七夕表达爱范文
时间：2023-04-06 22:27:45
导语：如何才能写好一篇七夕表达爱，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
【关键词】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克隆；基因表达
Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma
XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China
【Abstract】
Objective Its to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.
【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression
MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关抗原，这类抗原在正常组织中除和胎盘组织外均不表达,但在某些恶性肿瘤组织高度特异性表达,同时它们经MHC-Ⅰ类分子递呈到细胞表面后,可为自体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 识别［1］,因
而是一种CTL介导的特异性免疫治疗的理想靶分
子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成员达12个，各成员间的同源性较高。而肝细胞癌在我国发病率高，临床疗效及预后均很不理想，近来针对肝细胞癌的免疫治疗成为研究热点。
MAGE-1A9 cDNA 全长945 bp,编码分子量约35 Kd的蛋白产物。本文通过克隆、表达肝细胞癌MAGE-A9基因，制备抗MAGE-A9的单克隆抗体，观察MAGE-A9基因在肝细胞癌中的表达及定位，为进一步进行MAGE-A9基因的功能研究及肝细胞癌的免疫治疗奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料 6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自南京医科大学动物中心。肝细胞癌手术切除新鲜标本1例，取自江苏省肿瘤医院住院患者，液氮保存。肝细胞癌蜡块标本39例，其中38例取自南京医科大学第一附属医院病理科，1例取自江苏省肿瘤医院病理科，男性共36例，女性3例，年龄31～74岁。大肠杆菌菌株TG1及Top10由本实验室保存。质粒pMD18-T购自大连宝生物公司，pBAD/gIII 载体购自美国Invitrogen公司。PCR试剂，ExTaq酶，限制性内切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA连接酶,等购自大连宝生物公司； Hitrap镍亲合柱购自美国Amersham公司； ABC免疫组化试剂盒购自美国Vector公司。
1．2 方法
1．2．1 引物设计与合成 根据GenBank中MAGE-A9基因序列设计引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分别引入Hind III 和EcoR I酶切位点,由北京赛百盛公司合成。
1．2．2 肝癌组织总RNA制备及RT-PCR扩增 Trizol一步法提取肝癌组织总RNA，将抽提产物溶于DEPC处理的双蒸水中，以P1和P2为引物作RT-PCR扩增:94 ℃ 4 min预变性，94 ℃ 50 s变性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30个循环，72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化, 将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆重组, 连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,蓝白斑筛选阳性克隆, PCR初步鉴定阳性克隆后,进行DNA 序列分析。碱裂解法提取阳性重组体pMD18-T- MAGE-A9质粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切产物与同样酶切的表达载体pBAD/gIII用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,氨苄平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定阳性克隆,所得重组质粒命名为pBAD/gIII-MAGE-A9。
1．2．4 MAGE-A9基因的诱导表达及纯化 取1μl质粒pBAD/gIII-M9转化感受态大肠杆菌Top10, 氨苄平板筛选. 挑取单个阳性克隆培养至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(终浓度为0．002%)，于37 ℃
剧烈震荡诱导表达4 h后收菌,PBS 重悬,超声裂解,低温离心,取上清。表达产物经超声破碎,离心，上清经Hitrap镍亲和柱吸附, 样品过柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脱液依次洗柱，收集纯化液, 行12％SDS-PAGE电泳，分析最佳的咪唑洗脱浓度。
1．2．5 单抗制备 常规杂交瘤法制备单抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白纯化产物免疫BALB/c小鼠，对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA法检测杂交瘤培养上清,阳性细胞连续亚克隆,直至阳性率达到100%，确定为稳定的细胞株。
1．2．6 免疫组化 肝细胞癌石蜡切片4～5 μm，常规乙醇脱蜡至水，0．01%柠檬酸盐缓冲液微波修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，2%二抗动物（马）血清封闭,以本实验制备的抗MAGE-A9杂交瘤细胞培养上清为一抗，常规ABC法染色，DAB显色。以PBS代替一抗作为空白对照。
2 结果
2．1 RT-PCR扩增MAGE-A9基因 采用RT-PCR从人肝细胞癌组织中扩增目的基因,产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约945 bp 的条带，见图1,与945 bp的MAGE-A9基因目的片段大小一致。
注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker
图1
MAGE-A9基因RT-PCR扩增结果
2．2 MAGE-A9基因克隆载体的构建 将PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆，获得pMD18-T-MAGE-A9重组体，见图2，经蓝／白斑筛选和菌液PCR初步鉴定结果正确。DNA 序列分析表明质粒为MAGE-A9基因的克隆,序列与GenBank 报道序列完全一致。MAGE-A9基因与原核分泌型表达载体pBAD/gIII经EcoR I＋Hind III双酶切后连接，构建MAGE-A9基因的原核分泌型表达系统pBAD/gIII-MAGE-A9。
注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9
图2
pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重组质粒酶切鉴定图谱
2．3 MAGE-A9 蛋白的诱导表达和纯化 菌体经左旋阿拉伯糖诱导，冰冻超声裂解离心后，取上清行SDS-PAGE，结果见图3，与空载菌对比，在分子量约35 Kd的位置有明显表达条带，符合MAGE-A9基因945 bp片段编码315个氨基酸的蛋白分子质量。用HiTrap镍亲和柱纯化带有(His)6尾的重组蛋白，洗脱液咪唑浓度从0．2～0．5 M，纯化液行12％SDS-PAGE电泳。洗脱最佳咪唑浓度为0．4 M。
注：1-4:纯化的MAGE-A9（纯化咪唑浓度从0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空载细菌；7:诱导表达的菌体蛋白
图3
SDS-PAGE 鉴定MAGE-A9蛋白的表达和纯化
2．4 抗MAGE-A9单克隆抗体的制备和鉴定 间接ELISA法检测杂交瘤培养上清，经3次亚克隆，阳性率达100%。Western blot法检测单抗与MAGE-A9的结合，结果 见图4。
注：1：细菌空载； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker
图4
Western blotting 鉴定MAGE-A9 单抗
2．5 MAGE-A9在肝癌组织的定位观察 阳性表达表现为癌细胞胞浆被染成棕红色 见图5，非癌肝细胞未着色。39例肝细胞癌，阳性表达8例，阴性31例，阳性表达率为21%。MAGE-A9基因的表达与部分临床指标的关系见表1。
注：左图为阳性癌细胞胞浆染成棕褐色，右图为非肝癌细胞未着色
图5
肝细胞癌MAGE-A9基因表达产物定位观察。（DAB显色， 400×）
注：采用u检验进行统计学分析,P>0．05;MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无相关性
3 讨论
寻找合适的肿瘤抗原一直是肿瘤免疫治疗的难题。自20世纪50年代以来，科研工作者陆续在以黑色素瘤为主的多种肿瘤中发现了一些肿瘤相关抗原，从而成为肿瘤免疫治疗的基础。应用MAGE-A1基因作为疫苗应用于肿瘤治疗的探索性研究较多:
①用MAGE-A1抗原肽疫苗诱导扩增特异性CTL进行过继免疫治疗［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脉冲处理树突状细胞(DC)或用MAGE-A1基因修饰的DC制成DC疫苗,对肿瘤患者进行免疫治疗［3］。而继MAGE-A1基因第一个从黑色素瘤细胞克隆后,目前已发现12个MAGE-A成员并形成一个家族。由于MAGE-A抗原为许多肿瘤所共有,并具有严格的肿瘤表达特异性,因此MAGE-A
家族分子被视为肿瘤免疫治疗的理想靶点［1］。
MAGE-A9是MAGE-A亚家族成员, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成为良好的肿瘤靶基因，同时MAGE-A家族基因之间有较高的同源性，故MAGE-A9有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。因此, 对MAGE-A9基因进行克隆、表达,制备特异性单抗，明确其在肝癌中表达及定位，这不但有助于对MAGE-A9基因功能的研究，对肝癌的免疫治疗也具有重要意义。
本研究利用RT-PCR 方法,从人肝癌组织中克隆出目的基因全长片段,构建了原核表达载体pBAD/gIII-MAGE-A9，通过细胞融合技术，制备了一株抗MAGE-A9分子的单克隆抗体，证实可与MAGE-A9分子特异性结合。在以往研究中，由于缺乏特异性单抗，很多肿瘤因子的表达都是基因水平的研究，关于MAGE-A9在肿瘤中的表达研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相关的Barrett食道中过表达［5］，在皮肤T细胞淋巴瘤阳性表达率27%［6］。但基因与蛋白水平的表达并不完全一致，更重要的是，肿瘤免疫治疗是以抗原的确切定位为基础的。本文在制备了抗MAGE-A9单克隆抗体的基础上，应用免疫组化技术，首次证实MAGE-A9抗原在肝癌癌细胞中主要表达在胞浆，未见同一标本中部分肿瘤细胞MAGE-A9抗原阳性而另一部分肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阴性的情况,只是见标本中全部肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阳性或全部阴性，这提示,选用MAGE-A9 基因产物作为靶分子对阳性患者进行免疫治疗有可能对全部的肿瘤细胞都产生杀伤效应。本实验结果经统计学分析，认为MAGE-A9在肝癌中的表达于患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性，与赵海涛等检测MAGE-A10在肝癌中的表达与临床病理未见相关性的结果相一致［8］。本实验阳性表达率为21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超过50%［7，8］的表达偏低，可能与以下几方面原因有关：①以往研究以RT-PCR法检测基因表达居多，而本实验采用的是免疫组化法，在方法上可能会存在差异；②肝癌标本代表性不足，本实验标本数量不多，均为肝癌原发灶标本，未涉及肝癌转移灶，且多为中等分化程度的，分化程度较高和较低的肝癌标本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝细胞癌标本。今后的研究需扩大样本，同时检测MAGE-A9在常用的人肝癌细胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表达情况。
参考文献
1 Zendman AJ , Ruiter DJ , VanMuijen GN. Cancer/ testis-1associatedgenes : identification , expression profile , and putative function. Cell Physiol，2003，194(3):272 -288．
2 Toso JF , Oei C , Oshidari F , et al . MAGE-1- specific precursor cytotoxic T-lymphocytes from a patient with breast cancer : characterization and antigen-specific activation .Cancer Res，1996，56(1)：16.
3 Gillespie AM, Coleman RE. The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy .Cancer Treat Rev，1999，25(4)：219-227．
4 王道荣，陈国玉，等.胃癌患者外周血和骨髓血中CD44v6基因表达与胃癌微转移的研究.南京医科大学学报（自然科学版），2004，24（6）：638-640，653．
5 Lin J, Lin L, Thomas DG, et al . Melanoma-associated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGE-A10 splice variants． ClinCancer Res，2004，10(17):5708-5716．
6 Eichmuller S, Usener D, Thiel D, et al .Tumor-specific antigens in cutaneous T-cell lymphoma: expression and sero-reactivity.Int J Cancer，2003，104(4):482-487．
7 蔡胜利,陈红松,等.恶性黑色素瘤抗原编码基因MAGE-1在肝细胞肝癌中表达的研究. 中华普通外科杂志，1999，14（3）229-230．
篇2
【关键词】皮肤鳞状细胞癌;细胞周期蛋白;cyclin E;表达
【中图分类号】R739.5 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0007-01
2005年2月到2009年4月采用免疫组织化学法观察32例皮肤鳞状细胞癌中Cyclin E的表达,并进行相关性分析,探讨其在皮肤鳞状细胞癌是表达异常的意义及其与皮肤生物学行为的关系。
1 临床资料
1.1 一般资料:皮肤鳞状细胞癌标本为我院2005年2月到2009年4月经病理确诊存档的32例石蜡包埋组织(观察组),其中男26例,女6例,年龄40-90岁,平均年龄(54.5±12.5)岁。皮损部位:头面部10例,下唇部1例,躯干部5例,下肢5例,会10例,足部1例。病理分级按WHO标准,I级7例,Ⅱ级15例,Ⅲ级10例。对照组为外科手术中剔除的32例正常皮肤组织。
1.2 免疫组织化学染色
1.2.1 试剂及仪器。一抗:鼠抗人Cyclin E单克隆抗体,免疫组织化学SP试剂盒(生工生物工程公司,武汉)。
1.2.2 染色方法:石蜡切片常规脱蜡水化后,经高压锅热处理修复抗原,4% H2O2阻断内源性过氧化物酶,蒸馏水洗,10%正常羊血清封闭20min,滴加PBS稀释的Cyciin E工作液,室温2h,PBS洗3次,再分别加鼠抗人Cyclin E单克隆抗体及SABC复合物室温各孵育30min,两次孵育后均用PBS洗3次;DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。
1.3 结果观察及判定标准:Cyclin E蛋白阳性表达表现为细胞核出现棕褐色或棕黄色颗粒。在高倍镜下取5-8个视野观察,计数500个以上细胞并计算Cyclin E阳性细胞百分率,以Cyclin E阳性表达细胞数>5%为Cyclin E蛋白过表达。Cyclin E蛋白免疫组织化学结果均经重复染色一次印证,两位独立观察者分别观察计数并取均值。
1.4 统计方法:实验数据用SPSS15.0程序进行统计学处理。计量资料用均数±标准误(x±S>x),若是正态分布,用方差分析,组间、组内比较;若是非正态分布,用秩和检验。以P
2 结果
在对照组皮肤细胞核内未见阳性表达;在观察组鳞癌组织中表达定位于细胞核,呈棕黄色,阳性染色细胞散在分布于表皮组织中。Cyclin E在鳞癌组织中阳性表达较正常人对照组高,两者差异有统计学意义(P
3 讨论
当前细胞周期中存在几个重要关卡(checkpoint),并受一些细胞周期蛋白调控,当控制这些关卡的基因异常表达细胞周期调控蛋白时,可造成基因组不稳或静止的细胞越过这些关卡,引起细胞周期失控,导致细胞过度增殖。 G1向S转变是细胞周期主要调控点之一,目前发现G1期的调节因子与癌变关系最密切。细胞周期调控涉及细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI),以CDK的活性表达与调控为主。已证实,作为一种细胞周期正向调节因子的细胞周期蛋白E(Cyclin E)是一种癌基因, Cyclin E的正调控在肿瘤的发生发展过程中起关键作用。Cyclin E表达在G1晚期达高峰,是G1/S期转换的限速因子,其过度表达可加速细胞进入S期,导致细胞无限制增殖,并进一步引起肿瘤的发生发展。CyclinE是1991年美国的研究小组在筛选人cDNA文库中发现的。由4个外显子3个内含子组成,转录2.2 kb的mRNA,编码395个氨基酸的蛋白质,分子质量50ku。Cyclin E的合成在G1晚期达高峰,继CyclinD后被活化,然后经与PEST序列有关的蛋白水解或泛素路径降解而迅速下降。因此,CyclinE主要在G1晚期发挥正性调控细胞周期的作用。
Mullerw等研究表明在一大部分早期NSCLC患者中Cyclin E的mRNA水平升高。Geng等研究了87例乳腺癌患者,其中21例有Cyclin E mRNA的高表达,约占24%,雌激素受体阳性及阴性的频率大致相当。一大部分Cyclin E过表达的人乳腺癌同时过表达周期蛋白E mRNA。Payton等发现肺癌和乳腺癌患者原发肿瘤Cyclin E的表达升高。肺神经内分泌癌Cyclin E2信号最强,其次是乳腺浸润性导管癌。雌激素受体缺乏的乳腺肿瘤更容易引起Cyclin E升高,提示Cyclin E可能导致乳腺肿瘤发病机理的解偶联。本组正常皮肤组织cyclin E无表达,皮肤鳞状细胞癌组织cyclin E阳性表达,且在复发肿瘤中及随病理分级升高而升高。表明在皮肤鳞状细胞癌发生的早期,cyclin E阳性表达逐渐增高,但仅为量变,故其阳性表达与病理分型、临床分期、淋巴结转移、颅神经侵犯无关;当其阳性表达增至最高点,由量变发生质变,细胞进入S期,瘤细胞进入无限增殖期。cyclin E阳性表达在鼻咽癌患者中的3年生存率差异有显著性,表明其在判断鼻咽癌预后中有参考价值。
总之,细胞周期调节失控是肿瘤发生发展的重要机制,其中Cyclin E的正调控在此过程中起关键作用。随着对Cyclin E作用机理的深入研究,将为进一步阐明皮肤鳞状细胞癌的发病机制带来曙光,并为皮肤鳞状细胞癌的治疗和预防提供新的靶点。
参考文献
[1] 陈意生.肿瘤分子细胞生物学[M].北京:人民军医出版社,2002
[2] 曲才杰,史同新,林桂铭.p27和细胞周期蛋白E在Bowen病及皮肤鳞状细胞癌中的表达[J].中华皮肤科杂志,2006,53(2):71-72
[3] 郭建华,李玲香.Cyclin E与恶性肿瘤[J].肿瘤研究与临床,2003(1):68-71
[4] 黄剑飞,顾美珍,咸华,等.细胞周期素E、D1与增殖细胞核抗原在肝癌中的表达及临床意义[J].江苏医药,2006(3):212-213
篇3
【关键词】 IgG； 肝癌； 临床病理学指标； 原位杂交； 免疫组织化学
【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.
【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry
First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008
近来多项研究证明，乳腺癌、大肠癌、胃癌和肺癌等源于上皮的恶性肿瘤细胞可以产生IgG[1-6]。邱晓彦等[4]最早发现Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤的分化有关；依据肿瘤的分化程度不同，Ig样蛋白的表达水平也不同，即分化程度越高，表达强度越低，并证实该Ig样蛋白为IgG；叶雪等[7]发现在恶性卵巢上皮性癌中IgG的表达强度明显高于正常卵巢，IgG的表达水平与卵巢癌的临床分期和病理分级无相关性；李浩勇等[6]对膀胱癌研究发现：膀胱癌细胞能够表达IgG，其抗体体外对膀胱肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用，且具有促进癌细胞凋亡的效应；Niu等[8]研究了IgG的表达与结直肠癌的生物学指标和临床病理学指标的关系，通过siRNA干扰下调IgG的表达，可以抑制结直肠癌细胞（LOVO细胞）的增殖、克隆形成和侵袭能力，提示肿瘤源性IgG具有促进肿瘤生长，转移的作用。肝癌亦属于上皮性恶性肿瘤，但是目前对于IgG在肝癌组织中的表达与分布情况及其与临床病理学指标的关系的研究尚未有报道。本实验采用免疫组化技术和原位杂交技术检测肝癌组织中IgG的表达情况，进而分析其表达水平和肝细胞肝癌9项临床病理学指标的关系，以期为肝细胞肝癌的诊断、治疗和预后评估提供新的方法和思路。
1 材料与方法
1.1 材料来源 收集潍坊医学院附属医院和潍坊市民医院2010-2012年手术切除的肝癌标本60例，其中男40例，女20例，平均年龄45岁，患者术前均未采取任何治疗措施。所有肝癌病例随访12～18个月。本实验经潍坊医学院伦理委员会批准，并获得患者的书面许可。所有新鲜标本均经4%多聚甲醛/PBS固定，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。
1.2 免疫组化方法 采用PV-9000两步法（试剂盒购自美国Zymed公司）进行免疫组化检测。切片常规脱蜡，入水，枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，经3%过氧化氢37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG单克隆抗体（1：1000，购自美国sigma公司），4 ℃湿盒过夜，滴加试剂1（聚合物辅助剂），37 ℃孵育30 min，滴加试剂2（辣根过氧化素）标记二抗，37 ℃孵育30 min。各步骤之间均是PBS冲洗3次，每次5 min。AEC显色，苏木素复染，甘油明胶封片。以手术切除的扁桃体组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 原位杂交方法 切片二甲苯脱蜡，乙醇梯度透明至PBS反复冲洗，酶消化，经预杂交，滴 50μL含探针的杂交液，45 ℃保温，20 h。将切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次经5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL马血清封闭液，置湿暗盒中室温1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，购自瑞士roche公司），室温1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗数次，NBT-BCIP显色。以结肠黏膜下孤立淋巴结作为阳性对照，以IgG正义探针代替反义探针作为阴性对照。
1.4 免疫组织化学结果评分 采用双盲法，由3位病理学教授在400×的显微放大倍数下随机对染色切片独立评分，所得平均分作为最终结果。评分标准如下：（1）阳性细胞数所占比例：小于5%为0，5%～25%为1，25%～50%为2，大于50%为3；（2）染色强度：未着色为0，淡红色或粉红色为1，红色为2，深红色为3。两项测量标准得分之和为0～3分的切片标记为弱染色，阴性；4～6分的切片标记为强染色，阳性。
1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理，计数资料比较采用Pearson 字2及Fisher确切概率法检验分析，评估IgG的表达情况与临床病理学参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤分化程度、AFP浓度、pTNM分期、1年内是否复发或转移）之间的相关性。以P
2 结果
2.1 IgG蛋白在肝癌组织的表达及免疫组化检测结果 经免疫组化检测结果显示60例肝癌组织的IgG蛋白阳性率为85.00%（51/60），癌周正常肝组织的阳性率为6.67%（4/60），两者比较差异有统计学意义（P=0.001）。IgG蛋白阳性染色主要定位于肝癌细胞胞浆和胞膜。
2.2 IgG mRNA在肝癌组织的表达及原位杂交结果 IgG mRNA阳性信号位于肝细胞肝癌细胞胞浆，为蓝紫色，呈颗粒状，与免疫组化结果具有良好的一致性，从mRNA水平证实了肝细胞肝癌组织自身具有产生IgG的能力。
2.3 IgG在肝癌组织中的表达和临床病理学指标的关系 IgG的异常高表达与肝细胞肝癌分化程度和pTNM分期呈负相关（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；与血浆AFP浓度呈正相关（r=0.336，P=0.009）；与年龄、性别、肿瘤包膜完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发与转移无相关性（P>0.05），见表1。
3 讨论
免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是体内免疫球蛋白家族中含量最高的一种，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。经典免疫学理论认为IgG仅可由B淋巴细胞经成熟分化过程才能够特异性合成并分泌。近年来多项研究发现IgG在其他多种上皮性恶性肿瘤组织和细胞系中也存在异常高表达的现象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近发现IgG在结直肠癌组织中和CRC细胞中高度表达，而且此高度表达与肿瘤的分期、淋巴结转移和炎性细胞浸润有密切的关系，提示肿瘤源性IgG可能对肿瘤的发生发展有重要影响。有研究显示在肝细胞肝癌患者的血浆中和肝癌细胞系（BCL-7402）中均可检测到IgG的含量异常增高[2，5，9]。但是在肝癌组织中的表达情况未有报道，肝癌细胞所分泌的IgG的功能未知，其表达和癌症的临床病理学指标的关系也有待于研究。
在本项研究中，笔者分别从蛋白质水平和mRNA水平证明了肝癌组织可以产生IgG。IgG在肝癌中的高表达（85.00%）与肿瘤的分化程度和pTNM分期呈负相关，IgG在分化较差（低分化或未分化）或在处于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝细胞肝癌组织中的表达比在分化较好（中分化或高分化）或在处于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝细胞肝癌组织中更为明显；IgG的高表达与血浆AFP浓度呈正相关，与年龄、性别、肿瘤包膜的完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发或转移无相关性。实验结果提示肿瘤源性IgG可能与肿瘤生长有关。免疫球蛋白能促进肿瘤生长的现象已有报道，这主要与“抗癌抗体”阻断癌细胞表面的靶表位有关[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中发现异常糖基化的免疫球蛋白分子不能诱导免疫应答。此外，免疫球蛋白重链，T淋巴细胞受体（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白样黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌细胞中表达[15]。免疫球蛋白抗体和T淋巴细胞受体可启动补体依赖的细胞毒作用，致使癌细胞凋亡。所以免疫蛋白超家族对于肿瘤细胞可能具有自身保护作用，并与癌细胞的增殖有关。邱晓彦等[4]早期研究了3例肝癌组织，其分化程度均为中度，研究结果显示肝癌细胞中Ig蛋白均具有很高的表达量，因此认为在肝癌组织中IgG的表达程度与肿瘤的分化无相关性。而本研究提示IgG在肝癌中的异常表达与肿瘤的分化程度呈负相关。这种差异可能由于样本量大小不同造成。
甲胎蛋白（AFP）是分子量为64 000～70 000道尔顿的一种糖蛋白，主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成，是胎儿成长发育的重要蛋白，具有保护胚胎不受母体排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出现则提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌诊断、治疗和预后判断的重要指标。贾户亮等[16]分析肿瘤数目、大小和pTNM分期不同的肝细胞肝癌的患者血清AFP水平显示，AFP水平的高低与肿瘤的大小、数目和pTNM分期均呈正相关，其中pTNM Ⅰ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝细胞肝癌患者血清AFP水平具有显著的差异。
本实验结果表明，血清AFP水平较高（>400 μg/L）
的肝细胞肝癌患者组的IgG阳性表达率（92.8%，39/42），比血清AFP水平较低（≤400 μg/L）的肝细胞肝癌患者（66.7%，12/18）组显著增高，与先前文献报道结果一致。尽管血清AFP含量水平对肝癌的早期诊断有重要意义，但是并非所有AFP升高都可以断定为肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活动灶等疾病中亦可检测到高水平含量的血清AFP，因此仅仅根据血清AFP浓度来对肝细胞肝癌进行早期诊断是不够准确的[17-18]。所以联合肿瘤源性IgG表达水平的检测可提高阳性检出率，降低漏诊率和误诊。
综上所述，在肝癌组织中IgG表达显著增高，IgG的表达水平与肿瘤的分化、分期有着密切的关系。这可为以后的肝癌的早期诊断和分期判断提供了又一重要指标。研究IgG的表达与肿瘤的生长分化的关系，有助于为肿瘤的免疫治疗提供理想的理论依据，但是对于其功能与分子机制的关系有待于进一步研究。
参考文献
[1]汪涣，张叔人，何祖根，等.免疫球蛋白样物质在上皮来源的恶性肿瘤中的表达[J].中国肿瘤临床，2001，28（12）：169-171.
[2]邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内存在免疫球蛋白样物质[J].白求恩医科大学学报，1996，22（5）：572-575.
[3]邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内呈现Ig样物质的特性及其基因结构分析[J].中国免疫学杂志，1996，5（12）：296.
[4]邱晓彦，侯春梅，李秀森，等.Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤分化及增殖细胞核抗原的相关性分析[J].军事医学科学院院刊，1999，23（1）：16-18.
[5]邱晓彦，侯春梅，李秀森，等.多种肿瘤传代细胞中Ig样物质存在与检测[J].癌症，1999，18（11）：180-181，184.
[6]李浩勇，梁培育，朱孝峰，等.免疫球蛋白G在膀胱癌细胞中的表达及其抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J].中国生理病理杂志，2007，23（6）：1068-1073.
[7]叶雪，郭慧方，昌晓红，等.免疫球蛋白IgG在卵巢上皮性癌的表达[J].中国妇产科临床杂志，2007，8（2）：192-194.
[8] Niu N，Zhang J，Huang T，et al.IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors [J].Plos One，2012，7（11）：e47 362.
[9] Olubuyide I O，Salimonu L S，Adeniran S O.Soluble immune complexes and immunoglobulin （IgG， IgA and IgM） levels in Nigerians with primary liver cell carcinoma[J].African Journal of Medicine and Medical Sciences，1993，22（4）：57.
[10] Schreiber H，Wu T H，Nachman J，et al.Immunological enhancement of primary tumor development and its prevention[C].Seminars in Cancer Biology，Academic Press，2000，10（5）：351-357.
[11] Prehn R T.Stimulatory effects of immune reactions upon the growths of untransplanted tumors[J].Cancer Research，1994，54（4）：908-914.
[12] Manson L A.Anti-tumor immune responses of the tumor-bearing host： the case for antibody-mediated immunologic enhancement[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1994，72（1）：1-8.
[13] Sj?gren H O，Hellstr?m I，Bansal S C，et al.Suggestive evidence that the "blocking antibodies" of tumor-bearing individuals may be antigen-antibody complexes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1971，68（6）：1372-1375.
[14] Taylor D D，Gercel-Taylor C.Tumor-reactive immunoglobulins in ovarian cancer： diagnostic and therapeutic significance？（review）[J].Oncology Reports，1998，5（6）：1519.
[15] Lee G，Zhu M，Ge B，et al.Widespread expressions of immunoglobulin superfamily proteins in cancer cells[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61（1）：89-99.
[16]贾户亮，刑戌健，叶青海.甲胎蛋白在原发性肝癌临床诊断中的应用[J].中国医学科学院学报，2008，30（4）：440-443.
[17]赵恒，廖静，刘瑜.甲胎蛋白与肝癌[J].临床肝胆病杂志，2008，24（5）：385-387.
篇4
[关键词] T细胞共刺激分子；T细胞亚群；胃癌；大肠癌
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）02（a）-0003-03
[Abstract] Objective To discuss and analyze the significance of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups in the expression of gastric carcinoma and colorectal cancer tissues. Methods 41 cases of patients with gastric carcinoma and 39 cases of patients with colorectal cancer treated in our hospital from September 2014 to October 2016 were selected as the research objects and the patients with gastric carcinoma were selected as the group A， while the patients with colorectal cancer were selected as the group B， and 33 cases of healthy persons at the same period were selected as the group C， and the admission persons were tested by the Flow cytometry， and test results of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups of the three groups were compared. Results The T cell co-stimulatory molecule CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（25.81±10.55），（28.94±9.28）% vs （0.81±0.97）%]， and T cell CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（53.62±13.83），（55.95±10.67）% vs （72.06±7.82）%]，the T cell CD4+CD3+ level in the group A and group B was lower than that in the group C[（29.83±9.72），（33.74±9.03）% vs （38.78±5.07）%]， the T cell CD8+CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C， [（1.58±1.98）%，1.92±2.62）% vs（0.04±0.03）%]，the T cell CD8+CD28-CD3+ and CD4/CD8 levels in the group A was lower than that in the group C[（16.07±6.95）， （1.15±0.54）%vs （20.55±6.55），（1.35±0.32）%]， and the T cell CD4+CD25+CD3+ level in the group B was higher than that in the group C[（19.75±6.88）% vs （13.71±3.07）%]， and the difference had statistical significance（P0.05）. Conclusion The T cell number of patients with gastric carcinoma and colorectal cancer obviously decreases， but the expression of CD28 increases， and CD4+T cell number of patients with gastric carcinoma obviously decreases， but the regulatory T cell number of patients with colorectal cancer obviously increases.
[Key words] T cell co-stimulatory molecules； T cell subgroup； Gastric carcinoma； Colorectal cancer
临床上，肿瘤发生、发展同抗肿瘤免疫存在一定的联系，抗肿瘤免疫的机理目前主要有肿瘤细胞免疫逃逸学以及免疫监视学[1-3]。为了探讨和分析T细胞共刺激分子及其亚群在胃癌和大肠癌组织中表达的意义，该次研究方便选择该院于2014年9月―2016年10月期间收治的41例胃癌患者和39例大肠癌患者作为研究主体，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
该次研究选择该院收治的41例胃癌患者和39例大肠癌患者作为研究主体，胃癌患者为甲组，大肠癌患者为乙组，选择同期进行检测的33名健康人作为丙组。其中甲组患者男性为23例，女性为18例；年龄在43～79岁之间，平均为（59.61±3.15）岁。乙组患者男性为22例，女性为17例；年龄在42～78岁之间，平均为（59.31±3.24）岁。丙组中男性为19名，女性为14名；年龄在41～79岁之间，平均为（58.68±3.61）岁。甲乙丙3组上述资料差异无统计学意义（P>0.05），可对比。
1.2 方法
在术前和术后1周对甲乙两组患者进行外周静脉血抽取，抽取量为2 mL，行ETDA3K抗凝。丙组抽取2 mL的外周静脉血抽取，行ETDA3K抗凝，在室温下进行保存，检测要在18 h之内完成。
取100 μL的血样全血分别加入荧光标记的CD3-Pc5、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD28-FITC单抗和相应同型对照，在室温下行避光孵育，时间为25 min左右，之后加入0.5 mL的溶血剂，作用时间为30 min，加入PBS直到0.5 mL。在混合均匀后通过流式细胞仪进行检测，在检测前行荧光微球矫正，保证机器的误差
1.3 观察指标
观察并记录3组的检测结果。
1.4 统计方法
通过SPSS 20.0统计学软件对此次研究数据进行处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并采用 t 检验，以 P
2 结果
甲乙两组T细胞共刺激分子CD28+CD3+水平高于丙组，甲乙两组T细胞CD3+水平低于丙组，甲乙两组T细胞CD4+CD3+水平低于丙组，甲乙两组T细胞CD8+CD28+CD3+水平高于丙组，甲组T细胞CD8+CD28-CD3+以及CD4/CD8水平低于丙组，乙组T细胞CD4+CD25+CD3+水平高于丙组，差异有统计学意义（P0.05），见表1、表2。
3 讨论
T细胞、巨噬细胞以及NK细胞是机体抗肿瘤免疫主要效应细胞，而CD4+T细胞能调节和活化上述细胞抗肿瘤效应。Ts细胞（CD8+CD28-CD3+）组织抗原的呈递，并可阻断Th细胞功能。T细胞的完全活化是CD28共刺激活化，CD8+CD3-细胞的亚群参与到了肿瘤细胞的免疫反应中，同机体的带瘤状态存在一定关系[4-7]。此次研究结果表明，甲乙两组CD3+、CD4+以及CD8+等T细胞亚群的表达都明显降低，尤其是甲组CD4+降低最为明显，所以无法发挥出正常抗肿瘤的作用；丙组的CD28表达比较微弱，甲乙两组增高明显。甲乙两组的CD4+、CD8+表达升高，差异有统计学意义。甲乙两组的CD8+、CD3-较术前有所增加，但同丙组对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。这同傅冷西等[8]的研究结果： CD28+CD3+表达：胃癌组（25.80±10.56）%，大肠癌组（28.95±9.29）%，均明显高于对照组的（0.82±0.98）%（P
综上所述，在胃癌患者中T细胞亚群的异常表现主要为T细胞共刺激分子（CD28）的无效表达增加，CD4+T细胞的数量明显减少。而大肠癌患者的主要特征为CD4+CD25+T调节细胞数量增多，所以，T细胞亚群是肿瘤治疗效果以及预后判断有效的一个重要检测指标。
[参考文献]
[1] 鲍轶，郭丽.γδT细胞表达共刺激分子及协同信号通路的研究进展[J].中国医学科学院学报，2014，36（2）：223-226.
[2] 王婷，刘翠平，朱然然，等.转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用[J].国际免疫学杂志，2013，36（3）：226-230.
[3] 刘芝翠，元慧杰，曾维宏，等.天疱疮患者外周血CD4+T细胞活化状态及其表面共刺激分子的表达[J].中华皮肤科杂志，2014，47（1）：7-10.
[4] 王瑜，丁晓霞，胡孝彬，等.CHB患者CD4+ T细胞ICOS表达及其与干扰素治疗的相互关系[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32（2）：124-127.
[5] 卢芩，俞婷，张有珍，等.胃癌患者外周血及癌组织中调节性T细胞和Foxp3的表达意义[J].中国老年学杂志，2014，34（18）：5140-5142.
[6] 马俊杰，刘会平，周春祥，等.运用胸腔镜技术探索细支气管肺泡细胞癌中医证型与Th1/Th2关系[J].中国中西医结合杂志，2013，33（8）：1069-1071.
[7] 温鹏强，赵俊山，齐中香，等.急性期川崎病患儿CD4+CD25 highFOXP3+调节性T细胞亚群改变及意义[J].中华风湿病学杂志，2015，19（2）：91-96.
[8] 傅冷西，张声，陈思曾，等.T细胞共刺激分子及其亚群在胃癌和大肠癌组织中表达的意义[J].中国普外基础与临床杂志，2008，15（1）：51-55.
篇5
［目的］探讨口腔鳞状细胞癌（OSCC）发生、发展过程中基质金属蛋白酶9（MMP9）对微血管生成的意义。［方法］采用免疫组化SP法对65例OSCC、40例非典型增生、22例正常口腔黏膜进行MMP9、CD34免疫组化染色。检测OSCC、非典型增生、正常口腔黏膜中MMP9的表达和微血管密度（MVD），并分析MMP9的表达与MVD之间，以及它们与OSCC临床病理特征之间的关系。［结果］OSCC组中MMP9的表达与MVD值均高于非典型增生组，在非典型增生组中均高于正常口腔黏膜组；OSCC组、非典型增生组和正常口腔黏膜组中MMP9表达与MVD有正相关趋势；MMP9的表达与肿瘤大小、淋巴结转移密切相关，MVD与淋巴结转移密切相关。［结论］MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。
【关键词】 口腔鳞状细胞癌 免疫组织化学 基质金属蛋白酶9 CD34
Correlation between Expression of Matrix Metalloproteinase9 and Angiogenesis in Oral Squamous Cell Carcinoma
Abstract: ［Purpose］ To study the significance of matrix metalloproteinases9 (MMP9) on micro angiogenesisin carcinogenesis and progression of oral squamous cell carcinoma (OSCC). ［Methods］MMP9 and CD34 were detected by immunohistochemistry SP method in 22 cases of normal oral mucosa， 40 cases of atypical hyperlasia and 65 cases with OSCC. The expression of MMP9 and microvessel density (MVD) were detected in the three groups and the relationship between expression of MMP9 and MVD and its relationship with OSCC clinicpathological characteristics were reviewed.［Results］ The expression of MMP9 and the level of MVD in OSCC were significantly higher than that in atypical hyperlasia. The expression of MMP9 and the level of MVD in the group of atypical hyperlasia were significantly higher than that in normal oral mucosa. The expression of MMP9 were closely related with MVD in the tumor group， atypical hyperlasia group and normal oral mucosa group. MMP9 expression in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis and tumor size. MVD in OSCC was significantly associated with lymph node metastasis. ［Conclusion］ MMP9 may be one of important factors in angiogenesis ofOSCC.
Key words: oral squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; matrix metalloproteinases9; CD34
肿瘤内新生血管的生成是影响肿瘤增殖和转移的重要因素，近年来的研究表明[1]基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）在肿瘤血管生成中有重要作用，明胶酶是MMPs的一个亚类，包括基质金属蛋白酶2（MMP2）和基质金属蛋白酶9（MMP9），其中MMP9与肿瘤血管生成的关系研究较少，研究结果也不一致，有关口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织中MMP9与肿瘤血管生成的关系，更少见报道。本研究通过免疫组织化学技术检测口腔鳞状细胞癌组织中MMP9和CD34的表达，并对MMP9的表达与微血管密度（MVD）做定量分析，探讨口腔鳞状细胞癌组织中MMP9对血管生成的作用及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 资料来源
本研究所用石蜡包埋组织标本选自安徽医科大学第一附属医院1998年1月至2001年12月的手术患者。口腔鳞状细胞癌患者65例，均为作口腔鳞状细胞癌根治性手术的患者，术前未作放疗或化疗，术后经病理诊断确诊为口腔鳞状细胞癌，男性35例，女性30例，中位年龄45.5岁；肿瘤最大直径≤3cm者35例，>3cm者30例；有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者34例；临床分期为Ⅰ期15例，Ⅱ期28例，Ⅲ期15例，Ⅳ期7例；其中高分化鳞癌18例，中分化鳞癌24例，低分化鳞癌23例。口腔非典型增生病例40例，来自其他口腔疾患手术标本，正常口腔黏膜22例，取自活检标本，均未做过任何治疗。
1.2 方 法
鼠抗人MMP9多克隆抗体和CD34单克隆抗体，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。 所有组织均经10%甲醛液固定，常规石蜡包埋， 包埋组织标本作4μm连续切片，免疫组化SP法染色参照试剂说明书进行， MMP9、CD34均采用高温直接煮沸法修复抗原。用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。
1.3 结果判定
⑴MMP9以实质细胞胞膜或胞质出现明显的黄色或棕黄色颗粒判断为阳性着色。定量及图像分析采用同济医大千屏影像公司HPLAS1000病理图像分析系统，将切片上的阳性染色信号转为灰度进行分析。
⑵MVD计数，参照Weinder[2]报道的方法进行微血管计数，先在低倍镜（×100）下观察确定血管密度最高处，在（×200）视野下选择3个高血管密度区，计算单位视野（×200）平均血管数。单个内皮细胞或内皮细胞簇，均作为一个血管计数，而直径大于约8个红细胞的血管，有厚肌壁的血管以及硬化区的血管不在计数范围内。
1.4 统计学处理
运用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，采用t检验和F检验。
2 结 果
2.1 MMP9在正常口腔黏膜组织、非典型增生、OSCC中的表达和分布
MMP9阳性细胞胞浆或胞膜呈棕黄色，偶尔可见细胞核着色，阳性颗粒多呈团块状。MMP9在癌组织中于肿瘤细胞(见图1)、增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在血管平滑肌细胞，血管内皮细胞上也有明显阳性表达(见图2)，MMP9阳性分布呈异质性，阳性细胞多位于癌巢边缘和管腔周围，其中基底膜附近的肿瘤细胞染色尤为明显。MMP9在非典型增生的表达主要位于增生上皮细胞的胞质中，在间质细胞中偶见染色。MMP9在正常口腔黏膜组织表达微弱，仅见于少数上皮细胞的胞质中。对切片的MMP9染色进行灰度分析，结果显示从正常口腔黏膜，非典型增生到OSCC， MMP9的表达逐渐增高，OSCC组中MMP9表达显著高于非典型增生组织（P
2.2 正常口腔黏膜组织、非典型增生、OSCC中MVD的分布
CD34标记的微血管呈点状分布，血管内皮细胞膜被染成褐色。肿瘤组织中的微血管形态不规则，部分血管呈现发芽状，血管分布不均匀，在肿瘤的边缘区域最为密集，呈簇状(见图3)。非典型增生组织中微血管形态较规则，但分布不均，血管簇偶见。正常口腔黏膜组织内的微血管形态规则，分布均匀。OSCC组中MVD显著高于非典型增生组织（P
2.3 OSCC中MMP9表达与OSCC血管生成的关系
OSCC中MMP9表达与MVD显著高于非典型增生组（P
3 讨 论
肿瘤的侵袭和转移是多步骤过程。实验表明[3]肿瘤组织中微血管密度越大，肿瘤细胞进入血循环及淋巴循环的机会越多，淋巴结及邻近脏器转移的机会也增大。MMP9由结缔组织细胞、巨噬细胞或肿瘤细胞分泌，是降解Ⅳ型胶原最主要的酶，在生理情况下维持细胞外基质，在胚胎发育、组织塑形中起着不可替代的作用。在病理情况下，MMP9通过降解细胞外基质成分中的Ⅳ型胶原使得肿瘤细胞突破原发部位正常的基底膜而发生浸润，突破脉管周围的基底膜进入脉管系统，即发生转移。近来研究表明[1，4]，MMP9不仅是降解基底膜和ECM的关键酶，而且在肿瘤间质血管生成中起重要作用。
本研究结果显示从正常口腔黏膜，非典型增生到OSCC，MMP9的表达逐渐增高，在非典型增生MMP9的表达主要位于增生上皮细胞的胞质中，在癌组织中MMP9在肿瘤细胞，增生上皮细胞和间质细胞均有阳性表达，在表达的强度、阳性细胞的种类、数量上均高于非典型增生组，提示MMP9可能在OSCC发生中发挥作用。同时观察到并非所有肿瘤细胞均能表达MMP9，具有MMP9表达能力的肿瘤细胞多位于这部分细胞多位于肿瘤的外周部分和毛细血管淋巴管腔周围，呈片状、灶状分布，提示表达MMP9的细胞具有更强的侵袭能力，符合肿瘤细胞的侵袭规律。在本实验中还观察到，在毛细血管腔和淋巴管腔周围及管腔内部可见聚集成团状并深度着色的癌细胞，可能为迁移到该处的高转移性癌细胞克隆增殖而成。另外表达MMP9的肿瘤细胞附近的血管平滑肌细胞、血管内皮细胞上也有明显阳性表达，提示该区域的血管平滑肌细胞，血管内皮细胞与肿瘤细胞在MMP9的表达上存在着联系，分析结果显示MMP9在瘤径>3cm组中的表达高于瘤径≤3cm组，在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组，提示MMP9可能是OSCC侵袭和转移的重要促进因素。
本实验中显示从正常组织非典型增生OSCC，组织中的MVD有逐渐增加趋势，非典型增生组中的MVD显著高于正常组，提示细胞在未发生恶性转化之前已有血管生成增多，这一现象是否为OSCC血管生成的启动阶段有待于作进一步研究。Eisma等[5]对头颈部鳞癌研究发现MVD每增加10个，淋巴结转移的危险度就增加1.32倍，在本研究中显示OSCC淋巴结转移组中MVD显著高于无淋巴结转移组，由于在OSCC中发生淋巴结转移的机会远高于血行转移，提示对OSCC原发灶MVD检测有利于作出转移和预后优劣的判断，但是否能作为OSCC的一个独立预后因素尚需要做进一步研究。
大量研究显示MMPs与肿瘤血管生成关系密切，在本实验中我们观察发现MMP9的表达部位与MVD高密度区具有一致性，均位于肿瘤细胞生长活跃的癌巢边缘地区，提示：①肿瘤在局外浸润生长的过程中，新生血管化是同步进行的；②MMP9的表达与肿瘤血管形成有关。在本实验中我们还观察到MMP9不仅在肿瘤细胞和间质细胞中表达，在肿瘤组织的血管内皮细胞上MMP9也有表达，这与MMP9参与肿瘤新生血管形成的观点一致。有研究显示[6]肿瘤的新生血管内皮细胞可以通过分泌MMP9降解周围基质，调节内皮细胞的迁移，使自身的血管条索延长和扩大，也有研究显示[7，8]血管生成因子VEGF在促进肿瘤内新生血管形成的同时，可以通过不同的信号途径，促进MMP9的表达并对TIMP1的表达进行抑制。 这些研究说明MMP9通过多种途径对肿瘤新生血管形成起作用，总体上表现出促进作用。本研究结果表明 OSCC中MMP9的表达显著高于非典型增生，其MVD也显著高于非典型增生 ，MMP9的表达与MVD具有一致性，MMP9与肿瘤新生血管形成关系密切。
本研究结果表明MMP9、新生血管形成与OSCC发生和侵袭转移有密切关系，MMP9可能是OSCC的重要促血管生成因子之一。阻断MMP9的表达，抑制MMP9的活化可能具有抑制OSCC转移和血管生成的双重意义。
参考文献
[1] Guttman D，Stem Y， Shpizer T， et al Expression of MMP9， TIMP1， CD34 and factor8 as prognostic markers for squamous cell carcinoma of the tongue[J]. Oral Oncol， 2004，40(8):798-803.
[2] Weidner N. Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density in breast carcinoma and other solid tumors[J]. Breast Cancer Res Treat， 1995，36:169-180.
[3] Takes RP， Batenburg De， Jong RJ， et al. Markers for nodal metastasis in head and neck squamous cell cancer[J]. Arch Otolaryngol Head Neck Surg， 2002，128(5):512-518
[4] Nagakaya Y，Aoki T，Kasuya K， et al. Histologic features of venous invasion， expression of vascular endothelial growth factor and matrix metalloproteinase2 and matrix metalloproteinase9， and the relation with liver metastasis in pancreatic cancer[J]. Pancreas， 2002， 24(2):169-178.
[5] Eisma RJ， Spiro JD， Krentzer DL. Vascular endothelial cell growth factor expression in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Am J Surg， 1997，174:513-517.
[6] Yabushita H， Shimazu M， Noguchi M， et al. Vascular endothelial growth factor activating matrix metalloproteinase in ascitic fluid during peritoneal dissemination of ovarian cancer[J]. Oncol Rep， 2002， 10(1):89-95.
篇6
[关键词] 肺肿瘤；化疗；Stathmin；β-tubulin-Ⅲ
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）12-0059-03
2011年肺癌NCCN指南中指出：对于行R0切除的Ⅱ期非小细胞肺癌（NSCLC），术后需行辅助化疗（一类证据），但不同患者对化疗的反应及预后差别很大。这可能与个体的生物学差异有关，因此建立循证医学基础上，以药物基因组学研究为依托的个体化治疗已成为未来NSCLC临床研究的重要方向。目前研究表明，微管基因是许多抗肿瘤药物的作用位点，其中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ表达增高与紫杉醇类药物的敏感性降低相关。那么它们的表达水平与长春碱类药物疗效的关系怎么样呢？国内外的研究结果很不一致，甚至自相矛盾[1]。
因此，本文筛选出73例接受手术且术后病理明确为Ⅱ期NSCLC患者，术后均给予长春瑞滨联合顺铂辅助化疗，并检测肿瘤组织中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平，随访患者无瘤生存时间（DFS）和总体生存时间（OS），统计学分析蛋白表达水平与患者DFS和OS的关系，探讨Stathmin及β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平与化疗药物疗效的相关性，希望能为个体化治疗方案的制定提供依据。
1 资料与方法
1.1 标本及资料收集
所有标本均从本院标本库中筛选（所有入标本库患者均签定知情同意书，医院伦理委员会讨论通过）。术后病理按照2006年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准进行分期，共筛选2007年9月～2010年6月经根治性手术切除的Ⅱ期NSCLC患者73例。患者的临床特征：男58例、女15例；年龄≤60岁55例、>60岁18例；肿瘤大小≤3 cm2 2例、>3 cm 51例；无淋巴结转移28例、有淋巴结转移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鳞癌36例、其他病理类型4例。
1.2 辅助化疗
患者术后转至化疗科室进行长春瑞滨联合顺铂化疗，顺铂75 mg/m2分3天给予，长春瑞滨25 mg/m2第1、8天，以上方案每3周重复。其中1例患者因骨转移只进行2周期化疗，4例患者第1周期在本院进行，余3个周期化疗当地进行，其余患者均在本院完成4个周期的化疗。
1.3 随访资料（DFS和3年生存率）的收集
均通过电话随访，由指定医生完成，每3个月1次。共随访70例，失访3例，随访率为95.89%。
1.5 结果判断
1.6 统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用COX模型进行单因素分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并经Log-rank检验。
3讨论
近年来肿瘤的个体化治疗越来越受到从事肿瘤临床和基础研究的学者的重视。NSCLC患者的治疗更是需要这一原则。真正意义的个体化治疗是对每一个肺癌患者“量体裁衣”，根据肿瘤生物学特征和药物基因组学改变进行针对性的治疗。2006年《新英格兰医学杂志》发表了肺癌个体化化疗里程碑式的文章。在该研究中，只有肿瘤ERCC1蛋白低表达者可从辅助化疗中获益[2]。
Stathmin是一种微管不稳定蛋白，在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用对细胞微管系统动力平衡的调节发挥十分重要的作用。通过对几种肺癌细胞的研究表明，微管的聚合状态能够影响其与化疗药物的结合。增加微管的聚合状态能够增加紫杉醇与微管的结合，减少长春碱与微管的结合，从而影响肺癌患者对化疗药物的反应[3]。蒲骁麟等[4]报道：在晚期NSCLC中，免疫组织化学方法测得的Stathmin表达水平与长春瑞滨+顺铂/卡铂（NP）方案的化疗疗效负相关。但我们的研究结果表明，Ⅱ期NSCLC术后标本中Stathmin的蛋白表达与患者预后无关，不能作为患者预后的独立预测因素。其高表达患者与低表达患者相比，DFS和OS均无明显差异。
那么β-tubulin-Ⅲ的表达水平与长春碱类药物疗效的关系怎么样呢？国内外用免疫组化方法检测得到的结果很不一致，甚至相互矛盾。Seve等[5]研究了术后接受NP方案辅助化疗的ⅠB～Ⅱ期NSCLC或者， 发现肿瘤组织中β-tubulin-Ⅲ蛋白高表达者，其无复发生存期和总生存期均优于低表达者。Reiman T探讨了JBR.10等4个临床试验中1149例已切除NSCLC的患者与β-tubulin-Ⅲ蛋白表达之间的关系，发现β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平可以作为预测患者预后的指标，但并不能作为预测化疗疗效的指标[6]。我们的研究结果表明，Ⅱ期NSCLC术后标本中β-tubulin-Ⅲ的蛋白表达与患者预后无关，其高表达患者与低表达患者相比，DFS和OS均无明显差异。
[参考文献]
[1] Seve P，Dumontet C. Class Ⅲ beta tubulin expression in non-small cell lung cancer[J]. Rev Mal Respir，2010，27（4）：383-386.
[2] Olaussen KA，DunantA，FouretP，et al. DNA repair by ER-CC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. N Engl J Med，2006，355（10）：983-991.
[3] Singer S，Malz M，Herpel E，et al. Coordinated expression of stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res，2009， 69（6）：2234-2243.
[4] 蒲骁麟，王峻，许林，等. β-tubulin-Ⅲ和Stathmin与晚期NSCLC化疗敏感性的关系[J]. 中国肺癌杂志，2009，12（1）：49-53.
[5] Seve P，Lai R，Reiman T，et al. Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin/vinorelbine chemotherapy in operable non-small-cell lung cancer：analysis of NCIC JBR.10[J]. Clin Cancer Res，2007，13（3）：994-999.
[6] Reiman T，Lai R，Veillard AS，et al. Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer： analysis of four randomized trials[J]. Ann Oncol，2012，23（1）：86-93.
[7] Alli E，Bash Babula J，Yang JM，et al. Effect of stathmin on the sensitivity to antimicrotubule drugs in human breast cancer[J]. Cancer Res，2002，62（23）：6864-6869.
篇7
【中图分类号】R711.74【文献标识码】B文章编号：1004-7484（2012）-05-0786-02宫颈癌发病与很多因素有关。笔者对宫颈癌患者进行辅助检查，以研究TRAIL、Survivin两项指标在宫颈病变患者疾病中的表达和其与细胞凋亡之间的关系，并进行分析，现总结如下：1.对象与方法
1.1对象：收集2007年-2010年北京市顺义区医院74例患者的标本，都为进行阴道镜室活检及手术切除的标本。辅助病理检查均明确诊断，27例患者为宫颈浸润癌设为宫颈癌组。22例患者为CINII-III级设为CIN II-III级组；25例患者为CIN I级设为CIN I级组。并设立对照组进行研究，对照组15例患者为笔者所在医院宫颈正常的患者，其标本为子宫肌瘤手术切除标本。所有宫颈癌患者在手术之前都没有进行化疗、放疗的治疗。RT-PCR方法检测Survivin、TRAIL的表达，采用SPSSll.0统计学软件进行分析。
1.2结果：宫颈癌组的Survivin基因的表达指标l.293±0.438，CIN II-III级组为1.010±0.367，CIN I级组为0.718±0.205，正常宫颈组为0.596±0.229。结果显示正常宫颈组明显低于CIN组，CIN组明显低于宫颈癌组。CIN I级组指标明显低于CINII-III级组，差异明显有统计学意义（P0.05)。CINI级组和正常宫颈组比较无明显差异，无统计学意义(P>0.05)。
宫颈癌组TRAIL基因的表达指标为0.441±0.117，CIN II-III级组为0.536±0.150，CIN I级组为0.675±0.211，正常宫颈组为0.940±0.427。宫颈癌组和CIN II-III级组的指标明显高于正常宫颈组，差异有统计学意义(P
1.3统计学处理：对宫颈癌组织中的各项表达指标进行统计学处理，应用Spearman等级处理，其呈负相关关系表现。相关系数r=-0.541，P
在人体肿瘤的研究中，Survivin基因在此疾病的检查中都有明显表现。其高度表达可让患者的细胞凋亡受到抑制，从而致使患者的细胞出现了增殖异常的表现。这表明此指标和患者发生肿瘤疾病有着很大的关联。笔者应用RT-PCR的方法对患者的标本进行检查，经对比分析显示此指标在早期宫颈癌恶性转化的时候可能会高表达。分析结果还显示其和宫颈癌疾病地发生有很大的关系。
TRAIL指标为肿瘤坏死因子，其本身在正常患者体内为高表达的表现，其在肿瘤患者及胚胎中的表现为低表达或者为没有表达。本组资料显示其在宫颈癌组中的表达指标为最少，这表明患者在发生肿瘤疾病时TRAIL表现为逐渐地丢失。这表明其和疾病的产生和法则有很大的关系。故对其进行研究可能会有新的突破。
篇8
关键词: 癌，肝细胞;β-连环蛋白;免疫组织化学
摘 要:目的 研究β-连环蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及其与原发性肝细胞癌分化、侵袭转移和预后的关系. 方法 应用免疫组织化学方法对63例原发性肝细胞癌石蜡包埋标本进行β-连环蛋白半定量检测. 结果 有49例（78%）原发性肝细胞癌β-连环蛋白阳性表达，低分化癌的β-连环蛋白阳性率明显高于高分化癌（P
Keywords:carcinoma，hepatocellular;β-Catenin;immuno-histochemistry
Abstract:AIM To investigate theβ-Catenin expression in primary hepatocellular carcinoma and its relation ship with tumor differentiation，AFP level，invasion，metastasis and prognosis.METHODS β-Catenin expression was detected in63cases of primary hepatocellular carcinoma by using im-munohistochemical technique（DAB method）.RESULTS Expression ofβ-Catenin in77.89%cases of primary hepato-cellular carcinoma and15%cases of liver cirrhosis was stronger than that in the surrounding normal liver tissue.The positivity rate ofβ-Catenin was higher in poorly differen-tiated carcinoma group than that in well differentiated group（P
0 引言
原发性肝细胞肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制和发病原因至今未明.已有报道，一些细胞因子在正常细胞中异常表达，或正常细胞内不应出现的某些因子反而出现聚集状态，将启动不同的信号转导途径，直接或间接地影响核内某些基因的表达，导致细胞增殖过度，引发肿瘤［1，2］ .
β-连环蛋白（β-Catenin）作为细胞内的一种蛋白质，既是Wnt信号传导途径中关键调控因子，又与细胞间粘附作用有关，而这两种作用与肿瘤发生、发展均有密切关系［3］ .已有报道称在大肠癌、肺癌、肾癌等肿瘤的研究中发现癌细胞胞质内β-Catenin表达增加［4-6］ ，但其在肝癌中的表达及其临床意义的报道在国内还很少.我们应用免疫组织化学方法检测63例原发性肝细胞癌石蜡包埋标本中β-连环蛋白的表达，并探讨其临床意义，为防治提供依据.
1 材料和方法
1.1 材料 1988/2001第四军医大学西京医院普外科手术切除的原发性肝细胞癌病例标本63（男46，女17）例，年龄36～72（平均55）岁.按1991年WHO病理分类标准，肝细胞肝癌63例，其中Ⅰ级14例，Ⅱ级16例，Ⅲ级33例，其中手术时发现肝外淋巴结转移16例.另取肝硬化20例，正常肝组织10例.
1.2 试剂 兔抗人β-catenin多克隆抗体（附阳性对照片）、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均为武汉博士德生物制品公司产品.
1.3 方法 标本均经40g・L-1 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片，分别进行HE染色及免疫组化染色，切片常规脱蜡至水，H2 O
2 灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原，正常山羊血清封闭，分别滴加β-catenin一抗，4°C过夜，滴加生物素化二抗，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片，将β-catenin染色阳性的肝癌组织作为阳性对照，空白对照选择PBS代替一抗.
1.4 βCatenin染色结果判定标准 按肿瘤细胞着色强度及阳性细胞分布范围分为3个等级:全片未见着色或极少量细胞散在着色为（-），胞质和胞膜棕黄色着色为阳性，10%～30%细胞着色但镜下易观察到为（+），大于30%细胞清晰着色为（）.
统计学方法:免疫反应结果及其临床病理参数的关系采用χ2 检验，生存率计采用寿命表法，不同分组间生存率差异使用时序检验.
2 结果
2.1 βCatenin在HCC中表达的临床病理学特点 β-Catenin以膜定位为主，在10例正常肝组织中无1例阳性表达;20例肝硬化组织中仅3例（15%）呈（+），且主要定位于肝细胞膜的接触面和胆小管面，未见肝细胞的血窦面和胞质着色;而63例HCC中有49例（78%）标本β-Catenin呈阳性表达，且36例为（）表达，主要定位于肝癌细胞的外周胞质、血窦面、接触面和腺腔面.胞质β-Catenin阳性着色为点状着色或片状浅着色，胞膜β-Catenin阳性着色为不规则线状或颗粒状着色.在靠近毛细胞胆管腔面和小胆管腔面常见肝癌细胞阳性深着色.β-Catenin的分布呈异质性:有大片细胞广泛表达，小片细胞区域表达，散在表达或大片细胞中仅数个细胞表达（Fig1，2）.肝癌组织和非肝癌组织的β-Catenin表达亦呈异质性:肝癌组织β-Catenin表达为外周胞质点状或片状浅着色，粗大的胞膜不规则线状、点状着色，偶见胞核深染;而非肝癌组织大都阴性表达，或少量的胞膜线状、点状着色.β-Catenin的表达与肿瘤的分化程度呈反比，即分化差时β-Catenin的表达趋于增多.Ⅰ级中（-）8例、（+）表达1例、（）表达5例;Ⅱ级中（-）2例、（+）表达5例、（）表达9例;Ⅲ级中（-）4例、（+）表达7例、（）表达22例.3组比较，差异有显著性（P
2.2 βCatenin与患者AFP水平及预后的关系 β-Catenin的阳性表达与HCC患者AFP水平呈正比，即AFP水平越高者β-Catenin阳性表达越强，AFP400μg・L-1 组分别为3，8，23例.二组之间存在显著性差异（P
3 讨论
HCC的发生、发展是一个多基因参与、多因素影响、牵涉多条信号传导途径的复杂过程.Wnt信号转导途径异常是目前研究肿瘤发生机制的一个热点.而β-Catenin正是这一传导通路的关键调控点［7］ .本实验结果显示，49/63的HCC标本中β-Catenin呈阳性表达，且表达程度与HCC的病理分级、术后存活时间呈负相关，与患者AFP水平，有无淋巴结转移呈正相关.表明β-Catenin在HCC发生、发展过程中的作用不容忽视.β-Catenin被发现是一种与跨膜粘附分子钙粘着素（Cadherin）相连的胞内特异蛋白，以复合体形式存在于各类上皮和某些实质细胞中，介导细胞间连接，近几年研究发现，β-Catenin作为一种关键Wnt蛋白，与APC，GSK-3β复合、解离、胞质积累、入核，作用于核内转录因子TCF/LEF家族，促进基因转录［8-11］ ，或刺激增殖，或抑制凋亡，从而认为β-Catenin是一种癌基因［12］ .其致癌机制可能是发生在氨基端的突变使变异的β-Catenin大量积累而激活了转录因子.Yi等［13］ 报道β-Catenin/APC介导的Wnt途径的突变占肝癌发生的30%.关于癌细胞胞质内β-Catenin表达增加的原因，目前的看法主要是其降解减缓，而非生成增加.影响β-Catenin降解的因素有Wnt信号的增强，APC的突变以及β-Catenin本身的突变等.在Rubinfeld等［14］ 对黑色素瘤细胞系的研究中，发现β-Ccatenin的增加主要与其本身的突变有关，β-Catenin突变后可增加其稳定性，使其不被降解.Wnt信号的增强可以抑制APC对β-Catenin的降解作用.此外，也有报道发现，3个大肠癌细胞系中均有β-Catenin表达的增强，认为大肠癌癌细胞的增殖与转化与β-Catenin靶基因的持续转录关系密切，β-Catenin的靶基因可能就是大肠癌的癌基因
［15］ .
本研究结果显示，β-Catenin在肿瘤较靠近血窦、毛细胆管处表达较强，同时与肿瘤病理分级负相关，提示可以将β-Catenin作为分化差、易浸润转移的标志物;β-Catenin表达与AFP表达相关，可以协同原发性肝癌的临床诊断;手术标本中β-Catenin的表达情况可以作为判断患者预后的一个指标.
参考文献
［1］Yang LJ，Wang WL.Expression of Bcl-2and Bax proteins in hepatocellular carcinoma tissue ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2002;23（4）:337-340.
［2］Pennisi E.How a growth control path takes a wrong turn to cancer ［J］.Science，1998;281（5382）:1438-1441.
［3］Resnik E.β-Catenin-one player，two genes ［J］.Nat Genet，1997;16（1）:9-11.
［4］Korinek V，Barker N，Morin PJ，Wichen D，Weger R，Kinzler KW，Vogelstein B，Cleverst H.Constitutive transcriptional ac-tivation by aβ-Catenin-Tcf complex in APC-/-colon carcinoma ［J］.Science，1997;275（5307）:1784-1787.
［5］Cadigan K，Nusse R.Wnt signaling:A common theme in ani-mal development ［J］.Genes Dev，1997;11（3286）:167-172.
［6］Alman BA，Catherine L，pajerski ME，Diaz-Cano S，Wolfe HJ.Increasedβ-Catenin protein and somatic APC mutation in spo-radic aggressive fibromatoses ［J］.Am J Pathol，1997;151（2）:329-334.
［7］Ozawa M，Baribanlt H，Kemler R.The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecute unomorulin associates with three in-dependent proteins structually related in different species ［J］.Eur Mol Biol Org，1989;83（357）:1711-1717.
［8］Beherens J，Kries JP，Kuhl M，Bruhn L，Wedlich D Grosschedl R，Birchmeier W.Functional interaction ofβ-Catenin with the transcription factor LEF-1［J］.Nature，1996;382（6592）:638-642.
［9］Tetsu O，McCormick F.β-Catenin regulates expression of cyclin D1in colon carcinoma cells ［J］.Nature，1999;398（6726）:422-426.
［10］Peifer M.β-Catenin as Oncogene:The smoking Gun ［J］.Sci-ence，1997;275（5307）:1752-1753.
［11］Wang ZL，Wang WL，Guo SP，Zeng JX.Expression of PTEN protein in human hepatocellular carcinoma and its significance ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（20）:1862-1865.
［12］Molenaar M，van de Wetering M，Oosterwegol M，Peterson-Maduro J，Godsave S，Korinek V，Roose J，Destree O，Clevers H.XTcf-3transcripition factor mediatesβ-catenin-induced axis formation in Xenopus embryos ［J］.Cell，1996;86（3）:391-399.
［13］Yi Sun.The molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma ［J］.Foreign Med Sci，2001;21（2）:108-110.
篇9
[关键词] 肺癌; Beclin1; p53; p16
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)07-26-02
Expression of Beclinl,p53 and p16 in Different Stages of Lung Cancer
LI Xiaoyan1 WANG Guiqin2
1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China;2.Teaching and Research Section of Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] ObjectiveTo investigate expression of Beclinl,p53 and p16 in lung cancer tissue of different stages and provide reliable data for early diagnosis of lung cancer and the assessment of its m alignant degree. MethodsWe selected 50 patients with lung cancer from Shanxi Fengyang Hospital between Jan.2009 and Dec.2009. The expression levels of tissue Beclinl,p53 and p16 in different stages of lung cancer were detected and the analysis of variance and LSD-t test were used for their expression and their corresponding stage. ResultsThere were significant differences in the expression levels of Beclinl,p53 and p16 in different stages. ConclusionThe expression levels of Beclin1,p53 and p16 in the tissue of lung cancer in different clinical stages are different. With the increase in staging of lung cancer,the p53 expression level is increased,the p16 expression level is down-regulated and the Beclin1 expression level is decreased.
[Key words]Lung cancer; Beclin1; p53; p16
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。多数患者在确诊时已失去根治的机会,早期发现和诊断肺癌及其恶性度的评估对其治疗和预后都有重要意义。肺癌早期诊断与恶性度评估分子标志物的筛选是临床肿瘤工作者亟待解决的课题[1,2]。
自噬现象是一种高度保守的细胞行为,存于所有的物种。研究表明Beclin1是唯一发现的哺乳动物的自噬基因,是自噬的执行者;又是一类新的抑癌基因,只有在双等位染色体都表达时才发挥抑癌作用。Beclin1基因的缺失性突变导致自发性肿瘤发生率提高。Beclin1基因表达异常(减少或缺失)是否为肿瘤细胞早期事件?如果研究结果是肯定的,那么我们可以将其作为早期诊断的指标之一,甚至有可能成为高危人群筛选指标之一。
p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制蛋白,在多种恶性肿瘤中有异常表达。正常状态下,其效应分子的基因产物可防止细胞转化癌变,当发生突变时可成为一个直接的肿瘤基因,在细胞恶性转化中起作用,被认为是早期癌标志。p16蛋白是迄今为止发现的第一个直接控制细胞增殖周期的固有蛋白,通过调节Rb蛋白的活性防止细胞过度增殖。p16蛋白的丢失、突变广泛存在于人类恶性肿瘤中,因此p16蛋白既可作为早期诊断癌变的指标,也可用于评估预后。
本文旨在通过分析处于肺癌各个分期的50例肺癌患者的Beclin1、p53、p16的表达情况,探讨Beclin1、p53、p16与肺癌恶性度的关系,从而为临床诊断、治疗肺癌提供依据[3]。
1 资料与方法
1.1 标本与来源
选择2009年1～12月在山西省汾阳医院就诊的肺癌患者,取肺组织50例(每期10例)。入选条件和排除条件如下:(1)手术切除标本。所有标本均经病理学诊断证实,术前均未接受放、化疗。(2)均经病理确诊为肺癌。(3)另取癌旁正常肺组织(至少距癌边缘3cm)。(4)病理排除合并炎性改变等的可能。
1.2 方法
1.2.1 分组方法 依据1997年UICC公布的肺癌TNM分期,同时结合临床、胸部CT、X线检查将入选病例进行分组:按肿瘤分期0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分为5组,各组年龄、性别等控制情况基本匹配。
1.2.2 实验方法 肺癌及相应癌旁手术标本经10%甲醛固定,石蜡包埋连续切片,苏木精-伊红染色,进行组织病理学观察后,采用PV-9000通用型二步法免疫组化法进行Beclin1、p16和p53基因表达水平的检测。
1.2.3 结果判断 定性:光学显微镜观察Beclin1、p16和p53,阳性着色部位分别为细胞浆和细胞核,呈棕黄色,而阴性细胞不着色而显示复染的蓝色。定量:每张切片随机地在200倍显微镜下取5个视野,录入GD-6多媒体彩色病理图像分析系统,测定Beclin1、p53、p16的积分光密度。
1.3 统计学方法
用SPSS10.0软件包对Beclin1、p53、p16的表达情况与其各自对应的分期分别进行方差分析与LSD-t检验。
2 结果
肺癌分期的五组Beclin1、p53、p16的表达情况差别有统计学意义(P
本研究显示:各期肺癌组织中Beclin1、p53、p16表达的高低与肺癌的临床分期有关联;随肺癌分期的增高,p53表达量增高,p16表达量下调,同时Beclin1表达量降低。见图1。
3 讨论
国内外学者对Beclin1的研究大多集中在宫颈癌等生殖系统肿瘤,对其与肺癌的关系研究很少。对于p53、p16及Beclin1的测定方法大多是RT-PCR法、Western blot等,这些方法只能判断阳性病例而不能定量诊断[4,5]。Beclin1与肺癌相关性的研究目前国内报道较少,与肺癌病理分期相关的研究尚未见报道。
本文通过检测不同分期肺癌组织中Beclin1、p53、p16的表达情况,揭示自噬蛋白与凋亡蛋白在肺癌发生发展中的相互作用,研究三者之间及其与肺癌临床病理分期的关系,为早期诊断肺癌提供理论依据。通过研究了解肺癌发生、发展过程中Beclin1、p53、p16的表达情况,通过对肺癌组织中Beclin1、p53和p16表达的定量分析揭示自噬蛋白与凋亡蛋白在肺癌发生发展中的相互作用,为肿瘤早期诊断提供一条新思路。
[参考文献]
[1] Gorski DJ,Chittaranjan S,Pleasance ED,et al. A SAGE approach to discovery of genes involved in autophagic cell death[J]. Curr Biol,2003,13(4):358-362.
[2] Tan EM,Zhang J. Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system[J]. Immunol Rev,2008,22(5):328-340.
[3] Gadducci A,Ferdeghini M,Buttitta F,et al. Assessment of the prognostic relevance of serum anti-p53 antibodies in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol,1999,72(3):76-81.
[4] Tang R,Ko MC,Wang JY,et al. Humoral response to p53 in human colorectal tumors:a prospective study of 1,209 patients[J]. Int J Cancer,2001,94(13):859-863.
篇10
关键词： S100A2；喉鳞癌；免疫组织化学方法
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 资料 收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年1月至2007年5月行手术切除后经病理学诊断为喉鳞状细胞癌（lscc）的存档蜡块。所有病例术前均行喉部高分辨率CT检查，均未行放化疗治疗。40例喉鳞癌中，男性39例，女性1例,年龄45～71岁，平均61.8岁；病程2～36个月。将病例按年龄、不同分化程度、有无颈淋巴结转移、TNM分期进行分组。年龄以60岁为界，分为两组；按组织病理学分级分为高分化鳞癌22例，中分化鳞癌10例，低分化鳞癌8例；有淋巴结转移22例，无颈淋巴结转移18例；按1997年国际抗癌协会（UICC）制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;将40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜标本作为对照组。
1.1.2 主要实验试剂 兔抗人多克隆S100A2抗体（购于sigma公司），SP免疫组化试剂盒、DAB显色盒购于（北京中杉生物技术有限公司）。
1.1.3 主要实验仪器 轮转式切片机（Leica-RM2035 产于德国），OLYMPUS显微镜（BX-50，日本），CS2002-1恒温干燥箱孵育盒 （重庆四达实验仪器厂），SAYYO低温冰箱-20℃(MDF-330.产于日本），病理图像分析处理系统(GD-8,中国)。
1.2 实验方法 所有样本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4μm。免疫组化染色按试剂盒说明进行，组织切片经脱蜡、水化、微波处理，进行抗原修复，阻断内过氧化物酶30 min ，PBS 冲洗3 次，每次3min，非特异性血清封闭30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水，透明，封片，镜检及摄像。采用预实验反复多次证实均呈阳性的组织切片为阳性对照，空白对照以PBS代替一抗。
1.3 结果判断及资料整理 S100A2阳性结果判定：细胞核或核与胞浆染成黄色或棕黄色或弥漫的棕黄色为阳性细胞；每张切片选择典型部位，随意选5个不同高倍视野(400×)计数，以平均数做最后判定。根据阳性细胞数占视野中总细胞数比例进行判定：阳性细胞数≤10％为阴性结果，阳性细胞数≥ 11%，为阳性结果。切片均经2位病理医生盲法独立计数阅片,两者不一致时重新计数。最后根据免疫组化染色编号，对应的病理号及住院号整理检测结果。
1.4 统计学处理 所得实验数据通过SPSS14.0软件进行统计学分析，检验水准а=0.05。计数资料采用χ2检验对结果进行统计学处理，比较其差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
60例标本全部进入结果分析，S100A2蛋白经免疫组化染色后于细胞核或细胞核与细胞质，出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表现。