胰蛋白酶范文
时间：2023-04-12 02:25:15
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篇1
【摘要】
目的认识苏木素对胰蛋白酶作用活性的影响及苏木素对胰蛋白酶作用的荧光性质。方法用酶活性法观察苏木素对胰蛋白酶活性的影响；用紫外光谱和荧光光谱研究苏木素对胰蛋白酶作用的光谱性质。结果苏木素对胰蛋白酶活性可产生竞争性抑制，抑制剂常数k1=6.13×10-5 mol/l；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力。结论苏木素可使胰蛋白酶分子中的色氨酸所处环境的疏水性增强，使胰蛋白酶分子构象发生变化。
【关键词】 苏木素 胰蛋白酶 荧光光谱 紫外光谱 酶活性
中药苏木的主要成分苏木素(haematorylin)是组织、病理实验室中最常用的染色剂，可用于细胞核染色［1］。苏木素具有收缩血管、中枢抑制及抗炎等作用，具有行血、破淤、消肿、止痛的功效［2］。胰蛋白酶(trypsin)是人和动物肠道中一种重要的蛋白水解酶，从该酶被发现以来，人们对其进行了一定的研究，如用胰蛋白酶为催化剂对蛋白质进行降解的研究［3～5］。药物对胰蛋白酶作用的性质［6］及苏木素与dna作用的性质的研究已引起重视［7］。本文主要通过紫外和荧光光谱法研究苏木素与胰蛋白酶作用的性质，从而获得苏木素与胰蛋白酶作用时结构变化、所处微环境等信息，探讨苏木素与胰蛋白酶相互作用的机制，并对苏木素与胰蛋白酶作用活性的影响也进行了研究。
1 器材
1.1 仪器荧光分光光度计，美国cary eclipse（瓦里安）产品；双光束紫外可见分光光度计tu－1901，北京普析产品；ph－3c型酸度计，上海精密 科学 仪器有限公司产品。
1.2 药品牛胰蛋白酶（生化试剂），上海海洋生物技术有限公司产品；苏木素（生物染色剂bs），成都科龙化工试剂厂产品；硼酸（分析纯 ），成都科龙化工试剂厂产品。
2 方法
2.1 苏木素对胰蛋白酶活性影响在恒温水浴箱中将酪蛋白、胰蛋白酶和苏木素预热，按酶活性的测定方法，在胰蛋白酶与酪蛋白的酶解反应体系中加入不同体积的苏木素溶液，测定苏木素对酶活性的影响。胰蛋白酶活性及抑制常数测定参照 文献 ［8］方法操作。
2.2 苏木素对胰蛋白酶紫外光谱的影响配制ph＝7.5的硼酸缓冲溶液（内含0.1 mol/l cacl2维持离子强度）；用硼酸缓冲溶液配制1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液，再用3次蒸馏水分别配制2.0×10-3mol/l和1.0×10-3mol/l的苏木素溶液。
室温条件下，在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，扫描190～350 nm的吸收光谱。然后用微量注射往其中准确加入1.0×10-3mol/l的苏木素溶液10 μl，混匀，静置2 min后扫描190～350 nm的吸收光谱。扫描1.0×10-3 mol/l苏木素溶液190～350 nm的吸收光谱。
2.3 苏木素对胰蛋白酶荧光光谱影响在1 cm×1 cm的石英比色皿中准确加入 1.0×10-4mol/l的胰蛋白酶溶液3.0 ml，用微量注射器分别加入2.0×10-3mol/l的苏木素溶液0，10，20，30，40，50，60，70 μl。每次加入后混匀，放置5 min，分别在20，25，30，35℃下，测定其荧光光谱，激发波长为280 nm，绘制288～450 nm的荧光光谱。
2.4 苏木素对胰蛋白酶作用的同步荧光将“2.3”项下所配的温度为298 k的溶液，固定激发和发射波长间隔λ分别为20 nm和60 nm，同时扫描激发和发射波长并记录同步荧光光谱。
3 结果
3.1 苏木素对胰蛋白酶活性的影响苏木素对胰蛋白酶有抑制作用，当苏木素浓度为4.5×10-4 mol/l时，苏木素使胰蛋白酶的相对活性下降到70.2%，抑制率为29.8%。在不同的底物浓度（40，30，20，10 g/l酪蛋白溶液）下，按酶活性的测定方法测定酶的反应速度，其结果以1/v对抑制剂量用dixon作图法求出ki=6.13×10-5mol/l，抑制类型为非竞争性抑制。
3.2 苏木素对胰蛋白酶紫外吸收光谱影响图1为t＝298k，ph＝7.4时的吸收光谱。蛋白质分子中的色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基均有紫外吸收，蛋白质的吸收波长一般在280 nm附近。从图1可以看出，当往胰蛋白酶中加入苏木素后，混合溶液在280 nm附近的吸收峰均明显增高，说明苏木素与胰蛋白酶之间发生了作用，改变了胰蛋白酶的构象,而这种作用有利于胰蛋白酶分子中色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸残基的π－π* 电子 跃迁。
3.3 荧光光谱以λex＝280 nm，胰蛋白酶在354 nm附近有很强的荧光峰；而以同样激发波长激发苏木素溶液，在354 nm附近则没有荧光峰，证明苏木素不会产生与胰蛋白酶干扰的荧光。固定胰蛋白酶的量，随着体系中苏木素浓度的增加，胰蛋白酶的内源荧光产生有 规律 的猝灭，其最大发射波长未发生明显的变化（见图2）。
3.4 荧光猝灭常数及猝灭机理
3.4.1 苏木素对胰蛋白酶的猝灭效应一般情况下，可依据不同温度下的结果区别是动态猝灭，还是静态猝灭。对于动态猝灭，随着温度升高，将增加离子有效碰撞的数目，加剧 电子 的转移，使荧光物质的猝灭常数随温度的升高而增大。而对于静态猝灭则温度升高将降低复合物的稳定性，使猝灭常数减小。本文以相同的实验条件，分别测定了在20，25℃ 下胰蛋白酶的荧光猝灭光谱，以［f0/f－1］对［c］作stern－volmer图见图3。从图3可以看出苏木素在温度低于25℃时猝灭常数随温度的升高而降低，即符合静态猝灭机理。
当猝灭体分子和荧光物质分子之间形成新的复合物而发生静态猝灭时，服从lineweaver-burk方程。20，25℃时以（f0－f）－1对［c］－1拟合lineweaver-burk方程，由图4可见该双倒数呈现良好的线性关系，再次确定在20，25℃时为静态猝灭。
3.4.2 结合位点数n及结合常数ka的 计算 设苏木素与胰蛋白酶形成n个结合点位的复合物则有：
lg［（f0－f）/f］＝lgka+nlg［c］
分别作不同温度下lg［（f0－f）/f］－lg［c］的双对数拟合，得到不同温度下的ka和n见表1。表1 苏木素与胰蛋白酶的结合常数，结合位点数及相应的相关系数（略）
3.4.3 作用力类型的确定猝灭体与生物大分子之间的相互作用力主要有氢键、范德华力、静电引力和疏水作用力。根据以下公式计算。结果见表2。表2 苏木素与胰蛋白酶作用的热力学参数（略）
ln(k2/k1)=h(1/t1-1/t2)/r
g=-rtlnk
s=(h-g) /t
由上可知，h＜0和s＜0，可以说明苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力［9］。
3.4.4 苏木素对胰蛋白酶构象的影响固定激发波长与发射波长的间距λ，扫描同步荧光光谱，这种光谱可用于蛋白质构象变化的分析,由(a)λ＝20 nm所得到的同步荧光光谱图仅显示的是酪氨酸残基的荧光，(b)λ＝60 nm时仅表现出色氨酸残基的荧光，由图5可以看出在此实验条件下，酪氨酸和色氨酸残基荧光同时被猝灭，使其荧光强度下降，酪氨酸残基的最大发射波长没有发生改变，但色氨酸残基的最大发射波长发生了蓝移，表明色氨酸基所处环境的疏水性增强，引起了胰蛋白酶的构象变化。
4 结论
苏木素对胰蛋白酶活性可产生非竞争性抑制，抑制剂常数ki=6.13×10-5mol/l；苏木素对胰蛋白酶的荧光猝灭效应为静态猝灭，说明苏木素能与胰蛋白酶形成复合物；苏木素与胰蛋白酶之间的作用力主要表现为氢键和范德华力；苏木素与胰蛋白酶可发生作用，改变了胰蛋白酶的构象，而色氨酸所处环境的疏水性增强显著。
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篇2
关键词胰蛋白酶； 赖氨酸C端内切酶； 顺序酶切； 蛋白质组学； 液相色谱串联质谱； 遗漏酶切
1引 言
“鸟枪法”蛋白质组学（Shotgun proteomics）鉴定， 是基于高效液相色谱和质谱技术的“自下而上”（Bottomup）的蛋白质组学分析技术， 具有高灵敏度、高通量的特点[1]。该技术将蛋白质经特定蛋白酶酶切消化成肽段， 采用液相色谱串联质谱技术（LCMS/MS）进行分析[2]， 将检测到的肽段图谱与理论图谱进行匹配， 对蛋白质进行定性与定量分析。基于质谱的蛋白质组学研究， 已经建立了几乎完整的酵母蛋白质组表达谱[3]， 并于2014年绘制了第一张人类蛋白质组草图[4]。目前， 临床蛋白质组学项目已经完成了人类结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等临床组织的蛋白质组表达谱的分析[5～7]。
近十年来， “鸟枪法”蛋白质组学在细胞裂解、肽段分离、质谱碎裂方式、生物信息学分析手段等[8]方法学研究上取得了重大进展， 然而在蛋白质酶切中仍然多使用单一的蛋白酶―胰蛋白酶（Trypsin）。Trypsin可特异性识别并切割蛋白质/多肽链中赖氨酸（K）或精氨酸（R）羧基端， 具有极高的位点特异性， 酶切产生的肽段主要以赖氨酸残基或精氨酸残基结尾， 这些肽段在酸性条件下容易带二价或更高价态正电荷而被质谱检测， 因此Trypsin在Shotgun proteomics 研究中广泛使用。然而， Trypsin也存在一些缺陷， 如酶切时切割蛋白质不完全[9]， 且切割K、R位点的效率不同， 尤其K酶切位点的遗漏酶切比例较高[10]。样本制备体系中高浓度的盐、表面活性剂等都可能抑制Trypsin的活性[9]。Trypsin的这些缺陷将直接影响蛋白质鉴定的效率、质谱分析的重现性和蛋白质定量的准确性。
赖氨酸C端内切酶（LysC）是特异性识别并切割赖氨酸羧基端的蛋白酶， 在强变性条件下仍然具有酶切活性[10]。LysC与Trypsin联用， 能够在一定程度上克服Trypsin的上述缺陷， 使得蛋白质酶切更充分。1999年， Link等[11]首次提出将LysC与Trypsin联合用于分析大分子复合物； 随后， McDonald等[12]提出LysC/trypsin顺序酶切（蛋白先经LysC酶切， 再用Trypsin进一步酶切）方法， 用于复杂的蛋白质组学研究。Wada等[13]比较了十二烷基硫酸c聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）胶内酶切时， LysC/trypsin顺序酶切与Trypsin单独酶切对蛋白鉴定结果的影响， 结果表明使用顺序酶切得到的肽段长度适宜， 更易于从胶内提取出来， 而且更利于质谱鉴定。溶液内酶切（In solution digestion）由于具有操作简便、快捷、样本损失量少等优点， 是蛋白质组学研究中最为常用的酶切体系[15]。虽然LysC/trypsin顺序酶切已广泛用于溶液内消化[16]， 但目前很少有对溶液酶切条件下LysC/trypsin顺序酶切与Trypsin单独酶切进行比较的研究报道。2012年， Wisniewski 等[14]使用FASP（Filter aided sample preparation）方法， 发现顺序酶切得到的肽段总量增加了一倍， 且鉴定到的肽段数目、蛋白质数目均有显著增加。但该方法先用LysC在超滤管中对蛋白样本进行酶切， 之后离心收集酶切的肽段； 然后再向超滤管中加入Trypsin酶进行消化后， 离心收集酶切好的肽段， 最后合并两次离心得到的肽段样本。显然第一次离心收集的肽段因为仅用LysC酶切， 得到的肽段中会含有较多的R位点漏切的肽段， 肽段也较长， 在一定程度上不利于质谱检测。Glatter等[17]研究了溶液内LysC/trypsin顺序酶切的优势， 认为利用LysC/trypsin顺序酶切能得到较多的全酶切肽段， 从而提高可定量蛋白质的数目及定量结果的准确性， 但该研究并没有深入分析和探讨LysC/trypsin顺序酶切在蛋白质组样本鉴定方面的差异。目前， 对于LysC/trypsin顺序酶切在蛋白质组学样本制备中的应用仍然缺乏系统、全面的评估。
在顺序酶切时， 蛋白质与酶的质量比不同也可能会影响酶切效果， 常用的LysC质量比和Trypsin质量比例分别有100∶1和50∶1两种[18～21]。然而不同酶用量对实验结果是否有影响， 合适的酶用量是多少， 尚无详细和深入的研究报道。
本研究利用溶液内酶切方式， 从鉴定到的肽段数目、蛋白质数目、遗漏酶切位点数目、K/R遗漏酶切比例以及肽段长度和蛋白质覆盖率等多个方面， 评估了LysC/trypsin顺序酶切与Trypsin单独酶切的特性， 并比较了不同酶用量下对最终蛋白质组学样本检测结果的影响， 优化了酶切实验方案， 不仅大大提高了酶切效率， 而且也显著提高了蛋白质组学样本的检测效率和灵敏度。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Orbitrap Fusion三合一质谱仪， EASYnLC 1000纳升级液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）； DHP9052电热恒温培养箱（上海善志仪器设备有限公司）。
293T人肾上皮细胞（ATCC细胞库）； DMEM培养基（美国Introvigen公司）； 尿素（色谱纯）、NH4HCO3、半胱氨酸（纯度97%）、色谱纯三氟乙酸（TFA）、质谱级甲酸（FA）（德国SigmaAldrich公司）； 蛋白酶抑制剂（瑞士Rocher公司）； 二硫苏糖醇（DTT， 纯度99%）、碘乙酰胺（IAA， 纯度98%）（比利时Acros Organics公司）； 增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒（江苏碧云天生物技术公司）； 质谱纯乙腈（美国Thermo Fisher公司）； 质谱纯LysC、Trypsin（北京华利世科技有限公司）； 其它试剂均为色谱纯。
2.2实验方法
293T细胞在含10%胎牛血清（FBS）、1×105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中常规贴壁培养。生长至对数期后， 收集细胞， PBS缓冲溶液洗涤3次， 加入细胞裂解液（8 mol/L 尿素， 100 mmol/L NH4HCO3， 1×蛋白酶抑制剂， pH 8.0）， 冰上裂解30 min， 超声波破碎， 20000 g离心5 min， BCA法测定上清液蛋白质浓度。加入5 mmol/L DTT， 56℃ 反应30 min； 再加入15 mmol/L IAA， 避光条件下室温反应30 min； 最后加入30 mmol/L半胱氨酸， 室温反应30 min， 终止烷基化反应。
酶切消化过程分析进行5组实验， 第一组为Trypsin单独酶切（Tryp50/tryp100）， 其余四组为不同酶用量组合的LysC/trypsin顺序酶切（LysC50/tryp50， LysC50/tryp100， LysC100/tryp50， LysC100/tryp100）， 如图1所示。Trypsin单独酶切（Tryp50/tryp100）的方法为先将蛋白质溶液稀释4倍， 再按照蛋白质与酶质量比50∶1加入Trypsin （tryp50）， 37℃反应16 h后， 按照蛋白质与酶质量比100∶1补加Trypsin （tryp100）， 37℃继续反应3 h。顺序酶切的实验方法为： 蛋白质溶液不经稀释直接按预定比例（LysC50表示蛋白质与LysC的质量比为50∶1， LysC100表示蛋白质与LysC的质量比为100：1）加入LysC， 37℃反应3 h， 再将蛋白质溶液稀释4倍， 并按预定比例加入Trypsin， 37℃继续反应16 h。每组实验重复3次。酶切后的肽段用C18脱盐柱脱盐， 转干，
2.3高效液相色谱和质谱方法
液相色谱分离分析柱为自制毛细管柱（75 μm×15 cm）， 填充C18填料（3 μm粒径， 100 Dikma Technologies）。流动相A： 甲酸乙腈水=0.1∶2∶98（V/V）； 流动相B： 甲酸乙腈水（0.1∶98∶2， V/V）。梯度洗脱： 0～20 min， 8%～13% B； 20～51 min， 13%～26% B； 51～56 min， 26%～45% B； 56～57 min， 45%～80% B； 57～60 min， 80% B。流速： 300 nL/min。
Orbitrap Fusion质谱仪， 正离子模式检测， 离子传输毛细管的温度为300℃， 归一化碰撞能量为28%。采用数据依赖模式（Datadependent acquisition， DDA）进行采集， 包含一次MS全扫描（m/z 350～m/z 1300）， 分辨率R=120000（m/z 200）， 对其中强度最高的10个峰进行二级MS/MS扫描分析， 动态排除时间设置为60 s。
2.4数据处理
使用msconvert软件将质谱原始raw文件格式转化为mgf文件。使用Mascot 2.3.0搜索引擎搜索， 蛋白质数据库为Uniprot Human（版本： 20130507）； 胰酶最大漏切位点数为2， 母离子质量容差为10 ppm， 碎片离子质量容差0.5 Da， 固定修饰为半胱氨酸的烷基化修饰， 甲硫氨酸的氧化和蛋白质N端的乙酰化为可变修饰。采用离子分数20分筛选（cutoff）的方式进行过滤， 控制蛋白水平的FDR（False discovery rate）为1%。
3结果与讨论
3.1鉴定到的肽段数与蛋白数
首先对其鉴定到的肽段匹配谱图数（Peptidespectrum match， PSM）、非冗余肽段数目、蛋白独有肽段数目和蛋白质数目进行对比分析， 结果如图2A和2B所示， LysC/trypsin顺序酶切的肽段鉴定数目、蛋白质鉴定数目等均比Trypsin单独酶切高， 其中LysC100/tryp50组鉴定到的肽段数目、蛋白数目均最高。对顺序酶切相比单独酶切鉴定到的蛋白质和肽段提升的比例进行分析（图2C和图2D）， 发现LysC100/tryp50组提高的比例为11%～14%， LysC50/tryp50组其次， 提高了4%～7%。表明采用顺序酶切能够使蛋白质酶切消化更充分， 从而提高蛋白质和肽段的鉴定水平。此外， 研究结果还显示， 鉴定到的独有肽段数目也显著增加， 在进行蛋白质定量分析时可以进一步提高定量分析结果的准确性。
对比顺序酶切不同组实验的结果（LysC50/tryp50组与LysC50/tryp100M， LysC100/tryp50组与LysC100/tryp100 组， 图2C和图2D）， 发现当增加第二步中使用的Trypsin量时， PSM数目、肽段鉴定数目、蛋白质鉴定数目等都有显著提升， 说明在酶解过程中使用足量的Trypsin， 能进一步确保蛋白质的酶切程度， 对于提高蛋白鉴定水平具有显著意义。但是， 对比LysC50/tryp100组与LysC100/tryp100组、 LysC50/tryp50组与LysC100/tryp50组的结果发现， 增加第一步LysC酶的用量并不能提高最终的样本检测水平， 肽段、蛋白质等的鉴定水而有所降低。推测是由于随着第一步LysC酶的用量增加， 导致在第二步加入Trypsin进行酶切时， LysC酶仍然保留有较强的酶切活性， 造成在该环节中LysC酶对Trypsin酶发生了一定的酶切反应， 从而降低了第二步Trypsin的酶切效率及程度。以上实验结果表明， 在进行顺序酶切时， 第二步Trypsin酶切环节应该使用足量的酶， 以保证蛋白质被充分消化； 同时第一步加入LysC酶的量不宜过多， 避免其对Trypsin酶的切割， 导致样本最终的酶解不彻底。
3.2z漏酶切位点数目及比例
通过统计了各组实验结果中遗漏酶切的位点数目及比例， 进一步分析LysC/trypsin顺序酶切比Trypsin单独酶切能更有效提高鉴定肽段、蛋白质数目的原因。如图3所示， 使用Trypsin单独酶切时， 遗漏酶切位点的比例约为27%， 其中近80%为K遗漏酶切位点， 这与文献[13]报道的结果相符。而进行LysC/trypsin顺序酶切时， K位点遗漏酶切的比例显著降低。推测这不仅是由于LysC酶对赖氨酸具有高特异性酶切的特性， 而且在8 mol/L尿素的强变性条件下， 蛋白处于充分伸展状态， 使LysC酶能更加充分的对蛋白质进行酶切。因此， LysC酶和Trypsin酶进行顺序酶切能显著降低遗漏酶切位点数目和K位点遗漏酶切的比例， 从而提高质谱鉴定的重现性和定量分析的准确性。
3.3肽段长度分布
利用质谱进行蛋白质组学肽段样本检测时， 肽段过长或过短都不利于质谱检测与鉴定。对各组实验鉴定到的肽段长度进行统计分析的结果如图4所示。LysC50/tryp50与LysC100/tryp50两组鉴定到肽段的长度集中在7～21氨基酸残基（aa）， 且此长度区间的肽段数目明显高于其它3组， 而长度大于32 aa的肽段数目明显低于其余3组。对比LysC50/tryp50组与LysC50/tryp100组、LysC100/tryp50组与LysC100/tryp100组发现， 当第二步Trypsin酶使用量少时， 样本中鉴定到的肽段长度普遍较长， 统计分析发现主要是由于产生的遗漏酶切肽段较多导致的， 这与上文中当Trypsin酶的用量减少时导致的遗漏酶切比例升高的现象一致。
3.4蛋白质序列覆盖度
在蛋白质组学数据分析中， 蛋白质鉴定和定量的准确性与蛋白质序列的鉴定覆盖度密切相关。分别统计了各实验组中蛋白序列覆盖度在20～30%、30～40%、>40%区间的蛋白数目， 结果见图5。第二步Trypsin使用量较高的两组（LysC50/tryp50组与LysC100/tryp50组）， 在以上蛋白质序列覆盖度区间的蛋白数均最高， 说明顺序酶切时第二步使用足量的Trypsin能够增加蛋白质的序列覆盖度， 进一步证明其使得蛋白质被酶切的更加完全。此外， 序列覆盖度较高（>30%）的蛋白质中， LysC50/tryp50组的蛋白质数目均低于LysC100/tryp50组的数目， 提示第一步LysC酶的用量增大会导致第二步Trypsin效率的降低， 从而使得鉴定到的蛋白序列覆盖度低。
4结 论
本研究从鉴定蛋白质数目、肽段数目、遗漏酶切位点数目与比例、肽段长度和蛋白质序列覆盖度等方面， 对蛋白质组学样品溶液消化中的顺序酶切与单独酶切方法进行比较。结果表明， 顺序酶切能够使蛋白质被酶切的更完全， 从而降低遗漏酶切位点数目， 得到的肽段长度有利于进行质谱鉴定， 肽段数目、蛋白质数目以及蛋白质序列覆盖度均有所增加。顺序酶切时， 所用的酶量对实验结果有显著影响， 第二步使用足量的Trypsin能够更充分酶切蛋白质， 而第一步使用过量的LysC反而会影响到随后Trypsin的酶切效果， 使得蛋白质的酶切程度不彻底。本研究结果为蛋白质组学研究提供了实验基础， 对于提高蛋白组学样本检测的效率和灵敏度， 以及蛋白质组学的定量分析准确性具有参考意义。
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20Paulo J A， Gigy S P. Proteomics， 2015， 15（23）： 474-486
21Hebert A S， Richards A L， Coon J J. Mol. Cell. Proteomics， 2014， 13（1）： 339-347
篇3
【摘要】 目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法以市售大豆为材料，经酸浸、脱脂、硫酸铵沉淀、透析除盐、葡聚糖凝胶G-75柱纯化等方法进行大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯。然后，用大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃给药。通过比较正常对照组、实验对照组、大豆抑蛋白酶抑制剂高中低剂量组的多项血液指标（血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇）及各组小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制剂的降糖活性。结果给予大豆胰蛋白酶抑制剂灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明显下降，甘油三酯水平下降，总胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显变化。结论大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对糖尿病有较显著的疗效。
【关键词】 大豆 胰蛋白酶抑制剂 分离提纯 糖尿病 小鼠胰蛋白酶
抑制剂（soybean trypsin inhibitor，SBTI）是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的储藏器官，如种子、块根和块茎中［1］。大豆胰蛋白酶抑制剂已在多种医药领域有所应用［2，3］，另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［4］，但未见SBTI对糖尿病治疗效果的专项研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗作用进行研究和探索。
1 材料与仪器
1.1 试剂与药品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海维编科贸有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐，上海维编科贸有限公司)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，成都化学试剂厂生产)，Sephadex G-75（葡萄糖凝胶G-75，上海化学试剂厂生产），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖试剂盒-GLU(氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司)，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），总胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司），硫酸铵，正己烷，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，36%乙酸等均为国产分析纯。
1.2 仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂），DF206电热鼓风干燥机（北京医疗设备二厂），FA1004电子天平（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），AE240电子天平（METTLER公司）。
2 方法与结果
2.1 胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
2.1.1 大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）粗提物的制备用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制剂总量高［1］，故本实验采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制剂［5，6］。
2.1.2 大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的透析除盐将抑制剂粗制备物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。
2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5，7］参考文献［5，7］中方法，吸出存留缓冲液，加入1 ml样品，用缓冲液进行洗脱，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干净的试管分部收集，检测每管抑制剂的活性。
2.1.4 大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定［5，7］参考文献［7］中方法，以BAPNA为底物测定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的活性。计算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脱液（即大豆胰蛋白酶抑制剂的提取物）。
2.2 大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平的影响
2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立随机选取10只小鼠作为正常对照组(Control)。除正常对照组外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法测定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作为四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。将糖尿病模型小鼠随机分为实验对照组(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制剂中剂量组(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制剂高剂量组(Alloxan+SBTIH)。
2.2.2 分组给药及测定方法Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组和Alloxan+ SBTIH组的定时给药剂量分别为每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但为了消除不同给药剂量对实验结果的影响，需将Alloxan+SBTIL组和Alloxan+SBTIM组的药液用蒸馏水稀释，使得稀释后药液的给药量为每只每天0.5 ml。Control组和Alloxan组给予等容量生理盐水（0.5 ml）。连续7 d经口灌胃给药。末次给药后次日分别测定各组小鼠的血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇4项血液指标（均采用试剂盒法，其具体操作过程见试剂盒内说明书）。完成测定后，处死小鼠，取肾脏和肝脏制作病理切片。
2.2.3 大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响结果见表1。表1 对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响由表1可见，造模72 h后，四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠的血糖水平均显著高于正常对照组（P＜0.01），并且糖尿病模型小鼠状态较为萎靡，表明糖尿病模型制造成功。对照实验后的各给药组和糖尿病模型小鼠的血糖水平可见大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的降糖作用：由Alloxan组、Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组到Alloxan+ SBTIH组小鼠的血糖水平有逐渐降低的趋势，即血糖降低程度与给药剂量正相关。其中Alloxan+SBTIM组、Alloxan+SBTIH组与Alloxan组相比有明显降低（P＜0.01），尤以Alloxan+SBTIH组更为明显。结果表明，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病小鼠的血糖有较明显的降低作用。
2.2.4 SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C的影响结果见表2。表2 SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C指标的影响与Control组比较，aP＜0.01，cP＜0.05；与Alloxan组比较，bP＜0.01
本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中大豆胰蛋白酶抑制剂高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与四氧嘧啶糖尿病模型组之间存在统计学差异（P＜0.01），可认为给药组小鼠血清甘油三酯水平明显降低。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05），即影响不显著。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。
2.2.5 SBTI对糖尿病模型小鼠肾脏和肝脏细胞的病理切片显微镜观察结果比较观察图1～3，Control组小鼠肾脏细胞的组织切片中可见，其细胞形态为饱满，结构清晰，与周围细胞的界限较明显，细胞排列相对整齐；肾小球形态正常；近曲小管、远曲小管形状较规则，均匀排列。Alloxan组切片的细胞形态萎缩变形，轮廓不饱满，界限不清晰，细胞排列紊乱；肾小球固缩较明显，肾小球囊壁增厚；肾小管萎缩；间质组织细胞增生明显，有炎细胞浸润。Alloxan+SBTIH组细胞形态、界限、排列状况均较高血糖对照组有改善；肾小球固缩程度减轻；肾小管的形态、排列状况及间质增生情况也有改善。肾组织切片显示，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠的肾组织有一定的保护作用。
比较观察图4～6，Control组小鼠肝脏切片中可见，肝小叶结构完整，形态饱满，界限清晰；肝板排列规则整齐，且较为紧密。Alloxan组切片肝脏细胞体积变小；胞质嗜酸性增强，细胞核染色较深；肝板排列较为疏松，且不整齐。高剂量给药组小鼠的肝小叶结构明显，肝板细胞体积增大，排列较整齐、规则。
3 讨论
血糖是糖尿病的主要表征，临床上以血糖值作为糖尿病的主要诊断依据。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治疗效果。通过分析各组小鼠血糖水平的实验数据可得出，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病具有较好的治疗作用。
四氧嘧啶糖尿病小鼠较正常小鼠的血清甘油三酯，胆固醇水平均有升高［9］。本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与Alloxan组之间存在统计学差异（P＜0.01）。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05）。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。
由于糖尿病小鼠胰岛素的缺乏会引起肝糖原合成减弱和分解过程加强加速，引起糖尿病的肝细胞体积减小，胞质嗜酸性增强，即肝细胞发生病变；糖尿病肾组织中肾小管的重吸收作用降低，大量葡萄糖由肾脏排出，病理性渗透性利尿，即肾细胞发生病变。而且，蛋白质、脂肪、水和电解质的代谢紊乱等也对肝肾细胞造成相应的损伤。因而，通过其肾、肝脏器质病变程度也可反映出治疗糖尿病药物的疗效。肾、肝的病理切片反映，给药组糖尿病小鼠的病情有一定程度的好转。
从实验数据中可观察到，各大豆胰蛋白酶抑制剂给药组的CHO，HDL-C水平与Control组及Alloxan组之间均无统计学意义（P＞0.05）。因此，拟定在下一步研究中，通过四氧嘧啶和高糖高脂饲料诱导大鼠的高糖高脂糖尿病，研究大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型各项血脂指标的影响，进一步探索大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的疗效。
参考文献
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篇4
关键词：尿胰蛋白酶抑制剂（UTI）；肝癌细胞HepG2；增殖；迁移
Effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the migration and invasion of HEPG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro.
Yang Chaowen Luo Jiaxing Luo Weimin
Abstract：Objective： To investigate effects of urinary trypsin inhibitor （UTI） on the proliferation and migration of HepG2 hepatocellular carcinoma cells in vitro. Methods：Effects of UTI on HepG2 cells proliferation was evaluated by MTT assaya； Effect on HepG2 cells migration by UTI was evaluated by Transwell assay. Results：The UTI do not effect the proliferation of HEPG2 cells （P>0.05）. UTI suppress the migration of HepG2 cells dose-dependantly（P
Key words： Urinary trypsin inhibitor （UTI）； Liver hepatocellular carcinoma HepG2 cells； Proliferation； Migration
【中图分类号】Q51 【文献标识码】A 【文章编号】1674-7526（2012）12-0128-02
UTI是从尿液中提取的一种Ⅱ型Kunitz第二结构域的蛋白多糖，对丝氨酸蛋白酶（胰蛋白酶）、透明质酸酶和纤溶酶等多种酶具有抑制作用[1]，属于蛋白酶抑制剂，临床上常用于急慢性胰腺炎的治疗。然而近年国内外研究表明，UTI还能抑制多种肿瘤的转移，如卵巢癌、结肠癌、恶性间皮细胞瘤等，但其对肝癌细胞生物学的影响文献报道较少。目前认为抑制肝癌的转移已成为进一步提高肝癌术后生存率和治愈率的难点，在肿瘤转移过程中，肿瘤细胞的增殖和迁移能力尤为重要。因此，本研究通过体外细胞实验研究UTI对HepG2细胞的增殖、迁移的影响，初步探索UTI用于肝癌细胞活性的影响，为下一步研究内在机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂：人肝癌细胞株HEPG2由南华大学医学院病理实验室保存；UTI（批号021004042）购自广东天普生化医药股份有限公司；胎牛血清购自Hyclone公司；高糖DMEM培养液购自美国Invitrogen公司；MTT、二甲基亚砜（DMSO）均购自Sigma公司； Matrigel胶购自美国BD公司；PT-PCR试剂盒购自碧云天公司；Transwell小室购自美国Corning公司，膜孔径8μm；UPA多克隆单克隆抗体购自美国SantaCruz公司。
1.2 细胞培养与UTI配置：HepG2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置于37℃及5%CO 的湿化培养箱中。4-5d传代一次。UTI用培养液配成浓度为10000U/ml的储存液，过滤除菌，-20℃保存，使用时稀释至所需浓度。
1.3 细胞增殖实验：取对数生长期的HepG2细胞按1×104个/孔的密度接种于96孔培养板中。24h后，更换含不同浓度UTI的培养液（600、900、1500U/ml），每组设3个复孔；对照组为空白对照组。培养板继续培养24、48、72h，每天更换相应浓度UTI培养液，以保证浓度相对恒定。移除培养液后，每孔分别加入20μlMTT，37℃孵育4h。弃去MTT溶液后加入100μl二甲基亚砜，晃动10min。酶标仪测定490nm波长处每孔的吸光度（A）值。按公式计算增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（对照组A值-处理组A值）/对照组A值×100%。实验重复3次。
1.4 细胞迁移实验：取对数生长期HepG2细胞，消化后制成含无血清DMEM培养基的细胞悬液，调整细胞浓度为1×10 5/ml。在Transwell的上室中加入每孔150μl的细胞，加入含不同浓度UTI的培养液（600、900、1500U/ml），每组设3个复孔，对照组为空白对照组。在对应Transwell下室中加入600μl含20%FBS的DMEM培养基，37℃培养12h后取出Transwell小室，PBS轻轻冲洗2次，用棉签小心擦净小室底部微孔滤膜上层的细胞，然后将小室置于4%甲醇中固定10min，取出小室后结晶紫染色10min，PBS冲洗2次，于显微镜下观察滤膜下层的细胞。计算方法为200倍光学显微镜下随机计数5个视野的细胞，取平均值。
1.5 图像处理：利用HPIAS21000高清晰度彩色病理图像分析系统（南华大学医学院医研中心）分析细胞迁移图片，200倍光镜下随机选择5个视野拍照计数。
1.6 统计学处理：统计软件为SPSS 13.0。One Way-ANOVA方差分析比较多组间的差异，两组间则利用t检验；P
2 结果
2.1 UTI对HepG2细胞增殖无影响：试验结果显示，不同浓度UTI处理组分别在24、48、72小时的时间段，对HepG2细胞增殖的影响，与对照组比较差异无统计学意义（P>0.05，表1）。
表1 UTI对SK-HEP-1细胞增殖的影响（A490，）
注：对照组与各实验组比较，P>0.05
2.2 UTI显著抑制HepG2细胞迁移：HepG2细胞经过UTI处理12h后行transwell迁移试验，与对照组（403.17±27.05）个相比，600U/ml组穿过滤膜的细胞数为（298.83±20.9）个，900U/ml组为（153.5±18.9）个，1500U/ml组为（127±15.17）个。结果表明，与对照组相比，UTI各剂量组均能显著抑制HEPG2细胞的迁移且呈剂量效应关系，差异有统计学意义（P
3 讨论
原发性肝癌是世界最常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年上升，其对放化疗不敏感，病人5年生存率较低。目前临床上对于肝癌的切除率己有很大提高，但术后5年转移复发率仍然高达60%以上，因此，转移复发是影响肝癌远期疗效的主要原因。
UTI是从人体尿液中提取的一种Ⅱ型Kunitz第二结构域的蛋白多糖，是一种对酸对热较稳定的丝氨酸蛋白酶抑制物，具有抑制糖、多种蛋白酶和脂类水解酶的活性，稳定溶酶体酶，抑制炎性细胞因子的过度释放，防止缺血-再灌注损伤的作用。近年来，国外学者研究发现，UTI可抑制肿瘤的侵袭和转移[2，3，4]，但其对肝癌细胞的影响文献报道较少。本研究通过细胞迁移实验，证实UTI能在体外明显降低肝癌细胞的迁移能力，而对肝癌细胞的增殖无影响，这与在其他肿瘤中的发现是相符的[3，4]。过去认为肿瘤细胞表面存在UTI（UTI receptor，UTIR）受体，UTI与UTIR结合，改变细胞表面的环境、调节血浆酶的活性来抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。后来进一步的研究发现，UTI不能抑制肿瘤细胞的增殖，其抑制肿瘤的侵袭和转移也不是与UTI受体结合产生的结果，而可能是通过抑制与肿瘤细胞表面受体相关的纤溶酶系统而发挥作用。Kobayashi等[9]对卵巢癌的研究中发现UTI的N-末端是UTI与肿瘤细胞结合的位点，其C-末端则是抑制肿瘤转移的部位。然而，UTI抑制肿瘤细胞迁徙和转移的机制及UTI作用的靶点却仍不明确。
综上所述，本研究发现UTI能在体外显著抑制人肝癌细胞HEPG2的迁移能力，推测UTI对其UPA的mRNA及蛋白质表达抑制可能是其潜在机制。到目前为止，国内尚未见关于UTI抑制肝癌肿瘤侵袭和转移机制研究的报导，在体外实验中证实了UTI对肝癌细胞迁移能力的抑制作用。本研究为针对肝癌转移的治疗提供了新的思路，为下一步研究UTI影响肝癌细胞转移的内在机制奠定了实验基础。
参考文献
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篇5
【摘要】
目的：应用新型工艺制备阿霉素人血白蛋白微球(ADRHASMS)，并优化其最佳制备工艺。方法：以阿霉素(ADR)、人血白蛋白(HAS)为材料，采用超声雾化化学交联技术制备ADRHASMS；并应用正交设计法确定其制备工艺。结果：所得微球光学显微镜观测呈球型，圆整，粒径分布范围为2～5 μm，平均粒径为2.165 μm，载药量、包封率分别为(3.174±0.137)，(75.11±3.127)。结论：本法工艺可实现连续地、批量化生产，既能满足工业化生产要求，又可保证产品批量间的稳定性，具有良好应用前景。
【关键词】 阿霉素人血白蛋白微球 制备工艺 正交设计
白蛋白微球(albumin microsphere)是由人或动物的白蛋白制成的粒径为微米级的球状物［1］。早期的白蛋白微球研究主要集中在放射医学领域，用于检查肺循环异常［2］。后来人们发现白蛋白微球不仅可生物降解，无毒性和抗原性，而且对亲水性药物有较高的负载能力，很适合用作药物载体，于是将其应用于药物制剂尤其是抗癌药物制剂的研究中［34］。本实验利用“白蛋白微球制备仪”，采用超声雾化化学交联剂法制备肝靶向制剂ADRHASMS，可通过控制粒径实现靶向性。以粒径及其分布、载药量、包封率等为考察指标， 在单因素考察的基础上，对影响ADRHASMS制备的各个因素采用正交设计多指标综合评价法对微球的制备工艺进行优化筛选，从而确定了其最佳处方工艺。
1 实验材料
1.1 试剂 20%人血白蛋白(哈尔滨世亨生物工程药业股份有限公司)；注射用盐酸多柔比星(ADR)(浙江海正药业股份有限公司);25%戊二醛(天津市光复精细化工研究所，分析纯)；氢氧化钠(北京化工厂)；磷酸二氢钾(汕头市西陇化工厂)；胰蛋白酶(1∶250，宝泰克)；十二烷基硫酸钠(北京鼎国生物技术有限责任公司)；冰醋酸(北京化工厂，分析纯)；色谱甲醇、色谱乙腈；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器 501型超级恒温器(上海实验仪器厂有限公司);JR051型及JR031型超声波投入式雾化器(北京东方金荣超声电器有限公司)；HH1数显恒温水浴锅、852恒温定时磁力搅拌器(江苏省金坛市江南仪器厂)；A3S水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)；XSPBM生物显微镜(上海彼爱姆光学仪器制造有限公司)；LS13320MW激光粒度分析仪(BeckmanCoulter)；KQ100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TL5.0台式离心机(上海市离心机械研究所)；Waters 2487600高效液相色谱仪。
2 实验方法
2.1 ADRHASMS制备 超声雾化法是一种制备ADRHASMS的新方法，在超级恒温器中加入丙酮溶媒，在50 W的超声雾化器中加入与阿霉素为一定质量比的某一浓度的白蛋白水溶液，超声雾化后，采用在1 500转磁力搅拌器下缓慢滴加一定浓度的戊二醛交联剂，固化搅拌60 min后，用蒸馏水反复离心洗涤，即得红色阿霉素白蛋白微球。
2.2 微球性质考察
2.2.1 形态、粒径及分布测定 光学显微镜下观察所制微球色泽、形态、圆整度、表面等；用激光粒度分析仪测定微球粒径大小及粒径分布。
2.2.2 浓度测定 利用计数板，采用白细胞计数法测定微球浓度。
2.2.3 载药量测定
2.2.3.1 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的阿霉素标准品适量，用流动相作溶剂，制成浓度为1 mg/mL的标准贮备液。将其制成浓度为20、40、60、80、100、120 μg/mL的标准品溶液。采用高效液相色谱法，在254 nm处测定峰面积(A)，与浓度(C)做线性回归。
2.2.3.2 测定方法 酶解法降解ADRHASMS溶液，取阿霉素白蛋白微球混悬液加入酶解介质(内含0.1%胰蛋白酶的pH 7.4磷酸盐缓冲液)，于37℃恒温水浴中温育，经裸眼观察混悬液完全转变为透明溶液，由显微镜验证所有微球完全消失，降解液过滤，取40 μL进样，记录高效液相色谱仪测得的峰面积，带入回归方程得到阿霉素浓度。载药量(%)=测得微球中药物重量/微球重量×100%［6］。
2.2.4 包封率测定 处理同2.2.3.2项下操作，测定微球中和丙酮溶剂介质中的药物含量［6］。
2.2.5 正交设计筛选最佳处方工艺 根据单因素考察结果(数据略)得出，化学固化剂戊二醛浓度(Glutaral)(A)、搅拌速率(Stir Rate简化为S.R)(B)、阿霉素与白蛋白质量比(ADR:HSA)(C)及白蛋白浓度(HSA/%)(D)是影响ADRHASMS主要因素，按L9(34)进行正交设计，以粒径(R1)、载药量(R2)、包封率(R3)为考察指标，进一步筛选制备ADRHASMS最优工艺［7］。
2.3 数据分析 用SPSS10.0进行综合评分。
3 结果
3.1 微球形态、粒径及分布结果 40倍光学显微镜下观察，微球均匀圆整，表面较光滑，分散性好；用激光粒度分析仪测定微球粒径分布范围为2～5 μm，平均粒径为2.165 μm，95%的微球粒径落在5 μm内。
3.2 微球浓度测定结果 3个批次微球数目，计算得微球浓度为(1.2～1.5)×1015个/L，即(1.2～1.5)×1012个/mL(n=3)。
3.3 载药量测定结果
3.3.1 ADR线性回归方程 根据实验数据及线性回归，得到CA标准回归方程为C=25318A-3030.3(R2=0.9999，r=0.9999)，结果表明在20～120 μg/mL 范围内浓度与吸收度线性关系良好。
3.3.2 ADR回收率、精密度 经方法学考察，高、中、低3个浓度的平均回收率为99.57%，日内变异、日间变异系数均小于1%。
3.4 正交设计结果
3.4.1 正交设计因素水平表 见表1。
表1 正交设计因素水平表（略）
3.4.2 正交试验结果 见表2。
表2 正交试验结果（略）
3.5 Z值综合评价法分析结果 对实验结果进行直观分析，极差分析，确定影响因素的大小顺序是:C>D>B>A；最优处方：白蛋白浓度为5%，与阿霉素质量比为12.5∶1；化学交联剂戊二醛的浓度为0.25%，搅拌速率为1 500转。
4 小结
在微球的制备中，需要同时考察微球的粒径、载药量、包封率及外形等指标，以往的文献报道多是针对其中一个指标进行考察，往往单靠一个指标不能优选出兼顾多者的最佳工艺，本实验采用多指标综合评分法，不仅得到阿霉素白蛋白微球的最佳工艺，同时为其可能的工业化生产提供参考。
【参考文献】
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篇6
[关键词] 磷酸酶张力蛋白样同源物；肿瘤抑制因子；细胞增殖；蛋白印迹法；选择性剪接体
[中图分类号] R73 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）09-0001-04
[Abstract] Objective To identify a new phosphatase and tensin homolog（PTEN） subtype and explore its potential role in tumor suppression. Methods Western blotting， immunoprecipitation were used to detect the expression of PTEN subtype（upper PTEN，UPP） and PTEN in different cell lines. PTEN， UPP and mock-vehicle were transfected to HepG2 and PC3 cell lines， then tested PTEN and UPP's effection on tumor suppression by cell proliferation bioassay. Results The expression of UPP closely depended on the existence of PTEN. UPP was not a post-translational modification product by PTEN， rather than its alternative splicing variant. Compared to cells transfected with empty vector alone， HepG2 and PC3 cells transfected with UPP or PTEN inhibited cell proliferation， and there was statistical significance（P
[Key words] Phosphatase and tensin homolog； Tumor suppressor； Cell proliferation； Western blot；Alternative splicing variant
磷酸酶张力蛋白样同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）又被称为多种晚期癌突变基因（mutated in multiple advanced cancers，MMAC1），是继p53之后又一个重要的肿瘤抑制因子[1-4]。我们通常所指的PTEN是一个含403个氨基酸的蛋白质，具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶活性[5，6]。自从1997年PTEN被作为肿瘤抑制因子提出以来，人们发现在多种人类肿瘤中存在PTEN的缺失或突变[1-4，7]。目前针对PTEN的癌症治疗和其他疾病的治疗抱有很高期望。
我们和其他实验室发现在各种不同的组织和细胞中存在一个比PTEN大约大15kDa的同源蛋白[8，9]。此蛋白的存在严格依赖于PTEN的表达，且表达丰度和PTEN成正比，我们命其名为UPP（upper PTEN）。研究PTEN基因5'-UTR全序列发现在第513位核糖核苷酸存在一个非常规翻译起始位点CTG，且UPP在N端比PTEN多173氨基酸[8-10]。本实验拟鉴定UPP与PTEN关系，以及UPP潜在肿瘤抑制作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及细胞株
DMEM高糖细胞培养液、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、双抗（100 U/mL青霉素，100U/mL链霉素）均购自美国Gibico公司；Anti-Human PTEN（clone 6H2.1）抗体购自美国CASCADE生物公司；α-Actin羊单克隆抗体、GAPDH小鼠单克隆抗体、兔抗人IgG、猴抗羊IgG及羊抗鼠IgG二抗均购自美国Santa Cruz公司；Lipofectamine 2000 转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。A431、Cos-1、LNCaP、NIH3T3、PC3、293T、U2OS、HCT116、MDA-468、HepG2细胞株均购自上海中科院细胞库。MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）细胞株以及pcDNA3.1-PTEN、pcDNA3.1-UPP、空载体质粒由美国纽约斯隆癌症中心赠送。
1.2 细胞培养及转染
A431、Cos-1、LNCaP、PC3、293T、U2OS、HCT116、NIH3T3、MDA-468、HepG2、MEF（PTEN+/+）、MEF（PTEN-/-）细胞株用含10%FBS，双抗（100 U/mL青霉素，100 U/mL链霉素）的高糖 DM EM培养基，在37℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行实验。2×105细胞/3 mL接种于100 mm培养皿中，等其贴壁长到全皿的80%～90%时收蛋白。
按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将UPP、PTEN质粒和空载体分别转染进入HepG2细胞。转染前1 d，细胞铺板于100 mm培养皿中，使其转染日密度为90%。转染试剂用Opti-MEM无血清培养基稀释，细胞也用Opti-MEM无血清培养基孵育。转染6 h后，转染培养基换成完全培养基包含10%FBS和抗生素。细胞转染48 h后，提取蛋白。
1.3 蛋白印迹法（Western blot）检测
收集对数生长期的各细胞株，分别用含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液裂解，提取蛋白并定量。取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜后以5%脱脂牛奶封闭30 min，在1∶1000浓度的Anti-Human PTEN （clone 6H2.1） 抗体及1∶400浓度 α-Actin、GAPDH抗体中室温孵育2 h，TBST洗涤3次以后，1∶2000浓度的兔抗人IgG以及1∶1000猴抗羊IgG、羊抗鼠IgG二抗室温孵育1.5 h，TBST洗涤3次，通过加入BeyoECL Plus显色液于凝胶成像仪器曝光。
1.4 免疫共沉淀（Immunoprecipitation）检测
收集对数生长期的细胞株，同上述细胞裂解后，加入3 μg PTEN抗体，4℃孵育过夜。将预处理的20 μL protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4℃孵育2 h。免疫沉淀反应后，琼脂糖珠用裂解液清洗3次，PBS清洗1次，SDS-PAGE分离，western blot分析。
1.5 细胞增殖检测
UPP、PTEN和空载体转染 HepG2、PC3细胞，G418筛选数周后获得稳定表达细胞。将2×105个稳定表达细胞种在细胞培养皿中，每种表达细胞各种15个培养皿。从第2天开始每天取3个培养皿用胰蛋白酶消化收集细胞、计数取平均值，连续5 d。所得平均值以天为横坐标制作生长曲线，通过比较各种相应质粒转染的细胞生长曲线判断UPP、PTEN对细胞生长的影响。
1.6 统计学方法
采用SPSS13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P
2 结果
2.1 UPP是一种紧密依赖于PTEN而存在的蛋白
利用PTEN特异性抗体并借助免疫共沉淀和蛋白免疫印迹法，结果显示在A431、Cos-1、NIH3T3、293T、U2OS、HCT116、MEF（PTEN+/+）细胞中存在一个比PTEN约大15kDa的同源蛋白，此蛋白的存在严格依赖于PTEN的表达，且表达丰度和PTEN成正比。其中U2OS细胞存在UPP蛋白，但是表达量低。而LNCaP、PC3、MEF（PTEN-/-）细胞中UPP和PTEN均不表达（图1）。
2.2 UPP不是PTEN蛋白翻译后修饰产物
根据UPP分子量的大小，我们猜测了几种可能的翻译后修饰，如单泛素化、SUMO修饰、Nedd8修饰、ISG15修饰，并加以验证。在293T细胞中应用免疫沉淀法结果显示UPP不表达，提示UPP不是PTEN基因翻译后修饰产物（图2）。
2.3 UPP可能是PTEN蛋白选择性剪接产物
为了进一步确认UPP与PTEN的关系，我们转染C-末端HA-，和N-末端 GFP-的PTEN cDNA于COS-1细胞，使COS-1细胞过度表达PTEN，western blot结果显示PTEN表达量增多，但是不能检测到UPP（图3）。
0.1 μg/mL多西环素诱导PTEN缺失的MDA-468细胞，使其PTEN过表达，western blot结果显示，PTEN随着诱导时间表达量增多，但是仍无法检测到UPP表达（图4），以上结果说明UPP很可能是PTEN基因选择性剪接产物。
2.4 UPP可抑制癌细胞的生长
UPP、PTEN和空载体转染 HepG2细胞，检测细胞增殖数。结果显示，转染后第1天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（2.97±0.36）×105、（3.03±0.31）×105、（2.97±0.12）×105，各组间差异无统计学意义（F=0.17，P=0.85）。转染后第2天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（4.03±0.57）×105、（4.27±0.68）×105、（6.33±1.03）×105，各组间差异有统计学意义（F=7.84，P=0.02）；转染后第3天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（7.23±0.96）×105、（6.57±0.68）×105、（11.03±1.80）×105，各组间差异有统计学意义（F=11.29，P=0.01）；转染后第4天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（12.07±1.77）×105、（11.27±1.68）×105、（18.07±2.52）×105，各组间差异有统计学意义（F=10.13，P=0.01）（图5）。
UPP、PTEN和空载体转染PC3细胞，检测细胞增殖数，结果显示，转染后第1天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（2.99±0.30）×105、（2.75±0.42）×105、（4.18±0.67）×105，各组间差异有统计学意义（F=7.52，P=0.02）。转染后第2天，UPP、PTEN、空载体组细胞增殖数分别为（3.97±0.60）×105、（4.11±0.66）×105、（6.53±0.55）×105，各组间差异有统计学意义（F=17.06，P
3 讨论
PTEN作为继p53之后又一个重要的肿瘤抑制因子，学者针对其癌症治疗和其他疾病的治疗抱有很高期望。在针对PTEN的抗癌药物开发过程中，PTEN的调控是国内外研究的一个热点。已知的PTEN调控方式包括氧化、乙酰化、磷酸化、泛素化等[11-14]。其中磷酸化被研究得最多。普遍存在的蛋白激酶CK2能磷酸化PTEN蛋白的C端Ser/Thr残基[15]。PTEN去磷酸化后，其羟基端C2结构域外露，有助于PTEN实现膜转移，进而发挥其脂质磷酸酶的功能，抑制PI3K-AKT信号通路[16-18]。去磷酸化后的PTEN相对不稳定，在执行完功能后通常通过泛素-蛋白酶体途径被降解掉，但是CK2磷酸化的对象广泛，虽然通过抑制CK2能够激活PTEN，但因为其他CK2底物也受影响，副作用大[19]。
PTEN另一个被重点研究的翻译后修饰是泛素化，泛素化后的PTEN经由蛋白酶体降解[20，21]。临床显示很多癌症样本中的PTEN泛素化酶水平偏高，说明泛素化介导的PTEN降解可能是癌症发生的一个重要原因[20-22]。有趣的是，PTEN泛素化不仅导致它的降解。除了常见的多泛素化修饰PTEN还可被单泛素化修饰。Pier Paolo Pandolfi 实验室报道PTEN的单泛素化帮助PTEN实现细胞核转运[22]。临床上，从Cowden syndrome患者中发现的PTEN突变体K13E和K289E（两个重要的泛素化位点）虽然保留完整的脂质磷酸酶活性，却因为不能被单泛素化，无法转运入核行使抑癌功能[23]。这种单泛素化和多泛素化的矛盾给以PTEN泛素化酶为靶点开发癌症新药物带来困惑。
利用多种PTEN特异性抗体并借助蛋白免疫印迹法，我们研究显示在各种不同的组织和细胞中存在一个比PTEN大约大15kDa的同源蛋白――UPP。根据UPP分子量的大小，我们猜测了几种可能的翻译后修饰，如单泛素化、SUMO修饰、Nedd8修饰、ISG15修饰，并加以验证。这几种可能都被一一排除。用PTEN的cDNA转染细胞瞬间表达或在PTEN缺失细胞中长时间诱导PTEN的表达不能产生UPP，说明UPP很可能是PTEN基因转录选择性剪接产生的同源蛋白。
Hopkins等[9]是最早报道关于PTEN的亚基，他们将其命名为PTEN-Long，其具有膜脂质磷酸酶渗透性，由细胞分泌，并能进入其他细胞[9]。PTEN-Long的变异翻译起始于上游519bp位点的CUG，N端比PTEN多173个氨基酸，与我们实验室发现的UPP一样。研究显示PTEN-Long与PTEN一样可以通过调控PI3K-AKT途径诱导肿瘤细胞凋亡。之后Liang等[24]又发现一个PTEN亚基，命名为PTENα，其位于线粒体，与PTEN一起调控线粒体能量代谢。PTENα也是另一种翻译剪接体，但是其翻译也起源于上游一个非常规翻译密码CUG，其N段比PTEN多了一个173氨基酸（人类）或者169个氨基酸（小家鼠类）。但是PTEN-Long和PTENα调控的是两个不同的生物学途径，故他们可能是两个不同的PTEN亚基。
转染UPP于HepG2肝癌细胞可抑制其增殖，说明UPP抑制癌细胞生长。通常认为通过腺病毒将PTEN的cDNA重新引入有PTEN基因缺陷的患者体内，可以抑制因PI3K-AKT通路过于活跃导致的癌症[25]。但是，越来越多的临床报道显示腺病毒介导的基因治疗存在安全隐患，接受基因治疗的患者并没有像所期望的那样从癌症中康复，有相当一部分患者出现了由腺病毒导致的各类副作用包括新的癌症。新发现的UPP蛋白可能可以规避以PTEN基因治疗带来的副作用，为针对UPP设计治疗癌症和其他PTEN相关疾病的新方法提供依据。
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篇7
【关键词】益气活血方；心肌细胞；蛋白激酶C；缺血缺氧
文章编号：1009-5519（2007）18-2689-02 中图分类号：R26 文献标识码：A
益气活血方是中药黄芪、川芎、黄精、赤芍、红花、三七等药物组成的中药复方，在防治缺血性心脑血管疾病有较好的疗效。它能够降低血中脂质过氧化物形成，改善缺血后血流灌注，降低血液黏滞度，调节环磷酸鸟苷（cGMP）和环磷酸腺苷（cAMP）的动态平衡，促进血管新生[1，2]。但益气活血方如何在细胞水平上发挥其作用尚不清楚。近来的研究表明PKC在心血管的舒缩功能有重要的作用，本实验旨在通过体外培养的大鼠心肌细胞缺氧缺血模型，观察益气活血方对心肌细胞缺血缺氧条件下PKC活性的影响，以探讨益气活血方治疗缺血性心脑血管疾病的机制。
1 材料与方法
1.1 大鼠心肌细胞的培养：出生2~4日龄的大鼠幼鼠，75%酒精消毒皮肤。无菌操作取出心脏，用D-Hanks液或无血清培养基洗去血液。去外膜后用眼科剪将其剪碎。然后加入0.06%胰蛋白酶, 35~37℃消化10分钟，弃上清液。再加0.06%胰蛋白酶消化2~3次，每次10分钟。收集每次消化后的上清液，加血清终止消化。最后1 000 r/min，离心5分钟，细胞沉淀用含20%胎牛血清的DMEM培养基悬浮， 以5×105/ml接种到培养瓶中。 置5%CO2 37℃ 细胞培养箱中培养1～ 2小时后再轻轻吸出细胞上清, 接种到新的培养瓶中继续培养。隔天换液，待细胞快融合时进行实验[3,4]。
1.2 益气活血方含药血清的制备：将益气活血方复方制成水煎液，浓缩成每ml含1.25 g生药，4℃保存于冰箱中。取清洁级SD成年大鼠，体重180~220 g，雌雄不拘，随机分成两组，一组为灌服益气活血方组，一组为灌服生理盐水对照组。益气活血方的灌服剂量按成人与大鼠的体表面积换算成大鼠的用药剂量，每日灌服2次，每次2 ml，连续灌服7天，末次灌服1小时后经腹主动脉无菌取血，离心后得大鼠含药血清，过滤除菌后-20℃保存。生理盐水对照组的灌服和取血方法同益气活血方灌服组[5]。
1.3 心肌细胞缺血缺氧模型的复制：用自制的有机玻璃小盒，充入95%N2＋5%CO2，同时在培养瓶中加入低糖的培养基，作用4小时制成缺血缺氧模型[6]。
1.4 PKC的提取和测量：取原代心肌细胞，在冰上收集细胞，然后用低渗缓冲液孵育15分钟，超声粉碎仪粉碎细胞。4 ℃下18 000 r/min，1小时，上清液为细胞浆PKC的提取物。沉淀加入0.5% Triton X-100的缓冲液，同样在冰冻状态下孵育30分钟，4℃,10 000 r/m，10分钟，所得上清液为胞膜PKC的提取物，将所得的提取物通过层析柱DE-52过滤，然后收集通过紫外分析仪波峰时的洗脱液，即为比较纯的PKC提取物。
将提取的PKC加入到含有组蛋白、磷脂酰丝胺酸和γ-32P ATP的缓冲液中，置于30℃温浴30分钟，然后用γ-闪烁计数仪检测放射性，通过放射性计算PKC的活性。PKC的活性单位以fmol/mg・min-1计算。
1.5 实验分组：实验分为正常组（不做任何处理8小时后收集细胞测定PKC活性），治疗组（缺血缺氧4小时后加含药血清作用4小时再收集细胞，含药血清终浓度为20%），对照组（缺血缺氧4小时后加等量的生理盐水灌服组的大鼠血清，血清终浓度同治疗组，4小时后再收集细胞），每组重复3次。
1.6 统计方法：应用SPSS10.0电脑统计软件，数据用平均数±标准差（x±s）表示，用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P
2 结果(见表1)
胞浆PKC假治疗组与正常组相比，P
3 讨论
PKC是一类Ca2+、磷脂依赖性的蛋白激酶，在跨膜信号传递过程中起着重要作用。PKC通过催化多种蛋白质上Ser/Thr磷酸化，调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。
PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞， 静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以Ca2+依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上， 此过程称之为转位。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。
心肌细胞对于缺血缺氧等损伤较敏感，在体实验研究显示，心肌短暂缺血缺氧后，可引起心肌收缩力明显降低、心律失常和心肌顿抑等明显改变，其机理可能与心肌细胞钙超载、氧自由基大量产生等有关。而PKC在心肌缺血及缺血预处理中作用已日益引起重视。研究认为PKC在缺血缺氧中可能起到保护作用[7]。缺血缺氧过程中，PKC和ATP敏感K＋通道（K＋ATP）、腺苷受体、α-肾上腺素能受体、缓激肽、Ca2+以及Na+/H+交换蛋白等多种因素相互作用以调节心肌细胞的功能。PKC参与了K＋ATP通道的激活，K＋ATP的激活可以缩短动作电位时程和减少Ca2+的内流，从而发挥保护作用[8，9]。缺血缺氧过程中，细胞浆内Ca2+浓度升高以至钙超载是导致心肌细胞受损的主要和不可逆的因素。
PKC的激活可以减少心肌细胞对Ca2+摄取并降低游离钙的浓度，降低肌钙蛋白复合体对Ca2+的亲合力，从而抑制Ca2+浓度过高引起的心肌强直收缩；另外，PKC还可促使肌浆网磷酸化，钙泵活性增强，肌浆网摄取钙能力加强，有助于收缩心脏的快速舒张，保护心肌细胞功能。腺苷受体、缓激肽和α－肾上腺素能受体激活可以协同刺激PLC，PLC可以水解胞膜上的磷脂产生DAG，从而激活PKC，使其发挥保护作用。PKC还可以调节Na+/H +交换，Na+/H+交换对细胞内的pH值有重要的调节作用，细胞在缺血缺氧时酸化是一个重要的损害原因。PKC可以调节空泡质子ATP酶，抑制细胞酸化，从而发挥保护作用。在这些因素中，Ca2+和腺苷受体是PKC激活后从胞浆向胞膜转位的重要物质，若这种物质的浓度减低或者活化受阻，则PKC的转位也将发生障碍，但其具体的机制还不清楚。
在本实验中，益气活血方血清使正常的心肌细胞胞浆PKC的活性下降，而胞膜PKC的活性升高，表明益气活血方血清可能激活了PKC，促使其从胞浆转位到胞膜，但总的活性并没有明显变化，提示这可能只是一种低水平的激活和转位，这种激活作用可能调节了心肌细胞内［Ca2+］i，使其稳定在正常的水平，保护心肌细胞的功能。在缺血缺氧时，PKC的活性下降，而且没有发生胞浆向胞膜的转位，这可能是缺血缺氧导致了PKC活性下降，而且转位也发生了障碍，从而使PKC不能发生保护作用，导致心肌细胞受损。经益气活血方血清作用后，胞浆胞膜PKC活性显著恢复，而治疗对照组没有太大变化。由此我们认为，益气活血方血清可能是通过影响PKC的活性，从而发挥对心肌细胞保护作用，进而增强心肌的收缩和舒张功能，出现比多巴胺等药物还好的强心作用[10]。PKC也可能与其它信号通路相互作用来调节心肌细胞的功能，如丝裂原活化蛋白激酶通路[11]，或者cAMP通路[8]，但这些信号通路之间相互作用的机制不清。
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篇8
【关键词】 Eppin； ； 男性； 不育症； 避孕； 无症
进入21世纪，人们逐渐发现人类的繁衍生育能力正在逐渐下降，不孕不育已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后威胁全人类生存的三大疾病之一。WHO指出，排除女方的因素，婚后有规律性生活、未采取任何避孕措施的夫妻生活达到一年以上者，女方仍未能怀孕，可诊断为男性不育症。据WHO最新的统计结果显示，全球的不孕不育患者占世界人口的15%，并且这个数字还在飞速增加。我国的发病率约在12.5%左右，这些患者中约40%是由于男性因素导致的[1]。
质量是决定男性生育力最主要的方面，男性质量的下降是导致男性不育症的最重要原因，主要有少症、弱症以及畸形症[2]；另一方面，现代社会女性意外怀孕后的流产比例越来越高，目前针对男性的避孕措施仅仅局限于、体外、输精管结扎等[3]，并没有针对男性的可逆性药物，所以针对男性的避孕措施相对较少。大量研究表明Eppin（epididymal peptidase inhibitor）与生殖和免疫性避孕关系密切。本文对Eppin基因及蛋白的发现、特征及其在男性生殖等方面的作用做一综述。
1Eppin的发现及特征
研究发现部分人的精浆中存在一种蛋白质抗体，这种抗体会阻碍的液化和的运动，进而导致男性不育，后来人们将其命名为Eppin蛋白，由Eppin基因编码[4-6]。
人类Eppin表达的三种mRNA实际上只编码两种蛋白亚型（1、3的蛋白质序列一样），分别为Eppin 1和Eppin 2，它们的区别在于N端的氨基酸序列不同。Eppin 1是最主要的，它的mRNA编码133个氨基酸残基，1～21是信号肽，22～133是成熟蛋白，所以是一种分泌蛋白；Eppin蛋白理论上的等电点是8.52，相对分子质量（Mr）为15283[7]。这类蛋白质在和附睾中被检测到，可能在灵长类动物的繁衍中发挥重要的作用。
2Eppin对活动力的影响
O′Rand等[8，9]研究证实，重组Eppin免疫的雄猴无法使雌猴自然受孕，经过检测这些雄猴的血清发现其Eppin抗体阳性率非常高。王增军等[10]采用严谨的实验方法证明了存在于精浆中和表面的Eppin蛋白能够与精囊的凝固蛋白酶（Semenogelin）结合，同时让重组Eppin和重组Semenogelin的不同氨基酸片段自由结合，发现C端Eppin75-133氨基酸片段能够与Sg164-283氨基酸片段相结合，而且人类Semenogelin中唯一的胱氨酸残基（Cys239）就存在于Semenogelin片段中，这项研究证实了Eppin能够通过影响Semenogelin而发挥其作用，因此推测Eppin可能干扰了Eppin-Semenogelin结合，使形成团块影响了活动力。
ELISA法检测25例抗抗体阳性的不育患者中有7例Eppin（28%）阳性。然后使用Western blot方法进一步检测7例阳性患者的标本，发现有5例Eppin阳性表达。另外对25例可以正常生育的男性患者的进行检测，发现抗Eppin抗体均为阴性表达。这说明抗抗体阳性的不育患者的中含有抗Eppin抗体。抗Eppin抗体能够通过干扰正常Eppin和Semenogelin的相互作用，影响的成熟过程和液化情况，致使运动能力下降，进而导致患者不育。
丁新良等[11]通过对Eppin基因SNPS（单核苷酸多态性）的研究发现，位点rs2231829与数量之间以及位点rs6124715、rs11594与运动能力之间均存在显著相关性。在SNPS与发病风险的分析中，发现多态性位点rs2231829和rs11594的存在显著改变男性原发性不育症的发病风险，并且这种风险在质量异常的病例中非常明显。然而，这些SNPS各基因型对应的血清睾酮水平没有显著性差异。生物信息学分析表明，位点rs2231829影响转录因子的结合，而位点rs11594影响mRNA结构。因此可以推测Eppin基因多态性可能通过影响转录因子的结合以及mRNA的结构而影响该基因的生物学功能，进而干扰成熟过程，影响生育结局，但是这一假设还有待进一步研究证实。此外，以小鼠为研究对象，采用整体动物RNA干扰结合显微注射与膜片钳技术，发现Eppin基因低表达会引起小鼠运动能力明显下降，主要表现为平均路径速度、活力、直线速度和曲线速度的显著下降。进一步研究表明与运动能力变化相一致的是，小鼠生精细胞的T型钙电流也随之显著下降，T型钙通道的mRNA水平亦显著降低。因此可以得出以下结论：Eppin基因低表达导致生精细胞T型钙通道mRNA水平的降低和T型钙电流的下降，进而引起运动能力的下降。
3Eppin在OA和NOA诊断中的应用
基于Eppin基因在附睾和异性表达，Liu B等[18]采用Western blot的方法检测40例正常人和46例无症患者中Eppin蛋白的表达，将精浆中Eppin蛋白有表达的无症患者诊断为非梗阻性无症（NOA，Non obstructive azoospermia），而精浆中Eppin蛋白无表达的无症患者诊断为梗阻性无症（OA，Obstructive azoospermia），并且进一步通过经皮附睾穿刺术/经皮穿刺术（PESA/TESA）确诊无症的类别。对比发现，通过Western blot检测Eppin蛋白的表达得到的诊断结果与PESA/TESA的诊断结果非常类似。因此，Eppin蛋白检测或许是一种新的、有效的、无创的诊断OA和NOA的方法，将来有望在临床中得到广泛的应用。
4Eppin在男性避孕方面的应用
目前在避孕领域，男性避孕疫苗是研究的热点之一。Eppin蛋白是由和附睾特异性分泌，广泛存在于后的人类头部和尾部表面，进入附睾输出管后，表面与附睾头部和尾部所分泌的Eppin蛋白会发生特异性结合；另一方面，膜蛋白在发生和成熟过程中、受精过程中和胚胎早期发育过程中有着至关重要的作用，可能涉及到获能、顶体反应、穿透卵子透明带、精卵结合和受精卵的分裂等方面，机体可能对一些膜蛋白发生免疫反应，导致免疫性不孕症。顶体赤道区及顶体内膜含有顶体膜蛋白17（Sp17），Sp17会在顶体反应后大量表达，有促进受精的作用，其机制可能是Sp17能够与透明带上的糖基结合引起。因此Sp17和Eppin都可作为潜在的避孕疫苗靶点。
房磊臣等[19]采用基因重组及抗原抗体反应等方法，将人Sp17和Eppin作为靶抗原，成功构建了酵母Sp17-Eppin融合蛋白表达系统，获得了高纯度Sp17-Eppin融合蛋白，并且进一步在大量动物实验中发现这种融合蛋白疫苗组的避孕效应显著强于单一重组的Sp17蛋白疫苗组，大大增加了避孕效应。尽管其避孕效应具有可逆性，但同时也会造成缩小，因此对的生精功能会有一定程度的影响。然而这仍是对融合蛋白避孕疫苗构建的大胆尝试，为探索开发安全、高效、可逆的男性免疫性避孕疫苗新途径打下了坚实的实验基础。
5Eppin与糖尿病、肥胖症的关系
糖尿病、肥胖症等对男性生育力的影响正越来越受到大家的关注，它们造成的激素改变和新陈代谢紊乱会对男性生育力构成一定的危害，而且现在糖尿病和肥胖症的发病年龄越来越小，因此越来越多的人的生育力在生育年龄之前已经受到负面的影响。最近一项研究表明体重指数（BMI）对男性生育力的影响仅次于年龄。采用差异凝胶电泳方法对糖尿病患者、肥胖人群和正常人群的Eppin蛋白质组进行分析识别，对数据结果进行对比分析，证实了糖尿病患者和肥胖人群与正常人群之间的Eppin蛋白质组在表达程度上存在显著性差异[12～17]。
6结语
综上所述，Eppin基因和蛋白对质量有重要的影响，进而影响男性生育，但对其具体的分子机制报道的较少，下一步应着重对其机制方面进行研究。中抗Eppin抗体的检测或许能成为一种研究男性免疫性不育机制的无创的方法，不仅改善了不育症患者的特异性诊疗，拓宽了患者的辅助诊断指标，同时也为男性免疫性避孕疫苗的研发提供了一定的实验和临床研究基础。
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篇9
【关键词】肝硬化;单胺氧化酶;前白蛋白
【中图分类号】R446.11 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0018-01
病毒性肝炎后肝硬化已成为我国的常见病,对肝硬化的早期诊断与适宜治疗,对于稳定病情,延长患者的生命年限具有积极的意义。常用肝功能检查指标特异性不高;放免法检测透明质酸、Ⅲ型胶原、Ⅳ型胶原等指标条件要求高,检测时间长,不易普及。目前PA、MAO检测试剂盒已商品化,测定方法简便易行,可上全自动生化分析仪,与其它指标联合应用和动态测定有助于肝硬化的辅助诊断和病情判断。
1 对象与方法
1.1 对象:85例门诊及住院病人(男56例,女29例,平均年龄47±9岁),其中肝硬化代偿期患者56例(男34例,女22例,平均年龄46±6岁),失代偿期患者29例(男22例,女7例,平均年龄(52±11岁)均经临床确诊为肝硬化,检测其血清PA含量及MAO活力。健康对照系献血员血清50份,男38,女12例,平均年龄(34±11)岁。
1.2 方法:PA测定用免疫比浊法,MAO测定用连续监测法统计方法:数据均以(x±s)表示,采用方差分析(F检验)和相关分析,P
2 结果
肝硬化患者血清PA、MAO水平与对照组比较,见表1。
3 讨论
血清前白蛋白是肝细胞合成的蛋白质之一,由于在pH8.6电泳中移动速度比白蛋白快而命名为前白蛋白[1]。前白蛋白的半衰期仅为1.9d,与白蛋白(17~23d)相比,更是观测肝功能受损及营养缺乏的早期诊断指标[2]。肝硬化患者由于营养缺乏,同时有功能的肝细胞数目减少,前白蛋白合成下降,导致前白蛋白水平在代偿期即有显著意义的下降(P
MAO(Monoamine oxidase,EC1.4.3.4)为一组作用于不同单胺类化合物如肾上腺素、五羟色氨等氧化脱氨的水溶性酶,是由黄素蛋白和辅酶黄素蛋白腺嘌呤二核苷酸组成的含铜蛋白质,在胶原形成过程中,参与胶原成熟最后阶段的架桥形成,使胶原和弹性硬蛋白结合,形成纤维后MAO逸脱,导致血清中MAO活性升高,正常情况下胶原蛋白的合成和分解处于动态平衡,人体受到肝炎病毒感染后,引起肝内慢性炎症性刺激而产生纤维组织增生,肝纤维化时胶原合成增多,其总量的增加与肝纤维化程度呈正相关。MAO广泛存在于肝、肾、脑等器官的结缔增生,导致肝脏纤维化。在此过程中胶原合成增多,结果分析表明肝硬化时,MAO的活性明显增高,故MAO活性测定能反应肝纤维化的生化过程,对肝硬化的早期诊断和肝硬化的分级有重要诊断价值,肝硬化Child-PlughA、B、C各级之间MAO水平差异显著,对亚急性重型肝炎和慢性重型肝炎患者肝纤维化状况和监测有重要临床意义[3,4]。
综上所述,血清PA、MAO测定对肝硬化早期诊断具有重要的价值,PA、MAO测定有利于肝硬化的诊断、病程、疗效观察和随访。在实验室诊断中,我们应该利用MAO检测对肝硬化做出早期、准确的临床诊断。
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篇10
目的观察益气化淤中药对大鼠胃癌前病变胃黏膜蛋白激酶C（PKC）表达的影响。方法采用MNNG、乙醇、饥饱失常等多因素造模。造模型成功后，将造模存活大鼠随机分为自然恢复组，中药高、中、低剂量组， 各组大鼠作相应的处理后， 免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜组织PKC表达水平。结果各治疗组PKC表达较自然恢复组下调，有显著性差异(P
【关键词】 胃癌前病变 蛋白激酶C 益气化淤中药
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of Yiqi Huayu Recipe on the expression of protein kinase C(PKC) in rats with gastric precancerous lesions(GPL).MethodsThe model of GPL was established mainly through N-methyl-N-nitro N-nitrosoguanidine (MNNG) together with other factors including alcohol stimulation and undue hunger and overeating. The survived rats after modeling were randomly pided into spontaneous recovery， and high-， moderate-and low-dose of Yiqi Huayu Recipe group. After the corresponding treatment， the expression of PKC was detected by immunohistochemical method. ResultsThe expression of PKC in each treatment group were distinctly lower than that in spontaneous recovery group (P
Key words：Gastric precancerous lesions; Protein kinase C; Yiqi Huayu Recipe
慢性萎缩性胃炎（CAG）伴中重度不典型增生或/和不完全性结肠型化生是胃癌的重要癌前病变。益气化淤中药临床治疗胃癌前病变取得了很好的治疗效果［1］，为了探讨其作用机制，特设计本实验，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 药物及试剂
甲硝基亚硝基胍(MNNG)为Fluka公司产品，每周用双蒸水配成1 g/L的母液4℃避光储存，临用时用双蒸水配成所需浓度；脱氧胆酸钠购自湖北省医药公司；雷尼替丁由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产；PKC小鼠抗大鼠单克隆抗体为SantaGruz 公司产品；生物素化山羊抗小鼠IgG(二抗)、辣根酶标记链亲合素(三抗)、DAB、封闭用山羊血清等为博士德试剂公司产品。益气化淤中药主要由太子参、石斛、三七、郁金、白花蛇舌草等组成，浓度2 g／ml。
1.2 造模及给药方法
选用SPF级6周龄SD大鼠62只，体质量100～120 g。造模参照严茂祥等［2～6］综合造模方法并加以改进。大鼠自购进后适应性喂养1 d。从62只大鼠中随机抽取13只作为正常组， 其余49只用于造模。正常组大鼠不做任何处理；造模大鼠每日自由饮用100 mg/L MNNG液(饮料瓶用油漆涂黑避光)、进食含0.3 g/L雷尼替丁的纯鼠饲料、上午用56℃ 150 g/L的氯化钠液按10 ml/kg灌胃，进食2 d，禁食1 d，进食当天下午用8.5 g/L脱氧胆酸钠溶液按10 ml/kg灌胃。禁食当天下午用400 ml/L乙醇按10 ml/kg灌胃，连续24周。24周末时随机抽取正常组和造模大鼠各1只，杀检，观察组织病理学变化(以HE染色光学显微镜下观察的结果为主)，确认模型是否成功。
造模型成功后，将造模存活的48只大鼠随机分为自然恢复组12只。中药高、中、低剂量组(简称高、中、低剂量组)各12只。高剂量组每日每只按20 g/kg(相当于成人1 d用量的两倍)灌胃，中剂量组按10 g/kg(相当于成人1 d用量)灌胃，低剂量组按5 g/kg(相当于成人1 d用量的50%)灌胃。上述治疗16周。自然恢复组同正常组大鼠常规饮食。40周末所有动物禁食1 d，处死，剖腹取胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗，肉眼观察，平铺于硬纸板上，于胃窦部剪取组织1块，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋， 切片5 μm， 免疫组织化学染色。
1.3 PKC蛋白表达PKC一抗稀释倍数(1∶100)，染色步骤如下:切片脱蜡入水。3%H2O2室温孵育1 min，以灭活内源性酶。最后蒸馏水洗3次。将切片浸入TAB(0.05 mol/L，pH7.4)中，电炉加热至100℃，持续30 min。冷却后进行下一步。滴加抗原修复液，室温孵育10 min，蒸馏水洗3次。滴加正常5%山羊血清封闭液，室温孵育10 min，甩去多余液体。滴加稀释的一抗，4℃湿盒内过夜。TAB洗涤3次，每次5 min，滴加二抗室温孵育30 min。TAB洗涤3次，5 min/次，滴加三抗(HIGH-SABC)室温孵育30 min。TAB洗涤3次，5 min/次，DAB显色。自来水冲洗，苏木复染，封片。
1.4 观察方法及判断标准根据文献［7］加以改进。切片中出现黄染为阳性。每张切片由两位观察者独立计数，随机取染色区域4个高倍视野(×400)阳性细胞平均数，用半定量计分。染色强度用0～3级计分：0级为无染色；1级为轻度阳性染色；2级为中度阳性染色；3级为强阳性染色；染色范围根据细胞阳性染色的百分数而分为0～4级：0级为无染色；1级为5％～10％细胞染色；2级为10％～20％细胞染色；3级为20％～50％细胞染色；4级为>50％细胞染色。染色总评分为染色强度+染色范围。
1.5 统计学处理方法数据用±s表示， 组间差异性比较采用q检验，P
2 结果
PKC在正常组中主要存在于胞浆，其他组别中，除了胞浆外，在胞膜和胞核也可见。自然恢复组较对照组PKC表达增强，有非常显著性差异(P0.05)；各治疗组较自然恢复组PKC表达下调，有显著性差异(P0.05)。结果见表1。表1 各组大鼠的PKC蛋白表达(略)
3 讨论
蛋白激酶C(PKC)是1977年由日本学者Nishizuka等［8］首次在鼠脑的胞质成分中发现的一种依赖磷脂和钙的蛋白激酶，其广泛分布于真核细胞中，由多种具有不同生物学特性的同工酶组成，是细胞内信号传导的重要递质。PKC通常处于失活状态，被激活后可由细胞质转位到细胞膜，能够使众多蛋白质中的丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化而发挥作用。PKC的活化不仅与正常细胞和异常细胞的生长、分化、凋亡等多种生物学效应有关， 更在肿瘤的发生、发展、转移和多药耐药等方面发挥重要作用。有人采用不同浓度的PKC抑制剂Staurosporine(ST)作用于人胃癌细胞株MGC 803和SGC 7901后，细胞增殖受到明显抑制，表明PKC在胃癌细胞增殖中具有重要作用［9］。胃癌细胞增殖时，PKC活性表现为上调趋势，而诱导胃癌细胞凋亡时，它表现为下调趋势［10～12］，一些化疗药物和抑制增殖及诱导凋亡的药物如特异性环氧化酶 2抑制剂也通过下调PKC活性而抑制胃癌细胞生长［13，14］。
本实验结果表明，以MNNG为主的多因素联合攻击法诱发的大鼠胃癌前病变(自然恢复组)粘膜PKC蛋白表达明显增高，胃炎消能使PKC蛋白表达明显下降(与自然恢复组比较，P
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