蛋白质组学范文

导语：如何才能写好一篇蛋白质组学，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

在疾病基因组的研究中,为了寻找差异表达的疾病相关基因或蛋白质,除了采用传统的分子生物学方法,如差减杂交[1]、抑制性差减杂交[2]、差异显示PCR法[3]及基因表达串联分析技术(serialanalysisofgeneexpression,SAGE)[4]外,还可采用蛋白质组学的方法,即从蛋白质入手寻找新的或疾病相关基因或蛋白质。基因和蛋白质间并没有一一对应的关系,有mRNA,不一定能表达为有功能的蛋白质。但是,基因要表现其功能,一定要通过相应的蛋白质。所以,研究基因,特别是疾病相关基因,可从研究其表达蛋白质的结构或功能入手。常见的几种研究差异表达蛋白的蛋白质组学方法包括蛋白芯片技术、双向电泳技术、多维液相色谱技术以及它们和质谱鉴定的有机结合。

1•1蛋白质芯片技术

继基因芯片以后,蛋白质芯片技术逐渐发展起来。基因芯片又叫DNA芯片,是以DN段为材料的,而蛋白质芯片以蛋白质或多肽为材料。利用蛋白芯片技术能同时从微量的样品中检测成千上万个蛋白质或多肽,用于分析差异表达的蛋白质及药物靶标的鉴定,所以,蛋白质芯片在药物基因组学的研究中发挥着极为重要的作用。众所周知,蛋白质不如核酸稳定,在蛋白质样品的处理中将会遇到很多困难,对蛋白质芯片的操作将比对基因芯片的操作要求更为严格。从基因组测序知道,仅有约30000~35000个基因维持人体正常的生理作用[5],由于RNA编辑及翻译后修饰等因素,使得人体细胞的总蛋白质数目(蛋白质组)远远超过有活性的基因数目。因此,能同时检测成千上万蛋白质的蛋白质芯片技术,是唯一可用来有效研究人体蛋白质组的方法。目前,主要将蛋白芯片和表面增强的激光解吸离子化质谱技术(SELDI-MS)相结合寻找差异表达的蛋白质。其原理是将不同生理状态的样品(培养的细胞或组织样品)和同一蛋白芯片结合,洗去未结合的蛋白质,然后用SELDI-MS分析结合的蛋白质。一般来说,每种芯片可特异地结合某一细胞特定的蛋白质。具体的操作方法随不同厂家生产的蛋白芯片不同而异。LiX及其同事[6]将小鼠MRL的耳朵穿刺,观察耳朵上伤口愈合过程中蛋白质表达的变化情况,用蛋白芯片分析的结果表明,分子量为23•56ku的蛋白在伤口愈合过程中表达量大幅度增加,加速了伤口的愈合。尽管蛋白质芯片技术正逐渐得到广泛应用,但在应用于寻找差异表达蛋白时也有局限性:1)待检的低丰度蛋白往往被高丰度蛋白所掩盖而不能检测出来,2)蛋白质芯片系统对检测小分子量的蛋白有效,检测范围为10~30ku,但是10~30ku的蛋白只是占总蛋白的一小部分。

1•2多维分离技术

对于复杂的蛋白质样品,比如特定组织或细胞中的所有蛋白质(蛋白质组),仅靠某一分离原理将它们分开是不可能的,而要利用蛋白质的不同性质将它们分离开,由此而发展起来的分离技术叫多维分离技术(multidimensionalseparation)。目前主要采用的是二维分离技术,因为对于大多数蛋白质的分离,采用蛋白质间某两个性质的不同,利用二维分离技术已足够了。其中,双向电泳技术和二维液相色谱以及它们和质谱的联用,已成为当今蛋白质组学研究的有力工具。

1•2•1双向电泳技术:双向电泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)技术是80年展起来的一种有效的二维分离技术。其原理是基于不同蛋白质的等电点和分子量不同的特性,第一相是等电聚焦电泳,第二相是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。很多实验室利用不同的双向电泳技术建立了特定组织或细胞的双向电泳数据库(2DPAGE),以供不同的实验室检索和比较双向电泳图谱。SWISS-2DPAGE是一个经注释过的双向电泳公共检索数据库,其格式和SWISS-PROT蛋白序列数据库类似。在SWISS-2DPAGE数据库中包括蛋白质的双向电泳图谱(其中标明了蛋白质的具置)、建立图谱的具体方法和程序、以及相关的病理和生理数据。关于蛋白质的双向电泳数据可通过如下服务器进行检索:expasy•hcuge•ch/。在功能基因组时代,双向电泳技术除了用于分离复杂的蛋白样品,建立双向电泳数据库外,主要用于寻找不同组织或细胞中差异表达的蛋白质,以进行疾病相关蛋白或基因的研究。先用pH3-10的IPG胶条,对疾病组织和正常组织进行双向电泳分离,然后利用计算机软件对所产生的2-DE图谱进行分析,找出差异表达的蛋白。

如果想得到更为详细的2-DE图谱,可用pH4-7或pH6-9的胶条,甚至只有一个pH单位的窄pH范围的胶条,从而使分辨率大大提高。将找到的差异表达蛋白斑点从胶上切下来,经酶消化(常用胰蛋白酶),通过质谱(MS)或串联质谱(MS/MS)测定和数据库搜索,鉴定出所差异表达蛋白。然而,双向电泳技术有许多局限性,由于样品处理的差别、翻译后修饰、人为修饰等导致同一基因表达的蛋白质迁移到不同的位置;另外,不同的蛋白也会迁移到同一斑点,出现共迁移现象,从而使得用2-DE进行定性和定量分析变得相当复杂。而且,对于低丰度和低拷贝数蛋白的检测也相当困难。双向电泳要求操作者熟练掌握电泳、染色及软件分析技术,整个实验过程中要穿实验服,戴手套,尽量避免角蛋白等污染,才能得到较好的重复性。为了改进双向电泳的重复性和灵敏度,最近发展了一种荧光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差别电泳(differentialin-gelelec-trophoresis,DIGE)[7]。将样品和对照品分别用1-(5-羧戊基)-1′-丙基靛碳氰卤化物(Cy3)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-propylindocarbocyaninehalinge(Cy3)N-hydroxy-succinimidylester]和1-(5-羧戊基)-1′-甲基靛碳氰卤化物(Cy5)N-羟基琥珀酸酯[1-(5-carboxypentyl)-1′-methylindocarbocyaninehalinge(Cy5)N-hydroxy-succinimidylester]标记。在DIGE时,由于样品和对照在同一胶内分离,使用相同的内标,避免了使用不同凝胶时在操作上的偶然性和不平行性,可以准确检测出两个不同样品蛋白表达上的差别,消除胶与胶之间的差异,保证统计上的可靠性及操作上的重复性。荧光标记较其他染色方法灵敏度更高。与常规的双向电泳技术比较,DIGE更加简单,劳动强度大大降低,效率大大提高。

1•2•2多维液相色谱-质谱技术:液质联用质谱仪用于小分子和大分子的分离和鉴定是一项常规而重要的技术,将液相色谱和质谱用于蛋白质组的研究,尤其是差异表达蛋白质组的研究,是最近才发展起来的。目前,利用多维液相色谱-质谱进行差异表达蛋白的研究,通常要借助于同位素标记技术,也即是下面所述的ICAT技术。ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotopecoded-affinitytags,ICAT),可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质。目前的ICAT试剂,大多是用来标记磷酸化蛋白的[8]。对于酵母和细菌细胞,可在培养基中加入同位素进行标记。另外,在蛋白酶解的过程中,可采用18O对蛋白样品的片段进行标记,而对照品不用同位素标记。当使用胰酶、Glu-C或Lys-C等蛋白酶时,可分别引入2个18O到正在被酶解的肽中。现在流行的市售ICAT试剂由美国华盛顿大学GygiSP教授[9]等人首先报道。此ICAT试剂的结构包括三个部分:生物素亲和标签,用于分离ICAT标记的多肽;中部的连接子,使引入的同位素更稳定;反应活性基团,可和半胱氨酸的巯基发生特异性反应。此试剂以两种形式存在,重试剂(含同位素氘)和轻试剂(不含同位素),前者的质量数比后者多8。利用ICAT试剂标记蛋白,寻找差异表达蛋白质的原理是:当样品和对照分别用重试剂和轻试剂标记后,将两样品混合,酶解,过链亲和素柱,使ICAT标记的肽片段吸附在链亲和素柱上。将ICAT标记的肽洗脱下来,经液相色谱-质谱分析。样品和其对照表达量的差别可用质谱峰的强度(面积)进行定量。将所得的差别峰经进一步的串联质谱分析,数据库搜索,从而鉴定出相应的差异表达蛋白质,并进行进一步的功能鉴定,如Westernblot等。用这种ICAT试剂寻找差异表达蛋白的缺点是只对含半胱氨酸残基的蛋白质有效,而不能测定其它的蛋白质和多肽。

2疾病诊断与药物开发

蛋白质组学方法除了在基础医学研究中用于寻找差异表达蛋白质,进而找出疾病相关蛋白质外,在疾病基因组学与药物基因组学的研究中还具有以下几个方面的作用。

2•1鉴定和疾病相关的生物标记分子

蛋白质组学方法在基础医学研究中的优点在于,可以高通量的方式筛选和鉴定和疾病相关的生物标记分子,用于临床诊断。HeineG[10]等人利用脑脊液作材料,经过双向电泳分离后的蛋白斑点,用液相色谱-质谱分离鉴定,得到了脑脊液的高分辨率肽谱。因脑脊液的肽中包括许多激素、细胞因子和生长因子,在生物体中起着关键作用,它们以多种方式反映机体体内平衡中和疾病相关的变化,如果能从这些肽中鉴定出疾病相关的标记分子,将可从肽水平上调查中枢神经系统相关疾病,因而是一种疾病诊断和治疗的新方法。KuererHM[11]等人利用高通量的双向电泳技术,分析乳腺管流体(breastductalfluid)中生化和细胞成分,以监测乳腺癌的发生和进展情况。BrunagelG[12]等人则根据核基质蛋白和结肠癌的相关性,利用双向电泳技术鉴定病人的肝样品中是否有核基质蛋白,从而判断结肠癌病人是否发生肝转移,以此作为结肠癌肝转移的早期诊断。对于蛋白芯片技术,在基础研究中常用于检测蛋白质修饰、表征蛋白质相互作用、信号传导以及酶动力学研究等。在临床上,广泛用于寻找疾病相关的生物标记分子和疾病诊断。WuW[13]等用SELDI-蛋白芯片技术鉴定了来自同一病人的两种头颈部鳞状细胞癌细胞株HBSCC10A和VMSCC10B中蛋白的差异表达。结果发现,α-烯醇酶、annexin-Ⅰ和annex-in-Ⅱ是头颈部鳞状细胞癌发生和转移的重要分子,以这些分子作为生物标记分子,用于头颈部鳞状细胞癌的临床诊断。对于多维液相或毛细管液相色谱-质谱技术,由于可进行连续和微量检测,在寻找疾病相关的生物标记分子方面具有超强的灵敏度。可进行大体积、低丰度蛋白的分析,如对血清样品[14]和尿液[15]进行蛋白质组学的研究。

2•2药物开发

因为蛋白质直接决定生物体处于健康或疾病状态,所以,蛋白质可作为药物设计和开发的药靶。利用蛋白质组学方法研究健康或疾病生物体蛋白间的相互关系、疾病病理基础、鉴定药物成分、毒性和作用机理,从而改进药效和药物安全性。MujerCV[16]等利用双向电泳和质谱技术,分析了布鲁氏杆菌(Brucellamelitensis,BM)的蛋白质组。BM是一种细胞内兼性革兰氏阴性杆菌,可引起人或动物的布鲁氏热(brucellosis)。此杆菌的一个属中至少有6个种。利用双向电泳和质谱技术,分析了BM致病株16M的蛋白表达模式,并鉴定了所有表达的蛋白质,对6种布鲁氏杆菌减毒疫苗Rev1的蛋白图谱进行了广泛研究。从而为发展疫苗,鉴定致病岛(patho-genicityisland),建立宿主专一性、进化相关性及疾病治疗和药物开发奠定了基础。

2•3致病机理研究

用蛋白质组学方法研究疾病发生发展过程中某些蛋白或多肽水平的变化,从而了解疾病发生的机理,如对慢性髓性白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)分子机理的研究[17]。此病为造血干细胞疾病,标记分子为Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶。让全能的骨髓干细胞株(FDCP-Mix)有条件的表达Bcr-Abl蛋白酪氨酸激酶,从而使FDCP-Mix细胞株长期暴露于Bcr-Abl中,模拟CML疾病进程。用长期暴露和短期暴露进行对照,用MALDI-Tof质谱或LC-MS进行鉴定。分析结果表明,白三烯(Leukotriene)A4水解酶的表达上调,AnnexinⅥ、液泡ATP合成酶催化亚单位A及mortain的表达下调,表明这些分子在CML的发生中发挥重要作用。将蛋白质组学方法用于疾病机理研究的例子很多,这里不再赘述。

篇2

现代质谱技术作为蛋白质组学支撑技术之一，在蛋白质和肽段的鉴定、定量和结构分析方面起着非常重要的作用。质谱分析进行蛋白质鉴定和序列测定的基本原理是使用电喷雾离子化和基质辅助激光解吸离子化的软电离方法，经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷，然后根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定相对质量。样品分子进行上述方法电离时能保留整个分子，确保了完整性而不会形成碎片离子，称为肽质量指纹图谱（PMF）技术。PMF是一种现在运用最广的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法，伴随着现代质谱技术的不断发展，其在蛋白质组学中的应用将越来越广泛。

高效液相色谱及多维液相色谱高效液相色谱（HPLC）技术最初被用于分离蛋白质或多肽。现在，HPLC已成功应用于蛋白质组学研究中，它是基于样品分子在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）间的特殊相互作用而实现样品分离的。无须变性处理样品，可实现上样收集及在线分析的自动化。利用液相色谱结合电喷雾质谱（ESI-MS）而不依赖于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特异性的胰蛋白酶消化，产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI-MS/MS分析。液相色谱与MS联用，采用高速且高灵敏度的色谱分离法来代替耗时的2-DE蛋白质分离法，故其与经典的2-DE-MS法相比，具有快速、样品需要量少和多肽分离的通用性强等优点，将会在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更进一步的应用。但由于层析填充物对许多蛋白质组分有吸附作用，且难以实现多组分蛋白质样品的多维层析，因此仅适用于研究单一蛋白质或简单样品蛋白质组。多维液相色谱（MLC）则是利用与串联质谱联用，可以检测低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最新的技术，可快速并高通量鉴定复杂蛋白质混合物。

蛋白质组学技术在畜禽动物营养学中的应用

传统肉类生产中的饲养管理、饲料结构、饲喂方式和饲养密度在基于动物营养和饲料工业的现代肉类生产的出现后，发生了本质性的改变。同时，大规模的现代肉类生产影响到了饲养动物的生理学、行为学和生物化学过程，随之导致了肉品品质的下降。同时生产者为了增大产量和减少疾病风险，在养殖过程中滥用抗生素等化学药物，加剧了肉类品质的恶化。此外，为了追求提高肉类的某些性能，忽视了饲养动物的体质健康、外部形状与内在机能的协调，生理学的平衡和整体适应性，从而导致现代肉用动物（猪和鸡）对周围环境条件的高度敏感性，最终导致了肉品的食用品质，如：色泽、风味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素残留现象极为突出。鉴于此，对肉品品质进行评价并对其进行可能的等级标注及对其生产过程控制，对于现代肉品生产至关重要。蛋白质是肌肉组织的重要组成成分，研究表明：肉类品质研究与功能蛋白质的结构研究间密不可分，蛋白组变化可能与肉的嫩度相关。肌纤维分红肌纤维和白肌纤维2种类型，这2种类型在代谢水平上存在着结构和功能的差异。纤维类型与肉质性状，如：性、风味和嫩度等的关系存在着很多争议，尤其是纤维类型对肉嫩度的影响仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白质组学分析屠宰后猪肌肉的变化情况，采集了刚屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白质组样品，这些肌肉蛋白质相对分子质量介于5000~20万不等，pH在4~9，结果发现蛋白质组模式发生了15种显著的变化。此后的研究中Lametsch等最终确定了可作为肉品质标记的20多种蛋白质，包括结构蛋白质（肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白）和代谢酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在这些标记蛋白中，人们发现肌动蛋白和肌球蛋白重链与肌肉的剪切力间存在极显著的相关，这就清楚地表明屠宰后肌动蛋白和肌球蛋白重链的降解会影响肉的质量。Remignon等直接对肌肉蛋白质片段进行分析，认为蛋白质的改变很可能是导致家禽PSE肉综合征的直接原因。Molette等研究发现火鸡屠宰后胸肌糖酵解的速度比较快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），从而使得肉品质发生改变，如：系水力下降、加工产量降低和嫩度降低等。同样报道了糖酵解快的动物肉的系水力低，并且提取到的肌浆蛋白含量低，这表明当pH下降的速率加快时蛋白质功能发生了改变。

蛋白质组学技术在水产动物营养学中的应用

蛋白质组学方法在水产动物营养特别是鱼的品质鉴定中已有应用，目前也被广泛应用到了对虾和海蜇等的品质控制中。随着对鱼类水产品的需求日益增长，保障和控制其安全生产具有重要的意义。在以数量增长为主的水产集约化养殖、运输和销售过程中，拥挤应激是常见的影响水产品食用品质的因素，解冻程序同样深刻地影响水产的品质。近年来，蛋白质组学已被广泛地应用到了水产品品质控制。Inger等利用2-DE技术研究新鲜的鳕鱼与死后鳕鱼肌肉，发现有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，后续分析表明：这些蛋白质点是肌原蛋白、肌浆蛋白和肌肉纤维等肌肉组织的分解产物。由此可见，蛋白质组学技术对评价鱼肉鲜度等品质具有重要的现实意义。Kjaersgard等通过对11种不同冷冻储存条件下对鳕鱼肌肉蛋白质图谱进行研究分析，发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱并无显著影响，但经过不同的冷冻储存时间（3、6和12个月），肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A和2-α肌动蛋白片段等蛋白质的质量浓度发生了显著变化，从而导致鱼肉的质地和味道发生了变化。Martinez等通过研究人工养殖的鳕鱼与野生的鳕鱼，比较发现人工养殖的鳕鱼2-DE图上蛋白质相对分子质量在3.5万~4.5万间存在显著差异。然而目前蛋白质组学技术在水产养殖和贮藏加工过程中的研究还处于起步阶段，随着相关技术的发展，将在水产动物营养中起到更加重要的作用。

篇3

【摘要】 作为后基因时代的一门新学科，蛋白质组学研究技术为线粒体蛋白质组的研究提供了有力的支持，使得从整体上研究线粒体蛋白质组在生理、病理过程中的变化成为可能. 本文回顾了近年来国外学者应用蛋白质组学研究方法揭示相关疾病线粒体蛋白质存在相应的变化，以及通过对线粒体蛋白质组的研究去发现线粒体蛋白质在疾病发生发展中的作用，从而为寻找与疾病密切相关的疾病特异性蛋白提供线索.

【关键词】 线粒体；疾病；蛋白质组学

0引言

二十一世纪初，人类基因组计划基本完成. 生命科学研究步入了后基因时代，其核心便是蛋白质组研究. 蛋白质组被定义为：一种细胞、组织或完整的生物体所拥有的全套的蛋白质. 这是一个整体的、动态的概念.而蛋白质组学是研究这些成分在指定时间或特定环境条件下的表达. 因为蛋白质是我们理解细胞功能和疾病过程的核心，如果在蛋白质组学方面没有共同的努力，基因组学的成果将不会成为现实. 蛋白质组学现在被认为是一个在诊断和发现伴随细胞器变化的复杂疾病的强有力的工具. 迅速发展的蛋白质组学也推动了线粒体蛋白质组的研究发展.

近年来国外学者应用蛋白质组学研究方法揭示相关疾病线粒体蛋白质存在相应的变化，并通过对线粒体蛋白质组的研究去发现线粒体蛋白质在疾病发生发展中的作用，从而为寻找与疾病密切相关的疾病特异性蛋白提供线索. 现就近年来，相关疾病线粒体蛋白质组的研究进展作一综述.

1线粒体相关疾病蛋白质组学研究

线粒体是真核细胞中最复杂和最重要的细胞器之一，哺乳动物除成熟红细胞外，线粒体普遍存在于有氧呼吸的真核细胞的细胞质中. 它是细胞内的能量供应中心，与氧自由基生成有关. 线粒体在脂肪酸代谢、嘧啶生物合成、体内钙平衡，以及细胞信号传导中起着主要作用. 同时，线粒体也是人类“另一”个来源于母系基因组的所在地. 许多细胞进程，如凋亡、老化以及多种疾病病理学机制(包括癌、肌病、糖尿病、肥胖、老化、特别是神经退行性疾病等)都与线粒体功能障碍或突变有关［1-2］. 在人类线粒体中约有1500个蛋白质［3］，其中已经有600多种蛋白质被鉴定出来. 如果能鉴定出大部分，甚至全部蛋白质那将是非常宝贵的资源. 蛋白质组学技术为研究线粒体疾病和线粒体功能失调，为寻找疾病诊断的标志物，探索药物作用靶点提供了必不可少的手段. 成为临床、基础研究的热点.

1.1神经系统疾病

1.1.1神经退行性疾病帕金森病：是一种中老年人常见的运动障碍疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征［4］. 目前，导致黑质多巴胺能神经元变性缺失的确切发病机制尚不完全清楚，但是已经知道线粒体功能障碍在其中起了重要作用. 采用定量蛋白质组学技术和同位素编码标记物方法，Jin等［5］对使用1甲基4苯基1，2，3，6四氢吡啶（MPTP）辅以二丙苯磺胺（probenecid）处理5 wk的慢性帕金森病小鼠和对照小鼠，进行了二组间黑质线粒体蛋白表达谱的差异表达比较. 辨别出超过300个蛋白点. 比较处理组和对照组中这些蛋白点，发现超过100个蛋白点在处理组中有量上的显著变化，经鉴定其中有一个蛋白质为：DJ1，它的突变与家族性帕金森病有关. 采用蛋白印记分析和免疫组化方法得出，其在黑质的分布与鼠细胞内包涵体形成有关. 包涵体如同帕金森患者中的路易小体. 这一结果说明DJ1不仅与α突触核蛋白同时聚集在多巴胺能神经元中，还存在于经MPTP/prob处理的小鼠细胞包涵体内. 这一结果表明：在线粒体功能缺陷和帕金森病患者路易小体的形成中，DJ1可能起了重要作用.

阿尔茨海默病：是老年人中常见的神经系统变性疾病. 日益增多的证据表明新陈代谢异常和氧化应激所致线粒体功能缺陷与阿尔茨海默病相关. David等［6］采用蛋白质组学技术对阿尔茨海默病的P301L Tau转基因小鼠的蛋白质表达谱进行分析发现，主要是与新陈代谢相关的蛋白：包括线粒体呼吸链复合物组成部分、抗氧化剂酶、突触蛋白等都有改变. 随后的功能分析提示，Tau蛋白和β淀粉样蛋白对线粒体损伤有协同作用.

1.1.2家族性肌萎缩侧索硬化症肌萎缩侧索硬化症是运动神经元疾病最常见的类型，肌萎缩侧索硬化症是一种致命的神经变性疾病，特征是运动神经元的不断死亡. 大约10%的肌萎缩侧索硬化症患者是家族遗传病例. 肌萎缩侧索硬症已被公认与铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn super oxide dismutase gene，SOD1）基因突变有关，其在家族性遗传性病例中占20%. 至今已有超过90种基因突变类型被发现. 不断积累的研究证据表明，在家族性肌萎缩侧索硬化症的病因学中线粒体功能障碍和细胞凋亡的激活起了重要作用. 但是很少知道哪个SOD1基因突变导致了线粒体功能障碍和细胞凋亡. 应用蛋白质组学方法，Fukada等［7］对NSC34细胞的G93ASOD1型所致的家族性肌萎缩侧索硬化症的线粒体蛋白质改变进行了研究. 采用两种独立的蛋白质组学方法，在线粒体断片中辨别出470个蛋白点，其中有75个是新发现的，这些蛋白以前只在cDNA水平报道过. 随后，他们采用2DPAGE方法分析了NSC34细胞野生型和NSC34细胞的G93ASOD1型的线粒体蛋白质组表达谱的区别. 在G93ASOD1型表达谱中，有9个点显示高表达，36个点低表达. 运用MS鉴定这45个点，这些蛋白点包含了有关线粒体膜转运、凋亡、呼吸链和分子伴侣蛋白等. 特别是发现，翻译后修饰的电压依赖性阴离子通道2蛋白的改变，该蛋白与线粒体膜渗透性的调节和细胞凋亡激活之间的关联正在激烈地讨论之中. 该研究所发现的这些线粒体蛋白，很可能是揭开SOD1突变导致线粒体功能障碍和细胞凋亡的钥匙.

1.1.3癫痫癫痫是一组由不同病因引起，脑部神经元高度同步化、且常具有自限性的异常放电所致疾病. 临床表现具有发作性、短暂性、重复性以及刻板性的中枢神经系统功能失常为特征的综合征. Kammer等［8］对点燃小鼠的脑组织采用2DE和质谱分析技术鉴定出了一种变异的Rieske铁硫蛋白（Rieske ironsulfur protein）. Rieske铁硫蛋白是线粒体复合物Ⅲ的一部分. 研究显示，在癫痫发作中Rieske蛋白可能对神经元的反应起一定作用，从而在癫痫的分子发病机制上提出了一种新见解.

1.2心脏病扩张型心肌病是一种严重的可导致心衰的心脏病. Knecht等［9］采用双向电泳（2DE，2D electrophoresis）取得了3300个心肌蛋白条带. 通过氨基酸序列分析、Edman降解法及基质辅助的激光解吸离子化质谱（matrixassisted laser desorption MALD mass spectrometry MS）等方法分析了其中150条带. 经活检及术后病理证实，其中有12条为扩张性心肌病特有的蛋白质. Arnott等对新福林诱导的肥大心肌细胞进行线粒体蛋白质组分析，与对照样品相比较发现有8种蛋白质的表达水平发生了不同程度的变化. 对存在缺血再灌注区、被预先处理的局部缺血兔心和正常兔心线粒体断片，Kim等［10］应用蛋白组学技术检测其蛋白表达水平的差异. 采用2DE，辨别出25个线粒体蛋白，在缺血再灌注心肌中出现了不同程度的表达. 鉴定出的大部分蛋白与线粒体呼吸链和能量代谢有关. 同时表明，要鉴定因缺血所致心肌损害的生物标志物，蛋白质组学技术为其提供了一个适当的手段.

1.3其他疾病

1.3.1乙醇依赖性肝损伤对暴露于慢性乙醇的动物模型，Venkatraman等［11］运用蛋白质组学方法进行了肝线粒体蛋白水平变化的分析，结果显示43个点出现不同水平的改变. 其中13个点上调而另30个点下降. 在这些蛋白中，以前并不知道的25个蛋白发生了改变. 研究结果表明，长期饮酒导致的线粒体蛋白质组的改变远远超过了人们的预先估计. 在长期乙醇喂养的小鼠线粒体中所有核和线粒体编码基因产物中的氧化磷酸化复合物均有下降，说明在整个代谢通路中存在合成障碍.

1.3.2肿瘤随着线粒体功能蛋白质组学研究的发展，已经有可能鉴定出癌细胞中线粒体蛋白表达的异常，并有可能鉴定出新产生的生物标记物，并以此来作为早期检测和进行风险评估的指标［12］. Herrmann等［13］采用蛋白组学技术定量分析了，线粒体编码细胞色素C氧化酶亚单位和核编码细胞色素C氧化酶亚单位的比率，发现该比率与前列腺组织恶性进程相关. 在从正常上皮组织通过癌前病变发展到浸润性癌的过程中，核编码细胞色素C氧化酶亚单位IV， Vb， Vic与线粒体编码细胞色素C氧化酶亚单位I 和 II 之间相对浓度的比率有很显著的变化. 显然这一改变发生在恶化的早期阶段，充分显示了核DNA编码的线粒体蛋白在致癌上起了作用，为寻找潜在的生物标志物提供了依据.

1.3.3内毒素血症内毒素休克导致的器官功能衰竭现在已经被认为与线粒体功能受损相关联. Miller等［14］运用2DE及MS技术，通过对存在脂多糖免疫反应的大鼠肝线粒体蛋白质和对照组进行比较，发现ATP合酶α链、超氧化物歧化酶有显著的增量调节. 这些结果提示，内毒素休克介导的线粒体蛋白组改变促进了代偿反应（适应内毒素休克），而不是细胞损伤所致. Crouser等［15］也对内毒素血症中线粒体蛋白质组变化作了研究. 采用经静脉注入内毒素（3.0 mg/kg），以成年雄性猫和未处理的猫作对照，经2DE发现两组动物的肝线粒体蛋白表达谱有14个点不同. 质谱分析表明鸟氨酸循环酶、热休克蛋白60、二氧化锰超氧化剂岐化酶高表达，而热休克蛋白70、F(1)ATP酶和调节脂质代谢的关键酶表达降低. 他们认为在内毒素血症中线粒体功能有明显改变.

1.4老化关于老化过程的信息可以通过认识蛋白表达的改变来获得. Kim等［16］用2DE方法，对13 mo（年幼）和31 mo（年老）大小的雄性Fischer344大鼠肾的线粒体断片进行了差别分析. 电泳图谱中检测出380个点，其中167个点二者比较有显著性差异，再通过应用基质辅助的激光解吸及电离时间飞行质谱鉴定了其中103个蛋白. 在年老的线粒体断片中显示出，抗氧化和蛋白水解的蛋白增多，细胞骨架蛋白减少. 他们认为：通过对蛋白表达的蛋白质组学分析，可有效的评估年龄状态. Kiri等［17］也做了类似实验，他们对3~8 mo（年幼）牛心和18~24 mo（成年）牛心线粒体运用蛋白质组学技术进行蛋白分离和鉴定. 在PH 5~8范围中选取鉴定40个蛋白点，40个点中有5个蛋白只存在于成年，而另有5个蛋白只存在于年幼的牛心，有8个蛋白的量在两组中比较至少相差2倍以上. 这些蛋白中有与能量生成、新陈代谢密切相关的酶，线粒体蛋白合成延伸酶等. 这些氧化修饰蛋白很可能与促成心脏蛋白年龄相关性退化和功能减退有关.

1.5毒理学研究为研究锰对线粒体的毒性，Zhang等［18］对经二氯化锰（30 mg/kg）处理的雄性斯普拉道来大鼠的脑的线粒体，应用考马斯蓝染色，2DPAGE分离出超过300个点在. 与对照组相比，有3个点被抑制，3个点被诱导. 通过MALDITOF鉴定了有ATP依赖钙离子泵、60 000热休克蛋白、线粒体跨膜鸟苷三磷酸酶FZO1B、长链脂肪酸CoA连接酶、ATP合酶β链、琥珀酸脱氢酶、黄素蛋白等. 这些结果表明线粒体呼吸链复合物的改变与二氯化锰诱导的线粒体机能障碍相关.

2展望

线粒体蛋白质组研究也必须克服一些困难：由于分离技术和鉴定技术的局限，低丰度、低分子量蛋白质及疏水性蛋白质难以鉴定. 数据库的贫乏，线粒体蛋白质组学还有待于更进一步的发展. 虽然线粒体蛋白组学在疾病中的应用还不是十分广泛，但是从发展趋势可以看出它的研究是值得期待的. 今后需进一步完善：① 线粒体蛋白组数据库，特别是人类线粒体蛋白组数据库的完善，以便将来与病变组织线粒体蛋白质表达谱进行比对. 建立一个详细全面的人类线粒体图谱数据库，有意义的线粒体蛋白功能得到确定，将会成为开发药物和探索疾病诊断的强大工具. ② 研究细胞内线粒体蛋白的相互作用和转运. 随着蛋白质组学技术的不断发展进步，线粒体蛋白质组也将得到长足发展，因此揭开线粒体作用机制不再是梦想，预防和治疗线粒体相关疾病必将成为现实.

参考文献

［1］ McDonald TG， Van Eyk JE. Undercover in the lipid bilayer ［J］. Basic Res Cardiol， 2003，98(4):219-227.

［2］ Lopez MF， Melov S. Mitochondrial proteins and effect on functions ［J］. Circ Res， 2002， 90(4):380-389.

［3］ Taylor SW， Fahy E， Zhang B， et al. Characterization of the human heart mitochondrial proteome ［J］. Nat Biotechnol， 2003，21(3):281-286.

［4］ Braak H， Del Tredici K， Rub U， et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinsons disease ［J］. Neurobiol Aging， 2003，24(2):197-211.

［5］ Jin JH， Meredith， Gloria E， et al. Quantitative proteomic analysis of mitochondrial proteins: relevance to Lewy body formation and Parkinsons disease ［J］. Brain Res Mol Brain Res， 2005，134(1): 119-138.

［6］ David DC， Hauptmann S， Scherping I， et al. Proteomic and functional analyses reveal a mitochondrial dysfunction in P301L tau transgenic mice ［J］. J Biol Chem， 2005，280(25): 23802-23814.

［7］ Fukada K， Zhang FJ， Alexis Vien， et al. Mitochondrial proteomic analysis of a cell line model of familial amyotrophic lateral sclerosis ［J］. Mol Cell Proteomics， 2004，3(12):1211-1223.

［8］ Junker H， Spate K， Suofu Y， et al. Proteomic identification of the involvement of the mitochondrial rieske protein in epilepsy ［J］. Epilepsia， 2005，46(3):339-343.

［9］ Knecht H， Odermatt BF. Rearranged epsteinbarr virus genome in Hodgkins disease and angioimmunoblastic lymphadenopathy: Swiss results ［J］. Am J Pathol， 2003， 163(1):369-370.

［10］ Kim N， Lee Y， Kim H， et al. Potential biomarkers for ischemic heart damage identified in

mitochondrial proteins by comparative proteomics ［J］. Proteomics， 2006，6 (4):1237-1249.

［11］ Venkatraman A， Landar A， Ashley J， et al. Modification of the mitochondrial proteome in response to the stress of ethanoldependent hepatotoxicity ［J］. J Biol Chem， 2004，279(21):22092-22101.

［12］ Verma M， Kagan J， Sidransky D， et al. Proteomic analysis of cancercell mitochondria ［J］. Nat Rev Cancer， 2003， 3(10): 789-795.

［13］ Herrmann PC， Gillespie JW， Charboneau L， et al. Mitochondrial proteome: Altered cytochrome c oxidase subunit levels in prostate cancer ［J］ . Proteomics， 2003， 3(9):1801-1810.

［14］ Miller I， Gemeiner M， Gesslbauer B， et al. Proteome analysis of rat liver mitochondria reveals a possible compensatory response to endotoxic shock ［J］. FEBS Lett， 2006，580(5):1257-1262.

［15］ Crouser ED， Julian MW， Huff JE， et al. A proteomic analysis of liver mitochondria during acute endotoxemia ［J］. Intensive Care Med， 2006， 32(8):1252-1262.

［16］ Kim CH， Park DU， Chung AS， et al. Proteomic analysis of postmitochondrial fractions of young and old rat kidney ［J］. Exp Gerontol， 2004，39(8): 1155-1168.

［17］ Ajay NK， HungCuong T， Kate L， et al. Proteomic changes in bovine heart mitochondria with age: Using a novel technique for organelle

篇4

关键词： 大肠癌 蛋白质组学 差异表达

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率呈上升趋势，尤其是结肠癌发病率的增长速度迅猛。全球大肠癌的发病率在肿瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期发现、早期诊断、早期治疗是决定大肠癌患者预后及生活质量的关键。为了深入研究大肠癌发生、发展的分子机制，强化大肠癌的防治效果，笔者采用蛋白质组学双向凝胶电泳（2-DE）等研究方法，对比分析正常直肠黏膜、大肠癌原发灶组织中蛋白质的表达差异，分离、鉴定大肠癌发生的相关蛋白，研究其对大肠癌细胞生物学行为的影响，以期为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1标本采集。实验所用标本均取自湖南中医药大学第二附属医院，国家重点肛肠科经病理确诊的本病首诊患者共10例，以及经病理确诊的正常成人直肠黏膜12例。

1.1.2试剂。IPG缓冲液pH3～10、24cm固相化pH梯度干胶条、2D Quant蛋白质定量试剂盒、考马斯亮蓝G-250，购自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3仪器。IPGphor等电聚焦仪、Ettan DALT Ⅱ垂直电泳槽、Imagescanner扫描仪均为Amersham Biosciences公司产品。

1.2方法

1.2.1组织蛋白样品的制备。组织活检样本用生理盐水反复冲洗，以去除血液及其他污染，称取适量组织样品与8倍体积的组织裂解液混合后，用研钵使组织充分研磨裂解，研磨过程中不断加入液氮以避免蛋白降解，置于室温下1小时，间断涡旋混匀，然后于12000g、4℃离心1小时，吸取上清液即为组织的总蛋白质。2D Quant Kit定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2二维凝胶电泳。操作步骤主要按照IPGphor等电聚焦系统使用指南进行。实验重复3次。

1.2.3凝胶图像分析。应用Imagescanner扫描仪及LabScan扫描软件扫描考马斯亮蓝染胶获取图像，PDQuest 2-DE软件比较分析健康人和大肠癌患者组织蛋白二维电泳图谱的差异，选取表达水平相差 2倍以上的点作为后续质谱分析的候选蛋白质点。

1.2.4质谱分析。从胶中切取差异蛋白质点于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氢铵脱色30 min，乙腈脱水冷冻抽干。加入10 μl TPCK处理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸胀60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重复萃取1次。将萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷冻浓缩至总体积2-5μl。制备好的样品在MALDI-TOF-MS质谱仪中进行分析仪上进行分析。结果利用Mascot软件检索NCBI数据库鉴定蛋白质。

2.结果

2.1两组组织二维电泳图谱的建立和图像分析

应用2-DE技术分别分离12例健康人直肠黏膜和10例大肠癌患者癌组织的混合蛋白。考马斯亮蓝G-250染色后，得到了健康人和大肠癌患者组织的2-DE图谱。为了保证结果的可靠性，在相同的条件下重复2-DE两次，获得两组的2-DE图谱各3张，采用PDquest图像分析软件对2-DE图像进行分析。结果显示：健康人组织平均蛋白质点数为1000±10，大肠癌组织平均蛋白质点数为1010±5，匹配率为（93.5±5.0）%。两种组织样本共有26个差异点，其中在大肠癌组织中表达上调点11个，下调的点15个。图1为有代表性的大肠癌组织蛋白质的2-DE图谱。

2.2差异蛋白质点的鉴定

从胶中切取较明显的10个差异蛋白质点，进行MALDI-TOF-MS质谱分析。利用Mascot查询NCBI数据库，如果Mascot分数>56分（P

3.讨论

不同生物学特性的肿瘤细胞具有不同的发生、发展和特殊性状，其中蛋白表达的差异起到了重要作用。肿瘤与正常组织或细胞的蛋白质表达谱差异分析是肿瘤蛋白质组学研究中应用最广泛和最有效的手段[2，3]。本课题利用蛋白组学技术比较了大肠癌组织与正常直肠黏膜，发现了5种蛋白质的表达水平均发生了明显变化，这些差异表达的蛋白有可能成为早期诊断大肠癌的候选标记物。本研究鉴定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能与大肠癌的发生有关，可能作为大肠癌早期诊断的候选新型生物标志物及大肠癌治疗的靶标，但这需要在以后的实验中进一步证实。生物信息学分析表明，本研究筛选出的5种蛋白与细胞增殖、信号转导通路、细胞周期调控等密切相关，可能在大肠癌的发生发展中起重要作用，而对这些蛋白的特进一步分析研究可为探讨大肠癌的分子机制、寻找大肠癌早期诊断的分子标记物提供实验和理论依据。

参考文献：

[1]Park in DM，Bray F，Ferlay J，et al.G lobal cancer statistics[J].CA CancerJ Clin，2005，55（2）：74-108.

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【关键词】蛋白质组学；农业生物科学；研究应用

一、引言

蛋白质组学是一种用于解决蛋白质在现有水平之上，运用大规模转基因的方式发挥蛋白质应有的功能。蛋白质组学是基于蛋白质功能体系所形成的前所未有的一种中大突破，其通过利用生化研究的途径，顺利的攻克了这一难关。随着我国社会主义现代化的飞速发展，我国城乡之间人口流动的比率不断提高，从而促使了我国从事农业生产的居民越来越少，进而增加了我国对转基因农作物、林业乔木等农业生物开发的依赖。但是，由于人们对转基因产物的认识性不足，带来了这些产物在我国社会中的普及性程度不够，并且也带来了这一领域发展的困难。蛋白质组学相关研究能够顺利的让我国人们和科研领域从对基因层次、核酸层次的认识顺利的过度到了直接从蛋白质层次对诸多基因产物的认识。并且随着我国乃至世界对蛋白质组学的深入研究，这一领域在不久的将来将会成为生命科学研究领域的核心，其能够解决当前在农业生物科学研究领域遇到的诸多难题。因此，作者在本文中主要结合自身多年从事生命科学研究领域的经验，对这一追随时代潮流的理论进行研究，并就其适用的主要领域（农业生物科学领域）展开应用研究。

二、蛋白质组学在农学基础研究领域中的应用研究

蛋白质组学在农学基础的研究领域中主要应用于以下几两个方面：（1）农作物与微生物之间相互的作用机理。有关文献表面，农作物在生长过程当中会与微生物的生存之间存在对资源的竞争，其最终的生长发育会随着微生物存在的现状进行改变。那么，对于这一事实也可以用蛋白质组学理论进行解释。产生这一现象的主要原因是由于当农作物作物遭遇到微生物的共生和寄生，以及遭遇到病菌的侵害的时候，其就会改变被侵害部位的蛋白质的含量，从而向外界或者是其他未受侵害的组织或者部分传递这一信号，从而引起整个农作物个体的反应机制；（2）农作物的品质改良、提升产量问题。通过利用蛋白质组学技术，科学家发现可以提高农作物的产量，还可以改善农作物的品质。例如，著名生物学家Natarajan，其对野生型的黄豆和农户种植型的黄豆，利用蛋白质组学技术进行研究、比较其两种不同生长环境下的黄豆，其内部硫氨基酸的含量存在较大区别，从而证明了提升黄豆蛋白中的硫氨基酸的浓度，能够极大的改善现有大豆农作物产品的品质。

三、蛋白质组学在林学研究研究领域中的应用研究

时至今日，世界范围已经开始应用蛋白质组学这门技术，来对林木的生长、发育、繁殖，以及当林木受到了生物以及非生物的胁迫后产生的反应展开研究。这些研究为人们增加了眼界，使得当前人们对有关林木生物学产生了更为深刻的了解。在今天，蛋白质组学已经渗透到了农学基础领域的多个方面，例如：在林木的遗传育种领域、林木病虫害的防止领域等等。通过对蛋白质组学的应用，解决了以往让诸多从事这一研究领域科学家头疼的问题。以下作者将结合上述几种应用领域进行分别应用研究：（1）林木的遗传育种领域。著名生物学家Huang在其文中建立了具有高分辨率的和高稳定性的一种双向的电泳式的图谱，并以经过矮化处理过后的杉木叶片中蛋白质为例，运用蛋白质组学技术对其展开了有关研究。其发现，经过矮化处理的杉木其叶片蛋白质的数量较野生杉木叶片蛋白质的数量更低。（2）关于林木的逆境应答研究。著名生物科学家Renaut等人，采用情景模拟的方式，为林木设置逆境的环境，经过研究发现，在拥有六百个蛋白质的植物经过环境变化，其内部蛋白质的数量减少了百分之十，并且这些消失的蛋白质主要是与林木的新陈代谢有关。（3）关于林木病虫害领域研究。著名科学家Fan等人，以毛泡桐、白花泡桐为例，通过设置同龄和同方位的产生病虫害的部位切片，对这一切片中的蛋白质进行了单项和双向两种方式的电泳分析。其研究结果发现，这两种类型的泡桐的病虫害切片当中均找寻不到蛋白多肽这种物质，从而他们得出了这一的研究结论，即：林木的病虫害与林木中所含的蛋白多肽存在负相关的关系。

四、蛋白质组学在其他农业生物科学领域中的应用研究

蛋白质组学还可以应用于研究水产业和畜牧业的研究，例如：可以利用蛋白质组学技术，研究水产业和畜牧业的肉类不同品质、不同性状时其内部所含有的蛋白质的数量，从而判断哪种元素能够促进蛋白质总量的增加，从而改变肉质和性状。另外，也可以利用蛋白质组学技术去研究这些产业中神经组织中蛋白组的问题、逆境胁迫的应答反应，或者是用于其他领域，例如：研究分离和鉴定农药蛋白质中所包含的靶分子的结构等等。

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关键词：蛋白质组学；非生物胁迫；生物胁迫；双向电泳；质谱

中图分类号：q946.1；q945.78 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）22-5403-06

随着生命科学的日益发展，对基因功能的研究已不仅仅局限在核酸水平。蛋白质是基因功能的执行者，是生命现象的直接体现者。要深入了解生命的复杂活动，就需要从蛋白质的整体水平上进行研究。蛋白质组学是指研究蛋白质组的科学，本质上是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于组织变化、细胞代谢等过程的整体而全面的认识[1]。近些年来，蛋白质组学发展迅速，并得到了广泛的应用，成为生命科学研究的核心内容之一。

植物在生长发育过程中会遭遇高（低）温、干旱、水涝和高盐等非生物胁迫以及病原菌侵染和虫害等生物胁迫。植物感受逆境信号后，可以通过信号转导调节细胞内抗逆相关蛋白的表达，从而调整自身的生理状态或形态来提高对逆境的耐受能力。在蛋白水平，对发生变化的蛋白质进行定性和定量测定，探讨植物在逆境胁迫条件下的调控机制，是研究植物抗逆性的重要手段之一，并已在多种植物的研究中取得了一定的成果。

1 蛋白质组学研究技术

过去，许多科学家都致力于蛋白质组的大规模定性分析，而现在，如何系统地识别和定量一个蛋白质组则是蛋白质组学研究的主要目的之一[2]。由于蛋白质的浓度在很大程度上影响了其功能的实现，因此，对蛋白质的相对和绝对浓度进行测量也就变得至关重要。目前，比较成熟的蛋白质定量方法主要分为两类，一类基于传统双向凝胶电泳及染色，另一类基于质谱检测技术。

1.1 基于凝胶的定量蛋白质组学技术

双向电泳（two dimensional electrophoresis，2de）技术是由o’farrell于20世纪70年代建立的[3]，具有高分辨率的特点，通常能分辨出1 000～3 000个蛋白点[4]。该技术自诞生以来，一直在不断改进和优化。目前，应用比较广泛的双向电泳技术主要是双向荧光差异凝胶电泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2d-dige）。但双向电泳本身也存在着一些弊端：试验重复性差；对蛋白质的分离受到蛋白丰度、等电点、相对分子质量和疏水性等的限制；自动化程度低；操作起来费时费力等，这些都在一定程度上限制了该技术的应用。

1.2 基于质谱的定量蛋白质组学技术

基于质谱的蛋白质组学定量技术可以分为两大类：标记定量技术（labeling quantitation）和非标记定量技术（label-free quantitation）[2]。此外，标记或非标记的鸟枪蛋白质组学策略也是基于质谱技术的常用方法。

1.2.1 标记定量技术

1.2.1.1 同位素代谢标记法

同位素代谢标记以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。此方法的显著优点是蛋白质在样品制备的初期被标记，由此减少了试验操作造成的误差，从而提高了准确度。目前比较常用的方法包括15n体内代谢标记和细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（stable isotope labeling by amino acids in cell culture，silac）方法。

1）15n体内代谢标记法。采用含有15n（或14n）作为惟一氮源的培养基来培养植物组织（植株），依靠掺入合成蛋白质的15n实现定量[5]。这项技术适用于多种蛋白提取物的蛋白质定量，包括那些需要进行大量纯化步骤、蛋白产量易发生改变的[6]。其优势还在于可应用于水培植物，使得植物对养分的吸收得到更好的控制。

2）silac方法。依靠在培养介质中加入稳定同位素标记的必需氨基酸（如赖氨酸或精氨酸等）实现对蛋白质的定量，已经广泛用于高等动物细胞蛋白质的鉴定及定量[5]。silac法标记效率高、损失小；标记误差低，可靠性高。然而，由于植物细胞本身可以合成这些

必需氨基酸，导致只有部分蛋白质被标记。并且，此方法成本较高，导致其在植物蛋白质组学研究中的应用受到了一定的限制。

1.2.1.2 同位素化学标记法

1）同位素亲和标记法。比较典型且已商业化的一项技术是同位素亲和标记技术（isotope coded affinity tages，icat）。icat 无需繁冗的双向凝胶电泳技术，标记策略灵活多变，可对低丰度、难溶性蛋白进行分析。近些年来，该技术与不同的质谱技术联合应用得到了广泛的研究。但icat适用于含半胱氨酸或半胱氨酸存在修饰的蛋白质。

2）酶催化18o-同位素标记法。酶催化18o-同位素标记法是通过加入h218o，在蛋白酶催化作用下将羧基上的2个16o替换成18o，从而对肽段进行标记。该技术有以下优点：操作简单；标记效率高，准确率高；应用范围广，可用于多种不同类型的蛋白质；可标记所有酶解的肽段，使相对定量所有的蛋白质成为可能；反应条件温和、副产物少；便于与磷酸化肽段富集方法联用，适于低丰度磷酸化肽段的定量标记肽段；在蛋白质水解分裂的同时被标记上，避免了人为因素的干扰。但由于标记后的蛋白质样品过于复杂，该技术还有待进一步的完善。 　3）相对和绝对定量同位素标记法。相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantitation，itraq）技术是美国应用生物系统公司在 2004 年推出的一项新的体外同位素标记技术[7]。该技术使用8种（或4种）不同的同位素试剂来同时标记和比较8种（或4种）不同的蛋白质样品。如今该技术的应用越来越广泛，其优越性也逐步在许多生物体和组织研究中得到了证明，已成为目前蛋白质组学定量方法中一个十分重要的技术。

itraq技术有如下特点：①样本量大。可对多达4个样本同时相对量化，大大降低了试验过程中所引入的技术误差；②定性分析结果可靠。可以同时给出每一个组分的相对分子质量和丰富的结构信息；③灵敏度、准确度高。将离子抑制效应、背景噪音和仪器条件等系统误差的影响降到最小，获得的变异系数在9%的范围；④分离能力强，分析范围广。作为标记的反应不在活细胞，适合任何类型的蛋白质样品，包括高相对分子质量蛋白质、酸性蛋白质、碱性蛋白质、不溶性蛋白质（eg.膜蛋白）等；⑤分析时间快，自动化程度高。

当然，itraq标记技术也有自己的局限性。对全组蛋白质而言，它只能对相对丰度进行比较，因此只能提供相对的定量；数据的复杂度更高，因此需要开发更多的信息学工具；高丰度蛋白质干涉了低丰度蛋白质的检测和鉴定；每次试验，研究人员都必须鉴别全部的蛋白质组[8]。

1.2.2 非标记定量技术 非标记定量法（label-free）是一种新兴的蛋白质定量方法，包括基于色谱峰面积定量法及利用二级离子信号的强度进行mrm（多反应监测）检测等。与标记定量法相比，非标记定量法不需要花费大量时间准备同位素化合物，也不需要使用非常昂贵的试剂，但该技术比较依赖于仪器的状态、样品的复杂性以及一些未知因素，其灵敏度和精确度都不及标记定量法。要得到广泛的应用，非标记定量技术还需要进一步的优化和改进。

1.2.3 鸟枪蛋白质组学策略 鸟枪法首先采用标记或非标记的方法将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，利用质谱进行分析测序，然后利用计算机技术描绘出肽段在蛋白质上的位置图谱，从而确定该混合物中的蛋白质成分。其代表方法是mudpit。

2 蛋白质组学在植物逆境生物学研究中的应用

自然界中有多种非生物和生物因子都会对植物的生长发育造成不利影响，严重时甚至会导致植物的死亡。植物对这些逆境胁迫都有很强的响应机制，可通过一系列从细胞到生理水平的应答反应来适应这些不利的环境条件。应用蛋白质组学技术研究在逆境胁迫下植物蛋白质种类及表达量的变化，将有助于人们从整体和动态的蛋白质水平了解胁迫因子的伤害机制以及植物的适应机制。

2.1 非生物胁迫的植物蛋白质组学研究

2.1.1 温度胁迫 温度是影响植物生长发育和农作物产量的重要环境因子。目前的研究较多集中于温度胁迫下差异表达蛋白质的鉴定和植物响应高温、低温分子机制的解析。

ganmulla等[9]将24日龄水稻秧苗的叶片分别在5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）的低温和28 ℃（36 d）、36 ℃（44 d）的高温环境下处理3 d，并检测其蛋白质组变化。采用无标记的鸟枪法，对每个处理组的3个生物

学重复进行了蛋白质定量分析。结果表明，在一个或多个处理组中被鉴定出来的蛋白，有超过400个都对温度胁迫进行了响应。其中，分别有43、126和47个蛋白专一地出现在了5 ℃（12 d）、12 ℃（20 d）和36 ℃（44 d）处理组中。并且，与其他温度处理相比， 12 ℃（20 d）处理后的水稻叶片蛋白质组发生的变化更显著。另外，该试验还鉴定出了20个新的胁迫响应蛋白。

为了检测在成熟的硬质小麦子粒中热胁迫对非醇溶谷蛋白积累所产生的影响，laino等[10]将意大利栽培种svevo进行了2个不同的温度处理（热胁迫和对照）。通过检测非醇溶谷蛋白的2-d模型，鉴定出了在灌浆期受热胁迫影响的多肽。这项研究共发现了132个表达发生变化的多肽，其中有47个（包括hsps和胁迫相关蛋白）是通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（maldi-tof）和基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱（maldi-tof-tof-ms）鉴定出来的。很多热诱导的多肽被认为会引起敏感植株的反应。

2.1.2 水分胁迫 近年来，研究人员利用蛋白质组学，已鉴定出一些水分胁迫响应关键因子，并揭示出植物应答水分胁迫所涉及到的多个代谢通路。

ford等[11]在2011年首次采用鸟枪蛋白质组策略研究了小麦（triticum aestivum l.）栽培种在干旱胁迫下的蛋白丰度变化。对不耐旱种kukri、耐旱种excalibur和耐旱种rac875在温室中进行周期性干旱处理，处理结束后从叶片中提取蛋白，共鉴定出5 125个肽段，并分析出1 299个蛋白。从中选择了159个在所有时间点都有表达的蛋白用itraq技术进行相对定量。在不同时间点，3个栽培种的蛋白组变化反映了它们对干旱胁迫的不同生理响应。结果显示，在胁迫处理前期，excalibur没有明显的蛋白组变化，而rac875的蛋白组发生了显著变化。这3个栽培种的蛋白组变化都与它们的氧化胁迫代谢和活性氧清除能力相一致，表现为超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的增多以及参与光合作用和卡尔文循环的蛋白的减少。

祁建民等[12]以鉴定出的耐旱性红麻品种ga42为材料，在5叶期设置正常供水与控水比较试验，运用双向电泳分析红麻在干旱胁迫和正常供水条件下叶片蛋白质组的动态变化。在干旱胁迫下出现65个差异表达蛋白质点，选择表达量明显上调的9 个蛋白质点，通过maldi-tof-tof ms分析和数据库检索，鉴定出6个差异表达蛋白，分别是2个核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶或其大亚基、1个rubisco活化酶、1个二甲基萘醌甲基转移酶、1个推测的胞质型谷氨酰胺合成酶以及1个atp合酶β亚基。试验证明，红麻ga42表现出较强的耐旱性与上述6个差异表达蛋白质点明显上调有关。 　komatsu等[13]将发芽2 d的大豆在水涝胁迫下处理2 d，从大豆的根系和下胚轴中提取蛋白质。经sd-page和cbb染色后，在每张凝胶上得到具有可重复性的蛋白点约803个。水涝胁迫引起了21个蛋白点的表达量升高，其中有定位/贮存相关蛋白（11个）、能量相关蛋白（3个）、信号转导相关蛋白（2个）、初生代谢相关蛋白（2个）、细胞结构相关蛋白（1个）、病害/防御相关蛋白（1个）以及转运蛋白（1个）。同时，7个蛋白点的表达量在水涝胁迫处理后降低，包括4个定位/贮存相关蛋白和3个病害/防御相关蛋白。

2.1.3 盐胁迫及渗透胁迫 土壤盐分过多是影响植物生长发育、导致农业减产的主要因素之一。盐胁迫对植物的危害主要体现在渗透胁迫和离子胁迫等方面。

barkla等[14]对植物质膜在盐胁迫下的作用进行了研究，鉴定出了参与调控液泡中na+隔离的蛋白质。对盐胁迫处理的冰叶日中花和对照进行的双向差异凝胶电泳分析表明，质膜包括质膜h+-atpase 和v-atpase的亚基，都与醛缩酶和烯醇酶这两个糖降解酶相关。利用免疫共沉淀证实糖降解酶与v-atpase的b亚基vha-b存在相互作用。体外试验证明，醛缩酶可以通过吸引atp来激活v-atpase的活性。采用拟南芥烯醇酶突变体进行生物学功能验证，发现这些突变体对盐胁迫敏感，并且在其质膜中，醛缩酶激活v-atpase水解活性的能力减弱。糖降解蛋白与质膜的这些联系直接上调了质子泵的活性。

bandehagh等[15]对油菜盐胁迫响应机制进行了研究，分析了耐盐的油菜栽培种hyola 308和不耐盐的栽培种sarigol的第二片新叶和第三片新叶中蛋白的表达。对处于营养生长期的植株分别进行0、175和350 mmol/l的nacl处理。与第二片新叶相比，第三片新叶中的na含量较高且生长势较弱。不耐盐植株中na的积累比耐盐

植株中更加显著。2-de凝胶检测出了900多个蛋白点，其中有44个和31个蛋白的表达量分别在耐盐和不耐盐的基因型中发生了变化。聚类分析发现，根据第二片新叶的盐含量可明显区分出这两种不同的基因型。ms分析鉴定出了46个蛋白，包括参与氧胁迫响应、能量供应、电子转运、翻译和光合作用的蛋白。

skirycz等[16]研究了拟南芥叶片在缓和而持久的渗透胁迫下的适应能力。通过15n代谢标记法分析了蛋白变化。结果表明，质体的atpase、卡尔文循环和光呼吸都被下调了，但线粒体的atp系统被上调了。这说明线粒体在植物遭受水分胁迫时对保护质体起到很重要的作用。此外，胁迫下的转录组和蛋白组数据非常一致，但很多蛋白与蛋白合成和降解相关，推测其受到了转录后水平的调控。

张恒[17]用不同浓度的na2co3对星星草（puccinellia tenuiflora）进行处理，研究了其在盐胁迫下的应答机制。应用itraq标记法对蛋白质组进行定量分析，发现叶绿体中68种na2co3应答蛋白质，它们主要参与捕光复合体、光系统ⅱ、光合电子传递链和光系统ⅰ的形成、能量代谢、卡尔文循环、光合色素代谢、基础代谢、胁迫防御、转录、蛋白质合成与命运，以及信号转导等过程。

2.1.4 营养胁迫 为了解水稻对磷缺乏的适应性，torabi等[18]分析了亲本株系nipponbare与其近等基因系nil6-4（在第12条染色体上携带一个主要磷吸收的qtl）的根系在1和100 mmol/l磷浓度下生长的蛋白质组。2-de检测到669个蛋白点，两种基因型中有32个蛋白有明显差异。其中，两种基因型在胁迫条件下有17个蛋白表现不同。质谱鉴定出参与适应磷缺乏途径的26个蛋白，包括活性氧清除剂、柠檬酸循环、信号转导和植物防御反应蛋白，还有一些未知功能蛋白。这说明不仅有一条控制适应磷缺乏能力的信号途径，可能还存在着不同途径间的相互作用。

visioli等[19]对黑杨的一个高度抗钙胁迫的未定种进行了蛋白组变化分析。运用2-d液相色谱技术分离出126个蛋白。其中，有20个蛋白被鉴定为受到了钙胁迫的影响，并通过maldi-tof进行了指纹图谱分析。在胁迫处理的样品中，丰度较高的蛋白集中在叶绿体和线粒体中，说明这两个细胞器在植物对钙胁迫的响应中扮演了重要角色。

李坤朋[20]对两种不同基因型的玉米在富磷或缺磷条件下的蛋白质组变化进行了双向凝胶电泳分析，分别鉴定出79个和108个差异表达蛋白，功能解析表明，这些蛋白可能在调控玉米根系形态发育、细胞周期以及感知环境磷浓度变化等方面发挥了重要作用。

2.1.5 其他非生物胁迫 其他非生物胁迫如臭氧、重金属、机械损伤等对植物的影响，也在蛋白质组水平上取得了一定的进展。

肖清铁等[21]以抗镉水稻品种pi312777和镉敏感水稻品种ir24为材料，在不同镉离子浓度的条件下水培处理7 d。与对照相比，不同浓度镉胁迫下，pi312777中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶、硫氧还蛋白和dna重组修复蛋白均上调表达；而ir24中热激蛋白、谷胱甘肽还原酶、蛋白酶体α亚基6型的表达无显著差异，但果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和硫氧还蛋白表达下调。此外，dna重组修复蛋白仅在镉胁迫的pi312777叶片中表达。这些差异表达的蛋白质很可能是水稻pi312777比ir24具有更强镉抗性的生物学基础。

fuhrs等[22]研究了豇豆蛋白质组对锰胁迫的响应，发现锰胁迫后豇豆叶绿体中与co2固定和光合作用相关的蛋白丰度下降，说明锰胁迫对豇豆的能量代谢产生抑制作用。

乐寅婷等[23]对比了油菜（brassica napus cv. westar）在机械损伤前后可溶性总蛋白的含量变化，发现损伤后蛋白表达量增高。双向凝胶电泳分析表明有8个蛋白质点发生了明显的上调或下调，质谱鉴定出rubisco小亚基前体、果糖-1，6-二磷酸醛缩酶和粪卟啉-3-氧化酶，这些蛋白质可能在油菜叶片应答机械损伤过程中起关键作用。 　ahsan等[24]用双向凝胶电泳法检测了在o3胁迫下大豆中蛋白质的变化，分别在叶片和叶绿体中鉴定出20个和32个差异表达蛋白。其中，参与光合作用（包括光系统ⅰ/ⅱ和碳素同化）的蛋白都在胁迫后表达量降低，而与抗氧化剂系统和碳代谢相关的蛋白表达量增高。参与糖代谢的酶活性在胁迫后增强，淀粉减少而蔗糖增加。试验表明在光合系统经受o3胁迫时，可能通过淀粉降解为三羧酸的循环功能，使碳分配受到了影响。

2.2 生物胁迫的植物蛋白质组

学研究

2.2.1 病原菌侵染 病原菌侵染时植物局部会发生坏死并诱导产生一些抗病蛋白质。

maserti等[25]以柑橘属（citrus l.）的果树为材料，对二斑叶螨（tetranychus urticae）侵染后和茉莉酸甲酯处理后的叶片进行了蛋白表达差异分析，分别检测出了110个和67个蛋白质点。应用液相色谱—串联质谱技术鉴定出50个蛋白，大部分都属于光合和代谢相关蛋白。其中有5个与氧胁迫相关的酶，包括磷脂谷胱甘肽过氧化物酶、1个盐胁迫相关蛋白、抗坏血酸过氧化物酶和锰超氧化物歧化酶。有7个防御相关蛋白，包括与发病相关的酸性几丁质酶、蛋白酶抑制剂类奇蛋白和低密度脂蛋白等。

采用双向电泳联用 moldi-tof-tof 质谱技术，张晓婷等[26]对水稻感病品种武育粳3号和抗病品种kt95-418感染水稻条纹病毒（rice stripe virus，rsv）前后的叶片进行蛋白质组学分析。结果显示，rsv基因组编码的病害特异蛋白（disease specific protein， dsp）在武育粳3号中的积累量明显高于kt95-418中。另外还鉴定出其他25个蛋白，包括rsv ns2蛋白，寄主中与光合作用、细胞氧化还原状态和离子平衡状态及蛋白的合成、转运与翻译后修饰等相关的蛋白。

钟云[27]选用广东主栽砧木资源——江西红橘的根系为材料，运用itraq技术，分析了其接种黄龙病病原后第50天的根系蛋白。鉴定得到差异显著蛋白78个。差异蛋白主要参与生物代谢、防御反应、抗氧化、转运和几丁质代谢等。与转录组关联性强的差异蛋白有36个，其中半数与抗病（逆）相关。植株感病后韧皮部筛管闭塞有关的筛管阻塞蛋白上调了1.67倍，这与防御黄龙病病原有关。另外，枯草杆菌样蛋白酶表达是对照的282.09倍，说明该酶参与了黄龙病病原菌的抵御及根尖分生区的保护。

2.2.2 虫害 魏哲[28]利用itraq技术筛选了水稻抗褐飞虱相关蛋白质。在褐飞虱取食96 h后的水稻叶鞘中，发现多种蛋白质表达量发生了显著变化。这些蛋白包括3个ja合成蛋白质（alpah-dox、aos和aoc），7个氧胁迫应答蛋白（cata、apx2和5个poxs），3个β-葡聚糖酶（gnsl、gns4和gns5），3个蛋白激酶（crks、crk6和atypicalrlk），1个蛋白网格蛋白，1个甘氨酸分解系统h蛋白，5个光合作用相关蛋白和4个水通道蛋白。其中aoc、cata、3个poxs、gnsl、gns5、3个蛋白激酶和网格蛋白更多地在易感性水稻株系中被诱导。

由于自然环境下植物时常遭遇多重逆境，因此，目前有不少针对植物逆境蛋白质组学的工作已不仅仅局限于单一胁迫，而是将相关性较高的几种胁迫进行整合研究。zhang等[29]对云南假虎刺（carissa spinarum）同时进行了42 ℃高温和干旱处理。在处理期和恢复期设置4个不同的时间点取叶片进行蛋白质组学分析，发现49个蛋白质点的表达量发生了变化。用ms和2-d凝胶法鉴定出30个蛋白，这些蛋白包括hsp、光合成相关蛋白、rna加工蛋白以及参与代谢机制和能量生产的蛋白。evers等[30]对马铃薯分别进行了冷胁迫和盐胁迫处理，并在转录水平和蛋白质组水平都进行了分析和研究。发现响应盐胁迫和冷胁迫的基因和蛋白有一致也有不同。在蛋白质组水平，大部分鉴定出的蛋白都在胁迫下表达增强了。大多数光合成相关蛋白的丰度在两种胁迫下都降低了。

3 展望

综上所述，作为后基因时代的一个重要研究手段，蛋白质组学已经在植物抗逆研究中广泛开展，获得了丰硕的成果，对传统的植物生理学及功能基因组学研究进行了补充。然而，植物对环境胁迫的响应是一个非常复杂的过程，人们对植物在逆境下产生的复杂的生物学反应都还知之甚少，在这方面的研究还处于初步阶段。随着越来越多植物全基因组测序的完成、est数据库的日益丰富，以及研究手段的不断改进，相信将会有更多的与抗性相关的基因和蛋白被挖掘，更全面地揭示植物抗逆性的本质，为植物抗胁迫品种的选择和培育奠定基础。

参考文献：

[1] 赵 欣，蒲小平.蛋白质组学在药物研究中的应用[j].中国药理学通报，2009，25（8）：988-991.

[2] 谢秀枝，王 欣，刘丽华，等. itraq技术及其在蛋白质组学中的应用[j]. 中国生物化学与分子生物学报，2011，27（7）：616-621.

[3] wolters d a， washburn m p， yates j r. an automated multidimensional protein identification technology for shotgun proteomics[j]. analytical chemistry，2001，73（23）：5683-569

0.

[4] gorg a， weiss w， dunn m j. current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[j]. proteomics，2004，4（12）：3665-3685.

[5] 喻娟娟，戴绍军.植物蛋白质组学研究若干重要进展[j]. 植物学报，2009，44（4）：410-425. 　[6] blindschedler l v， cramer r. quantitative plant proteomics[j].proteomics， 2011， 11（4）：756-775.

[7] ross p l， huang y n， marchese j n， et al. multiplexed protein quantitation in saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[j]. mol cell proteomics，2004，3（12）：1154-1169.

[8] 王林纤，戴 勇，涂植光. itraq标记技术与差异蛋白质组学的生物标志物研究[j].生命的化学，2010，30（1）：135-140.

[9] gammulla c g， pascovici d， atwell b j， et al. differential proteomic response of rice （oryza sativa） leaves exposed to high-and low-temperature stress[j]. proteomics，2011，11（14）：2839-2850.

[10] laino p， shelton d， finnie c， et al. comparative proteome analysis of metabolic proteins from seeds of durum wheat （cv. svevo） subjected to heat stress[j]. proteomics，2010，10（12）：2359-2368.

[11] ford k l， cassin a， bacic a. quantitative proteomic analysis of wheat cultivars with differing drought stress tolerance[j]. frontiers in plant science，2011，2：44.

[12] 祁建民，姜海青，陈美霞，等.干旱胁迫下红麻叶片的差异蛋白表达分析[j].中国农业科学，2012，45（17）：3632-3638.

[13] komatsu s， sugimoto t， hoshino t， et al. identification of flooding stress responsible cascades in root and hypocotyl of soybean using proteome analysis[j]. amino acids， 2010，38（3）：729-738.

[14] barkla b j， vera-estrella r， hern？魣ndez-coronado m， et al. quantitative proteomics of the tonoplast reveals a role for glycolytic enzymes in salt tolerance[j]. the plant cell，2009，21（12）：4044-4058.

[15] bandehagh a， salekdeh g h， toorchi m， et al. comparative proteomic analysis of canola leaves under salinity stress[j]. proteomics，2011，11（10）：1965-1975.

[16] skirycz a，memmi s，de bodt s，et al. a reciprocal 15n-labeling proteomic analysis of expanding arabidopsis leaves subjected to osmotic stress indicates importance of mitochondria in preserving plastid functions[j]. journal of proteome，2011，10（3）：1018-1029.

[17] 张 恒. 星星草（puccinellia tenuiflora）叶绿体na2co3胁迫应答的生理学与定量蛋白质组学研究[d]. 哈尔滨：东北林业大学，2012.

[18] torabi s， wissuwa m， heidari m， et al. a comparative proteome approach to decipher the mechanism of rice adaptation to phosphorous deficiency[j]. proteomics，2009，9（1）：159-170.

[19] visioli g， marmiroli m， marmiroli n. two-dimensional liquid chromatography technique coupled with mass spectrometry analysis to compare the proteomic response to cadmium stress in plants[j]. journal of biomedicine and biotechnology，2010：id567510.

[20] 李坤朋.不同基因型玉米对磷胁迫的反应及根系蛋白质组学研究[d]. 济南：山东大学，2007. 　[21] 肖清铁，戎 红，周丽英，等.水稻叶片对镉胁迫响应的蛋白质差异表达[j].应用生态学报，2011，22（4）：1013-1019.

[22] fuhrs h， hartwig m， molina l e b， et al. early manganese-toxicity response in vigna unguiculata l. ——a proteomic and transcriptomic study[j]. proteomics，2008，8（1）：149-159.

[23] 乐寅婷，李 梅，陈 倩，等.油菜叶片蛋白质组对机械损伤应答的初步分析[j].植物生态学报，2008，32（1）：220-225.

[24] ahsan n， nanjo y， sawada h， et al. ozone stress-induced proteomic cha

nges in leaf total soluble and chloroplast proteins of soybean reveal that carbon allocation is involved in adaptation in the early developmental stage[j]. proteomics，2010，10（14）：2605-2619.

[25] maserti b e， del carratore r， croce c m， et al. comparative analysis of proteome changes induced by the two spotted spider mite tetranychus urticae and methyl jasmonate in citrus leaves[j]. journal of plant physiology，2011，168（4）：392-402.

[26] 张晓婷，谢荔岩，林奇英，等.水稻条纹病毒胁迫下的水稻蛋白质组学[j].植物病理学报， 2011，41（3）：253-261.

[27] 钟 云. candidatus liberibacter asiaticus诱导的柑橘转录组学及蛋白组学研究[d]. 长沙：湖南农业大学，2012.

[28] 魏 哲.水稻对褐飞虱取食应答的蛋白质组学研究[d].武汉：武汉大学，2010.

[29] zhang m， li g， huang w， et al. proteomic study of carissa spinarum in response to combined heat and drought stress[j]. proteomics，2010，10（17）：3117-3129.

篇7

中药归经是用来表示药物作用定位的药性理论。归经理论源于《内经》，成于金元时代，再经后人的不断补充和发展，至明清时代已发展成系统理论，成为中药理论的重要组成部分之一，并用来指导临床用药。

目前对中药归经理论的现代研究处于停滞状态。由于至今对归经理论的认识不尽一致，无统一规范的客观判断标准，加之受到实验技术的限制，所以为从现代实验方法来探求归经的本质带来了很大的困难。笔者在回顾和总结分析了中药归经理论研究方法的现状后，提出了新的研究思路。

1 中药归经理论研究方法的现状

1.1 以药理作用来认识药物的归经

有人用数理统计分析法分析其药物作用与归经之间的关系，发现中药的归经与它的药理作用存在一定的相互关系[1-2]。

1.2 以有效成分来探索药物的归经

利用有效成分探索中药归经，应用较多的是借助同位素示踪和放射性自显影来观察中药中的某种活性成分在体内脏器的分布特点，以此说明中药活性成分的体内分布与中药归经的关系[3-4]。根据这种研究的结果来推论，中药归经的实质是指药物活性成分在体内某些脏器的高浓度分布。但以成分的脏器分布说明归经的实质则混淆了中医脏腑与解剖脏器在概念与内容上的差别，同时活性成分分布较多的器官，不一定就是该药作用最明显的靶器官。但作为一种新的研究方法，值得进一步探索。

1.3 用中药微量元素研究药物的归经

微量元素分析法是通过剖析中药中某些特异性元素的浓度，并结合这些微量元素在人体脏腑组织中的分布特点，来实现“归经”，从而发挥疗效，以推测微量元素是中药归经的物质基础[5-7]。

1.4 从受体学说判断药物的归经受体为首先与药物结合并能传递信息、引起效应的细胞成分，是存在于细胞膜上或胞浆内的大分子蛋白质。最初由Langleg[8]用来描述细胞上可与药物和其它化学信使物质结合并介导效应的化学成分。有人从分子药理的角度理解，认为归经理论可以从现代的受体学说来认识[9]。叶氏[10]也认为，归经与受体学说在强调药物对人体的特殊选择方面是一致的。只是归经主要从药物特性的角度出发，说明它对脏腑经络具有选择性的性能；而受体学说则是从人体组织器官的角度出发，说明它对药物具有特殊的敏感作用。这两种认识方法可谓“异曲同工”。

1.5 用环核苷酸检测法认识药物的归经

郑氏[11]报道，环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)是细胞内调节代谢的重要物质，两者具有相互拮抗、相互制约的生物学效应。正常情况下，二者必需维持一定的比例，若比例发生改变(偏高或降低)就会引起机体功能失调而导致疾病，这与中医的阴阳学说非常相似。有人用五味子、鱼腥草、汉防己3味药的水煎剂分别给大白鼠灌胃后，用放射免疫测定技术测定动物脑、肺、心、肝、脾、胃、肾、膀胱8个脏器组织中cAMP、cGMP的水平。实验结果发现，每一种药物对不同脏器组织中cAMP、cGMP水平的影响是不一样的。这表明cAMP、cGMP的浓度变化能在一定程度反映药物对某脏器组织的选择性作用。经统计分析还发现，cAMP、cGMP浓度以及cAMP/cGMP值有显著变化者之相关脏器，与各药归经的关系非常密切[12]。

最近，王氏[13]将麻黄、丹参、葛根、大黄给动物分别灌胃，通过测定动物心脏、肝脏等10种组织脏器中环核苷酸水平的变化，观察比较中药对组织选择性的影响。结果显示，给动物连续灌服麻黄等中药后，动物各组织脏器环核苷酸含量明显不同；在所测定的10种组织中，有9种组织受到麻黄的明显影响而出现cAMP/cGMP比值显著升高或者降低；而受丹参影响的组织仅有3种；葛根和大黄对组织环核苷酸的影响介于两者之间。

2 目前研究方法的可取之处与不足之处

综观以上各种研究和实验方法，其思路可概括为两大类：一是根据中药有效成分在体内的分布及其作用部位研究中药的归经，主要从归经与作用部位、归经与有效成分、归经与微量元素、归经与体内代谢等方面着手，运用同位素示踪、放射自显影、微量元素分析等方法进行研究；二是根据药理效应，选定某些特异性的药理观察指标研究中药的归经，主要从归经与药理药效、归经与受体、归经与环核苷酸等方面着手进行。这些研究方法和思路各有所长，有可取之处，但也有不足之处。

2.1 可取之处

在这些方法中，取各组织脏器作为观察材料是可取的，因为归经的“经”并非单纯的经络或经脉之意，而是带有药性理论特色的方向、部位的概念，是部位和功能的综合。正是由于大家知道中医的脏腑不同于解剖学上的脏器，所以才选择各组织脏器作为观察对象，去寻找药物发挥主要作用的部位，因为药物被机体吸收后，总要落实到相关的组织脏器才能发挥其药理作用。

2.2 不足之处

已知药物有效成分分布得较多的脏器，不一定就是作用最明显的靶器官，故仅从分布难以阐明药物发挥疗效的部位。

所检测的药物是主要活性成分，但不是唯一的活性成分，其分布不能代表所有活性成分的分布。

中药归经是从疾病对药的治疗反应中总结出来的，而大多实验所用都是生理状态下的动物，这就不能准确地反映药物在病理状态动物体内的作用过程。

最重要的问题是有些实验方法有悖于中医的归经理论。中医传统理论认为：一种药物主要对某一经或某几经发生明显作用，而对其它经作用较小，甚至没有作用，是为归经；根据药物在机体产生效应的部位各有偏重，将其归纳总结，使之系统化，便形成归经理论。

很明显，这里讲的应是药物对机体产生的效应而不是药物的分布。目前的研究方法大都是从观察药物有效成分的分布着手。从归经理论的定义来看，应从药效学观点出发观察药物的归经问题才符合中医归经理论。在这一点上，其实人们早已认识到了，只是由于研究技术的限制，即使目前有人从药效反应来研究药物归经问题，也只能是观察几个功能指标，而不可能观察药物对机体产生的全部效应。

3 新的研究思路与方法

如何做到全面地观察中药对机体各部位产生的效应，并从中发现潜在的规律，从而阐明归经理论的科学内涵是中药归经理论研究必须要解决的问题。在回顾和总结分析他人所做的有关研究工作之后，根据中药作用机制的特点和归经的定义，笔者提出一个假说，并根据这一假说，结合蛋白质组学研究技术，设计了新的研究方案，使较全面地观察药物对机体产生的效应成为可能。

3.1 中药的作用特点决定其效应可能发生在机体任何组织脏器中

由于中药成分复杂，单味药材就是一个化学分子库，虽然不是所有化学成分都是有效成分，但在发挥作用过程中是一个涉及多成分、多靶点、多途径的作用过程，因而其效应可能发生在机体任何组织脏器中，所不同的是在有的组织脏器中其效应较强，有的较弱。

3.2 其药效最终作用结果是影响机体蛋白质表达，且效应越强，蛋白质表达变化越大

从中药治疗疾病的机理来看，中药治疗疾病不是单纯强调以药物去直接对抗致病因子，重点在于调整机体功能状态，发挥机体抗病能力。中药有效部位或有效成分进入人体发挥作用，必然会引起从遗传信息到整体功能实现中的分子、细胞、器官、整体多个层面的结构与功能状态的改变，调节这些层面的结构与功能的本质是基因，其药效最终作用结果是影响机体蛋白质表达，因此药物对机体产生的效应能从蛋白质表达的变化反映出来，药物对机体某组织脏器产生的效应越强，其蛋白质表达应变化越大。

3.3 根据中药作用机制的特点和归经的定义，提出假说

由此，根据归经的定义和中药作用机制的特点，我们提出假说：归某经的药物对机体产生明显效应的组织脏器应当具有一定的共性，其效应的强度与该组织脏器蛋白质表达差异的数量有关，即效应越强，蛋白质表达差异的数量越多，反之亦然。

3.4 蛋白质组学研究技术的出现，使验证这一假说成为可能

蛋白质组学是一门对某一生物或细胞在各种不同环境条件下表达的所有蛋白质进行定性和定量分析的科学。蛋白质组学研究技术以其特有的思想方法和技术手段在解决生物学重大问题上已显示出其强大的威力。全世界的科学家正应用蛋白质组学技术来解决用传统方法所不能解决的问题[14]。同样，将蛋白质组学研究技术运用到药物归经理论研究中，可能会发现归经的潜在规律和本质，从而对中药归经理论的研究带来重大的突破。蛋白质组学集生物技术、分析技术、信息技术和材料技术等的精华，采用大规模、高通量、高速度的技术手段，通过研究基因所表达的所有蛋白质表达谱，可以较全面地观察到机体对药物作用产生的蛋白质表达差异，从而为从药效学观点出发研究药物归经的实质与内涵找到了一个极好的实验平台。

4 根据假说，制定研究方法

根据假说，利用蛋白质组学研究技术，我们只要观察药物对机体作用后各组织脏器蛋白质表达差异变化的程度，即可推断出该药物对机体组织脏器产生效应强度的大小。具有相同归经的药物对机体产生较强效应的那些组织脏器就必然有一定的共性，而产生效应强度较大的那些组织脏器就应与该药物所归经络有关。

根据各味中药的归经情况，我们可以有两种研究方法，这两种方法各有优点与缺陷。

4.1 用正常动物为实验观察对象

用正常动物为实验观察对象，所观察的中药可不考虑它的作用与药性，首先选取那些归单一经络的药物，如青葙子、密蒙花、赤芍、月季花、茜草等单归肝经的药物，浮萍、鱼腥草、挂金灯、马勃、苍耳子等单归肺经的药物，仙茅、巴戟天、海狗肾、阳起石、葫芦巴、蛇床子等单归肾经的药物作为观察对象。这种方法的优点是所观察的药物归经单一，便于找出其内在的规律。此方法的缺陷是用正常动物为实验观察对象，与用病理状态下的动物相比可能有所差距。

4.2 以中医证的动物模型为实验观察对象，观察中药在病理状态动物体内的作用过程

这种方法虽然能准确地反映药物在病理状态动物体内的作用过程，但由于作用相同的药物所归经络过于分散，只有为数不多的几类药物中存在5味以上归相同经络的药物，例如，平肝熄风类药中羚羊角、石决明、天麻、白蒺藜、贝齿、全蝎和蜈蚣等7味归肝经，祛风湿类药中豨莶草、海桐皮、石楠叶、松节、五加皮和千年健等6味归肝、肾两经，泽兰、荆三棱、蓬莪术、马鞭草、延胡索、姜黄等6味归脾、肝两经，且这几类药物所治疗的相应证候动物模型也不易制造，因此，这种方法也有一定的局限性。

以上方法无论选用哪一种，所观察的具有相同归经的药物至少选取5味。每味药给予一组动物，然后取每只动物的肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、胃、心脏、、大肠、小肠以及脑等组织脏器，提取蛋白质做双向凝胶电泳。其蛋白质表达图谱与给水对照组的各个相应组织脏器蛋白质表达图谱相比较，找出表达差异的蛋白质。然后，以表达差异蛋白质数量的多少排列各组织脏器，最后看给予归相同经络几味药的动物各组织脏器的排列顺序是否一致，而给予不同归经药物的动物各组织脏器的排列顺序是否不一致。如果能得到上述结果的话，那么我们就可能找到了归经理论的内在规律和其科学内涵。同时，我们也可得出排列在前面的几种组织脏器与所归的经络有密切关系的结论，这也可为中医有关经络的实质研究提供客观依据。

当然，我们也可能得不到这样的结果，这无非有两种可能：一种是假说本身不符合归经理论的真实客观情况，因此得不到预期的结果；二是假说正确，只是由于根据临床经验得来的各味药物的归经所属还不够精确客观，因而得不到预期的结果。

在目前中药归经理论研究停滞不前的状况下，迫切需要有新的研究思路与方法出现。此方法的思路与设计更加符合归经理论的定义，其蛋白质组学研究技术的应用是目前从药效学角度来研究中药归经问题的最佳途径和方法。在有条件的情况下，我们应尝试采用这一方法对归经理论进行实验研究。虽然我们不能肯定这种方法就能完全揭示归经理论的实质，但无论其结果如何都会对归经理论的研究有所帮助和推进，因为科学上的任何成就都是在不断总结前人成功和失败的经验基础上取得的。

参考文献

[1] 李仪奎，徐莲英，马建平.中药药理和归经关系的统计分析[J].中药通报，1988，13(7)：48－50.

[2] 高其铭.当归的药理研究与其归经功效关系的探讨[J].中成药研究，1985，(5)：13－15.

[3] 陆光伟.中药归经及其成分在体内的分布[J].中成药研究，1984，(5)：38－39.

[4] 郭顺根，牛建昭，贲长恩.3H-川芎嗪在动物体内分布的放射自显影研究[J].中国医药学报，1989，4(3)：17－21.

[5] 柴 立.从微量元素及其配位化合物对组织器官的富集、亲合探讨“归经”实质[J].微量元素，1984，(试刊号)：24.

[6] 朱梅年，柴 立.试论中医“肾”的物质基础中有关微量元素锌、锰的探讨[J].中医杂志，1983，24(5)：66－67.

[7] 徐径采.明目中药的归经与微量元素的关系[J].微量元素，1987，(2)：23－24.

[8] 王 莉(译).受体与递质：现代概念[J].中国药理学通报，1987，3(6)：379－382.

[9] 王海东.中药归经理论研究现状及受体学说关系的论证[J].浙江中医杂志，2001，36(8)：323－326.

[10] 叶显纯.论“归经”[J].山东中医学院学报，1980，(4)：11－12.

[11] 郑广华.阴阳学说与环核苷酸[J].自然杂志，1979，2(4)：208－209.

[12] 王树荣，孙 冰，丁国明.中药归经的实验研究[J].中国中药杂志， 1994，19(8)：500－502.

[13] 王树荣，翟继伟，盖英臣，等.麻黄等四味中药归经的实验研究[J].中华现代中西医杂志，2003，1(5)：388.

篇8

蛋白质组学简介

蛋白质组（Proteome）一词，源于蛋白质（protein）与 基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。

蛋白质组（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一个基因组（genome），或一个细胞、组织表达的所有蛋白质（Protein）。蛋白质组的概念与基因组的概念有许多差别，它随着组织、甚至环境状态的不同而改变. 在转录时，一个基因可以多种mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以许多形式进行翻译后的修饰。故一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学（Proteomics）处于早期“发育”状态，这个领域的专家否认它是单纯的方法学，就像基因组学一样，不是一个封闭的、概念化的稳定的知识体系，而是一个领域。蛋白质组学集中于动态描述基因调节，对基因表达的蛋白质水平进行定量的测定，鉴定疾病、药物对生命过程的影响，以及解释基因表达调控的机制。作为一门科学，蛋白质组研究并非从零开始，它是已有20多年历史的蛋白质（多肽）谱和基因产物图谱技术的一种延伸。多肽图谱依靠双向电泳（Two-dimensional gel electrophoresis， 2-DE）和进一步的图象分析；而基因产物图谱依靠多种分离后的分析，如质谱技术、氨基酸组分分析等。

蛋白质组学在大豆与根瘤菌相互作用中的研究进展

篇9

【摘要】 目的：研究梗阻性黄疸家兔血浆中蛋白质电泳变化。方法：复制家兔梗阻性黄疸模型，用淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳检测血浆中蛋白质电泳的变化。结果：血浆蛋白中α1球蛋白组分增多、纤维蛋白原增多;在血红蛋白类物质的三个区带中，有一个区带增多。结论：梗阻性黄疸家兔血浆中蛋白质成分发生明显变化，此变化是否与手术因素、黄疸因素或是机体对手术刺激的应激反应等有关，有待于深入研究。

【关键词】 梗阻性黄疸;家兔;血浆蛋白;血红蛋白

Abstract　Objective： To study the changes in plasma protein electrophoresis of rabbits with obstructive jaundice. Methods：Electrophoresis of agarose-starch mixed gel was used in these experiments. Results： There was an increases in α1 globulin and fibrinogen. Among the three electrophoresis zones of hemoglobin， there was an increase in one of them. Conclusions： There are some obvious changes in plasma protein elements of the rabbits with obstructive jaundice. It needs a further study to reveal if this is related to such factors as jaundice， operation or stress.

Key words　Obstructive jaundice; Rabbit ; Plasma protein; Hemoglobin

我们在关于血浆中蛋白质电泳变化与人类常见疾病关系的系列研究中发现，个别胆石症等梗阻性黄疸患者血浆中蛋白质电泳行为有变化，第一次电泳后原点残留血红蛋白量增多[1]，而目前国内外有关梗阻性黄疸研究中，很少涉及血浆中蛋白质的变化[2-5]。为了进一步深入研究，本实验通过复制家兔梗阻性黄疸动物模型及蛋白质电泳方法，探讨梗阻性黄疸后血浆中蛋白质的变化及其意义。

1　材料与方法

1.1　取材　采用胆总管结扎法复制家兔梗阻性黄疸模型，耳缘静脉采血。

1.2　电泳及染色　采用淀粉-琼脂糖混合凝胶薄层电泳。电泳完毕后将玻璃板置于丽春红溶液染色过夜，次日取出晾干，再用联苯胺溶液染色10 min，用漂洗液10 min，室温晾干。

2　结果

2.1　家兔一般情况　家兔胆总管结扎术后12 h出现尿色加深，术后2 d出现皮肤及巩膜黄染，粪便颜色变浅。随梗阻时间延长，家兔食欲减退，精神不振，反应渐迟钝，皮肤及巩膜黄染加重。术后5 d时取血，血清总胆红素、谷丙转氨酶含量均明显升高。

2.2　家兔梗阻性黄疸后血浆中蛋白质的单向电泳　从图1中泳道2可见，家兔梗阻性黄疸后α1球蛋白组分总体减少、其中慢泳成分增多，α2球蛋白组分增多，β球蛋白组分也增多;血红蛋白类物质区带由三个变成两个，其中快泳成分明显多于慢泳者。从泳道4可见，家兔梗阻性黄疸后α1球蛋白组分减少不明显、但其中慢泳成分明显或增多，α2球蛋白组分减少，β球蛋白组分未增多，白蛋白减少;血红蛋白类物质三个区带的中央成分明显增多。

2.3　家兔梗阻性黄疸后血浆中蛋白质的双向电泳　家兔梗阻性黄疸后血浆中血浆蛋白的变化及血红蛋白类物质的变化，与单向电泳结果基本相同，见图2。图1　家兔梗阻性黄疸前、后血浆中蛋白质的单向电泳

3　讨论

梗阻性黄疸是由肝内小胆管、肝总管或胆总管的机械性梗阻所致胆红素沉着导致的皮肤与黏膜黄染，是临床多发病之一，患者常出现肝、肾功能损害及消化道出血等一系列并发症，严重危害机体健康甚至生命。目前，人们对梗阻性黄疸的研究多集中在分子生物学、血液流变学、影像学等几方面，其中很少涉及有关血浆中蛋白质的变化。本实验发现，家兔梗阻性黄疸后血浆中蛋白质的电泳发生如下改变：(1)血浆蛋白中α1球蛋白组分增多，纤维蛋白原增多，白蛋白减少。(2)血红蛋白类物质含量增多。

人类α1球蛋白组分有α1抗胰蛋白酶、α1酸性糖蛋白等，在营养不良、严重肝脏疾病、应激等情况下均可增多。在肝脏疾病及应激状态下，白蛋白合成可减少。人类血浆中与血红蛋白有关的成分有结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、血红素结合蛋白(hemopexin，Hpx)。Hp位于α球蛋白区，Hpx位于β球蛋白区。Hp是一种α2糖蛋白，主要由肝脏合成，其功能是和血液中游离的血红蛋白结合，防止体内铁的丢失，属于一种急性反应蛋白。一些人类Hp的研究表明，许多疾病可以引起体内Hp含量的变化，而且某些疾病Hp含量的变化与疾病的严重程度相一致[7]。Hp广泛存在与哺乳动物体内，但每种动物Hp类型差异很大，且存在遗传多态性[8]。Hpx和游离血红素有特异结合能力，可配合结合珠蛋白对血红蛋白进行处理。Hpx可与血红素可逆地结合，避免血红蛋白和血红素从肾排出体外，是机体有效地保存铁的一种方式。已报道人类多种溶血性疾病、急慢性肝炎、肝癌、肾病综合征病人Hpx含量降低，某些肿瘤、慢性神经-肌肉病变病人Hpx含量升高[9]。有关家兔Hp或Hpx的含量及在梗阻性黄疸中发生变化的意义，尚未见文献报道。本研究推测，梗阻性黄疸家兔血红蛋白类物质成分增多，可能与上述两种蛋白有关。

家兔梗阻性黄疸前后血浆蛋白、血红蛋白成分发生明显变化。这些变化可能由黄疸因素、手术因素或是机体对手术刺激的应激反应等引起，有待进一步研究确定。

参考文献

[1]　秦文斌，高丽君，苏燕，等.血红蛋白释放试验与轻型β地中海贫血[J].包头医学院学报，2007，23(6):561-563.

[2]　关晓东，张百萌，熊国珍，等.热应激预处理对梗阻性黄疸大鼠肾功能的影响[J].中国误诊学杂志，2008，8(13):3032-3034.

[3]　王天然，曾祥元，胡晓莉，等.可逆型梗阻性黄疸兔血液流变性研究[J].四川医学，2006，27，(9):886-888.

[4]　林琳，巩鹏，马晓兰，等.梗阻性黄疸大鼠肾细胞凋亡及bcl-2表达的作用[J].中国普外基础与临床杂志，2007，14(3):296-299.

[5]　王天然，周纬，黄海，等.可逆型梗阻性黄疸动物模型探讨[J].世界华人消化杂志，2005，13(12):1454-1456.

[6]　周斌，姚南，李玉民，等.内皮素在梗阻性黄疸肝、肾、心组织损伤中的作用及血塞通干预[J].中国普外基础与临床杂志，2006，13(1):77-81.

[7]　Huntoon KM，Wang Y，Eppolito CA，et al.The acute phase protein haptoglobin regulates host immunity[J].J Leukoc Biol，2008，7(84):1-12.

篇10

Expression of HSP in the mouse brain after shortterm learning and memory

【Abstract】 AIM: To investigate the association of heat shock proteins (HSP70 and HSP27) with shortterm learning and memory. METHODS: Thirty mice were randomly pided into 3 groups: Trained group（TG）， swimming control group （SC） and blank control group（BC）. After shortterm training， the mice were killed and the brains were prepared for tissue section. An immunohistochemical method was used in detecting HSP70 and HSP27 expression. RESULTS: A significant increase in HSP70 levels was observed in hippocampus， cerebral cortex and nucleus amygdala in shortterm trained group， a little expression in SC group and hardly no expression in BC group. But no HSP27 expression was found in all the 3 groups. CONCLUSION: HSP70 may be a critical molecule involved in shortterm learning and memory.

【Keywords】 learning; memory; Morris water maze; heatshock proteins 70; heatshock proteins 27; immunohistochemistry

【摘要】 目的： 建立小鼠短期学习记忆模型，研究热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白27(HSP 27)是否参与学习记忆过程. 方法： 采用Morris水迷宫建立学习记忆模型，同时设立游水对照组及空白对照组. 训练结束后处死小鼠，取脑，灌注固定脑组织，冰冻切片，免疫组化染色检测脑组织中HSP70，HSP27的表达情况. 结果： 学习记忆模型组小鼠的海马、杏仁核簇及大脑额叶皮质高表达HSP70，游水对照组HSP70免疫阳性细胞数较少，空白对照组HSP70几乎无表达；HSP27在各组均无表达. 结论： HSP70可能是参与学习记忆的重要分子之一.

【关键词】 学习；记忆；Morris水迷宫；热休克蛋白质70；热休克蛋白质27；免疫组织化学

0引言

学习和记忆的机制至今不明. 热休克蛋白（heat shock protein， HSP）是一种在应激状态下产生的保护性蛋白质，具有复杂的生物学功能. HSP与学习记忆的关系如何，目前此方面的报道并不多见. 本文采用Morris水迷宫建立小鼠学习记忆模型，同时设立游水对照组和空白对照组，排除应激因素所引起的HSP表达，观察各组HSP表达的差异. 实验结果可望为研究学习记忆的分子机制提供新的思路.

1材料和方法

1.1材料

雄性昆明种小鼠30只，6周龄，第四军医大学实验动物中心提供. 利用随机数字表将其均分为3组，即正常空白对照组（BC）、游水对照组(SC)和学习记忆模型组(TG). 饲养条件为（22±1）℃，相对湿度40%~50%，自然昼夜非直接光照，自由饮食. 实验前动物适应环境15 d，以避免环境应激造成的HSP表达的变化.

1.2方法

1.2.1Morris水迷宫实验程序及组织准备Morris水迷宫（北京新天地科技公司）直径为90 cm，高度50 cm. 水深27 cm，平台置于水面下0.5～1 cm. 水温（21±1）℃. 采用视频图象处理系统记录小鼠寻找平台的时间及轨迹图. 参照Schimanski［1］的Morris水迷宫小鼠学习记忆模型建立方法，分为三个阶段训练小鼠. 训练前期：将小鼠放置于平台上，使其脱离平台后，在水中自由游泳30 s，然后引导其到平台上. 期间变换平台位置，共进行3次实验；训练期：将平台固定在一个象限的中点，每只动物从其它三个象限的任意位置头面向池壁释放入水. 记录动物游上平台的时间及轨迹图. 若60 s内小鼠未找到平台，人工将其引导至平台，并使其停留30 s，将游泳时间记录为60 s. 共进行4 d实验，8次/d，前4次实验为一组，后4次实验为一组. 组与组之间间隔时间约1 h，组内给予小鼠数分钟休息时间；空间探索期： 在训练期最后一次实验结束之后，撤除平台，让小鼠在池中游泳60 s，用于测试小鼠学会寻找平台后对站台的记忆能力. 学习记忆组完全按照上述方法行水迷宫实验，游水对照组与学习记忆组配对，水中不放置平台，使其游泳时间一致，也分4 d在同一时间进行. 空白对照组在实验期间一直置于正常饲养环境中. 实验在10：00～16：00进行，结束后将动物送回饲养室. 空间探索实验结束后24 h用10 g/L戊巴比妥钠麻醉小鼠，开胸，暴露心脏，先用生理盐水10 mL冲洗血液，然后用预冷的40 g/L的多聚甲醛(pH=7.4)固定液40 mL灌注固定完毕后取出全脑，后固定12 h，再将脑放入200 g/L的蔗糖溶液中，4℃过夜，组织块完全沉底后，用冰冻切片机连续冠状切片（冰冻切片机，Leica），厚度14 μm.

1.2.2免疫组织化学检测采用生物素酶标链霉亲和素原理(即SP法)进行免疫组织化学检测（SP9003试剂盒，宝信公司）. 具体步骤如下，组织切片室温滴加30 mL/L的H2O2，以阻断内源性过氧化物酶活性，加入试剂A(封闭用正常兔血清工作液)，孵育13 min，分别加山羊HSP70， HSP27多克隆抗体（1∶100， Santa Cruze 公司 ，李新民教授惠赠）， 4℃过夜. 然后依次加入试剂B（生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液）、试剂C（辣根酶标记链酶素卵白素工作液），各置于室温中15 min，以上各步骤间PBS充分冲洗. DAB棕色法显色，脱水、透明、封片. 用无关抗体和PBS作替代或空白对照. 细胞质棕黄色为阳性信号. 每组随机取6张切片，每张切片取3个高倍视野（×40），进行阳性细胞计数.

统计学处理： 学习记忆组 Morris水迷宫实验结果采用逐步回归分析法，免疫阳性细胞计数结果用x±s表示，用t检验进行组间比较，SPSS11.0软件进行处理.

2结果

2.1学习记忆模型的建立采用逐步回归分析法，结果发现两个自变量(次数，天数)进入回归方程，回归方程为： Y=28.581-1.816X1-8.407X2，Y为时间（单位s），X1为次数，X2为天数. 即说明小鼠寻找平台潜伏期与训练天数、次数有线性回归关系. 随着训练天数次数的增加，小鼠寻找水下隐藏平台的能力得以提高. 空间探索实验阶段根据小鼠在各个象限的时间分布，发现小鼠在平台所处的象限游泳时间最长，而且实验中可看到小鼠放入池中最先在目标象限游泳. 对采集到的轨迹图进行分析，训练初期小鼠为边缘式搜索，但在学习记忆模型建成后，大多都为直线趋向式(Fig 1).

2.2脑组织中HSP70，HSP27的表达学习记忆模型组脑组织细胞质内有棕黄色沉淀物，在杏仁核簇、海马和大脑额叶皮质，阳性反应神经元密集分布（Fig 2）. 而游水对照组阳性细胞零星散布，空白对照组几乎没有阳性细胞表达（Fig 3）. 学习记忆组HSP70阳性细胞数(115.1±12.0)，明显高于游水对照组(22.7±8.1， P＜0.05）. HSP27在各组间未有差异，均未达到免疫组化检测水平.

3讨论

Morris水迷宫是研究啮齿类动物学习记忆的一种实验工具，简便易行. 强迫动物游泳及迷宫环境对于动物属于一种应激行为. 通过调节水温可把这种应激降低，但是实验动物的神经系统及内分泌系统仍会发生一些改变，可能影响空间学习记忆形成过程中细胞分子的表达. 神经递质受体和生长因子是参与学习记忆的主要细胞分子. 其中包括三种受体：亲离子受体、促代谢受体和跨膜受体. 而生长因子研究比较多的是脑源性生长因子，Yamada等［2］发现其对学习记忆有重要作用. 突触可塑性及神经元所形成的神经网络是学习记忆的神经生理基础. 对于长期学习记忆，突触结构需要转录翻译合成新的蛋白质. 而短期学习记忆，可以不需合成新的蛋白质，它的形成与突触局部变化有关，如酶的活化、蛋白质的磷酸化及相应的电生理的变化［3］. Lisman等［4］认为钙/钙调节蛋白引起激酶Ⅱ（ CaMKⅡ）活性的改变是短期学习记忆的典型代表，通过此途径使AMPM谷氨酸受体的活性增加，来调节突触功能. 突触蛋白Ⅰ，突触结合蛋白Ⅰ，突触融合蛋白等都是短期突触可塑性的调节信号. 本实验对小鼠短期学习记忆的分子机制进行了研究，发现HSP70高表达. 即Morris水迷宫短期学习记忆过程中有新的蛋白质合成.

目前，各个领域都对HSP进行了深入研究，分子伴侣是其最重要的生物学功能，此外还能装配、折叠新合成的蛋白多肽，降解变性、错误折叠的蛋白质，调控调节蛋白的活性，参与细胞器、分泌蛋白膜转位［5，6］. 研究［7］发现，预先给予热休克处理，可对东莨菪碱诱发的记忆缺损起一种保护作用，即热休克反应产物HSP70可保护胆碱能受体不与东莨菪碱结合，从而维持学习记忆相关细胞分子的正常功能. 本实验发现HSP70可孤立于应激因素，在短期学习记忆中表达. Morris水迷宫环境（即游水对照组）可引起HSP70的表达，但是这种与迷宫相关的应激并没有引起HSP70表达的显著变化，切片染色只有零星的免疫阳性HSP70细胞. 而学习记忆组可看到密集的HSP70免疫阳性细胞，这现象证明HSP70可能直接参与空间学习记忆的形成过程. 而HSP27在三个组均未有表达，说明HSP27与学习记忆无关. 新近研究［8］认为，HSP27主要为一种抑制子，对于防止细胞凋亡起重要作用.

最新观点［9］认为特殊的学习记忆行为由特殊的脑区来完成，如暗示性学习记忆相关脑区为新皮质、新纹状体、小脑或杏仁体，外在性学习记忆主要依赖于海马，工作性学习记忆建立在额前皮质与其他脑区相互作用相互联系的基础之上. HSP在学习记忆信号通路中的详细作用机制还有待进一步研究. 我们可以从本实验中得到启发，对于临床上常见的轻度认知功能障碍、痴呆性疾病，尽早对其进行一些主动功能训练，可能可以通过增加HSP的表达来提高其学习记忆能力.

【参考文献】

［1］ Schimanski LA， Nguyen PV. Multidisciplinary approaches for investigating the mechanisms of hippocampusdependent memory: A focus on inbred mouse strains ［J］. Neurosci Biobehav Rev， 2004; 28(5):463-483.

［2］ Yamada K， Mizuno M， Nabeshima T. Role for brainderived neurophic factor in learning and memory ［J］. Life

Sci， 2002; 70(7):735-744.

［3］ Zipursky A. Learning， memory and transcription factors ［J］. Pediatric Res， 2003;53:396-374.

［4］ Lisman J， Schulman H， Cline H. The molecular basis of CaMKⅡ function in synaptic and behavioural memory ［J］. Nat Rev Neurosci， 2002;3(3):175-190.

［5］ Bratincsak A， Palkovits M. Activation of brain areas in rat following warm and cold ambient exposure ［J］. Neuroscience， 2004;127(2):385-397.

［6］ Young JC， Barral JM， Ulrich HF. More than folding:Localized function of cytosolic chaperones ［J］. Trends Biochem Sci， 2003;28:541-547.

［7］ Hung CH， Lin MT， Liao JF， et al. Scopolamineinduced amnesia can be prevented by heat shock pretreatment in rats ［J］. Neurosci Lett， 2004;364(2):63-66.

［8］ Concannon CG， Gorman AM， Samali A. On the role of HSP27 in regulating apoptosis ［J］. Apoptosis， 2003;8:61-70.