老顽童爷爷范文

导语：如何才能写好一篇老顽童爷爷，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

爷爷是个老顽童，长得又高又大，看上去像个“粗人”，但是做起事来却是细致入微，有一丁点儿的差错都不行。在我的心目中爷爷是那么可亲、可敬而又可爱。

记得去年国庆长假，我和爷爷、奶奶去旅游。回来的路上，我突然得了感冒，上吐下泻，当时吐得浑身尽是赃物。爷爷赶忙拿出卫生纸和衣服，小心翼翼的帮我把呕吐的赃物一点一点地擦掉，然后又给我换上干净的衣服，拿来水让我一遍一遍的漱口，嘴里还不停地说：“小乖乖，别着急，一会儿就好！”紧接着让我躺在他的腿上，轻轻地拍着我让我静静地入睡。一路上，爷爷总是用他的大手握着我热乎乎的小手。对我真是百般的呵护！回到家中，爷爷的老腿病又犯了，脚上还磨起了大血泡，他浑然不顾，拿起体温表就给我量体温，爷爷这样无微不至的关怀，我不止一次的热泪盈眶！

爷爷平时很幽默，很滑稽，也很天真，奶奶总管他叫老顽童。我也觉得爷爷这个雅号是再合适不过了。

记得有一次，我和爷爷一起看电视，正好是上演《西游记》。爷爷见屏幕上出现了孙悟空就从沙发上跳起来，抄起拖把杆，一边挥舞，一边大喊：“看俺老孙来也……”我和奶奶笑得前仰后合，我仔细一看奶奶的眼泪都笑出来了。

篇2

我的爷爷今年七十多岁，中等个子，白白的头发，最有特色的是他那又肥又大的鼻子和他那双细长的眼睛。爷爷待人和善，常和我们说笑，因此，我们几个孙子和他在一起就像朋友一样随便，光这一点我就很喜欢他了。

爷爷吃饭特别慢。餐桌上，我们都吃完半碗了，爷爷的饭还没动，我催他时，他却悠闲地喝着酒，故意眯着眼睛向我做鬼脸，并对一旁的奶奶努努嘴，意思是别让奶奶知道。一杯酒喝完了，他对奶奶嚷道：“我的杯子里怎么没酒呀？快给我倒一杯吧！”奶奶不满意爷爷光喝酒，不吃饭，于是不但没给他倒酒，反而给他换了一碗热饭。这时的爷爷像小孩似的嘟着嘴，不说话，嘴上可以挂一个油瓶了！我呢，则在一旁挤眉弄眼，笑话怕奶奶的爷爷。

平日里，如果我和哥哥们有什么好吃的，爷爷见了，总会故意摆出一副可怜兮兮的模样，张着嘴伸出手讨好地说：“给我尝尝吧？”有时我们故意逗爷爷，他就会缠着我们，我们走到哪儿，他就跟到哪儿，不分给他一点，他决不“撤兵”。给他了，他却舍不得吃，总会想办法加倍补偿给我们。

篇3

内容摘要:竞业禁止作为保护用人单位商业秘密的重要手段为越来越多的用人单位所采用。但这一制度在保护用人单位利益的同时,也在一定程度上限制了劳动者的择业自由权乃至生存权。《中华人民共和国劳动合同法》(以下简称《劳动合同法》)于2008年1月1日实施,该法首次在法律中规定了竞业禁止的内容,但这些条款过于原则,不能满足实际的需要,由此产生了大量纠纷。基于此,本文探讨了竞业禁止义务主体的规定,以及经济补偿问题,以期更全面、细致的构建竞业禁止制度,从而既保护用人单位的利益,也保护劳动者的合法权益。

关键词:劳动合同法 竞业禁止 主体 经济补偿 期限

竞业禁止又称为竞业限制和竞业避止,最早规定在民法的人制度中,作为一种法律制度,旨在用法律防止人对被人利益的侵害。竞业禁止从概念上可分为广义的竞业禁止和狭义的竞业禁止。广义的竞业禁止是指对特定的营业具有竞争性之特定行为加以禁止,而狭义的竞业禁止,则仅指对于特定营业具有特定关系的特定人之特定行为加以禁止(刘清波,1996)。我国对竞业禁止的规定主要散见于《中华人民共和国公司法》(以下简称《公司法》)、《中华人民共和国合伙企业法》、《中华人民共和国个人独资企业法》、《劳动合同法》、部门规章、地方性法规及地方政府规章中。从我国现行立法上看,竞业禁止按其效力来源可分为两类:一是法定竞业禁止,其义务的产生是由法律明确规定的,其适用主体主要是董事、高级管理人员以及合伙企业的合伙人,其与公司或合伙企业之间建立的本质仍是一种劳动法律关系。二是约定的竞业禁止,是通过劳动者与用人单位之间签订的竞业禁止协议来实现的。由此可以认为竞业禁止制度主要存在于劳动法律关系中,是调整用人单位与劳动者之间利益关系的产物(黎建飞、丁广宇,2006)。竞业禁止一方面可以遏制无序竞争,保护雇主的商业秘密,另一方面也限制了劳动者的自由择业权,甚至影响其生存权。

《劳动合同法》中竞业禁止义务主体的规定

《劳动合同法》和《公司法》分别对竞业禁止义务主体作了规定。《劳动合同法》第24条规定;“竞业限制人员限于用人单位的高级管理人员、高级技术人员和其他负有保密义务的人员”。《公司法》第149条(五)规定:“董事、高级管理人员未经股东会或者股东大会同意,不得自营或为他人经营与所任职公司同类业务”。这里需要指出,“董事、高级管理人员”根据《公司法》第217条(一)的规定,是指公司的经理、副经理、财务负责人,上市公司董事会秘书和公司章程规定的其他人员。就竞业禁止的人员限制来看,《劳动合同法》中规定的竞业禁止义务主体较《公司法》中的竞业禁止义务主体的范围广,加上了“其他负有保密义务的人员”。也就是说,用人单位除了可与本单位的“高级管理人员”“高级技术人员”签订竞业禁止协议外,还可以与“其他负有保密义务的人员”签订竞业禁止协议,而《劳动合同法》并未对“其他负有保密义务的人员”作出界定,这样在实践中容易导致竞业禁止协议的“滥用”。

以竞业禁止的方式保护商业秘密应当以了解、掌握商业秘密为前提条件,一些企业不论员工从事何种岗位、也不管员工是何种文化程度以及是否接触到商业秘密,都一律签订竞业禁止协议。更有甚者许多企业的竞业限制协议都是以“合同范本”形式出现,企业上至老总下至普通员工全都签订同一模式的合同。由于竞业禁止协议与一般的民事合同存在着实质的不同,普通员工与用人单位在签订竞业禁止协议时处于弱势地位,“订立的合同很少是协商一致的产物,而是由对方一手操纵的”(姚辉,1999)。竞业禁止在客观上限制了劳动者的择业权,使劳动者不能在自己擅长的行业工作,进而影响了劳动者的生存权。尽管用人单位为此支付了一定的对价,但该对价并不能完全弥补劳动者因竞业限制而遭受的损失,因此,《劳动合同法》应明确规定竞业限制的义务主体应是高层管理人员、高级技术人员以及可能接触到商业秘密的人员,从而避免竞业禁止协议被“滥用”。保守用人单位的商业秘密是每一个员工基于诚信原则而应承担的义务,对于虽在用人单位工作,但不掌握商业秘密的劳动者,即使其利用自身的知识为新的用人单位工作,增强了新用人单位在市场上的竞争力,也不应将其列入竞业禁止的义务主体。

在国外,承担竞业禁止义务的主体一般限于由于业务关系或者其他关系有机会接触商业秘密的人员,否则竞业禁止协议无效。如瑞士《债务法》第340条规定:竞业禁止仅对于劳务关系中知悉雇佣人之客户圈、技术秘密或交易秘密之受雇人,有拘束力。

《劳动合同法》中竞业禁止的经济补偿问题

《劳动合同法》第23条规定“用人单位与劳动者可以在劳动合同中约定保守用人单位的商业秘密和与知识产权相关的保密事项。对负有保密义务的劳动者,用人单位可以在劳动合同或者保密协议中与劳动者约定竞业限制条款,并约定在解除或者终止劳动合同后,在竞业限制期限内按月给予劳动者经济补偿。劳动者违反竞业限制约定的,应当按照约定向用人单位支付违约金。”从该条内容看,这导致实践中劳动者的权益得不到保护,司法机关面对由此而发生的劳动争议没有法律依据,导致不同地区对相同的争议采取不同的判决,加大了执法的难度。

(一)用人单位未支付竞业禁止经济补偿竞业限制是否有效

根据《劳动合同法》第23条的规定,用人单位可以与劳动者在劳动合同或者保密协议中约定竞业禁止条款,并约定在解除或者终止劳动合同后,在竞业禁止期限内按月给予劳动者经济补偿。但是,该条款既没有对用人单位给予经济补偿金的数额作出规定,也没规定如只有竞业禁止条款而没有约定给予劳动者经济补偿金或约定了经济补偿但没有按月支付给劳动者,竞业禁止条款是否有效?实践中有两种观点:其一,补偿金是竞业禁止协议生效的必要条件。该观点认为支付补偿金是单位限制劳动者就业权的对价,也是竞业禁止合同生效的要件(徐芳宁,2006)。其二,认为补偿金并非是竞业禁止条款有效性的必要条件,未按约定支付经济补偿金只能导致用人单位的违约,劳动者可请求原用人单位支付竞业限制的补偿金(张心全,2007)。由于《劳动合同法》没有对此明确的规定,导致各地在司法实践中执法不一,如上海地区在司法实践中根据本地规章《上海市劳动合同条例》若干问题的通知(二),对于用人单位未支付离职后的竞业限制补偿金的,只要雇佣双方的竞业限制约定是双方真实意思表示,且不违反法律、行政法规定的强制规定,符合一般合同的生效条件即认定竞业禁止协议生效。至于用人单位不按约定支付经济补偿,则只能将其归入违约行为,不能构成对竞业限制条款效力的否定因素。在用人单位违约的情形下,劳动者可以利用仲裁、诉讼等途径保护自己的权益,请求用人单位支付经济补偿金。没有法律层面的统一规定,造成不同地区相同案件不同的判决,导致执法的混乱。因此,《劳动合同法》应对此问题作出明确规定。

笔者认为《劳动合同法》应采用第一种观点。因为用人单位与劳动者在实力对比上,用人单位是强势,劳动者是弱势,如果用人单位与劳动者签订了竞业禁止协议,又没按法律规定和协议约定给予劳动者竞业限制补偿金,如认定竞业禁止有效,劳动者的择业权在竞业禁止期限内受到限制,否则要承担违约责任,用人单位又不给经济补偿,劳动者通过仲裁和诉讼索要经济补偿费时费力,造成生活困难,不利于对弱势群体的保护,也有悖于《劳动合同法》的社会法属性。这点可以借鉴德国的《商法》关于竞业禁止的规定:雇主与受雇人之间必须有书面协议,雇主须负补偿义务,否则该项竞业禁止条款无效。

(二)《劳动合同法》应明确竞业禁止经济补偿底线

2006年3月20日公布的《劳动合同法》(草案)征求意见稿第16条规定:用人单位在劳动合同终止或者解除时,应向劳动者支付数额不少于劳动者在该用人单位年工资收入的经济补偿。但在2008年1月1日开始实施的《劳动合同法》将此条删掉,立法者可能出于两种考虑,其一,强制规定补偿金的数额有悖于该法第3条“订立劳动合同,应当遵循合法、公平、平等自愿、协商一致、诚实信用的原则”。其二,是来自用人单位反对的呼声过于强烈。但是,去掉了补偿金数额的条款,导致现实生活中,用人单位在签订劳动合同中处于优势地位,利用劳动者迫切找到工作的心理,在竞业禁止条款上损害劳动者的利益。例如李某是某公司的员工,在与用人单位签订劳动合同时被要求签订竞业禁止协议,其中约定李某在劳动合同终止后2年内不能到与本单位生产或经营同类产品、从事同类业务的有竞争关系的其他用人单位工作,或者自己开业生产或者经营同类产品、从事同类业务。并约定竞业限制的经济补偿每月200元,劳动合同终止后的两年内劳动者需每月在用人单位发工资日去用人单位领取。这样的条款对劳动者不公平,因为劳动者不能发挥自己的特长,丧失了择业自由权,影响了其经济收入,而区区200元根本就不足以补偿其因竞业禁止而遭受的经济损失。

为了保护劳动者的利益,《劳动合同法》应当对竞业禁止经济补偿金的底线作出规定。因为《劳动合同法》属于社会法,兼有公法和私法的属性,对劳动者的倾斜保护,体现了《劳动合同法》的社会法属性。劳动合同也不同于一般的民商事合同,虽然劳动关系的当事人即用人单位与劳动者之间是平等主体的劳动合同关系,两者具有平等的法律人格,但这种平等是相对的。从总体上看,劳动者和用人单位在经济利益上不对等,这种不对等导致劳动者在签订劳动合同时不可避免的接受一些损害劳动者利益的条款。因此,《劳动合同法》应该对竞业禁止经济补偿作出一个最低限额的规定,以保护在劳动关系中处于弱势一方劳动者的权益。这点可以借鉴德国商法第74条:离职后竞业限制期间,原企业或雇主应支付补偿金,竞业限制期间每一年之补偿金,其数额不得低于劳工离职时与劳动合同所能取得报酬的一半,当事人就每一年竞业限制期间所约定数额低于5184马克者,其离职竞业限制协议无效。因此我国《劳动合同法》也应结合我国国情,对离职后竞业限制的经济补偿底线作出规定以保护劳动者的利益。同时,这样的规定在现实中还能起到遏制竞业禁止协议使用的作用。不鼓励企业大量使用竞业禁止协议,应成为《劳动合同法》关于竞业禁止规定立法的主导思想。

《劳动合同法》对竞业禁止期限应分档规定

《劳动合同法》第24条(二)规定:“在解除或者终止劳动合同后,前款规定的人员到与本单位生产或者经营同类产品、从事同类业务的有竞争关系的其他用人单位,或者自己开业生产或者经营同类产品、从事同类业务的竞业限制期限,不得超过二年”。《劳动合同法》对竞业禁止期限规定了上限,也就是用人单位与劳动者约定竞业禁止的期限自劳动者离职后最长二年的时间。该法对不同行业竞业禁止的期限统一规定了上限,这样的规定难以满足实际需要。由于各个行业不同,竞业限制不应有一刀切的统一标准。有的企业研发一项新技术或新产品需要投入大量的人力和物力,两年的时间可能还没完全投入市场,也还没有获得可观的收益,但是当初参与研发的员工离职后两年就不受竞业限制的约束,这无疑加大了原企业投资的风险,对原企业不公平,从而也挫伤了企业研发新技术和新产品的积极性,最终不利于经济的发展和社会的进步。

意大利《民法典》第2125条规定,经理级人员离职后竞业禁止协议的时间限制为5年,其他人员的限制不得超过3年;在约定期限超过上述限制规定的情况下,应当相应的削减。结合我国国情,笔者认为竞业限制的期限长短,应依据商业秘密在市场竞争中具有的竞争优势持续的时间长短来决定,而不应规定统一的上限。《劳动合同法》可以借鉴国外的立法,结合我国国情对竞业禁止期限分档作出规定。对高新技术的商业秘密竞业禁止期限的上限规定为1年,对于一般的商业秘密维持现在的上限规定2年,而对于像掌握可口可乐秘方的员工竞业禁止的期限应无上限规定。

参考文献:

1.黎建飞,丁广宇.竞业禁止义务规范研究[J].法学杂志,2006(4)

篇4

通讯作者：胡权

【摘要】 目的 探讨麝香保心丸与银杏叶片治疗老年冠心病心绞痛的疗效。方法 将120例老年冠心病心绞痛患者随机分为两组,麝香保心丸组60例,银杏叶片组60例。结果 两药均可改善冠心病心绞痛症状，总有效率分别为91.7%和90.0%，无明显差异；血脂降低总有效率分别为88.3%和91.7%，两组亦无显著差异。结论 两药治疗老年冠心病心绞痛疗效相当。

【关键词】 麝香保心丸； 银杏叶片； 老年冠心病； 心绞痛

冠心病心绞痛是由于冠状动脉粥样硬化引起管腔狭窄或由于冠状动脉痉挛导致心肌供血不足所致，临床表现为发作性胸骨后或心前区疼痛，好发于中老年人，易发展为急性心肌梗死或猝死。因此，对老年冠心病心绞痛的防治要予以高度重视。麝香保心丸和银杏叶片是目前治疗冠心病心绞痛常用中成药物，为比较两种药物的确切疗效，笔者选择了120例老年冠心病心绞痛患者，随机分为两组，进行临床疗效对比，现将观察结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 120例冠心病心绞痛老年患者均为笔者所在医院2007年1月～2009年5月住院或门诊患者。所有病例均参照WHO制定的“缺血性心脏病的命名和诊断标准”。麝香保心丸治疗组与银杏叶片治疗组各为60例。麝香保心丸治疗组中男38例，女22例，年龄60.5～85.7岁，平均64.8岁，病程0.3～13年，平均4.1年；银杏叶片治疗组中男36例，女24例，年龄61～84.6岁，平均71.2岁，病程0.2～16年，平均3.9年。两组病例资料无明显差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法 两组在治疗前均进行心电图、动态心电图、血糖、血脂及肝肾功能检测，排除急性心肌梗死、重度神经官能症、更年期综合征、心功能不全及休克等原因所致心电图缺血性改变。

麝香保心丸治疗组予麝香保心丸（上海和黄药业），每次2片，每日3次，4周为一疗程。银杏叶片治疗组予银杏叶片（江苏扬子江药业），每次2片，每日3次，4周为一疗程。

1.3 观察指标 主要观察心绞痛发作次数、疼痛持续时间、诱发因素、硝酸甘油的用量、药物起效及持续时间、心电图变化和血脂变化等。

1.4 疗效标准 参照1979年全国中西医结合治疗冠心病心绞痛及心律失常座谈会《冠心病心绞痛及心电图疗效评定标准》。显效:症状消失或显著减轻；有效:疼痛发作次数，程度及持续时间明显减轻；无效:症状基本与治疗前相同；加重:症状与治疗前相比加重。心电图：显效:心电图恢复正常或大致正常；有效:ST段回升≥0.05 mv，但未达正常水平，T波改善，由平坦转为直立；无效:治疗前后的心电图无明显改善；加重：治疗后ST段加深≥0.05 mv，T波倒置加深，由直立变平坦或倒置。血脂水平的观察按1988年卫生部调脂药物标准制定疗效。显效：TC下降≥20%，TG下降≥40%；有效：TC下降≥10%～20%，TG下降≥20%；无效：未达到有效标准；加重：TC、TG较治疗前升高。

2 结果

2.1 心绞痛疗效 麝香保心丸治疗组心绞痛疗效总有效率为91.7%，银杏叶片治疗组总有效率为90%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2 心电图疗效 麝香保心丸治疗组心电图疗效总有效率为73.3%，银杏叶片治疗组总有效率为70%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 血脂疗效 麝香保心丸治疗组血脂疗效总有效率为88.3%，银杏叶片治疗组总有效率为91.7%，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表1 两组心绞痛疗效比较（n,%）

表2 两组心电图疗效比较（n,%）

表3 两组血脂疗效比较（n,%）

3 讨论

麝香保心丸由麝香、苏合香、人参提取物、人工牛黄、肉桂、蟾酥、冰片等七味中药组成，具有芳香温通、益气强心的功效。现代中药药理学研究已证实，该药能够快速扩张冠状动脉，保护缺血心肌，预防心室重构［1］。近年来研究发现，麝香保心丸具有促进治疗性血管新生的作用，是第一个有治疗性血管新生作用的中成药。研究还发现，麝香保心丸不但有增强心肌收缩力，扩张冠状动脉，改善心肌供血和心肌代谢作用，还具有降低血液黏稠度和改善异常血液流变学指标等作用［2］。故在临床上用于治疗冠心病，尤其是心绞痛有显著疗效。

银杏叶片主要成分为银杏萜类内酯及黄酮醇苷类，药理研究证明，银杏叶及有效成分有广泛的药理作用，用于治疗冠心病时能有效扩张血管，改善微循环，改善心肌缺血，防治心肌缺血和再灌注损伤，能有效降低血脂，减少脂类在血管壁的附着，对抗脂质过氧化物而防治动脉粥样硬化［3］。近年来银杏叶片在临床广泛用于冠心病心绞痛的防治。

本研究采用随机双盲对比法，对120例老年冠心病心绞痛患者分组治疗，经统计学分析表明，两组对心绞痛、心电图及血脂的疗效均无显著差异（P＞0.05），证明两药治疗冠心病的疗效是相当的。两药均为中药制剂，尽管药理作用机制有所不同，但对冠心病心绞痛的治疗均是有效的。在临床运用中，两药均很少有不良反应发生，且价格适中，服用方便，无耐药性，患者依从性好，易于接受。因此，笔者认为麝香保心丸和银杏叶片均为治疗老年冠心病心绞痛的理想药物。但在治疗冠心病急症上，麝香保心丸可予舌下含服，起效快，优于银杏叶片。

参 考 文 献

［1］ 王受益，戴瑞鸿，金椿，等.麝香保心丸治疗冠心病心绞痛的临床观察.中国中西结合杂志,1996,16（12）:717-720.

［2］ 夏玲宁.麝香保心丸治疗冠心病心绞痛45例临床观察.现代中西医结合杂志,2000,9:482-483.

篇5

正在这时，老顽童爷爷走了进来，他认真地问小海归：“听说你们能听到千里之外的声音，那你们能听到黑煞在说些什么吗？”

“能！”他们说：“让我们仔细地听一听，黑煞说他们要用垃圾做成垃圾炸弹投向快乐星球，让我们的星球变成垃圾世界！这样一来宇宙就成了他的地盘了，他要统治宇宙！’”

“好，太好了，让我们来启动一号防御系统，让他们自己炸自己！自食其果。”老顽童爷爷兴奋地说。

正在这时垃圾炸弹飞了过来，就在快要到达快乐星球千钧一发的时候，老顽童爷爷启动了一号防御系统，棒棒用隐身仪指了炸弹一下，垃圾炸弹就一下子被隐身并返回了黑暗星球。

那么隐身仪是什么东西呢？

它是棒棒前不久发明的，只要是被它隐身的东西，哪怕用再高级的探测器搜索，也是无济于事。

黑煞以为快乐星球已经下起了垃圾雨，乐得手舞足蹈，高兴得跳起舞来。正在这时垃圾雨下还是下了，可是地点却是在黑暗星球上。黑煞火冒三丈，恨不得马上就杀了老顽童，可他哪里知道是小海归们的耳朵立了大功呢？

篇6

防火墙进来时，电脑病毒越来越强烈，电脑已经处于瘫痪状态，防火墙也没办法，只好去叫老顽童爷爷来帮忙，他打电话给老顽童爷爷：“老顽童爷爷，电脑出现病毒啦！而且病毒很厉害，请您快来帮帮忙！”

“那好，我马上就来。”说着，老顽童爷爷就来到了防火墙实验室，一看病毒，是一种从未出现过的新型病毒，在仔细确认后就知道是黑煞传进来的，说着立刻命令艾克启动三号防御系统，把网络进行病毒冲洗，使病毒在被消灭的同时对他的产生地—黑暗星球，进行了病毒的反传播。

果然不一会儿，在黑暗星球的总控制台也出现了病毒 ，黑煞又被气得半死，大叫：“你这个老顽童，竟敢拿我发给你的病毒进行反传播，好，等我统治了宇宙，我就要把你抛进一号黑洞，哈哈哈哈，哈哈哈哈……”又对着他的手下大吼：“你们这群废物，还不赶快杀毒。”

这时候，快乐星球上已经恢复了平静，又是一片欢声笑语了，真不愧是快乐星球呀。

篇7

“防火墙，你来这里干什么？”五兄弟好奇地问。防火墙说：“老顽童爷爷用能源探测器探测到火星有很多的能源，要你们去一趟火星，找到能源。”

“是，长官！”五弟调皮地说。

“我饿！”大哥说。

防火墙忍不住笑了出来，说：“我们先回快乐星球吧！”说着，驾驶着飞船，带着大家回到了快乐星球。

老顽童爷爷见到他们平安归来，高兴极了，问他们，“企鹅得救了吗？”“Yes!Sir！”五弟一本正经地举起右手行了个礼。“太好了，来来来，爷爷请你们吃快乐星球大餐，怎么样？”吃吃立刻口水直流三千尺，连声叫：“太棒了！太棒了！”

老顽童爷爷带着大家边说边笑的来到了快乐星球旋转餐厅，他们点了满满一桌子的菜，有吃吃爱吃的红烧蹄膀，有玩玩爱吃的油焖大虾，有洗洗爱吃的炒三鲜，有打打爱吃的清蒸大黄鱼，喝喝说：“我要一大瓶可乐。”

看着大家吃得高兴，老顽童爷爷也很高兴，他说：“大家一定要吃饱喝足。明天休息一天，后天出发去火星。好吗？”

篇8

节俭朴素，人之美德。

——题记

在一个古朴的小镇上，人们过着无忧无虑的日子，他们团结合作，互相帮助，更可贵的是他们特别节俭，所以他们越来越富裕，越来越幸福。

这时候，有一个人的受不了了，他开始策划一次行动。

镇上小学放学了，放学后，三个小孩子在亭子里嬉戏，当他们玩得正开心的时候，突然“咕—咕”的声音从他们的鞋子里传出，喔！原来是那个最大的孩子的肚子在叫，他想：我的肚子一定是饿了吧！后来，他们三人兴高采烈地跑到一个小饭店吃了起来，店老板想借比机会害这三个小朋友，于是，他在菜里面下了一种药，然后给他们吃，这三个小孩子见了这些美食，顿时胃口大开。不一会儿，他们三个人受到了控制，开始浪费粮食，搞得小镇上浑浊不堪，一片，有几次，小镇上还发生了火灾呢！经过这些事，有的人忐忑不安，有的人赶紧带着小孩和老人逃跑，还有的人天天在家里呆着，不敢出门！

店老板看到这些，高兴得快笑破了肚皮，好像这里的人痛苦就是他的快乐。那么，这个可恶的店老板是谁呢？为了捍卫人们的劳动果实，为了使人们的生活回到往日的宁静，镇上的权威W博士开始四处寻找资料——

W博士在老顽童爷爷那儿得知，店老板叫明乐，今年37岁，他是浪费大王，原来的他热心助人，天天都面带微笑，可是，可恶的A博士把他变成了一个可恶的浪费大王，这个坏蛋就是今天在这里的店老板。

W博士听了这些，立马向老顽童爷爷说再见。

W博士准备上飞马时，听到一种叫声，这是，W博士把飞马放在一个车库里，然后，向那种声音走了过去。“老顽童—”W博士看了老顽童爷爷大叫，突然，浪费大王把W博士也抓了起来，关进了密室里，W博士小声地对浪费大王说：“明乐，你如果再这样下去，世界将会灭亡！”“对的，如果，如果再这样，你不为别人想，也要为自己想啊！”老顽童爷爷也吆喝起来。“唰——”明乐慢慢地抬起头来，这句话让明乐像被电打了一般，让明乐清醒了，明乐把老顽童爷爷、W博士、三个小孩子给放了，支支吾吾地对他们说：“对——对不起！”他们几个人听了，异口同声地说：“没关系。”于是，明乐请他们到他家享受美食呢！

六个人手挽手，高兴地离开了这人死气沉沉的城堡，并且，让大自然恢复了往日的美丽。

……

篇9

1引言

引起过敏的物质称为过敏原，一般为蛋白质类物质。随着食物过敏患者的增多，以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果，已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法，包括核酸法（PCR）和酶联免疫法（ELISA）等。新兴的质谱法（MS）灵敏度高、假阳性概率低，并具有方法开发快速、运行成本低等优势。

葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质，使酒液获得长期稳定性。酪蛋白是常用的澄清剂之一。酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原，残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。但是葡萄酒，特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质，单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用，有很强的蛋白结合能力。单宁常用作酶抑制剂使酶失活。单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解，传统蛋白提取方法（超滤、透析、有机溶剂沉淀等）用于葡萄酒时回收率只有20%-30%[1，2]。因此，关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少，研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒，对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略[3，4]。已报道的方法如十二烷基硫酸钾（KDS）法、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）法等，提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质，工作量大，分析通量低，蛋白质的回收率很低[5，6]。

交联聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）是PVP交联后形成的颗粒（约110 μm），具有很强的吸附能力[7]。PVPP竞争性地与单宁结合，释放蛋白，可以有效去除单宁等多酚类物质[8，9]。本研究利用PVPP建立了快速、高效的红葡萄酒蛋白提取与酶解方法，使前处理时间缩短到2 h之内，回收率达到80%以上。将本方法与三重四极杆液相色谱串联质谱联用（LCMS/MS）结合，分析了红酒中3种亚型的酪蛋白，检出限达到10 μg/L，比目前报道的方法提高了至少一个数量级[3]。

2实验部分

2.1仪器与试剂

TSQ Vantage三重四极杆质谱、Ultimate 3000超高效液相色谱（Thermo公司）。α酪蛋白（αCasein）、β酪蛋白（βCasein）、胰蛋白酶（Trypsin）、PVPP、NH4HCO3购自SigmaAldrich公司；乙腈、甲酸购自Fisher公司；红葡萄酒商品若干。

2.2蛋白提取与酶解

样品制备：取红酒200 μL与酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 μg/L）充分混匀后（添加量为100 μg/L时），加入200 μL PVPP混悬液（100 g/L，溶于0.5 mol/L NH4HCO3溶液），并于30 ℃振荡反应15 min。反应后，直接加入2 μL Trypsin （200 μg/L），并于37 ℃振荡酶解1.5 h。

酶解完成后，于20000 g离心5 min，取上清液。沉淀加入100 μL水，振荡超声2 min，再于20000 g下离心5 min，将溶液完全取出。两次溶液合并后，再次20000 g离心，取上清液直接进样分析。

对照品制备：第一步不加酪蛋白，前处理完成后、进样前，再加入Trypsin酶解后的酪蛋白混合溶液4 μL（α酪蛋白、β酪蛋白各5 mg/L ，添加量为100 μg/L）， 混匀后直接进样分析。

2.3LCMS/MS分析

第10期张 伟等： 交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液相色谱串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原

2.4数据处理

酪蛋白亚型序列来自SwissProt数据库； 专一性肽段与特征性碎片选择及碰撞能量优化由PinPoint软件（Thermo）分析，结合LTQOrbitrap 高分辨质谱（Thermo）全扫描确证获得； 质谱数据由Xcalibur Qual Browser软件（Thermo）进行定性分析，由Xcalibur Quan Browser软件（Thermo）进行定量分析。

3结果与讨论

3.1酪蛋白LCMS/MS方法建立

酪蛋白有α和β两种主要亚型，其中α包含S1和S2两种亚型。由于αS1， αS2和β三者序列完全不同，并同时具有致敏性，因此同时针对这3种酪蛋白建立LCMS/MS分析方法。根据Pinpoint软件分析，从3种酪蛋白中分别选择两条特征性肽段，每条特征性肽段分别选择两个子离子，即每种亚型对应4对离子对，并获得相应的优化碰撞能量（表1）。为了确定离子对选择的准确性，进一步通过LTQOrbitrap高分辨质谱对酪蛋白酶解产物进行了数据依赖性扫描分析，验证了离子对选择的合理性（图1）。

Fig.2SRM total ion chromatogram and extracted ion chromatogram of casein unique peptides[HT5][TS）]

比PCR和ELISA检测，LCMS/MS不仅能直接对目标过敏原进行鉴定，还可以同时分析不同亚型，方法的选择性、准确度、通量均有很大提高。

3.2红葡萄酒快速前处理

利用PVPP实现了红葡萄酒高效、快速前处理，并最大程度地降低了蛋白的损失。向红酒中加入足量的PVPP竞争性吸附单宁，再加入过量的Trypsin快速酶解蛋白，离心取上清液，并重复一次，合并两次上清液后直接进行质谱分析（图3）。与传统方法相比，PVPP法不仅使回收率明显提高，也使前处理时间由12 h（过夜酶解）缩短到2 h之内。

值得注意的是，PVPP添加量与处理效果并不完全成正比，当超过最优添加量时，质谱响应反而下降，处理效果变差。这可能与PVPP的比表面积和吸附力有关：达到最优添加量之前，PVPP在红酒中均匀分散成小颗粒，比表面积大、吸附力强，有利于酚类物质吸附；当添加量超过最优值后，PVPP颗粒之间快速团聚形成沉淀，吸附能力下降，同时蛋白也随酚类物质掺杂在沉淀中，难以有效释放。因此，合适的PVPP添加量对前处理非常重要。

考察了PVPP法的基质效应，200 μL红酒经PVPP处理并添加酪蛋白（1 mg/L ）后质谱分析，并与等量经PVPP处理的空白红酒基质进行比较。结果表明（图5），基质对肽段的质谱响应影响不大（峰面积差异小），空白基质未见特征肽段的质谱响应。证明基质效应对检测无影响，前处理方法可靠、有效。

效解决了这一难题。

在低浓度下，PVPP法同样能达到较高回收率。如表2所示，在0.1 mg/L 酪蛋白（100 μg/L）添加量下，特征性肽段的回收率均可达到75%以上，肽段ALNEINQFYQK由于响应太低，无法准确计算回收率。

考察了0.1 mg/L 酪蛋白在4种不同品牌红酒中的回收率。如表3所示，特征性肽段的回收率均保持在64%-150%之间，进一步证明了PVPP用于红酒酪蛋白快速前处理方法高效、可行。

根据α酪蛋白中αS1和αS2所占比例计算，最终确定6条肽段的定量限在10-100 μg/L之间，对应到αS1， αS2和β酪蛋白的定量限分别为40， 40和10 μg/L（表4），比文献[3] 报道方法提高约一个数量级。此外，在10 μg/L浓度下，所有肽段均有响应（信噪比>3）， 因此αS1， αS2， β酪蛋白的检测限均在10 μg/L以下，同样比文献[3]报道方法提高约一个数量级。

4结论

通过PVPP快速前处理，使红酒中酪蛋白回收率提高到80%以上，使整个前处理时间缩短到2 h之内，有效解决了红酒中大量单宁对蛋白提取与酶解的抑制。将PVPP法与三重四极杆液相色谱质谱结合，分析了红酒中3种亚型的酪蛋白αS1， αS2， β的过敏原，检测限均低至10 μg/L，定量限达10-40 μg/L，同时结果具有良好的重现性。PVPP前处理方法简单有效、重现性好，适用于高通量的红葡萄酒过敏原检测。

Reference

1Oh H I， Hoff J E， Armstrong G S， Haff L A. J. Agric. Food Chem.， 1980， 28（2）： 394-398

2Goncalves R， Mateus N， Pianet I， Laguerre M， de Freitas V. Langmuir， 2011， 27（21）： 13122-13129

3Monaci L， Losito I， Palmisano F， Godula M， Visconti A. Food Addit. Contam.， 2011， 28（10）： 1304-1314

4Monaci L， Losito I， Palmisano F， Visconti A. J. AOAC Int.， 2011， 94（4）： 1034-1042

5Vincenzi S， Mosconi S， Zoccatelli G， Dalla Pellegrina C， Veneri G， Chignola R， Peruffo A， Curioni A， Rizzi C. Am. J. Enol. Vitic.， 2005， 56（2）： 182-187

6Wigand P， Tenzer S， Schild H， Decker H. J. Agric. Food Chem.， 2009， 57（10）： 4328-4333

7LI XinMing， CUI YingDe， LIAO LieWen. Food Sci.， 2002， 23（8）： 74-76

黎新明， 崔英德， 廖列文. 食品科学， 2002， 23（8）： 74-76

篇10

一星期后……

返校了，同学们都期待自己的成绩好一点，这时，欧阳老师让杨阳来发试卷，发完试卷后，杨阳对老师说还有两份卷子，欧阳老师看同学们都来了，没有没来的人。这两份卷子，一份三张，张张都是满分。这是欧阳老师看一下姓名，上面的名字就是刚转走的学生：艾克、艾雪。

在快乐星球上，艾克和艾雪也是每天无所事事。根本没有小孩子的快乐。回来一个星期了，照艾克的性格，他一定会搞发明的。可现在，根本没摸实验器材。艾雪拿着一张全班合影，眼泪一滴一滴的流，没有唱一首歌（在我的文中，艾雪除了是艾克的助手还是快乐星球的一名歌手）。笨笨聪聪看着两个人失魂落魄的样子，心中很不好受，于是就问他们为什么这样。可是两人谁也说不清。似乎这是一个不能解开的迷，于是，他们去找了老顽童爷爷。