胃蛋白酶范文
时间：2023-03-22 00:20:34
导语：如何才能写好一篇胃蛋白酶，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
据报道，测定血清胃蛋白酶原进行胃癌早期诊断的普查以及胃癌的预防干预计划，已在日本、芬兰、挪威等国家实行。日本利用胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ在大面积的人群中进行普查，使胃癌的早诊率提高到了90％。
以往的研究表明，血清胃蛋白酶原水平可反映不同部位胃黏膜的形态和功能，联合测定胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅰ/Ⅱ比值(PGR)被视为胃黏膜的“血清学活检”。
在正常人血清中的胃蛋白酶原Ⅰ浓度是胃蛋白酶原Ⅱ的6倍。胃蛋白酶原Ⅰ正常参考值范围为67～200 微克/升。
胃蛋白酶原Ⅰ
胃蛋白酶原Ⅰ>200微克/升：提示可能与饮食、药物的刺激或幽门螺旋杆菌感染以及胃溃疡、十二指肠溃疡有关。
胃蛋白酶原Ⅱ正常参考值范围
胃蛋白酶原Ⅱ>15微克/升：提示可能与幽门螺旋杆菌感染、胃溃疡、十二指肠溃疡以及胃窦部的疾病有关；
胃蛋白酶原Ⅰ/胃蛋白酶原Ⅱ比值（PGR）正常参考值范围为>7.5。
PGR
众多流行病学证据表明，胃癌患者胃蛋白酶原Ⅰ较健康者明显下降，胃蛋白酶原Ⅱ因为分布较广、变化不大。而胃癌患者PGR明显降低，是胃癌的高危信号。可见，血清胃蛋白酶原的测定是普查中筛选胃癌的良好指标。
临床上，若血清胃蛋白酶原呈现“阳性”结果，需再进一步进行多种肿瘤标志物的联合检测。这样常可在临床症状出现之前数月鉴别出复发和转移。胃蛋白酶原阳性者应每年检查一次胃镜，并进行密切随访，以早期发现变化，早期在内镜下进行治疗，以达到根治的目的。
篇2
【关键词】 胃蛋白酶原； 萎缩性胃炎； 胃癌 ；应用价值
Application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer SHI Ling-ling， ZHANG Ying-bo， DONG Lin. Department of Clinical Laboratory， Sanmenxia Central Hospital， Sanmenxia 472000， China
【Abstract】 Objective To investigate the application value of serum pepsinogen detection in early diagnosis of gastric cancer. Methods A total of 89 cases stomach illness were treated as the experimental group， and 40 cases of healthy people as the health control group. Results The levels of pepsinogenⅠ（PGⅠ） and ratio between PGⅠand PGⅡ（PGR） in the atrophic gastritis and gastric cancer groups were all lower than the healthy control group， and the differences were statistically significant （P
【Key words】 Pepsinogen； Atrophic gastritis； Gastric cancer； Application value
全球每年约有1万例胃癌新发病例， 居癌症最常见死因的第二位[1]。在我国胃癌是常见的恶性肿瘤之一， 发病率和病死率一直居我国恶性肿瘤之首， 早期发现和早期综合治疗是降低病死率的关键措施[2]。为探讨血清胃蛋白酶原（PG）检测在我国胃癌和癌前病变筛查中的应用价值， 本文采用免疫比浊分析法进行血清PG水平检测， 通过血清PG检测分析胃病患者血清胃蛋白酶原Ⅰ、Ⅱ水平和胃黏膜病变的关系以及临床应用价值。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 2012年5月～2013年12月本院门诊及住院患者89例， 其中胃癌组17例， 男10例， 女7例， 平均年龄（48.6±11.8）岁；胃溃疡组29例， 男19例， 女10例， 平均年龄（46.3±10.6）岁；萎缩性胃炎组23例， 男16例， 女7例， 平均年龄（47.8±11.2）岁；浅表性胃炎组20例， 男12例， 女8例， 平均年龄（45.9±10.4）岁；所有患者均经胃镜及病理学诊断确诊。健康对照组40例， 男26例， 女14例， 平均年龄（51.7±14.2）岁， 为本院体检科健康体检者， 均无肝、肾、胃等疾病及病史。各组患者一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。
1. 2 检测方法 受检者清晨空腹抽血并分离血清， 提取0.5 ml血清于-20℃冰冻保存备用。血清PGⅠ、PGⅡ含量用日立7600-020全自动生化分析仪胶乳增强免疫比浊法检测， 试剂盒、校准品和质控品均由北京万泰公司提供。
1. 3 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行统计分析。计量资料以均数± 标准差（ x-±s）比较， 采用t检验；计数资料采用χ2检验；组间比较采用方差分析。P
2 结果
2. 1 浅表性胃炎组和胃溃疡组血清PGⅠ水平和PGR显著增高， 与健康对照组比， 差异有统计学意义（P
2. 2 胃癌阳性检出率 联合检测PGⅠ和PGⅡ， 胃癌阳性检出率为88.23%， 萎缩性胃炎阳性检出率为73.91%， 胃溃疡阳性检出率为13.79%， 浅表性胃炎阳性率为5.00%， 而健康对照组检出率仅为2.50%。在这五组中胃癌阳性检出率最高， 萎缩性胃炎次之， 浅表性胃炎阳性检出率最低。见表2。
3 讨论
PG是胃蛋白酶的前体， 分为PGⅠ和PGⅡ。PGⅠ和PGⅡ由胃体黏膜的主细胞和颈黏液细胞分泌， 但PGⅡ也可由胃窦的幽门腺和十二指肠的Brunner腺分泌[3]。胃黏膜发生病变时， PG分泌细胞受累， 血清PG水平也发生相应变化。因此， 血清PG水映了不同部位胃黏膜的形态和功能[4]， PGI是检测胃泌酸腺细胞功能的指针， 胃酸分泌增多PGI升高， 分泌减少或胃粘膜腺体萎缩PGI降低；PGII与胃底黏膜病变的相关性较大（相对于胃窦黏膜）， 其升高与胃底腺管萎缩、胃上皮化生或假幽门腺化生、异型增值有关；PGⅠ/PGⅡ比值进行性降低与胃黏膜萎缩进展相关。因此， 联合测定PGⅠ和PGⅡ比值可起到胃底腺黏膜“血清学活检”的作用[5]。胃癌预防亚太地区共识与指南中第15条：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例反映了胃萎缩， 低血清PG可作为萎缩性胃炎的一个替代标志物。第16条：低血清PGⅠ水平和低PGⅠ/PGⅡ比例可作为鉴别胃癌高危人群的标志物[6]。而在前面的检测中萎缩性胃炎阳性检出率仅次于胃癌的阳性检出率， 据报道有80%以上的胃癌伴有萎缩性胃炎， 而大约10%的萎缩性胃炎可发展为胃癌[7]， 检测PG含量可反映胃黏膜状态及功能情况。上世纪90年代日本在临床试验的基础上， 血清PG作为慢性萎缩性胃炎的标志物已被纳入胃癌的筛查项目中， 结果显示PG检测有利于检出早期胃癌。
近几年来， 国内外大量资料报道[8， 9]因受检人群、地区差异及检测方法等的不同， 血清胃蛋白酶原检测筛查胃癌早期临界值存在很大区别。目前大多报道均以日本Miki 等[5]提出的PGⅠ≤70 μg/L和PGⅠ/PGⅡ≤3.0作为临界值， 灵敏度和特异度分别为77%和73%；而萎缩性胃炎患者PGⅠ/PGⅡ比值的临界值在HP阴性受试者中为6.0， 而在HP阳性受试者中为3.0。本文采用胶乳增强免疫透射比浊法检测PGⅠ、PGⅡ含量及PGR， 萎缩性胃炎组PGⅠ及PGR值分别是（56.29±20.14）μg/L和（4.52±1.57）明显低于健康对照组（81.92±26.22）μg/L和（7.82±1.59）， 而检测发现胃癌患者和萎缩性胃炎患者中PGⅠ
综上所述， 血清PGⅠ、PGⅡ及PGR检测方便、快捷， 适合大范围人群。筛查出阳性患者， 通过PG水平的检测可反映胃黏膜变化， PGⅠ
参考文献
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篇3
关键词 婴儿生理性腹泻 复方胃蛋白酶散 宝乐安
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.01.163
生理性腹泻多见于6个月以下的婴儿，其外观虚胖，常有湿疹，出生后不久即腹泻，每天大便次数多，甚至十几次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般没有特殊腥臭味。生理性腹泻的婴儿除大便次数增多外，多无其他症状，食欲好，无呕吐，生长发育不受影响，添加辅食后，大便即逐渐转为正常。但是长时间的生理性腹泻容易继发细菌性肠炎，肛周糜烂，严重者可发生脱水、生长发育迟缓［1］，偶尔也可发生短暂的肠绞痛，致使患儿长时间哭闹，因此婴儿生理性腹泻也需要积极的治疗。应用复方胃蛋白酶散联合宝乐安治疗婴儿生理性腹泻，取得满意的疗效，现报告如下。
资料与方法
2006年4月～2011年5月收治生理性腹泻患儿68例，男30例(44.1%)，女38例(55.9%)。＜1个月患儿38例(55.9%)，1～4个月患儿23例(33.8%)，4～6个月患儿7例(10.3%)，期中纯母乳喂养患儿54例(79.4%)，混合喂养13例(19.1%)，人工喂养1例(1.47%)。患儿表现多为生后1周左右开始出现腹泻，每天大便次数多，甚至十几次，大便稀黄，呈蛋花洋或者黏液稀便，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，并有酸奶味，一般没有特殊腥臭味，患儿多伴有腹胀，排气多，多不影响食欲及生长发育，多数病例大便常规多次均未检出白细胞、红细胞，个别病例白细胞＜3个/HP，脂肪球若干个，粪便细菌培养均为阴性。
治疗方法：所有病例均采用复方胃蛋白酶散联合宝乐安治疗。①＜1个月：复方胃蛋白酶散0.5g/次，2次/日。宝乐安0.25g/次，2次/日。②1～4个月：复方胃蛋白酶散0.5g/次，3次/日。宝乐安0.25g/次，3次/日。③4～6个月：复方胃蛋白酶散0.6g/次，3次/日。宝乐安0.375g/次，3次/日。用温开水送服，疗程2周，用药后由专人负责复查，并记录用药后3天、7天、14天腹泻症状的演变恢复(腹泻次数、大便性状、是否腹胀以及用药后有无不良反应)。
疗效判断标准：①显效：治疗3天粪便性状及次数恢复正常，全身症状消失；②有效：治疗7天粪便性状及次数明显好转，全身症状明显改善；③无效：治疗14天粪便性状、次数及全身症状均无好转，甚至恶化。总有效率为显效+有效。
结 果
结果显示，治疗3天后总有效率89.7%，7天总有效率92.6%，14天总有效率97.1%。治疗效果，见表1。
讨 论
生理性腹泻多见于6个月以下的婴儿，其外观虚胖，常有湿疹，出生后不久即腹泻，每天大便次数多，甚至十几次，每次大便量不一定很多，其中含少量水分，一般没有特殊腥臭味。生理性腹泻的婴儿除大便次数增多外，多无其他症状，食欲好，无呕吐，生长发育不受影响，添加辅食后，大便即逐渐转为正常。婴儿的消化能力有一定的限度，如果给婴儿吃的食物超过其承受能力，就会发生腹泻。比如，将牛奶里的水分蒸发掉一半，制成所谓蒸发奶，然后用这种奶不加稀释地喂养婴儿，就可能有部分婴儿因奶内营养成分太高而发生腹泻。母乳的成分由于民族、饮食习惯、健康状况以及个体差异而有很大差别，有的母乳汁内含的营养成分不足，造成婴儿营养不足，而有的母乳汁内含的营养成分超过婴儿的需要，其多余的部分便随腹泻而排出体外。如果生理性腹泻是由人工喂养造成的，那么只要注意调整喂养习惯即可；如果生理性腹泻是由母乳原因造成的，解决的根本办法就是换奶，当改吃牛奶或其他乳品后一般都能奏效，药物治疗是不能解决根本问题的。
复方胃蛋白酶散是助消化药，用于小儿积食，食后腹胀：食乳即泻［2］，大便清稀、绿便：小儿消化不良等。复方胃蛋白酶散为复方制剂，主要成分是胃蛋白酶、白术(土炒)、山药、鸡内金、山楂。其组分为每1g含胃蛋白酶活力不得少于32U。复方胃蛋白酶常用于因食蛋白性食物过多所致的消化不良；炒白术补气健脾；炒山药健脾补血；鸡内金主治食积不化，消化不良，小儿疳积：山楂消食化积。
宝乐安其有效成分东海酪酸菌-CGMCC0313-1菌株［3］，可以分泌肠黏膜再生和修复的重要营养物质酪酸，修复受损伤的肠黏膜，消除炎症，营养肠道。并能促进双歧杆菌等肠道有益菌的生长，抑制痢疾志贺氏菌等肠道有害菌的生长，恢复肠道菌群平衡，减少胺、氨、吲哚等肠道毒素的产生及对肠黏膜的损害，恢复肠道免疫功能和正常的生理功能。同时，还可以分泌多种促进营养物质消化吸收的酶以及多种维生素类有益物质。
复方胃蛋白酶散与宝乐安联合治疗婴儿生理性腹泻，无配伍禁忌，促进消化，补充肠道有益菌，患儿用药3天疗效明显，疗程达2周效果更佳显著，具有显著的协同作用。
参考文献
1 沈晓明,王卫平.儿科学.北京:人民卫生出版社,2008.
篇4
关键词：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧诱导因子-1α；萎缩性胃炎；香砂六君子汤；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）01-0047-05
Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）
Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control
group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P
Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats
慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作为消化系统常见病，尤其在CAG伴有肠上皮化生和异常增生时，易引起继发性胃癌，严重威胁生命质量。就其临床病症特点而言，中医认为CAG多以脾胃虚弱、气机或气血失调为主要病机，故治疗多以健脾益气、理气和胃为大法。香砂六君子汤出自《古今名医方论》。临床应用显示，香砂六君子汤及其加减方治疗CAG疗效显著[1-2]。本研究通过观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃窦黏膜缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
2月龄SPF级健康Wistar大鼠54只，体质量（160±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001-0001010。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，雌雄各半，分笼饲养，湿度45%～55%，室温（23±2）℃，喂养灭菌标准饲料和消毒纯净水，自由饮水进食。本实验动物处理相关程序遵守中国国家健康与医学研究委员会动物道德准则，并得到甘肃中医药大学动物实验伦理委员会的批准。
1.2 药物
香砂六君子汤以人参、白术、茯苓、陈皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（饮片均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医药大学药学院中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格），第1次加10倍量蒸馏水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，0.2 g/片，批号20140108。
1.3 主要试剂与仪器
脱氧胆酸钠，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号SLBC0243V；吲哚美辛，上海信谊黄河制药有限公司，批号120702；氨水，白银良友化学试剂有限公司，批号120102；乙醇，天津市富宇精细化工有限公司，批号120100107；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号20140813）、胃蛋白酶测定试剂盒（批号20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，宝生物工程（大连）有限公司；Trizol试剂（批号AK7208-1）、反转录和实时定量PCR试剂盒（批号0000036802），Promega Corporation；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），批号ZB-2301，北京中杉金桥生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批号B3301），美国ImmunoWay公司。DF110型电子分析天平，江苏常熟衡器工业公司；XYJ80-2离心机，广东塘厦骏越机电设备厂；HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所；Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、S1000TM逆转录仪、Chemi DOC XRS凝胶成像分析系统、CFX96TM Optics Module PCR仪，美国BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系统显微镜，日本Olympus公司。
2 实验方法
2.1 造模与分组
除空白组8只大鼠正常饲养不予造模外，其余46只大鼠参照文献[3]方法造模。造模组采用复合慢性损伤因素联合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除饲料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脱氧胆酸钠灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用，并记录每日饮用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饥饱失常喂养法：2 d足量喂养，1 d禁食。连续造模40周。待综合法造模30周时，每隔1周随机抽检大鼠，取胃黏膜组织做病理检查并判定胃黏膜萎缩病理变化，评价CAG模型大鼠胃黏膜萎缩病理形成后开始治疗。将CAG大鼠按体质量编号，采用随机数字表法分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组，每组8只。
2.2 给药
香砂六君子汤高、中、低剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的12、6、3倍）；对照组每日给予0.30 g/kg维酶素药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的6倍），等效剂量按人与动物系数折算[4]。连续给药120 d。每日给药体积为10 mL/kg。空白组和模型组给予等量蒸馏水灌胃。
2.3 标本采集与检测
胃排空率实验参照文献[5]方法，于末次给药后禁食不禁水24 h后，分别随机抽取各组大鼠8只，给予半固体营养糊2 mL，30 min后用乌拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打开腹腔，结扎幽门和贲门后取出胃，清除胃表面的血渍，第1次称重（胃总重），后剪开胃体，洗去胃内容物，用滤纸吸干水分第2次称重（胃净重），计算胃排空率[1-（胃总重-胃净重）÷所给糊重×100%]。胃黏膜组织匀浆制备：麻醉处死后低温条件下快速剖取胃黏膜组织，以冰冷生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待测胃组织蛋白酶活性。
2.4 胃黏膜组织缺氧诱导因子-1α基因表达检测
取适量胃窦组织，用Trizol法抽提总RNA：将保存于-80 ℃冷冻冰箱中各组大鼠胃窦组织称取50 mg组织块置于研钵中，加入1 mL Trizol，研磨均匀，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震荡后4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 mL异丙醇，震荡，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g离心 10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震荡后4 ℃、8000×g离心10 min，弃上清液后室温下干燥，加入 50 μL DEPC 处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求，可用于后续PCR。
香砂六君子汤出自《古今名医方论》，主治因脾胃虚弱，气机阻滞，痰浊、湿毒内生而生“痞满”之效方，亦是体现“健脾理气和胃”治则治法的经典方剂。方中人参补中益气，健脾养胃；白术健脾燥湿；茯苓健脾渗湿；白术、茯苓合用，能增强健脾除湿功能，促进脾胃运化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理气消痞而止痛；陈皮、姜半夏燥湿化痰，理气降逆；甘草调胃和中，具有补脾和胃、缓急止痛、调和诸药作用。本方是中医临床治疗CAG的有效方剂。
中医认为，脾（胃）主司运化水谷，主要涉及机体消化吸收功能。从现代医学病理生理学的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促进摄入物质的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反应，组织充血水肿而胃动力障碍，或因壁细胞数量逐渐减少，胃黏膜腺体发生不同程度萎缩，常伴有分泌功能降低[9]，临床则出现纳呆少食、运化迟滞、嗳气胃胀等消化功能障碍的典型症状。胃蛋白酶是由胃黏膜主细胞所分泌并存在于胃液中的一种消化性蛋白酶，具有促进机体消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺体细胞发生不同程度的萎缩，其胃液分泌量和胃蛋白酶减少，同时因胃液pH值改变，胃蛋白酶的活性亦减弱，进而导致胃体化学消化功能降低，从而出现纳呆少食、运化迟滞及胃脘胀满之证[10]。同时从病理学角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反应及不典型增生等变化，而且HIF-1α与慢性炎性反应的关系密切。HIF-1α是广泛存在于机体细胞中的一种转录调节因子[11]，该基因由低氧诱导并介导细胞对缺氧微环境进行适性反应，缺氧时HIF-1α表达显著上调[12]，由此启动60余种下游因子的转录以使细胞逐渐适应有氧到缺氧的转变，而且HIF-1α与炎症反应关系密切，多种致炎细胞因子如白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的转录活性[13]，参与创伤修复重塑及炎症等过程。
本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠一般生存情况较差，胃排空功能、胃蛋白酶活性显著降低，而HIF-1α基因和蛋白表达水平显著升高，说明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊乱，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜组织萎缩、炎性病变表现为缺氧条件下黏膜组织中HIF-1α基因和蛋白高表达；经药物治疗后并与模型组比较，香砂六君子汤组大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性显著升高，HIF-1α基因和蛋白表达下调，且以香砂六君子汤高剂量作用显著，提示香砂六君子汤通过调节胃排空功能，促进胃蛋白酶活性、下调缺氧环境中胃黏膜组织HIF-1α基因和蛋白表达的途径以防治脾胃虚弱型CAG。
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篇5
关键词：中性蛋白酶：复合蛋白酶；水解度：固定化酶；苦味值
中图分类号：TQ936.1
文献标识码：A
文章编号：1672-979X(2010)09-0305-03
用蛋白酶催化水解蛋白质，可提高其溶解性和热稳定性，防止酸沉淀，还可以改进食品的风味。蛋白质水解物可用于各类食品和方便食品调味料中。酶法水解蛋白质具有效率高、条件温和、营养成分不破坏等优点，是目前国内外用于食品生产的主要方法。但酶法水解蛋白质会产生主要由疏水氨基酸组成的小分子多肽，有苦味，影响了产品的口感。目前国内食品企业主要使用丹麦诺维信公司的复合蛋白酶和风味酶，用国产酶制剂生产的蛋白质水解物苦味较重。用低成本工艺生产水解度高的低苦味或无苦味的蛋白质水解物，是目前急需解决的问题。固定化酶具有稳定性好，带入杂质少等优点，仅需简单过滤即可重复使用，可降低生产成本。本研究以酪蛋白为实验材料，用固定化蛋白酶制备蛋白质水解物，探索水解度高、苦味少、成本低、杂质少，能达到食品工业质量要求的蛋白质水解物制备方法。
1材料
中性蛋白酶(neutral protease，NP)从本实验室保藏的产蛋白酶菌株提取；复合蛋白酶(protamex，PM)丹麦诺维信公司产；其它试剂均为国产分析纯。
2方法
2.1溶液配制
酪蛋白溶液：取酪蛋白5 g，加蒸馏水60 mL，3 mol／L氢氧化钠1.8 mL，沸水浴加热至溶解，调pH 7.0，定容至100 mL：茚三酮溶液：取茚三酮1.0 g，果糖0.06 g，用95％乙醇溶解并定容到100 mL：三氯乙酸溶液：取三氯乙酸1.8 g，无水乙酸钠2.99 g，冰乙酸1.89 mL，加蒸馏水溶解并定容至100 mL。
2.2固定化载体的制备
取壳聚糖1.0 g，加蒸馏水200 mL，冰乙酸4 mL，37℃振荡4 h至溶解。调pn 7.0，析出壳聚糖，加25％戊二醛2 mL，37℃振荡反应4 h，所得活化壳聚糖用蒸馏水充分洗涤15次以上，吸干水分后于－20℃保存。
2.3固定化酶的制备
活化壳聚糖加蛋白酶溶液，30℃振荡反应30 min后，离心去上清，沉淀用蒸馏水洗涤10次以上，得固定化酶。
2.4酶活性测定
取5％酪蛋白0.0 mL，加入酶液100 gL，50℃振荡反应10 min，加入900 p_L三氯乙酸溶液终止反应，离心后取上清测A275，计算酶活性。
固定化酶活性回收率(％)=固定化酶总活性／游离酶总活性×100％。
酶活性定义：在上述反应条件下，每1 min产生的氨基酸和肽的A275增加值相当于1ug酪氨酸A所需的酶量为1个酶活性单位(u)。
2.5苦味值的评定
参考陶红等的方法，蛋白质水解液由有经验者品尝，评定结果分为1～5级，顺序为：无苦味，微苦，较苦，苦，很苦。
2.6蛋白质水解度(degreeofhydrolysis，DH)的测定
取蛋白质水解液100ul(以未水解蛋白质溶液为对照)，加磷酸氢二钠.柠檬酸缓冲液(pH 5A)800ul，茚三酮100ul，混匀后沸水浴加热15 nm，冷却15 nlh后测A，参考赵新淮等的方法计算DH。
3结果与分析
3.1固定化酶活性回收率
取活化壳聚糖0.15g，加入NP 1 mL(2580U／mL)，反应后分别测定上清液和固定化酶的酶活性。结果表明，上清液剩余酶活性为14.2％，固定化中性蛋白酶(INP)酶活性回收率为59.9％；取活化壳聚糖0.2 g，加入PM l mL(2 360U／mL)，反应结果表明，上清液剩余酶活性为23.8％，固定化复合蛋白酶(IPM)酶活性回收率为35.0％(图1)。上清液剩余酶活性和固定化酶活性之和低于出发酶液的总活性，可能是因固定化酶受空间结构限制，不能与底物自由接触；IPM酶活性回收率很低，可能是因诺维信PM由多种不同的酶组成，其中某些酶不能被活化壳聚糖固定。
3.2固定化酶的稳定性
50℃下用固定化酶分解5％酪蛋白10 h。离心回收固定化酶，洗涤后再重复使用9次。结果表明，使用10次后INP和IPM的酶活性仍分别保存70.0％和79.8％，表明2种固定化酶都具有较高的稳定性。
3.3固定化酶法制备低苦味蛋白质水解物
3.3.1用INP和IPM制备低苦味蛋白质水解物分别取1NP O.15，0.30，0.45，0.60 g和IPM 0.8，1.2，1.6，2.0，4.0 g，分别加5％酪蛋白10mL，50℃反应6h，离心取上清，测DH。结果表明，蛋白质水解物的DH随固定化酶用量增加而增加，其中用INP制备，DH快速增加，可达到26.5％(图2)，苦味值2级：用IPM制备，DH增加缓慢，低于10％(图3)，苦味值4级；用IPM制备，DH和苦味值的质量指标均较低，可能是因IPM中只有诺维信复合蛋白酶的一部分，固定化的酶中还有一部分未充分表现其活性，所以酶切位点大量减少。
3.3.2比较用INP和游离PM制备的低苦味蛋白质水解物取INP 0.45 g和PM 50 mg，分别加5％酪蛋白10 mL，于50℃反应1，2，4，6，8 h，离心，测上清水解度。结果表明，DH随着反应时间的延长而增加，INP制备的蛋白质水解物的DH快速增加，游离PM制备蛋白质水解物的DH缓慢增加(图4)，反应8h后两者DH都达到25％，苦味值都是2级，但后者的苦味稍低于前者。表明用INP和游离PM制备所得蛋白质水解物的DH和苦味值基本相同。
4讨论
篇6
【关键词】 尿NAG;mALB;α1-MG;β2-MG;糖尿病肾病;诊断价值
糖尿病肾病(Diabeticnephropathy,DN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是糖尿病致死的重要原因,早期无明显的症状和体征。糖尿病对肾小球、肾小管的损伤一直是糖尿病肾病研究的重点[1]。约30%～40%的1型糖尿病和5%～20%的2型糖尿病患者在病程高达10～15年间发生糖尿病肾病,因此糖尿病肾病的早期诊断是防止DN的关键[2]。本文通过检测2型糖尿病患者尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、尿微量白蛋白(mALB)、尿β2-微球蛋白(β2-MG)、尿α1-微量球蛋白(α1-MG)的含量,以探讨对DN的早期诊断价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料 将95例受试者分为健康对照组(为门诊健康体检人群)和病例组(均为2型糖尿病患者)。健康对照组55例,男25例,女30例。年龄19～70岁,平均(43.4±14.4)9岁,均已证实无糖尿病、肾脏疾病及其他内分泌疾病。病例组40例,按世界卫生组织(WHO)诊断标准[3]确诊的2型糖尿病患者,男31例,女9例,年龄39～71岁,平均(48.8±9.81)岁。
1.2 标本收集 所有入选本组实验者均留取新鲜晨尿10 ml,以1500 r/min离心5 min后取上清液进行检测。
1.3 仪器、试剂及检测方法 选用的仪器为“上海棱光技术有限公司”生产的S22PC可见分光光度仪、“北京普朗有限公司”生产的9602-DNM酶标分析仪。检测项目的试剂盒均由“上海德波生物有限公司”提供。尿NAG测定采用对硝基苯酚(PNP)比色法检测,尿mALB、β2-MG、α1-MG测定均采用酶联免疫法检测。检测结果的判断:尿NAG>15.7 U/L、mALB>20 mg/L、β2-MG>0.30 mg/L、α1-MG>15 mg/L均为阳性结果。
1.4 统计学方法 资料处理使用Excel2003中文版将回收的资料建立数据库,运用SPSS 16.0 统计学软件包进行统计学处理。统计描述:计数资料用频数、百分比;计量资料用均数±标准差(x±s)表示;统计推断:连续性变量先进行正态性和方差齐性检验,不符合正态分布的变量采用Log10转化后使其符合正态分布后再进行分析;然后进行t检验及Logistic多元回归分析。采用双侧检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 病例组四项指标阳性率明显高于健康对照组。病例组尿NAG异常38例(95.0%);尿ALB异常32例(84.2%);尿α1-MG异常20例(50.0%);尿β2-MG异常19例(47.5%)。尿NAG阳性率最高。两组各指标检测结果见表1。
2.2 病例组四项检测指标高于健康对照组,差异具有统计学意义,(P
2.3 是否有早期DN为因变量,尿NAG、mALB、β2-MG、α1-MG为自变量进行Logistic回归分析,结果尿NAG进入方程,其敏感性最高,差异具有统计学意义(P
表1
两组四项指标检测结果比较的阳性率(例,%)
组别例数NAGmALb β2-MG α1-MG
健康对照组551(1.8)0(0)0(0)0(0)
住院病例组4038(95.0)32(84.2)19(47.5) 20(50.0)
DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.04.93
作者单位:830001乌鲁木齐市人民医院肾病研究室
表2
健康对照组与病例组之间四项指标水平比较(x±s)
组别例数 Lg10 NAGLg10 (mALb×10)Lg10(β2-MG×10) Lg10α1-MG
健康对照组55 0.95±0.2542.85±0.394 0.82±0.323 0.73±0.283
病例组40 1.58±0.286 4.31±0.837 1.48±0.5241.28±0.339
P值
表3
Logistic多元回归模型分析
项目 BOR95%CIP值
Lg10 NAG14.952 3.12×106 20.474-4.74×1011 0.014
Lg10 (mALb×100)1.3033.6810.384-35.2970.259
Lg10(β2-MG×100) 0.411 1.5080.104-21.8570.763
Lg10α1-MG 4.361 78.316 0.284-2.16×1040.128
2.4 ROC曲线、诊断试验 LgNAG确诊早期DN,曲线下面积为0.972,95%可信区间是0.932～1.001(P
表4
项目 曲线下面积95%CIP值
LgNAG0.972 0.932-1.011
图1
3 讨论
DN是糖尿病的严重并发症,是糖尿病患者死亡的重要原因之一。能够早期发现DN,对于临床早期治疗有一定意义。NAG为大分子糖蛋白,相对分子量为(130～140)×103,肾脏是合成和存储NAG的主要器官,血浆中半衰期仅为5 min,且血浆中的NAG不能被肾小球滤过。当近端肾小管受损时NAG活性明显增高,预示近端肾小管上皮细胞受损,溶酶体破裂释放NAG,因此尿NAG是反映肾小管损害的敏感且特异的指标[4]。尿mALb正常情况下肾小球滤过膜存在电荷选择屏障的静电同性排斥作用,尿mALb不能通过肾小球滤过膜,而各种炎性反应、代谢异常和免疫损伤均可导致滤过膜上负电荷减少,静电排斥力下降,造成尿mALb从尿中漏出增多,是早期肾损伤的敏感指标[5]。正常人体内的β2-MG的生成和释放速度是非常恒定的,且能自由通过肾小球滤过膜。原尿中的99.9%的β2-MG可被近端肾小管上皮细胞重吸收和降解。当肾近曲小管轻微受损时,对β2-MG的重吸收下降,尿β2-MG含量就增加,当肾脏损伤影响到肾小管重吸收功能时尿β2-MG升高[5]。α1-MG为人体内的一种糖蛋白,较广泛存在于人的体液中。健康状况下,体液中的α1-MG可自由通过肾小球滤膜,在近曲小管吸收或代谢。据报道[6],肾小管重吸收的功能下降1%时,尿中β2-MG的排出量可增加30%,α1-MG也有所升高。当发生糖尿病肾病时,β2-MG、α1-MG均升高,其升高幅度与肾功能受损程度相关。尿mALB检测是较公认的糖尿病肾病早期诊断的指标之一,但由于其对肾小管损伤诊断不敏感,不可避免地存在着漏检漏诊现象。目前逐渐认识到糖尿病不仅会累及肾小球,还会累及肾小管间质结构,且肾功能恶化的程度与肾小管间质纤维化程度密切相关,肾脏病的发生、发展、预后转归过程中,肾小管间质损害起着极其重要的作用[6]。糖尿病时肾小管的损伤先于肾小球的损伤[7],在糖尿病损害早期,肾小球滤过压增高,滤过膜负电荷减少和裂孔变化使蛋白质滤出增加,使溶酶体激活,导致尿NAG升高,并随病程的延长损伤率上升[8] 。本文资料表1、表2显示:病例组四项指标阳性率及检测含量明显高于健康对照组,病例组阳性率分别为尿NAG(95.0%);尿ALB(84.2%);尿α1-MG(50.0%);尿β2-MG(47.5%),差异具有统计学意义(P
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篇7
主要从四个方面来分析：
第一，成本。根据公开资料显示，摩拜的单车成本大约3 000元/辆，而ofo的单车成本含维护大约270元/辆。
在客单价上，摩拜的收费为1元/30分钟。如果作为城市公共交通末梢和微循环的自行车出行场景，即500米到3千米的骑行距离，客单价在2元以内。ofo校内0.01元/分钟，0.04元/千米，校内客单价大约在0.1元以内。在校外，ofo双号牌的车，收费是0.04元/分钟，0.16元/公里，客单价大约在0.5元。
结合单车成本和客单价，排除天气等原因，假设实际出行为300天，每辆摩拜单车的使用频率1天5次，大约1年可以收回成本。由于学生单车出行的习惯比较普遍，假设ofo每天使用频率大约10次，那一辆ofo大约270天就能收回成本。
第二，覆盖密度。这是ofo真正凸显成本优势的地方。如果寻车的距离在500米以上，寻车时间超过6分钟，人们对骑车接驳公共交通的需求将大幅下降。为了确保500米范围内有车，则需要对城市运营区域内500米半径对应的每0.79平方千米的面积进行覆盖。按广州市环城高速内人口密度20 000人/平方千米计算，假设每100人中1人选择骑车，在广州环城高速210.13平方千米的范围内，则需运营42 025辆自行车。假设通过数据分析优化调度能够实现20%的自行车满足80%的需求，那么广州环城高速内合适的投放量是16 810辆。要实现这个投放量，摩拜的成本是5 043万元，ofo的成本是453.87万元。
篇8
关键词 鱼鳞；明胶；酶解产物；生物活性
中图分类号 TS20 文献标识码 A 文章编号 1673-9671-(2012)062-0228-01
鱼鳞是有鳞鱼加工的主要副产品之一，占鱼体重量的1%-5%。目前对鱼鳞的开发利用主要有以下几个方面：提取鱼鳞胶，作为食品、化妆品等原材料，具有抗氧化和降低血压、降低血液总胆固醇、抗衰老等功效；制备鱼鳞水解液，除水解出大量的氨基酸外还会产生具有特定功能的肽；提取鱼银，作为一种昂贵的生物试剂，用于珍珠装饰业和油漆制造业；低值淡水鱼的鱼鳞可用来开发鱼鳞凉粉、鱼鳞冻膏、干制鱼鳞等食品，制作成各种工艺品；提取卵磷脂；提取鸟嘌呤，用于治疗白血病。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
冷冻罗非鱼鱼鳞；木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；胃蛋白酶；酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶。
1.2 实验仪器
真空泵、旋转蒸发器；紫外可见分光光度计；冷冻干燥机；氨基酸自动分析仪；精密增力电动搅拌器
2 实验方法
2.1 鱼鳞明胶提取
鱼鳞50.00 g按照设定的提取时间、温度、液料比提取，经铁筛过滤，滤液用105℃干燥，得到明胶。
2.2 明胶酶解产物活性研究
2.2.1 明胶的酶解
不同蛋白酶对同一底物的水解效果不同，本实验选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶分别对明胶进行水解。
2.2.2 抗氧化活性的测定
1）羟自由基清除作用。试管中依此加入硫酸亚铁1mL，水杨酸-乙醇1 mL，样品1 mL，H2O2 1 mL，将混合液在37℃水浴锅中反应30 min，取出后用分光光度计在510 nm波长下测定吸光值。
计算公式为：清除率I（%）=[1-（As-Ao）/Ac ]×100
2）DPPH自由基清除力。试管中加入4 mL样品，1 mLDPPH-乙醇溶液，充分震荡后暗室反应30min，用分光光度计在517 nm波长下测定吸光值。（不加样品加蒸馏水为空白对照，以100 μg/ml的VC作阳性对照）
计算公式为：DPPH自由基清除率I（%）=（Ac-As）/Ac×100
2.2.3 血管紧张素I转换酶抑制活性测定
取5ul样品加入15 ul的ACE酶（37℃ 5 min）后，加入25 ulHHL（三肽马尿酰-组氨酸-亮氨酸）（37℃ 25 min），再加入0.1%三氟乙酸（TFA）10 ul于16500×g的速度4℃离心20 min后，取上清液在228 nm处紫外光检测条件下检测马尿酸的峰面积。（以缓冲液替代样品作为空白对照）
计算公式为：抑制率I（%）=（Ac- As）/Ac×100%
2.2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
抑制剂活力测定：根据Tremblay等的方法测定AG的活性，即以pNPG为底物，0.5 mol/L碳酸钠溶液为终止液。在37℃，pH6.8的条件下反应，用酶标仪在405 nm波长处比色测定。
计算公式为：抑制率I（%）=1-[（As- AB）/Ac×100%]
3 结果与讨论
3.1 抗氧化活性的测定
3.1.1 羟自由基清除作用
六种蛋白酶水解液中，胰蛋白酶水解液和碱性蛋白酶水解液的羟自由基清除力较强分别为76.7%和76.0%，甚至高于VC的65.6%；其次为中性蛋白酶水解液、酸性蛋白酶水解液和胃蛋白酶水解液；而木瓜蛋白酶水解液清除率仅为6.8%。
3.1.2 DPPH自由基清除力
六种蛋白酶水解液中，碱性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最强为42.2%，低于阳性对照VC的47.7%，其次为胃蛋白酶水解液30.8%和酸性蛋白酶水解液25.6%，再次为胰蛋白酶水解液16.3%和木瓜蛋白酶水解液10.9。中性蛋白酶对DPPH自由基没有清除能力。
3.2 血管紧张素I转换酶抑制活性测定
六种蛋白酶水解液中，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高为71.7%，其次为木瓜蛋白酶水解液68.9%和碱性蛋白酶水解液68.7%，再次为胰蛋白酶水解液63.9%和中性蛋白酶水解液61.5%，ACE抑制率最低的是胃蛋白酶水解液仅为0.78%。
3.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定
六种蛋白酶水解液对AG活性有截然不同的作用。酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对AG有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制率为67.10%，对AG的抑制作用最强。而中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶明胶水解液对AG没有抑制作用。
4 结论
六种不同的酶（酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶）水解鱼鳞明胶，对其生物活性进行比较。其中胰蛋白酶水解液和碱性蛋白酶水解液的羟自由基清除力较强分别为76.7%和76.0%，高于VC的65.6%；碱性蛋白酶水解液的DPPH自由基清除力最强42.4%，但不及VC；六种蛋白酶水解液中酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶对AG活性有抑制作用，其中胃蛋白酶水解液的抑制作用最强为67.10%；六种酶水解液均有ACE抑制作用，酸性蛋白酶水解液的ACE抑制率最高71.7%。
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篇9
【摘要】 目的比较壁虎不同提取工艺成分对S180和H22荷瘤小鼠的抑瘤作用及免疫器官的影响。方法以肉瘤S180、肝癌H22荷瘤小鼠作为动物模型，以抑瘤率及胸腺、脾脏指数为指标比较壁虎原粉及水煎煮、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、仿生酶解等不同工艺成分的抗肿瘤作用。结果3种酶解工艺成分对肉瘤S180和H22肝癌抑瘤率均明显高于原粉与水煎煮液，相比模型组有显著性差异(P
【关键词】 壁虎; 酶解; 抗肿瘤; S180; H22
壁虎，别名守宫、壁虎、蝎虎、天龙，味咸性寒，功能祛风，定惊，散结，解毒。壁虎作为药材始见于《本草经集注》，而《本草纲目》就称其能治“瘰疬初起……血积成痞，反胃膈气，痈疮大痛”。 其可入血分透筋达络，既善破血散结解毒，又能通经活络而止痛。随着壁虎多种药理活性，特别是抗肿瘤活性被发现后[1]， 人们对壁虎的关注度日益提高。目前壁虎临床一般以原粉、水煎煮等方法应用，存在服用量大、易被微生物污染等缺点。现代药理研究表明，动物类药材发挥作用的主要为其小分子肽[2～4]，因此，我们拟采用酶解方法得到其小分子肽，并与常规原粉和水煎煮液比较其抗肿瘤作用的差异。
1 材料
1.1 动物昆明种小鼠，雄性，体质量(20±2)g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(鲁)20050015。S180腹水小鼠和H22肝癌小鼠均购自山东省医学科学院。
1.2 仪器JJ-2型组织捣碎机，江苏江南仪器厂;摇摆式高速中药粉碎机，浙江大德中药器械有限公司;W-O型恒温水浴锅，上海申顺生物科技有限公司，TDL-5飞鸽牌离心机，上海安亭科学仪器厂;小型切向流超滤系统，美国Millipore公司(密理博)。
1.3 试剂及药品胃蛋白酶(酶活力>1 200 U/g)，胰蛋白酶(酪蛋白转化力≥25.0)，均购自国药基团化学试剂有限公司，注射用环磷酰胺，200 mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08051354，氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭东海普药业有限公司，批号:080302。壁虎购自济南兴旺蟾业，经本校周风琴教授鉴定系壁虎科动物无蹼壁虎Gekko swinhonis Gunther的干燥全体，置干燥箱60℃以下真空干燥，粉碎，过80目筛，细粉备用。
2 方法
2.1 供试品溶液的制备
2.1.1 原粉液的制备取壁虎细粉，用0.2%羧甲基纤维素将其稀释成1 ml∶0.5 g的混悬液，备用。
2.1.2 水煎煮提取液的制备取壁虎细粉，加8倍量水煮沸煮沸60 min，离心，残渣加8倍量水煮沸30 min，离心，合并上清液，浓缩至1:0.5(每毫升药液相当于0.5 g药材，下同)，即得水煎煮提取液。
2.1.3 胃蛋白酶酶解液的制备[5]取壁虎细粉90 g，置于组织捣碎器中，加入5倍量水，匀浆(10 000 r/min)10 min，等分为3份，取1份，煮沸15 min，放冷，调节pH 2.0，移至37 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得胃蛋白酶酶解液。
2.1.4 胰蛋白酶酶解液的制备[6]取“2.1.3”项下一份样品液，煮沸15 min，放冷，调节pH 7.5，移至55 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得胰蛋白酶酶解液。
2.1.5 仿生酶解液的制备取“2.1.3”项下一份样品液，煮沸15 min，放冷，调节pH 2.0，移至37 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胃蛋白酶，2 h后取出，调节pH 7.5，移至55 ℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入1%胰蛋白酶，3 h后取出，离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，微滤(0.22 μm)，超滤(相对分子质量3 000)，收集相对分子质量小于3 000部分，浓缩至1∶0.5，即得仿生酶解液。
2.2 抗肿瘤作用的比较[7]
2.2.1 对S180荷瘤小鼠的影响无菌抽取传代8 d的S180腹水小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整浓度至4×109个/L，于每只小鼠右腋下注射0.2 ml，接种140只。接种24 h后，将小鼠随机分为7组，每组20只，即模型组、原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组与阳性对照组。模型组灌胃生理盐水10 ml·kg-1，连续10 d;原粉组、水煎煮组、胃蛋白酶酶解组、胰蛋白酶酶解组、仿生酶解组均5 g药材·kg-1药液，连续10 d;阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量30 mg·kg-1，连续3 d;给药量均为10 ml·kg-1。第11天，各组动物颈椎脱臼处死，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数，计算公式如下：
抑瘤率(%)=(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值×100%
胸腺(脾脏)指数=重量(mg)/体质量(g)
2.2.2 对H22荷瘤小鼠的影响建模方法、给药方式、剂量均同S180荷瘤小鼠(对照组为5-Fu，25 mg·kg-1)。
2.3 统计学方法实验数据采用SPSS 10.0统计软件进行分析，所有测定数值以±s表示，采用方差分析法进行分析，P
3 结果
3.1 对S180荷瘤小鼠的影响
3.1.1 对S180荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表1表1 对S180荷瘤小鼠抑瘤作用的影响
3.1.2 对S180荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表2表2 对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响
3.2 对H22荷瘤小鼠的影响
3.2.1 对H22荷瘤小鼠抑瘤率的影响结果见表3表3 对H22荷瘤小鼠抑瘤作用的影响
3.2.2 对H22荷瘤小鼠脾脏、胸腺指数的影响结果见表4表4 对H22荷瘤小鼠免疫器官的影响
4 讨论
壁虎在临床上常用于肿瘤，特别是消化道肿瘤的治疗，一般焙干研细或水煎煮入药，但壁虎起抗肿瘤作用的物质基础还不清楚。小分子肽抗肿瘤作用逐渐引起了人们的注意。越来越多的研究表明，动、植物含有小分子肽具有很好的抗肿瘤作用，世界上许多国家正在竞相研究开发小分子肽类抗肿瘤的防治药物，如谷胱甘肽、海参五肽、槲寄生肽、胸腺五肽等[8，9]。本研究运用酶解的方式，使壁虎含有的蛋白类成分酶解成小分子肽，对其抗肿瘤作用进行研究。研究结果表明，壁虎经酶解后的抗肿瘤作用明显高于原粉组与水煎煮组。
本实验中的壁虎仿生酶解是指模拟人体消化过程，先用胃蛋白酶酶解，再以胰蛋白酶酶解的方法，对壁虎药材进行酶解。
小分子肽的界限划分迄今未有明确定义，鉴于国内外热门研究小分子肽的相对分子质量都在3 000以下[10]，本实验中3种酶解液均为经过超滤所得的相对分子质量小于3 000的小分子肽。
参考文献
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[2] Shimonishi Y. Peptide Science-Present and Future[M].Dordrecht:Kluwer Academic Publishers，1999:436.
[3] 王爱华，柳美玲，戴志明，等.小肽的吸收机制与营养价值研究进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008，2:7.
[4] 王克夷.开发小肽，筛选新药[J].中国生化药物杂志，2003，24(1):48.
[5] 钱 方，邓 岩，刘 阳，等.胃蛋白酶水解大豆蛋白的研究[J].中国乳品工业，2001，29(3):10.
[6] 黄开华，周艳明，吴 畏，等.胰蛋白酶酶解鹿血条件的优化[J].湖北农业科学，2007，46(2):302.
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篇10
【关键词】 胃肿瘤;乙酰肝素酶;基质金属蛋白酶9;免疫组织化学
[ABSTRACT] Objective:To investigate the clinicopathological significance of the expression of heparanase (Hpa) and MMP9， and its relationship to progressing in gastric carcinoma. Methods： The expression of Hpa and MMP9 were detected by immunohistochemistry SABC in 65 gastric carcinoma cases and 20 adjacent nonneoplastic tissues. The positive ratios of Hpa and MMP9 were compared in gastric carcinoma tissues and adjacent nonneoplastic tissues as well as perse deep infiltration tissues with or without lymph node metastasis. The correlation analysis of Hpa and MMP9 expression in gastric carcinoma tissue was assessed. Results：The positive ratios of Hpa and MMP9 were significant higher in gastric carcinoma tissue than that in adjacent nonneoplastic tissue(P
[KEY WORDS] Gastric carcinoma; Heparanase; Matrix metalloproteinase 9; Immunohistochemistry
肿瘤细胞的侵袭和转移是一个复杂的多步骤过程。乙酰肝素酶(Hpa)是目前已确定的唯一能够降解硫酸乙酰肝素蛋白多糖基因(HSPG)的蛋白酶， 通过特异性降解HSPG发挥其促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用;基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9，MMP9)是一种锌离子依赖性内肽酶，主要降解细胞外基质和基底膜中的胶原蛋白，在破坏细胞外基质和基底膜的屏障作用、促进肿瘤细胞侵袭和转移的过程中同样具有作用。Hpa mRNA的检测在多种肿瘤中已有研究报道，但目前联合检测Hpa和MMP9在胃癌中的表达少有报道，本实验对65例胃癌切除标本Hpa和MMP9的表达进行了检测，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
选取河源市人民医院2003～2005年胃癌手术切除标本65例，男性47例，女性18例，年龄35～78岁，中位年龄60岁，其中有淋巴结转移者40例。所有病例术后均经病理证实。另取癌旁非瘤组织20例作为对照，癌旁组织距离肿瘤边缘不小于5 cm。
1.2 Hpa、MMP9的检测
采用免疫组化SABC法进行检测。Hpa抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB显色试剂盒购于武汉博士得生物工程有限公司;兔抗人MMP9多克隆抗体为北京中山生物技术有限公司产品，均在4℃冰箱保存。用已知的阳性切片作阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定标准
1.3.1 Hpa Hpa以细胞膜和/或细胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达。参照Friedmann等[1]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞记数仅限于肿瘤细胞染色。染色强度分级如下：无着色为0，淡黄色为1，黄色及更深颜色为2;阳性细胞数分级为:阳性细胞数小于50%为0， 50%～75%为1，>75%为2。染色强度分级与阳性细胞数分级两项得分相乘结果≥2为阳性表达。
1.3.2 MMP9 MMP9以细胞浆和/或细胞膜内出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，参照Liaball等[2]的方法，每张切片随机观察5个视野，每个视野观察100个肿瘤细胞，计数500个肿瘤细胞中阳性染色的细胞数，阳性细胞计数仅限于肿瘤细胞染色，10%及以上细胞阳性染色的切片为阳性，10%以下阳性染色的切片为阴性。
1.4 统计学处理
应用SPSS10.0统计软件，行χ2检验或精确概率法及Spearman相关性检验，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 Hpa的表达
Hpa蛋白阳性表达主要位于细胞浆和/或细胞膜，肿瘤间质中的血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞也偶有阳性表达，胃癌中Hpa的阳性表达率为60%(39/65);在癌旁非瘤组织中，血管内皮细胞、巨噬细胞和淋巴细胞偶有阳性表达， Hpa的阳性表达率为15%(3/20)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=12.390，P
2.2 MMP9的表达
MMP9在正常胃黏膜细胞中着色均匀，主要分布于细胞胞浆内，阳性表达率为15%(3/20);在胃癌组织中的表达异质明显，呈灶状或弥散性分布，阳性表达率为55.4%(36/65)，胃癌中的表达明显高于癌旁非瘤组织，差异具有统计学意义(χ2=10.046，P
2.3 不同肿瘤浸润深度及淋巴结有无转移胃癌患者Hpa、MMP9的表达
肿瘤浸润深度达到或超过浆膜层的胃癌患者Hpa、MMP9的阳性表达率明显高于未达浆膜层者，差异有统计学意义(P
2.4 Hpa、MMP9在胃癌中阳性表达的相关性
经相关性检验，Hpa、MMP9在胃癌组织中的表达呈正相关(rs=0.531，P=0.000)，见表2。表2 Hpa、MMP9在胃癌中表达的相关性
3 讨论
肿瘤细胞对细胞外基质(extracellar matrix，ECM)成分及其基底膜的降解是肿瘤浸润、转移的关键。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是人体内降解ECM的主要酶类，参与肿瘤演进等众多生理和病理过程[3，4]，MMP9作为MMPs家庭重要成员，具有广泛的酶底物特性，是降解基底膜成分IV型胶原的主要酶[5]。Sier等[6]的研究结果显示胃癌组织MMP9表达显著高于临近的正常胃粘膜，MMP9高表达的胃癌患者生存期明显缩短;David等[7]研究表明，与正常胃粘膜相比，胃癌组织MMPs表达明显升高，MMPs表达与胃癌分期密切相关。本实验结果显示，淋巴结转移患者MMP9阳性表达率明显高于无淋巴结转移者，说明MMP9在胃癌细胞突破基底膜向周围淋巴结转移过程中起着重要的作用; MMP9的表达还与胃癌的浸润深度密切相关(P
Hpa是目前发现的唯一能够降解细胞外基质和基底膜中主要成分HSPG的蛋白水解酶，其在肿瘤细胞的侵袭和转移中具有重要的意义。 Vlodavsky等[9]研究发现高转移潜力的肿瘤细胞Hpa活性比低或无转移潜力的肿瘤细胞高4～10倍。在卵巢腺癌、转移性黑色素瘤细胞、口腔鳞状细胞癌、肝细胞癌以及前列腺癌、膀胱癌和胰腺癌中Hpa mRNA和蛋白呈优势表达。Hulett等[10]也发现高转移的鼠腺癌细胞系表达高水平Hpa mRNA，而低转移细胞系仅有少量表达。Takaoka等[11]用RTPCR检测胃癌组织中Hpa的表达发现，正常胃粘膜组织中无Hpa的表达，胃癌组织中Hpa的表达与肿瘤体积和局部淋巴结转移有明显正相关性，高表达Hpa的患者预后差。本研究结果显示，Hpa的阳性表达与胃癌的浸润深度及有无淋巴结转移密切相关，表明在胃癌的进展过程中，Hpa具有重要的作用。本研究还发现，Hpa和MMP9在胃癌细胞上的表达呈正相关，推测Hpa和MMP9在胃癌浸润转移过程中存在相互关联、相互作用，联合检测Hpa和MMP9在判断肿瘤生物学行为及预后方面具有重要意义。
参考文献
1 Friedmann Y， Vlodavsky I，Aingon H，et al. Expression of heparanase in normal， dysplastic， and neoplastic human colonic mucosa and stroma evidence for its role in colonic tumorigensis[J]. Am J Pathol， 2000，157(4):11671175.
2 Liaball NB， Talbot I， Smith RA， et al. Matrix metalloprtease 2 (MMP2) and matrix metalloprtease 9 (MMP9)， type IV collagenase in colorectal cancer[J]. Cancer Res， 1996，56(3):190196.
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6 Sier CFM， Kubben FJ， Canesh S， et al. Tissue levels of matrix metalloproteinase MMP2 and MMP9 and related to the overall survival of patients with gastric carcinoma[J]. Br J Cancer， 1996，74:413 417.
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8 张成武，邹寿椿，徐文娟，等.胃癌基质金属蛋白酶临床意义 [J].中国胃肠外科杂志，2000，3(1):2527.
9 Vlodavsky I， Fridmann Y， Elkin M， et al. Mammalian heparanase: gene cloning， expression and function in tumor progression and metastasis[J]. Nat Med， 1999，5(7):793802.