化学发光范文
时间：2023-03-20 20:16:22
导语：如何才能写好一篇化学发光，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
【关键词】化学发光免疫；应用；发展
中图分类号：C911文献标识码： A
一、前言
化学发光免疫分析方法灵敏度高、适用范围广泛受到了人们的认可，在医学、食品、药品等众多领域广泛使用。传统的免疫分析需要的培育时间长，因此，提高分析的时间和效率是当前研究人员重点解决的问题。
二、化学发光免疫分析法
化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法。化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合，用化学发光相关的物质标记抗体或抗原，与待测的抗原或抗体反应后，经过分离游离态的化学发光标记物，加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光，进行抗原或抗体的定量或定性检测。化学发光免疫分析中使用最多的4类标记物为鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物，吖啶酯衍生物，过氧化物酶和碱性磷酸酶。
以酶为标记物的化学发光仍然是化学发光免疫分析的主流，辣根过氧化物酶(HRP)与碱性磷酸酶(ALP)是两种常见的标记酶，均有其相应的化学发光底物，在临床检验中有广泛应用，开发催化活性更高、稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物是化学发光免疫分析的研究热点之一。
三、PEC免疫分析的基本装置
PEC分析需要在光电检测系统中实现.该系统主要包括激发光源、吸收池以及三电极体系的电化学装置.在光激发条件下,电解质溶液中光电活性材料的表面将发生电荷的分离与跃迁,电极表面发生一定的氧化还原反应从而在外电路产生电流,这一过程由电化学装置所记录并用于特定检测对象的测定.
PEC免疫分析的基本原理是基于免疫反应前后光电流信号的变化。在一个简单典型的PEC免疫系统中,免疫探针分子(通常是特异性的抗体或抗原)首先被固定在光电换能器(transducer)表面作为识别元件(recognitionelement),抗原(或抗体)作为待测物与探针分子在电极表面形成免疫复合物,导致光电流信号的增强或降低.本节将介绍PEC免疫传感界面的基本构建过程,主要包括光电极的选择与制备、免疫探针分子的固定等重要步骤。
1、电极材料的选择与制备
PEC检测的基本模式决定了其在免疫传感中必须使用特定的光电活性电极.而免疫探针分子则在这种电极表面固定,随后的免疫识别反应也在该表面发生,所以光电活性材料的选择和制备与免疫传感的检测性能密切相关.理想的光电活性电极应该具有较低的电子空穴复合率,以便获得稳定的光电流密度.一般而言,在PEC免疫传感中,光电活性电极的选择主要取决于所设计的检测路径与传感过程.常用的电极有整体电极和氧化铟锡(ITO)修饰电极.整体电极如二氧化钛纳米管阵列电极(TiO2NTs),ITO修饰电极则由ITO基底和光电修饰材料两部分构成.
2、免疫探针分子的固定
电极制备好后,免疫探针分子的固定是传感器制备中重要的一步,直接决定着传感器性能的优劣.原则上,电化学免疫传感器中可以使用的固定方法都可以用于PEC传感.但因后者使用的电极材料有所不同,所以具体采用的固定方法往往和电极材料的种类以及实验的设计有关.另外,为了保证探针分子的准确定位与吸附以使探针分子在固定后保持较高的活性和稳定性并形成具有适宜厚度、密度、多孔性的敏感膜,同时为了避免非特异性吸附和结合的干扰,在固定这一步骤中需对电极的表面化学性质进行严格控制,因此需要对实验条件进行多重优化以便确定最佳条件.具体来讲,考虑到免疫探针生物分子具有不稳定性,其固定需要满足以下两个条件:
(1)固定过程条件温和,防止生物分子变性,而且固定在电极表面后也能保持良好的活性;
(2)固定后,敏感层与电极表面接触紧密,同时具有良好的稳定性和耐用性。
四、光电免疫检测的分类与传感机理
和其他的免疫分析方法一样,PEC免疫分析也可以简单地分为非标记型和标记型两大类.结合不同的实验设计,相应的传感机理也有所区别.
1、非标记型光电免疫传感器
非标记型光电免疫传感器通过直接测定抗原抗体免疫复合物形成时的光电流信号的变化来确定待测物的浓度.在非标记型光电免疫传感中,由于省去了对待测物的标记过程,且样品前处理过程简单,极大地简化了制备和操作步骤,因此该类型的相关研究工作在免疫传感器领域一直具有不可取代的优势.但是,由于其检测原理大多基于免疫复合物形成前后所产生的位阻效应变化,因此检测信号的变化幅度往往非常有限,在检测灵敏度方面尚有待提高.目前对非标记型光电免疫传感器的研究工作主要侧重在对新型光电基底的利用和目检测物的多样化.Cosnier的非标记型PEC免疫工作中,钌联吡啶配合物上被衍生连接了吡咯和生物素,然后利用吡咯的电聚合作用实现了光电物质在电极表面的固定.然后通过生物素-亲和素的连接作用,将标记有生物素的霍乱毒素固定到光电物质表面.当向溶液中加入待测的霍乱毒素抗体(anti-choleratoxinantibody)时,形成的免疫复合物在光电物质表面产生更强的位阻效应,阻碍电子受体向电极扩散,从而导致光电流降低.该方法很好地实现了霍乱毒素抗体的免疫测定,检测限可以达到0.5μg/mL。
2、标记型光电免疫传感器
非标记型免疫分析法虽然有着很好的简易性,但是由于其负载量低以及无法实现信号放大,它在检测灵敏度方面仍然需要改进.在此情况下,标记型免疫传感分析应运而生.在不同的检测系统中,可以通过标记引入信号分子或实现信号放大.具有催化活性的酶分子因为易于与抗体或抗原结合,且可在短时间内将大量底物分子转化为具有电化学活性的产物,因此常被用做标记物.常用的标记酶有葡萄糖氧化酶(GOx)、辣根过氧化物酶(HRP)与碱性磷酸酶(ALP)。
最近,基于光电化学、酶联免疫方法和生物催化沉积的协同作用,本课题组报道了用HRP标记的放大型PEC免疫分析方法.在CdSQDs修饰的ITO电极表面,通过免疫反应形成夹心结构Ab1-Ag-Ab2-HRP免疫复合物,然后利用BCP反应在电极表面形成不溶物覆盖层.此外,因为HRP在410nm的实验条件下有很强的光吸收性质,所以在该体系中HRP除了引发BCP反应,还能够竞争性的吸收入射光,协同提高了检测灵敏度.该工作以小鼠IgG为模型分子,实验结果表明可以实现对待测物的高灵敏检测.因为很多种酶都可以被引入该系统并且引发相关BCP反应,所以本工作为发展高灵敏性的PEC免疫分析方法提供了一种新思路.基于该工作结合纳米金标记放大技术,我们进而实现了对前列腺肿瘤标记物(prostate-specificantigen)的高灵敏检测。
五、发展与展望
化学发光免疫分析法具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。本文总结了近几年化学发光免疫分析法的应用进展，涉及到降低温育时间，多组分检测，以及信号放大技术。这些例子都证明了化学发光免疫分析法具有广泛的应用前景和可操作性。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展微型化、集成化和自动化的化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分析方法将得到不断发展，开发催化活性更高、稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析的酶和底物并推广到临床检测，发展新型标记技术用于信号放大，建立化学发光免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重点。
六、结束语
随着科技水平的发展和进步，化学光电免疫分析方法也将进一步完善，并发挥更大作用，推动相关行业的快速发展和进步。
参考文献
[1]彭芳,荣,司士辉,等.光电化学型半导体生物传感器.化学进展,2008,20:586593
篇2
关键词：甲状腺疾病;化学发光免疫技术;应用;效果
甲状腺疾病为常见临床疾病，常通过检测患者甲状腺球蛋白进行诊断。传统检测方法为放射免疫技术、血凝法等，但检测效果不甚理想。化学发光免疫技术具有稳定性高、灵敏度高和操作方便等优点，标本用量较少，且标记物易得[1]。现搜集2013年7月―2014年7月我院接诊的甲状腺疾病45例、甲状腺肿瘤45例、甲亢45例患者，对其化学发光免疫技术的应用效果进行总结性分析，并将分析结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料 将2013年7月―2014年7月我院接诊的甲状腺疾病45例患者作为甲组，平均年龄是（29.32±10.25）岁，男患者和女患者分别是23例、22例;将甲状腺肿瘤45例患者作为乙组，平均年龄是（29.39±10.25）岁，男患者和女患者分别是24例、21例;将甲亢45例患者作为丙组，平均年龄是（29.48±10.22）岁，男患者和女患者分别是25例、20例;将同期正常体检人群45例作为丁组，平均年龄是（30.07±1.12）岁，男性和女性分别是22例、23例。甲组、乙组、丙组和丁组的一般临床资料相比，无明显差异，无统计学意义（P>0.05）。
1.2 方法 在受检者空腹情况下采3ml血，抗凝剂选择肝素钠，通过放射免疫技术对血浆甲状腺球蛋白进行检测;后选择化学发光免疫全自动分析仪检测。比较甲组、乙组、丙组和丁组假阴性、假阳性和检测浓度。对比不同检测方法的符合率、特异性及灵敏度。
1.3 统计学分析 对本文所得实验数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行检验，所得计量资料采用t检验，所得计数资料采用χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 假阴性及假阳性结果 与放射免疫技术相比，四组经化学发光免疫技术检测假阴性及假阳性率较低，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组检测结果比较情况见表一。
表一 四组假阴性及假阳性结果对比
2.2 甲状腺球蛋白检测浓度 与放射免疫技术相比，经化学发光免疫技术检测的甲状腺球蛋白浓度较高，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组不同检测方法甲状腺球蛋白浓度比较情况见表二。
表二 四组不同检测方法甲状腺球蛋白浓度对比
2.3 符合率、特异性及灵敏度 与放射免疫技术相比，四组化学发光免疫技术检测符合率、特异性及灵敏度较高，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组不同检测方法符合率、特异性及灵敏度比较情况见表三。
表三 四组不同检测方法符合率、特异性及灵敏度对比
3 讨论
放射免疫技术假阴性率及假阳性率较大，试剂有效期较短，且具有一定放射性，限制临床应用。该技术又分为发光反应和免疫反应，在抗原或抗体上标记化学发光剂，将其与待测标本抗体或抗原经特异性反应相互结合，产生复合物，通过磁场对结合态、游离态进行分离，加入发光底物或氧化剂，促使物质氧化，产生激发态中间体，跃迁至基态，发射光子，经发光强度检测进行定性检测和定量检测[2]。该技术主要适用于肿瘤标志物分析、心脏疾病标记物测定、激素分析等。甲状腺疾病患者的甲状腺功能主要依靠检测甲状腺球蛋白判断，因此，必须加强对患者甲状腺球蛋白的定量检测[3]。在本文研究中，对甲组、乙组、丙组和丁组分别进行放射免疫技术及化学发光免疫技术检测，结果显示，甲组经放射免疫假阴性率为8.89%，经化学发光免疫假阴性率为2.22%;乙组分别为11.11%、2.22%;丙组分别为6.67%、0%;丁组假阳性率分别是4.44%、2.22%，表明化学发光免疫技术可有效检测甲状腺疾病，假阴性率及假阳性率较低。甲组、乙组、丙组和丁组经不同方法检测甲状腺球蛋白，化学发光免疫技术检测浓度均高于放射免疫技术，表明化学发光免疫技术对有效检测甲状腺球蛋白具有重要作用。化学发光免疫技术检测符合率、特异性及灵敏度均高于放射免疫检测，表明化学发光免疫技术具有较高的检测特异性及灵敏度，符合率较高。
综上认为，化学发光免疫技术在临床上应用价值较大，能为临床诊断甲状腺疾病提供有力依据，应予以推广。
参考文献：
[1] 李晓霞.化学发光免疫分析[J].延安大学学报（医学科学版）.2012，16（17）：50-51.
篇3
【关键词】肿瘤生物标志物；化学发光酶；免疫分析
作者：张艳波，宋秀，作者单位：132001吉林市人民医院检验科
恶性肿瘤会给人类健康带来严重威胁[1]。在恶性肿瘤筛查、诊断、预后及疗效评估中，肿瘤生物标志物检测发挥着重要的作用[2]。化学发光免疫法主要是利用标记于抗体上物质发光检测的方法，在临床上有着广泛的应用[3]。本研究以62例原发性肝癌患者及62名健康体检者为研究对象，探讨化学发光免疫法在肿瘤生物标志物检验中的应用价值，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
以2013年4月～2015年4月本院收治的62例原发性肝癌患者为研究组，以同期到本院体检的62名健康人为对照组。研究组：男32例，女30例；年龄35～70岁，平均年龄（68.2±5.5）岁。对照组：男33例，女29例；年龄35～70岁，平均年龄（68.7±5.2）岁。研究组与对照组一般资料对比，P＞0.05，具有可比性。
1.2方法
晨起抽取3ml空腹静脉血，置于生化管，做离心处理，确保速率为3000r/min，半径为15cm，分离出血清。以化学发光免疫法检测两组对象的α-L-岩藻糖苷酶（AFU）、γ-谷胺酰转肽酶（GGT）、血清胆碱酯酶（CHE）、铁蛋白（SF）。本研究所用仪器为ROCHEE601电化学发光免疫分析仪，以及由ROCHE公司生产的试剂盒，严格按照产品操作说明进行操作。
1.3阳性判断标准[4]
AFU：＞40U/L；GGT：＞49U/L；CHE：＞25000U/L；SF：＞16mg/L。
1.4统计学分析
以SPSS18.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1肿瘤生物标志物检测结果
研究组AFU、GGT、CHE、SF水平分别为（48.3±17.2）U/L、（254.0±128.3）U/L、（45.3±10.5）×103U/L、（21.4±5.2）mg/L，高于对照组的（17.6±4.7）U/L、（30.5±25.0）U/L、（10.6±5.1）×103U/L、（10.0±3.2）mg/L，结果差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.2阳性率检出情况
研究组AFU、GGT、CHE、SF单个检出阳性率分别为51.6%（32/62）、82.3%（51/62）、54.8%（34/62）、69.4%（43/62），高于对照组的0%、0%、0%、1.6%（1/62），结果差异有统计学意义（P＜0.05）。
研究组联合检出阳性率为95.2%（59/62），高于对照组的1.6%（1/62）（P＜0.05）。
3讨论
化学发光免疫法有着较高的灵敏度和特异性，且所需设备简单，适用范围较广，在临床上的应用较为广泛。有大量临床研究认为，化学发光免疫法在肿瘤生物标志物检测中有着较好的应用效果，有助于恶性肿瘤的早期筛查、诊断、临床治疗评估与预后[5]。
本研究结果显示，研究组患者AFU水平高于对照组（P＜0.05）。由此可知，一旦机体肝肾等组织存在病变，会提升血清中AFU活性。而且，有研究认为，原发性肝癌患者在经过积极的治疗后，血清中AFU水平会降低[6]。研究组SF水平高于对照组（P＜0.05）。这可能是因人体肝脏中存在众多铁蛋白，且肝脏是铁蛋白循环的主要清除场所，因此，一旦机体出现肝脏病变，会提升铁蛋白水平。本研究中，研究组GGT水平高于对照组（P＜0.05）。GGT广泛存在于人体各个组织。有研究认为，GGT在前列腺中的含量最为丰富，能释放进入血液，所以正常男性体内GGT含量高于女性[7]。聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳可将GGT分为13种同工酶，以此作为恶性肿瘤患者辅助诊断指标有着较高敏感性。此外，研究组CHE水平高于对照组（P＜0.05）。CHE通常包括两类，即真性胆碱酯酶与假性胆碱酯酶。CHE常见于人体肝、胰、子宫及中枢神经白质等处，为血浆固有酶，能对丁酰胆碱进行水解。然而，血清中CHE主要为假性胆碱酯酶，生成于肝脏，随后进入血液，能对人体肝实质合成蛋白的能力进行反映[8]。
篇4
[关键词] CEA；残余试剂；再利用；评估
[中图分类号] R197.39 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）22-49-03
Preliminary evaluation of CEA residual reagent recycling in Abbott ARCHITECT I2000SR
ZHU Bo SHEN Wei HUANG Jiaqin YAN Li PENG Yusheng WANG Peng
Department of Clinical Laboratory， First People's Hospital of Yibin， Yibin 644000， China
[Abstract] Objective To evaluate the performance of recycling about CEA residual reagent in Abbott ARCHITECT I2000SR. Methods Recycle combined residual reagents， to evaluate the detection precision and recovery， and in accordance with the Committee of Clinical Laboratory Standards （NCCLS） EP9-A2 document solutions， comparative tests with the original reagents. Results The residual reagent CEA batch precision is 2.84%-3.69%， inter-day precision is 3.28%-4.86%， the recovery rate is 92.31%-104.53%， are in line with the relevant provisions； the two reagent CEA correlation coefficient r=0.996， the regression equation is Y=1.049X-0.521.The expected bias （Bc） was within allowed bias on the medical decision level （Xc）， so two methods can be accepted. Conclusion About Abbott Architect i2000SR， the performance of CEA residual reagents accords with clinical requirement and can be recycled.
[Key words] CEA； Residual reagent； Recycling； Evaluation
癌胚抗原（CEA）最早是在结肠癌患者和内胚层（胃肠道）的上皮肿瘤中发现，是消化道肿瘤血清学筛选指标之一，也是当今体检筛查的必查项目之一，准确测定患者血清CEA含量非常重要[1-2]。雅培（ABBOTT）公司ARCHITECT I2000SR全自动化学发光仪可以对血清CEA进行定量检测，拥有灵敏度高、线性范围宽、检测速度快等特点[3]。但该仪器使用原装进口试剂，固定人份数、条码自动记录、价格不菲。在实际使用中，当仪器提示“0 TEST”后，实际还有约20%的残余试剂，如若弃掉，势必是一种资源浪费。本研究对CEA残余试剂的性能进行评估，以评价其能否进行回收再利用。
1 材料与方法
1.1 标本来源
宜宾市第一人民医院检验科收集的患者血清，常规检测CEA后，分为低、中、高3个浓度的标本，少量分装，-20℃冷冻保存。
1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器 美国雅培公司Abbot ARCHITECT I2000SR全自动化学发光分析仪。
1.2.2 原装试剂 CEA检测试剂盒及校准液均购自美国雅培公司；质控物来自美国伯乐，批号：54541，54542，54543。
1.2.3 残余试剂 按常规操作用完的同一批号试剂盒（仪器显示0 TEST） ，将瓶中剩余量的试剂每3～4瓶合并为1瓶。轻轻充分混匀，将气泡小心吸出。所有合并残余试剂保证在有效期内使用。
1.3 方法
1.3.1 精密度试验 批内精密度测定 取高、中、低三份不同浓度混合血清，用回收残余试剂重复测定CEA 20 次；天间精密度测定 取高、中、低值混合血清各分装20份，置-20℃保存，用回收残余试剂每天测定1次，共20次。分别计算均值（x）、标准差（SD）和变异系数（CV）。
1.3.2 回收试验 制备混合血清，分别取950μl，四份，第1份加入50μL蒸馏水作为基础样品，其余分别加入CEA低、中、高浓度定值质控血清50μL，使四份样品总体积均为1mL。执行3次重复检测，计算每一标本平均值。与基础样品测定结果的差值为回收量。
1.3.3 对比试验 根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）EP9-A2文件，每天收集8份新鲜血清，分别用两种试剂进行双份平行测定，按1～8、8～1顺序测定，共测5天；以原装试剂作为比较方法，残余试剂为实验方法，对结果进行对比分析和偏倚评估；残余试剂结果为Y变量，原装试剂为X变量，根据给定的医学决定水平（Xc）及允许偏倚（T±20%），计算残余试剂（Y）与原装试剂（X）之间的系统误差即预期偏倚（Bc）及其95%可信区间[4-6]。
1.4 统计学处理
数据用Microsoft Excel 2003和SPSS19.0统计软件处理，P
2 结果
2.1 精密度试验
CEA批内精密度、天间精密度见表1。
表1 CEA残余试剂精密度试验结果
均值（x） 标准差（SD） 变异系数（CV%）
批内精密度 低值 3.85 0.14 3.69
中值 45.82 1.64 3.59
高值 273.68 7.77 2.84
天间精密度 低值 2.56 0.12 4.86
中值 25.34 0.83 3.28
高值 81.93 3.55 4.33
2.2 回收试验
CEA残余试剂在加入低、中、高浓度定值血清时的回收率。见表2。
2.3 对比实验及偏倚评估
残余试剂和原装试剂检测CEA结果所作散点图，见图1，两试剂检测结果呈良好的线性相关，其回归方程：Y=1.049X-0.521，相关系数r为0.996， 两种试剂在给定医学决定水平（Xc）上的预期偏倚（Bc）及95%可信区间见表3。
图1 残余试剂和原装试剂检测CEA结果
表3 残余试剂与原装试剂检测CEA在给定Xc的预期偏倚
及Bc95%可信区间
医学决定水平（Xc）
（ng/mL） 允许偏倚（Ea）
（ng/mL） 预期偏倚
（Bc） Bc95%可信区间
低 高
5 1 -0.276 -1.037 0.485
20 4 0.459 -0.191 1.109
100 20 4.379 2.330 6.428
由上表可知：在医学决定水平处的允许偏倚均大于Bc 95%可信区间的上限，偏倚可以接受。
3 讨论
雅培ARCHITECT I2000SRSR化学发光分析仪的分析测定原理是吖叮脂在碱性环境中发光，通过测定发光量来检测测定物的含量，具有准确、快速、无污染等优点，是当今检验科在免疫定量检测这一领域使用最为广泛的仪器之一。但试剂为原装试剂，价格昂贵，每瓶提示“0 TEST”时，实际上还有15%～20%的残余量。如果能很好的再利用残余试剂，将创造良好的经济效益。
回收再利用方法：最简单的方法以工程师用户名登陆，在主屏幕下选择Reagents，再选择reagent history，选中将要加入的残余试剂的相应项目信息，点Delete键删除。把残余试剂盒重新装载扫瞄后，仪器记录又恢复到“100TEST”。另外可以将回收合并试剂直接放在另一台相同型号仪器上检测，仪器会默认为是一盒新试剂。但在回收合并过程中也有几点注意事项：（1）试剂报零后应及时取出，加盖放2～6℃冰箱，以免液体蒸发，影响结果；（2）合并试剂时每试剂瓶内液体不能多于原装新试剂的20%，否则将检测不出结果；（3）合并试剂时，每套试剂的各个试剂瓶之间是一一对应关系，千万不能放混，否测将报试剂错误，扫描不能通过。
CEA是消化道肿瘤实验室诊断和判断预后的重要指标，也是当今体检筛查的必查项目之一，是本实验室用量最大的检测试剂之一。CEA残余试剂和原装试剂的检测原理和程序过程完全一致，因此本研究没有进行全面的系统评价，仅从精密度、回收率和对比试验三个方面进行评价，对比试验采用澳大利亚室间质评标准（T±20%）作为判断标准[7]。本研究所有检测均是在室内质控在控的前提下来进行的。精密度是反映系统检测结果的重复性。本研究中批内精密度、天间精密度CV均小于5%，满足临床精密度要求[8]。回收实验是反映检测系统准确性的一种有效方法，因它可检系统的比例误差。本文回收率分别为92.31%、104.03%、104.53%，分别表明有7.69%、5.97%和5.47%的比例误差，都小于允许误差（T±20%）。以上均表明CEA残余试剂有
表2 CEA回收试验结果
原样品
（μL） 定值血清
（μL） 定值血清浓度
（ng/mL） 蒸馏水
（μL） 加入浓度
（ng/mL） 测定浓度
（ng/mL） 回收浓度
（ng/mL） 回收率
（%）
基础样品 950 0 - 50 0 7.53 - -
L 950 50 2.51 0 0.13 7.65 0.12 92.31
M 950 50 24.80 0 1.24 8.82 1.29 104.03
H 950 50 79.60 0 3.98 11.69 4.16 104.53
（下转第页）
（上接第页）
较好的重复性和准确性。方法比较试验所得的结果是配对资料，可进行配对t检验，经检验t=1.073，P>0.05，也同样显示两试剂结果差异无统计学意义。但t检验在临床对比研究中有时并不能很好地反映两方法间的相关性和一一对应关系，所以本研究选用的是相关和回归分析方法，此法在对比研究中应用更为普遍，能够计算出任意浓度的系统误差。在回归方程Y=a+bX中，a表示恒定误差，b表示比例误差，还可以根据回归方程的a、b值，计算出候选方法预期偏倚，并与不同医学决定水平（Xc）的允许偏倚作比较，从而对评价方法的可接受性作出判断。本研究中，回归方程Y=1.049X-0.521，斜率显示出的比例分析误差是2.70%，截距=0.521ng/mL，表明有0.521ng/mL 的固定误差。相关系数r为0.996，大于0.975，表明对比试验的浓度范围够宽，适合采用简单线性回归分析，且两种试剂检测结果相关性良好[8]。由此计算出各选定医学决定水平下的预期偏倚及可信区间，与允许偏倚比较得出残余试剂与原装试剂检测结果相当，可以接受 。这说明在检测的过程中，残余试剂与原装试剂具有可比性，差异无统计学意义，不需重新校标，可直接用于病人标本的检测，结果准确可靠。
综上所述，雅培ARCHITECT I2000SR化学发光CEA残余试剂的回收再利用方法简便，结果的准确性和重复性均满足临床要求，与原装试剂的测定结果具有可比性，可以用于临床检测。本研究仅是以CEA为例，后面还将陆续对雅培ARCHITECT I2000SR化学发光其它残余试剂的利用进行评估，以期在保证检测结果准确的前提下，创造最大的经济效益。
[参考文献]
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篇5
关键词：化学发光免疫分析法 血清C肽 胰岛素
Doi：10.3969/j.issn.1671-8801.2013.01.209
Chemiluminescence immunoassay detection serum C peptide and insulin clinical analysis
Zhang Yangwen
Abstract：Objective：To investigate chemiluminescence immunoassay detection serum C peptide and insulin clinical application value.Methods：December 2010 to December 2012 were our Ⅱ diabetes patients were set to observe group， will be in the same period of our medical without diabetes health is set to 120 cases of control group， the two groups of serum insulin and c-peptide test comparing.Result：Two groups of C-P Insulin and compared with significant difference （P
Keywords：Chemiluminescence immunoassay Serum C peptide Insulin
【中图分类号】R9 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2012）01-0231-01
最近几年，非同位素免疫检测在世界各国得到了越来越广泛的应用，化学发光免疫分析就是其中一种[1]。现对2011年06月至2012年12月我院收治的Ⅱ型糖尿病患者应用化学发光免疫分析法检测血清C肽与胰岛素取得的良好情况报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料。将2011年06月至2012年12月我院收治的Ⅱ型糖尿病患者120例设为观察组，男72例，女48例，平均年龄57.9±4.1岁，病程1～4年，患者均无糖尿病并发症。将同期在我院体检的非糖尿病健康者120例设为对照组，男69例，女51例，平均年龄56.1±3.9岁，均无糖尿病家族史。受试者在处于安静状态的条件下，保持平卧位，抽取三到四毫升的静脉血，标本全部都按照实验室常规工作进行对应的分析测定。
1.2 检测方法。化学发光技术用到的抗体有两种，都是常量的。抗体一位于标记试剂里面，为吖啶酯标记鼠单克隆抗C肽。抗体二位于固相试剂里面，属于和顺磁颗粒予以共价结合形成的鼠单克隆抗C肽。试剂批号不同，对应的标准曲线也不一样，用前借助条形码阅读器，也可以通过键盘输定标曲线数值到系统里面，然后通过C-P以及Insulin定标液这两点定标的方法对标准曲线进行对应的校准[2]。测试样品的时候，一定要严格准确的测量质控品。通过西门子ADVIA CentaurXP化学发光免疫分析仪实施项目检测。
1.3 统计学处理。采用SPSS 13.0统计软件。采用X±S表示，采用X2检验。差异有显著性为P
2 结果
两组的C-P及Insulin相比差异具有显著性（P
3 讨论
准确严格的测定胰岛素和C肽，可以说对于正确地进行糖尿病的诊断，准确地做出分析治疗，以及随后的相关回访，意义都是非常的重大的。尤其是C肽，其无论是对于Ⅰ型，还是Ⅱ型的糖尿病来讲，都具有很好的诊断指引意义。借助于胰岛素对糖尿病进行治疗的过程中，一个特殊的问题就是如何更加准确的测定胰岛素的存在[3]。之所以这样说，是因为外周循环里面存在的抗体以及外源性的胰岛素极大的干扰了胰岛素的有关测定。不过用胰岛素予以具体治疗的病患，抗体对于C肽分析则没有特别明显的干扰。C肽测定能够帮助对患者内源性胰岛素的具体储备情况做出准确的评估，相比于胰岛素而言，这种方法更加的可靠。无论是胰岛素，还是C肽分泌出以后回来到静脉血循环里面，经由肝脏，最终进入到体内的系统循环里面。C肽有三十五分钟的半衰期，胰岛素只有五到十分钟的半衰期[4]。肝脏对C肽基本上没有什么摄取能力，故而代谢清除率非常的缓慢，也就是在外周血里面，C肽和胰岛素相比，稳定性更强，能够更加精准的对β细胞的具体分泌情况予以反映，对于借助胰岛素进行对应治疗的病人，这一指标更为有用。
试验证实，糖尿病Ⅱ型患者和健康组相比，对应的胰岛素以及C肽都明显的偏低，差异显著（P
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篇6
呋喃它酮是一种人工合成的硝基呋喃类抗生素，主要用于畜禽和水产动物的各种肠道感染性疾病的治疗及促进生长的添加剂，曾经在畜禽水产养殖中广泛应用。有关研究证明，呋喃它酮及其代谢物5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮（AMOZ）具有相当大的毒性和副作用，能诱导有机体基因突变及致畸胎，且能诱发癌症[1，2]。美国、加拿大、中国和欧盟的很多国家都已规定动物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ残留为不得检出。但是因为其价格低廉、疗效好，目前违法使用现象在很多国家仍然存在，故有必要对动物源性食品中呋喃它酮及其代谢物AMOZ加强监控[3]。由于呋喃它酮原药不稳定， 进入动物体内后会被迅速代谢和分解，对原药的检测难度很大，但其代谢物AMOZ可以蛋白结合物的形式长期、稳定存在组织内，在适当的酸性条件下，这些结合残留物可以从蛋白质中释放出来，因此通常将AMOZ作为监测呋喃它酮的靶化合物[1，4，5]。
目前，AMOZ 检测方法主要有色谱法[6～9]、免疫分析法[10] 等。色谱法准确、灵敏，但操作复杂、设备昂贵、检测速度慢，需要专业技术人员。而免疫分析法具有简单、快速、灵敏度较高、特异性强和高通量等优点。免疫分析法的关键是高亲和力和特异性的抗体的制备，其中基因工程重组单链抗体是将天然抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL通过一条柔软的连接肽连接成的单链分子，不仅具有高亲和力和特异性，而且还可以通过工程菌发酵快速大量制备，极大地降低了抗体生产成本，缩短了抗体生产周期。化学发光免疫分析是近十年来发展起来的一项将高灵敏度的化学发光与高特异的免疫分析相结合的新兴的免疫检测技术，具有检测特异性好、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点，能显著提高检测的灵敏度，并且比常用的其他免疫分析法的灵敏度都高[11～14]。迄今为止，文献报道的AMOZ免疫分析法都是建立在传统的多克隆或单克隆抗体基础上的ELISA法，利用重组单链抗体建立的AMOZ化学发光酶免疫分析方法还未见报道。本研究利用重组抗AMOZ衍生物单链抗体，建立了测定虾肉中AMOZ残留的间接竞争化学发光酶免疫分析新方法。本方法简便、快速、准确、仪器设备简单，灵敏度高于ELISA法，测定结果和HPLC-MS/MS法测定结果呈现良好的相关性。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
篇7
【摘要】
基于苯海拉明对联吡啶钌(Ru(bpy)2+3)的电化学发光的增敏作用和丝素蛋白联吡啶钌复合膜修饰玻碳电极稳定好的特点，建立了一种以丝素蛋白多孔膜联吡啶钌复合物修饰的玻碳电极电化学发光检测苯海拉明的新方法。结果表明，该修饰电极具有很好的电化学活性和电化学发光(ECL)响应。在最佳实验条件下，苯海拉明浓度在1.0×10－4～1.0×10－7 mol/L范围内与其相对发光强度呈良好的线性关系(r=0.9989)； 检出限为2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。连续平行测定3.78×10－5 mol/L苯海拉明5次，发光强度的RSD为1.76%。 用于实际样品中苯海拉明的测定，结果满意。
【关键词】 苯海拉明；电致化学发光； 联吡啶钌；丝素蛋白；化学修饰电极
Abstract Based on the increasing effect of diphenhydramine on Ru(bpy)32+ electrochemiluminescence (ECL) system， an ECL method was developed for the determination of diphenhydramine hydrochloride by silk fibroin (SF)Ru(bpy)2+3 composite film modified glassycarbon electrode. A highlysensitive sensor was prepared based on SFRu(bpy)2+3 composite film modified glasscarbon electrode. Its fabrication procedure， related experiment conditions and electrochemical characterization were studied. Under the optimum experimental condition， the linearity of diphenhydramine concentration to ECL intensity was achieved (r2=0.9989) in the concentration of diphenhydramine hydrochloride of 1.0×10－4－1.0×10－7 mol/L and the detection limit (S/N=3) was 2.3×10－7 mol/L. The RSD for 5 times determination of 3.78×10－5 mol/L diphenhydramine was 1.76%.
Keywords Diphenhydramine; Electrochemiluminescence; Tris(2，2′bipyridine)ruthenium; Silk fibroin; Modified electrode
1 引 言
盐酸苯海拉明(Diphenhydramine hydmchloride，DPH)化学名为N，N二甲基2(二苯基甲氧基)乙胺盐酸盐，又名苯那君，是一种氨基醚类衍生物，为常用的抗组胺药物。具有抗过敏、止痒、消炎、消肿、镇静及镇吐等作用，临床主要用于荨麻疹、枯草热、过敏性鼻炎和皮肤瘙痒等皮肤黏膜变态性疾病。目前，对DPH的测定方法主要有原子吸收法[1]、疏水作用电动色谱法[2]、分光光度法[3]、离子选择电极法[4]、流动注射分光光度法[5]﹑气相色谱法[6，7]及电化学法[4]等，分别用于片剂[1，3，4，7]、药膏[2]、胶囊[5]和糖浆[5，7]中DPH的测定。虽然这些方法均可直接或间接测定1×10－5～1×10－3 g/L的DPH，但仍不能完全满足临床痕量分析的要求。而且这些方法多存在操作繁琐或设备昂贵、费时等缺点。中国药典2005版采用容量法测定苯海拉明[8]，此方法操作繁琐，终点不易观察，且仅适用于常量分析。因此，开发简便灵敏测定DPH的方法具有重要意义。
丝素蛋白(Silk fibroin，SF)是从蚕丝中提取的一种优良的天然高分子材料， SF具有无毒性、无刺激性、无过敏性和良好的生物相容性[9，10]，再生SF已被用于伤口保护、细胞培养、生化酶固定、隐形眼镜镜片和药物释放器等方面[11]。用溶解丝素制备的丝素膜在现代科学领域中具有广泛的应用，如人工皮肤材料、药物控制释放载体、固定酶载体、生物传感器等[12～14]。实验证实，SF可以对多种细胞表现较好的粘附和增殖，具有良好的细胞相容性，并可以通过共混、接枝、交联等方式提高或改变SF的理化性能[15，16] 。
联吡啶钌是目前应用范围最广和研究最活跃的电化学发光体系［17，18］。本实验是以SF作为模板，利用SF与Ru(bpy)2+3相互作用，反应形成新的物质或相互吸附得到的混合物膜，从而制备了新型传感器，实现了Ru(bpy)2+3的固定。实验结果表明，此修饰电极对联吡啶钌具有很好的电化学和电化学发光特性。
目前，关于用电化学发光测定DPH的报道较少。以SF固定联吡啶钌构建电化学发光传感器尚未见报道。本研究用SF膜固定联吡啶钌修饰玻碳电极，建立了测定DPH的电化学发光新方法， 实现联吡啶钌的循环使用，并成功地应用于药片中DPH含量的测定。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
MPIE型电致化学发光分析系统(西安瑞迈电子科技有限公司)；DL60D型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)；微量移液器（德国Eppendorf公司）。三电极系统: SF膜修饰玻碳电极为工作电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl为参比电极（饱和KCl溶液）。
0.1 mmol/L苯海拉明标准储备液(用时现配)：准确称取0.0029 g 苯海拉明，用水溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容，超声脱气后冷藏于冰箱中备用。1.0 mmol/L联吡啶钌(Aldrich公司)储备液：准确称取六水合三（2.2联吡啶）氯化钌0.0374 g， 用水溶解后，转移至50 mL棕色容量瓶中，用水定容，用超声波除气后放入冰箱中（4 ℃）冷藏； 家蚕废丝（汰头， 柳州市汇利丰茧丝有限责任公司）； 0.1 mol/L PBS缓冲液（pH 7.5）。实验用水均为二次石英亚沸水。
2.2 电化学发光传感器的制备
2.2.1玻碳电极的预处理
将玻碳电极分别用金相砂纸打磨， A12O3粉抛光至镜面，用大量水冲洗后，依次用无水乙醇、丙酮、水超声波清洗，将其置于0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV扫描，得到稳定的CV曲线为止，室温晾干待用。
2.2.2 再生丝素液的配制
将废蚕丝先用40 ℃温水浸泡30 min，再浸渍于煮沸的0.5% Na2CO3中脱胶[12]1.5 h， 蚕丝与NaCO3溶液比为1∶30（w／V)， 然后取出洗净、干燥，并用苦味酸胭脂红指示剂检验脱胶是否完全。用40% CaCl2溶液煮沸搅拌直至溶解，溶液为黄棕色。将溶解的丝素置于截留范围8000～14000 Da的34 mm透析袋中，分别以自来水、蒸馏水流动透析2 d，直至透析液电导率＜1×10－5 Ω－1， 可认为丝素液中的小分子已处理掉，即得再生丝素液。
2.2.3 SFRu(bpy)2+3膜修饰玻碳电极的制备
取上述再生丝素液80 μL，与100 μL 0.1 mmol/L联吡啶钌混合反应，即可得到SFRu(bpy)2+3复合物溶液。然后将6μL SFRu(bpy)2+3复合物溶液均匀涂在处理好的玻碳电极表面，在室温下自然干燥24 h后，放入0.10 mol/L PBS（pH 7.5）中CV扫描。电极再用水冲洗3次，用氮气吹干后，于室温下干燥保存。
2.3 实验方法
实验在MPIE型电致化学发光工作站上进行。采用三电极系统。将0.2 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液溶液（支持电解质）加入电解池，采用CV（0.2～1.3 V）扫描，然后记录发光信号，作为空白。在上述溶液中加入一定浓度的DPH溶液0.12 mL， 采用相同的方法测定发光信号值，得相对化学发光强度（扣除空白信号）。绘制相对峰高强度与DPH浓度的校准曲线，同时对样品进行分析测定。
发光强度时间曲线由MPIE型电致化学发光工作站给出。电化学发光（ECL）检测池的结构如图1所示。位于检测池下方的光电倍增管用于收集待测样品的ECL强度，光电倍增管负高压为800 V。溶液测定前用超声波除气5 min。 实验在室温下进行，所有电位值均相对于参比电极Ag/AgCl。
3 结果与讨论
3.1 SF Ru(bpy)2+3修饰玻碳电极中联吡啶钌电化学行为研究
考察了SFRu(bpy)2+3/GC/CME的电化学行为。实验发现，固定于SF膜中的联吡啶钌分子仍具有良好的电活性。图2a为CME在0.1 mol/L PBS中的CV图，图2b为该电极在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的CV图。由图2可见，固定于SF膜中的联吡啶钌分子仍具有良好的电活性，具有明显的氧化峰和还原峰。
3.2 盐酸苯海拉明在SF Ru(bpy)2+3修饰玻碳电极上的电化学发光行为研究
DPH在SFRu(bpy)2+3/GC/CME中联吡啶钌电化学发光行为如图3所示。曲线a为该修饰电极在0.1 mol/L PBS中的电化学发光图；曲线b为该修饰电极在0.1 mmol/L DPH0.1 mol/L PBS中的电化学发光图。从图3b观察到发光信号明显增强，从1.0 V开始出现发光信号，到1.12 V达到最大值，这与图2a中固定的联吡啶钌在1.12 V氧化峰电流达到最大值相符，也说明SFRu(bpy)2+3/GC/CME对DPH具有很好的ECL响应。
3.3 SF修饰量的选择
SF在玻碳电极表面的修饰量对联吡啶钌氧化峰电流和ECL强度都会产生影响。实验考察了修饰量（V）在2～8 μL之间对ECL行为的影响。随着覆盖量增加，联吡啶钌ECL强度增加。当修饰量为6 μL时， ECL强度达到最大值；继续增加修饰量，联吡啶钌氧化峰电流和ECL强度反而稍微降低（图4）。因为随着修饰量的增多，膜厚度也不断增大，电子在膜中阻力变大。本实验中SF修饰量选择6 μL。
3.4 缓冲溶液及pH值对发光行为的影响
介质是影响电化学发光重要因素。本实验考察了硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、碳酸盐缓冲液对SF膜修饰玻碳电极电化学发光信号强度和电化学发光信号稳定性的影响。结果表明，以PBS为介质时，DPH增敏的联吡啶钌电化学发光信号与其空白电化学发光信号的信噪比最大，且重现性较好，其最佳浓度为0.1 mol/L。考察了pH 6.0～9.0的PBS（图5），在pH=6.0时，发光强度较弱；随着pH值增大，发光强度逐渐增大，当pH=7.50时达到最大值。由于DPH带有胺基，其氨原子上有一对孤电子，易与质子结合，因此在酸性溶液中会与H+反应形成正离子。pH值继续变大， 发光强度有所降低，可能是由于溶液中过多的OH－参与在电极上的竞争反应造成高价态联吡啶钌的减少。实验中选择PBS缓冲液（pH=7.5）。
3.5 方法的评价
在选定的最佳条件下，通过电致化学发光工作站记录不同浓度DPH标准溶液在SF Ru(bpy)2+3/GC/CME上的发光强度响应曲线，DPH浓度在1.0×10－4～1.0×10－7mol/L与其相对峰高呈线性关系，其线性回归方程为I(counts )=5×107C+1003(r=0.9989)。方法的检出限为2.3×10－7 mol/L（S/N=3）。
在含有3.78×10－5 mol/L DPH溶液中，考察了常见的药物赋形剂、无机离子以及有机化合物对方法的影响（＜±5%）。结果表明：1000倍的Na+， K+， NH＋4， Ca2+， Mg2+， NO－3， CO2－3； 300倍的淀粉均不产生干扰； 5倍的半胱氨酸和尿酸产生干扰。
固定有联吡啶钌的SF复合物膜修饰的玻碳电极有较好的稳定性和重现性。使用前放置在PBS缓冲液中进行活化，对3.78×10－5mol/L DPH连续平行测定10次，发光强度的RSD为1.76 %，说明该传感器有很好的重现性。将修饰电极放置20 d后，在同样的条件下对同样浓度的DPH 连续测定10次，发光强度如图6所示，说明该传感器具有很好的稳定性。实验观察到修饰电极放置一段时间后对同样浓度DPH响应强度并没有降低，说明SF作为修饰材料固定联吡啶钌中的发光试剂流失现象不严重。
3.6 样品分析
取10片DPH缓释片研磨粉碎混匀，后称取相当于1片DPH含量的样品量，加水溶解后过滤，滤液定容至100 mL后收藏于棕色容量瓶中，稀释后以确定的最佳实验条件进行测定，结果如表1。
在一系列样品中加入标准液进行回收率实验， 测得回收率见表1。结果表明： 回收率为92.7%～101.2%，可见本方法可以用于DPH含量测定。表1 样品测定及回收率实验（略）
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篇8
关键词 镀铂； 铅笔芯； 热电极； 核黄素； 电致化学发光
1 引 言
黄素是7,8二甲基异咯嗪的衍生物，根据异咯嗪环上N（10）位置所连基团的不同，主要分为核黄素（RF）、黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）[1]。作为动植物中广泛存在的黄素蛋白的辅基，RF参与了食物的吸收利用以及身体内能量的转化过程。如果人体缺乏RF，细胞生长将会明显受损，而且会出现一些眼部及皮肤方面的疾病。RF广泛存在于生物、药物及食物中[2]，因而对它的检测具有重要意义。传统的检测方法有荧光法[3]、毛细管电泳或高效液相色谱荧光检测法[4,5]、电化学方法[6]、化学发光法[7,8]等。电致化学发光法（ECL）结合了电化学和化学发光的特点，具有选择性好、快速灵敏、仪器简单便宜等优点［9］。利用ECL法测定RF的文献已有报道[10～12]。
热电极技术只对电极加热，因此具有能产生热对流而增强传质，促进电极反应等特点，已成功应用于电分析领域。Sun等详细研究了铅笔芯热电极（HPGE）的电极直径与升温性能的关系[13]，并在该电极上利用吸附溶出法测定了RF[14]。Lin等将热电极技术引入到ECL分析系统，通过研究电极表面温度对Ru（bpy）32＋[15]、光泽精[16]和鲁米诺[17] ECL行为的影响，发现升高电极表面温度能加快物质的扩散速度、降低电极表面的污染、提高发光信号的重现性。
铅笔芯热电极（HPGE）具有升温性能良好、电势窗口宽和易于进行表面修饰等特点，但是由于电极结构的多孔性，表面吸附性较强。Pt丝热电极表面不易吸附，但是电极制作技术要求较高，而且价格相对昂贵。本研究结合了HPGE和Pt热电极的优点，制备了镀铂铅笔芯热电极（Pt/HPGE），在此电极上研究了温度对Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL体系的影响。利用核黄素对Ru（bpy）32＋C2O42－ ECL体系的猝灭作用，实现了对RF的灵敏检测， 并成功应用于实际维生素片中RF的定量检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
超微弱化学发光检测仪 （中科院生物物理研究所）；CHI 440电化学工作站（上海辰华仪器公司）。Ru（bpy）3Cl2•6H2O （St. Louis, MO, USA），以水配成4×10－3 mol/L溶液，于4 ℃保存备用；核黄素（AR，国药集团化学试剂有限公司），以0.10 mol/L醋酸溶液配成2.657×10－4 mol/L储备液，4 ℃避光保存备用，使用时用0.1 mol/L KCl稀释至所需浓度。其它试剂均为国产分析纯，未做进一步纯化。实验用水均为Millipore MiliQ系统净化超纯水（18.2 MΩ•cm， Millipore, Bedford, MA, USA）。
铅笔芯（Φ 0.38 mm, Hi Polymer 300 EB, Japan）分别用不同粗细的金相砂纸打磨至Φ 100
SymbolmA@ m。设计制作好一定规格的PCB板，将打磨好的铅笔芯用银导电胶固定到PCB板上（电极长度为单边5 mm），烘干后封胶，并于70 ℃下烘烤至密封胶完全固化，得铅笔芯热电极（HPGE）。镀铂液的组成为3.0 mmol/L H2PtCl6•6H2O和0.5 mol/L H2SO4。实验前, 溶液通氮除氧15 min。采用循环伏安法，扫描电位0～－0.3 V（vs. SCE），扫速为100 mV/s, 扫描50圈，即得镀铂铅笔芯热电极（Pt/HPGE）。
2.2 实验方法
采用三电极系统，铂片电极（99.9%，Goodfellow, UK）为对电极, 饱和甘汞电极（上海辰华仪器公司）为参比电极。工作电极在PBS（pH 7.4）中0～0.8 V循环扫描10圈更新。将发光池清洗干净，移取10 mL PBS（pH 7.4）缓冲液于发光池中，分别加入1 mL 1.0 mol/L KCl，100
SymbolmA@ L 4.0 mmol/L Ru（bpy）32＋及100
SymbolmA@ L 0.1 mmol/L C2O42－。工作电极和对电极固定好后置于溶液中，工作电极正对着光电倍增管PMT （高压设为 －750 kV。对电极施加0.4～1.4 V 的电位扫描，同时记录发光信号。以一定电位下发光峰的峰值为ECL 强度，并以加入核黄素前后的发光信号差（ΔI＝I0－ Is）对核黄素定量分析。
样品预处理：取10片维生素片（VB2）研细，称取适量粉末，用水溶解后超声20 min, 以3000 r/min离心20 min, 取上层清液过滤，以水稀释至RF浓度约为0.2 mmol/L, 于4 ℃冰箱保存。检测时，以PBS稀释至所需浓度。
分 析 化 学第39卷
第12期吴爱红等： 核黄素在镀铂铅笔芯热电极上的电致化学发光检测
3 结果与讨论
3.1 Pt/HPGE的表征
将HPGE和Pt/HPGE分别置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在室温下考察其循环伏安行为（图1A）。HPGE在H2SO4溶液中基本上没有电化学响应，而在Pt/HPGE上则明显观察到Pt的特征峰，即活性物质氧和氢的吸附和脱附峰，说明该电极具有与纯Pt电极类似的电化学性质，即Pt已经成功地修饰到电极表面。用SEM表征镀铂前后电极的表面形貌（图1B），在铅笔芯电极表面均匀地镀上了一层Pt粒子，其粒径约为150～200 nm。Pt镀层的存在，极大增加了电极的有效面积。[TS（][HT5”SS]图1 A. HPGE和Pt/HPGE在0.1 mol/L H2SO4中的CV图; B. 电极升温曲线; C. 电极表面SEM表征图
Fig．1 A. CVs of heated pencil graphite electrode （HPGE） and Pt/HPGE in 0.1 mol/L H2SO4; B. Relationship between temperature rise and heating current; C. SEM images[HT][TS）]
采用文献[13]报道的电势测温法可得到电极表面温度差（ΔT）与加热电流平方（I2）的关系。如图1C，在相同的加热电流下, Pt/HPGE表面能够上升的温度明显比HPGE高。这可能是由于金属铂比碳基底具有更好的导电性引起的。
3.5 电极的重现性
采用平行制备的5根电极测定Ru（bpy）32＋C2O42－的响应情况，相对标准偏差为6.0%。对于同一根电极，由于RF在电极表面会有一定程度的吸附，因此需对工作电极进行更新处理。如前所述，电极可以通过在PBS溶液（pH 7.4）中循环扫描而得到更新。分别在常温18 ℃及加热电极到38 ℃时，对1.33×10－8 mol/L RF进行多次平行测定，每次重新测定前均用上述方法更新电极，ΔIECL相对标准偏差（RSD，n＝9）分别为5.4%和5.1%，表明电极具有良好的重现性。
3.6 干扰研究
研究了某些无机离子及生物活性物质对核黄素ECL检测的干扰情况。当RF浓度固定为1.0
SymbolmA@ mol/L时，100倍的Ca2＋, Mg2＋, Fe2＋, Zn2＋, Cu2＋, SO42－和NO3－，50倍的抗坏血酸、烟酰胺、环糊精、淀粉、柠檬酸根、乳糖、葡萄糖和蔗糖对其测定都无明显干扰（相对误差
3.7 维生素片中核黄素含量的测定
当电极表面温度升高到58 ℃时，采用标准加入法对实际样品进行定量测定和回收率实验，（表1）。实验测得RF的回收率在97.0%～106.0% 之间，实际样品中RF测得量平均为标示含量的102.8%，说明本方法可用于实际药物中RF的分析检测。
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Determination of Riboflavin by Electrochemiluminescence at
Platinum Coated Heated Pencil Graphite Electrode
WU AiHong, SUN JianJun*, WU ShaoHua
（Key Laboratory of Analysis and Detection Technology for Food Safety, Ministry of Education,
College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002）
Abstract A platinum coated heated pencil graphite electrode （Pt/HPGE） was fabricated and its properties were characterized by cyclic voltammetry （CV） and scanning electron microscopy （SEM）, etc. It was demonstrated that Pt/HPGE had unique properties such as cheapness, easy preparation, good reproducibility and sensitive temperature response. The Pt/HPGE was employed to detect riboflavin （RF） sensitively based on the quenching effect of RF on Ru（bpy）32＋/C2O42－ electrochemiluminescence （ECL） system. The limit of detection was 1.9×10－10 mol/L （S/N＝3） at an electrode temperature of 58 ℃, which clearly lower than that at room temperature. The method was applied to the determination of RF in vitamin pills with an average recovery of 102.8%.
篇9
甲钴胺(mecobalamin)是一种周围神经障碍治疗药物,是维生素B12的甲基衍生物,临床主要用于治疗糖尿病神经障碍及多发性神经炎等周围神经疾病,也用于治疗因缺乏维生素B12引起的巨红细胞性贫血。与其他维生素B12相比,甲钴胺对神经组织具有更好的传递性,在体内通过甲基转换反应可促进神经细胞内的核酸-蛋白质-脂质代谢以及神经髓鞘的合成,修复被损害的神经组织,改善代谢障碍。此外甲钴胺还可以抑制神经组织传导的异常兴奋,促进正红血母细胞的成熟与分裂,促进血红素的合成, 改善贫血者的血象[1-3]。甲钴胺制剂的主药含量为每片500μg,给药后体内血药浓度极低( ng·L-1级),很难用一般的方法进行检测。本试验建立了甲钴胺血药浓度的化学发光微粒子免疫测定方法(chemiluminescentmicrop- article immunoassay,CMIA),并对甲钴胺胶囊的生物等效性进行研究。目前国内外尚未见有关于该方法测定甲钴胺人体内血药浓度的报道。
1 材料与方法
1·1 仪器 ARCHITECTTMi2000SR(ABBOTT LABORATO- RIES,USA);YKH-Ⅱ型液体快速混合器(江西医疗器械厂); KQ-50型超声清洗仪(上海超声波仪器厂);TGL-16C型高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。
1·2 药品和试剂甲钴胺标准对照品(北京市福瑞康正医药技术研究所,纯度99·2%,批号: 030611); B12试剂盒(批号: 11001M300);B12Controls(批号: 10845M100);B12 MasterCalibrators(批号: 04444M100);预激发液(批号: 05454M100);激发液(批号: 06725M100);清洗液(08317M102),美国雅培制药有限公司生产。试验制剂:国产甲钴胺胶囊(500μg,福建华海药业有限公司,批号: 030301;参比制剂:弥可保[500 μg,卫材(苏州)制药有限公司,批号: 020173]。
1·3 受试者选择本试验经国家食品药品监督管理局批准,试验方案经北京大学第三医院伦理委员会批准。20名健康成年男性志愿者经全面体格检查,心电图、血压、血尿常规及肝肾功能等各项指标均正常;受试者年龄(22·7±1·4)岁,身高(1·72±0·06)m,体重 (63·6±5·9)kg。受试者均无吸烟、饮酒史,受试前两周内未服用过任何药物,各受试者均自愿参加试验并于试验前由本人签署知情同意书。
1·4 给药方法与样本采集本试验采用2制剂、2周期的随机交叉给药方案。入选受试者于每周期试验前1 d晚入住Ⅰ期病房,禁食过夜后于次日清晨,以200 mL温水送服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂。分别于服药前及服药后0·5, 1, 1·5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24, 48及72 h各采取前臂静脉血4 mL,静置2 h后 4 000 r·min-1离心10 min,分离血清置-40℃冰箱保存待测。在整个试验过程中样品注意避光,以避免药物降解。试验期间受试者进统一饮食。给药后2 h进早餐、给药后4 h进午餐、给药后10 h进晚餐,给药后 2 h后可自由饮水。受试者在试验期间禁烟、酒;禁服含咖啡因、可可碱、茶碱的饮品;禁食含B12的动物性食品,如肉、蛋、牛奶;禁止剧烈运动。
1·5 甲钴胺血药浓度测定方法的建立
1·5·1 血清样品的处理 定量移取血清样品 300μL至反应杯,加入包被内源性因子的磁性微粒子进行结合;用清洗液清洗后,加入吖啶共轭物、预激发液和激发液进行免疫反应;将反应液用ARCHI- TECTTMi2000SR进行测定。
1·5·2 甲钴胺标准曲线的制备 吸取0, 100, 250, 500,1 000, 2 000 ng·L-16个质量浓度的标准液置样品杯中,按血清样品处理程序操作,于ARCHI- TECTTMi 2000SR分析仪中测定。ARCHITECTTMi 2000SR采用4-参数对数转换法(4PLC)及线性转换 (LT)技术建立标准曲线,标准曲线经B12Controls和 MasterCalibrators校准,通过程序处理判断标准曲线是否合格,若合格则存储该标准曲线,并以此对未知样品进行测定。
1·5·3 方法精密度和准确度 分别配制低、中、高 (200, 400, 800 ng·L-1)3种质量浓度的血清质控样品,按标准曲线方法分别于日内和日间处理测定, 并计算日内和日间相对标准偏差,评价方法精密度。 同法配制低、中、高3种质量浓度的血清样品,按标准曲线方法分别处理测定,计算其回收率,评价方法准确度。
1·5·4 样品稳定性试验 取口服甲钴胺制剂后采集的受试者血清样品于室温避光放置,按标准曲线方法分别于0, 2, 6, 9 h测定,考察样品的稳定性。 1·5·5 方法质量控制 在每批血清样品测定时建立新的标准曲线,并于每日测定样品时平行测定低、中、高(200, 400, 800 ng·L-1)3种质量浓度的质控样品,质控样品数大于被测定样品总数的5%。
1·6 数据处理将受试者口服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂后的血药浓度列表,计算血清中甲钴胺浓度增加值(ρ),并绘制平均血药浓度(ρ)-时间曲线。计算每1个受试者的有关药动学参数,并求出参数的平均值及标准差。相对生物利用度F 用各受试者的AUC0-t和AUC0-∞分别计算,并求其平均值和标准差。F0-t= [(AUC0-t)T/ (AUC0-t)R]×100%;F0-∞= [(AUC0-∞)T/ (AUC0-∞)R]×100%。用3P97软件对受试者血清中甲钴胺浓度增加值(ρ)-时间数据进行处理, 分析甲钴胺在人体内的药物动力学特征。将AUC和ρmax数据进行对数转换,然后进行方差分析及双单侧t检验处理,tmax用非参数检验进行统计分析,对甲钴胺试验制剂与参比制剂的生物等效性进行评价。
2 结 果
2·1 甲钴胺血药浓度测定标准曲线甲钴胺血药浓度测定后经B12Controls和Master Calibrators校准合格,符合测定要求,ARCHITECTTM i2000SR将试验制备的标准曲线自动存储,结果见表 1。本试验建立的标准曲线线性范围为100~2 000 ng·L-1。
2·2 方法精密度和准确度甲钴胺血药浓度测定方法的精密度和准确度结果见表2。结果表明,本试验建立的甲钴胺血药浓度化学发光微粒子免疫测定方法准确、可靠。
2·3 稳定性试验及质量控制甲钴胺血清样品室温避光放置时,在9h内测定结果的RSD为7·16%,结果表明,血清样品在本试验测定过程中稳定。本试验在测定过程中,于每日平行测定低、中、高浓度的质控样品,质控样品的测得值均在其真实值的±20%范围内。
2·4 血药浓度-时间曲线将测得的给药后血清中甲钴胺浓度减去给药前血清本底中的B12浓度,即得口服甲钴胺制剂后的血药浓度(ρ)。经研究,口服单剂量1 500μg的甲钴胺试验或参比制剂后平均血清药物浓度(ρ)-时间曲线见图1。
2·5 药动学隔室模型的拟合本试验采用简均数据法(na ve average data, NAD)将给药后每个时间点的各个个体的血药浓度数据进行平均作为主数据,然后用3P97软件进行隔室模型拟合,根据AIC值、r2和拟合优度等拟合结果进行判断。结果表明,甲钴胺口服给药后其血药浓度- 时间数据符合权重因子为1/ρ2的口服二室模型。
2·6 有关药动学参数根据血清中增加的甲钴胺的血药浓度(ρ)-时间曲线末端直线部分的试验点,以ln(ρ)对t进行回归,求得消除速率常数ke;ρmax、ρmax、tmax为试验的实测值;用梯形面积法计算样品的AUC0–t, AUC0–∞,AUC0–∞=AUC0–t+ρt/ke,有关的药动学参数见表3。
2·7 生物等效性评价单剂量口服试验和参比甲钴胺制剂后的 AUC0-t、AUC0–∞和ρmax经对数转换后进行方差分析,结果表明本试验中处方间和周期间均无显著性差异,个体间有显著性差异;再采用双单侧t检验法对试验制剂与参比制剂的生物等效性进行评价,结果见表4。采用SPSS软件对口服甲钴胺试验和参比制剂后的tmax进行Mann-Whitney秩和检验, 结果表明,两种制剂的tmax没有显著性差异。由统计分析结果可知,试验和参比甲钴胺制剂生物等效。
篇10
关键词 ：DNA生物传感器；切刻内切酶；量子点；电致化学发光；信号放大
1 引 言
近年来，随着生命科学的不断发展，低浓度特定DNA序列的超灵敏检测在临床诊断、基因突变检测等生物学研究中显示出越来越重要的作用和意义[1～4]。与荧光法[5]、石英晶体微天平法[6]、比色法[7]等众多的DNA检测方法相比，电化学发光法因其方法简单、响应速度快、灵敏度高和选择性好而得到了广泛应用[8～10]。
目标放大和信号放大是提高DNA检测灵敏度的两种常用方法。传统的目标放大方法如聚合酶链式反应（PCR）[11]、依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）[12]等因高的放大效率、灵敏的检测效果而被广泛应用[13]。然而这些方法一般都需要特殊的设备或昂贵的检测仪器，存在耗时、易污染、成本高、操作不便等缺点[14]。相比之下，通过目标物提高检测灵敏度的信号放大技术，快速、简便，已成为超灵敏检测DNA的研究热点之一[15～18]。切刻内切酶信号放大是近年来逐渐采用的低浓度核酸的检测方法[19]。探针DNA与目标DNA结合成双链时，形成切刻内切酶的识别位点，内切酶对探针DNA进行剪切，使得目标DNA被释放出来，并进行循环利用，实现检测信号的放大[20～24]。
电化学发光法不仅具有化学发光分析的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，而且电化学分析控制性强，选择性好[25]。量子点作为一种新兴的纳米材料，因其独特的光学性质，如高稳定性、不易分解、荧光寿命长等[26]，已被作为生物传感器的标记物和信号探针[27]。近年来，利用量子点高效及稳定的电化学发光性能研制的电化学发光生物传感器备受关注[28～31]。然而，将量子点优异的电化学发光性能与切刻内切酶的特异性相结合，进行目标物测定的研究至今未见报道。
本研究基于切刻内切酶的信号放大和量子点高效的电化学发光性能，建立了超灵敏检测DNA的方法。通过自组装方式将捕获DNA（cDNA）固定在电极表面，靶DAN分子（tDNA）与其特异性杂交形成双链，利用切刻内切酶对形成的双链中的cDNA进行识别和切割，释放出tDNA序列，参与下一轮的杂交和酶切。本传感器制作简单，灵敏度高，选择性好，具有良好的应用前景。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
MPIE 型电致化学发光分析系统（西安瑞迈分析仪器有限公司），采用三电极系统：工作电极为金电极（直径2 mm），参比电极为Ag/AgCl（饱和KCl）电极，对电极为铂丝电极。PGSTAT128N Autolab 电化学工作站（瑞士万通有限公司）；UV2400PC紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；F7000 荧光仪（日本日立公司）。
氯化镉（CdCl2・2.5H2O）、碲粉（Te）、硼氢化钠（NaBH4）、巯基乙酸（TGA）、巯基乙醇（MCH）、N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1乙基33二甲基氨丙基碳化二亚胺（EDC）购于上海Aladdin公司；切刻内切酶Nt.BstNBI（New England Biolabs有限公司）；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。DNA序列均购自于上海生工生物工程技术服务有限公司，使用时用TE缓冲液（10 mmol/L TrisHCl， 1 mmol/L EDTA， 100 mmol/L NaCl， pH 8.0）进行配制和稀释，碱基序列如表1所示。
2.2 水溶性量子点的制备
CdTe水溶性量子点合成方式参考文献[32]的方法并稍做改进。将250 mL 0.0025 mol/L CdCl2溶液倒入三口烧瓶中，磁力搅拌，通氮气除氧15 min，接着加入100 μL TGA，并用NaOH调节至pH≈10，继续通氮气10 min，封口。
量取3 mL二次蒸馏水倒入另一个50 mL 三口烧瓶中，同样通氮气除氧。称取0.36 g NaBH4和0.144 g Te粉加入水中，在65℃水浴和磁力搅拌下反应，直到黑色Te粉完全消失，得到紫色透明的NaHTe溶液。将得到的溶液倒入上述含有CdCl2溶液的三口烧瓶中，95℃水浴中搅拌回流2 h，得颜色透明的CdTe水溶性量子点。
2.3 电化学发光DNA生物传感器的制备
将金电极用0.05 μm Al2O3抛光至镜面，分别置于50% （V/V） HNO3、无水乙醇、水中超声清洗后，浸入含有1 μmol/L cDNA溶液中过夜，cDNA通过SAu键自组装在电极表面。将修饰电极浸入到巯基乙醇溶液中，避光孵育1 h，封闭其非特异性结合位点，分别用0.1 mol/L PBS缓冲液和0.5 mol/L NaCl溶液清洗，制得电化学发光DNA生物传感器。
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