热休克蛋白范文

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篇1

【关键词】热休克蛋白70创伤热应激PC12细胞

【中图分类号】Q753 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)03-00-02

Effects of heat shock protein 70 in traumic stress of PC 12 cells

【Abstract】Objective: To investigate the changes of heat shock protein 70 (HSP70) expression levels in neurons in traumic stress. Methods: The expression amounts of HSP70 were determined of PC12 cells using immunocytochemical approach during heat stress. Results: The expression levels of HSP70 increased in heat stress. In the present study, the proliferations of PC 12 cells also increased. Conclusions: High level expressions of HSP70 is one of protective mechanisms in PC 12 cells.

【Key words】Heat shock protein 70;Trauma;Heat stress;PC 12 cells

热休克蛋白 (heat shock proteins,HSP) 70 是一类广泛存在于所有原核和真核细胞内,具有高度保守性的蛋白家族,在正常情况下基础水平表达较低。当生物体受到应激刺激(如热、机械力、缺血、缺氧以及感染等)和其它损伤因素作用而发生应激反应时,就会启动HSPs台成基因,促使HSPs的合成,以对细胞起一定的保护作用[1,2]。本实验探究PC12细胞在热应激状态下表达HSP70的情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PC12细胞为本实验室保存细胞株。HSP70单克隆抗体购自Sigma公司;SABC免疫细胞化学试剂盒由博士德公司提供,台盼兰染液等其它试剂为国产分析纯。

1.2 细胞培养

细胞培养体系为含l0%胎牛血清和双抗的MEM培养基,置于37℃,浓度为5%CO2的培养箱中。上述细胞培养试剂均购自GIBCO公司。

1.3 细胞存活率测定

实验分为热应激组和对照组。PC12细胞依3×104/孔密度接种于96孔板内,待细胞融台成单层后,予以热应激损伤刺激,即置于42℃水浴中20min,然后用培养液清洗三次,以除去脱落细胞;接着更换新鲜培养液在37℃恢复培养3h,用胰酶将细胞消化,台酚兰染色,计算细胞活性。

1.4 免疫细胞化学染色检测HSP70

将PC12细胞按照1×106/孔密度接种于24孔板内的直径为12mm的盖玻片上。PC12细胞融合后,予以热损伤刺激(同前述方法),应用免疫细胞化学方法分析HSP70表达变化。

1.5 统计学方法

热应激损伤组和对照组数据使用SPSS 10.0软件进行方差分析和t检验。

2 结果

PC12细胞为贴壁细胞,呈梭形或多突起形扁平状。一般地,接种24h后即可贴壁;培养48-72h即可达到增殖旺盛状态,形成单层融合。

细胞生存率评价结果显示,热损伤组和对照组PC12细胞生存率分别为90.9±2.7%和93.2±2.4%,实验组细胞存活率略低于对照组,但是,统计学分析两组比较无显著性差异(P>0.05)。

在实验组,热应激刺激后即可见PC12细胞浆内!HSP70表达,其表达一直持续在较高水平,即使当细胞长成单层时,HSP70的表达仍为阳性。与之相比较,对照组PC12细胞接种24h后细胞贴壁、伸展,HSP70表达基本为阴性;48h时细胞增殖旺盛,可见细胞分裂现象,胞浆及胞核内均可见HSP70着色;72h后长成单层细胞,HSP70表达又转为阴性。

3 讨论

作为一种非特异性细胞保护蛋白质,Hsp70主要通过提高细胞对应激原的耐受性、分子伴侣作用以及抗细胞凋亡等途径达到对细胞的保护[3]。近年来,大量研究证实HSP70在哺乳类动物损伤局部迅速诱导产生,对机体有明显的保护作用[4]。采用免疫组化染色可以直接观察细胞和/或组织中HSP70的表达。

生物体在各种损伤后将启动复杂的全身反应,导致机体内一系列特殊应激因子的基因表达,HSP70就是在各种刺激因素作用下细胞内诱导合成的蛋白质。研究报道HSP70在组织细胞损伤的过程中表达增强,并对细胞具有保护作用,同时也能反映细胞损伤的程度[5,6]。细胞内HSP70的表达是当今的研究热点,研究认为细胞外的HSP70在机体的生理和免疫机制上起着主要的作用,其中包括保持自身遗传的高度保守性、免疫应答的调节等。但其作用机制还需进一步的研究。有文献报道,应激时大部分诱导型Hsp70位于细胞核内并包围核仁,恢复后则移人胞浆,另外血液中的单核细胞、神经胶质细胞、动脉血管内皮细胞等能够释放HSP70[7]。

本研究以PC12神经细胞为实验对象,研究热应激损伤对HSP70的影响和作用。实验结果表明在热应激损伤作用下,神经细胞中HSP70作为细胞自我保护机制,HSP70蛋白持续较高水平表达,可能与早期免疫炎性反应及创伤愈合有关。数据显示HSP70的表达变化与细胞和/或组织的增殖活性密切相关。即细胞增殖旺盛时,HSP70表达水平升高。换言之,在创伤的早期,HSP70的表达以炎细胞为主,当细胞/组织转入修复阶段时,HSP70开始在修复的细胞/组织中表达,在细胞/组织增生旺盛时,表达更为强烈;当创伤完全愈合后,HSP70的表达水平逐渐下降。其作用机制有待于在将来工作中从分子水平上深入研究,加以阐述。

4 结论

热休克蛋白是细胞受应激原刺激后诱导产生的一组应激蛋白,一般认为HSP70可以提高细胞的应激能力,抵御各种损害因素的影响,起到保护细胞的作用。研究表明,HSP70在创伤后即开始在神经细胞中持续较高水平表达。

参考文献

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[关键词]热休克蛋白90(HSP90);糖尿病;难愈创面;创面愈合

[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing,ZENG Hai-feng,XIA Wei,LIU Bei,LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army,Xijing Hospitol,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds, causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline, the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline, the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline, the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed, and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test, using SPSS 14.0 software. On the 3th, 5th,7th, 10th, 14th and 21th, we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day, the wound closure rates of the group C(85.9%),D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的难愈创面已成为目前临床治疗的一大难题,研究表明,高糖会抑制人表皮细胞的迁移,从而导致创面上皮化延迟[1-2]。近来,Li.W的研究发现热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)能够有效促进人表皮细胞的迁移[3],而关于其是否能够有效促进糖尿病性难愈创面的研究并未见报道。本实验旨在将HSP90应用于糖尿病性难愈创面,并辅以胰岛素作为参照,以观察不同时期各组创面的愈合程度及创面中HSP90的表达含量。

1材料和方法

1.1动物及分组:选用健康清洁级雄性SD大鼠100只,由第四军医大学动物试验中心提供,体重(200±3)g,分为A、B、C、D、E五组,每组20只。A组为正常创面但不予以任何治疗,即对照组;B组为糖尿病大鼠难愈创面给予空白凡士林药膏治疗组,即空白组;C组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90的凡士林药膏治疗组,即HSP90组(HSP90浓度:1μg/ml);D组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有胰岛素的凡士林药膏治疗组(胰岛素浓度:30μg/ml)E组为糖尿病大鼠难愈创面给予含有HSP90及胰岛素的凡士林药膏治疗组,即联合用药组(E组,HSP90浓度:1μg/ml,胰岛素浓度:30μg/ml)。每组n=(5n1+n2)=20只,共100只大鼠,

1.1.1 构建2型糖尿病难愈创面模型:采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)法诱导2型糖尿病造模。各组提前4周高脂高糖饮食,饥饿12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并维持高脂高糖饮食,并于注射后48h用强生稳步血糖仪检测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),FBG值>16.7mmol/L,体重明显下降(>50g)为造模成功[4]。三天后补注STZ(以10～20mg/kg体重剂量腹腔注射),并测量FBG值。切取全层皮肤暴露肉膜为准后以d=2cm的金属环间断缝合固定于创缘,防止创面挛缩。

1.1.2 给药及分组:A组不涂抹任何药物;B组为空白药膏;C组为含有浓度1μg/ml HSP90的药膏;D组为含有浓度30μg/ml胰岛素的药膏;E组为含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰岛素的药膏。各给药组均以外用涂抹局部给药,药膏均匀覆盖整个创面(约1g/次)为准(含有药物的药膏均委托金花生物制药集团有限公司完成)。HSP90的浓度为我们参考了Li.W试验中用于正常创面的治疗浓度后[3],并以15只糖尿病大鼠给予1μg/ml,5μg/ml,10μg/ml进行了简单的预实验,发现三种浓度的效果并无显著差异,所以取最小浓度。

6941,

2实验过程及观察设计

在创面形成后即时给予难愈创面药物治疗持续2天,A组则不治疗,动物创面予以暴露。创面的固定环会于创面形成后的第10天予以摘除,因为此时皮肤挛缩力量较大,会导致缝合线断裂,为统一标准予以摘除。并创面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天进行大体观察及活体取材做常规病理学观察,在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5个时间点各取n1=3个标本,而在第21天取n2=5个标本,各标本取材时取全层厚皮肤,保留创缘约1～2mm的正常皮肤。

2.1 大体观察指标:分别于用药后第3、5、7、10、14、21 进行大体拍照观察并采用ADOBE photoshop cs4 计算各时期的创面愈合率;

2.2 镜下观察指标:并于3、5、7、10、14、21天取创面标本,3、5、7、10、14天每组各时间点3只,21天时每组5只。皮肤标本剪成横断面,标本均用1%中尔马林固定,石蜡包埋,连续切片,分别进行HE染色、并使用ABC法进行HSP90的免疫组化染色。并采用image pro plus 6.0彩色图像分析系统, 每张切片选取5个有代表性的200倍视野,测量每个标本HSP90阳性表达密度及积分光密度IOD值的均值并记录。

2.3 数据统计:所得试验数据均采用SPSS11。文中数据以均数和标准差(x±s) 表示,并且对创面愈合率采用两个独立样本t检验进行比较。

3实验结果

3.1 大鼠创面愈合率差异比较:各组大鼠在各时间点创面愈合率比较见表1。由表可见,单独使用HSP90(C组)及单独使用胰岛素(D组)均能够提高创面的愈合率(与同期B组相比,P

3.2 各组创面第10天时HSP90的免疫组化对比:见图1～5。由图可见,联合用药组及正常创面对照组创面中,HSP90的阳性表达较为强烈。

3.3 HSP90阳性表达的比较:为更加客观的反应HSP90在创面中的阳性表达状况我们选取平均阳性率及积分光密度作为指标[5-6]。各组大鼠各时间点HSP90平均阳性率(Density Mean,DM)值的比较见图6。各组大鼠各时间点创面中HSP90的平均积分光密度(Identical Optical density,IOD)的比较见图7。

由图6、图7我们发现:①在糖尿病大鼠创面中,HSP90的表达明显下调(同期对照组相比,P

4讨论

美国创面愈合协会的资料显示大约有66%的难愈性创面即使经过6个月的治疗护理仍无法治愈[7],仅处理创面的材料每年就花费90亿美元[8]。糖尿病创面的治疗一直是难题,表皮细胞迁移迟缓也是其发生机制的一个重要特点。 在糖尿病创面的临床治疗中,胰岛素的局部应用的疗效及作用机制均得到了验证,这一方法也成为了临床治疗糖尿病创面的经典方法。而其作用机制主要在于降低创面组织血糖浓度,加快糖尿病创面的新生毛细血管形成,促进上皮细胞的增殖与迁移[9-10]。

2007年DR. Woodley等发现人表皮细胞受到缺氧刺激后,会大量分泌HSP90α,在胞外的HSP90α能够有效促进人表皮细胞的迁移,并将其应用于正常创面,发现HSP90α能够加速创面的再上皮化过程[3,11]。在此之前,人们对于HSP90的关注了解更多的集中在癌症领域,作为重要的分子伴侣,它介导了多条调控细胞增殖、凋亡、迁移的信号通路[12],并保护细胞产生应激反应,抵抗各类损伤带给机体的不可逆性伤害[13]

在本实验中我们主要为了研究HSP90是否能够促进糖尿病性难愈创面的愈合,并观察HSP90在糖尿病性难愈创面中的表达,探索HSP90在创面中的表达是否与创面的愈合速率有关联。我们的研究发现:在大体观察下,①外源性给予糖尿病性难愈创面HSP90,同期的创面愈合率有所提高(与同期空白组相比,P0.05)。仅从大体实验的观察结果我们认为,创面中HSP90的表达与糖尿病难愈创面的愈合是存在相关性的。在镜下观察,我们发现:①糖尿病性难愈创面的高糖微环境明显抑制了HSP90的表达(空白组与同期对照组相比,P

分析结果我们认为,高糖环境会降低HSP90在创面中的表达,减弱HSP90对细胞的保护作用。并且创面中HSP90的表达高低与创面的愈合速率具有相关性。虽然无论是局部给予胰岛素改善高糖微环境,还是局部应用HSP90提高创面中HSP90的表达,均能够提高糖尿病性难愈创面的愈合率,但是我们发现联合应用后糖尿病性难愈创面的愈合效果最好。据此我们认为,胰岛素改善了糖尿病性难愈创面的局部微环境,有利于创面中HSP90的表达提高,进一步局部给予HSP90,提高创面中HSP90的含量,从而激活部分HSP90参与调控的信号通路,提高创面中各类生长因子的表达,促进了糖尿病性难愈创面的愈合。

然而,我们的研究尚属浅显,对于HSP90在糖尿病创面愈合过程中的作用机制也未进行研究。但是,依然为我们寻找糖尿病创面的治疗方向提供了一个具有临床应用意义的思路。下一步,我们会对HSP90在糖尿病性难愈创面的作用机制进行进一步的研究,探索HSP90在糖尿病性难愈创面中所调控的与创面愈合密切相关的生长因子与细胞外基质的变化。并且HSP90的提取目前还很昂贵,所以进一步寻找到其稳定的上游信号分子或寻找一种能够有效且廉价的提取HSP90的方法会成为我们今后的研究方向。

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篇3

【关键词】 热证／中药疗法

摘要：【目的】探讨清热复方对大鼠热休克蛋白70(HSP70)表达的调控作用。【方法】将70只大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组和正常对照组7组，每组10只。采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对热休克模型组、内毒素模型组和正常对照组大鼠的肝、肺组织进行了HSP70 mRNA表达的检测，观察清热复方白虎汤和黄连解毒汤分别对两种模型大鼠肝、肺组织HSP70 mRNA表达的影响。【结果】热休克模型组、热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组中HSP70 mRNA的表达高于正常对照组（P＜005）；热休克加白虎汤组和热休克加黄连解毒汤组均高于热休克模型组（P＜005）；内毒素模型组、内毒素加白虎汤组和内毒素加黄连解毒汤组之间的HSP70 mRNA表达以及与正常对照组相比均无显著性差异（P＞005）。【结论】提示不同因素导致的热证状态下HSP70的基因表达不一致，清热复方可诱导热休克大鼠肝、肺组织中HSP70表达的增加，从而提高细胞的耐受力，避免细胞组织的损伤。

关键词：热证／中药疗法；白虎汤／药理学； 黄连解毒汤／药理学；

热休克蛋白70；疾病模型，动物

生物体在高温或其他因素刺激下会诱导基因开放而合成一组新的蛋白质―热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。许多研究证实整体动物的热处理可预防随后的心、脑、肺、视网膜等损伤，并认为全身热处理对这些器官的保护作用与HSPs的表达有关［1］。HSPs作为分子伴侣，在维持细胞的正常形态及功能中起着重要作用，参与其他蛋白质的折叠、转运、合成等过程，与细胞内的其他肽类蛋白质结合，参与细胞的抗损伤、修复和热耐受过程，其在多种疾病过程中的重要作用已经被大量证据证实。本研究主要采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR）观察白虎汤和黄连解毒汤对热休克、内毒素两种大鼠热证模型的HSP70基因表达的调控，以探讨清热解毒中药对HSP70表达的影响。

1 材料与方法

11 研究对象

清洁级健康雄性SD大鼠70只，体重(200±10)g，由中山医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：2696001。

12 药物与试剂

药物：白虎汤(石膏30g、粳米9g、知母9g、甘草3g)，每剂水煎浓缩至50mL，相当于生药1g/mL；黄连解毒汤(黄连9g、黄芩6g、黄柏6g、栀子9g)，每剂水煎浓缩至30mL，相当于生药1g/mL，4℃保存备用。

主要试剂：总RNA提取试剂盒和逆转录PCR反应试剂盒(大连宝生物工程有限公司提供)；RTPCR引物(Canada，Stress Gen Corp，STM507);βaction引物(上海生工生物工程公司提供)；DL2000 DNA Marker(大连宝生物工程有限公司提供)。

13 主要仪器

TGL16G型台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNA／RNA纯度检测仪(Gene Quant American Pharmacia Biotech Corp)；PE9600型PCR扩增仪(American Perkin Corp)；EDAS120电泳凝胶图象分析系统(American Kodak Corp)。

14　动物分组及处理

70只雄性SD大鼠随机分为热休克模型组、热休克加白虎汤组、热休克加黄连解毒汤组、内毒素模型组、内毒素加白虎汤组、内毒素加黄连解毒汤组、正常对照组7组，每组10只。

141 热休克组大鼠模型的制备与处理

将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后进行第2次灌胃，再经1h将大鼠置恒温烤箱中进行热休克处理，参考Cruiie方法［2］，温度控制在约55℃，测量大鼠肛温达到42℃，维持10～15min，密切观察大鼠动态，大鼠出现烦躁、乱窜动、毛发竖立、爪底湿润后，断头处死，取肺、肝组织备用。

142 内毒素组大鼠模型的制备与处理

将大鼠按不同组别分别用生理盐水、白虎汤、黄连解毒汤灌胃(100g/kg)，1h后于尾静脉注射内毒素(15mg/kg)，1h后再重复灌胃，3h后观察大鼠出现烦躁、乱窜动后，断头处死，取肺、肝组织备用。

143 正常对照组

生理盐水灌胃，不经其他任何处理，断头处死，取其肝、肺组织备用。

15 实验方法

采用RTPCR法检测各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA的表达。

βaction引物序列：Sense Primer 5′ ACCACAGTCCATGCCATCAC 3′；Antisense Primer 5′ TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3′。

HSP70引物序列：Sense Primer 5′ CTCCAGCATCCGACAAGAAGC 3′；Antisense Primer 5′ ACGGTGTTGTGGGGGTTCAGG 3′。

βaction扩增片段长度为450个碱基对(base pair，bp)，HSP70扩增片段长度为234bp。

RTPCR反应体系组成：MgCl2 60μL，10×RNA　PCR　Buffer 80μL，TaKaRa LA Taq05μL，HSP70上下游引物各1μL，βaction上下游引物各1μL，Rnase Free dH2O 615μL，总反应体积为80μL。PCR扩增反应条件为：前预变性94℃ 2min，1个循环；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共28个循环；后延伸15min。取出反应液约10μL，在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴乙锭染色，将电泳结果置于EDAS120电泳凝胶图象分析系统内扫描并摄片。采用Gelbase电脑软件对HSP70 DNA与βaction DNA条带进行光密度扫描，计算HSP70 DNA和βaction DNA吸收峰面积之比，即D值，以此估计HSP70 mRNA的表达情况。

16 统计学处理

用SPSS100软件进行多组间两两比较。

2 结果

各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA转录水平的比较结果见表1。表1 各组大鼠肝、肺组织中HSP70 mRNA转录水平（略）

结果显示，热休克各组与内毒素各组大鼠的肝、肺组织中HSP70 mRNA表达不同，热休克各组HSP70 mRNA表达均比正常对照组高（均P＜005），而内毒素各组的表达与正常对照组相比均无显著性差异（P＞005）。说明热刺激(热休克)比致热源更容易刺激细胞组织合成热休克蛋白，从而增加对组织细胞的耐热性和保护作用。热休克加白虎汤组及热休克加黄连解毒汤组的HSP70 mRNA的表达高于热休克模型组（P＜005）；热休克加黄连解毒汤组大鼠在肝、肺组织中HSP70的表达与热休克加白虎汤组相比有显著性差异（P＜005）。表明白虎汤和黄连解毒汤均能诱导HSP70表达的增加，从而增强对肝、肺组织的保护作用。相比之下，白虎汤较黄连解毒汤在肝、肺组织中更能诱导HSP70的表达。内毒素模型各组HSP70的表达与对照组相比差异无显著性（P＞005），内毒素模型各组之间HSP70的表达亦无显著性差异（P＞005）。表明给大鼠静脉注射内毒素不能诱导HSP70表达的增加，中药清热复方亦不能诱导内毒素模型组中HSP70表达的增多，提示内毒素导致的炎性发热不能刺激组织细胞合成对细胞有保护作用的HSP70。

3 讨论

一切生物在受到高温、缺氧、感染、创伤及乙醇等因素的刺激时，会发生细胞应答反应，其共同特点是产生一组具有生物活性的蛋白――热休克蛋白。HSPs是一组高度保守的伴随细胞蛋白，可使细胞非特异性抗损伤能力增加，能对抗更为严重的应激损伤。HSPs与一些基本的细胞功能有关，如蛋白转运、折叠和装配，是存在于细胞内的一种主要“分子伴侣”，在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面有重要作用，对细胞抗御外界损伤具有保护作用，在生理和应激条件下均能表达。据报道，热休克时细胞中许多编码正常功能蛋白质的基因关闭，使大部分蛋白质的合成受抑制，而热休克基因被开启，HSPs合成增加［3］。自20世纪70年代以来，按照分子量的大小HSPs有HSP90、HSP70、HSP60及小分子HSP等家族，其中HSP70是目前国内外研究较多的，也是最重要的一类热休克蛋白。

目前认为HSP70有多种功能，是一种非特异性保护蛋白，人体在高温及各种有害因素刺激下，HSP70合成明显增加，以提高机体耐热和抗病毒能力，其广泛的生理和病理作用已成为当今生命科学研究的热点［4］。王燕如等［5］采用Western印迹法发现热休克预处理使肺泡巨噬细胞(PAMs)中HSP70 mRNA表达增多，且获得抵抗H2O2损伤的能力；用放射菌酮和放射菌素D分别从蛋白合成及基因转录水平阻断热休克基因的表达，能取消热休克对H2O2所致PAMs损伤的保护作用。李国成等［6］发现其自制健脾益气方能诱导大鼠提高HSPs的表达，防止胃粘膜损伤，促进溃疡的愈合，认为HSPs可能介导胃粘膜防御。

本研究结果表明，不同因素导致的热证状态下HSP70的基因表达是不一致的，热休克反应更类似中医所说的“阳明气分热盛证”，其表达的增强是细胞保护作用的体现，而白虎汤诱导其表达的进一步增强，一方面从HSP70的角度阐明了白虎汤对“实热证”的治疗效应；另一方面更证实了中医辨证论治的正确性。

参考文献：

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［4］Linquise S，Craig E A.The heat shock proteins［J］．Annu Rev Genet，1998，22:631.

篇4

【关键词】 α-突触核蛋白;热休克蛋白70;过表达

α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现，α-突触核蛋白基因过表达或突变可引起α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。HSP70是分子伴侣家族中的一员，作为一种重要的应激蛋白，能与　错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1，2〕。在果蝇及酵母的PD模型中发现，HSP70能减轻α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3，4〕，而HSP70抑制α-突触核蛋白毒性可能与其能够与α-突触核蛋白相互作用，阻止α-突触核蛋白纤维样聚集，降低α-突触核蛋白表达量有关〔5，6〕。为进一步证实HSP70在α-突触核蛋白所致PD的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过降低α-突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。

1材料与方法

1.1实验材料SH-SY5Y细胞购自ATCC公司;限制性内切酶购自Takara公司;QIAprep TIP100 Kit购自QIAGEN公司;人胎脑cDNA文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;蛋白酶抑制剂cocktail购自Sigma公司;anti-α-synuclein 204抗体、anti-beta-actin抗体购自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司。

1.2方法

1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板，PCR获得α-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中，通过overlap PCR方法，构建A53T突变体，同样以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中。按照QlAprep TIP100 Kit Protocol抽取并纯化质粒，测序证实。pCDNA3.1-HSP70质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。

1.2.2细胞培养与转染SH-SY5Y细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养液，置于37℃，5%CO2的培养箱培养。转染严格按照Lipofectamine2000说明书进行。用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞2次，24孔细胞培养板每孔加入含2 μl Lipofectamine2000及0.8 μg质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基500 μl，在37℃，5%CO2的培养箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM培养基继续孵育48 h。

1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5Y细胞接种到有盖玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培养于37℃、5% CO2培养箱中36 h后，弃去培养基，3.7%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)室温下固定15 min。PBS洗2次，每次5 min。0.2%的TritonX-100/PBS透化10 min，PBS洗2次，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温封闭30 min。加入1∶400稀释的anti-α-synuclein204一抗室温孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。5%BSA封闭液，室温封闭20 min。加入1∶200稀释的anti-鼠IgG-Cy2二抗100 μl，避光室温下孵育60 min。1×PBS洗3次，每次5 min。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，室温，避光反应2 min。PBS洗2次，每次5 min。去离子水洗1次，封片，用激光共聚焦显微镜扫描和照相。

1.2.4免疫印迹取细胞，吸去培养基，加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCl，20% Glycerol，4% SDS，0.1% bromphenol blue，pH 6.8)加入蛋白酶抑制剂cocktail裂解细胞，超声后，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。均取20 μg总蛋白经18% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应一抗，4℃过夜，Tris缓冲生理盐水溶液(TBST)洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜后，电化学发光免疫分析法(ECL)发光，曝光。内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。

1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5Y细胞密度约5×104/ml，以100 μl/孔接种于96孔板，24 h后分别转染pCDNA

3.1+HSP70;α-突触核蛋白野生型+ pCDNA3.1;α-突触核蛋白野生型+HSP70;α-突触核蛋白A53T+pCDNA3.1;α-突触核蛋白A53T+HSP70;每种处理设3个复孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养4 h。弃培养基，每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl振荡混匀，待颗粒溶解后置于酶标仪上，空白孔调零，以570 nm波长检测各孔吸光度值。

1.3统计学分析利用SPSS11.5软件进行统计分析，用t检验进行两组间差异比较。

2结果

2.1PD细胞模型的构建α-突触核蛋白野生型和突变型A53T在转染SH-SY5Y细胞后，胞浆和胞核都有分布，以胞浆分布为主，部分细胞α-突触核蛋白呈点状分布，可能为其聚集体。免疫印迹也显示，SH-SY5Y细胞中α-突触核蛋白野生型和突变型A53T都得到了过表达，说明PD细胞模型构建成功。见图1A、B。

2.2HSP70对PD细胞模型中α-突触核蛋白的影响了探讨HSP70对PD细胞模型中过表达的α-突触核蛋白的作用，将HSP70与α-突触核蛋白进行了共转染，通过免疫印迹检测HSP70对α-突触核蛋白表达的影响。结果显示，无论是在α-突触核蛋白野生型还是突变型PD细胞模型中，HSP70均能降低α-突触核蛋白的表达。见图2。A：免疫荧光检测α-syunclein 野生型(左图)与A53T突变体(右图)在SH-SY5Y中的表达。一抗为anti α-syunclein 鼠单克隆抗体，二抗为cy2标记的anti mouse IgG抗体。蓝色为DAPI染色的细胞核。B：western印迹检测α-syunclein在SH-SY5Y中的表达。一抗为anti α-syunclein 鼠单克隆抗体，二抗为HRP标记的anti mouse IgG抗体。内参为细胞骨架蛋白beta actin。图1α-syunclein过表达PD模型的建立Western印迹检测α-syunclein与HSP70共转染后，HSP70对α-syunclein 野生型和突变性表达量的影响。一抗为anti α-syunclein 鼠单克隆抗体，antiHSP70单克隆抗体，二抗为HRP标记的anti mouse IgG抗体。内参为细胞骨架蛋白β-actin。图2HSP70降低α-synuclein的表达量

2.3HSP70对PD细胞模型活力的影响转染野生型和突变体α-突触核蛋白后，SH-SY5Y细胞活性明显降低，说明α-突触核蛋白对SH-SY5Y具有毒性作用，PD细胞模型建立成功。而增加HSP70的表达后，对比α-突触核蛋白野生型(α-synuclein WT)+ pCDNA3.1组和α-突触核蛋白突变型(α-synucleinA53T)+pCDNA3.1组，表达HSP70能分别提高α-synuclein WT和α-synuclein A53T引起的细胞活性降低(P

3讨论

α-突触核蛋白是一种分布于中枢神经系统突触前末梢，约15~20 kD的可溶性蛋白质。自然状态下呈一种非折叠构象，不形成明显的三维结构，但其N末端2/3的序列可以形成一系列双极性区域，可能介导其与膜结构的结合;当高浓度或异常修饰时，构象改变形成寡聚体甚至是聚集体，具有细胞毒性〔7，8〕。与单体不同，这类寡聚体富含8片层结构，在原子力显微镜及电镜下，可以观察到这类寡聚体形成过程中，一般先呈包含20～30个α-突触核蛋白分子的圆状结构;随后因彼此聚合形成链状结构，最终转化为稳定的纤维状结构。这种由单体向纤维状结构的改变，可能是α-突触核蛋白产生毒性作用的重要原因〔5，10〕。研究进一步发现，与家族性PD有关的α-突触核蛋白 A53T及A30P突变蛋白在体外均可以促进寡聚体的形成，同时，野生型α-突触核蛋白的过量表达也可以导致寡聚体的增加〔11，12〕。当机体无法处理有毒的α-突触核蛋白中间体时，可能会导致α-突触核蛋白形成聚集体，最终导致PD的发生〔11，13，14〕。

分子伴侣作为一类介导协助蛋白形成与维持天然构象的重要细胞因子，在α-突触核蛋白蛋白结构状态转换过程中可能发挥着很重要的调控作用。实验表明，路易小体中除α-突触核蛋白外，还含有其他蛋白质，而HSP是其中重要的蛋白之一〔15〕。当α-突触核蛋白本身结构的改变或分子伴侣、降解系统出现异常时，α-突触核蛋白的毒性作用就体现出来了。在模型动物的研究中发现，分子伴侣(HSP70、HSP40)的表达可减轻α-突触核蛋白的细胞毒性。譬如，在PD果蝇模型中，HSP70的表达可以减轻或阻止α-突触核蛋白引起的神经元损伤;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地减缓或抑制PD的发生〔3，4〕。因此，分子伴侣蛋白可能通过协助α-突触核蛋白形成并维持正确构象而防止其聚集产生有毒害作用的聚集体。本研究中，利用α-突触核蛋白过表达细胞模型发现，过表达HSP70后能使PD细胞活性增加，说明HSP70对PD细胞模型具有保护作用。过表达HSP70后，α-突触核蛋白的表达量也降低，而目前已知α-突触核蛋白是导致PD发生的重要因素〔11，13，14〕，因此认为HSP70对PD细胞模型的保护作用是通过减少α-突触核蛋白的表达量的表达量而实现的。由于

α-突触核蛋白的细胞毒性作用与其由单体向寡聚体转化有关〔9，10〕，因此推测，HSP70可能通过参与维持α-突触核蛋白的正确构象，减少其向有毒的寡聚体和聚集体状态进行转化，减少细胞的毒性作用。

参考文献

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6Dedmon MM，Christodoulou J，Wilson MR，et al.Heat shock protein 70 inhibitsalpha-synuclein fibril formation via preferential binding to prefibrillar species〔J〕.J Biol Chem，2005;280(15):14733-40.

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13Spillantini MG，Goedert M.The alpha-synucleinopathies：Parkinson′s disease，dementia with lewy bodies，and multiple system atrophy〔J〕. Ann N Y Acad Sci，2000;920:16-27.

篇5

目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体，为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAdHSP70，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定， RTPCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体，并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒；荧光显微镜下可观察到GFP的表达，收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L。结论 成功构建pAdHSP70重组腺病毒表达载体，且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。

【关键词】 HSP70热休克蛋白质类 腺病毒科 遗传载体

［ABSTRACT］ Objective To construct recombinant adenovirus expression vector containning human HSP70 and provide a base for investigating the protection of HSP70 on the cellunder stringent state. Methods The recombinant adenovirus vector pAdHSP70 carrying HSP70 was constructed with AdEasy system and then transfected 293 cells to produce recombinant adenovirus vAdHSP70. The viral titer was tested. The expression of target gene in Hela was tested by RTPCR. Results It was confirmed by PCR， sequencing identification and restrictive analysis that the target gene was cloned correctly to the shuttle plasmid. The expression of GFP could be observed by fluorescence microscope. The viral titer was 3.2×1012 U/L， and RTPCR indicated that HSP70 could effectively express in Hela. Conclusion Recombinant adenovirus vector was constructed successfully and packed in 293 cells.

［KEY WORDS］ HSP70 heatshock proteins; Adenoviridae; Genetic vectors

热休克蛋白70（HSP70）是一组高度保守的蛋白，作为一种重要的应激蛋白，HSP70可参与应激状态下细胞内蛋白的正确折叠、移位以及降解等，从而维持细胞的正常形态及功能，保证细胞的稳定性。研究结果表明，HSP70在正常情况下表达水平很低或不表达，而在应激状态下细胞内热休克蛋白编码基因被激活，表现为表达上调。本研究旨在将外源性HSP70编码基因插入含GFP标记基因的腺病毒载体中构建重组腺病毒载体，经293细胞包装获得可高效转录表达HSP70的重组腺病毒，为探讨外源性HSP70表达对应激状态下靶细胞的保护作用提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料

逆转录试剂盒购自美国Promega公司，限制性核酸内切酶PacⅠ和PmeⅠ为英国NEB公司产品；DNA Marker、限制性内切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4 DNA连接酶、pMD18T载体为大连宝生物工程公司产品；TRIzol购自美国Invitrogen公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1，大肠杆菌JM109、BJ5183和 DH10B以及人宫颈癌细胞系Hela和人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物学教研室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取及逆转录合成cDNA Hela细胞用含体积分数0.10的胎牛血清、105 μg/L 链霉素、105 U/L青霉素的DMEM于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。当细胞达80%汇合后，42 ℃水浴30 min，然后迅速放回培养箱中继续培养8 h，胰蛋白酶消化离心收集细胞，采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNA 。

1.2.2 目的基因的PCR扩增及TA克隆 根据GenBank中编码HSP70的核苷酸序列及pAdTrack　CMV载体的多克隆位点，采用Primier 5.0软件设计扩增HSP70基因的特异性引物。并分别在两条引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位点以及保护性碱基。上游引物序列为：5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′，下游引物序列为：5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′，下划线部分为引入的酶切位点。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，扩增片段长度为1 486 bp。反应体系为：10×buffer 2.5 μL， MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物各0.3 mmol/L，Taq 1 U， cDNA 2 μL，无菌去离子水补至25 μL。扩增条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环； 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物于1 g/L的琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L溴化乙锭）中电泳，凝胶自动成像系统分析结果。

自琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因，然后与PMD18T载体在连接酶的作用下进行连接，将连接产物以1×TSS 两步法转化E.coli JM109，涂布于氨卞抗性的LB平板，37 ℃过夜培养。次日挑取平板克隆振荡培养后提取质粒，KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆，产物送上海生工生物技术有限服务公司测序。

1.2.3 穿梭载体pAdTrackCMVHSP70的构建 测序确证序列正确无误后，分别用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切目的基因片段和穿梭载体pAdTrackCMV，并在T4 DNA连接酶作用下以摩尔比1∶3进行连接。将连接产物全部转化已准备好的感受态细菌JM109，取转化菌涂布于含卡那抗性的LB琼脂平板，37 ℃培养14～16 h。然后，从转化菌平板上挑取若干个生长良好的单个菌落接种至5 mL含卡那霉素的LB 培养液中，37 ℃振荡培养16～24 h，取1.5 mL培养液用碱裂解法小量提取质粒。将所提质粒使用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ进行双酶切电泳鉴定，阳性克隆命名为pAdTrackCMVHSP70。

1.2.4 重组腺病毒载体AdHSP70的构建 将pAdTrackCMVHSP70线性化和去磷酸化，随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。自平板挑取较小克隆转入卡那抗性LB培养液中振荡培养16 h，采用碱裂解法小量提取质粒，进行PacⅠ酶切鉴定，鉴定为阳性者命名为pAdHSP70。

1.2.5 293细胞包装腺病毒和重组腺病毒滴度测定 QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化AdHSP70后，用PacⅠ酶切线性化，脂质体法转染对数生长期的293细胞包装重组腺病毒，同期制备载体对照。用本原正阳公司快速腺病毒感染滴度（TCID50）检测试剂盒测定所获腺病毒滴度，操作按说明书进行，并计算病毒滴度。计算公式：病毒滴度=101+d(s+0.5)×103U/L， d=log10稀释度，s=阳性比率之和。

1.2.6 病毒感染靶细胞后RTPCR检测目的基因 取100 μL重组腺病毒液感染Hela细胞，3 d后约90%的细胞观察到绿色荧光时收集细胞， TRIzol一步法提取细胞总RNA，所获RNA加DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA，应用RTPCR检测目的基因mRNA的表达。并取5 μL DNaseⅠ消化处理的RNA直接作为模板进行PCR作为对照，以确定是否有DNA污染。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 HSP70编码基因的PCR扩增及pAdTrackCMVHSP70的酶切鉴定

采用RTPCR自热刺激Hela细胞扩增HSP70编码序列cDNA，可在约1 486 bp处观察到特异性扩增条带，与理论预计值相符且测序后与GenBank报道的HSP70编码序列完全一致。见图1。内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切重组质粒pAdTrackCMVHSP70，电泳后可观察到长约9.2 kb的载体片段和长1 486 bp的目的基因片段，表明目的基因片段成功插入表达载体。

2.2 重组腺病毒载体pAdHSP70的鉴定

重组腺病毒载体pAdHSP70经限制性内切酶PacⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳可观察到长4.5 kb和30 kb左右的两条带，结果提示穿梭质粒pAdTrackCMVHSP70和骨架质粒pAdEasy1的重组发生在ori与右臂之间。见图2。

2.3 重组腺病毒的包装

质粒pAdHSP70经PacⅠ酶切线性化后，用脂质体法转染293细胞，转染48 h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光，表明质粒转染成功，外源基因开始表达。之后表达绿色荧光蛋白的细胞数目逐渐增多，转染后5 d达高峰，细胞开始变圆、脱落，第7～9天约90%的细胞表达荧光蛋白时收获细胞，反复冻融3次后离心除去细胞碎片，取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒，24 h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多，说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3～4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒，所获病毒命名为vAdHSP70，经检测病毒滴度为3.2×1012 U/L。

2.4 RTPCR检测

提取经重组腺病毒感染的Hela细胞总RNA经RTPCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后可明显观察到特异性长为1 486 bp大小的片段，而未感染腺病毒和热应激处理后的Hela细胞此条带相对较弱。见图3。

图1 目的基因的RTPCR扩增及重组质粒pAdTrackCMVHSP70的双酶切分析（略）

①Marker DL15000;②HSP70 mRNA RTPCR产物;③pAdTrackCMVHSP70 PCR 产物s;④pAdTrackCMVHSP70/KpnⅠ与EcoRⅤ酶切产物;⑤pAdTrackCMVHSP70

图2 同源重组质粒的PacⅠ酶切鉴定（略）

①Marker DL2000;②AdHSP70 PCR产物；③pAdTrackCMVHSP70/PacⅠ酶切产物;④AdHSP70/PacⅠ酶切产物；⑤AdHSP70；⑥Marker DL15000

图3 RTPCR检测Hela细胞中HSP70的表达（略）

①Marker DL2000；②vAdHSP70感染Hela细胞；③未感染腺病毒和热应激处理的Hela细胞；④Hela细胞对照

3 讨论

生物体在受到周围环境刺激或不良因素影响时，会产生一系列为适应环境变化而做出的快速细胞代谢调节。在这期间，细胞内某些正常基因的表达受到抑制，而另外一些特殊的基因则被激活，表现为表达上调，其中热休克蛋白就是这类特殊的基因。迄今为止，已发现30余种热休克蛋白，根据同源性和相对分子质量大小，可将其分为HSP70、HSP90、HSP60、小分子HSP以及泛素等[1]。其中HSP70是热休克蛋白家族中含量最多也是最保守的一类。

研究发现，HSP70具有明显增强应激状态下细胞对损害的耐受程度、维持细胞正常功能代谢和提高细胞生存率等作用[2]。DONNELLY等[3]研究结果表明，HSP70在心肌细胞的过量表达是提高心肌对缺血再灌注耐受性的重要途径之一。KINOUCHI等[4]用免疫组化法检测大鼠大脑中动脉阻断后HSP70蛋白的表达，研究结果显示HSP70 蛋白在梗死灶周围神经元，即缺血半影区大量表达。MATSUYAMA等[5]和SAKURAI等[6]将缺血预处理分别用于狗和兔的脊髓缺血性损伤保护作用的实验研究，他们在脊髓缺血前48 h进行缺血预处理，发现脊髓缺血后HSP70的表达增强而且表达时间延长，因而减少随后的脊髓缺血造成的损伤。在这诸多研究中，大多采用热诱导、缺血预处理等方法来诱导内源性HSP70的表达，以证明其保护作用。这种方法简单、直接，但是仍存在一些弊端。因为实验过程中，在对机体给予热刺激或者缺血预处理等的同时，除HSP70基因水平的升高以外，其他基因的表达也会不同程度地受到影响。相对而言，利用分子生物学技术将携带外源性HSP70基因的载体导入特定细胞，使其在细胞内稳定表达，能够更加客观地研究HSP70在应激状态下对靶细胞的保护作用。因此，如何大量获取外源性HSP70基因和选择高效、安全的载体就显得格外重要。

HSP70普遍存在于所有真核和原核生物体中，但表达量很低。而在机体处于应激状态，包括热应激，化学物质（氧自由基、乙醇等）刺激，缺血低氧，感染以及严重创伤等时表达量明显增加[7～9]。而在这些应激中，热应激是诱导HSP70大量表达的最重要因素。研究报道，虽然肿瘤细胞内HSP70的表达高于正常细胞，但含量仍然较低，将其在热疗等应激条件下处理后HSP70产生明显增多[10]。而对于不同温度诱导引起HSP70表达量的差异，VAN等[11]报道，较激烈的热诱导（43 ℃）作用于肿瘤细胞仅有少量HSP70蛋白表达，而较缓和热诱导（42 ℃），可于诱导后8 h出现且持续高水平表达的HSP70蛋白，激烈的热休克刺激(45 ℃)可导致肿瘤细胞来不及合成HSP70，以致死亡。在本实验中我们从温热休克处理后8 h人宫颈癌细胞系Hela中提取外源性HSP70 mRNA作为模板进行扩增，结果显示扩增后目的基因与理论预计值相符，经测序与GenBank中的序列一致。同时，我们选择了宿主范围广、包装容量大，对人致病性低、滴度高，在增殖和非增殖细胞中均感染和表达基因且与人类基因同源的腺病毒作为载体[12]，并通过AdEasy系统与骨架质粒pAdEasy1在大肠杆菌内同源重组而获得重组腺病毒载体[13]。

本实验成功构建了携带外源性HSP70基因的重组腺病毒表达载体，并在293细胞中包装获得重组腺病毒vAdHSP70，应用RTPCR鉴定结果表明，vAdHSP70重组腺病毒可在靶细胞中高效转录。从而为进一步研究HSP70对应激状态下的细胞保护作用及其在临床治疗和诊断中的应用奠定了实验基础。

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篇6

[关键词]热休克蛋白质 视网膜神经节细胞 高眼压 热耐受 免疫组化

热休克蛋白(heal shock protein，HSP)是一组所有的细胞能在应激情况下由热休克基因所编码合成的序列高度保守的伴随细胞蛋白，并能对抗更为严重的应激损伤，这种现象称为热休克反应(heat shock response，HSR)[1]。目前认为热休克反应是细胞对各种不利因素刺激所表现的一种以基因表达和调控方面发生改变的反应。目前的研究发现高温、缺氧、再灌注局部损伤或感染等多种有害因素刺激均可产生热休克蛋白[2]。

HSP通常按分子量大小进行分类，主要有HSP70、HSP90、HSP60以及小分子HSP[3]。在HSP家族中，HSP70与神经保护有着最为密切的联系。研究发现高热诱导HSP合成后具有保护光感受器免受光损害的作用[4]。而热耐受是否可以提高在体眼急性高眼压视网膜HSP70的表达而减少组织细胞的损伤，目前尚未见报道。为此，本研究在眼急性高眼压动物模型建立的基础上，研究眼急性高眼压后视网膜HSP70的动态表达情况以及热耐受后对在体眼急性高眼压视网膜HSP70表达的调节，为急性青光眼的药物防治提供相关理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

60只清洁级Sprague―Dawley(SD)大鼠，鼠龄2～3周，雌雄不限，体重50～100g。实验前散瞳并行裂隙灯显微镜检查排除角膜病、葡萄膜疾病、晶状体及玻璃体等疾病。

1.2 主要试剂与仪器

兔抗鼠HSP70单克隆抗体(浓缩型)，S-P超敏免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物

(1)分组：56只SD大鼠随机随机分为2组，分别为高眼压组、水浴+高眼压组。每组28只，右眼为实验眼。①高眼压组组：28只，随机分成7个亚组，每组4只。分别为：A：不予高眼压立即取材组；B：高眼压后立即取材组；C：高眼压后2 h取材组；D：高眼压后4 h取材组；E：高眼压后12 h取材组；F：高眼压后24 h取材组；G：高眼压后36h取材组。②水浴+高眼压组：28只，随机分成7个亚组，每组4只。分别为：A：水浴后立即取材组；B：水浴+高眼压后立即取材组；C：水浴+高眼压后2 h取材组；D：水浴+高眼压后4 h取材组；E：水浴+高眼压后12 h取材组；F：水浴+高眼压后24 h取材组；G：水浴+高眼压后36 h取材组。 (2) 急性高眼压模型制作方法及水浴方法：急性高眼压模型按贾莉君等[5]介绍的方法，具体步骤如下：大鼠予10％水合氯醛3mg／kg体重腹腔内注射麻醉后固定在鼠用立体定位仪上，用4号半一次性输液针头作右眼前房穿刺，经一次性消毒输液器连接乳酸钠林格氏液输液瓶，将液面高度调整至距实验眼水平面1387mm，使之产牛102 mmHg静水压，在大鼠右眼前房内持续加压灌注，2 h后拨出针头，大鼠自行苏醒。水浴时将SD大鼠麻醉后置于45℃ 恒温水中，肛温表测量其直肠温度达40.5～41.5℃ ，维持10 min，常温下置放3 h后制高眼压模型。

1.3.2 取材和切片

戊巴比妥钠按35mg/kg 行大鼠腹腔注射，待大鼠深度麻醉后，将大鼠固定于手术台上。剪开大鼠胸部皮肤及胸廓组织后，暴露出心脏，剪开左心室尖，插入供灌注用的9号灌注针头至升主动脉，止血钳夹闭主动脉并固定灌注针头，先用生理盐水l00mL以40mL/min 速度推注，后快速推注40g/L的多聚甲醛200mL左右(防止视网膜神经节细胞变性)，直到大鼠全身僵硬。完整取出大鼠的左右眼球，分别放入40g/L 的多聚甲醛中，30min后用前房穿刺刀穿刺前房，2h后将角膜、晶状体剔去(大鼠的玻璃体极少)制成眼杯，再将眼杯继续固定4～6h，取出眼杯后依次梯度洒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，同一标本连续切出3～4张厚度为5um的切片，免疫组化使用。

1.3.3 免疫组化染色

石蜡切片常规脱蜡、水化；加3％ H2O2室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；加1：100稀释的HSP70单克隆一抗，阴性对照用PBS代替一抗，37℃温育30min；加聚合物增强剂室温下孵育20 min；加酶标抗鼠／兔聚合物，室温下孵育30min；加新鲜配制的DAB显色液显色3～10min，显微镜下控制显色时间，自来水充分冲洗，苏木素复染40s，lg/L 盐酸酒精分化2s，自来水冲洗返蓝l5min；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3.4 免疫组化结果判定

光镜下观察胞浆或胞核内呈现不同程度的棕黄色粗大颗粒反应者为抗HSP70抗体染色阳性细胞，反之染色阴性。每份标本取一张未复染切片，每张切片随机取3个视野，应用LeicaQ5OOMC图像分析仪对阳性反应部位进行平均灰度和面密度分析。灰度值采用Median(QR)表示，记录相应数据，取平均值作为该标本的结果，结果进行统计分析。

1.4 统计学分析方法

实验中HSP70表达强度的统计数据采用SPSS 13.0软件进行分析 。对两实验组(高眼压组和水浴＋高眼压组)间、两组的A-F亚组结果之间的比较采用两因素析因方差分析(即组别、时段两因素)，A组和其他各亚组间的比较采用Dunnett-f检验，两实验组同一亚组间的比较采用t 检验，以P

2 结果

免疫组化结果：图1为正常视网膜组织切片光镜下的神经节细胞，免疫组化显示棕黄色颗粒位于视网膜神经节细胞(RGCs)胞浆内(图2、图3、图4)，其余各层均未见明显表达，各组及亚组图像分析平均灰度值Median(QR)见图5。

通过析因分析，显示高眼压组与水浴+高眼压组两组组间、不同亚组间HSP70表达强度比较，差异有统计学意义(组间及亚组间P值均小于0.01)。高眼压组和水浴+高眼压组HSP70 蛋白的表达强度均于高眼压后4 h开始增强(与各自A组相比行Dunnett-t检验，P=0.00)， 24后h达到高峰， 36小时后回落，但仍高于正常组(与各自A组相比行Dunnett-t检验，P=0.00) 。

水浴后大鼠视网膜神经节细胞HSP70的表达基础水平提高，水浴＋高眼压组A～F各亚组的HSP70表达强度均较相应高眼压组高，差异均有统计学意义(t值分别为-4.25，-5.78，-l1.05，-8.31，-7.29，-6.77，-4.31；其P值均小于0.05)。36 h后水浴＋高眼压组的HSP70表达强度虽然回落，但与高眼压组相比，差异仍然有统计学意义(t=-6.77，P

3 讨论

近年来，抗青光眼手术设计日臻完善，加之各种高效降眼压药物的开发和应用，将青光眼患者的眼内压控制在靶眼压以内不再象以前那样困难，但即使是最大限度地降低了眼内压，仍不能阻止部分患者视功能恶化。另外，正常眼压性青光眼患者的眼内压正常，发病机制不清，降眼压治疗缺乏针对性，视神经保护的研究成为研究的热点和难点。

热休克蛋白与青光眼视神经保护的研究日益受到重视，而在HSP家族中，作为与神经保护联系最密切的HSP70，其保护视神经的机制包括：（1）通过分子伴侣作用在蛋白质代谢过程中发挥着极其重要的作用。分子伴侣作用的主要功能包括：帮助新合成蛋白质的折叠，防止其互相聚集；帮助蛋白质的细胞内移位；帮助变性蛋白质复性以及清除严重受损的蛋白质[6]。（2）帮助细胞对抗凋亡刺激因素侵袭，这些因素有热休克、肿瘤坏死因子、生长因子、氧化应激、化疗药物、宇宙辐射等。所有HSP中，HSP70是凋亡的主要抑制者[7,8]。（3）保护线粒体使之免受活性氧族的毒害作用的作用[9]。

本实验模拟青光眼高眼压环境，探讨急性高眼压条件下RGCs与HSP70表达的关系。结果表明在前房内加压灌注时，眼内压急剧升高；当眼内压超过大鼠尾动脉压的75％(102 mmHg)时，视网膜动静脉血流由于机械受压停止，RGCs处于缺血和机械受压应激状态下，在缺血再灌注4小时后细胞内HSP70的表达增加,并逐渐加强 ,到24小时达到高峰，36小时后开始减少。HSP70的表达呈峰时出现亦说明HSP70作为一种应激蛋白，其蛋白保护作用具有时间依赖性。

本实验还探讨了热耐受对RGCs的HSP70表达的调节作用。 热耐受(thermotolerance)作为HSP的一个重要生物学功能，是指细胞经过预先的热休克处理后诱导HSP的合成，使细胞能够耐受一个更为强烈的热处理。Caprioli[10]等研究提示通过热耐受可以提高视网膜细胞的耐热能力，从而减少组织细胞的损伤。本实验采用45℃ 温水浴的方法，通过温水浴加热大鼠，使热量均匀传导至全身。由于热耐受与HSP表达有关，因此若要产生热耐受，则第2次的应激一般要在第1次热休克恢复期，有研究显示[11]大鼠热休克后恢复37℃ 2―3 h再给予第2次的应激是必要的。因此本实验在给予第二次应激时，予常温恢复是必须的。本实验结果显示HSP70表达的峰值时间高眼压组与水浴组一致，但水浴组的转录强度均高于高眼压组，差异有统计学意义。

本研究结果证实，热应激能诱导RGCs内源性HSP70的表达，从而提高RGCs对急性高眼压的耐受性，起到保护视神经的作用。

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篇7

[关键词] 消化性溃疡；中医证型；中药方剂；热休克蛋白70；瘦素

[中图分类号] R259 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）02（a）-0084-03

The influence comparison on expression of heat shock protein 70 and Leptin by two types Chinese herbal medicine prescription in the treatment of peptic ulcer

LI Changjun ZHANG Ping

Department of Gastroenterology， Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces， Hubei Province， Wuhan 430061， China

[Abstract] Objective To observe the expression influence of heat shock protein 70 （HSP70） and Leptin on patients with peptic ulcer （PU） treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription. Methods 41 patients with Helicobacter pylori （HP） positive in active stage in Hubei Provincial Corps Hospital of Chinese People′s Armed Police Forces from October 2011 to April 2013， were divided into two groups， of which there were 19 cases with deficiency cold of spleen and stomach （control group）， 22 cases with qi-stagnation of liver and stomach （treatment group）. The two groups were treated respectively by spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi decoction while using western medicine， reexamination of gastroscope and HP were taken after 6 weeks. The HSP70 and Leptin content in serum were tested by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The HP eradication rat and gastroscopic curative effect were not significantly different between control group and treatment group （P > 0.05）. The HSP70 and Leptin content were no significant differences between control group and treatment group before treatment （P > 0.05） after treatment， the content of HSP70 in control group was significantly higher than that in the treatment group （t=3.531， P < 0.01）， the content of Leptin improved was much higher in treatment group than that in control group （t=2.487， P < 0.05）. Conclusion There are intensive difference on expression of HSP70 and Leptin in serum of patients with peptic ulcer treated by traditional spleen-nourishing middle-warming and soothing liver regulating qi prescription， the medicine physicians should attach much weight to the consistence of TCM syndrome type and Chinese herbal medicine prescription.

[Key words] Ulcer peptic； TCM syndrome type； Chinese herbal medicine prescription； Heat shock protein 70； Leptin

由于独特的预防和治疗作用，尤其在某些疾病上发挥着化学药品不可替代的重要作用，各大医院采购品种繁多的中成药[1]，我国约70%的中成药由综合医院西医医师开出，但不合理使用率高达四成。许多中成药也被联合运用于消化性溃疡（peptic ulcer，PU）治疗，PU病理过程中相关因子的变化及中药或中成药对相关因子的影响及该影响对优势疗效的作用有许多与单用西药的对照性报道[2]。由于不少中成药已从传统的以主治证命名方式改变为有的以功效和作用命名，有的以治疗某病命名，甚至冠以通俗效能名，虽然方便了临床医师运用，但也易产生对病不对证等问题。中药治病，处方基于中医辨证，鉴于以辩证分型为基础的分类中药方剂机制对照研究不多，以及西医医师缺乏中医辨证的相关知识与经验，本文对中西医结合治疗PU过程中不同类别中药对患者热休克蛋白70（heat shock protein，HSP70）及瘦素（Leptin）表达的影响进行比较分析，望提高西医医师对中成药对证作用的重视，并对西医医师尽量准确对证使用中成药提出建议。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年10月～2013年4月武装警察部队湖北省总队医院门诊患者41例，均经胃镜检查证实为活动期溃疡，并经活检排除胃癌；幽门螺杆菌（helicobacter pylori，HP）快速尿素酶检测及14C尿素呼气试验均为阳性；男32例，女9例，年龄22～52岁；胃溃疡9例，十二指肠溃疡32例。患者4周内未服用抗生素、铋剂、抑酸剂及对HP有抑制作用的药物，有严重心、肺、肝、肾及内分泌疾病；多发性及复合性或有严重并发症；疑有恶变或有外科手术指征；特殊类型胃溃疡或十二指肠溃疡（如胃泌素瘤患者）；不愿、不便参与及有心理精神疾患者，均不列入观察。脾胃虚寒型（对照组）19例，男15例，女4例，年龄23～50岁，胃溃疡4例，十二指肠溃疡15例；肝胃气滞型（治疗组）22例，男17例，女5例，年龄22～52岁，胃溃疡5例，十二指肠溃疡17例。各组年龄、性别、职业、饮酒、吸烟、饮食习惯等差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 主要试剂与仪器

人热休克蛋白70 ELISA试剂盒（美国RD公司）；人瘦素ELISA试剂盒（安徽安科生物工程股份有限公司）；Elx800自动酶标仪（美国Bio.TekInstruments公司）。

1.3 方法

1.3.1 中医分型及疗效判定标准 参照《中药新药临床研究指导原则》（试行）[3]，中医辨证分型标准：必备胃痛隐隐，喜暖喜按主症，兼具其余主症中1项加次症2项为脾胃虚寒型；必备胃脘胀痛，两胁胀闷，兼具其余主症中1项加次症2项为肝胃气滞型。胃镜疗效判定标准：临床痊愈为溃疡及周围炎症全部消失；显效为溃疡消失，仍有炎症；有效为溃疡缩小50%及以上；无效为溃疡缩小不及50%。

1.3.2 治疗方法 两组患者均给予泮托拉唑（海南海力制药有限公司，批号：11120290）40 mg/d，餐前0.5 h服用，2次/d；阿莫西林胶囊（珠海联帮制药股份有限公司中山分公司，批号；18578）1000 mg/d、克拉霉素分散片（黑龙江肇东华富药业有限责任公司，批号：100901）500 mg/d，2次/d，餐后即服；10 d后，泮托拉唑20 mg，1次/d；1个月后，雷尼替丁（杭州民生药业有限公司，批号：4110101）300 mg/d，2次/d。对照组加服自拟健脾温中汤（由党参20 g，炒白术15 g，炙甘草10 g，干姜6 g，肉桂3 g等组成，由本院制剂室制作成煎剂，每袋100 mL，下同），200 mL/d，2次/d，饭前1 h服用；治疗组加服自拟自疏肝理气汤（由柴胡15 g，陈皮15 g，香附10 g，枳壳12 g，炙甘草6 g等组成），饭后1 h服用，均每7天为停服1 d。6周后进行胃镜等复查。

1.3.3 标本采集和处理 治疗前后，每例患者取胃窦及胃体黏膜组织各2块做尿素酶试验；清晨空腹，用带分离胶的血清采集管采前臂静脉血6 mL，室温静置1 h，离心取上清2 mL分装2个EP管，分置-27℃、-85℃冰箱保存。

1.3.4 血清标本检测方法 按ELISA试剂使用说明进行操作，在酶标仪450 nm波长下测定光密度值（OD值），以曲线回归方程计算样品浓度，再乘以稀释倍数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0软件，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HP根除率

对照组17/19（89.47%），治疗组20/22（90.91%），两组比较，差异无统计学意义（χ2=0.024，P=0.877 > 0.05）。

2.2 胃镜疗效

对照组19例，痊愈15例（78.95%），显效2例（10.53%），有效1例（5.26%），无效1例（5.26%），总有效率94.73%。治疗组22例，痊愈18例（81.82% ），显效2例（9.09% ），有效1例（4.55% ），无效1例（4.55%），总有效率95.45%。两组临床痊愈率比较，差异无统计学意义（χ2=0.054，P=0.817 > 0.05）。

2.3 血清HSP70及Leptin含量

治疗前两组血清HSP70及Leptin含量比较，差异无统计学意义（t=0.052，t=0.197，P > 0.05）。治疗后，对照组HSP70含量显著增加（t=25.241，P < 0.01），治疗组亦明显增加（t=2.136，P =0.045 < 0.05），对照组增加显著高于治疗组（t=3.531，P =0.001 < 0.01）；治疗组Leptin含量显著提高（t=97.018，P < 0.01），对照组明显提高（t=0.264，P =0.472 < 0.05），治疗组提高明显高于对照组（t=2.487，P =0.017 < 0.05）。表明健脾温中与疏肝理气类中药对PU患者HSP70及Leptin的表达促进作用存在强度区别。见表1。

表1 两组患者治疗前后血清HSP70及Leptin含量比较（ng/mL，x±s）

注：与对照组治疗后比较，*P < 0.05，**P < 0.01；HSP70：热休克蛋白70；Leptin：瘦素

3 讨论

中医中药在治疗消化性溃疡方面积累了丰富经验，有许多临床观察和研究[4]，中西医结合治疗PU能提高疗效，能更快地改善临床症状[5]，但对按中医辩证分型确定的不同类中药配方进行较为深入机制对照研究不多。基于任何有效的中药方剂都可能被制作为中成药的考虑，笔者根据辨证分型以对证的自拟方剂合用西药进行PU治疗对照观察，结果胃镜下临床痊愈率，对照组78.95%，治疗组81.82%，与相关中药方剂合用西药疗效接近[6]，再次说明中西医结合治疗能提高PU的疗效。

各种生物受到外界不利或有害因素刺激时都会发生热休克反应并产生热休克蛋白（HSPs），它们具有参与蛋白折叠、转运、机体免疫和细胞凋亡等多种生理功能[7]。HSP70是热休克蛋白家族主要成员之一，其通过提高细胞对应激的耐受性、抑制炎性反应、抗氧化、抗凋亡等多种途径发挥细胞保护作用。Leptin在机体内作用广泛，在免疫功能，细胞增殖、分化、转移和调亡等方面具有重要的调节作用，其对免疫功能和炎性反应的调节作用是目前的研究热点[8]。有研究显示，黄芪建中汤合失笑散能显著增加消化性溃疡患者血清HSP70及瘦素的表达水平，并通过它们各自的保护机制促进溃疡愈合[9]，笔者观察PU患者治疗后HSP70及Leptin含量两组有显著和明显增加，推测较好的中西医结合疗效可能与上述两种因子通过相关环节与因素的保护作用有关。PU患者HSP70表达较正常人增强[10]，消化性溃疡的发生可使黏膜组织中Leptin的表达增加[11]，PU病理过程中的相关因子因素对HSP70及Leptin的表达应该有激发作用。但也有研究表明，PU患者治疗前Leptin水平与正常人接近，治疗后水平轻度下降[12]，与相关研究结果不一致的原因有待进一步研究，与本研究结果不一致的原因，笔者推测可能与病例选择标准及检验时间不同有关，更有可能是中药的促进表达影响作用。HSP70及Leptin调控机制十分复杂，溃疡病理过程中的组织坏死性毒素、缺氧、胃酸和疼痛等诸多刺激因素可激活HSP70表达，而Leptin的表达促进则受体脂含量、某些激素、炎症等多因素影响。他们的调控与作用涉及相关基因水平的激活与抑制，包含激素、酶类、神经机制等诸多因子因素间环节相互作用与反馈作用。笔者观察发现健脾益气类中药提升HSP70作用强势于疏肝理气类中药，而疏肝理气类中药提升Leptin作用强势于健脾益气类中药，提示两类中药对PU患者HSP70及Leptin的表达的促进强度存在区别。该结果虽不能代表两类中药作用的全面机制，也可能对证使用的表达促进强度差异对机体发挥保护作用是适宜的，但从HSP70及Leptin调控机制及环节作用分析，两种因子的表达差异应该对机体整体病理生理产生不同影响。尽管HSP70及Leptin对机体不良影响研究不多，但上述差异对疗效和机体在不对证使用中药时可能产生的不利影响应引起重视，也提示西医医师使用中成药时要认真考虑对证作用。至于差异的原因仍有待进一步研究，也应加强治疗前与正常人和组内与单用西药治疗的对照观察。

中医的证，是对致病因素与机体反应性两方面情况的综合，辨证是根据患者的临床表现，辨别出病变当前的位置和性质，既含病因又含机制。客观而言，高年资中医医师能做到辩证精准也属不易，加之中医症状体征、病因病机描述术语及身体部位的概念与西医又存在很大区别，要求西医医师正确辩证极不现实。有学者发现PU患者中医各证型与感染HP关系比较有显著差异性[13]，更有学者对慢性肾功能衰竭不同中医证型与HSP70、尿水通道蛋白2含量等指标的关系作了研究[14]，即便如此，也很难做到西医检查的客观依据与中医辨证所需要素的有机对应。目前，除传统的膏、丹、丸、散外，针剂、口服液等稳定安全的新剂型逐渐进入市场。但许多中成药说明书，功能与主治说明既含中医的证，也含西医的病，或说明治疗西医某病中的某证，或按西医药理直接写明某作用，如此势必导致不熟悉中医辩证的西医医师按病开药，或按药理和效能处方，不考虑对证或对证不准的问题在所难免。中医界应加快与证相关检查、检验客观依据的定性、量化系统研究；中西医结合工作者在中医症状体征、部位术语等方面描述与西医的差异要多作对照融通探索和宣教工作；单方复方机制研究，应将对证药物可能引起对应症状体征改变的原因在机制上以现代医学已有的病理生理及药理认识和发展趋势进行预测，开展如西医的激动与阻滞、抑制与兴奋似的中药宏观归类与微观作用的系列研究。要尽力减少只作与西医相关因子符合性、验证性的研究，避免支离性和分散性，中医辨证分型结果关联中药性味，要把性味概念提升为西医医师易于理解的中药药理依据，中成药说明书也应根据上述工作的开展作必要的内容调整。如此，也许能为西医医师尽量对证准确运用中成药提供便利。

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篇8

“肿瘤”是非常令人恐惧的疾病，很多人都认为，“患了肿瘤，就判了死刑”，这种想法不完全正确，事实上有一部分肿瘤可以治愈，还有一部分患者可以带瘤长期生存。

肿瘤治疗理念的变化

随着科学技术的不断发展，对肿瘤研究的深入，治疗方法也在不断完善。如上个世纪肿瘤外科医生侧重于肿瘤的手术切除，因此，很多外科医生认为，“我的手术做得好，手术以后就不用化疗了”。实际上，经过多年的临床实践，大家逐渐将肿瘤的治疗从单纯手术或化疗过渡到了外科手术后接受化疗和放射治疗，在此基础上，又认识到手术前化疗和放疗的重要性（和肿瘤的性质、分期有关）。

随着生物治疗基础研究的深入，特别是免疫治疗在肿瘤治疗研究的开展，使医学工作者建立起新的肿瘤治疗理念：肿瘤的治疗是外科手术、药物化疗、放射治疗和生物治疗联合的综合治疗，当前的生物治疗主要是指免疫治疗。

如何认识肿瘤的免疫治疗

对于肿瘤的认识，大家早期觉得是一种“要命”的病，所以无论是医生还是患者都认为必须想尽办法先把肿瘤清除干净，也就是常说的“为了保命，再难受也得用（化疗）”。

通过多年的经验发现，肿瘤化疗过程中对患者的打击很大，如化疗出现的副作用（包括恶心、呕吐、精神不佳、白细胞减少、免疫力下降等）导致患者的生活质量下降，身心健康受到严重影响，甚至部分患者的死亡与化疗导致机体极度衰弱有直接关系。因此，现在的化疗过程中，医生对上述副作用予以了高度重视，认识到在治疗肿瘤的同时，应该兼顾患者的生活质量。开发没有或较小副作用的肿瘤治疗方法一直是医学工作者研究的重点之一。

二十世纪五十年代起，人们对肿瘤免疫学进行了大量研究，证明机体对肿瘤存在特异性免疫反应，为肿瘤治疗打开一条新的思路，免疫疗法成为肿瘤治疗重要手段之一。

有观点认为：手术、放疗、化疗能治愈部分肿瘤患者，不是由于上述疗法杀死了全部肿瘤细胞，而是由于当肿瘤细胞负荷明显降低时，机体的免疫功能恢复，清除了微小残留病灶或明显抑制了残留肿瘤细胞的增殖。这说明机体免疫对肿瘤生长、转化有重要意义。肿瘤的免疫治疗和化疗、放疗相比，是一种副作用很小的“绿色治疗”，是一种专门攻击肿瘤细胞，而对正常细胞无损害的疗法。

肿瘤的免疫治疗主要包括：（1）肿瘤疫苗或主动免疫治疗；（2）单克隆抗体以及过继性细胞免疫治疗；（3）细胞因子治疗等。以下重点介绍一种肿瘤疫苗――混合热休克蛋白/肽免疫治疗。

混合热休克蛋白/肽免疫治疗机制

传染病疫苗以预防疾病为主（如乙肝疫苗预防乙肝的发生），但是，我们研发的肿瘤疫苗大部分是治疗性疫苗，这些疫苗通过特异性激活机体的体液和细胞免疫杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗的优势在于一旦应用成功，可产生长期的免疫记忆细胞，消除肿瘤微小残留病灶并减少肿瘤复发，其缺点是干扰因素多，起效时间长。混合热休克蛋白就是一种肿瘤疫苗。

混合热休克蛋白（heart shock protein，简称HSP）是一种分子伴侣，其亚型HSP―70、Gp―96、HSP110具有结合肿瘤抗原和递呈抗原的作用，因此从肿瘤细胞中分离提取的HSP―70、Gp―96、HSP110、携带了广谱肿瘤抗原，类似DNA指纹库，称为热休克蛋白/肽复合物。这三者都可递呈抗原给T细胞，诱发CD4+、CD8+细胞反应，促进树突状细胞成熟，即促进了针对肿瘤的特异性细胞免疫，是诱发机体的抗肿瘤免疫作用的重要手段。它们具有多价性、特异性，只对自身的肿瘤有杀伤作用。

热休克蛋白的另一种亚型HSP―60，具有活化机体非特异免疫作用，可活化吞噬细胞、树突状细胞、γδT细胞，以及自然杀伤细胞（NK），从而释放多种细胞因子，并杀伤肿瘤细胞。

混合热休克蛋白/肽的“绿色治疗”

肿瘤患者，经过多次入院治疗，通过对周围患者的观察，一定注意到：和自己年龄相近的患者，患相同部位、相同大小的肿瘤，全程接受同一医生的治疗方案，最后出现不同的结果，是什么原因呢？

我们知道同一个环境成长的两个孩子，虽然他们的语言相似（当地的方言），饮食习惯相同，但是两者之间仍然有很多性格方面的区别，成年后两者的能力相差很大，此个体化性格造就了他们不同的发展前途。同样的道理，同样性质的肿瘤发生在不同患者的机体，一样存在不同的肿瘤生物学特性（只是现在的科学技术还不能发现他们之间的所有差别），因此，采用同一治疗方案对待不同的患者，自然会出现不同的治疗结果，其实这也就是医生常说的“患者的个体差异”。

那么，肿瘤患者在接受常规治疗的同时，如何再增加一种针对他本人的个体化治疗方案呢？解决这个问题就必须从每位患者人手。就像我们经常说的乙肝疫苗，它是通过对乙肝病毒信息深入研究的基础上研制出来的，能够把乙肝的信息作用于机体使机体产生预防乙肝病毒感染的能力，同时又不引起乙肝疾病。同样的道理，我们通过对每位患者肿瘤组织的微观信息进行深入研究，能否也从患者的肿瘤组织中获取能够代表他自己的“个体化肿瘤信息物质”，提取这种物质成分，注射到患者机体，使患者产生专门针对自己肿瘤的免疫反应，杀死肿瘤细胞，而对其他细胞不构成伤害呢？

混合热休克蛋白/肽就是从肿瘤患者的肿瘤组织提取的、能够特异性代表患者肿瘤的信息物质，其临床应用实现了个体化肿瘤治疗的理念。通过我们临床应用的病例，证实它确实是只针对肿瘤细胞起作用，而对正常细胞不伤害的“绿色治疗”，全部病例未发现明显的副作用或不适表现。

混合热休克蛋白/肽提取和临床应用流程

接受本治疗方法的前提是必须在患者接受肿瘤切除手术前和主管医生联系，因为手术后获得新鲜的肿瘤组织是此治疗的关键。具体包括以下流程。

1 收集患者的新鲜肿瘤组织（病理科固定后的标本不能提取混合热休克蛋白/肽）。

2 通过免疫组化检查肿瘤组织，确定患者肿瘤组织的微观信息情况，包括有无表达上述文中提及的4种（即HSP―70、Gp―96、HSP110、HSP―60）热休克蛋白，以及其量的多少。

篇9

摘要：目的：研究右美沙芬（DM）对激活的小胶质细胞的作用及热休克蛋白60（HSP60）在DM神经保护中的作用机制。方法：培养BV2小胶质细胞株，分为对照组，细菌脂多糖组，（LPS），实验组（DM）。Western-blot检测DM对LPS激活的BV2细胞HSP60和Caspase 3的影响，ELISA检测DM对HSP60释放的作用。结果：LPS组中HSP60和Caspase 3的表达及释放都比对照组显著增加，加入DM后，这些因子的水平都明显降低。结论：DM可能通过HSP60信号通路途径阻止小胶质细胞的凋亡而发挥神经保护作用。

关键词：热休克蛋白60；右美沙芬；Caspase 3；小胶质细胞

中图分类号：G642.423 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）18-0277-02

热休克蛋白是机体的一类应激蛋白，在生理状态下对机体起着保护功能。但是有研究发现，在病理情况下，很多细胞会大量表达热休克蛋白60（HSP60），并将其释放到胞外，引起细胞凋亡[1]。右美沙芬（Dextromethorphan，DM）是一种右旋吗啡喃化合物[2]，对动物因低血糖或脑缺血引起的神经损伤具有保护作用，DM被证明能有效抑制小胶质细胞活化，并且可抑制细胞炎症因子如TNF-α、IL-6，NO和超氧化自由基等[3]，但是右美沙芬的作用机制目前尚不清楚。

一、材料与方法

（一）材料

右美沙芬和LPS购自Sigma公司；HSP60抗体购自ENZO公司；Caspase 3及β-actin抗体购自Cell Signaling公司；蛋白定量BCA试剂盒购自Thermo公司；ELISA试剂盒购自欣博盛公司。

（二）方法

1.小胶质细胞BV2的培B。BV2细胞培养在DEME培养基中，含10%胎牛血清。利用1μg/ml LPS处理30min后，在细胞培养液中加入DM溶液（10μM），作用24小时后收集细胞及上清。

2.Western blot检测蛋白含量。药物处理完毕，提取各实验组的蛋白并收集上清液，10% SDS-PAGE分离后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭膜2小时。然后加入一抗，置于4℃过夜。利用TBST洗涤膜三次，洗去未结合的一抗。最后用二抗室温孵育1 h，利用ECL试剂显色成像。

3.ELISA试剂盒检测HSP60的释放。按照HSP60 ELISA试剂盒操作说明进行实验，最后酶标板置于酶标仪上，450nm处测定各孔光密度值（OD）。

4.统计学分析。采用SPSS11.11进行统计学分析。实验数据用x±s表示，组间比较用方差分析，进一步比较两两间差异采用Student-Neuman-Keuls Test方法。

二、结果

（一）DM显著抑制LPS激活的小胶质细胞HSP60的表达及释放

LPS激活后的小胶质细胞中HSP60的表达明显高于对照组，差异具有显著性。加入DM可显著抑制LPS引起的HSP60的升高，差异具有统计学意义（P

（二）DM抑制Caspase 3的表达

Western blot结果表明，LPS激活的小胶质细胞中Caspase 3的表达明显高于对照组，在DM处理的实验组中，Caspase 3的表达显著下降，差别有统计学意义（P

三、讨论

热休克蛋白是一类应激蛋白，对机体主要起着保护作用。但是HSP60对细胞凋亡具有双重作用。我们先前的研究发现心肌细胞中HSP60的表达和定位都发生了改变，导致心肌细胞的损伤或凋亡[4]。但是关于HSP60在神经系统中的作用的报道还很少见。

小胶质细胞的激活参与了多种神经系统退行性病变如老年痴呆症、帕金森症等的发生发展[5]。本研究假设HSP60在激活的小胶质细胞中高度表达，并被释放至胞外。胞外的HSP60激活凋亡因子Caspase 3，导致周围其他神经细胞的损伤或凋亡。本实验证实了在LPS激活的小胶质细胞内HSP60的表达显著增高，胞外也检测到HSP60，并增强了Caspase 3的表达。这些结果与心肌细胞中关于HSP60的研究结果的报道一致，说明小胶质细胞活化后释放至胞外的HSP60可进一步激活自身导致自身的凋亡。

右美沙芬可能是一种潜在的治疗神经系统炎性疾病的药物[6]。本实验中，我们证实了DM能有效抑制小胶质细胞的激活，为一些神经退行性疾病的防治提供了潜在的药物治疗靶点。

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收稿日期：2016-11-30

基金项目：2016年国家级大学生创新创业训练计划项目（201610752010）

作者简介：王俊燕（1992-），女（汉族），宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；李玲（1973-），女（汉族），宁夏银川人，专科，主治医师，银川市第一人民医院高压氧科，主要从事高压氧神经科学研究；张燕（1992-），女，宁夏银川人，宁夏医科大学生物技术专业本科生；

篇10

【关键词】 甲醛；适应性反应；蛋白质组

摘要： 目的 研究甲醛诱导真核细胞适应性反应及其可能的机制。方法 建立甲醛刺激人胚肺成纤维细胞(MRC-5)适应性反应模型；采用AlamarBlue还原率检测细胞增殖。双向凝胶电泳分离细胞总蛋白，图像分析后选取差异蛋白点进行质谱鉴定。结果 AlamarBlue检测结果表明，低剂量甲醛预刺激可诱导细胞适应性反应。双向凝胶电泳结果显示，甲醛刺激后19个蛋白斑点发生变化，肽指纹图谱及肽序列标签鉴定了其中13个蛋白斑点，已鉴定的蛋白包括二磷酸核苷酸激酶、延长因子1-γ，磷酸丙糖异构酶、60S酸性核糖体蛋白P0、75kDa热休克蛋白、70kD热休克蛋白样结合蛋白、钙依赖磷脂结合蛋白I、假想蛋白FLJ34423、微管-肌动蛋白交叉连接因子1、核纤层蛋白B2、ATP合成酶α链、蛋白酶体α亚基6，这些蛋白功能涉及转录调节、蛋白折叠、信号传导、能量代谢、细胞骨架等各个方面。结论 低剂量甲醛可诱导MRC-5细胞适应性反应，多种蛋白参与细胞的适应性反应调控。

关键词： 甲醛；适应性反应；蛋白质组

Proteomie analysis of adaptive response induced by low concentration of formaldehyde in human embryonic fibroblasts cells

Abstract： Objective To study the adaptive response induced by formaldehyde(FA) on eukaryocyte and its possible mechanism.Methods After FA treatment，AlamarBlue reducing rate was observed to determine the cell proliferation.The total cellular proteins were separated using two-dimensional gel electrophoresis and visualized by sliver staining.Gels from different batches of control and FA-treated MRC-5 cells were analyzed for quantitative spot comparisons with the ImageMaster 2D platinum 5.0 software.The differentially expressed prorein spots were picked and digested in gel then identified by tandem mass spectrum.Results The results of AlamarBlue reducing rate showed that low concentration of FA induced adaptive response on MRC-5 cells.Nineteen spots were changed significantly after FA treatment.Thirteen proteins were identified by peptide mass fingerprinting or peptide sequence analysis，including putative nucleoside diphosphate kinase，elongation factor 1-gamma，triosephosphate isomerase，60S acidic ribosomal protein P0，heat shock protein 75 kDa，similar to heat shock 70kD protein binding protein，annexin I，hypothetical protein FLJ34423，microtubule-actin crosslinking factor 1，lamin B2，ATP synthase alpha chain，mitochondrial precursor，proteasome subunit alpha type 6.These identified proteins involved in energy metabolism，translation and RNA processing，protein folding，redox regulation，cell structure and cell signaling.Conclusion Adaptive response can be induced by low concentration of FA on MRC-5 cells and cellular adaptation is a complex process involving in a modulation of perse cellular functions.

Key words： formaldehyde；adaptive response；proteomics

适应性反应（adaptive response）是机体受到低剂量环境因子预刺激后对后续高剂量的刺激产生耐受的现象。研究表明〔1〕，许多环境刺激因子低剂量接触可诱导适应性反应。但适应性反应是否为自然界普遍存在的现象，适应性反应的机制还未阐明。甲醛(FA)是常见的环境化学污染物，早期研究发现，机体接触低剂量甲醛可能诱导产生某种耐受与适应现象，但尚未对其机制进行探讨〔2，3〕。本实验利用建立的甲醛适应性反应细胞模型，采用蛋白质组学技术研究了甲醛刺激后人胚肺成纤维细胞蛋白质表达差异，并用串联质谱鉴定差异蛋白，为了解甲醛诱导细胞适应性反应的分子机制提供依据。

1 材料与方法

11 材料 甲醛(上海标准试剂）、硫脲(美国Sigma公司)；等电聚焦胶条(13cm pH4～7)、尿素、二巯基苏糖醇(瑞典Amersham公司)；丙基磺酸盐、碘乙酰氨(美国USP公司)；胰蛋白酶(测序级)、丙烯酰胺(美国Promega公司)；AlamarBlue染料(美国Biosource公司)；其余试剂采用国产分析纯。

12 方法

121 细胞培养 MRC-5细胞来源于成都肿瘤研究所，培养于改良的伊格培养基(DMEM)，含10％胎牛血清，100kU/L青霉素，100mg/L链霉素。FA临用前用无血清DMEM配制。

122 AlamarBlue检测细胞增殖 将细胞接种于96孔板，至对数生长期，按实验方案分别加入适应性反应剂量(10μmol/L)及攻击剂量(500μmol/L)的甲醛，对照组分别加入相同体积的无血清DMEM培养基，培养结束前4h每孔加入10μl染料，继续培养4h用酶标仪测吸光度值计算AlamarBlue还原率。

123 双向凝胶电泳 参照Amersham公司技术手册及本实验室改进的技术方法〔4〕，上样量90μg，上样体积250μl，等电聚焦42000～48000vhs，聚焦时间19～21h。样品收集方案：FA染毒低剂量组为10μmol/L刺激12h，高剂量组为500μmol/L FA刺激5h，适应组为10μmol/L FA预刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，空白对照组加入相应体积无血清DMEM，收集不同批次的细胞重复至少3次。

124 图像采集和分析 染色后的双向电泳凝胶用的图像扫描仪扫描(瑞典Amersham公司)后采用ImageMaster 2D platinum 5.0软件进行图像分析。分析过程包括蛋白质斑点检测及编辑、背景扣除、以全体点之和作归一化处理后进行斑点匹配。分析3次独立实验所得二维电泳胶，结果以占总蛋白点灰度值的百分比表示。最大比值(Max ratio)为各组数值间最大值与最小值的比，如各组间有为0的数据，Max ratio计为100000。

125 质谱检测及数据库搜索 切取在不同批次胶上重复性较好的差异表达的蛋白点，胶内酶解后用质谱分析(ABI4700，美国ABI公司)检测，激光强度355nm， 200Hz，选定5个最强峰做串联质谱，所得肽谱用搜索引擎(MASCOT)对人类蛋白组数据库(IPI HUMAN)搜索。

13 统计分析 采用SPSS110软件进行单因素方差分析；二维电泳图像分析采用ImageMaster 2D Platinum5.0软件分析。

2 结果

21 低剂量FA预刺激对MRC-5细胞增殖的影响 MRC-5细胞分别给予500μmol/L FA刺激5h，及10μmol/L FA预刺激12h后500μmol/L FA刺激5h，检测AlamarBlue还原率。结果显示，空白对照组AlamarBlue还原率为(0.5771±0.0238)，高剂量组下降至(0.4922±0.019)，适应组细胞为(0.56911±0.03383)，差异有统计学意义。

22 低剂量FA预刺激后MRC-5细胞双向电泳图谱差异 经图像分析发现，对照组MRC-5细胞检测到(834±74)个蛋白点，低剂量组为(917±118)个，高剂量组为(820±116)个，适应组为(874±107)个，凝胶匹配后发现，19个蛋白点表达发生改变，变化量达2倍以上，见表1。表1 FA刺激后二维电泳差异表达的蛋白点（略）

23 低剂量FA预刺激后MRC-5细胞差异蛋白质谱分析及数据库搜索 选择19个差异表达 的蛋白点进行鉴定，经肽指纹图谱(PMF)及肽序列标签(MS／MS)鉴定了其中13个蛋白点，其余因无法得到好的肽指纹图谱或搜索数据库时无法得到可信度较高的结果而未能鉴定。已鉴定的蛋白结果见表2。

3 讨论

本研究结果显示，低剂量FA预刺激后细胞可耐受更大剂量FA的攻击，提示FA可诱导细胞产生适应性反应。磷酸丙糖异构酶参与多种能量代谢途径；二磷酸核苷酸激酶与三磷酸核苷合成有关，是癌基因c-Mye的激活因子；蛋白酶体参与泛素依赖的蛋白降解；60S酸性核糖体蛋白PO与E.Coli蛋白L10功能相似；75kDa热休克蛋白及70kDa热休克蛋白样结合蛋白作为分子伴侣或分子伴侣结合蛋白发挥其生物学效应；微管-肌动蛋白交叉连接因子1、核纤层蛋白B2与细胞骨架相关；钙依赖磷脂结合蛋白I(ANX I)为钙依赖的磷脂结合家族成员，具有多种生物学功能；延长因子1在蛋白翻译过程中起重要作用：ATP合成酶α链与ATP合成有关，提示甲醛诱导的细胞适应性反应是一个复杂的过程，需要多种蛋白共同参与。本研究所鉴定的甲醛适应性反应相关蛋白中，热休克蛋白和ANX I的诱导表达与氢醌诱导的适应性反应蛋白质组学研究结果有共同之处〔4〕。提示这2种蛋白可能在化学物诱导的适应性反应的共同机制中具有重要作用。已有研究表明，在应激条件下热休克蛋白的表达对细胞具有保护作用〔5〕。ANX I也可被热应激、过氧化氢、亚砷酸盐等多种因素诱导，提示ANX I也可能是一种热休克蛋白(HSPs)〔6〕。HSPs在化学物诱导的适应性反应中所起的作用是特异性的抑制或非特异性，其表达是适应性反应产生的因或果，以及HSPs与其他适应性反应相关蛋白之间的关系都有待进一步研究。

表2 FA调节蛋白Mascot数据库搜索结果（略）

注：a PMF鉴定结果；b MS/MS鉴定结果

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