生物学论文范文

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模型建构是一种重要的科学方法，也是生物学课程标准所重视的一种能力。高中生物学教材含有丰富的模型建构案例，是试题原创的重要素材库。模型分为三种类型，即物理模型、概念模型、数学模型。物理模型如细胞膜的流动镶嵌模型、DNA双螺旋结构模型;概念模型如血糖平衡调节模型、达尔文的自然选择学说的解释模型等;数学模型如自由组合定律、有丝分裂中DNA含量变化曲线等。在原创试题的命制中，对核心概念的考查，可在物理模型、概念模型、数学模型之间进行转换，从而创设出新颖的问题情景。例1:图示某反应物分子从常态到显著活跃状态能量变化的一段曲线。①②③三条曲线表示加酶、常温和加氯化铁等条件下的反应。下列叙述正确的是A．E1表示酶所降低的反应活化能B．E2表示氯化铁所降低的反应活化能C．曲线①与曲线③的对比，说明酶具有高效性D．曲线①与曲线②的对比，说明加氯化铁能加快反应速率例1是以“酶的作用及其原理”为考查内容的试题。命制时，将“概念模型”转换成“数学模型”，用数学中的坐标曲线图进行情景设计。该曲线图的设计创意来自大学教材陈阅增《普通生物学》第2版第46页上的插图，但经过较大的改进，在图中增加了有效信息，去除了一些干扰信息。题目情景新颖，又重点考查了“活化能”概念中之“显著活跃状态与常态下分子能量的差值”这一要素。参考答案:D。例2:图示为研究渗透作用的实验装置，请回答下列问题:(1)漏斗内溶液(S1)和漏斗外溶液(S2)为两种不同浓度的蔗糖溶液，漏斗内外起始液面一致。渗透平衡时的液面差为h，此时S1和S2浓度大小关系为。(2)图中半透膜模拟的是成熟植物细胞中的，两者在物质透过功能上的差异是。(3)为进一步探究两种膜的特性，某兴趣小组做了以下实验……(以下部分略)例题2是2013年江苏高考生物学试题的第27题，就是这种原创策略的成功案例。“渗透作用原理”是考纲中“物质出入细胞的方式”这一考点的重点内容之一。在命题时，将概念模型转换成物理模型，即将渗透作用的内涵和外延分解开来，将渗透装置示意图这一物理模型作为渗透作用概念外延的一部分。用数学方法处理实验结果(如液面高度差h、S1和S2溶液的浓度关系)，通过考查学生对实验宏观现象的认知来考查对渗透作用微观原理的认知，通过考查对概念外延的认知来考查对概念内涵的认知。参考答案:(1)S1＞S2(2)原生质层原生质层能主动转运有关物质而半透膜不能。

2“知识与方法”考查的“重组移植”策略

生物学试题考查的知识内容主要包括事实性知识和方法性知识。考查时，整合事实性知识和方法性知识可以还原知识的产生过程、体现知识的应用价值。从知识的形成过程提炼出的科学方法，还可以“移植”到其他知识的探究过程。生物学原创试题采用这种思路，重组“知识”和“方法”，可创设出新颖的问题情景。例如，差速离心法是分离各种细胞器的方法。设计“酵母菌细胞呼吸”有关试题时，可将差速离心法“移植”到酵母菌细胞呼吸的研究中。即用差速离心法将线粒体和细胞质基质分离，然后进行细胞呼吸的实验，以此作为试题情景，以考查细胞呼吸的过程。又如，将放射性同位素标记法“移植”到考查细胞周期染色体行为的试题中，创设出来的试题既能够考查有丝分裂细胞中染色体的行为，又能够考查DNA半保留复制的特点。例3就是这样的试题。例3:提取正常家兔的造血干细胞，放入液体培养基培养，提供的脱氧核苷酸原料中的N元素全为15N。造血干细胞连续进行有丝分裂，则第二次分裂后期的细胞中，含14N的染色体所占比例为A．0B．50%C．25%D．100%参考答案:B。

3从科学史资料提炼试题的“补充整合”策略

高中生物学教材含有丰富的科学史素材，是命题的重要素材库。若能根据知识的生成过程，梳理史实的脉络，挖掘史料之间的内在联系，以思维能力和核心知识为测量目标和考查内容，做好“补充整合”，命题往往能够打破框框、达到求变出新的效果。这一策略的要点:第一，要对史料进行针对性的“补充”，才能出新;第二，须“整合”，形成一个有内在联系的知识结构，思路才会连贯，主题才能聚焦。2014年高考理综试题福建卷的第28题，就是采用这种策略命制的。从例4可以看出，该题对教材中的科学史素材有选择、有提炼，以“人类对遗传的认知逐步深入”为线索，主题聚焦，第1小题和第3小题对教材中的史料有补充和整合，设问的角度也比较新颖。这道题的出现，是福建高考遗传方面命题的一个新突破，它避开了以往的旧模式，打开一片新的视野。尽管题干文字较长、语言表达还存在一定的瑕疵。但是，其灵活的创作思路和求新求变的可贵精神值得赞赏。例4:人类对遗传的认知逐步深入。(1)在孟德尔豌豆杂交实验中，纯合的黄色圆粒(YYRR)与绿色皱粒(yyrr)的豌豆杂交，若将F2中黄色皱粒豌豆自交，其子代中表现型为绿色皱粒的个体占。进一步研究发现r基因的碱基序列比R基因多了800个碱基对，但r基因编码的蛋白质(无酶活性)比R基因编码的淀粉支酶少了末端61个氨基酸，推测r基因转录的mRNA提前出现。试从基因表达的角度，解释在孟德尔“一对相对性状的杂交实验”中，所观察的7种性状的F1中显性性状得以体现，隐性性状不体现的原因是。(2)摩尔根用灰身长翅(BBVV)与黑身残翅(bbvv)的果蝇杂交，将F1中雌果蝇与黑身残翅雄果蝇进行测交，子代出现四种表现型，比例不为1∶1∶1∶1，说明F1中雌果蝇产生了种配子。实验结果不符合自由组合定律，原因是这两对等位基因不满足该定律“”这一基本条件。(3)格里菲思用于转化实验的肺炎双球菌中，S型菌有SⅠ、SⅡ、SⅢ等多种类型，R型菌是由SⅡ型突变产生。利用加热杀死的SⅢ与R型菌混合培养，出现了S型菌。有人认为S型菌出现是由于R型菌突变产生，但该实验中出现的S型菌全为，否定了这种说法。(4)沃森和克里克构建了DNA双螺旋结构模型，该模型用解释DNA分子的多样性，此外，的高度精确性保证了DNA遗传信息稳定传递。参考答案:(1)1/6终止密码(子)显性基因表达，隐性基因不转录，或隐性基因不翻译，或隐性基因编码的蛋白质无活性或活性低(2)4非同源染色体上非等位基因(3)SⅢ(4)碱基对排列顺序的多样性碱基互补配对。

4基于科技论文原创试题的“挖掘转化”策略

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1.1实验方法

1.1.1病原菌的分离和致病性测定采集新近腐烂的百合鳞茎，采用组织分离法[11]在病健交界组织处切取4mm×4mm小块，用75％酒精表面消毒30s，再用2%次氯酸钠消毒7min，无菌水冲洗3次，然后置于PDA培养基上28℃黑暗培养，待长出菌丝后，挑取菌落边缘进行纯化，纯化后的菌落再进行单孢分离培养。病原菌致病性测定根据柯赫氏法则，用灭菌的接种针在消毒后的鳞茎片上刺孔，将浸有菌液的滤纸片贴在孔上作为有伤接种，同时将浸有菌液的滤纸片贴在未刺孔的鳞茎片上作为无伤接种，将浸无菌水的滤纸片贴在孔上作为对照。接种处理完成后将鳞茎片置于培养皿中保湿培养，5d后观察并记录发病情况，确定病原菌对百合鳞茎的致病性。对接种发病的鳞茎片再次进行病原菌的分离。

1.1.2病原菌鉴定

1.1.2.1病原菌形态学观察将病原菌接种到PDA平板，28℃黑暗培养2-5d，观察菌落形态，并在显微镜下观察病原菌的菌丝及孢子的形态特征，测量孢子大小。

1.1.2.2ITS序列分析将供试菌株接种于PDA培养基中；28℃恒温培养4d，收集菌丝体，采用CTAB法提取病原菌基因组DNA。ITS通用扩增引物为TS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和TS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。扩增体系：50µL，基因组模板DNA1µL、10µmol/L上下游引物各1µL、2mmol/LdNTPs5µL、KODDNA聚合酶1µL、10×KODbuffer5µL，加ddH2O补足体积。PCR扩增反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s；58℃复性30s；72℃延伸3min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京信诺金达生物技术有限公司测序。所得测序结果在NCBI网站上用BLAST软件进行同源性比较后，下载同源序列，用MEGA（molecularevolutionarygeneticsanalysis，Version6.0）软件将病原菌ITS序列与同源序列进行比对，并采用邻接法（Neighborjoining，NJ）构建系统发育树，自举法（bootstrap）对系统发育树进行检验，500次重复。

1.1.3病原菌生物学特性将直径5mm的病原菌菌块分别接种于供试培养基平板（直径9cm）中央，于培养箱中培养，分析培养基种类、碳源、氮源、温度、pH和光照时间对病原菌菌丝生长和产孢量的影响。采用PDA、PSA、PMA、LA和LDA培养基；培养温度分别为5、15、25和35℃；pH分别为5、6、7、8和9；全光照、全黑暗和光照/黑暗各12h；等量葡萄糖、果糖、乳糖和淀粉置换查氏基本培养基中的蔗糖，等量硫酸铵、硝酸铵、硝酸钾和蛋白胨，置换查氏基本培养基中的硝酸钠，并设空白对照。病原菌菌株Z1和Z2分别在以上各条件下培养5d、2d后（因菌株Z2生长速度较快，因此缩短培养时间统计菌落生长状况），采用十字交叉法测量菌落生长直径作为菌丝生长状况指标，7d后采用血球计数板法测量孢子产量。

1.2数据分析

采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏新复极差法检验处理间差异显著性。显著水平p=0.05，每个处理3个重复。

2结果与分析

2.1百合鳞茎腐烂病症状及致病性兰州百合鳞茎腐烂病的发生一般从鳞茎表面破损处开始，初侵染时在破损处形成略显褐色的侵染点，逐渐扩展形成近圆形或不规则形状的褐色病斑，病斑中央呈腐烂状，并逐渐向四周扩大，病斑上可见灰绿色霉层，腐烂组织不断增加，严重时导致整个鳞茎软化腐烂。从兰州百合鳞茎腐烂病斑上分离纯化得到五株菌株，分别编号为Z1、Z2、Z3、Z4和Z5。致病性结果表明，仅菌株Z1、Z2单独接种健康百合鳞茎片后，在接种部位出现腐烂病斑，并伴随菌丝体大量繁殖，菌株Z2比Z1的侵染能力强，无伤接种也可导致鳞茎片腐烂（图1-b、c）。菌株Z1和Z2混合接种鳞茎片后，使鳞茎片腐烂更为严重（图1-d），其病症与百合鳞茎自然条件下的发病症状相同。从接种发病部位可分别重新分离到与接种菌相同的菌株，表明所分离到的菌株Z1、Z2均为兰州百合鳞茎腐烂病病原菌。

2.2病原菌鉴定

2.2.1病原菌形态从兰州百合腐烂鳞茎上分离到的病原菌菌株Z1，在PDA培养基上菌丝质地致密丝绒状，中央部分呈絮状，菌株形成少量菌核，同时伴有渗出液（图2-a）；菌落反面为无色至淡褐色，后期产生菌核时，会显现黑褐色斑点（图2-b）；分生孢子头初为球形，后呈辐射形；分生孢子梗多生自基质，孢子梗200~800μm×8~20μm，壁厚，无色，粗糙；产孢结构为双层；分生孢子为近球形，直径为2.4~6.4μm，壁略粗糙（图2-c）。病原菌菌株Z2在PDA培养基上生长迅速，菌丝疏松，最初呈白色，后变为灰黑色（图2-d），菌落背面呈白色棉絮状（图2-e）；假根发达，分枝呈指状或根状，呈深褐色。孢子囊呈球形或近球形，初期呈白色，老后呈黑色，直径25~200μm，孢囊孢子呈椭圆形或近球形，淡褐色（图2-f）。

2.2.2ITS序列分析用ITS通用引物扩增出病原菌的通用引物序列，长度分别为594bp（GenBank登录号：KP172534）和627bp（GenBank登录号：KP172533）。经BLAST分析，菌株Z1、菌株Z2的rDNA-ITS序列分别与黄曲霉和米根霉的同源性最高。在同源性最高的序列中各挑选10个菌株的ITS序列分别与供试菌株构建系统发育树。如图3所示，菌株Z1序列与Aspergillusflavus（JF754467.1）的序列亲缘关系最近，且与A.flavus相聚于同一群。如图4所示，菌株Z2的序列与Rhizopusoryzae（JQ683242.1）的序列亲缘关系最近，且与R.oryzae相聚于同一群。菌株Z1、Z2的ITS序列在NCBI上BLAST结果与A.flavus和R.oryzae的相似性为分别为99%和99%～100%，进而从系统分类学上进一步验证了菌株Z1和菌株Z2；再结合病原菌的形态特征，可以确定菌株Z1为黄曲霉（A.flavus），菌株Z2为米根霉（R.oryzae）。

2.3病原菌的生物学特性

2.3.1培养基种类对病原菌菌丝生长和产孢量的影响A.flavus和R.oryzae两种病原菌在供试的五种培养基上都能生长，两种病原菌在百合培养基和百合葡萄糖培养基上菌丝生长和产孢量最大，且在这两种培养基上的差异不显著。A.flavus在LA上培养5d后菌落直径达19.0mm，R.oryzae在LA上培养2d后，菌落直径达40.5mm，7d后产孢量分别为10.35×106个/ml和8.06×106个/ml（图5）。

2.3.2碳源、氮源对病原菌菌丝生长和产孢量的影响两种病原菌对供试碳源均可利用。A.flavus在葡萄糖为碳源的培养基上菌丝生长速度最大，培养5d后菌落直径达20.0mm，而在果糖、乳糖和淀粉为碳源的培养基上菌丝生长速度次之，且三者间差异不显著。A.flavus在葡萄糖和果糖为碳源的培养基上产孢量最高，而两者间差异不显著；在淀粉为碳源的培养基上产孢量次之，在乳糖为碳源的培养基上产孢量最低（表1）。R.oryzae在葡萄糖和果糖为碳源的培养基上菌丝生长和产孢量最大，且两者间差异不显著；在乳糖和淀粉为碳源的培养基上菌丝生长和产孢量次之，且两者间差异也不显著（表1）。A.flavus在蛋白胨和硝酸铵为氮源的培养基上菌丝生长速度最大，且两者间差异不显著，但在蛋白胨为氮源的培养基上产孢量高于硝酸铵为氮源的培养基，在硫酸铵和硝酸钾为氮源的培养基上菌丝生长速度和产孢量都较低（表1）。R.oryzae在蛋白胨为氮源的培养基上，菌丝生长和产孢量都最大，在硫酸铵和硝酸钾为氮源的培养基上菌丝生长较好，在硝酸铵为氮源的培养基菌丝生长较差，与无氮培养基差异不显著，但在硝酸铵为氮源的培养基上产孢量高于硫酸铵和硝酸钾为氮源的培养基（表1）。

2.3.3培养条件对对病原菌菌丝生长和产孢量的影响由表2可知，两种病原菌的菌丝生长和产孢的最适温度是25℃。A.flavus和R.oryzae在pH为5-9范围内的PDA培养基上均能生长，A.flavus在pH为5、8和9的PDA培养基的菌丝生长速度均较快，5d后菌落直径差异不显著，而在pH为6时产孢量最大，7d后产孢量为9.85×106个。R.oryzae在pH为6时菌丝生长速度和产孢量最快，2d后菌落直径达35.5mm，7d后产孢量为3.75×106个/ml：光照可促进两种病原菌的菌丝生长和产孢，A.flavus在全光照条件下生长5d后，其菌落直径达23.0mm，而R.oryzae在全光照条件下生长2d后，菌落直径达24.0mm，7d后产孢量分别达13.03×106个/ml和6.33×106个/ml。

3讨论

本研究通过致病性测定、形态学特性和ITS序列分析，确定引起兰州百合鳞茎贮藏腐烂病的病原菌是A.flavus和R.oryza，表明此腐烂病害是根霉腐烂病和曲霉腐烂病混合发生，这两种腐烂病害在百合鳞茎腐烂的相关研究中也有报道，但与本研究中分离到的病原菌不同，其病原菌是A.niger和R.stolonifer。此外，也有较多研究表明圆弧青霉菌、簇状青霉菌也可导致百合鳞茎腐烂，我们在兰州百合鳞茎贮藏病害调查时也发现大多腐烂严重的百合鳞茎表面着生有青霉菌菌丝，而且在分离病原菌时也分离到两种青霉菌，但致病性测定表明，这两种青霉菌均不引起百合腐烂，仅可在刺破表皮的百合鳞茎表面繁殖，表明我们分离到两种青霉菌仅是腐生菌，而不是病原菌。

生物学特性研究表明，A.flavus和R.oryzae两种病原菌的最适生长条件基本相同，这可能也是两种菌可以共生而侵染百合导致其发生腐烂病的原因。此外，这两种病原菌在LA和LDA培养基上的菌丝生长速度和产孢量均高于PDA和PSA（在LA和LDA上的菌丝生长速度和产孢量差异不显著），表明百合鳞茎本身的营养有利于这两种菌的繁殖而侵染百合鳞茎导致发生腐烂病害。目前，国内外食用百合的种植面积远低于观赏用百合，因此对百合鳞茎腐烂病的研究大多关注观赏用百合鳞茎种球在生长发育过程中的腐烂对出苗率和花卉品质的影响，而尖镰孢菌是引起观赏用百合鳞茎种球腐烂的主要病原菌，这与导致兰州百合鳞茎贮藏期间腐烂的病原菌不同，因此，防治花卉百合种球腐烂病的方法对食用百合也无借鉴作用。而作为食用的兰州百合鳞茎在原产地的贮藏方式目前多采用低温冷库在零下4℃条件下贮藏，通常不采用其它防腐措施，导致贮藏期间腐烂病的发生较为严重，本研究通过对其病原菌的分离和生物学特性的研究，为下一步开展采用安全的方法消毒百合贮藏冷库以及预处理百合鳞茎来防治腐烂病害的发生奠定了必要的基础。

4结论

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1.1茎

雷波野芭蕉的茎分为真茎和假茎两部分，真茎包括球茎和花序轴。

1.1.1真茎真茎维管束之间的形成层分生的新细胞通过横向生长和纵向生长，通过均匀增生膨大如球状，故又称为“球茎”，根、叶、花及繁殖用的珠芽均由此发生。真茎大部分位于地表之下，仅有较小部分贴近或稍露出地面，故又被称为“地下茎”，真茎粗大而又短小，其每年生长仅为5～10㎝，因此，生长速度极为缓慢。通过外部形态特征和内部解剖观察，可以看到真茎通常为球形，有时椭圆状球形，球状椭圆形或卵状椭圆形，具有明显的节，节间密集，节上着生有呈螺旋状排列的叶，叶腐烂后有残存的叶纤维或叶脱落后留下的叶痕迹。真茎顶端的顶芽发生于中央圆柱组织，顶芽分生叶和潜伏芽，潜伏芽着生于每片叶的叶鞘的腋部故又叫腋芽，每片叶鞘的腋部都着生有一个腋芽，腋芽数量较多，可达60～120个，但真正能发育成珠芽的通常有3～7个、多时有8～16个，珠芽生长发育形成新植株，并连同母株共同组成大型的野芭蕉株丛。真茎四周着生肉质须根，珠芽分散在肉质须根中，其维管束与母株球茎中的维管束相连接和相互贯通。真茎内部皮层中具有大量薄壁细胞，薄壁细胞中充满着水分和营养物质，因此，真茎在植株开花结实后假茎已消耗大量水分和营养物质，还可残留1～2年仍能继续分生新幼株。真茎生长到花芽分化期时增至最粗，待植株开花、结果，果实成熟后才逐渐死亡，真茎体内贮藏的水分和养分也转供给珠芽和幼苗生长，真茎既是根系、叶片、珠芽和花序发生的地方，同时又是水分和养分重要的贮藏场所。

1.1.2假茎野芭蕉植株位于地面之上高大，直立、粗壮、挺拔的圆柱状的“干”，高3.5～7m，直径30cm～50cm。实际上，它来源于叶属于叶的其中一部分，是叶柄基部变扁变薄并向两侧扩展延生而成，这些扁状叶柄在植物学上称为“叶鞘”，叶鞘从粗大短小的真茎长出，由数量众多的叶鞘相互重叠并紧密环抱形成的“干”，由于它内部没有维管形成层，与木本植物的茎具有显著区别，故并非真正的茎，所以被称为“假茎”。假茎的增粗主要是假茎基部的真茎顶端叶芽分化产生的新叶，在生长过程中新叶的叶鞘从假茎中央将外侧老的叶鞘向外挤压，致使叶鞘层数增多，周径不断增大，导致假茎逐渐增粗。假茎中的每一层叶鞘内部都由表皮层、厚壁组织、薄壁细胞、通气组织、维管束组成。表皮层由厚壁组织与靠近外层的维管束组成，上下表皮层之间有较为发达的薄壁组织、通气组织和分散其中的维管束，薄壁组织和通气组织形成的众多间隔空室，维管束有发达的韧皮部和数量较多的导管。叶鞘内较多的维管束和大量充满水分的薄壁细胞，在纤维强韧拉力和水分膨压的作用下，使得假茎能挺立地面之上，把叶片举到高处并平铺展开捕获阳光进行光合作用。假茎贮藏有大量的水分和丰富的养分，开花结果后假茎的大部分水分和养分转移到花序和果实中。因此，假茎既是贮藏水分和养分场所，也是输送水分和养分的通道，又有支撑和保护叶片、花序、果序的作用。

1.2叶

雷波野芭蕉叶由叶鞘、叶柄、叶片组成。真茎顶端的叶芽分化形成叶，叶在真茎上螺旋式互生，新叶在假茎中心向上生长，沿主脉两侧的左右两半叶片相互旋转包裹着，当整个叶片全部伸出叶鞘顶端后新叶片开始从上向下逐渐展开。

1.2.1叶鞘叶鞘位于叶柄的下部，是组成假茎的主体。叶鞘外形压扁、宽大，质地为海绵状肉质，具有一定的弹性。叶鞘内部结构由表皮层、厚壁组织、薄壁细胞、通气组织、维管束组成。叶鞘内由薄壁组织和通气组织形成的众多间隔空室和维管束组成，维管束分散在叶鞘中部，维管束有发达的韧皮部夹带离生的乳汁导管，多分布于靠近外表皮层处，而外表皮层又由最外层的维管束与厚壁组织组成。叶鞘中的细胞木质化程度较低，组织结构较为疏松，支撑能力和抗风能力相对较弱，加之叶片大型，花序和果穗沉重，如遇大风暴雨植株极易折断或倒伏，所以，野芭蕉多生于山沟两侧的密林中。

1.2.2叶柄叶柄位于叶鞘和叶片之间，下与叶鞘顶端相连，上与叶片基部相连，肉质状粗壮、厚实、坚韧、挺拔，长15～45㎝，在假茎上部近直立或斜生，上部开口具深槽，呈深半圆状强烈内弯，下部强烈圆凸，虽然在形态特征上叶柄与叶鞘具有较大区别，但二者在内部结构则极为相似，都是由表皮层、厚壁组织、薄壁细胞、通气组织、维管束组成。外为表皮，表皮内具有多层厚壁细胞与靠近表皮的维管束相间排列，中央由薄壁组织和通气组织形成的众多矩形或近四方形蜂窝状空室，维管束呈45°角分散在薄壁细胞中；由于主脉内部为较为典型的蜂窝状特殊的结构，因此，具有自重轻，抗弯性强，承载力高等特点，与主脉两侧叶片中的羽状平行脉一起组成骨架支撑着大型叶片平展在空间，有利于进行光合作用。叶柄两侧边缘两侧逐渐变薄，并向外延伸呈纸质或厚纸质翅，干后变厚纸质或薄革质，宽1～2.5㎝，皱缩或平展，并向下与叶鞘边缘的翅和向上与叶片基部相连成一体。

1.2.3叶脉叶脉为羽状平行脉，中脉粗大、肥厚、坚韧，上部开口呈半圆状深槽，下部强烈圆凸，从横切面外层为表皮层，维管束与中部垂直的维管束呈45°角分散排列，薄壁细胞分布在维管束之间同角度排列，从纵切面来看，主脉内的细胞呈长方形或正方形空室，为较为典型的蜂窝状结构，由于主脉内部特殊的结构，具有自重轻，抗弯性强，承载力高等特点，与主脉两侧叶片中的羽状平行脉一起组成骨架。主脉一是将巨大的叶片举至高处，支撑叶片使其平展在空间，有利于进行光合作用，二是贮藏和输送水分和养分，三是引导叶片上过多的雨水沿主脉深槽向下流淌，以避免新叶和花序被雨水长期浸泡，四是承受外界的风吹、雨打、雪压，而不易折断。野芭蕉能够在阳光强烈，土壤干旱、贫瘠的生态环境中生长，可能与其发达的主脉保证供给水分和营养物质以及具有较强的光合作用有密切关系。

1.2.4叶片叶片宽大，长椭圆形或长矩圆形，长3.2～4.5米，宽0.75～0.89米，先端圆形，稍偏斜，基部渐狭至楔形，并下延与叶柄两侧的翅相连成一体，叶片两侧对称，边缘常下垂有利于雨水排除。通过解剖结构可知叶片由上下表皮（表皮细胞、气孔器），栅栏组织、海绵组织、叶脉（维管束）组成。叶片上表皮细胞2～3层，为典型的复表皮，外壁角质层显著增厚，具有较强的防水、抗旱、抗寒能力和防病虫害作用，栅栏组织多层排列较为整齐，海绵组织不规则疏松，叶脉分散在叶肉组织中。气孔分布在上表皮疏散数量较少，下表皮紧密数量较多，沿中脉两侧的密度较大，数量较多，向两侧边缘其密度逐渐减小，数量也随之减少，气孔密度及数量还与植株所处生态环境和叶片在植株上着生的位置有关。气孔既是进行光合作用时气体进出的重要通道，同时也是病菌入侵的通道。雷波野芭蕉吸芽经过生长发育形成幼苗，幼苗出土后在生长初期长出4～5枚幼叶只有叶鞘没有叶柄和叶片的，当长到5～8枚幼叶时不仅具有叶鞘，在叶鞘先端还具有狭窄短小的叶片，8～9片之后的叶不仅有叶鞘还具有明显的叶柄和叶片。野生芭蕉的叶有两种类型，一种是没有叶柄，只有叶鞘或有叶鞘、叶片的叶属不完全叶，另一种是具有叶鞘、叶柄和叶片的叶属于完全叶。以后随着植株的生长，叶片逐渐增大,直至花芽分化开始，叶片达到最大为止。野芭蕉叶片面积增大一方面加大了对光能的捕获较强，特别是在阳光不足时有利于更有效地进行光合作用，但另一方面叶片面积增大使其蒸腾作用增强，水分也容易过度散失，抗旱能力要求特别高，因此，野芭蕉通常生活在温暖湿润的环境中。此后，随着叶片逐渐收缩变小，假茎中心部便抽出花序轴，当最后在花序轴上长出狭窄细短先端钝的叶片时，叶的发生和生长发育完全终止，其数量也不再增加。叶片还具有可以随不同阳光强度、温度高低和空气湿度变化调节叶片位置，控制气孔的开合和蒸腾量。雷波野芭蕉植株的总叶数及叶片的大小、数量和寿命与植株、土壤、水分、光照、气候及生态环境的不同等密切相关，野芭蕉植株从幼苗出土至开花结果后停止抽叶，一生抽生叶片36～50片，其中剑叶6～18片，小叶9～16片，大叶13～25片，叶的寿命通常为76～298d。叶片是野生芭蕉进行光合作用的重要场所，根系将吸收的水分和无机矿质营养通过光合作用，合成有机养分供植株生长发育、开花结果，因此，叶片的多少和叶面积的大小也是衡量野芭蕉植株生长发育的一项重要指标。

1.3花序

花序由花序轴、苞片和花组成。雷波野芭蕉真茎顶端中部的生长点，前期时仅分化叶芽抽生叶片，植株生长发育到一定阶段，叶片达到一定数量时，由营养生长转为生殖生长，球茎顶端生长点停止分化为叶芽，不在抽生新的叶片，转而分化形成花芽，花芽生长分化为花序。花序分化初期花序原始体较小，其形态特征及性别不甚明显，内部的花和果梳用肉眼还难以分辨，进入分化中期，花序生长发育长至15～20厘米时，内部花的形态特征逐渐明显，通过肉眼就能识别花的性别和果梳数量。花芽分化成熟后期在假茎内部形成花序，花序在假茎内部通过花序轴向上延伸，从假茎顶部中心抽出顶生的肉穗状柔荑花序，穗状花序上的花由花序基部开始逐渐向顶端开放，且开花时间较长，故野芭蕉的花序又属于无限花序类型。自基部向花序先在基部开两性花或雌花，然后再向上开雄花，两性花或雌花逐渐发育成果实。花芽分化是植株从营养生长转人生殖生长时的内在生理变化，花序和花分化开始时，其植株体内的营养物质和生长素类物质转化加快，含量显著升高，通过花芽分化的生理指标也可判断这些物质的变化。花芽分化是在珠芽生长发育形成幼苗，幼苗出土后生长至三年生的植株叶片数量长到25～30片，叶展开的面积与接收到的光照时数和积温达到一定量时才开始进行的，整个花序和花芽的分化及其形态特征的变化都在假茎内部中央进行。花序在花序轴的作用下从假茎顶端伸出，初时为椭圆形、卵状椭圆形，大型，长18～19.5厘米，直径12.5～13.5厘米，先端钝状圆形或圆形，随着苞片的开放，花序逐渐变短小为阔卵形。

1.2.1花序轴球茎顶部生长点初时仅抽生叶片，但当地下茎的生长点伸出地面，生长点不再分化叶片，转而分化花序轴（茎）及花序，花序轴属于真茎向上延长生长的一部分，花序轴沿假茎中央不断向上生长，直至从假茎顶端伸出，将花序伸出假茎顶端外。花序轴厚实粗壮，圆柱形，深绿色，长度可达5～7m，直径5.5～6.2厘米，被短柔毛，其中大部分被假茎包裹并直立向上延伸，另一部分则伸出假茎外向下弯曲，顶端着生花序，花序在花序轴的作用下与其一起下垂。

1.3.2苞片苞片着生于花序轴上，呈螺旋状层层重叠紧密排列，将花包裹于内侧，海绵状肉质，卵状椭圆形，长卵状椭圆形，长椭圆形，阔卵形，卵形，长20～23厘米，宽12～16.3厘米，初时较长大，随着不断展开逐渐变短小，先端钝状圆形或圆形，基部向内凹陷呈月牙状或半圆形，苞片仅在基部最外2～3片为绿色，大型，内部没有花，从基部至顶端外面黄色或淡黄色，内面淡黄色，而且每一苞片内均着生有花；每苞片内花排成二列，有小花（13～）17～24朵。苞片开放顺序为从上到下，从基部至顶端，即先从花序最基部一片开始展开，然后由基部依次向上至顶端逐一展开，展开后的苞片向后反卷，将着生于苞片内侧基部的花露出，花随即开放。苞片通常在展开后反卷，花开2～5天后脱落。

1.3.3花花由花被片、雄蕊和雌蕊组成。花为野芭蕉花序中的雌花、两性花、中性花的和雄花的统称。花被花序中的苞片间隔为花序段，而每一段的花分别都着生于苞片内，被苞片包裹，只有待苞片展开后才暴露在外开放，所以，花开放的时间苞片展开先后不同而有所不同。花没有或明显没有花梗，直接着生在花轴上，雌花或两性花较少，位于花序基部的数轮苞片内，其子房生长发育后逐渐膨大为果实；雄花较多，位于花序基部以上至顶端的所有苞片内，子房败育，不能生长发育为果实。

1.3.3.1花被片花被片由合生花被片、离生花被片组成。合生花被片带形（或条形）或披针状带形，长约5.5厘米，宽1.3～1.5厘米，边缘薄，半膜质，先端具不等大5裂（3+2），裂片卵形、阔卵形、阔三角形，长2～5毫米，先端钝形或锐形，两侧裂片背面先端有或无角刺状突起；离生花被片长卵形，长4.7～5.2厘米，宽1.5～1.9厘米，半膜质，先端细尾尖，基部圆形。

1.3.3.2雄蕊雄蕊由花丝和花药组成。雄蕊5枚，第6个雄蕊退化或不存在，花丝丝状长1.8～2.5厘米，花药条形，长（2.7～）3.4～3.8厘米，2室，药隔在顶端微突起。

1.3.3.3雌蕊雌蕊由子房、花柱和柱头组成。子房下位。发育子房5～7（～9）棱，生长发育为果实，3室，每室具有多数生于中轴胎座的胚珠，胚珠发育为种子；败育子房4～5棱，披针状柱形，长2～2.4厘米，直径0.5～0.6厘米，密被短柔毛，3室，每室具有多数生于中轴胎座的胚珠，不发育为种子，花柱扁四棱柱状，长4.8～5.4厘米，柱头膨大，扁形或近头状。

1.3.3.4花粉粒花粉粒大型，圆球状，无萌发孔，表面光滑至不平、粗糙、皱波状或为规则的细颗粒状突起;花粉粒解剖结构外壁薄,内壁厚,内壁外层通常为管状层厚、外方具有明显的均质颗粒层,内壁内层为均质的纤维层。野生芭蕉花期长，开花时间可长达6～10个月，花中富含蜜腺，苞片颜色鲜艳，通常可借助蜂类、蝇类、蛾类等昆虫进行传粉受精。

1.4果穗

果穗由果穗轴和果实组成。雷波野芭蕉果穗由花序基部10～20片内的雌花或两性花发育而来。果穗较大，长27～35㎝，直径24.5～30㎝，阔椭圆状，阔椭圆状球形至近圆球状，果实较多，86～143个，紧密着生。

1.4.1果穗轴果穗轴由花序轴演化而来，粗壮，弯曲，圆柱状，长60～85㎝，直径5.2～7.5㎝，深绿色，被短毛，它既有发达的维管束系统，能将位于地表之下真茎中的水分和营养物质向上输送，为花序和果穗的生长发育提供所需的水分和营养物质，又有发达的纤维组织，承重力特强，能承受5～30㎏的重力，将花序和果穗悬垂在3～5m的高空。

1.4.2果实果实为浆果肉质，通常不开裂，3室。幼时绿色，密被短柔毛，成熟后深绿色或黑绿色，倒卵状，长倒卵状，阔倒卵状，倒卵状椭圆形，长倒卵状椭圆形，椭圆状，长（6.7～）8.5～11.9㎝，宽5～-7.2㎝，通常具5～7（～9）钝状棱角，被疏毛或渐变无毛，先端截平，残留有干花被片；果柄较长，长（0.5～）1～1.5㎝。果皮较厚，外面深绿色，内面白色，果肉较少，白色，内部充满较多种子，可能是依靠种子发育产生的刺激作用而生长的，每个果实中含有种子（12～）24～68（～76）个。

1.4.3种子种子质地硬骨质，压扁或不规则多棱形，椭圆形，卵性，阔卵形，四方形，近圆形，矩形，长（1～）1.2～1.4厘米，宽1～1.1厘米，高（0.4～）0.5～0.8（～0.9）厘米，灰黑色，黑色，灰褐色，黑褐色，无光泽，腹面种脐大，圆形，直径4～6毫米，灰色，背面中部明显具一小瘤状突起。种子由种皮、珠孔、合点、胚乳、胚组成。种皮又由外种皮、中种皮、内种皮构成，外种皮细胞由栅栏状排列的厚壁细胞组成，细胞壁增厚并木质化，中种皮由厚壁细胞组成，内种皮由细胞壁增厚的石细胞组成，种子中厚壁细胞数量增多，种皮机械支撑能力和保护作用增强；胚乳由外胚乳和内胚乳组成，外胚乳仅有1层细胞,分化较弱，内胚乳发达，占据了种子较大的体积，为种子后含物的重要贮藏场所，内含有丰富的淀粉、蛋白质、脂类物质等；胚直立、柱状；珠孔区由珠孔领和孔盖组成；合点区仅具有合点堆，合点区的内种皮连续。雷波野芭蕉种子的萌发率较低，约在5%左右，可能与种子的种壳坚硬，种皮透水性极差，种子内胚得不到充足的水分和营养物质有关，也有可能胚还尚未完全成熟或处于休眠状态，因此，导致种子萌发率的原因很多，既有外部的也有内部的以及生理原因。雷波野芭蕉种子即使能够萌发，其幼苗长势也非常虚弱，成活率不高，由此可见，野芭蕉在自然状况下，能进行无性繁殖和有性繁殖两种类型，但在野外自然条件下，吸芽无性繁殖还是野生芭蕉主要繁殖类型。

1.5吸芽

雷波野芭蕉的吸芽由球茎上的叶腋间的腋芽生长发育而成，是在假茎基部根际或茎叶腋间自然发生的极度缩短的球状短枝。吸芽发育形成初期基部大上部逐渐变小，形似近圆状卵形、阔卵状或长卵状，基部白色，上部淡绿白色或淡绿色；夏季阳光强烈，温度较高，雨水较多湿度较大，水分和营养充足，在这样的环境中生长的球茎较大，形成的吸芽叶鞘较发达，节间距相对较大，秋末随着温度降低而湿度变小，在这样的环境中生长的球茎较小，节间距相对较小，根系较多，吸芽上的鳞片状叶鞘较短小，干枯后常呈褛衣状。母株死亡后其球茎上发生的吸芽芽体伸长生长形成地下茎，地下茎伸出地面生长发育形成幼苗，这些幼苗通常可作为新植株的幼株，新幼苗由于没有母株产生的激素和母株叶片遮荫的影响，容易长出叶片。吸芽发生初期不定根没活动不长根，水分和养分由母株供给，随着吸芽的生长发育芽体不断增粗伸长，芽体基部长出了不定根形成的肉质状须根，即可吸收土壤中的水分和养分供其生长。吸芽生长发育形成的新幼株在没有与母株分离之前，既可由母株供给其生长发育所需的水分和养分，也可通过肉质状须根从土壤中吸收水分和养分供其生长，直至母株死亡，新幼株经生长、发育即可自母株分离长成新植株，新幼株的水分和养分才完全由其球茎产生的肉质状须根独立自主吸收。目前所知，在自然状况下雷波野生芭蕉及整个芭蕉属植物中有两种无性繁殖类型，即吸芽繁殖和肉质状须根繁殖，但以吸芽繁殖为主的无性繁殖是自然繁殖类型中最常见、最普遍的繁殖类型。

2结论

篇4

首先将ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株分别接种在5mLTSB中，37℃200r/min摇床培养12h，再转接种于30mLTSB中，同法培养11h，测量菌液OD600，调整ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株菌液浓度OD600为1，用于攻毒小鼠，并涂板计数。将6周龄Balb/c每7只分为一组，共8组。分别将ZJ1208野毒株和ZJ1208-ΔWza缺失株菌液0.3、0.5、1.0和1.5mL／只腹腔接种于各组小鼠。攻毒后每隔2小时观察和统计小鼠发病和死亡情况。

2结果与分析

2.1同源重组pUC18-LR-Kan的构建

用上下游同源臂引物分别从HPsZJ1208野毒株的基因组DNA中扩增得到了Wza基因上游同源臂Wza-UP和下游同源臂Wza-Down(图3泳道1和3)，上游同源臂5'端和下游同源臂3'端端含有USS识别序列，用Kan引物从pET-28质粒扩增得到了Kan基因片段(图3泳道2)；再将3个PCR扩增片以重叠PCR融合成Wza-UP+Kan+Wza-Down外源打靶片段(图3泳道4)。将Wza-UP+Kan+Wza-Down片段克隆入pUC-18质粒构成同源重组质粒pUC18-LR-Kan。经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后验证，得到预期的2684bp同源重组片段和2635bp的线性化质粒pUC18(图4)，外源打靶基因的三个片段测序结果证明没有发生碱基突变。

2.2自然转化法转化

HPs分别用2μg同源重组质粒自然转化HPs的5个不同菌株的感受态菌，经37℃温箱约36~48h培养，其中5个菌株中,ZJ1017、ZJ1208、ZJ1404和ZJ1307菌株在30μg/mLKan-TSA平板上长出菌落(表2)，以组合PCR鉴定(即用Kan引物、Wza引物、同源臂上下游引物Wza-U-F-EcoRⅠ-USS/Wza-D-R-HindⅢ-USS同时鉴定)结果只有ZJ1208的菌落有被鉴定为阳性的(表2,图5A)。将ZJ1208阳性转化子传至第20代提取基因组DNA，再次进行组合PCR验证，结果依然为阳性(图5B)，测序上下游片段和Kan片段正确，以上验证结果表明获得了Wza缺失株，命名为ZJ1208-ΔWza株。

2.3ZJ1208-ΔWza株与野毒株的生物学特性比较

2.3.1菌落形态的比较

将-70℃冻存的ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株分别涂布在TSA平板上，37℃温箱培养24h后，可见二者均长出半透明，圆润的小菌落(直径约0.5~2mm)；此结果表明与野毒株相比,ZJ1208-ΔWza缺失株的菌落形态并没有发生明显变化(图6)。

2.3.2生长速率的比较

结果如图7所示，在整个生长过程中，ZJ1208野毒株生长速率要快于ZJ1208-ΔWza缺失株，二者都在12h时OD600值达到最大，分别为2.196和1.246；但其差值达到了0.95；ZJ1208野毒株的对数生长期在约10h时结束，而缺失株ZJ1208-ΔWza在培养8h，即提前2个小时结束。二者的活菌数基本都在8~10h间达到最大，但二者每毫升活菌数对数值的差值也在0.4~0.5个数量级之间。在其继续培养之后，二者活菌数均逐渐减少。

2.3.3荚膜染色和形态结构的比较

取对数生长中前期的突变株ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株进行荚膜染色，显微镜下观察发现，突变株ZJ1208-ΔWza缺失株中存在比例较多的长链状菌体和长杆状菌体，约占总菌数的30%~40%，而ZJ1208野毒株菌体大部分则较短小，松散，单个菌体居多。在荚膜表达量初步比较中发现，ZJ1208-ΔWza缺失株和野毒株菌体周围都可见被染成绿色的荚膜成分存在(图8)。

2.3.4菌体沉降速率比较

将ZJ1208-ΔWza缺失株和ZJ1208野毒株过夜培养的菌液室温静置5h，每隔1h进行观察，2小时后ZJ1208-ΔWza缺失株菌体即可出现肉眼可辨的菌体沉淀，并且随着时间的延长，沉淀越明显；而ZJ1208野毒株菌体在5h未发生沉淀，菌液依然浑浊；此现象与2者OD600变化相符合(图9)。

2.3.5细胞吞噬实验

细菌计数结果表明，1个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的细菌数量为9.25×103，而ZJ1208-ΔWza缺失株为6.95×105，吞噬率分别为0.064%和3.8%；10个MOI感染时，ZJ1208野毒株被吞噬的数量为1.23×105，而ZJ1208-ΔWza缺失株为0.88×106，吞噬率分别为0.085%和0.48%(图10)。说明ZJ1208-ΔWza缺失株比ZJ1208野毒株更容易被PAM所吞噬。

2.3.6小鼠攻毒实验

实验结果表明，ZJ1208野毒株接种的四个组别小鼠都全部死亡，并且随着攻毒剂量的增加，小鼠起始死亡时间随之提前。而ZJ1208-ΔWza缺失株0.3mL接种组未有小鼠死亡，0.5mL组只有一只小鼠死亡，并且死亡时间比同剂量ZJ1208野毒株组的小鼠死亡时间滞后10个小时。ZJ1208-ΔWza缺失株1mL和1.5mL接种组虽然小鼠也全部死亡，但是死亡时间比相同剂量的野毒株ZJ1208组的滞后(表3)。说明将Wza基因缺失后，ZJ1208-ΔWza缺失株对小鼠的毒力相比野毒株ZJ1208有明显下降。

3讨论

构建缺失株在研究微生物生物学特性方面起着举足轻重的作用，但是其转化技术到目前为止还依然不是很成熟;包括多数细菌和真菌在内，其转化方法都具有菌株特异性或其方法本身的不成熟(Juetal.,2012；孙磊等,2005;Xueetal.,1999)；然而HPs更是如此，这也是针对HPs研究中，国内外目前都在努力克服的一个关键性技术难点。Anna(2005)通过自然转化法构建HPs缺失株；Chen(2012)通过构建大肠杆菌-副猪穿梭质粒在电转化副猪嗜血杆菌方面也进行了初步尝试；Zhang等(2012)利用筛选出的天然感受态副猪嗜血杆菌通过自然转化成功获得ompP2缺失株；申果(2013)也通过自然转化成功构建了cdt基因缺失突等。在本实验构建HPsWza基因缺失株的实验过程中，针对筛选的5个HPs菌株，除了对自然转化方法的尝试和优化外，本实验室前后亦对电转化方法进行了摸索和尝试，但最终未能够用电转化方法获得阳性缺失株；采用自然转化法也是仅仅成功构建了ZJ1208HPs菌株，其他4个菌株中3个虽在Kan抗性平板可以长出菌落，但都没能获得阳性缺失株，以上也印证了HPs转化方法的不成熟和HPs菌株缺失株难以被构建的现象。目前推测限制修饰系统可能是副猪嗜血杆菌转化效率低下的一个关键因素。限制修饰系统最初在大肠杆菌中被发现，其分为4种类型(Robertsetal.,2009)，每种类型由一种限制性内切酶和对应的一种甲基化酶组成；不同的菌属或菌株可能又会存在酶结构上的差异性(Tombetal.,1997)。几乎90%的细菌包含限制修饰系统，而且43%的细菌存在以上4种或更多的限制修饰系统(Robertsetal.,2004)；。Ando等(2000)从分子机制水平验证了幽门螺杆菌的限制修饰系统对质粒的转化和重组起着阻碍的作用。因此，在前期电转方法的尝试中，根据Donahue等(2000)的方法，本实验室亦尝试利用无细胞抽提物(cellfreeextracts,CFEs)先预处理质粒，然后再转化副猪，但并没有取得成功。并且质粒在被CFEs处理回收后，有大量质粒被降解，条件的优化并不能抑制质粒的降解；另外，人们也通过预先确定受体菌中的限制修饰系统所包含的甲基化酶的种类，从而用商品化相应的甲基化酶在试管中预先处理，再转化受体菌，从而证明也可以提高外来质粒的转化效率(Kimetal.,2010)。基于以上经验，笔者认为应该先从基因水平上确定副猪嗜血杆菌的限制修饰系统的种类，然后有针对性的利用甲基化酶来修饰重组质粒，无论是针对自杀质粒或是穿梭质粒，或许此方式可提高自然转化和电转化的转化效率。荚膜合成基因在大肠杆菌和其他菌属已被鉴定出，由于其外膜合成基因和蛋白空间构象具有保守性，华中农业大学通过对HPs基因进行测序，并将其与其他菌科的相关基因和蛋白进行序列和空间构象对比，获得了HPs相关的基因序列功能，同时荚膜合成相关基因亦被鉴定出来，其中在HPs中被鉴定出的Wza基因被推测具有荚膜多糖运输功能(Xuetal.,2011)。因此，本实验通过构建HPs的Wza基因缺失株，一方面来研究证实Wza在HPs中的功能，另一方面来研究荚膜在HPs毒力和致病性中的作用。从本次实验结果来看，ZJ1208菌株至少在体外培养时，野毒株和Wza缺失株都可形成较薄的荚膜，并不能在光学显微镜下看到明显差异；或许其原因可能存在除Wza基因外其他有关荚膜合成的代偿代谢途径，另外ZJ1208-ΔWza缺失株在室温静置可形成菌体沉淀，而ZJ1208野毒株不能，并且在静止时其OD600在1~2h稍有增长，随后平稳，说明ZJ1208野毒株在短时间静置时有菌体进行了分裂繁殖，且不形成沉淀。Cheng等(2010)对肺炎杆菌的一种粘液蛋白合成基因rmpA缺失后，菌体K2荚膜合成减少，从而导致菌体粘度降低，低速离心时，rmpA缺失株可以在试管形成沉淀而野毒株不形成沉淀，并且缺失株对小鼠的毒力亦降低；因此作者推测，ZJ1208的Wza基因亦只对HPs荚膜合成中的一种或几种粘性多糖的运输或合成起着关键性作用，但并不在菌体荚膜的所有多糖的运输或合成中起着关键性作用。另一方面，通过对ZJ1208-ΔWza缺失株株和ZJ1208野毒株的菌落形态，荚膜染色菌体形态,生长速率以及抗PAM吞噬能力大小和对小鼠毒力等生物学特性的初步比较和分析后，发现其二者的菌落形态并没有明显的差异，ZJ1208-ΔWza株生长速率相比起ZJ1208野生株表现的明显较慢，作者认为可能是缺失株在菌体荚膜形成过程中的异常从而使其对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱，使其活菌死亡或是裂解的快，亦或是缺失株本身在生物代谢上的异常从而造成了其生长的缓慢；另外，在8-~10h间，活菌数达到最大，这与OD600变化并不一致，原因可能是菌体死亡速率与二分裂的速率基本持平，但ZJ1208-ΔWza株菌体比起ZJ1208野生株菌体裂解的更快，因此可以看到对数生长曲线中ZJ1208野生株在8~10h后仍然在攀升,而ZJ1208-ΔWza株已基本保持平行状态，，这从另一方面也验证了作者对缺失株对培养环境相较于野毒株表现的更敏感和脆弱这一推测；同时，缺失株中较长的菌体比例明显增加，可能原因是其生长缓慢，造成了菌体二分裂的周期延长和缓慢，从而使菌体与菌体之间连接在一起，最终形成了看似较长的菌体；在抗PAM吞噬实验中，相同MOI情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza的吞噬能力显著高于ZJ1208野生株，尤其在MOI为1并作用1h的情况下，二者的差异尤为显著；另外，在MOI增加时，野生株ZJ1208被PAM吞噬的数量亦成明显增长，但ZJ1208-ΔWza株被吞噬的数量却增加的幅度较小，甚至不明显；其可能原因是在MOI为1，菌体与PAM相互作用1h的情况下，PAM对ZJ1208-ΔWza菌体的吞噬几乎到达饱和状态，因此在增加菌体数量时，一定数量的PAM亦不能更高效地对其进行吞噬，而野生株ZJ1208菌体相比较ZJ1208-ΔWza，其对PAM不敏感，PAM对野生株ZJ1208吞噬的效率并不高，此时增加菌体数量时，可以较线性的增加PAM对ZJ1208的吞噬数量。小鼠的毒力实验亦表明了ZJ1208-ΔWza和野生株ZJ1208的毒力存在明显的差异，其在0.3和0.5mL组表现得尤为明显。

4结论

篇5

1．学校、老师对实验课的重视度不高

大多数生物教师在传统教学理念的影响下，认为生物实验教学只是生物教学的一种辅助工具而存在，没有理论课来的重要．这就导致许多学校的实验课基本上是讲解、背诵实验目的，实验原理，实验器材，实验步骤，实验结果，考试时也仅仅是粗略地考查实验，片面强调实验操作的熟练化，注重实验的结果，轻视在实验中发现问题，分析看到的实验现象，实验课沦为一种简单的实验技能训练，而研究方法的探寻不被重视，它的重要科学价值被抹杀．常此以往学生不仅失去了独立思考的机会，更会变成只会机械背诵，应付考试的机器，创新精神的缺失将更加严重．生物学的教学形式迫切需要变革，生物实验教学急需改进，一定要将生物实验教学落到实处才能培养出具有创新精神的新时代学生．另一方面，实验室利用率很低，大都闲置着．大部分学校都有单独的生物实验室，但平均利用率很低．学校在进行课程安排时将大部分的时间安排在理论课教学上，学生的实验课时间被大大压缩，理论与实践存在脱节的现象．

2．学校的硬件设施没有跟上

学校硬件设施的配备与学校对生物实验的重视程度，学校所在地的经济文化的发展程度有着极其密切的关联．总体而言，当前大多数地区的经济发展程度都可以满足基本的硬件设施配备需要，只要学校更加重视这方面的教育，加大一定的投入，基本的实验器材还是可以满足的．但生物学实验受外界客观因素的影响较大．客观条件的限制是实验课开设度不高的重要影响因素．有一些生物学实验需要用到较为先进的观察仪器，但这些仪器的价格高昂，大多数学校很难拿出足够的经费引进．另一些实验需要用到活体，像家兔，小白鼠，蟾蜍等，这些实验材料的储存需要找专人看管，投入的人力物力较大．其次，在一些偏远地区或者比较偏远的农村，想达到和大城市学校一样的实验配备在现有的经济条件下是不允许的，许多农村中学缺乏实验课程必备实验器材，开设实验课困难重重．

3．缺乏实验研究意识

当前学校开设的一些生物学实验，仅仅是从书本中选取一些操作相对简便，耗费的人力物力相对较少，没有危险性的最基本的实验，这已经远远不能满足新课程的需要．理想与现实总是存在一定的差距，当前的生物学教学中存在一些薄弱环节需要加强．

二、提高高中生物实验教学水平的举措

1．增强学校和老师对于高中生物实验教学的重视

生物教师和学生都应当充分地认识到，上实验课不是一种上课的新形式，重要的是通过实验能使学生更愿意动手操作、与他人展开合作和积极探索科学．在实验过程中，学生为着相同的实验目的进行相互分工合作，在合作中认识到人与人之间合作的重要性;亲身参与实验的每一个步骤，学生实事求是的科学态度得到培养;实验的失败与成功存在很大的不确定性，失败的痛苦，成功的喜悦教会学生要有一个健康良好的心理素质，不畏失败，坚持不懈，克服艰难、勇于探索，积极进取．这些实验可以教给学生知识的同时，助力学生的健康成长．学校和老师要从根本上真正认识到实验课的重要性，协调好实验课与理论课的比重，培养学生学习生物的兴趣，引导学生参与到生物实验教学中来．

2．完善学校的实验设备

高中生物对于学生来说也是比较重要的一门高中学科，在理科高考中占据一定的地位．生物课的教学成果差的话，将影响学生的整个高中生活．高中生物的很多知识都需要一些实验来证明，例如细胞分裂等实验．这些实验如果不能让学生实地得去操作，那么对于学生来说，并不能深入地理解这些实验所讲述的原理．所以学校引进优良的生物实验设备是十分必要的，学校可以向政府申请一定款项来重新完善实验室设备或者向社会的慈善的人士求助，帮助学校修葺生物实验室，让学生能够在设备完善的实验室里学习，提升学生的生物成绩，让学生在实验过程中爱上这个这门学科．

3．提升学生对实验研究的重视

生物学的发展需要进行大量的实验，仅仅依靠机械背诵是不能牢固掌握生物学知识的内核的，在课堂教学中，学生只有主动参与课堂教学，逐步对生物学科产生一定的学习兴趣，才能提高课堂学习的效率，使学生获得更多的知识．实验是人类认识和研究生物科学的一种直观的重要的手段，也是老师进行生物学教学的一种重要手段．教师指导学生利用一定的材料，药品，仪器设备，按照指定的内容去进行一系列生物实践活动是实验课的主要形式．通过生物学实验，学生获得一些对生物界的感性认识，学生学习生物的基本技能得到锻炼．由认识，分析，掌握，到综合运用生物学知识的能力增强．学生学习生物学的兴趣被生动有趣的生物学实验大大激发，实验可以培养学生秉持一种实事求是的科学态度．综上所述可见，要完成高中生物学的教学任务必须提高实验课的质量，要提高整个学科的综合成绩，也必须重视实验课．对此，提出以下举措:学校要从长远出发，积极开展一些生物实验型研究性学习，生物界缤纷多彩的，可以拿来进行研究的课题也层出不穷．引进一些具有较强带领学生进行实验研究的骨干教师，带领学生进行科学研究，

三、对高中生物的实验教学的展望

篇6

1通过“饥饿教学”提高教学难度

“饥饿教学”的知识应有一定的难度，学生必须付出一定的努力才能完成，否则不能激起学生的求知欲。例如，在学完“伴性遗传”后，出示例题(2010年江苏省高考题第29题)，鼓励有兴趣的学生课后完成:遗传工作者在进行遗传病调查时发现了一个甲、乙两种单基因遗传病的家系，系谱如图所示，请回答:(所有概率用分数表示)(1)甲病的遗传方式是。(2)乙病的遗传方式不可能是。(3)如果II4、II6不携带致病基因，按照甲、乙两种遗传病最可能的遗传方式，请计算:①双胞胎(IV1与IV2)同时患有甲种遗传病的概率是。

②双胞胎中男孩(IV1)同时患有甲、乙两种遗传病的概率是。女孩(IV2)同时患有甲、乙两种遗传病的慨率是。此题完全没有超出教材知识范围，掌握了课堂所学解遗传概率问题的方法，完全能够做出来;此题为高考题，且具有一定的难度，对学生来说是一个挑战，能引起学生征服此题的“饥饿”，学生都想通过做出此题来证明自己的解题水平;此题具有相当的综合性，将各种遗传概率问题集中到一起，能起到很好的训练作用。

2通过“饥饿教学”提高学生的灵活性

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【关键词】医学微生物学；直观教学；教学研究

直观教学是从具体形象入手，通过直观的感知刺激不断强化，使学生从视觉、听觉、触觉等多角度感知表象，开发学生形象思维能力，强化学生记忆认知效果［1］。笔者在医学微生物学教学中采用直观教学法，讨论如下。

1实物直观

1.1标本观察提供实物让学生去感知，在此基础上，再辅助以相应讲解、强化，可以使学生牢固掌握微生物的生物学形状，达到过目难忘，这种效果是单纯抽象语言叙述所无法达到的。

1.2实验示教医学微生物学实验技术复杂，标本具有一定的致病性，且要求严格遵守无菌操作，是实验学习的难点。到位的实验示教可以保证良好的实验效果，培养学生严谨的学习态度，一丝不苟的工作作风，对学生今后从事临床研究极为重要。

1.3访问调查医学微生物学涉及面广，涵盖性强，与医学免疫学、内科学、实验诊断学等多学科相联系，因此，在条件允许的情况下带领学生到医院访问实际病例，观察临床表现，以了解微生物的致病性。

实物直观优点在于学生直接接触物体，所获感性材料真实具体，有利于准确理解知识，在此过程中，学生易产生学习兴趣，提高学习积极性。但实物直观的缺点是易受客观条件限制，需用模像直观加以弥补。

2模像直观

2.1图片观察提供实物照片或简化了的示意图，通过挂图、投影方式展示出来，满足学生的感官认识需要。

2.2绘图教学人的感知规律其中包含活动律，即在固定不便的背景上活动的物体容易被感知，因此教师在教学中画图优先于挂图。

2.3动画展示课程中许多知识点研究微生物动态活动规律，如病毒的复制周期，衣原体感染细胞的过程，噬菌体的生活周期等，将这些书本上单纯语言叙述的枯燥过程制成模拟动画呈现出来，具体而直观，有利于调动学生的学习兴趣。

2.4电子课件应用计算机技术，教师根据课程需要制作个性化的电子课件进行微生物教学也是十分必要的。电子课件可以整合书籍、图片、动画、声音等直观素材［2］，是最有效的模像直观手段。

3言语直观

3.1口诀式微生物学中零散的知识点很多，很难记忆，将这些知识点综合起来，编成通俗易懂而又朗朗上口的口诀，则方便记忆。如描述破伤风芽胞梭菌生物学性状有这样的口诀：细长杆菌周鞭毛，幼龄运动很活跃，革兰阳性鼓棰样，端立芽胞要记牢。学生根据口诀，扎实记忆知识点，避免了造成相关特征的含糊和混淆。

3.2类比式为了使学生深刻理解典型知识点，类比方式在微生物教学中使用较为普遍。如介绍结核分枝杆菌培养特性，将其拟人化总结为3个字：馋(专性需氧，营养要求极高，pH6.5-6.8)、懒(生长速度极慢，18-24h繁殖一代，2-4w见菌落)、赖(菌落极粗糙，聚集生长，呈菜花状)。肺结核典型临床表现3个字：热(发热)、汗(盗汗)、美(面部潮红)。类比法化难为易，变抽象为具体，引起学生兴趣，加深学生对知识的理解。

3.3情境式这种方法是启发式教学的一部分，设立问题情境，组织学生讨论，使学生开动脑筋，运用课程相关知识解决问题，设立具体情境，启发学生发散式思维，知识在头脑中有意识地整合与重组，锻炼了学生分析问题解决问题的能力。言语直观的优点是不受时空条件限制，使用范围广，但言语直观往往不如实物直观和模像直观鲜明、具体、完整和稳定。

【参考文献】

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一年一代,成虫寿命约一年。于每年四月,越冬成虫开始活动,觅食及交尾产卵,卵经历共三龄幼虫和蛹的阶段羽化成成虫,六月至七月性成熟。据实验室内观察,成虫在光线之下,如有遮蔽物即全部躲于遮蔽物下方;若无遮蔽物,会在塑料缸内同一个角落聚集成堆,到了夜晚则分头觅食(图1)。野外炮步甲经常栖息于在肥力较好,有机质含量多,湿度较大的田块的土壤和田埂缝隙中,河流岸边等,没有固定的巢穴,有时也在其他昆虫(如蝼蛄或蚯蚓)造成的洞穴中或天然裂缝中,在10-20厘米的表土层中容易找到。实验室观察可见在无天然洞穴时,成虫会自主挖洞,以第一对步足和上颚掘土,因没有专门的挖掘结构,其挖洞速度稍慢,一周左右可挖出刚好伸入头部大小的洞穴,一个月以上基本可以见到能容纳整只炮步甲的洞穴。成虫食性很广,不仅取食其他昆虫,而且会食用馒头水果等。在可以选择时,会优先食用其它成虫尸体,如干黄粉虫和活黄粉虫,炮步甲会首先取食干燥的黄粉虫。在食物充足时没有见到取食活体昆虫的现象。当抢食同一只黄粉虫时,两只炮步甲会向对方喷射,除抢食外,它们并不互相攻击同类,但若有自然死亡的炮步甲,剩余活体便会取食死亡个体的内脏,剩下头胸部及腹部的外壳。

2防御行为关于防御行为作了如下几个方面的调查:

2.1.瞄准取0.3x0.3mm大小的双面胶,一面粘于虫体背部正中一面固定在铁丝上(双面胶的黏力需要强)用以固定虫体,再使用镊子加以刺激(此操作需在屋内只有单一光源时可拍摄照片捕捉到喷射轨迹):1.刺激腿,炮步甲能够通过灵活的腹部末端进行瞄准,当刺激其足时,它可以准确喷射到被刺激的部位。喷射来自前腿方向的刺激,需要腹部末端有较大的扭转角度,来自后腿方向的,需要较小的扭转角度。2.刺激后背,刺激后背时,炮步甲不能像刺激腿那样精确的定位,它的腹部末端向上弯曲到最大角度所喷出的液体,基本与身体平行,无论刺激头部、前胸、背板还是鞘翅,它都以同一向上弯曲到最大的角度喷射,但横向角度还是有区别的,如刺激鞘翅左边缘即喷射偏向左边,刺激鞘翅右边缘即结果相反。3.跟踪瞄准,炮步甲能够进行连续喷射和精准定位,改变刺激部位,它的腹部末端也会跟随转换喷射角度。例如,先刺激左中足,待它准确喷射向左中足后,立即刺激右后足,它也能立即定位右后足进行喷射,连续喷射并不影响定位准确性。

2.2.喷射次数与喷射距离炮步甲体内贮存的反应物含量有限,因此它所能进行的防御喷射次数也是有限的。将广炮步甲固定,以镊子进行刺激。经对20只广炮步甲研究所得,在同样强度的刺激下,立即喷射次数为3~5次。加强刺激和等待时间,刺激强度以不破坏炮步甲的身体为标准,直到炮步甲不再喷射,可得炮步甲总共能喷射的次数约6~9次。可见炮步甲可以进行连续喷射,但喷射次数多了以后,炮步甲需要用几秒长的时间来晃动腹部以进行喷射,无论是喷射时间还是精准度与开始相比都有所偏差。以淀粉碘化钾试纸铺于虫体下方,刺激喷射,可观察到喷射距离。在尽量于虫体正后方刺激,平直喷射,于纸上留下的痕迹在65mm左右,作为虫体的最远喷射距离。

2.3.喷射脉冲炮步甲共进化出两个分支,brachinoid和paussoid,其中paussoid分支的炮步甲种类非常少见,其喷射过程中并没有脉冲现象,另一类brachinoid包含了大多数种类的炮步甲[6],而广炮步甲就属于brachinoid分支。通过对炮步甲喷射的声音进行录音,并以cooleditpro软件进行音频处理,可见广炮步甲的喷射确实有音频脉冲。其喷射持续0.01～0.03s,如图可知,0.002s左右即有一脉冲波,一次喷射有5～15次脉冲(图2)。

3讨论

国内的炮步甲属有三个常见的近缘种较难鉴别,分别是广炮步甲、耶炮步甲和爪哇炮步甲,三者体表花色相近,大小类似,同样都具有“喷射”行为,难以辨别。其中耶炮步甲身体花纹稍显不同,而广炮步甲和爪哇炮步甲目前可见鉴别方式只有雌雄生殖器。本文所采炮步甲皆取自河北省白洋淀,根据生殖器和分布范围可以断定是广炮步甲(爪哇炮步甲主要分布在中国南部)。遂对其进行详细的形态描述予以补充便于分类。

本文对广炮步甲的生活习性主要是实验室内观察,其生活史可能与野外观察有所出入,但大体上与爪哇炮步甲习性相类似,所以主要提出几点关于习性的补充,尤其是关于广炮步甲的食性跟前人研究的其他种有所出入,广炮步甲偏向杂食,并且几乎不取食活体昆虫,除活体黄粉虫和死亡黄粉虫对比之外,笔者还曾观察到一只广炮步甲因为被水浸泡时间过长,处于行动非常困难的濒死状态,却在每当有其他炮步甲靠近时强烈挣扎移动身体或者推开其他炮步甲,直到它恢复活力不再有对其他同种的排斥行为,笔者怀疑是它怕其他炮步甲误认为自己已死取食自己身体所致。但在食物不充足的条件下,只提供活体昆虫广炮步甲是否会取食还需要进一步实验。炮步甲属的昆虫以它们独特的防御方式而著名。受“炮步甲”喷射毒液的启发,二战期间,美国的军事专家研制出一种二元化武器。对炮步甲的防御行为进行研究,既有助于了解生物奥秘,又可能具有仿生学意义。世界关于炮步甲防御机制有些报道,但对于炮步甲具体的防御行为,如喷射最远距离和喷射次数等目前还未见,本文对此作了初步调查。

篇9

比较记忆法就是对相似而又不同的知识进行对比分析，不论哪一种比较方式，都能达到同中求异、异中求同的目的。有比较才有鉴别，其特征、本质就会得到凸现。

1．1横向比较例如，基因重组和易位这一对概念的比较，都属于可遗传变异，前者发生在一对同源染色体的非姐妹染色单体之间的部分交叉互换，而易位发生在两条非同源染色体之间的互换，属于染色体的结构变异。

1．2顺序比较在学习新知识时，将其与头脑中已有的旧知识加以比较。例如，在记忆动物细胞培养的条件时，与之前学过的植物细胞与组织培养的条件相比较，除了找出动植物细胞相同的培养条件外，还特别强调要控制一定的渗透压和溶解氧，在培养液中要添加动物血清。

2联想记忆法

根据知识点的特征引导学生进行正确的思维，对不同的知识点赋予不同的联想来加强记忆的方法。例如，由感冒时夜间咳嗽比白天严重，联想到副交感神经有使气管收缩的功能;由寒冷季节人们排尿增多的现象联想到人体内水分的来源和去路，以及体内渗透压的调节。

3图形再现法

俗话说，“一幅画胜过千万言”，由此说明图形记忆的有效性。这是由于图形具有鲜明的形象性、直观性，容易引起记忆。例如，拓展教材中“甘油三酯的代谢过程”图示，清晰呈现了甘油三酯的来源和代谢过程，其来源有外源性和内源性两种，前者是小肠上皮细胞吸收;后者是肝细胞和脂肪细胞的自身合成，去路是在肝细胞和脂肪细胞都能分解为甘油和脂肪酸再转化成葡萄糖，然后被组织细胞的利用，还体现了甘油三酯的平衡受到胰岛素、胰高血糖素和肾上腺素的调节机制。高三教材中还有很多知识点借助图形进行分析和记忆，是非常有效的。

4归纳记忆法

篇10

从2002年开始，我们结合我校人才培养目标及具体情况，制定了本科生《分子生物学实践》及《基因工程实践》的教学大纲，开设了相应独立的实践课程，设计了质粒提取、PCR技术、DNA电泳、限制性内切酶技术、DN段的胶回收、外源基因的连接及重组DNA的转化、筛选和鉴定等最基本需要掌握的实践。同时，我们还自编了内容详细、操作具体的实践教材。从2002年第一次开课至今已经过去了十多年，实践课取得了一定的成绩，根据课上学生上课情况和完成的实践报告上看，学生反应良好，能积极动手动脑并提出问题，实践报告也完成得认真、仔细。学生掌握了这些基本实践的原理和操作，对将来从事中药相关领域的研究工作有一定的帮助。但是在这十多年的教学实践中，我们也发现了问题，由于该课程的实践内容全都是验证性实践，实践设计为“教师包办型”，从试剂配制到操作步骤教师都已经准备好，学生只是按照规定的步骤按部就班地做实践就行了，在这样的教学模式下学生的行为受到限制，对教师和教材依赖性强，限制了发挥学生主动思维的空间。

二、改革实践教学内容，强调综合性和连贯性

由于验证性实践限制了学生发挥主动思维的空间，因此，必须建立分子生物学实践教学创新培养新模式，从验证性实践过渡到以设计性、综合性实践为主，重点培养学生在科研中的综合思维能力及实际动手操作能力，变被动灌输为主动思考，为学生今后进实践室从事相关领域的科学研究做准备。我们在改革中强调实践的综合性和连贯性，如学习重组DNA技术时，我们安排了5个实践：重组质粒的提取，DNA的酶切，DNA凝胶电泳及片断的胶回收，外源基因的连接，重组DNA的转化、筛选及鉴定。这五个实践包括了重组DNA技术的五个核心内容“分、切、接、转、筛”。我们把这5个实践串联成一个综合实践，使其具有连贯性。每次实践结束时的样品正好是下次实践的材料，这些实践将变成一整套前后关联的有机整体，一环扣一环，只有这5个实践全部操作成功了，才能最后得到自己需要的克隆。这种综合性实践使学生在整个过程中面临着挑战，也使最终成功得到产物的学生有成就感；不仅能培养学生综合实践操作能力，还能培养学生团结协作的精神和对科学研究的兴趣。

三、开放型教学模式，提高教学质量

在传统的实践课教学中，学生除了在规定的上课时间，机械地完成规定的实践任务外，几乎没有机会进入实践室，学生的主观能动性得不到发挥。开放实践室，为学有余力的学生提供更多时间和空间显得很有必要的。但对于多数中医院校来说，由于实践室资源紧张，在开放方面一直实行得不够。这次，我们尝试对学生开放实践室，鼓励学有余力的学生进入实践室，开展相关的分子生物学实践研究，取得了一些成绩。我们首先在课堂上向学生介绍本课程组教师在课题研究中所用到分子生物学实践技术。有不少学生对教师的科研课题感兴趣，我们组织感兴趣的学生，在业余时间来课题组和教师一起进行了相关分子生物学的实践研究。通过和研究生共同实践，加强了理论课的知识。其次，我们组织学生利用所学到的分子生物学知识，以小组为单位，通过课下查阅资料，完成了科研小课题的实践设计。学生在课堂上讨论了他们设计的小课题，通过教师评价并与教师一起讨论，调动了学生的学习兴趣，激发了学生活跃的思维，通过讨论进一步修正方案，使其更加完善。同时，教师利用业余时间，组织感兴趣的学生进行了正式实践。最后，在课堂中，我们抽出15分钟，让做实践的学生讲了具体实践的体会和出现的问题，与大家分享成功的快乐和失败的经验。学生听得都非常认真，讨论得也很热烈，大家都觉得这种实践教学模式非常好，增长了很多知识，如果时间允许，希望能多些这种实践教学模式。