲烷，无水氯化钙，盐酸，三氯乙酸，氢氧化钠等为国产分析纯。

1.2  仪器可见光分光光度计，高速冰冻离心机，精密pH 计，数显恒温水浴锅，精密电子天平，蛋白质电泳仪等。

2  方法

2.1  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂抑制率的测定参考杜旭东等［2，3］的苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺(BAPNA)法。

2.2  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的分离与纯化参考康庄等［4］的方法进行。

3  结果

3.1  硫酸铵分级沉淀按照硫酸铵沉淀表，对样品浸提液添加硫酸铵至30％，45％，60％，75％饱和浓度，分别测定各浓度下的体积、抑制活性和蛋白浓度。pH值为6.0的样品浸提液实验结果见表1，pH值为8.0的样品浸提液实验结果见表2。表1  pH 6.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）表2  pH 8.0条件下硫酸铵分级沉淀TI的结果（略）

    

从图1可以看出，两种不同pH体系活性析出均集中于30％～75％饱和度，但45％～60％饱和度下比活力最高，且pH 8.0体系时比活力大。因此，在以后的纯化过程中，均采用pH 8.0溶液体系对样品液进行硫酸铵分级沉淀，加(NH4)2SO4至40％饱和度，以除去碱性或中性杂蛋白。再加(NH4)2SO4至60％饱和度，收集沉淀，溶解透析供下步离子交换层析用。抑制剂的析出在pH 6.0体系比pH 8.0体系要早，这说明抑制剂可能是一种酸性蛋白。

3.2  DEAE-52离子交换分离纯化取pH 8.0 Tris-HCl缓冲液透析后的粗提液5 ml，上DEAE-52离子交换柱(ф 2.5 cm×15 cm),流速为0.75 ml/min，以50 ml缓冲液洗脱,使样品液压实，再分别用由缓冲液配制的60～400 mmol NaCl溶液进行梯度洗脱，所得各管洗脱液(每管收集3 ml)在紫外光280 nm下测其吸光度，检测蛋白含量，其梯度洗脱曲线见图2。

由图3可知, 在55～70号试管具有HCTI活性，以60～63号活性最高。收集60号试管及附近活性较高的试管保存，进一步处理后进行HCTI相对分子量的测定。洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系见表3。表3  洗脱液的浓度梯度与试管号的对应关系（略）

3.3  鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的相对分子量的测定

DEAE-52离子交换柱分离纯化后HCTI液的活性峰经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图4。

由电泳图谱上测定的标准蛋白相对迁移率及其分子量，待测蛋白的迁移率为0.530。经计算机处理数据后，得回归方程：LogY=－1.355X+5.165 3 如图5所示，将待测的蛋白相对迁移率带入方程，计算出HCTI的分子量约为28 kDa。

4  讨论

   

本实验在粗提过程中采用分级盐析法除掉了部分杂蛋白，分离过程中用到了DEAE-52离子交换层析法，并检测到活性峰。说明分级盐析发挥了一定作用，从而简化了分离纯化过程，测得HCTI分子量约为28 kDa。为该胰蛋白酶抑制剂的进一步深入研究奠定了一定的理论基础。

【参考文献】

 

［1］刘同祥,牛建昭,杜旭东,等.具有蛋白酶抑制剂活性成分中药的筛选［J］.中国中药杂志, 2007, 32 (7) :643.

［2］杜旭东,刘同祥,张宗申,等.正交实验法优选鱼腥草胰蛋白酶抑制剂的提取工艺［J］.时珍国医国药,2007,18(10):2337.

篇2

【关键词】 大豆胰蛋白酶抑制剂 人宫颈癌细胞 细胞增殖

Abstract: Objective To study the influence of soybean trypsin inhibitor (Trypsin inhibitor.SBTI) on the human hela cells' (Ishikawa) proliferation in vitro. Methods Hela cells were cultured in vitro and effects of SBTI on cell proliferation were measured by using methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. Results For 0.20～1.00 g/L SBTI concentration， with the increasing concentration of the drug and with the duration of the same concentration， the inhibition to cell proliferation was significantly strengthened. The characteristics of the apoptosis can be observed under the light microscope. Conclusions SBTI markedly inhibited hela cells' proliferation on dose- effect and time- effect relationship.

Key words:soybean trypsin inhibitor; the human hela cells; cell multiplication

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。患者年龄分布 呈双峰状，35～39岁和60～64岁，平均年龄52.5岁。宫颈癌不仅发病率居于首位，近年来发病年龄有提前的趋势，探寻一种经济有效的、非手术的、能够免除平常化疗药物副作用的方法可谓当务之急。大豆胰蛋白酶抑制剂是从大豆中提取的，是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。国内外已经有文献报道大豆胰蛋白酶抑制剂具有多种药理活性，其中包括抗炎，抗病毒，抗肿瘤等。现在人们在对结肠癌，前列腺癌，乳腺癌的研究已经证明大豆胰蛋白酶抑制剂有明显的抗肿瘤作用［1-3］。大豆胰蛋白酶抑制剂已经受到人们的关注，成为研究的热点。但是国内外关于大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌的研究报道较少。本实验以细胞培养为基础，对大豆胰蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用进行了初步研究，通过证明大豆胰蛋白酶抑制剂对宫颈癌细胞增殖的抑制作用，以期对临床用药和开发提供科学依据，积累实验资料，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品和试剂

大豆胰蛋白酶抑制剂为北京中医药大学细胞与生化实验室提取（浓度为98%）；RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青血清；胰蛋白酶和EDTA均购于Ameresco公司。四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司；HERAD—6345型二氧化碳培养箱(德国赫利氏公司)；IⅩ71倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）;FCANF129004酶标仪(澳大利亚TECAN公司)。

1.1.2 细胞株

人宫颈癌细胞株（Hela）由北京病毒学研究所惠赠。

1.1.3 培养液

RPMI1640全培养液（RPMI1640+10％胎牛血清+青链霉素100 U/mL及100 μg/mL）。

1.2 实验方法

1.2.1 肿瘤细胞培养

Hela细胞使用含有10%胎牛血清的RPMI1640全培养液，在设定为37.0 ℃、5%CO2 培养箱中培养。细胞可贴壁生长，待细胞生长贴满底壁的80%左右时传代。传代时移去旧的培养液，用PBS洗涤2 次，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合消化液消化，培养液重悬细胞于新培养液中，每瓶传代为2或3 瓶。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 MTT法测定细胞生长

将用上述方法培养得到的细胞消化，l 000 rpm离心10 min，计数，以2×105个/L密度接种于96孔培养板中，每孔100 μL，在37.0 ℃、5% CO2 培养箱培养24 h后，加入浓度分别为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L 的 SBTI (溶解在含10%胎牛血清的1640全培养液中)100 μL。每一浓度各设6个平行孔，并分别设空白孔(即只加入药液和培养液，不加细胞)以调零。继续培养24、36、48 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)，再培养4 h，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡器上震荡10 min，应用酶标仪于490 nm处测吸光值（A），按照公式：抑制率％=(对照组A－实验组A)/对照A×100％，求抑制率。实验在相同条件下均重复进行3 次。

1.2.3 光镜下形态学观察

hela细胞接种于50 mL培养瓶中，培养24 h后，加入0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L的SBTI，培养24 h后，光学显微镜下观察细胞形态学变化，并拍摄照片。

1.2.4 统计学处理

数据利用SPSS13.0统计软件处理，求抑制率，采用重复测量的方差分析。并绘制出SBTI对Hela细胞抑制作用的量效和时效依赖关系曲线。

2 结果

2.1 SBTI对Hela细胞增殖的抑制作用

SBTI能够明显的抑制Hela细胞的增殖，并且呈现明显的量效和时效依赖关系。在不同的作用时间分别是24、36、48 h，随着药物浓度（为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L）的依次增加，抑制率依次增加，最高可达83.24％，87.83％，96.01％， 除了0.50 g/L与1.00 g/L组之间差异没有显著性（P>0.05）外，其他各组差异均有显著性（P﹤0.01）；在不同的作用浓度（如上的6个浓度），随着作用时间（24，36，48 h）的依次增加，抑制率也依次增加，除了0.50 g/L和1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性（P>0.05）外，其他的均有有显著性差异（P﹤0.01），抑制率最高可达49.2%，59.77%，77.52%，80.92%，96.01%。见表1、图1。表1 不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂在不同作用时间对Hela细胞的抑制率（略）注：* 实验组与对照组比较P﹤0.01。#与前一组比较P﹤0.01，与上一组比较P﹤0.01但是0.50 g/L与1.00 g/L两组间在24 h时差异没有显著性P>0.05， 0.50 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05，1.00 g/L组的24 h与36 h比较差异没有显著性P>0.05

2.2 SBTI对Hela细胞形态上的影响

正常培养时，Hela细胞在传代后陪培养3～4 h即可贴壁，呈现长椭圆形，10 h后贴壁结实，呈现多角形而且细胞大小不一，可见巨大细胞，胞质也多少不一，核大小不等，可有双核。24 h后细胞呈现活跃的增殖。48～72 h后细胞生长贴满一底壁，此期间细胞称为对数生长期，见图2，图3。96 h后则由于细胞之间互相的抑制而不再增殖。在对数生长期的细胞，加药不同浓度后培养24 h，可见1.00 g/L浓度的细胞不再增殖，细胞间距变大，而且贴壁不紧固，见图4，10.00 g/L浓度的细胞，细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，见图5。

3 讨 论

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor ，TI)是指能够抑制胰蛋白酶作用的一类物质。天然的胰蛋白酶抑制剂来源广泛，动物植物以及人体内均含有TI，如可从黄豆、南瓜籽、牛肺或牛胰以及人尿中提取等。大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor ，SBTI)是从大豆中提取的 ［4］，无毒副作用［5］，具有广泛的生物学活性和作用，有着良好的科学研究和临床治疗前景。

肿瘤的发生有其遗传物质基础，主要表现为多基因突变所致的细胞失控性生长，细胞增殖失控和凋亡受阻是其发生、发展的主要原因，有效的抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一。

大豆胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤作用。Zhang［6］等研究了单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI 对人类乳腺癌细胞（MCF7）、人类头颈肿瘤细胞 （SCC61 和 SQ20B） 、人类宫颈癌细胞（Hela ，Hela-R1 ，Hela-R3） 、非肿瘤生成性人类上皮细胞 （MCF10）、非肿瘤生成性人类甲状腺上皮细胞（Htori-3）及小鼠成纤维细胞（C3H10T1/2）的影响 ，结果显示单纯型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBI 和结合型的大豆胰蛋白酶抑制剂BBIC 能够显著降低MCF7 和SCC61 细胞系的存活率。

有实验证明大豆胰蛋白酶抑制剂具有明显的抑制肿瘤细胞降解基质膜的作用，从而能够抑制肿瘤细胞离开原来的生长部位，突破细胞外基质（ECM）的屏障和侵犯周围毗邻的正常组织［7］。

大豆胰蛋白酶抑制剂的还可以通过抑制肿瘤细胞的纤溶酶原激活系统起作用。这一系统包括:尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type plasmino gen activator， uPA)及其受体(uPAR)和uPA抑制剂。大豆胰蛋白酶抑制剂与目前研究较为成熟的尿胰蛋白酶抑制剂（B ikunin）有着类似的作用，即与uPA结合形成一个复合体，并竞争地与uPAR 结合，封闭uPAR 的激活部位，使uPA酶活性不被激活，从而防止肿瘤细胞的转移和浸润。Kobayashi等［8］研究发现，肿瘤可分泌大量uPA，分泌后随即与肿瘤细胞表面的uPAR高度结合，活化的uPA再催化细胞表面的纤溶酶产生蛋白溶解级联反应，导致基底膜和细胞外基质被破坏。Kobayashi 等［9］ 通过Northernblot、Western blot、酶联免疫吸附法等证实，SBTI以一种时间及剂量依赖形式，在基因及蛋白水平抑制卵巢癌细胞系HOC－Ⅰ和HRA 的uPA 表达。

另外，大豆胰蛋白酶抑制剂调节信号传导途径而抑制肿瘤细胞的生长。大豆胰蛋白酶抑制剂通过直接抑制CD44 的二聚化抑制肿瘤转移。白细胞分化抗原CD44是一种多功能跨膜糖蛋白，它促进肿瘤细胞粘附、迁移，参与新生血管形成等一系列关键步骤。Kobayashi等［10］对人类软骨肉瘤细胞系HCS22 /8研究显示，肿瘤细胞间是通过CD44相互识别透明质酸，其相互作用是通过CD44蛋白二聚化完成。SBTI 通过直接抑制CD44二聚化介导激活的促细胞分裂原活化蛋白激酶系统，从而抑制uPA mRNA及其蛋白的表达及肿瘤的侵袭。

本实验用大豆胰蛋白酶抑制剂处理人宫颈癌细胞Hela细胞后，Hela细胞的生长受到明显抑制， 随着药物浓度为0、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 g/L依次增加，作用时间为24、36、48 h的依次延长，其抑制率也明显增加。并且出现凋亡的特征性改变：细胞大部分变圆，边缘跷起，且已脱离底壁，少量细胞聚集成一个一个的小细胞团，并随着药物浓度的增加，细胞均漂起，聚集成一个一个的大细胞团。这些结果表明大豆胰蛋白酶抑制剂能抑制Hela细胞增殖，与文献报道相似这可能是诱导Hela细胞发生凋亡有关。有关于大豆胰蛋白酶抑制剂抑制Hela细胞的机理方面我们将在以后做进一步的研究。

总之，大豆胰蛋白酶抑制剂，作为一种新型又无毒副作用的抗癌药，很有值得研究的价值，尤其我国是一个大豆资源丰富的国家，对其机制的深入研究，将对临床肿瘤治疗步入一个新的阶段有着重要的意义。

参考文献

［1］Kennedy AR， Billings PC， Wan XS， et al. Effectsof Bowman-Birk inhibitor on rat colon carcinogenesis ［J］ . Nutr Cancer，2002 ，43 （2）:174-186.

［2］Wan XS， Ware JH， Zhang L ， et al. Treatment with soybean derived Bowman-Birk ihibitor increases serum prostate specific 49antigen concentration while suppressing growth of humanprostate cancer xenografts in nude mice ［J］ . Nutr Cancer，1999 ，33 （2） :174-177.

［3］Stonelake PS， Jones CE， Neoptolenos JP etal， Proteinase inhibitors reduce basement membrane degradation by human breast cancer cell lines［J］. Br J Cancer，1997， 75(7): 951-959.

［4］Kennedy AR. Chemopreventive agents : protease inhibitors ［J ］.Pharmacol Ther ， 1998 ，78 (3) :197-209.

［5］Ann R Kennedy.The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent1-3［J］.Am J Clin Nutr， 1998，68(suppl):1406-1412.

［6］Zhang L ， Wan XS， DonahueJJ ， et al.Effectsof the Bowman Birk inhibitor on clonogenic survival and cisplatinor radiation induced cytotoxicity in human breast ， cervical ， and head and neck cancer cells ［J］ .Nutr Cancer，1999 ，33 2 :165-173.

［7］杜惠芬，李克生，郭红云，等.胰蛋白酶抑制剂体外抑制肿瘤细胞降解细胞外基质的研究［J］.中国预防医学，2004，5（2）：138－139.

［8］Kobayashi H， Suzuki M， Sun GW， et al.Suppression of urokinase-type plasminogen activator expression from human ovarian cancer cells by urinary trypsin inhibitor［J］.Biochim BiophysActa， 2000， 1481 (2) : 3102-3161.

篇3

【摘要】 目的 探讨重组蛋白酶抑制剂(recombinant proteinase inhibitor，RPI)对大鼠胰腺缺血再灌注(I/R)损伤的保护作用。方法 Wistar大鼠30只随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组，分别测定各组大鼠血清淀粉酶、脂肪酶含量。检测各组血清中肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1β(IL1β) 的变化。结果 RPI组的淀粉酶、脂肪酶含量较模型组显著降低(P

【关键词】 胰腺;缺血再灌注;重组蛋白酶抑制剂;淀粉酶;肿瘤坏死因子α

胰腺移植能增加患者胰岛素分泌细胞，从而有效地控制血糖，防止和改善糖尿病的并发症。早期胰腺炎是胰腺移植术后的常见并发症，而缺血再灌注(I/R)损伤是引起移植胰腺炎的主要原因，因此术后使用高效治疗胰腺炎的药物可取得较好的效果。重组蛋白酶抑制剂(RPI)是含有Kunitz结构域(Kunitz domain)的一个片段(289～345)，由57个氨基酸残基组成多肽，具有Kunitz型丝氨酸蛋白水解酶抑制(KPI)活性，能够有效地抑制胰蛋白酶、弹性蛋白酶、纤溶酶、胰血管舒缓素等蛋白水解酶的活性。研究表明，成功地利用DNA重组和分子克隆技术制备重组人Kunitz型RPI优选的表达系统是巴斯德毕赤酵母表达系统〔1〕，并通过药效学实验证实RPI对急性胰腺炎有明显的治疗作用〔2〕。本研究旨在观察RPI在胰腺I/R损伤的保护作用，为临床防治胰腺I/R损伤提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 Wistar大鼠30只，雌雄兼用，由吉林大学医学动物研究中心提供。RPI由吉林大学药学院制备。淀粉酶和脂肪酶测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。COLE PARMERP酶标仪 (新加坡 ) TJ6低温高速离心机(美国BACPKMA公司);2700型生化分析仪(日本SANYO公司);KUBOT KR2000T高速离心机(日本)。

1.2 动物模型与分组 术前实验动物禁食 12 h，自由进水，随机分为假手术组、I/R模型组和RPI组。术前30 min假手术组、I/R模型组尾静脉推注生理盐水1 ml，RPI组尾静脉推注RPI(8×104 kIU/kg) 。3%戊巴比妥钠 30 mg/kg腹腔注射，腹正中切口，分离胃脾韧带，结扎脾门血管，夹持脾脏，将胃翻向大鼠右侧，暴露膈肌与左肾动脉之间的腹主动脉，游离腹腔干至脾动脉，用无创动脉夹闭脾动脉，造成胰腺体尾缺血模型，30 min后松开动脉夹进行再灌注，松开动脉夹前各组按上述方法再次给药 1 次。假手术组以相同的手术方法切开显露腹腔干及脾动脉，但不夹闭血管。再灌注时间均为 6 h。

1.3 大鼠血清淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)测定 各组动物分别在再灌注后 6 h腹主动脉取血约 3 ml，2 000 r/min 离心 10 min，分离血清，测定血清AMY、Lipase。

1.4 大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNFα)和白细胞介素1β(白介素1β)的测定 标本采集同1.3，分离血清，采用ELISA方法测定血清TNFα、IL1β，具体步骤按试剂盒要求进行。

1.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件，实验数据以x±s表示，各组数据的均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清AMY和Lipase的影响 I/R模型组大鼠血清AMY及Lipase含量均明显增高，与假手术组比较具有显著性差异。RPI组与I/R模型组比较，大鼠血清AMY及Lipase含量均明显降低(P

2.2 RPI对胰腺I/R损伤大鼠血清TNFα和IL1β的影响 I/R模型组大鼠血清TNFα和IL1β水平均明显增高，与假手术组比较差异显著(P

3 讨 论

I/R损伤是造成胰腺移植后各种并发症的主要原因之一，如移植术后早期胰腺炎、移植术后胰岛细胞功能不良，这些都大大降低了胰腺移植的效果〔3〕。I/R损伤的具体发病机制复杂，目前认为与能量代谢障碍、 氧自由基的产生以及中性粒细胞激活并释放炎性细胞因子等有关〔4〕。

基因工程制备的RPI是一种小分子量β淀粉样蛋白前体(APP)，包含一段KPI结构域，具有强抑制活性，氨基酸序列与KPI家族的抑肽酶43%同源性，具有与KPI相同的生物学活性和药理作用。本研究中通过建立大鼠胰腺I/R损伤模型后，血清AMY和Lipase明显升高，而给予RPI治疗后则明显降低，说明RPI可有效地抑制胰酶的分泌和释放。

另外炎性细胞因子的释放在胰腺I/R损伤的病理生理中起重要作用。炎性细胞因子主要由机体的免疫细胞分泌，在各种因素刺激如感染、 外伤、 缺血后其表达可急剧增加，过度表达可导致或加重组织损伤〔5〕。其中，TNFα 和 IL1β 已被普遍认为是介导胰腺I/R损伤的主要细胞因子，其水平异常增高时，可直接作用于细胞，使组织细胞溶解;作用于中性粒细胞时，刺激中性粒脱颗粒，生成自由基，释放各种蛋白酶和其他水解酶，诱导细胞凋亡，造成局部组织损伤和毛细血管通透性增高，进一步加重微循环障碍，微循环障碍反过来又诱发炎症介质的释放。本研究也显示，RPI可明显降低I/R模型组血清TNFα、 IL1β，说明胰腺I/R后，RPI通过抑制炎性细胞因子的作用而达到对胰腺I/R的保护作用。

参考文献

1 贺巾超，杨莉莉，马 杰，等. KPI/AβPP大规模发酵及纯化工艺〔J〕.吉林大学学报：医学报，2006;32(2):21881.

2 颜波群. rhKD/APP对实验性大鼠急性坏死性胰腺炎的作用〔A〕.吉林大学博士论文，2006.

3 曹 鋆，芮 景.胰腺移植研究进展〔J〕.临床和实验医学杂志，2008;7(3)：16870.

篇4

【关键词】子宫内膜异位症；性激素受体；基质金属蛋白酶抑制剂；免疫组织化学

子宫内膜异位症（内异症endometriosis,EMs）发病机理有多种学说，随着分子生物学研究的进展，发现性激素和性激素受体在内异症的发生发展中可能起着重要作用，内异症是激素依赖性疾病，近年来研究细胞外基质的降解与重建是异位内膜侵袭并种植于腹膜的关键。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌依赖的，在结构上高度同源的蛋白水解酶，是降解细胞外基质成分最重要的酶类[1]。有研究表明，基质金属蛋白酶及其组织抑制因子介入了子宫内膜异位症的发生过程[2]，为深入探讨性激素受体和免疫因子在内异症发病中的作用，现采用免疫组化PV-9000法对子宫肌瘤患者的正常子宫内膜和内异症患者的在位内膜和异位内膜作比较，检测雌激素受体(entrogen receptor,ER)和孕激素受体(progesterone receptor,PR)及基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitors of metalloproteinase-1,TIMP-1)在异位内膜中的表达，从而进一步阐明内异症发生发展的机制。

1 研究资料与方法

1.1标本来源与分组所有标本均取自2003年1月～2006年8月间，青岛大学医学院附属医院妇产科经腹腔镜或开腹手术，均经病理诊断。研究组1为EMs异位内膜组：标本均为异位内膜，大多为卵巢巧克力囊肿，共84例，年龄25.3～50.0岁，平均年龄（38.6±6.6）岁；按美国生育协会修正分期标准(r-AFS)为：Ⅰ～Ⅱ期26例，Ⅲ期28例，Ⅳ期30例。研究组2为EMs在位内膜组：为研究组1中部分内异症患者子宫全切术后对应的子宫内膜，共44例，年龄37.0～50.0岁，平均年龄（43.7±3.0）岁。对照组：因子宫肌瘤行子宫全切术者的正常子宫内膜，共32例，年龄20.0～49.5岁，平均年龄（42.7±7.7）岁。上述患者术前半年内均未接受性激素及抗EMs药物治疗，无其他内分泌类疾病史。

1.2标本的制备与检测

1.2.1 取材与包埋 术中取卵巢巧克力囊肿壁（异位内膜），子宫肌瘤和部分巧克力囊肿患者的在位子宫内膜，将内膜组织置于10%甲醛液固定，二甲苯透明后石蜡包埋。

1.2.2 ER、PR和TIMP-1检测 4 μm连续切片后脱蜡，水化组织切片，3% H2O2去离子水孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，根据所应用的ER、PR和TIMP-1的要求，严格按北京中山生物技术有限公司提供的具体操作步骤要求进行。

1.2.3 结果评定 显微镜下观察，细胞核显色棕褐色者为强阳性，浅棕或浅褐色者为阳性，蓝色为阴性。采用高清晰彩色电子图像分析仪，用平均密度＝棕褐色细胞核/（棕褐色细胞核+蓝染细胞核）代表ER、PR和TIMP-1的表达强度，每个切片选择4个视野，10×40倍镜放大，每个视野测定3次后取均值，由同一人用同一台仪器测定。

1.2.4 统计学方法 评分数据用x±s表示，运用SPSS 11.5统计软件处理进行t检验。

2 结果

结果显示：异位内膜组织中ER、PR及TIMP-1的表达明显低于正常内膜组织，差异均有统计学意义(P

3 讨论

EMs是激素依赖性疾病，雌、孕激素与子宫内膜细胞上的相应ER、PR发生特异性结合，产生一定效应，从而影响细胞的代谢过程或对基因表达进行调控[3]。且Sampson提出经血逆流学说被认为是一种正常现象，因并非所有发生经血逆流的妇女都将患内异症，这说明经血逆流可能仅仅是个诱因。TIMP-1是一种糖蛋白，它能与活化的基质金属蛋白酶(MMPs)形成1∶1复合体而使它们失活。而异位内膜的细胞外基质的降解与重建是异位内膜侵袭并种植于腹膜的关键，因此检测ER和PR及TIMP-1在内异症中的表达，对研究子宫内膜异位症的发生、发展等方面有重要意义。

本实验采用免疫组化方法，检测了异位内膜组织及EMs在位内膜中ER、PR、TIMP-1的表达，结果发现，异位内膜组织中ER、PR、TIMP-1的表达明显低于正常内膜，说明异位内膜虽然在结构和功能上与正常子宫内膜基本相同，同样有月经周期的改变。内异症患者的异位内膜ER、PR的表达明显低下，使得异位内膜激素变化幅度不如正常内膜明显，说明异位子宫内膜从周围组织纤维化到供血不足及组织分化程度不同，局部生长环境不良以及腺体细胞中激素受体的变化等，造成了对激素反应的差异。同时也说明TIMP-1对MMPs的抑制作用减弱，相反也说明MMPs的作用增强，对细胞外基质的降解与重建作用增强，而细胞外基质的降解与重新建成是异位内膜侵袭并种植于腹膜的关键[4]，从而导致许多病理过程。本研究表明TIMP-1在EMs病人在位内膜中的表达与正常内膜中的表达差异有显著性，表明EMs病人在位内膜比正常内膜表现出更强的侵袭能力，只有内膜组织逆流入腹腔后，周围因素发生改变，才促使TIMP-1表达减弱，从而发生内膜的异位侵袭。因此异位内膜组织中TIMP-1的异常表达在EMs的发生发展中发挥了主要作用。

尽管将EMs称为激素依赖性疾病，但异位内膜毕竟与在位内膜不同，这种对激素的依赖是不完全的，这也可能是某些用激素治疗不能完全根除EMs的原因所在。EMs患者子宫内膜的生物学特性不同于正常在位内膜，其差异在其形成中可能具有决定性作用，即EMs“在位内膜决定论”[5]。本试验结果显示：在位内膜组织中ER、PR明显高于正常内膜组织，而TIMP-1在在位内膜中呈低表达，充分表明EMs在位内膜组织局部特性的改变在EMs的发生发展中起到关键性作用，进一步突出了“在位内膜决定论”的理论意义。在位内膜中ER及PR较正常内膜组织中高，而TIMP-1却较正常内膜组织中低，是否又说明了雌孕激素对TIMP-1有抑制的作用，使得在位内膜碎片一旦种植到腹腔即可发挥其异位种植的作用。Ramon等[6]却发现TIMP-1在患者中的活性明显高于正常对照组，他们认为TIMP-1活性增高，抑制细胞侵袭的能力加强，这一结果有利于解释临床上经常发生的子宫内膜异位灶对其周围的卵巢组织没有侵袭的现象。但同时，TIMPs和MMPs一般都是以复合体形式出现的，不知是否还与目前大家讨论比较热的MMPs/TIMPs比值失衡还有关[7，8]，有待进一步研究证实。

综上所述，异位内膜组织中ER、PR、TIMP-1的低表达，表明异位内膜仍保留对激素反应的特性，是其得以种植生长的必要条件，细胞外基质的降解与重建作用增强是关键。异位内膜对激素敏感性的降低，也可能是某些用激素治疗不可能完全根除内异症的原因所在，而内异症患者在位内膜中ER、PR的高表达及TIMP-1表达较低，则是内异症发生发展中的关键因素。

参考文献

1Amy R,Barlara,Mace L,et al.Matrisian:matris metallopro- teinasesc biologic activity and clinical implications[J].J ClinOncol,2000,18(5):1135

2Collette T,Bellehumeur C,Kats R,et al.Evidence for an in- creased release of proteolytic activity by the eutopic endometri-al tissue in women with endometriosis and for involvement ofmatrix metalloproteinase-9[J].Hum Reprod,2004,19(6):1257-1264

3丁小曼,冷金花,郎景和.芳香化酶与子宫内膜异位症，见郎景和子宫内膜异位症的基础与临床研究[M].北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社,2003.228-242

4Sillem M,Hahn U,Coddington CC 3rd,Gordon K,Runnebaum B,Hodgen GD.Ectopic growth of endometrium depends on is structural integritu and proteolytic activity in the cynomolgus monkey (Macaca fascicularis) model of endometrio sis[J].Fertil Steril,1998,Sep;66(3):468-73

5郎景和.子宫内膜异位症研究的新里程[J].中华妇产科 杂志，2005，40(1)：3-4

6Ramon L,Gilabert-estelles J,Castello R,et al.mRNA analysis of several components of the plas minogen activator nd matrix metalloproteinase systEMs in endometriosis using a real-time puantitative RT-PCR assay[J].Hum Reprod,2005,20(1): 272-278

7孔丽娜,孙青,李书勤,等.子宫内膜异位症中膜型1-基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的研究[J].中国实用妇科与产科杂志，2006,22(5):367-368

篇5

【关键词】 钙蛋白酶； 缺血再灌注损伤； 钙离子； 凋亡

钙蛋白酶（calpain）是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶，广泛存在于包括心脏在内的各种组织细胞中，在体内calpain可被钙离子激活后对特定的底物进行限制性水解，参与了细胞增殖、分化、迁移和细胞信号传导等多种生物学功能［1］。calpain的异常激活则参与了许多神经系统疾病，如神经退行性病、外伤性脑损伤和脊髓损伤等，而对其在心脏病理条件下的作用研究不是很多。本试验利用calpain特异性抑制剂，观察其对离体大鼠心脏缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤的影响，旨在探讨calpain在I/R损伤中作用及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 calpain抑制剂(ALLN)、N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC、AMC、calpain单克隆抗体、辣根过氧化酶标记的二抗、FLUO-3/AM FITC (美国Sigma公司)，Western blotting ECL发光试剂盒（美国Pierce公司），胶原酶Ⅰ型（美国Amresco公司），GAPDH单克隆抗体（上海康成生物公司），其它试剂为国产分析纯。FACSAria流式细胞仪（美国BD公司），Langendorff离体灌流装置由扬州医院心血管病研究所提供，荧光分光光度计（日立，F-4500），电泳仪、转膜仪及凝胶成像系统均为Bio-Rad公司产品。

1.1.2 实验动物 实验动物为成年雄性SD大鼠，250～300 g，由扬州大学动物比较中心提供。

1.2 方法

1.2.1 离体大鼠心脏I/R模型的制备和分组 (1)模型制备：SD大鼠，3%戊巴比妥钠30 mg·kg-1及肝素500 U·kg-1腹腔注射，麻醉后无菌条件下摘取心脏，在4 ℃的Kerbs-Henseleit（K-H）液中迅速行主动脉插管并与Langendorff逆灌装置连接，用以95%O2、5%CO2达饱和的K-H液行逆行恒温恒压灌注，整个试验过程中温度控制在(37±0.5)℃、pH(7.4±0.5)，灌注压90 cmH2O，并于灌注过程中持续通入95%O2、5%CO2混合气体。(2)分组：心脏复跳成功后平衡15 min随机分为以下5组，每组9只。①正常灌注组（control组），离体大鼠心脏用K-H液灌注85 min。②I/R组，离体大鼠心脏用K-H液先灌注15 min后停止灌注30 min，然后再用K-H液恢复灌注40 min。③ALLN+control组，离体大鼠心脏用含10 μmol·L-1ALLN的K-H液先灌注15 min，后用K-H液恢复灌注70 min。④ALLN+I/R组，用含10 μmol·L-1 ALLN的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接着再用K-H液恢复灌注40 min。⑤二甲亚砜(DMSO)+I/R组，用含0.3%DMSO的K-H液先灌注15 min，然后停止灌注30 min，接着再用K-H液恢复灌注40 min。

1.2.2 乳酸脱氢酶(LDH)和冠状动脉流出量(CF)的测定 收集再灌注15 min时单位时间内的CF，并应用日立全自动生化分析仪测定冠脉流出液中LDH的漏出量。

1.2.3 心肌匀浆制备 去除心房和右心室，将剩余的心脏组织剪碎后加入10 ml·（g组织）-1匀浆液（10 mmol·L-1 NaHCO3，5 mmol·L-1NaN3，15 mmol·L-1Tris-HCl，pH 6.8），制成匀浆后离心（10 919 ×g，20 min），收集上清，分装储存于-70 ℃，以上操作均在4 ℃进行，蛋白浓度采用Bradford法测定。

1.2.4 calpain活性测定 我们以N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC（calpain特异性作用底物）与calpain 反应释放出AMC的荧光强度来代表不同样品中calpain的活性［2］。取150 μl的心肌匀浆液，加入1 ml的反应缓冲液（145 mmol·L-1NaCl，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 7.3）37 ℃水浴箱中振荡10 min，再加入150 μl的500 μmol·L-1的N-Succinyl-Leu-Tyr-AMC，在37 ℃水浴箱中振荡60 min 后取1 ml加入比色皿，在荧光分光光度计上用波长为360 nm的光线激发后，测定在440 nm处发射的荧光强度。用已知浓度的AMC作标准曲线，测得的结果以ngAMC·min-1·(mg蛋白)-1表示。

1.2.5 Western blotting测定calpain蛋白表达 取40 μg 变性蛋白(心肌匀浆液)经12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将胶转移至硝酸纤维素膜上(电压50 V，2 h)，转膜后5％脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，洗膜3次，每次10 min，洗膜后与1∶1 000稀释的calpain单克隆抗体37 ℃结合2 h，洗膜3次，每次10 min，然后用1∶4 000稀释的辣根过氧化酶标记的二抗37 ℃结合2 h，洗膜3次，每次10 min，以上的洗膜均在摇床上进行，洗膜所用液体均为PBS+0.05％Tween-20。最后用化学发光试剂ECL显色，X光胶片曝光，显影，定影。用同样的方法做内参GAPDH的Western blotting免疫印迹［一抗（1∶3 500），辣根过氧化酶标记二抗（1∶5 000）］，X光胶片采用Bio-RAD凝胶成像系统进行扫描，并用自带的Quantity One分析软件对结果进行定量分析，各组calpain条带与各自对应的内参GAPDH的积分光密度值的比值作为结果。

1.2.6 心肌细胞内钙离子及凋亡的测定 再灌注结束后，每组随机取3枚心脏采用酶分解法制备成年大鼠心肌细胞［3］，调整细胞浓度至2×106 ml-1，在相差显微镜下可见心肌细胞呈细长杆状，边缘光滑，横纹清晰。

(1)心肌细胞内钙离子测定：每组样品中加入适量的FLUO-3/AM液（终浓度为5 mmol·L-1），混匀后避光37 ℃振荡30 min，去除负载液，用D-Hanks液洗涤3次，流式细胞仪参数设置激发波长488 nm，发射波长526 nm，每组样品取10 000个细胞，以平均荧光强度代表各组细胞内的钙离子浓度。FLUO-3/AM用DMSO配制，混匀后-20 ℃保存。

(2)凋亡的测定：按照Annexin-Ⅴ-FLUOS Staining KIT使用说明，取30 μl Annexin-Ⅴ染料加入到1.5 ml的结合缓冲液中，再加入30 μl PI染料，充分混匀。每个细胞样品中加入100 μl的混合染料，混匀，避光室温放置15 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果判定Annexin-Ⅴ-／PI-为正常细胞，Annexin-Ⅴ+／PI-为凋亡细胞，Annexin-Ⅴ+ ／PI+ 为坏死细胞。每组样品取10 000个细胞，计算Annexin-Ⅴ+／PI-细胞数占总细胞数的百分比作为凋亡指数。

1.3 统计方法

数据以x-±s表示，应用SPSS11．5统计软件分析处理，并采用单因素方差检验(ANOVA)分析组间差异的显著性。若差异有统计学意义时，进一步进行两两比较(SNK法)，P

2 结

果

2.1 各组间再灌注15 min时CF和LDH比较

与control组相比，I/R组和DMSO+I/R组的CF显著降低(P

2.2 各组间calpain活性比较

I/R组calpain活性为0.365 5±0.001 7，明显高于control组的0.136 0±0.002 2(P

转贴于 2.3 各组间calpain蛋白表达比较

I/R组calpain/GAPDH（2.34±0.20）明显高于control组（0.73±0.13）、ALLN+control组（0.64±0.07）和ALLN+I/R组（1.19±0.14)，均为P

1. control组；2. ALLN+control组;

3. ALLN+I/R组；4. I/R组;

5. DMSO+I/R组

图1 各组大鼠心肌calpain和

内参GAPDH蛋白印迹

Fig 1 The protein blot of calpain and

GAPDH in all groups

2.4 各组间细胞内钙离子浓度比较

I/R组与DMSO+I/R组明显高于其他各组（P

2.5 各组间细胞凋亡指数的比较

与I/R组相比，control组、ALLN+control组和ALLN+I/R组的细胞凋亡指数均显著降低（P

3 讨

论

心肌I/R损伤一直是临床和基础研究的热点，其发生机制可能与再灌注期自由基生成过多、钙超载、微血管损伤和能量生成不足等有关，其中钙超载可通过以下机制引起心肌细胞功能障碍：(1)导致线粒体功能障碍。(2)引起心律失常。(3)使肌原纤维挛缩、断裂。(4)激活许多钙依赖的酶系统，如磷脂酶，可促进膜磷脂水解，造成细胞膜及细胞器质膜受损，此外还可激活calpain，后者是半胱氨酸异源二聚体蛋白酶，其家族包括具有组织特异性的n-calpain和非组织特异性的μ-calpain 和m-calpain。 其中μ-calpain 和m-calpain分布广泛且生化和催化特性十分相似，但两者激活表现半最高活性所需钙离子浓度不同，前者需1～20 μmol·L-1，后者需250～750 μmol·L-1。calpain活性主要受calpain-激活蛋白，calpain-抑制蛋白（calpastatin）、钙离子、PKA的磷酸化以及亚硝基化调节［4-5］。

本试验中我们利用离体心脏Langendorff灌流模型，测量了再灌注15 min时的CF和冠脉流出液中LDH的漏出量，并利用流式细胞仪测定细胞内钙水平和细胞的凋亡程度，从而综合评价心脏损伤程度。结果发现，I/R组较control组损伤明显，证实我们离体大鼠心脏I/R模型构建成功，若在I/R前预先使用10 μmol·L-1的ALLN可明显减轻I/R所致的损伤，但与control

组仍有差异，这些提示ALLN通过抑制calpain活性，一定程度上减轻了I/R所致的细胞坏死和凋亡，这与国外一些研究是相符的。Barta等［6］试验发现心肌纤维组成蛋白和骨架蛋白均可被calpain降解，其中相对分子质量为284 000的胞衬蛋白(fodrin)和相对分子质量为3 000 000～3 300 000的肌联蛋白（connectin）对calpain最敏感，所有这些蛋白的水解都将损伤心脏功能，而ALLN可减轻这种损伤。Chen等［7］通过实验证实了［Ca2+］i的增加可以激活calpain，后者水解Bid形成tBid(截短的Bid)，促使了BAX/BAK易位和寡聚化，促使细胞色素c的释放，而ALLN可以阻止Bid活化所造成的细胞凋亡。

为进一步研究calpain在I/R中的作用，我们利用calpain特异性荧光底物以及免疫印迹法分析了各组calpain活性和蛋白表达情况，结果发现calpain活性在I/R组明显高于control组，而预先使用ALLN可使calpain活性明显降低，但令人惊奇的是，该组细胞内钙水平较I/R组也显著降低，此前Armstrong等［8］试验发现，激活的calpain可以蛋白水解肌浆网膜骨架上的α-fodrin，从而增加肌浆网的脆性，这些在再灌注的前几分钟持续恶化，使肌浆网对心肌细胞内钙的处理能力趋于崩溃，最终导致细胞内钙超载的发生。由于心肌肌浆网是控制心肌细胞内钙稳态的关键环节，结合相关文献［9］及我们的试验结果，我们提出以下假设：在I/R损伤中，细胞内calpain激活后发挥其蛋白酶的功能，损害肌浆网的功能，造成细胞内钙转运的失调，加重钙超载，而增加的钙离子又可以进一步激活calpain，从而形成一恶性循环，而ALLN可以打断这种循环，一定程度缓和了钙超载，从而保护了细胞，这方面我们将在下一步试验中继续研究。

关于calpain蛋白表达情况，实验结果发现calpain蛋白量与活性相一致，这提示在I/R损伤中calpain蛋白表达是增加的。此外为排除溶剂DMSO对试验的影响，我们增加DMSO+I/R组，其各项指标与I/R组相比无明显差异。

综上所述，我们认为10 μmol·L-1ALLN可一定程度缓和I/R引起的细胞坏死和凋亡，作用机制可能与其抑制calpain活性，从而减轻calpain对细胞的损伤，维持了细胞内钙稳态有关。

【参考文献】

［1］SAEZ M E，RAMIREZ-LORCA R，MORON F J，et al.The therapeutic potential of the calpain family: new aspects ［J］. Drug Discov Today，2006，11(19-20):917-923.

［2］CHEN M，WON D J，KRAJEWSKI S， et al. Calpain and mitochondria in ischemia/reperfusion injury［J］. J Biol Chem，2002，277:29181-29186.

［3］BUGAISKY L B，ZAK R.Differentiation of adult rat cardiac myocytes in cell culture［J］.Circ Res，1989，64(3):493-500.

［4］SANADA S，ASANUMA H，TSUKAMOTO O， et al. Protein kinase A as another mediator of ischemic preconditioning independent of protein kinase C［J］. Circulation，2004，110:51-57.

［5］CHOHAN P K，SINGH R B，DHALLA N S，et al. L-arginine administration recovers sarcoplasmic reticulum function in ischemic reperfused hearts by preventing calpain activation ［J］. Cardiovasc Res，2006，69(1):152-163.

［6］BARTA J，TOTH A，EDES I，et al.Calpain-1-sensitive myofibrillar proteins of the human myocardium［J］.Mol Cell Biochem，2005，278(1-2):1-8.

［7］CHEN X，ZHANG X，KUBO H，et al.Ca2+influx-induced sarcoplasmic reticulum Ca2+overload causes mitochondrial-dependent apoptosis in ventricular myocytes［J］.Circ Res，2005，97(10):1009-1017.

篇6

[关键词] 组蛋白去乙酰化酶；抑制剂；肿瘤

[中图分类号] R977.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）06（a）-0015-07

Research progress of histone deacetylase inhibitors

GU Hua-wei LIU Yan SANG Jun-xia LIU Jing

Pharmacy of Department，the Fourth Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology；Tumor Hospital of Anyang City in Henan Province，Anyang 455000，China

[Abstract] Histone deacetylase（HDACs） is a kind of protease which plays an important role in the modification of chromosome and regulation of gene expression，and is closely associated with the occurrence and development of tumor.Histone deacetylase inhibitors（HDACIs） of great significance in the development of the antitumor drugs.The molecular structures of HDACs，HDACs with malignant tumor，the molecular structures of HDACIs，main design ideas of HDACIs，structure-activity relationship were reviewed in this article.

[Key words] Histone deacetylase；Inhibitors；Tumor

近年来，肿瘤已经成为威胁人类健康的一大杀手。2012年全球新增癌症病例达到1400多万例，预计在未来20年内，癌症死亡人数将从每年820万飙升至1300万[1]。2014年2月3日，世界卫生组织下属的国际癌症研究机构发表的《2014年世界癌症报告》显示，全球癌症死亡率正在以惊人的速度增加，平均每8个死亡病例中就有1例死于癌症。目前肿瘤治疗方法主要是手术治疗、化学疗法和放射治疗，花费高、治愈率低、副作用大，给患者造成了沉重的负担，如何解决这些问题成为科研以及医务工作者密切关注的问题。

随着表观遗传学、分子生物学等研究的深入，越来越多的证据表明，肿瘤的发生发展与基因水平的病变密不可分。组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HATs）与组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDACs）是调控基因转录与表达的两个主要酶家族。HATs将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，降低组蛋白与DNA的结合，激活基因转录及表达；HDACs使组蛋白去乙酰化，增强组蛋白与DNA的结合，染色质致密卷曲，从而抑制基因的转录及表达。在肿瘤细胞中，HDACs过度表达，去乙酰化作用增强，抑制了特定基因的表达，与肿瘤的发生发展具有密切联系[2-3]。早在1990年就有科学研究[4-5]表明，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）有助于抑制肿瘤细胞的存活。本文就HDACs与肿瘤的关系及其现阶段已经上市、处于临床及临床前研究的抑制剂进行综述，以期为抗肿瘤药物的研发提供一些新思路。

1 HDACs的结构及其与肿瘤的关系

真核细胞中，染色质由DNA、组蛋白及其他蛋白组成。组蛋白构成的八聚体紧紧环绕在DNA周围，构成核小体，是染色质的基本组成单位。组蛋白的N-端氨基酸是可被修饰的活性位点，可以发生乙酰化、磷酸化、甲基化等作用，调控基因的表达。HDACs可能通过以下2种机制调控基因的表达：①HDACs使组蛋白去乙酰化，增强组蛋白与DNA结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制；②HDACs使一些非组蛋白在DNA附近集聚，与组蛋白N-端活性位点发生作用，影响转录过程[6-9]。

目前已知的人类HDACs存在18种亚型，根据结构和功能可以分为以下4类。Ⅰ类：HDAC1～3和8；Ⅱ类：HDAC4～7，9～10；Ⅲ类：SIRT1～7；Ⅳ类：HDAC11[10-11]。其中Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅳ类HDACs为Zn2+依赖酶，Ⅲ类为NAD+依赖酶。Zn2+依赖的HDACs是研究的主要靶点，其仅有HDAC4、HDAC7和HDAC8获得了蛋白晶体结构（图1）。表观遗传学研究[12]表明，在众多的亚型中，HDAC1和HDAC2与肿瘤发生发展的关系最为密切。

图1 HDAC8的晶体结构及其与TSA结合（PDB ID：1T64）

组蛋白的乙酰化与去乙酰化分别受HATs和HDACs的调控，一旦平衡被打破，基因的转录过程将失调。病理情况下，HDACs过度表达，一些肿瘤抑制基因转录受到抑制，引起一系列疾病。例如，HDAC1在胃癌[13]和前列腺癌[14]中高表达，HDAC1和HDAC6在胸腺癌中高表达[15-16]，HDAC2和HDAC3在结肠直肠癌中高表达[17-18]等。因此，HDACs是抗肿瘤药物研发中的一个重要靶点。

2 HDACIs的结构及其与肿瘤的关系

目前设计开发的HDACIs种类繁多，根据其化学结构可以分为4类：①异羟肟酸类；②苯酰胺类；③环肽类；④羧酸类。按照其结构特征又可分为3部分片段：①与Zn2+络合的异羟肟酸结构；②中间的脂肪链连接部分；③亲脂性的帽子结构，与受体口袋疏水性结合。临床实验及临床前研究表明，HDACIs对多种肿瘤细胞具有生长抑制的作用，影响肿瘤细胞分化及诱导肿瘤细胞凋亡，用于肿瘤的单一或联合治疗（表1）。

2.1 异羟肟酸类

2.1.1 处于临床实验研究的抑制剂 异羟肟酸类HDACIs是在二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）的基础上研究开发的。Friend等[19]在复苏小鼠红白血病细胞时发现DMSO对传代细胞具有生长抑制作用，并且2/3的病变细胞有好转的现象。该现象引起了Marks等[20]的注意，拉开了异羟肟酸类HDACIs的研究序幕。研究表明，一些极性小分子胺类化合物同样对小鼠红白血病细胞具有生长抑制作用，但其抑制活性未能显著增高。两分子的胺类化合物拼接后得到二乙酰胺类化合物六亚甲基二乙酰胺（HMBA，13）（图2），并选择性的改变基因的表达，从而起到抑制肿瘤细胞生长的作用，对小鼠红白血病细胞的抑制IC50达到5 mmol/L，抑制活性得到显著提高。临床前研究表明，HMBA具有毒性低、良好的药动学性质等优点。HMBA曾进入二期临床实验，用于治疗骨髓异常综合征和急性髓细胞白血病[21]，但由于其活性较低，剂量需求过大，在患者中耐受性差，且有血小板减少等副作用，研究被迫终止。

图2 部分异羟肟酸类HDACIs的结构及其活性

对HMBA进行进一步的结构修饰，采用羟肟酸片段取代酰胺片段，亲脂性的苯环取代一侧羟基，以期同时达到离子螯合和与疏水性口袋结合的作用，获得了一系列的HDACIs。Merk公司开发的化合物Vorinistat（SAHA，1）是该类化合物中理化性质及活性较好、毒性适中的化合物，于2006年被美国FDA批准上市，主要用于治疗CTCL。Belinostat（PXD-101，2）是TopoTarget公司开发的HDACIs，对HDACs的IC50为27 nmol/L，目前已经在美国批准上市，用于治疗外周T细胞淋巴瘤。Novartis公司研发的Panobinostat（LBH589，3）用于治疗恶性淋巴瘤，例如CTCL已经进入Ⅲ期临床实验。体内外实验表明，Italfarmaco公司开发的Givinostat（ITF2357，4）具有抗炎和细胞毒作用，一项用于治疗霍奇金淋巴瘤Ⅱ期临床实验表明，Givinostat具有抑制淋巴瘤的作用，并且呈现出了良好的安全性。Pharmacyclics公司开发的Abexinostat（PCI-24781，5）用于治疗B细胞淋巴瘤现在正处于Ⅱ期临床实验阶段[22]。Resminostat（4SC-201，6）是可以口服的HDACIs，用于治疗顽固性肿瘤处于Ⅰ期临床实验阶段[23]。Quisinostat（JNJ-26481585，7）作为广谱HDACIs，用于治疗骨髓瘤、白血病等的研究正在进行[24-25]。

2.1.2 处于临床前研究的抑制剂 Guan等[26]根据异羟肟酸类HDACIs的构效关系，设计一类取代1，3，4-噻二唑类的化合物，获得了化合物14（表2），其IC50为89 nmol/L，优于SAHA，但该化合物抑制细胞增殖能力却弱于SAHA。Guan等[27]继续对其结构改造，用取代的芳杂环代替苯环，得到化合物15～17（表2），其对HDACIs的抑制活性与抑制细胞增殖能力均高于SAHA，有继续开发的价值。Woo等[28]发现Trichostatin A（TSA，18）（图2）是一种天然异羟肟酸类HDACIs，对HDAC1的IC50为5 nmol/L。Yang等[29]通过改变连接部分的C链长度及帽子区域的结构类型，发现了化合物19（图2），对HDAC1的IC50为1.8 nmol/L，强于SAHA，体内外实验具有良好的结果。Yang等[30]合成了一系列噻吩并嘧啶类异羟肟酸HDACIs，其中化合物20对HDAC1和HDAC3的IC50分别为1.14 nmol/L和3.56 nmol/L（图2）。

表2 1，3，4-噻二唑异羟肟酸类HDACIs的结构及其活性

2.2 苯甲酰胺类

20世纪90年代，药物化学家发现经典的抗惊厥药地西林具有抑制细胞生长的作用，动物实验显示其对各种实体瘤具有一定的抑制活性。其乙酰化产物CI-994（21）（图3）的抗肿瘤活性与地西林相当，但是代谢稳定性更强。临床前研究表明，CI-994具有较好的抗肿瘤活性和较低的毒性[31-32]。目前，CI-994与吉西他滨联合治疗非小细胞肺癌已经完成了Ⅲ期临床实验。进一步结构修饰表明，CI-994的A环可被生物电子等排体，如芳香环或者芳杂环取代，但活性保持不变或增强；如脂肪链取代，活性降低。Hamblett等[33]用取代吡啶环代替A环合成得到了化合物22（表3），其对HDAC1的IC50为73 nmol/L。体内实验表明，化合物22具有良好的药动学和药效学性质，具有开发成药物的潜力。

CI-994（21）

图3 CI-994的结构

表3 苯甲酰胺HDACIs的结构及其抑制活性

1999年，Suzuki等[34]报道了一类新型的苯甲酰胺类衍生物，A环的4位是亚甲氨基而非氨基取代，得到了一个活性较好的先导化合物Entinostat（MS-275，8），对HDACIs的IC50达到了4.8 μmol/L。Syndax公司正在对其进行临床研究开发，用于治疗霍奇金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌等疾病，研究正在处于Ⅱ期临床实验研究阶段，2013年9月FDA已经提议与Syndax公司联合对Entinostat进行Ⅲ期临床实验研究。Paquin等[35]用吡啶、嘧啶、三嗪等芳杂环对4位亚甲氨基进行结构修饰，得到了化合物23（表3），对HDAC1的IC50为70 nmol/L。Frechette等[36]开发出了化合物24（表3），对HDAC1的IC50为60 nmol/L。Zhou等[37]用嘧啶衍生物对4位亚甲氨基进行结构修饰，得到了化合物Mocetinostat（MGCD0103，9），现在正在进行Ⅰ、Ⅱ临床试验，主要用于治疗急性髓细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤。未保留4位亚甲氨基结构进行的一些结构修饰，如化合物25、26及27（表3），其IC50均在nmol/L级别。

Moradei等[38]用计算机辅助药物设计的方法，将MS-275分子与HDAC1的催化活性中心进行对接，发现B环NH2的对位方向有一个疏水性空腔，于是在MS-275的B环NH2的对位引入了噻吩基团得到化合物28（表3），活性提高了将近27倍，但是邻间位取代活性则下降。

2.3 环肽类

环肽类化合物是HDACIs中结构最复杂、最具成药潜力的一类化合物，对HDACs抑制活性较强，作用方式与异羟肟酸类HDACIs一致。其基本结构是疏水氨基酸构成的12元环，是亲脂性的帽子结构；非天然氨基酸的侧链构成了连接部分；与Zn2+结合区域是一些环氧酮类或者异羟肟酸片段。目前存在的环肽类HDACIs，根据结构组成可以分为含硫抑制剂、含L-Aoe的抑制剂及其他类抑制剂。

含硫的环肽类HDACIs多为前药，分子中的二硫键或硫酯键在体内降解生成硫醇，与HDACs活性位点的Zn2+螯合而发挥作用，例如Romidepsin（FK-228，10）、FR901375（29）、Largazole（30）（图4）。其中Romidepsin对HDAC1的IC50为0.2 nmol/L，已获得美国FDA批准上市，主治复发或顽固性CTCL及外周T-细胞淋巴瘤。Taori等[39]从海燕蓝藻中分离得到十六元环肽内酯类化合物Largazole（图4），其对HDACs的抑制活性在nmol/L级别。其乙酰化衍生物与Largazole具有同等程度的抑制活性。Ying等[40]和Nasveschuk等[41]均已经完成了Largazole的全部合成工作。

含有L-Aoe的环肽类HDACIs大都从具有抗寄生虫或抗增殖作用的天然产物中筛选获得，是HDACs的不可逆抑制剂，其功能基团为（2S）-2-氨基-9、10-环氧-8-氧代癸酸（L-Aoe），所以叫做L-Aoe类抑制剂，例如化合物31～37（表4）。

还有一些其他类型的环肽类HDACIs，也具有很好的开发价值。例如Apicidin（38）[42]，对HDAC1和HDAC8的IC50分别为2 nmol/L和>1000 nmol/L，对包括胃癌、乳腺癌和子宫内膜癌在内的多种人类肿瘤细胞均有较好的抗增殖活性。

2.4 羧酸类

羧酸类的HDACIs对HDACs抑制活性较弱，为mmol/L级别，其与Zn2+结合区域是一个羧基集团。虽然表面识别区对HDACs抑制活性较为重要，但是目前研究开发的羧酸类HDACIs仍然是简单的烷基链。丁酸是结肠中的微生物代谢的副产物，mmol/L级别的丁酸选择地抑制肿瘤细胞生长的G1期，从而抑制肿瘤细胞增殖，并且不影响正常细胞结构和功能。羧酸类HDACIs作为抗肿瘤药物，其毒性较低，但首过效应强、半衰期短，所需剂量大。其抑制活性低，可能是由于其仅仅具有HDACs抑制活性，而促进细胞分化能力较低的缘故[43]。其常与其他药物联合使用，如丁酸钠和抗脂肪酸合成酶激动剂抗体联合用药，能起到协同诱导作用；苯基丁酸（39）（图5）和全反维甲酸（ATRA）联合用药治疗前髓细胞白血病[44]。因此，羧酸类化合物生物利用度低，多将羧基制成酯基，做成前药，吸收、代谢更好。

Phenylbutyric acid（39）

图5 苯基丁酸的结构

3 结语

HDACs是人体内一类重要的金属蛋白酶，其参与了细胞周期调控，在肿瘤的发生发展中起到了至关重要的作用。目前已经合成了结构丰富的HDACIs，SAHA、FK228及Belinostat已成功被FDA批准上市；Largazole、Panobinostat、Entinostat等许多化合物已经进入临床前或临床研究阶段。随着对肿瘤发生机制及HDACIs构效关系地深入研究，HDACIs的设计开发将对肿瘤的治疗产生重要意义。

[参考文献]

[1] Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9-29.

[2] Bernstein BE，Meissner A，Lander ES.The mammalian epi-genome[J].Cell，2007，128（4）：669-681.

[3] Smith BC，Denu JM.Chemical mechanisms of histone lysine and arginine modifications[J].Biochim Biophys Acta，2009， 1789（1）：45-57.

[4] Yoshida M，Kijima M，Akita M，et al.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A[J].J Biol Chem，1990，265（28）：17174-17179.

[5] Richon VM，Emiliani S，Verdin E，et al.A class of hybrid polar inducers of transformed cell differentiation inhibits histone deacetylases[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（6）：3003-3007.

[6] Kouzarides T.Chromatin modifications and their function[J].Cell，2007，128（4）：693-705.

[7] Roth SY，Denu JM，Allis CD.Histone acetyltransferases[J].Annu Rev Biochem，2001，70（1）：81-120.

[8] Izzo A，Schneider R.Chatting histone modifications in mammals[J].Brief Funct Genomics，2010，9（5）：429-443.

[9] Sanchez R，Zhou MM.The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription[J].Curr Opin Drug Discov Devel，2009，12（5）：659-665.

[10] Gregoretti IV，Lee YM，Goodson HV.Molecular evolution of the histone deacetylase family：functional implications of phylogenetic analysis[J].J Mol Biol，2004，338（1）：17-31.

[11] de Ruijter AJ，van Gennip AH，Caron HN，et al.Histone deacetylases（HDACs）：characterization of the classical HDAC family[J].Biochem J，2003，370（3）：737-749.

[12] Haberland M，Johnson A，Mokalled MH，et al.Genetic dissection of histone deacetylase requirement in tumor cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（19）：7751-7755.

[13] Choi JH，Kwon HJ，Yoon BI，et al.Expression profile of histone deacetylase 1 in gastric cancer tissues[J].Jpn J Cancer Res，2001，92（12）：1300-1304.

[14] Halkidou K，Gaughan L，Cook S，et al.Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer[J].Prostate，2004，59（2）：177-189.

[15] Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.Quantitation of HDAC1 mRNA expression in invasive carcinoma of the breast[J].Breast Cancer Res Treat，2005，94（1）：11-16.

[16] Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.HDAC6 expression is correlated with better survival in breast cancer[J].Clin Cancer Res，2004，10（20）：6962-6968.

[17] Zhu P，Martin E，Mengwasser J，et al.Induction of HDAC2 expression upon loss of APC in colorectal tumorigenesis[J].Cancer Cell，2004.5（5）：455-463.

[18] Wilson AJ，Byun DS，Popova N，et al.Histone deacetylase 3（HDAC3） and other class Ⅰ HDACs regulate colon cell maturation and p21 expression and are deregulated in human colon cancer[J].J Biol Chem，2006，281（19）：13548-13558.

[19] Friend C，Scher W，Holland JG，et al.Hemoglobin synthesis in murine virus-induced leukemic cells in vitro：stimulation of erythroid differentiation by dimethyl sulfoxide[J].Proc Natl Acad Sci USA，1971，68（2）：378-382.

[20] Marks PA，Breslow R.Dimethyl sulfoxide to vorinostat：development of this histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug[J].Nat Biotechnol，2007，25（1）：84-90.

[21] Andreeff M，Stone R，Michaeli J，et al.Hexamethylene bisacetamide in myelodysplastic syndrome and acute myelogenous leukemia： a phase Ⅱ clinical trial with a differentiation-inducing agent[J].Blood，1992，80（10）：2604-2609.

[22] Bhalla S，Balasubramanian S，David K，et al.PCI-24781 induces caspase and reactive oxygen species-dependent apoptosis through NF-kappaB mechanisms and is synergistic with bortezomib in lymphoma cells[J].Clin Cancer Res，2009，15（10）：3354-3365.

[23] Brunetto AT，Ang JE，Lal R，et al.First-in-human，pharmacokinetic and pharmacodynamic phase Ⅰ study of Res-minostat，an oral histone deacetylase inhibitor，in patients with advanced solid tumors[J].Clin Cancer Res，2013，19（19）：5494-5504.

[24] Stuhmer T，Arts J，Chatterjee M，et al.Preclinical anti-myeloma activity of the novel HDAC-inhibitor JNJ-26481585[J].Br J Haematol，2010，149（4）：529-536.

[25] Tong WG，Wei Y，Stevenson W，et al.Preclinical antileukemia activity of JNJ-26481585，a potent second-generation histone deacetylase inhibitor[J].Leuk Res，2010，34（2）：221-228.

[26] Guan P，Sun F，Hou X，et al.Design，synthesis and preliminary bioactivity studies of 1，3，4-thiadiazole hydroxamic acid derivatives as novel histone deacetylase inhibitors[J].Bioorg Med Chem，2012，20（12）：3865-3872.

[27] Guan P，Wang L，Hou X，et al.Improved antiproliferative activity of 1，3，4-thiadiazole-containing histone deacetylase （HDAC）inhibitors by introduction of the heteroaromatic surface recognition motif[J].Bioorg Med Chem，2014，22（21）：5766C5775.

[28] Woo SH，Frechette S，Abou Khalil E，et al.Structurally simple trichostatin A-like straight chain hydroxamates as potent histone deacetylase inhibitors[J].J Med Chem，2002，45（13）：2877-2885.

[29] Yang F，Zhang T，Wu H，et al.Design and optimization of novel hydroxamate-based histone deacetylase inhibitors of Bis-substituted aromatic amides bearing potent activities against tumor growth and metastasis[J].J Med Chem，2014，57（22）：9357-9369.

[30] Yang W，Li L，Ji X，et al.Design，synthesis and biological evaluation of 4-anilinothieno[2，3-d]pyrimidine-based hydroxamic acid derivatives as novel histone deacetylase inhibitors[J].Bioorg Med Chem，2014，22（21）：6146-55.

[31] el-Beltagi HM，Martens AC，Lelieveld P，et al.Acetyldinaline：a new oral cytostatic drug with impressive differential activity against leukemic cells and normal stem cells-preclinical studies in a relevant rat model for human acute myelocytic leukemia[J].Cancer Res，1993，53（13）：3008-3014.

[32] Seelig MH，Berger MR.Efficacy of dinaline and its methyl and acetyl derivatives against colorectal cancer in vivo and in vitro[J].Eur J Cancer，1996，32A（11）：1968-1976.

[33] Hamblett CL，Methot JL，Mampreian DM，et al.The discovery of 6-amino nicotinamides as potent and selective histone deacetylase inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett，2007，17（19）：5300-5309.

[34] Suzuki T，Ando T，Tsuchiya K，et al.Synthesis and histone deacetylase inhibitory activity of new benzamide derivatives[J].J Med Chem，1999，42（15）： 3001-3003.

[35] Paquin I，Raeppel S，Leit S，et al.Design and synthesis of 4-[（s-triazin-2-ylamino）methyl]-N-（2-aminophenyl）-benzamides and their analogues as a novel class of histone deacetylase inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18（3）：1067-1071.

[36] Fréchette S，Leit S，Woo SH，et al.4-（Heteroarylamino-methyl）-N-（2-aminophenyl）-benzamides and their analogs as a novel class of histone deacetylase inhibitors[J].Bioorg Med Chem Lett，2008，18（4）：1502-1506.

[37] Zhou N，Moradei O，Raeppel S，et al.Discovery of N-（2-aminophenyl）-4-[（4-pyridin-3-ylpyrimidin-2-ylamino） methyl]benzamide（MGCD0103），an orally active histone deacetylase inhibitor[J].J Med Chem，2008，51（14）：4072-4075.

[38] Moradei OM，Mallais TC，Frechette S，et al.Novel amino-phenyl benzamide-type histone deacetylase inhibitors with enhanced potency and selectivity [J].J Med Chem，2007，50（23）：5543-5546.

[39] Taori K，Paul VJ，Luesch H.Structure and activity of largazole，a potent antiproliferative agent from the Floridian marine cyanobacterium Symploca sp[J].J Am Chem Soc，2008，130（6）：1806-1807.

[40] Ying Y，Taori K，Kim H，et al.Total synthesis and molecular target of largazole，a histone deacetylase inhibitor[J].J Am Chem Soc，2008，130（26）：8455-8459.

[41] Nasveschuk CG，Ungermannova D，Liu X，et al.A concise total synthesis of largazole，solution structure，and some preliminary structure activity relationships[J].Org Lett，2008， 10（16）：3595-3598.

[42] Ahn MY，Ahn SG，Yoon JH.Apicidin，a histone deaceylase inhibitor，induces both apoptosis and autophagy in human oral squamous carcinoma cells[J].Oral Oncol，2011，47（11）：1032-1038.

[43] Chen JS，Faller DV，Spanjaard R A.Short-chain fatty acid inhibitors of histone deacetylases：promising anticancer therapeutics？[J].Curr Cancer Drug Targets，2003，3（3）：219-236.

篇7

【关键词】 胃肿瘤;乙酰肝素酶;基质金属蛋白酶9;免疫组织化学

[ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P

[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry

肿瘤细胞的侵袭和转移是一个复杂的多步骤过程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已确定的唯一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通过特异性降解HSPG发挥其促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用;基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一种锌离子依赖性内肽酶，主要降解细胞外基质和基底膜中的胶原蛋白，在破坏细胞外基质和基底膜的屏障作用、促进肿瘤细胞侵袭和转移的过程中同样具有作用。Hpa mRNA的检测在多种肿瘤中已有研究报道，但目前联合检测Hpa和MMP9在胃癌中的表达少有报道，本实验对65例胃癌切除标本Hpa和MMP9的表达进行了检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取河源市人民医院2003～2005年胃癌手术切除标本65例，男性47例，女性18例，年龄35～78岁，中位年龄60岁，其中有淋巴结转移者40例。所有病例术后均经病理证实。另取癌旁非瘤组织20例作为对照，癌旁组织距离肿瘤边缘不小于5 cm。

1.2 Hpa、MMP9的检测

采用免疫组化SABC法进行检测。Hpa抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品，均在4℃冰箱保存。用已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定标准

1.3.1 Hpa Hpa以细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。参照Friedmann等[1]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞记数仅限于肿瘤细胞染色。染色强度分级如下：无着色为0，淡黄色为1，黄色及更深颜色为2;阳性细胞数分级为:阳性细胞数小于50%为0， 50%～75%为1，>75%为2。染色强度分级与阳性细胞数分级两项得分相乘结果≥2为阳性表达。

1.3.2 MMP9 MMP9以细胞浆和/或细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，参照Liaball等[2]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞计数仅限于肿瘤细胞染色，10%及以上细胞阳性染色的切片为阳性，10%以下阳性染色的切片为阴性。

1.4 统计学处理

应用SPSS10.0统计软件，行χ2检验或精确概率法及Spearman相关性检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Hpa的表达

Hpa蛋白阳性表达主要位于细胞浆和/或细胞膜，肿瘤间质中的血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞也偶有阳性表达，胃癌中Hpa的阳性表达率为60%(39/65);在癌旁非瘤组织中，血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞偶有阳性表达， Hpa的阳性表达率为15%(3/20)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=12.390，P

2.2 MMP9的表达

MMP9在正常胃黏膜细胞中着色均匀，主要分布于细胞胞浆内，阳性表达率为15%(3/20);在胃癌组织中的表达异质明显，呈灶状或弥散性分布，阳性表达率为55.4%(36/65)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=10.046，P

2.3 不同肿瘤浸润深度及淋巴结有无转移胃癌患者Hpa、MMP9的表达

肿瘤浸润深度达到或超过浆膜层的胃癌患者Hpa、MMP9的阳性表达率明显高于未达浆膜层者，差异有统计学意义(P

2.4 Hpa、MMP9在胃癌中阳性表达的相关性

经相关性检验，Hpa、MMP9在胃癌组织中的表达呈正相关(rs=0.531，P=0.000)，见表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表达的相关性

3 讨论

肿瘤细胞对细胞外基质(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是肿瘤浸润、转移的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人体内降解ECM的主要酶类，参与肿瘤演进等众多生理和病理过程[3，4]，MMP9作为MMPs家庭重要成员，具有广泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型胶原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究结果显示胃癌组织MMP9表达显著高于临近的正常胃粘膜，MMP9高表达的胃癌患者生存期明显缩短;David等[7]研究表明，与正常胃粘膜相比，胃癌组织MMPs表达明显升高，MMPs表达与胃癌分期密切相关。本实验结果显示，淋巴结转移患者MMP9阳性表达率明显高于无淋巴结转移者，说明MMP9在胃癌细胞突破基底膜向周围淋巴结转移过程中起着重要的作用; MMP9的表达还与胃癌的浸润深度密切相关(P

Hpa是目前发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在肿瘤细胞的侵袭和转移中具有重要的意义。 Vlodavsky等[9]研究发现高转移潜力的肿瘤细胞Hpa活性比低或无转移潜力的肿瘤细胞高4～10倍。在卵巢腺癌、转移性黑色素瘤细胞、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈优势表达。Hulett等[10]也发现高转移的鼠腺癌细胞系表达高水平Hpa mRNA，而低转移细胞系仅有少量表达。Takaoka等[11]用RTPCR检测胃癌组织中Hpa的表达发现，正常胃粘膜组织中无Hpa的表达，胃癌组织中Hpa的表达与肿瘤体积和局部淋巴结转移有明显正相关性，高表达Hpa的患者预后差。本研究结果显示，Hpa的阳性表达与胃癌的浸润深度及有无淋巴结转移密切相关，表明在胃癌的进展过程中，Hpa具有重要的作用。本研究还发现，Hpa和MMP9在胃癌细胞上的表达呈正相关，推测Hpa和MMP9在胃癌浸润转移过程中存在相互关联、相互作用，联合检测Hpa和MMP9在判断肿瘤生物学行为及预后方面具有重要意义。

参考文献

1 Friedmann Y， Vlodavsky I，Aingon H，et al. Expression of heparanase in normal， dysplastic， and neoplastic human colonic mucosa and stroma evidence for its role in colonic tumorigensis[J]. Am J Pathol， 2000，157(4):11671175.

2 Liaball NB， Talbot I， Smith RA， et al. Matrix metalloprtease 2 (MMP2) and matrix metalloprtease 9 (MMP9)， type IV collagenase in colorectal cancer[J]. Cancer Res， 1996，56(3):190196.

3 Chambers AF， Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloprotinases inmetastasis [J].J Natl Cancer Inst， 1997，89(17):12601270.

4 陈莉萍，刘嘉茵.血清基质金属蛋白酶-9和基质金属蛋白酶抑制剂-1在接受IVF-ET患者中的测定[J].实用临床医药杂志，2008，12(9)：110111.

5 Liotta LA， Steeg PA， StetlerStevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis:an imbalance of positive and negative regulation[J].Cell，1991，64(2):327336

6 Sier CFM， Kubben FJ， Canesh S， et al. Tissue levels of matrix metalloproteinase MMP2 and MMP9 and related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer， 1996，74:413 417.

7 David L， Nesland J， Holm R， et al. Expression of lamin， collafen Ⅳ， fibronectin and type Ⅳcollafenase in fastric carcinoma[J]. Cancer，1994，13:518527.

8 张成武，邹寿椿，徐文娟，等.胃癌基质金属蛋白酶临床意义 [J].中国胃肠外科杂志，2000，3(1):2527.

9 Vlodavsky I， Fridmann Y， Elkin M， et al. Mammalian heparanase: gene cloning， expression and function in tumor progression and metastasis[J]. Nat Med， 1999，5(7):793802.

篇8

【关键词】 川芎嗪注射液; 腹膜间皮细胞; 高糖; ⅰ型胶原; 基质金属蛋白酶?1; 基质金属蛋白酶抑制剂?1; 体外实验

zhu gs, he js. j chin integr med. 2009; 7(1): 65?69.

received june 18, 2008; accepted july 22, 2008; published online january 15, 2009.

indexed/abstracted in and full text link?out at pubmed. journal title in pubmed: zhong xi yi jie he xue bao.

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doi: 10.3736/jcim20090110open access

effects of ligustrazine injection on high glucose?induced type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro

gui?song zhu, jin?song he

department of nephrology, the affiliated drum tower hospital, nanjing university medical school, nanjing, jiangsu province 210008, china

objective: to investigate the effects of ligustrazine injection on type ⅰ collagen, matrix metalloproteinase?1 (mmp?1) and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 (timp?1) expressions in human peritoneal mesothelial cells (hpmcs) cultured in high glucose conditions.

methods: hpmcs were isolated from human omenta by trypsin digestion method and subcultured. then, the hpmcs were divided into normal control group, high glucose group and high glucose plus low?, medium? and high?dose ligustrazine (10, 20 and 40 mg/l ligustrazine respectively) groups. semi?quantitative reverse transcription?polymerase chain reaction was used to detect the expressions of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 mrnas in hpmcs. proteins of type ⅰ collagen, mmp?1 and timp?1 in culture supernatants were measured by enzyme?linked immunosorbent assay (elisa). cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid method to correct the elisa assay results.

results: ligustrazine injection could significantly decrease high glucose?induced type ⅰ collagen and timp?1 expressions in a dose?dependent manner both in protein and gene levels (p<0.05, p<0.01). in addition, medium? and high?dose ligustrazine injection could significantly increase mmp?1 expression which was inhibited by high glucose concentrations (p<0.05).

conclusion: ligustrazine injection does not only decrease type ⅰ collagen synthesis, but also promote its degradation by modulating unbalanced mmp?1/timp?1 expression in hpmcs cultured in high glucose conditions.

keywords: ligustrazine injection; human peritoneal mesothelial cells; high glucose; type ⅰ collagen; matrix metalloproteinase?1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1; in vitro

腹膜纤维化是腹膜透析治疗的主要并发症，最终导致腹膜功能衰竭，这是腹膜透析患者退出治疗的主要原因［1］。腹膜纤维化以细胞外基质（extracellular matrix, ecm）的过度沉积为特点［2］。研究表明，ecm的过度沉积是由于ecm合成与降解失衡而引起［3］。ⅰ型胶原是腹膜纤维化中主要的ecm［4］，其降解过程受基质金属蛋白酶?1（matrix metalloproteinase?1, mmp?1）及其特异性抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂?1（tissue inhibitor of metalloproteinase?1, timp?1）调控［5］。有研究证实，高糖能上调腹膜间皮细胞（human peritoneal mesothelial cells, hpmcs）ⅰ型胶原和timp?1的表达，降低mmp?1活性［3］。本研究通过观察川芎嗪注射液对高糖刺激下hpmcs ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1表达的影响，探讨川芎嗪在防治腹膜纤维化中的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 试剂和主要仪器 川芎嗪注射液（江苏苏中药业集团股份有限公司，批准号为国药准字h20020630）；50％葡萄糖注射液（江苏方强制药厂，批号为200710111）。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution, pbs）、胎牛血清（fetal calf serum, fcs）、trizol和rpmi?1640粉剂等（gibco公司）；胰蛋白酶和琼脂糖粉等（promega公司）；ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1酶联免疫吸附测定（enzyme?linked immunosorbent assay, elisa）试剂盒（adl公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, bca）蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技公司）；ⅰ型胶原、mmp?1、timp?1和β?actin引物，m?mlv第一链cdna合成试剂盒和taq酶等（invitrogen公司）；抗细胞角蛋白抗体、抗细胞波形蛋白抗体、第ⅷ因子抗体和抗白细胞cd45抗体（北京中山生物技术有限公司）。nu?2500e二氧化碳培养箱（nuaire公司）；全自动酶标仪（biobank公司）；生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 hpmcs的培养与鉴定 取来自南京大学医学院附属鼓楼医院普外科择期腹部手术患者（排除尿毒症、腹膜炎）捐献的大网膜组织，按文献［3］方法原代培养hpmcs，按1?3传代，第3代细胞用于实验，每次实验均由来自3个患者的标本进行3次独立实验。倒置相差显微镜观察hpmcs呈多边形，似铺路鹅卵石样外观；免疫组化鉴定抗细胞角蛋白抗体和抗波形蛋白抗体染色阳性，抗第ⅷ因子抗体和抗白细胞cd45抗体染色阴性。

1.2.2 实验步骤和分组 hpmcs用含1％fcs的rpmi?1640培养液同步培养24 h后分为5组（每组设3个样本）：正常组（完全培养液）、高糖对照组（2.5％葡萄糖）和高糖（2.5％葡萄糖）加低、中、高剂量川芎嗪（10、20和40 mg/l）组。各组完全培养液均为含有15％ fcs的rpmi?1640培养液。细胞置于37 ℃、5％ co2培养箱培养48 h。

1.2.3 elisa法检测细胞上清液中ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1含量 分组干预48 h后，离心收集上清液，按elisa试剂盒说明书检测ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1表达水平。用0.1 mol/l naoh溶解细胞沉淀，bca蛋白检测试剂盒测定细胞沉淀中蛋白质浓度，用相应蛋白质浓度结果校正检测结果。

1.2.4 半定量rt?pcr 分组处理同上。采用trizol一步法提取总rna，2 μg总rna进行逆转录合成cdna，50 μl反应体系进行pcr扩增，以β?actin作内参照（引物序列及反应条件见表1）。1.5％琼脂糖凝胶电泳（110 v，15 min）进行pcr产物鉴定，电泳图像分析仪扫描分析，mrna相对含量用其pcr产物吸光值（absorance, a）与β?actin a值的比值表示。引物及pcr反应条件见表1。

1.3 统计学方法 实验数据用x±s表示，采用spss 15.0软件进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用lsd?t检验。检验水准α=0.05。 表1 ⅰ型胶原、mmp?1、timp?1和β?actin引物序列及pcr反应条件

2 结 果

2.1 上清液中ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1蛋白质水平 与正常组比较，高糖对照组上清液中ⅰ型胶原和timp?1含量显著升高（p<0.01），mmp?1含量显著下降（p<0.01）；与高糖对照组比较，低、中和高剂量川芎嗪组上清液中的ⅰ型胶原和timp?1含量显著降低（p<0.05, p<0.01），且两者均呈量效关系，中、高剂量川芎嗪组上清液mmp?1含量显著增加（p<0.01）。见表2。表2 各组上清液中ⅰ型胶原、mmp?1和timp?1蛋白质表达

2.2 hpmcsⅰ型胶原、mmp?1和timp?1 mrna的表达 与正常组比较，高糖对照组hpmcs ⅰ型胶原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna分别上升（15.43±0.83）倍和（4.19±0.09）倍（p<0.01），mmp?1/β?actin mrna下降（86.9±0.44）%（p<0.01）；与高糖对照组相比，低、中、高剂量川芎嗪组ⅰ型胶原/β?actin mrna和timp?1/β?actin mrna表达水平均显著下调（p<0.05），两者均呈量效关系，中、高剂量川芎嗪组mmp?1/β?actin mrna表达显著增加（p<0.05）。见图1和图2。

3 讨 论

高糖透析液导致ecm过度沉积是腹膜纤维化的病理基础［2］，研究表明，高糖不仅增加hpmcsⅰ型胶原的表达，并且引起ⅰ型胶原降解酶系mmp?1/timp?1的表达失衡［3］。我们的研究结果与之基本相同，此外我们发现，川芎嗪能显著对抗高糖的上述作用。

在生理条件下，hpmcs可以产生一定量的ecm和mmps/timps［3, 6］。mmps是降解ecm的蛋白水解酶系，几乎能降解全部ecm成分。timps是内源性分泌蛋白，作为mmps的特异性抑制因子，其n'端可与相应的mmps催化活性中心的锌离子结合而抑制其催化活性［7］。本实验通过研究川芎嗪对hpmcs在高糖刺激下主要ecm ⅰ型胶原及其降解酶系mmp?1/timp?1分泌及表达的影响，旨在探讨川芎嗪对hpmcs在高糖环境下ⅰ型胶原的合成和降解的干预作用及其机制。结果显示，川芎嗪能显著降低高糖所致的ⅰ型胶原的过度合成，同时显著下调timp?1的表达，增加mmp?1的表达，提示川芎嗪亦能通过调节mmp?1/timp?1的平衡，从而促进ⅰ型胶原的降解，减少ecm沉积。由此我们推测，川芎嗪可能具有预防或延缓腹膜纤维化的作用。

川芎嗪是中药川芎的有效成分之一，属酰胺类生物碱，具有活血化瘀的功效。药理实验证明，川芎嗪具有扩张血管、改善微循环、调节免疫和钙离子拮抗的作用［8］。目前川芎嗪抑制ⅰ型胶原、timp?1和增加mmp?1表达的机制尚不清楚。以往的研究发现这可能与抑制转化细胞生长因子β1（transforming growth factor?β1, tgf?β1）表达有关［9, 10］。tgf?β1是重要的致纤维化细胞因子，参与了腹膜纤维化的病理过程［2］。tgf?β1可增加ⅰ型胶原的合成，并且抑制mmps的活性而激活timps，使ⅰ型胶原降解减少［3, 11］。有研究报道，川芎嗪能降低多种细胞如心肌细胞、肝细胞和血管内皮细胞的胶原合成和timp?1表达，而增加mmp?1的分泌和表达，进一步的研究发现这可能是通过抑制tgf?β/smads信号传导通路继而抑制tgf?β1表达的结果［9, 10, 12］。我们前期研究证实，川芎嗪能下调高糖致hpmcs tgf?β1的表达（文章待发表）。因此我们推测，川芎嗪抑制tgf?β1的表达可能是其抑制hpmcs ⅰ型胶原合成和调整mmp?1/timp?1表达平衡的机制之一，其具体机制将是我们下一步要研究的内容。

综上所述，川芎嗪能抑制高糖致hpmcs ⅰ型胶原的过度合成，并且通过调节mmp?1/timp?1的平衡，促进ⅰ型胶原降解，从而减少ecm的沉积，防止腹膜纤维化的发生和发展。因此，川芎嗪可能具有预防或延缓腹膜纤维化的作用，这对腹膜纤维化的机制及其防治的研究有一定借鉴和应用价值。

【参考文献】

1 plum j, hermann s, fussh?ller a, schoenicke g, donner a, r?hrborn a, grabensee b. peritoneal sclerosis in peritoneal dialysis patients related to dialysis settings and peritoneal transport properties. kidney int suppl. 2001; 78: s42?s47.

2 yung s, liu zh, lai kn, li ls, chan tm. emodin ameliorates glucose?induced morphologic abnormalities and synthesis of transforming growth factor beta1 and fibronectin by human peritoneal mesothelial cells. perit dial int. 2001; 21(suppl 3): s41?s47.

3 kim jj, li jj, kim ks, kwak sj, jung ds, ryu dr, yoo th, choi hy, han sh, kim hj, yoon sy, han ds, kang sw. high glucose decreases collagenase expression and increases timp expression in cultured human peritoneal mesothelial cells. nephrol dial transplant. 2008; 23(2): 534?541.

4 perfumo f, altieri p, degl'innocenti ml, ghiggeri gm, caridi g, trivelli a, gusmano r. effects of peritoneal effluents on mesothelial cells in culture: cell proliferation and extracellular matrix regulation. nephrol dial transplant. 1996; 11(9): 1803?1809.

5 wang yd, yan py. expression of matrix metalloproteinase?1 and tissue inhibitor of metalloproteinase?1 in ulcerative colitis. world j gastroenterol. 2006; 12(37): 6050?6053.

6 visse r, nagase h. matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. circ res. 2003; 92(8): 827?839.

7 fujisaki k, tanabe n, suzuki n, mitsui n, oka h, ito k, maeno m. the effect of il?1alpha on the expression of matrix metalloproteinases, plasminogen activators, and their inhibitors in osteoblastic ros 17/2.8 cells. life sci. 2006; 78(17): 1975?1982.

8 huang y, chen sq, zhang g, chen rh. effect of tetromethylpyrazine and aminoguanidine on expression of vascular endothelial growth factor in kidney of diabetic rats. j chin integr med. 2004; 2(1): 39?41. chinese with abstract in english.

黄焱, 陈少强, 张更, 陈瑞华. 川芎嗪联合氨基胍对糖尿病大鼠肾脏血管内皮细胞生长因子表达的影响. 中西医结合学报. 2004; 2(1): 39?41.

9 lin yz, xu cx, deng yl, chen l, huang h, du j. effects of tetramethylpyrazine on fibrosis of atrial tissue and atrial fibrillation in a canine model of congestive heart failure induced by ventricular tachypacing. j chin integr med. 2006; 4(1): 35?38. chinese with abstract in english.

林亚洲, 许春萱, 邓玉莲, 陈林, 黄海, 杜建. 川芎嗪对心室快速起搏心力衰竭实验犬心房颤动及心房纤维化的影响. 中西医结合学报. 2006; 4(1): 35?38.

10 hua hy, li yy, ge sw. study of tetramethylpyrazine in treatment on liver fibrosis and mechanism in rats. zhong yao yao li yu lin chuang. 2007; 23(5): 60?62. chinese with abstract in english.

华海婴, 李艳瑛, 戈士文. 川芎嗪抗大鼠免疫损伤性肝纤维化作用及机制研究. 中药药理与临床. 2007; 23(5): 60?62.

篇9

【摘要】

本研究旨在探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂－SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）诱导人急性髓性白血病细胞株HL60凋亡的分子机制。采用MTT法，瑞氏姬姆萨染色和Hoechst33342／PI荧光染色方法，检测SAHA对HL60细胞生长的抑制作用及细胞的形态变化；通过流式细胞术、Westernblot方法测定HL60细胞的周期变化以及多种信号蛋白的表达。结果表明：SAHA可以呈剂量时间依赖性抑制HL60细胞的生长；经2 μmol/L SAHA处理12-48小时，HL60细胞显示细胞周期被阻滞于G0/G1期；经Hoechst33342荧光染色后细胞核出现明显的凋亡小体结构；Western blot检测证实，SAHA作用HL60细胞后caspase 3被激活，其底物蛋白聚ADP核糖聚合酶［poly(ADPribose) polymerase， PARP］发生剪切，细胞发生凋亡；对细胞凋亡相关信号转导通路P44/42 MAPK及PI3K/Akt检测结果表明，涉及MAPK信号通路的Raf及ERK激酶磷酸化受到明显抑制，而Akt及其下游mTOR激酶的活性没有明显改变。结论：SAHA对HL60细胞的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现，与细胞增殖相关的P44/42 MAPK信号通路被阻断是细胞凋亡发生的机制之一。

【关键词】 组蛋白去乙酰化酶抑制剂；SAHA； MAPK； 信号转导；细胞凋亡；HL60细胞

Histone Deacetylase Inhibitor SAHA Induces Inactivation of MAPK Signaling and Apoptosis in HL60 Cells

Abstract

The study was aimed to investigate the molecular mechanisms of histone deacetylase inhibitor SAHAinduced apoptosis of acute myeloid leukemia cell line HL60. The effect of SAHA on HL60 cell proliferation was detected by MTT assay and the cell morphological changes were observed with WrightGiemsa and Hoechst33342 staining. The cell cycle distribution was determined by flow cytometry and the expression of cell signaling proteins were detected by Westernblot analysis. The results showed that SAHA inhibited the proliferation of HL60 cells in dose and timedependent manners，after 2 μmol/L SAHA exposure for 12-48 hours， the cell cycle was arrested at G0/G1 phase and apoptotic cell death was confirmed by either defined apoptotic bodies stained by Hoechst33342， Western blot showed cleavedPARP， which represents the activation of caspase 3. The Western blot analysis indicated the activation of two important survival signal pathways after SAHA treatment， the phosphorylation of Raf and its downstream ERK kinases were remarkable downregulated， whereas the phosphorylation of AKT and its downstream molecular mTOR were not changed. It is concluded that SAHAinduced apoptosis of HL60 cells is mediated by inactivation of p44/42 MAPK signaling pathway.

Key words

HDAC inhibitor; SAHA; MAPK; signal transduction；apoptosis; HL60 cell

SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）是继HMBA(hexamethylenebisacetamide)之后的第二代羟肟酸类的组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histon deacetylase inhibitor， HDACi）。与HMBA相比，它诱导鼠红白血病(murine erythroleukemia， MEL)细胞分化的活性是HMBA的2 000倍，并且在微摩尔(μmol/L)水平即可达到如此高的活性［1］。已知组蛋白的乙酰化状态可以影响基因的表达，当组蛋白处于乙酰化状态时，由组蛋白与DNA双链构成的核小体结构变得更为开放，有利于各种转录因子与DNA的结合，启动基因的表达。而当组蛋白处于低乙酰化状态时， 可出现转录抑制， 并介导肿瘤的发生，因此HDACi已经成为一类新型的抗肿瘤制剂。目前，SAHA已经在美国进入Ⅱ期临床试验。研究表明，SAHA可以选择性诱导细胞周期负调控子p21的表达，从而阻滞细胞周期［2］，同时可以诱导多种肿瘤细胞的分化和凋亡，但其诱导细胞凋亡的分子机制还不十分清楚。本研究采用HL60细胞为研究模型，探讨SAHA诱导其凋亡的分子机制。

材料和方法

细胞系及培养条件

急性髓性白血病细胞HL60为本室冻存保存株，用含10％灭活胎牛血清及青霉素、链霉素（各100 U／ml）、NaHCO3 (2 g/L)、HEPES (2.4 g/L) 的RPMI 1640 (Gibco BRL)培养液，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养。定期换液传代，取对数生长期细胞用于实验。

试剂

SAHA（suberoylanilide hydroxamic acid）由英国阿斯利康公司提供。MTT（methyl thiazolyl tetrazolium）购自Sigma公司，500 mg粉末溶于100 ml PBS中，过滤分装，-20℃避光保存。抗体acetyleH3、PARP、pAkt、Akt、pmTOR、mTOR、pRaf、pErk、Erk均购自Cell Signaling Technology公司。抗CDK4、Raf1抗体购自Becton Dickinson PharMingen公司。抗p21抗体购自SantaCruz Biotechnology公司。抗βactin抗体购自Oncogene公司。ECL试剂，BCA试剂盒购自PIERCE Biotechnology公司，Laemmli sample buffer 购自BioRad公司。

细胞生长曲线测定

采用台盼蓝排斥实验。将对数生长期HL60细胞以2×104／ml浓度接种于6孔板，设正常对照组及SAHA终浓度为1 μmol/L和2 μmol/L的处理组；于药物作用细胞后1-5天分别取细胞，用0.4%胎盘兰溶液混匀，3分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞数，并计算细胞存活率。

细胞存活率＝［活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）］×100％

细胞存活率测定

采用MTT法，通过酶联仪测量细胞的OD值检测细胞对药物的敏感性。取对数生长期HL60细胞以2×104／ml的密度接种于96孔板，每孔100 μl细胞悬液。SAHA处理浓度分别为0.5、1、2、3、5 μmol/L。每一个药物浓度设3个复孔，分别处理12、24和48小时。每个时相点结束后加0.5% MTT（每孔20 μl），4小时后加入细胞裂解液（每孔100 μl），置培养箱过夜。次日在酶联仪上调节到540 nm波长，以空白对照孔调零，读取各孔OD值。试验重复3次。按下列公式计算细胞生存率。

细胞存活率＝（加药组细胞OD平均值／

正常细胞OD平均值）×100％

细胞形态学观察

取对数生长期HL60细胞，以2×104／ml的密度接种于培养瓶中，加SAHA（2 μmol/L）处理24和48小时。细胞经药物处理后，离心弃培养液，加入PBS混匀。吸取少量细胞悬液（5×104／ml）进行细胞甩片，甲醇固定10分钟后，进行瑞氏姬姆萨染色，在显微镜下观察细胞的形态学变化。细胞经Hoechst33342染色，用荧光显微镜观察细胞是否出现凋亡小体。

细胞周期分析

取对数生长期细胞接种于6孔板，经SAHA（2 μmol/L）处理12、24、48小时后，1 500 ×g离心10分钟，收集细胞。用PBS洗沉淀，离心，收集于1.5 ml EP管中。然后以70％的冷乙醇（含1％FCS的PBS配制）固定过夜，-20℃冰箱保存。次日常温下1 500 ×g离心10分钟后，以PBS洗细胞沉淀。以含RNase A（终浓度200 μg/ml）的PBS 0.5 ml重悬细胞沉淀，37℃水浴30分钟。离心去掉RNA酶。向试管内加入PI染液(终浓度为100 μg/ml，贮存液为10 mg/ml)，室温下避光反应1小时后，上流式细胞仪检测。

蛋白表达的Westernblot检测

将SAHA（2 μmol/L）处理12、24、48小时的HL60细胞10 000 ×g离心5分钟收集起来，加入Laemmli sample buffer（100 μl/1×106个细胞）裂解细胞。置热混匀仪上99℃加热8分钟，冰水浴冷却。然后4℃、10 000 ×g离心10分钟。转移上清至另一无菌EP管内，取适量样品应用BCA试剂盒测量蛋白浓度（具体步骤见试剂说明书）。配制SDS聚丙烯酰胺凝胶，上样前加入5％β巯基乙醇，每个样品上样50 μg蛋白。80 V电压电泳2小时，至溴酚蓝到达凝胶底部。转移蛋白至PVDF膜，80 V电压电泳2小时。将膜置5%脱脂牛奶室温封闭1-2小时，TBS+Tween洗膜3×5分钟。加入5%脱脂牛奶或5％BSA稀释的一抗封闭膜，置4℃摇床过夜。洗膜后再分别与相应的二抗（5%脱脂牛奶稀释）室温孵育1小时，洗膜3次。将等体积混合的ECL化学发光底物A、B液均匀加在PVDF膜上，显色5分钟，X光片曝光3分钟后，将X光片依次进行显影和定影。βactin作为内参对照。

统计学分析

利用SAS 6.0软件对细胞生长抑制实验进行具有一个重复测量的二因素析因设计方差分析。

结

果

SAHA对HL60细胞生长的抑制作用

与未经药物处理的正常对照组相比较，HL60细胞经过不同浓度的SAHA处理后，细胞增殖受到明显抑制（图1）。药物敏感性实验显示，SAHA对细胞的杀伤作用具有时间和剂量依赖性(图2)。SAHA 2 μmol/L作用48小时后对细胞已经达到60％的杀伤效果，故在后续的实验中仅采用2 μmol/L的药物浓度。

SAHA阻断HL60细胞周期并诱导细胞凋亡

流式细胞仪测定结果显示，SAHA作用细胞后12小时 细胞周期明显被阻滞于G0／G1期，表现为G0／G1期细胞比率由对照组的38%增加至85%， 伴有S期细胞数目明显降低。这一结果与SAHA对细胞增殖的抑制作用相一致。SAHA作用48小时，细胞出现subG1峰，提示HL60细胞出现凋亡（图4）。Western blot结果显示，SAHA可明显上调细胞周期检测点的主要负调控因子P21的水平，同时降低CDK4的表达水平（图4），这些分子改变表明细胞周期在G1期的进程受到影响。聚ADP核糖聚合酶（PARP）是caspase 3的底物蛋白，在caspase 3活化的过程中会受到切割，被剪切后的PARP可以作为细胞凋亡的分子标志。图4显示，在SAHA作用48小时后出现PARP剪切后的条带，证实HL60细胞内caspase 3被激活，细胞发生凋亡。

SAHA对HL60细胞组蛋白H3乙酰化的影响

SAHA属于广谱型组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，细胞经SAHA处理后，作为HDAC1和HDAC2底物的组蛋白H3的乙酰化明显增强，在药物作用12小时时最为明显，这说明SAHA对HDAC具有明显的抑制作用(图5)。

SAHA对HL60细胞信号蛋白表达的影响

为探讨SAHA诱导HL60细胞凋亡的分子机制，我们采用Western blot方法，对细胞内两条重要的细胞存活信号转导通路的活化状态进行了测定。结果表明，SAHA对细胞内Akt激酶及其下游的mTOR蛋白磷酸化没有影响，提示HL60细胞经SAHA处理后，PI3K/AKT生存信号通路并没有受到影响。但细胞内另一条重要的信号通路Ras/Raf/Mek/Erk（p44/42 MAPK）被阻断，表现为Raf激酶及Erk激酶的磷酸化受到显著抑制 （图 6） 。 细胞内 p44/42

Figure 6. Effects of SAHA on various cell signal proteins of HL60 cells. The levels of βactin served as the loading control.MAPK信号通路在药物作用后24小时即出现活性降低，至用药后48小时，激酶活性出现明显降低，同期出现细胞凋亡，提示p44/42 MAPK信号通路阻断在介导细胞凋亡中起重要的作用。

讨

论

真核生物染色质的基本单位是核小体，由核心组蛋白（H2A，H2B，H3，H4），H1及DNA组成。核心组蛋白的乙酰化和去乙酰化是基因表达过程中的重要调控方式之一。组蛋白的高度乙酰化是转录活跃的一个标志，而低乙酰化与转录抑制有关。组蛋白的乙酰化多发生在组蛋白的N端碱性氨基酸定赖氨酸残基上。组蛋白乙酰转移酶（HAT）将乙酰辅酶A的乙酰基转移到赖氨酸的氨基端，中和组蛋白所带的正电荷，从而减弱DNA和组蛋白的相互作用，使转录因子易与DNA结合而促进转录。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)则可以移去氨基端的乙酰基，增强DNA和组蛋白的相互作用，从而抑制转录。HAT和HDAC两者之间的动态平衡调节着组蛋白的乙酰化水平［3］。组蛋白乙酰化水平的异常在白血病细胞的发展，增殖和分化中起着很重要的作用［4］。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）是一类新型的抗肿瘤药物。通过抑制HDAC的活性，诱导靶细胞中组蛋白高度乙酰化，由于乙酰化修饰可以改变组蛋白与DNA链间的结合状态，使染色质结构变得疏松，有利于转录因子与DNA链的结合，启动某些特异性基因的表达，从而达到阻断肿瘤细胞的生长［5］。实验表明，HDACi可以在体外有效抑制肿瘤细胞的增殖，在体内可以抑制实体瘤的生长，并能有效抑制肿瘤血管的形成。更为重要的是，它能特异性杀伤肿瘤细胞，并对正常细胞影响较小［6，7］。

本研究采用SAHA处理人HL60白血病细胞。结果表明，SAHA可抑制细胞的生长，阻断细胞周期于G0/G1期，并诱导细胞凋亡。SAHA对细胞周期的调节表现在它可以增强CDK抑制因子P21蛋白的表达。本实验中观察到SAHA作用12小时后P21蛋白的表达即明显增强。增强的P21蛋白表达可以通过抑制cdc2和CDK从而阻断细胞周期在G1期［8］。本实验中也检测到SAHA在增强P21蛋白表达的同时降低CDK4的水平使细胞发生G0/G1期阻滞。近年来，有试验表明P21蛋白同样在细胞的分化和凋亡中发挥作用。如：经细胞分化诱导剂phorbol或bryostatin1处理白血病细胞，或者加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理，再加入CDK的抑制剂flavopiridol后，发现flavopiridol会促进细胞发生凋亡［9，11］。HDACi诱导P21的表达增强，表明CDK抑制因子在HDACi介导的细胞凋亡中同样发挥着重要的作用。

细胞外信号调控细胞生长是通过激活细胞内不同的信号传导途径实现的。PI3K/AKT生存信号通路具有抗凋亡作用，此信号通路的调节紊乱会导致细胞的恶性转化。在本实验中AKT及其下游信号分子mTOR的表达均没有明显改变，表明SAHA处理细胞后并没有影响到此信号通路。MAPK通路是典型的细胞生长调控信号途径，目前发现细胞内有3种家族成员：JNK，P38，ERK1/2。其中Ras/Raf/MEK/ERK通路与肿瘤细胞增殖的关系最为密切，此信号通路被激活后，ERK1/2被磷酸化，转位至细胞核，作用于转录因子（如NFΚb， cmyc等），调控基因的表达，产生不同的生物学效应［12，13］。经SAHA处理细胞后，Raf1和Erk蛋白的磷酸化呈时间依赖性降低，提示SAHA对HL60细胞凋亡的诱导是通过阻断Ras/Raf/MEK/ERK（P44/42 MAPK）信号通路而实现的，而与PI3K/AKT通路并无关联。

近年来有研究表明，HDACi不仅可以使组蛋白发生乙酰化，而且还能够诱导细胞内的非组蛋白发生乙酰化修饰［14］。2002年， Yu等［15］首次发现HDACi可以乙酰化修饰胞内的热休克蛋白90(HSP90)，从而影响其分子伴侣的功能，导致其多种靶蛋白通过泛素蛋白酶体途径降解，进而介导细胞凋亡。最新的研究表明，慢性髓性白血病细胞K562经HDACi（LAQ824，LBH589）处理后，细胞内HSP90发生明显的乙酰化修饰，从而影响了其与靶蛋白BCR/ABL的结合，并介导信号通路中Raf1和Akt的表达下调，进而诱导细胞凋亡［16］。在本实验中，HSP90的底物蛋白Raf1及CDK4蛋白表达降低，提示SAHA可能对HSP90的分子伴侣功能有抑制作用，但同为HSP90底物蛋白的AKT表达水平却并未受影响，因此SAHA是否通过抑制HSP90分子伴侣功能而介导HL60细胞凋亡尚需要更多的实验证实。

【参考文献】

1V M Richon，Y Webb，R Merger，et al. Second generation hybrid polar compounds are potent inducers of transformed cell differentiation. Proc Natl Acad Sci USA，1996; 93:5705-5708

2Astrid A.Ruefli，Michael J.Ausserlechner，David Bernhard，et al. The histone deacetylase inhibitor and chemotherapeutic agent suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) induces a celldeath pathway characterized by cleavage of Bid and production of reactive oxygen species. Proc Natl Acad Sci USA， 2001;98: 10833-10838

3So Hee Kwon， Seong Hoon Ahn， Yong Kee Kim， et al. Apicidin， a histone deacetylase inhibitor， induces apoptosis and Fas/Fas ligand expression in human acute promyelocytic leukemia cells.J Biol Chem， 2002; 277: 2073-2080

4Chambers AE， Banerjee S， Chaplin T， et al. Histone acetylationmediated regulation of genes in leukaemic cells. Eur J Cancer， 2003; 9: 1165-1175

5Ricky W.Johnstone.Histonedeacetylase inhibitors:novel drugs for the treatment of cancer. Nat Rev Drug Discov， 2002; 1: 287-299

6Qiu L， Kelso MJ， Hansen C， et al. Antitumour activity in vitro and in vivo of selective differentiating agents containing hydroxamate. Br J Cancer， 1999; 80: 1252-1258

7Mariadason JM， Corner GA， Augenlicht LH. Genetic reprogramming in pathways of colonic cell maturation induced by short chain fatty acids: comparison with trichostatin A， sulindac， and curcumin and implications for chemoprevention of colon cancer. Cancer Res， 2000; 60: 4561-4572

8María J.Mu?ozAlonso，Juan C.Acosta，Carlos Richard，M..et al. p21Cip1 and p27Kip1 induce distinct cCell cycle effects and differentiation programs in myeloid leukemia cells. J Biol Chem， 2005; 280: 18120-18129

9Cartee L， Wang Z， Decker RH， et al. The cyclindependent kinase inhibitor (CDKI) flavopiridol disrupts phorbol 12myristate 13acetateinduced differentiation and CDKI expression while enhancing apoptosis in human myeloid leukemia cells. Cancer Res， 2001; 61: 2583-2591

10Cartee L， Maggio SC， Smith R， et al. Protein kinase Cdependent activation of the tumor necrosis factor receptormediated extrinsic cell death pathway underlies enhanced apoptosis in human myeloid leukemia cells exposed to bryostatin 1 and flavopiridol. Mol Cancer Ther， 2003;2: 83-93

11Almenara J， Rosato R， Grant S. Synergistic induction of mitochondrial damage and apoptosis in human leukemia cells by flavopiridol and the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA). Leukemia (Baltimore)， 16: 1331-1343， 2002

12Steelman LS， Pohnert SC， Shelton JG， et al. JAK/STAT， Raf/MEK/ERK， PI3K/Akt and BCRABL in cell cycle progression and leukemogenesis. Leukemia， 2004; 18:189-218

13Platanias LC. Map kinase signaling pathways and hematologic malignancies. Blood， 2003; 101: 4667-4679

14Fiona McLaughlin， Nicholas B.La Thangue. Histone deacetylase inhibitors open new doors in cancer therapy. Biochemcal Pharmacology， 2004; 68: 1139-1144

篇10

[关键词] 心肌内基质金属蛋白酶；组织基质金属蛋白酶抑制因子；表达；变化

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）04（a）-0007-03

Changes of Intramyocardial Matrx Metalloproteinases and Tissue Inhibitor of Metalloproteinase Protein Expression

MA Xin-hua

Department of Clinical Laboratory， Heze Multiple Hospital， Heze， Shandong Province， 274000 China

[Abstract] Objective To study the changes of intramyocardial matrx metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression. Methods 20 SD rats in the laboratory in our hospital from January to February 2017 were randomly selected and divided into the Adriamycin group and the control group， the mRNA expression level was measured by the semi-quantitative RT-PCR method， while the protein level was tested by the Western blotting method， and then the effect of adriamycin on the cardiac muscle tissue MMP-2， MMP-9 expression， TIMP-1 and MAPKs activity was analyzed. Results The cardiac muscle tissue MMP-2 and MMP-9mRNA increased affected by the adriamycin， and the cardiac muscle tissue MMP-2 and MMP-9 protein expression level increased under the treatment of adriamycin， and the cardiac muscle tissue TIMP-1mRNA level increased affected by the adriamycin， the cardiac muscle tissue TIMP-1 protein level increased under the treatment of adriamycin， and the cardiac muscle tissue p38MAPK phosphorylation level increased under the treatment of adriamycin， but the ERK and JNK MAPK MAPKs phosphorylation levels did not increase under the treatment of adriamycin，. Conclusion Adriamycin has a direct and deep effect on the intramyocardial matrx metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression， which is worth full attention in clinic.

[Key words] Intramyocardial matrx metalloproteinases； Tissue inhibitor of metalloproteinase protein expression； Expression； Change

心力衰竭儆谝蛔樽酆险鳎在临床极为常见，心室重塑及心肌损伤是其发病及发展的主要机制，极易降低心功能[1]。阿霉素属于一种广谱高效的抗肿瘤药物，在肿瘤的治疗中应用极为广泛，但是由于其毒性会损伤心肌组织，因此其在临床的应用受到了一定程度的限制。充血性心力衰竭的心肌病是其主要的毒性作用，患者具有极差的预后[2]。在对完整的心肌结构进行保持的过程中，细胞外基质发挥着极为重要的作用。基质金属蛋白酶（MMPs）属于一组蛋白水解酶，能够对胞外基质进行降解，在很多组织中存在，如心肌、肝脏、血管等。有MMPs抑制剂及基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）存在于体内。细胞外基质的生成及降解平衡在一些病理生理条件下会随着MMPs及TIMPs表达的改变而改变，引发心肌重构[3]。该研究对2017年1―2月该院实验室的20只SD大鼠的相关资料进行了回顾性分析，探讨了心肌内基质金属蛋白酶及组织基质金属蛋白酶抑制因子表达变化，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取该院实验室的20只SD大鼠，依据随机数字表法将其分为阿霉素组和对照组两组，每组10只，阿霉素组应用5 mg/kg体重阿霉素（批准文号：注册证号 H20130186）+生理盐水对大鼠进行处理，每5天1次，连续应用2次，共10 mg/kg。第1次注射阿霉素+生理盐水2周后开始对大鼠进行乙醚（批准文号：国药准字Z20093680）麻醉，将胸腔打开，将心脏血流抽取出来，同时取出心脏，然后将其浸泡在pH值为7.4的10 mmol/L磷酸钠盐（批准文号：国药准字H201034 72）+生理盐水的PBS溶液中进行清洗，在-80℃的环境中冻存[4]。

1.2 基因表达测定

应用Trizole试剂提取心肌总RNA，应用SuperScript Ⅱ逆转录酶合成cDNAs，应用半定量RT-PCR法测定mRNA表达水平，引物序列具体见表1。

1.3 蛋白质水平检测

运用Western blotting方法对蛋白质水平进行检测，用SDS-PAGE分离心肌组织蛋白，一抗为TIMP-1、MMP-2、MMP-9的抗兔抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗兔lgG，发光底物为ECL检测试剂[5]。

1.4 统计方法

应用SPSS 20.0统计学软件处理该研究所得数据，用单因素方差分析数据，用q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 心肌组织MMP-2、MMP-9表达受到阿霉素的影响

水平半定量RT-PCR检测结果表明，心肌组织MMP-2、MMP-9mRNA在阿霉素的作用下提升，见图1。Western blotting检测也表明，心肌组织MMP-2、MMP-9蛋白表达水平在阿霉素处理的情况下提升，见图2。

2.2 心肌组织TIMP-1表达受到阿霉素的影响

MMP-2、MMP-9最主要的抑制剂为TIMP-1，心肌组织TIMP-1mRNA水平会在阿霉素的作用下提升见图3。Western bolttingz测也表明，心肌组织TIMP-1蛋白水平在阿霉素处理的情况下提升。

2.3 心肌组织丝裂速活化蛋白激酶（MAPKs）活性受到阿霉素的影响

相关医学学者研究表明，MMPs、TIMPs的表达调控中有MAPKs的参与，MAPKs主要分为3类，即ERK、JNK MAPK、p38，其激活的标准为丝/苏氨酸磷酸化。Western boltting检测表明，心肌组织p38MAPK磷酸化水平在阿霉素处理的情况下提升，而ERK、JNK MAPK MAPKs磷酸化水平并没有在阿霉素处理的情况下提升。

3 讨论

相关研究表明，阿霉素产生的大量活性氧自由基直接而深刻地影响着其诱导的心肌毒性[5-7]。在动物模型中，抗氧化剂处理能够对阿霉素诱导的心力衰竭进行明显的缓解。相关医学学者研究表明，细胞内转录因子AP-1会在体内氧化应激状态下提升，进而提升TIMP-1基因表达。目前，临床还没有完全弄清楚活性氧自由基对AP-1的激活机制，可能是自由基将MAPK蛋白激酶首先激活。相关医学学者研究表明，JNK或p38MAPK会磷酸化AP-1的亚基c-Jun，增强其转录活性[8]。该研究结果表明，心肌组织p38MAPK磷酸化水平在阿霉素处理的情况下提升，而ERK、JNK MAPK MAPKs磷酸化水平并没有在阿霉素处理的情况下提升，说明阿霉素提升了p38MAPK蛋白激酶活性。因此，临床普遍认为，TIMP-1表达在阿霉素的作用下提升的分子机制可能为：①阿霉素提升了心肌组织活性氧自由基；②p38MAPK蛋白激活被细胞内信号活性氧自由基的作用下激活；③p38MAPK蛋白激酶磷酸化AP-1的亚基c-Jun等，进而激活该转录因子；④阿霉素提升了AP-1介导的TIMP-1表达。但是，这些假设还没有得到临床的充分验证，需要相关医学学者进行进一步的实验研究来对其进行验证。

综上所述，心肌内基质金属蛋白酶及组织基质金属蛋白酶抑制因子表达受到阿霉素的直接而深刻的影响，值得临床充分重视。

[参考文献]

[1] 高放，张凤梅，李胜水，等.膀胱良、恶性上皮肿瘤中MMP-9的表达及临床意义[J].现代肿瘤医学，2014，22（1）：134-136.

[2] 张金平，孙发林，周大海.膀胱癌中MMP-2及TIMP-2的表达与病理分期和预后的相关性[J].实用医药杂志，2013， 30（5）：391-394.

[3] 叶昶，程帆，祝存海，等.基质金属蛋白酶-9和脆性组氨酸三联体基因在人类膀胱移行细胞癌中的表达及其意义[J].中华实验外科杂志，2013，30（8）：1756-1757.

[4] 余世明，初同伟，廖通权，等.CD147抗体对破骨细胞中基质金属蛋白酶活性影响的体外研究[J].中国免疫学杂志，2012， 10（3）：205-209，216.

[5] 殷寒秋，马华，刘春梅，等.瘦素和基质金属蛋白酶-3与类风湿关节炎骨破坏相关性研究[J].中国免疫学杂志，2013，29 （12）：1285-1287.

[6] 蒯榕，王志荣，彭海霞，等.胃癌超声内镜术前分期与组织中基质金属蛋白酶-2和组织基质金属蛋白酶抑制因子-2表达的关系[J].临床和实验医学杂志，2014（24）：2029-2032.

[7] 阴W宏，马红，王爱民，等.复方861对HSC-T6细胞组织基质金属蛋白酶抑制因子1基因表达的影响[J].中华肝脏病杂志，2002，10（3）：197-199.