春天的谚语范文

导语：如何才能写好一篇春天的谚语，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

【春天的谚语】

立春

在笑嘻嘻的雪人后面，淘气地躲着。

在火辣辣的爆竹声里，开心地笑着。

在红彤彤的春联上荡啊荡啊荡起了秋千。

到处疯跑的小孩子，忽然累了

厚厚的棉衣里沁出细细的汗

雨水

从雨水联想到的，是些多么美丽的汉字啊。

沐浴。清新。温泽。滋润。洁净。

淋了山野，湿了树林

汇入清溪，渗进土地

涤去春闺轻愁，洗尽游子的风尘

惊蛰

嬉戏的孩子在倾听

忙碌的大人在倾听

花儿在倾听，草也在听

这第一声雷

熟睡着的小虫子一下被惊醒

广袤的土地上蓦然探出

无数枝 敏感的触角

春分

白天与黑夜一样长

诗歌与春天一样长

春到桥头荠菜花

红杏枝头春意闹

春*满园关也关不住啊，

红的是樱桃 绿的是芭蕉

清明

所有该在春天唱歌的花都开了

所有该在春天跳舞的树都绿了

所有该在春天记起的人 都在心里一遍遍温习了

清明 有多绵绵密密的雨

就有多么绵绵密密的忧伤与思念啊

谷雨

是俗谚里最厚重的一页春天

是田野里最喧闹的一节春天

偏以这样浓艳的语言说再见

篇2

春雨贵如油

春无三日晴

立春赶春气

早春晚播田

春风如醇酒，著物物不知

春天孩儿面，一日三变脸

立春打雷，十处猪栏九处空

不知细对谁裁出，二月春风似剪刀

一年之计在于春，一日之计在于晨。

南园桃李花落尽，春风寂寞摇空枝

天街小雨润如酥，草色遥看近却无

芳树无人花自落，春山一路鸟空啼

二月风光浓似酒，小楼新湿青红

侵陵雪色还萱草，漏泄春光有柳条

江浦雷声喧昨夜，春城而色动微寒

侵陵雪色还萱草，漏泄春光有柳条

有时三点两点雨，到处十枝五枝花

恰似春风相欺得，夜来吹折数枝花

篇3

1、春风不刮，草芽不发。

2、一年四季春为首。

3、立春之日雨淋淋，阴阴湿湿到清明

4、雷打立春节，惊蛰雨不歇。

5、春天人们起得早，秋后人马吃得饱。

6、肥不过春雨，苦不过秋霜。

7、春天孩子面，一日三变脸。

8、立春打雷，十处猪栏九处空。

9、季节不等人，春日胜黄金。

10、立春赶春气。

11、雨淋春牛头，七七四十九天愁。

篇4

2、立春晴，雨水均。

3、立春晴一日，耕田不费力。

4、水淋春牛头，农夫百日忧。

5、春天孩子面，一日三变脸。

6、立春打了霜，当春会烂秧。

7、立春天气晴，百事好收成

8、立春之日雨淋淋，阴阴湿湿到清明。

9、春天人们起得早，秋后人马吃得饱。

10、肥不过春雨，苦不过秋霜。

11、初一如下雨，初二则会放晴，初三若下雨则会落到十五。难估计。

12、立春赶春气。

13、雷打立春节，惊蛰雨不歇。

14、立春天气晴，百事好收成。

15、立春打雷，十处猪栏九处空。

16、雨浇上元灯，日晒清明日：上元日下雨，清明定放晴。

17、春风不刮，草芽不发。

篇5

The beginning of spring rain, rainwater

2、立春晴一日，耕田不费力

The beginning of spring sunny day, and effortless

3、立春之日雨淋淋，阴阴湿湿到清明

The beginning of spring, rain, cloudy and wet to the tomb

4、雨淋春牛头，七七四十九天愁。

The rain spring Ngau Tau, seven seven forty-nine days of sorrow.

5、水淋春牛头，农夫百日忧

The water spring, the hundred days of sorrow

6、立春打了霜，当春会烂秧

The beginning of spring to frost, when the spring seedling rot

7、雷打立春节，惊蛰雨不歇。

Thunder made the Spring Festival, the rain did not stop the awakening of insects.

8、腊月立春春水早，正月立春春水迟。

Twelfth lunar month of lunar January Chunshui early spring, late spring.

9、年逢双春雨水多，年逢双春好种田。

Years to meet the double spring water, years to meet the double spring good farm.

10、雨水连绵是丰年，农民不用力耕田

Rain is harvest, farmers do not forcibly plow

11、立春赶春气：立春之后万象回春，稻田、池塘等水面开始蒸发，明示世人春天已降临。

The beginning of spring to spring: spring after Reviver, paddy fields, ponds and other water evaporates, express the world spring has come.

12、初一落初二散，初三落月半：初一如下雨，初二则会放晴，初三若下雨则会落到十五。难估计。

The first fall two powder, the third fall half: first day such as rain, the second is cleared, the third if rain will fall fifteen. Difficult to estimate.

13、雨浇上元灯，日晒清明日：上元日下雨，清明定放晴

The rain poured lantern lights, sun Tomb Sweeping Day: Shangyuan day rain, Qingming will clear up

14、早春晚播田：立春日如在上年十二月内谓之早春，若播种莫过早也不过迟，按季节行事。

Da: early spring day such as early spring in December last year in that, if not early than late sowing, according to season.

篇6

1、春阴垂野草青青，时有幽花一树明。晚泊孤舟古祠下，满川风雨看潮生。宋苏舜钦《淮中晚泊犊头》

2、春在乱花深处鸟声中。宋陈亮《南歌子》

3、道由白云尽，春与青溪长。唐 刘虚《阙题》

4、等闲识得东风面，万紫千红总是春。宋朱熹《春日》

5、东风洒雨露，会人天地春。唐 李白《送祁昂滴巴中》

6、东风随春归，发我枝上花。唐 李白《落日忆山中》

7、二月湖水清，家家春鸟鸣。唐 盂浩然《春中喜王九相寻》

8、春日迟迟，卉木萋萋。仓庚喈喈，采蘩祁祁。《诗经小雅出车》

9、碧玉妆成一树高，万条垂下绿丝线。不知细对谁裁出，二月春风似剪刀。唐 贺知章《咏柳》

10、池塘生春草，园柳变鸣禽。南朝宋 谢灵运《登池上楼》

11、春草如有情，山中尚含绿。唐 李白《金门答苏秀才》

12、春风如醇酒，著物物不知。宋程致道《过红梅阁一首》

13、春来——爆竹声中一岁除，春风送暖入屠苏。

14、春雨——小楼一夜听春雨，深巷明朝卖杏花。

15、春花——惆怅东栏一株雪，人生看得几清明。

16、春夜——更深月夜半人家，北斗阑干南斗斜。

17、春水——春水碧于天，画船听雨眠。

18、恼人天气又春阴。 ——宋·晏殊

19、料峭春风吹酒醒，微冷，山头斜照却相迎。 ——宋·苏轼

20、东风有信无人见，露微意，柳际花边。——宋·苏轼

21、乍暖还寒时候，最难将息。 ——宋·李清照

22、洛阳城里又东风，未必桃花得似旧时红。 ——宋·陈与义

23、东风知我欲山，吹断檐间积雨声。

24、春心莫共花争发，一寸相思一寸灰。

25、春风——春风又绿江南岸，明月何时照我还。

26、春光——等闲识得东风面，万紫千红总是春。

27、春景——试上超然台上看，半壕春水一城花。

28、春游——东风知我欲山，吹断檐间积雨声。

29、春思——春心莫共花争发，一寸相思一寸灰。

30、春寂——春潮带雨晚来急，野渡无人舟自横。

31、春愁—问君能有几多愁，恰似一江春水向东流

32、池塘生春草，园柳变鸣禽。 ——南朝宋谢灵运

33、城上风光莺语乱，城下烟波春拍岸。 ——宋·钱惟演

34、落尽梨花春又了，满地残阳，翠色和烟老。 ——宋·梅尧臣

35、雪消门外千山绿，花发江边二月晴。 ——宋·欧阳修

36、寒雪梅中尽，春风柳上归。唐 李白《宫中行乐词八首》

37、寄语洛城风日道，明年春色倍还人。唐 杜审言《春日京中有怀》

38、林花扫更落，径草踏还生。唐 孟浩然《春中喜王九相寻》

39、满眼不堪三月喜，举头已觉千山绿。宋辛弃疾《满江红》

40、时有落花至，远随流水香。唐 刘虚《阙题》

41、时在中春，阳和方起。《史记秦始皇本纪》

42、闻道春还未相识，走傍寒梅访消息。唐 李白《早春寄王汉阳》

43、咸阳二三月，宫柳黄金枝。唐 李白《古风》

44、喧鸟覆春洲，杂英满芳甸。南朝梁 谢眺《晚登三山还望京邑》

45、燕燕飞来，问春何在，唯有池塘自碧。宋姜夔《淡黄柳》

46、阳春白日风在香。晋 乐府古辞《晋白绮舞歌诗三首》

47、阳春布德泽，万物生光辉。 汉乐府古辞《长歌行》

48、阳春二三月，草与水同色。晋 乐府古辞《盂珠》

49、云霞出海曙，梅柳渡江春。淑气催黄鸟，晴光转绿苹。唐 杜审言《和晋陵陆丞早春游望》

50、——枕上片时中，行尽江南数千里。

51、春恨——人生自是有情痴，此恨不关风和月。

52、春归——落红不是无情物，化作春泥更护花。

53、春事到清明，十分花柳。唤得笙歌劝君酒。酒如春好，春色年年如旧。宋辛弃疾《感皇恩为范寿》

54、春晚绿野秀，岩高白云屯。南朝宋 谢灵运《入彭蠡湖口》

55、飞雪伴春还，善庭晓自闲。唐 刘虚《积雪为小山》

56、过春风十里，尽荠麦青青。宋姜夔《扬州慢》

57、芳菲消息到，杏梢红。——宋·贺铸

58、午睡渐多浓似酒，韶华已入东君手。—— 宋·周邦彦

59、枕上片时中，行尽江南数千里。

60、人生自是有情痴，此恨不关风和月。

61、春潮带雨晚来急，野渡无人舟自横。

62、问君能有几多愁，恰似一江春水向东流。

篇7

关于春天的演讲稿大全

春天，万物复苏，冰雪融化。小河又在奔跑，一边跑一边在唱着欢快的歌呢!看，它跑到田野去，让麦子喝够了水;流到树林里去，让树儿长得更加茂盛;奔到草地边，让小草长得更加绿。小鱼在清澈见底的小河里自由自在地玩耍。太阳下，水面波光粼粼，水里的一颗颗鹅卵石，如同一颗颗闪耀着耀眼的光芒的宝石，美丽极了。小河边的棵棵柳树，长出了嫩嫩的绿芽。摇一摇小柳树，飘下了纷纷扬扬的“雪花”，如同又回到了银色的冬天。风儿吹过，一条条柳枝如同春姑娘那细细的头发，在风中跳起了优美的舞蹈，舞姿婀娜多姿，美极了!那棵棵柳树倒映在水中，好像那树是从水中长出来的。

春天，田野里，农民伯伯播种下新的希望，希望今年有好的收获。

草地上，一只只风筝上的老鹰，不知被谁施了魔法，竟然飞上了天，翱翔在宽阔的天空里。一只只风筝飞上了天，有的飞得很高，有的飞不起来。

下面，人们坐在绿油油的草地上，有的在讲笑话;有的在打扑克;有的在踢足球……

春天，花园里的鲜花百花齐放，有红的、黄的、蓝的、白的……数也数不清，真是五颜六色。鲜花的颜色招来了许多蜜蜂、蝴蝶，让小花变得更加美丽。

如果人人都不乱扔垃圾，那我们春天的花园将变得更加美丽，更加美好。

美丽的春天，I Love you!

关于春天的演讲稿大全

各位老师各位同学：

大家好!在这明媚的春光里，衷心祝愿大家都能播种下新的希望、新的梦想!是的，春天是个播种的季节，是个希望的季节，是个醉人的季节!当春带着她特有的新绿，海一样地漫来时，真能让人心醉;

当春携着她特有的温煦，潮一样地涌来时，也能让人断魂。

春，绝对是一桢浸染着生命之色的画布。

新绿、嫩绿、鲜绿、翠绿，满眼的绿色呀，温柔着我们的视线。还有那星星般闪动的一点点红、一点点黄、一点点粉、一点点紫呀，也惊喜着我们的目光。

于是，开始在春天漫步。

踩在她松软的泥土上，才知道生命的温床可以如此地平实。只要季节的老人飘然而至，所有沉睡的种子，都可以在这里孕育，并赋予生命一种变换的姿态。

春，绝对是一幅饱蘸着生命繁华的画卷。

无论是破土而出的，还是含苞待放的;无论是慢慢舒展的，还是缓缓流淌的;也无论是悄无声息的，还是莺莺絮语的，只要季节老人把春的帷幕拉开，他们就会用自己独特的方式，在这里汇演自然那神奇的活力。

于是，开始在春天漫游。

披着柔媚的春光，让略带甜意的风，从身边掠过。就会领悟到春的气息里，其实包含着一种最令人感动的柔情。也会觉得大自然就是一位奇特的母亲，她竟选择在万物萧条的冬的尽头，将千姿百态的生命孕育而出，让它们踏着那最为柔媚的第一缕春光，相拥而至，把无限的生机带给人世。

春，也是一拱彰显着生命神奇的画廊。

你看，每一种生命都有自己特定的形态，而每一种特定的形态，都包含着特定的生命信息。无论是高大的，还是弱小的，都要经历着有生也有死的历程，也都有稚气和成熟的时节。无论是引人注目的，还是平淡无奇的，都要沿着那特定的时令轨迹，在自己特定的生存空间里，完成一段生命的壮举。也无论是否有名有分，无论是生在富饶的家园，还是长在贫瘠的沙土，所有所有的、所有的在春天萌生的万物呀，都用自己独特的方式，用尽全部的热情，谱出一曲生命的颂歌。

这就是春，因着萌生在这里的生命的齐奏，让我真真切切感受到一种神奇的美丽。

谢谢大家!

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春天在哪里呀?春天在哪里?春天在那翠绿的山林里……”我们唱着歌儿去外面找春天。

到了蟒河边，哇，河边垂柳的枝条更长了、更绿了，真是“碧玉妆成一树高，万条垂下绿丝绦。”呀!风一吹，绿绿的枝条飘过来又飘过去，像春姑娘的头发在写字，告诉我们：春天已经来到了!

河边的小草发芽了，还有许多五颜六色的花儿：有红的、有白的、有黄的、有粉的、还有一

些蓝的，美丽的蝴蝶在花丛中飞来飞去!妈妈告诉我：黄的是迎春花和油菜花、粉的是桃花、红的是海棠花、白的是梨花，不知道名字的蓝色的小花儿在草地上像星星一样，好漂亮啊!

你们看!春风吹到河面上，河面好像有许多皱纹!几只小鸭子在鸭妈妈的带领下，“嘎嘎”地唱着歌，在河里游来游去，真开心呀!

春天多美啊!

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一脚踏进公园的北门，就被里面迎面扑来的花香所陶醉，跟随着小鸟叽叽喳喳的叫声，不知不觉地来到了一片绿色的世界里，眼睛已经被绿色蒙住了双眼，都睁不开啦，我深深吸了口气，啊!好清新!来到小鸟旁边，发现好多老爷爷坐在鸟笼旁边，多像一幅美丽的画卷。

院里的花大都竞相开放，红的，粉的，白的，只有花中之王牡丹静待开放，我会静静地等你开放，下次在来看你的，牡丹!前来散步的阿姨都被这一片春光吸引的赞不绝口，还回想着去年牡丹开放的景象，我也不知不觉地想起去年去洛阳看牡丹了，今年就不用千里迢迢地跑到洛阳了，因为戚城公园满园的春*已经把我深深地陶醉了!平日生活在人潮汹涌的都市，没想到这里还有一个世外桃源!

平时懒得活动的我今天看见这绿色我也好好养养眼，不一会儿就逛完了一大圈，虽然有点累，但是心里很是愉快!俏皮的春姑娘总是把自己打扮的花枝招展，在人们面前炫耀着!

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春姑娘那沙沙的脚步声近了!那无际明媚的春*把大自然装扮的更加娇娆。

你看，小草不知什么时候偷偷的从土里钻出来，挺胸抬头探望着这一片稀奇的世界。它在春风的吹拂下轻盈舞动，似摆动的绿绒毯。

河边的柳枝也悄悄的伸进解冰的小河里，好似在跟小河亲切的言好、在和小河议论春*。微风吹来，映在水里的青山绿树，一会儿扩大，一会儿缩小，一会儿聚拢，一会儿散开，美丽极了。

春天的阳光更是暖洋洋得照在人们的脸上，使人陶醉。春天的阳光像一个温热的火炉，散发着春的光芒;照在绿色的大地上，金光粼粼。

春天的白云也格外多姿，像奔腾的小马，像翻滚的浪花，又像春姑娘白净的脸，使人们感到精神舒爽，感到心旷神怡。

篇8

教材：

活动目标：

1.理解诗歌的内容，引导幼儿感受诗歌的美好意境，初步了解诗歌的结构特点。

3.有感情的朗诵散文诗，感受春天的美好。

一、经验准备

二、物质准备

（二）钢琴协奏曲《春》。

三、说教学法

（二）练习法：朗诵环节所设计的采用多种形式进行朗诵练习，能够使幼儿体验朗诵的乐趣、感受诗歌的意境，还突出了本次活动的重点。

活动过程：

引导幼儿运用已有经验描述春天的美丽景色。

（环节简析：教师将幼儿的描述用散文诗的句式进行提炼，使幼儿自然产生一种成就感，提高幼儿的学习兴趣，对诗歌有一个最初的感受，更为顺利过渡到下一环节做了铺垫 。）

（一）欣赏

教师：小朋友，老师看到的春天像一本书。我们来听一听春天是一本什么样的书？教师播放轻柔舒缓的音乐，有感情的朗诵诗歌。

教师：小朋友，这一遍我们仔细听一听彩色的书里有什么？会笑的书里有什么？会唱歌的书里有什么？

（二）分段理解诗歌内容，把握诗歌中的重难点部分

教师：请小朋友说一说，诗歌里为什么说春天是一本彩色的书呢？我会引导幼儿通过观察图片，来发现春天的色彩，从而理解此句诗文的含义。

教师：春天还是一本会笑的书呢。小池塘笑的时候出现了酒窝，它的酒窝是怎么来的呢？（这是一个重点的部分，小朋友可能会回答不出来，这时我会引导幼儿运用已有的生活经验，回忆出风吹池塘水时出现的涟漪、石子投进水里时出现的涟漪等现象，帮助幼儿理解“小池塘的酒窝”是怎样形成的。）

教师：在最后一本会唱歌的书里，是谁在唱？它们是怎样唱的？（这部分的学习理解主要突出四个象声词的引领，从而使幼儿理解诗文的含义。）

（三）朗诵

教师：请小朋友看着小图书自己朗读，先说诗歌的名字再朗诵诗歌。

（环节简析：本环节采用了两个有效策略，一是边看小图边朗读，二是采用多种形式练习朗读。不同的朗诵形式激发幼儿朗诵的热情，避免了乏味练习。）

（一）讨论

教师：春天还会是一本什么样的书？

（二）创编

教师：老师相 信，小朋友们能够自己说出春天是一本什么样的书、书里都有什么。

附：

春天是一本彩色的书，

红的桃花，

白的梨花；

小池塘笑了，

小朋友笑了，

春天是一本会唱歌的书，

春雨滴滴答，

青蛙呱呱呱。

本次活动，通过活动前带幼儿到户外观察感知春天的主要特征，活动中听、说、看、仿编等多种途径，使幼儿很好地理解诗歌，充分体会、感受诗歌的意境，激发幼儿对散文诗的喜爱，提高幼儿的朗诵、仿编等文学素养。同时，还能积累更多有关春天的生活经验和知识经验。

当幼儿对散文诗的学习、理解和体验达到一定程度时，教师进一步创设机会，提出发散性问题，让幼儿扩展自己的想象，创造性地运用语言去表达自己的认识和想法，对作品进行仿编。幼儿在仿编中通过对原作品结构的模仿、语言的运用、意韵的揣摩，能够达到一种创造性、深层次的学习。

研讨小组意见：

篇9

老师们，同学们：

早上好！今天我国旗下讲话的题目是：与春天相约 与文明同行。

现在，又到了桃红柳绿，春暖花开的季节。当你走出户外，看到路边的花儿在一场春雨过后悄然绽放；当你放眼望去，路上行人的衣衫一天比一天薄了；抬头看，天空中不时飞过一只又一只小鸟……是啊，春风拂面，令人不由得心中涌动起这样一种渴望：让我们踏青去吧。

春天，繁华似锦；春天，水绿山青；春天，洋溢着诗情画意。画家描绘她，诗人歌唱她。踏着诗人的足迹，我们将要走向自然，去看“黄四娘家花满蹊，千朵万朵压枝低”，去看“留连戏蝶”，去看“自在娇莺”。去感受那“满园春*关不住，一枝红杏出墙来”的盎然生机。去清新的大自然，绿湖泛舟；去朴实的农人家，感受独特的民俗文化；去可爱的小动物身边，欢乐嬉戏；去尽情地游戏，在游戏中培养合作意识，培养团队精神，接受锻炼，体验成功的喜悦……

让我们去体验春天，接受大自然给予我们的礼物吧！

亲爱的同学们，我们该还春天什么礼物呢？

我衷心地希望同学们在亲近绿色、感受春天的实践活动中，在享受快乐，净化心灵的同时，也撒播文明的种子。捡起一片垃圾，还春天一份整洁；种下一棵小苗，还春天一份希望；呵护一只小鸟，还春天一份生机；扬起一张笑脸，还春天一份温柔……以我们的实际行动为人与自然的和谐做贡献。请大家记住：自然是美丽的，我们是文明的；与春天相约，与文明同行。

篇10

【关键词】 骨关节炎；巴戟天；牛膝；醇提物；软骨细胞；增殖；大鼠

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种临床常见的骨科退行性疾病，由于生物力学作用异常等叠加因素的影响，引起关节软骨代谢及修复功能失衡，进而加剧关节软骨退变，造成关节损害。临床表现常以关节反复性疼痛、肿胀、活动障碍为主。鉴于其发病周期长、致残率高等特点，对其防治具有重要现实意义[1-2]。目前，治疗OA的方法众多，大致可分保守治疗和手术治疗两大类。其中，保守治疗以药物为主，西医主要有口服和局部给药两种方式，前者因非甾体抗炎药等产生的胃肠道不良反应而使用受限，而后者可有感染危险且效果也非常有限；手术方法作为一种补救措施，因其并发症较多，影响因素复杂，且术后需要长时间康复，远期疗效有待进一步考证。中医药疗法治疗具有多靶点、疗效显著、副作用小、适合长期治疗等优势[3]。

当前，在中医药领域，补肝肾祛风湿法在防治OA上应用广泛，并成为该领域研究热点[4]。巴戟天、牛膝均具有补肝肾、祛风湿、强筋骨功效，是临床治疗OA常用配伍药。巴戟天、牛膝的联用可追溯到《备急千金要方》记载的巴戟天酒，其合用可增强补肾强筋、祛风除痹之效用，治疗肝肾亏虚型骨痹具有良性作用；另外源自《太平圣惠方》的巴戟丸亦由巴戟天和牛膝组方。因此，本研究旨在观察药对巴戟天-牛膝醇提物（M-AAE）对体外培养大鼠软骨细胞周期蛋白与基因的影响，进而为其阐明防治OA的治疗机制及临床运用提供实验支持。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠16只，体质量90～100 g，由福建中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK2012-0001（闽）。

1.2 实验药物 中药材巴戟天和牛膝，均由福州回春中药饮片有限公司提供。

1.3 主要试剂 磷酸盐缓冲液（HyClone）；DMEM/LOW GLUCOSE（HyClone）；逆转录试剂盒、DNA Marker Ⅱ（北京全式金生物技术有限公司）；RT-PCR引物合成、CyclinD1、CDK4、β-actin引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；TRIZOL（美国life）；异丙醇（国药集团药业股份有限公司）；无水乙醇（国药集团药业股份有限公司）；琼脂糖（Biowest Agarose）；核酸染料（Solarbio）；WB玻板（美国BIO-RAD）；PMSF（蛋白酶抑制剂）；RISF（裂解液）、蛋白上样缓冲液、1-StepTM Transfer Buffer、ECL高效显影液（Thermo）；质量分数为30%的聚丙烯酰胺、Tris（pH = 8.8与pH = 6.8）、SDS（十二烷基磺酸钠）、10×电泳液、AP（过硫酸铵）、TEMED、50×TAE（碧云天生物技术研究所）；10×TBST（Solarbio）；高效封闭液（北京康为世纪生物科技有限公司）；一抗（兔抗）、CyclinD1 Antibody、Cdk4 Antibody（C-22，美国Santa Cruz Biotechnology）；二抗（羊抗兔，美国CST）等。

1.4 主要仪器 DNA扩增仪（9600型，美国PE）；低温高速离心机（64R型，美国BECKMAN）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水装置（MILLI-Q型，美国MILIPORE）；荧光倒置相差显微镜（Olympus，日本TKO）；无菌操作台（AIRTECH型）、超净工作台（SW-CJ-1F型）（苏州安泰空气技术有限公司）；凝胶成像系统（GELDOC2000型，美国BIO-RAD）；全自动酶标仪（BIO-TEK ELX800型，美国BIO-Tek）；CO2恒温培养箱（BB16/BB5060型，德国Heraus）等。

2 方 法

2.1 M-AAE的提取 称取巴戟天、牛膝各100 g，依次经粉碎、筛检后移入装有500 mL质量分数为50%乙醇的烧瓶中浸渍7 d，收集上清液；再加入500 mL质量分数为50%乙醇，依法浸渍7 d，再次收集上清液；第3次加入500 mL质量分数为50%乙醇，继续浸渍7 d后收集上清液，最后合并3次浸出液，静置24 h，过滤，浓缩，回旋蒸发乙醇，97 ℃水浴锅持续蒸干水分，即得M-AEE提物浸膏。后置于烘干箱^续蒸干，待低温下研磨成粉末状。实验用时进行精确称量，并使用DMEM在低频超声下溶解，再经0.22 μL无菌滤嘴滤过后4 ℃冰箱保存备用。

2.2 软骨细胞的分离、培养与鉴定 在麻醉状态下进行脱颈椎处死SD大鼠，每次3只，分离膝关节处关节软骨。收集并剪碎至1 mm3/单位体积，PBS缓冲液冲洗至少3次后移至无菌小培养皿中，按每个器皿2.5 mL的体积加入质量分数为0.2%的Ⅱ型胶原酶进行消化，15 mL离心管收集消化后的上清液（每次2 h），1500 r・min-1离心机离心后弃上清液，移液器代液（含质量分数为10%胎牛血清DMEM）状态缓慢吹匀沉淀。经计数板计数（2×105・mL-1）后种植原代软骨细胞于培养瓶进行培养，48 h后初次换液。镜下观察细胞铺满80%瓶底面积时，经胰酶消化进行细胞传代。本实验使用第2代软骨细胞[5]。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色：软骨细胞（经计数每毫升2500个）待爬片后，经PBS冲洗3次，质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min。再经冲洗、裂解（质量分数为0.1%的破膜剂50 μL）20 min，冲洗后加入50 μL质量分数为3%的H2O2反应

20 min。再次冲洗后经5% BSA封闭30 min，设置阳性对照组、阴性对照组。阳性对照组加入含Ⅱ型胶原1∶200的一抗反应过夜，阴性对照组加入PBS作为对照。后经PBS冲洗3遍后加入50 μL二抗（1∶200）反应30 min，再次冲洗后以每张玻片50 μL DAB进行浸润10 min。再依次经过漂洗、苏木素复染、冲洗（PBS）、返蓝2 s、常温晾干、梯度酒精、二甲苯进行脱水与透明后封片观察[6]。

2.3 MTT测定M-AAE干预后软骨细胞增殖活性

以96孔板为载体培育经计数为每孔2×103的第

2代软骨细胞24 h后，再饥饿细胞同步培养24 h，

弃去旧液更换含质量分数为10%的胎牛血清DMEM培养，标记分组后依次加入0，75，150，300，600 μg・mL-1浓度的M-AEE分别培养24，48，72 h。后续操作依次为：弃净每孔旧液、

37 ?C温箱MTT（每孔100 μL）反应5 h、二甲基亚砜（DMSO）振荡条件下反应10 min（每孔100 μL）、

酶标仪570 nm波长下检测每孔OD值、记录与分析。

2.4 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 软骨细胞的分离和培养，选取实验所需细胞，经0，75，150，300 μg・mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后，使用光镜观察。

2.5 RT-PCR法检测CDK4、Cyclin D1 mRNA表达

2.5.1 CDK4、Cyclin D1 mRNA引物设计与合成见表1。

2.5.2 RT-PCR方法 使用核酸蛋白检测仪检测所提Total RNA浓度，当A260/A280比值在1.8～

2.0时，表明本实验所提取的软骨细胞Total RNA纯度较高。然后进行RNA逆转录反应，制备质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶。成胶后取出浸入电泳槽，加TAE（1×）电泳缓冲液，排除气泡。取上述各组RNA 每孔5 μL、Marker 每孔4.5 μL，电泳条件为100 V、70 mA、15 min，使用BIO-RAD Fluor-S TM Multi Imager图象分析仪下扫描，经分析后拍照存档。

2.6 Western Blot检测CDK4、Cyclin D1蛋白含量 设置分组（0，75，150，300 μg・mL-1组），经M-AAE干预48 h后，依次经PBS冲洗后吸净、加入裂解液（含100∶1蛋白酶抑制剂PMSF）、收集经刮刀刮取的细胞后离心取上清进行蛋白提取，参照碧云天生物技术研究所生产的BCA蛋白浓度检测试剂盒说明进行定量；制备质量分数为12%分离胶与质量分数为5%浓缩胶进行灌板，按每孔50 μg量算上样体积后依次加入，蛋白Marker加入每孔5 μL，在恒流下以20 V电压先跑10 min，再调整到100 V电压跑至分离胶底部进行电泳；调整电流为1.3 A、电压25 V，本实验中以β-actin耗时为7 min、CDK4为5 min、Cyclin D1为5 min进行半干式转膜，再经TBST中漂洗、封闭、洗膜、一抗过夜（1∶1000浓度的β-actin、CDK4、Cyclin D1）、TBST漂洗、二抗（1∶5000）封闭后洗膜进行显影。

2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以表示，采用t检验和单因素方差分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 软骨细胞观察与鉴定 第2代软骨细胞镜下观察：分布均匀，边界清晰，形态结构一致，呈明显的铺路石状外观；经Ⅱ型胶原免疫组化染色后，阳性对照组胞浆区为棕黄色，阴性对照组胞浆区颜色透明。以上可鉴定本实验所用细胞为软骨细胞。见图1。

3.2 M-AEE对软骨细胞增殖的时效与量效关系 用MTT法检测M-AAE在不同浓度（0，75，150，300，600 μg・mL-1）及不同时间（24，48，72 h）对软骨细胞增殖特性的影响。与0 μg・mL-1组比较，24，48，72 h的OD值均有升高，其中以48 h与150 μg・mL-1条件下软骨细胞增殖明显，差异有统计学意义（P < 0.01）。进而推测M-AAE干预软骨细胞后，对其增殖具有一定的时效-量效关系。其最佳干预时间和浓度分别为48 h和

150 μg・mL-1。见表2。

3.3 M-AEE干预软骨细胞活性镜下观察 经0，75，150，300 μg・mL-1浓度的总醇提物DMEM溶液干预48 h后，行光镜下观察：0 μg・mL-1浓度下观察细胞外观形似扁平状，胞浆丰富，胞核清晰，具有1～2个核仁，细胞数目较少，见图2（1）；经75 μg・mL-1浓度干预后，细胞分布均匀，大部为扁平状、细胞状态较好且细胞数量较多，见图2（2）；经150 μg・mL-1浓度干预后，软骨细胞紧贴聚集生长，外观以扁平状为主，边界清晰，形态结构一致，细胞核清晰、饱满，细胞状态佳，细胞数目最多，见图2（3）；经300 μg・mL-1浓度干预后，细胞数目较多但细胞核不规则，培养基中漂浮细胞较多，细胞状态欠佳，见图2（4）。

3.4 RT-PCR检测结果 M-AAE干预软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1的mRNA的表达量均明显高于0 μg・mL-1组，其中以150 μg・mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg・mL-1组和300 μg・mL-1

组在CDK4及Cyclin D1 mRNA上比较，其表达量差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

3.5 Western blot检测结果 M-AAE干预软骨细胞后，各加药组CDK4、ClinD1蛋白表达量明显高于0 μg・mL-1组，其中以150 μg・mL-1组的表达量最高（P < 0.01）。75 μg・mL-1组和300 μg・mL-1

组相比，在Cyclin D1和CDK4指标上，其蛋白含量的表达差异无统计学意义（P > 0.05）。见图4。

4 讨 论

OA属中医学“骨痹”范畴，其病机主要在于“天癸竭，形体衰”导致肝肾亏虚，进而加剧筋骨失养，最终表现为关节不利、疼痛缠绵。基于“肾主骨、肝主筋”“肝肾同源”理论，肾精充足则肝血充盈，肝血得到濡养则能化精，肾精方可充满，由此可见，肾中精气的气化与肝血的化生存在互生互利的密切联系。鉴于OA的病位在“肝肾”而外现于“筋骨”，故通过补肝肾、祛风湿法使经络通达，则肝肾精华得以濡养筋骨，从而驱逐滞留关节外邪，以达通利关节之效[7]。巴戟天、牛膝则以其补肝肾、祛风湿的作用整体切合OA的病机。现代药理研究发现，巴戟天主要化学成分有糖类、蒽醌类、环烯醚萜苷类、有机酸类、微量元素、氨基酸和甾醇类等，具有改善机体免疫功能、抗氧化、强壮骨骼、抗炎镇痛补血及促进造血干细胞增殖和分化等作用[8-10]。牛膝作为临床治疗OA常用药物，可引经下行，治疗OA发挥重要作用，研究表明，其主要成分有皂苷、脱皮甾酮、牛膝甾酮及糖类物质，并具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血等作用[11-13]。

鉴于细胞活力与细胞数呈正相关性，本实验首先运用MTT比色法检测狗脊多糖在不同浓度下对体外培养SD大鼠软骨细胞活性作用的影响，结果显示，M-AAE对软骨细胞增殖的影响与其药物浓度和时间有关，其最佳时效-量效关系为48 h和150 μg・mL-1；软骨细胞可发生有丝分裂，产生子代软骨细胞，以此维持关节功能趋于稳定。鉴于细胞有丝分裂的表现形式类似圆周循环，即具有周期性，通常称之为细胞周期，而对其调控发挥主要作用的内源性途径主要由细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）等组成，两者的协同作用可直接推动骨细胞跨越位于DNA合成起始部的G1/S

周期，进而决定细胞分裂，从而影响细胞增殖结果[14-15]。故本研究基于G1/S周期的CDK4、Cyclin D1的正性调节作用，初步探讨M-AAE对体外培养大鼠软骨细胞的影响，结果发现，与0 μg・mL-1组相比，M-AAE在一定条件下可上调CDK4、Cyclin D1 mRNA及蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。进而提示M-AAE可通过促进软骨细胞G1/S期的转变，加速细胞分裂，对软骨细胞增殖具有正性调控作用，从而为其在临床应用于OA提供相关依据。

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