七夕表达爱范文
时间：2023-04-06 22:27:45
导语：如何才能写好一篇七夕表达爱，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
【关键词】 黑色素瘤抗原；MAGE-A9；RT-PCR；基因克隆；基因表达
Construction of MAGE-A9 gene prokaryotic expression system and its expression in hepatocellular carcinoma
XU Lu，ZHU Jin，QIU Zhen-ning, et al. Department of Pathology, Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China
【Abstract】
Objective Its to clone human MAGE-A9 cDNA ，to express its recombinant protein in E. coli and to examine the expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens.Methods The cDNA encoding human MAGE-A9 gene was amplified by RT-PCR from human hepatocelluar carcinoma tissue before the MAGE-A9 gene was inserted into plasmids pMD18-T. After sequencing, the MAGE-A9 was cloned into the prokaryotic expression vector pBAD/gIII to construct the recombinant expression vector pBAD/gIII-MAGE-A9 and was transformed into E. coli TOP10．The recombinant MAGE-A9 protein was expressed under induction of L-Arabinose and was purified through Hitrap column. The anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was generated. The expression of MAGE-A9 in hepatocellular carcinoma specimens was examined through ABC assay.Results The sequence of MAGE-A9 was identical to the sequence from GenBank. By affinity column and SDS-PAGE , the purified MAGE-A9 fusion protein displayed a band of Mr 35 000． Anti-MAGE-A9 monoclonal antibody was procuced. We found that MAGE-A9 expressed in the cytoplast of positive cells and MAGE-A9 antigen was detected on 8 cases out of 39 (21%) hepatocellular carcinoma specimens.Conclusion MAGE-A9 antigen was expressed in a fair proportion of hepatocellular carcinoma specimens , these patients might be suitable candidates for immune involving antigen encoded by MAGE-A9 gene.
【Key words】 Melanoma antigen ; MAGE-A9; RT-PCR; Gene cloning; Gene expression
MAGE-A（melanoma antigen A）基因是首先从黑色素瘤中发现的一组肿瘤相关抗原，这类抗原在正常组织中除和胎盘组织外均不表达,但在某些恶性肿瘤组织高度特异性表达,同时它们经MHC-Ⅰ类分子递呈到细胞表面后,可为自体细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 识别［1］,因
而是一种CTL介导的特异性免疫治疗的理想靶分
子［2］。迄今已知MAGE-A基因家族成员达12个，各成员间的同源性较高。而肝细胞癌在我国发病率高，临床疗效及预后均很不理想，近来针对肝细胞癌的免疫治疗成为研究热点。
MAGE-1A9 cDNA 全长945 bp,编码分子量约35 Kd的蛋白产物。本文通过克隆、表达肝细胞癌MAGE-A9基因，制备抗MAGE-A9的单克隆抗体，观察MAGE-A9基因在肝细胞癌中的表达及定位，为进一步进行MAGE-A9基因的功能研究及肝细胞癌的免疫治疗奠定基础。
1 材料和方法
1．1 材料 6～8周龄雌性BALB/c小鼠，购自南京医科大学动物中心。肝细胞癌手术切除新鲜标本1例，取自江苏省肿瘤医院住院患者，液氮保存。肝细胞癌蜡块标本39例，其中38例取自南京医科大学第一附属医院病理科，1例取自江苏省肿瘤医院病理科，男性共36例，女性3例，年龄31～74岁。大肠杆菌菌株TG1及Top10由本实验室保存。质粒pMD18-T购自大连宝生物公司，pBAD/gIII 载体购自美国Invitrogen公司。PCR试剂，ExTaq酶，限制性内切酶EcoR I、Hind III, T4 DNA连接酶,等购自大连宝生物公司； Hitrap镍亲合柱购自美国Amersham公司； ABC免疫组化试剂盒购自美国Vector公司。
1．2 方法
1．2．1 引物设计与合成 根据GenBank中MAGE-A9基因序列设计引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分别引入Hind III 和EcoR I酶切位点,由北京赛百盛公司合成。
1．2．2 肝癌组织总RNA制备及RT-PCR扩增 Trizol一步法提取肝癌组织总RNA，将抽提产物溶于DEPC处理的双蒸水中，以P1和P2为引物作RT-PCR扩增:94 ℃ 4 min预变性，94 ℃ 50 s变性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30个循环，72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1．2．3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化, 将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆重组, 连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,蓝白斑筛选阳性克隆, PCR初步鉴定阳性克隆后,进行DNA 序列分析。碱裂解法提取阳性重组体pMD18-T- MAGE-A9质粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切产物与同样酶切的表达载体pBAD/gIII用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,氨苄平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定阳性克隆,所得重组质粒命名为pBAD/gIII-MAGE-A9。
1．2．4 MAGE-A9基因的诱导表达及纯化 取1μl质粒pBAD/gIII-M9转化感受态大肠杆菌Top10, 氨苄平板筛选. 挑取单个阳性克隆培养至A600 nm=0．5,加入左旋阿拉伯糖(终浓度为0．002%)，于37 ℃
剧烈震荡诱导表达4 h后收菌,PBS 重悬,超声裂解,低温离心,取上清。表达产物经超声破碎,离心，上清经Hitrap镍亲和柱吸附, 样品过柱, 以含有0．2、0．3、0．4和0．5 M咪唑的洗脱液依次洗柱，收集纯化液, 行12％SDS-PAGE电泳，分析最佳的咪唑洗脱浓度。
1．2．5 单抗制备 常规杂交瘤法制备单抗。腹腔注射100 μg MAGE-A9蛋白纯化产物免疫BALB/c小鼠，对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞和免疫小鼠的脾细胞按常规PEG方法融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA法检测杂交瘤培养上清,阳性细胞连续亚克隆,直至阳性率达到100%，确定为稳定的细胞株。
1．2．6 免疫组化 肝细胞癌石蜡切片4～5 μm，常规乙醇脱蜡至水，0．01%柠檬酸盐缓冲液微波修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，2%二抗动物（马）血清封闭,以本实验制备的抗MAGE-A9杂交瘤细胞培养上清为一抗，常规ABC法染色，DAB显色。以PBS代替一抗作为空白对照。
2 结果
2．1 RT-PCR扩增MAGE-A9基因 采用RT-PCR从人肝细胞癌组织中扩增目的基因,产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大小约945 bp 的条带，见图1,与945 bp的MAGE-A9基因目的片段大小一致。
注：1:MAGE-A9;2:DL2 000 Marker
图1
MAGE-A9基因RT-PCR扩增结果
2．2 MAGE-A9基因克隆载体的构建 将PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆，获得pMD18-T-MAGE-A9重组体，见图2，经蓝／白斑筛选和菌液PCR初步鉴定结果正确。DNA 序列分析表明质粒为MAGE-A9基因的克隆,序列与GenBank 报道序列完全一致。MAGE-A9基因与原核分泌型表达载体pBAD/gIII经EcoR I＋Hind III双酶切后连接，构建MAGE-A9基因的原核分泌型表达系统pBAD/gIII-MAGE-A9。
注：1: DL15 000 Marker; 2: DL2 000 Marker;3: pMD18-T-MAGE-A9;4: pBAD/gIII-MAGE-A9
图2
pMD18-T-MAGE-A9及pBAD/gIII-MAGE-A9重组质粒酶切鉴定图谱
2．3 MAGE-A9 蛋白的诱导表达和纯化 菌体经左旋阿拉伯糖诱导，冰冻超声裂解离心后，取上清行SDS-PAGE，结果见图3，与空载菌对比，在分子量约35 Kd的位置有明显表达条带，符合MAGE-A9基因945 bp片段编码315个氨基酸的蛋白分子质量。用HiTrap镍亲和柱纯化带有(His)6尾的重组蛋白，洗脱液咪唑浓度从0．2～0．5 M，纯化液行12％SDS-PAGE电泳。洗脱最佳咪唑浓度为0．4 M。
注：1-4:纯化的MAGE-A9（纯化咪唑浓度从0．2~0．5 M）；5:Marker；6:空载细菌；7:诱导表达的菌体蛋白
图3
SDS-PAGE 鉴定MAGE-A9蛋白的表达和纯化
2．4 抗MAGE-A9单克隆抗体的制备和鉴定 间接ELISA法检测杂交瘤培养上清，经3次亚克隆，阳性率达100%。Western blot法检测单抗与MAGE-A9的结合，结果 见图4。
注：1：细菌空载； 2:MAGE-A9 protein;3: Marker
图4
Western blotting 鉴定MAGE-A9 单抗
2．5 MAGE-A9在肝癌组织的定位观察 阳性表达表现为癌细胞胞浆被染成棕红色 见图5，非癌肝细胞未着色。39例肝细胞癌，阳性表达8例，阴性31例，阳性表达率为21%。MAGE-A9基因的表达与部分临床指标的关系见表1。
注：左图为阳性癌细胞胞浆染成棕褐色，右图为非肝癌细胞未着色
图5
肝细胞癌MAGE-A9基因表达产物定位观察。（DAB显色， 400×）
注：采用u检验进行统计学分析,P>0．05;MAGE-A9的表达与患者年龄、性别、肿瘤大小及分化程度无相关性
3 讨论
寻找合适的肿瘤抗原一直是肿瘤免疫治疗的难题。自20世纪50年代以来，科研工作者陆续在以黑色素瘤为主的多种肿瘤中发现了一些肿瘤相关抗原，从而成为肿瘤免疫治疗的基础。应用MAGE-A1基因作为疫苗应用于肿瘤治疗的探索性研究较多:
①用MAGE-A1抗原肽疫苗诱导扩增特异性CTL进行过继免疫治疗［2］；②用人工合成的MAGE-A1抗原肽脉冲处理树突状细胞(DC)或用MAGE-A1基因修饰的DC制成DC疫苗,对肿瘤患者进行免疫治疗［3］。而继MAGE-A1基因第一个从黑色素瘤细胞克隆后,目前已发现12个MAGE-A成员并形成一个家族。由于MAGE-A抗原为许多肿瘤所共有,并具有严格的肿瘤表达特异性,因此MAGE-A
家族分子被视为肿瘤免疫治疗的理想靶点［1］。
MAGE-A9是MAGE-A亚家族成员, 由于MAGE-A家族中的部分基因已成为良好的肿瘤靶基因，同时MAGE-A家族基因之间有较高的同源性，故MAGE-A9有可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。因此, 对MAGE-A9基因进行克隆、表达,制备特异性单抗，明确其在肝癌中表达及定位，这不但有助于对MAGE-A9基因功能的研究，对肝癌的免疫治疗也具有重要意义。
本研究利用RT-PCR 方法,从人肝癌组织中克隆出目的基因全长片段,构建了原核表达载体pBAD/gIII-MAGE-A9，通过细胞融合技术，制备了一株抗MAGE-A9分子的单克隆抗体，证实可与MAGE-A9分子特异性结合。在以往研究中，由于缺乏特异性单抗，很多肿瘤因子的表达都是基因水平的研究，关于MAGE-A9在肿瘤中的表达研究也不例外［4］，包括MAGE-A9在食管腺癌相关的Barrett食道中过表达［5］，在皮肤T细胞淋巴瘤阳性表达率27%［6］。但基因与蛋白水平的表达并不完全一致，更重要的是，肿瘤免疫治疗是以抗原的确切定位为基础的。本文在制备了抗MAGE-A9单克隆抗体的基础上，应用免疫组化技术，首次证实MAGE-A9抗原在肝癌癌细胞中主要表达在胞浆，未见同一标本中部分肿瘤细胞MAGE-A9抗原阳性而另一部分肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阴性的情况,只是见标本中全部肿瘤细胞MAGE-A9 抗原阳性或全部阴性，这提示,选用MAGE-A9 基因产物作为靶分子对阳性患者进行免疫治疗有可能对全部的肿瘤细胞都产生杀伤效应。本实验结果经统计学分析，认为MAGE-A9在肝癌中的表达于患者年龄、性别、肿瘤大小和分化程度没有相关性，与赵海涛等检测MAGE-A10在肝癌中的表达与临床病理未见相关性的结果相一致［8］。本实验阳性表达率为21%（8/39），相比MAGE-A1、MAGE-A10等其他MAGE-A家族抗原在肝癌中超过50%［7，8］的表达偏低，可能与以下几方面原因有关：①以往研究以RT-PCR法检测基因表达居多，而本实验采用的是免疫组化法，在方法上可能会存在差异；②肝癌标本代表性不足，本实验标本数量不多，均为肝癌原发灶标本，未涉及肝癌转移灶，且多为中等分化程度的，分化程度较高和较低的肝癌标本基本未包括，亦未收集到不伴慢性肝炎的肝细胞癌标本。今后的研究需扩大样本，同时检测MAGE-A9在常用的人肝癌细胞株（如SMMC-7721、BEL-7402、HepG2等）中的表达情况。
参考文献
1 Zendman AJ , Ruiter DJ , VanMuijen GN. Cancer/ testis-1associatedgenes : identification , expression profile , and putative function. Cell Physiol，2003，194(3):272 -288．
2 Toso JF , Oei C , Oshidari F , et al . MAGE-1- specific precursor cytotoxic T-lymphocytes from a patient with breast cancer : characterization and antigen-specific activation .Cancer Res，1996，56(1)：16.
3 Gillespie AM, Coleman RE. The potential of melanoma antigen expression in cancer therapy .Cancer Treat Rev，1999，25(4)：219-227．
4 王道荣，陈国玉，等.胃癌患者外周血和骨髓血中CD44v6基因表达与胃癌微转移的研究.南京医科大学学报（自然科学版），2004，24（6）：638-640，653．
5 Lin J, Lin L, Thomas DG, et al . Melanoma-associated antigens in esophageal adenocarcinoma: identification of novel MAGE-A10 splice variants． ClinCancer Res，2004，10(17):5708-5716．
6 Eichmuller S, Usener D, Thiel D, et al .Tumor-specific antigens in cutaneous T-cell lymphoma: expression and sero-reactivity.Int J Cancer，2003，104(4):482-487．
7 蔡胜利,陈红松,等.恶性黑色素瘤抗原编码基因MAGE-1在肝细胞肝癌中表达的研究. 中华普通外科杂志，1999，14（3）229-230．
篇2
【关键词】皮肤鳞状细胞癌;细胞周期蛋白;cyclin E;表达
【中图分类号】R739.5 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0007-01
2005年2月到2009年4月采用免疫组织化学法观察32例皮肤鳞状细胞癌中Cyclin E的表达,并进行相关性分析,探讨其在皮肤鳞状细胞癌是表达异常的意义及其与皮肤生物学行为的关系。
1 临床资料
1.1 一般资料:皮肤鳞状细胞癌标本为我院2005年2月到2009年4月经病理确诊存档的32例石蜡包埋组织(观察组),其中男26例,女6例,年龄40-90岁,平均年龄(54.5±12.5)岁。皮损部位:头面部10例,下唇部1例,躯干部5例,下肢5例,会10例,足部1例。病理分级按WHO标准,I级7例,Ⅱ级15例,Ⅲ级10例。对照组为外科手术中剔除的32例正常皮肤组织。
1.2 免疫组织化学染色
1.2.1 试剂及仪器。一抗:鼠抗人Cyclin E单克隆抗体,免疫组织化学SP试剂盒(生工生物工程公司,武汉)。
1.2.2 染色方法:石蜡切片常规脱蜡水化后,经高压锅热处理修复抗原,4% H2O2阻断内源性过氧化物酶,蒸馏水洗,10%正常羊血清封闭20min,滴加PBS稀释的Cyciin E工作液,室温2h,PBS洗3次,再分别加鼠抗人Cyclin E单克隆抗体及SABC复合物室温各孵育30min,两次孵育后均用PBS洗3次;DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。
1.3 结果观察及判定标准:Cyclin E蛋白阳性表达表现为细胞核出现棕褐色或棕黄色颗粒。在高倍镜下取5-8个视野观察,计数500个以上细胞并计算Cyclin E阳性细胞百分率,以Cyclin E阳性表达细胞数>5%为Cyclin E蛋白过表达。Cyclin E蛋白免疫组织化学结果均经重复染色一次印证,两位独立观察者分别观察计数并取均值。
1.4 统计方法:实验数据用SPSS15.0程序进行统计学处理。计量资料用均数±标准误(x±S>x),若是正态分布,用方差分析,组间、组内比较;若是非正态分布,用秩和检验。以P
2 结果
在对照组皮肤细胞核内未见阳性表达;在观察组鳞癌组织中表达定位于细胞核,呈棕黄色,阳性染色细胞散在分布于表皮组织中。Cyclin E在鳞癌组织中阳性表达较正常人对照组高,两者差异有统计学意义(P
3 讨论
当前细胞周期中存在几个重要关卡(checkpoint),并受一些细胞周期蛋白调控,当控制这些关卡的基因异常表达细胞周期调控蛋白时,可造成基因组不稳或静止的细胞越过这些关卡,引起细胞周期失控,导致细胞过度增殖。 G1向S转变是细胞周期主要调控点之一,目前发现G1期的调节因子与癌变关系最密切。细胞周期调控涉及细胞周期蛋白(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI),以CDK的活性表达与调控为主。已证实,作为一种细胞周期正向调节因子的细胞周期蛋白E(Cyclin E)是一种癌基因, Cyclin E的正调控在肿瘤的发生发展过程中起关键作用。Cyclin E表达在G1晚期达高峰,是G1/S期转换的限速因子,其过度表达可加速细胞进入S期,导致细胞无限制增殖,并进一步引起肿瘤的发生发展。CyclinE是1991年美国的研究小组在筛选人cDNA文库中发现的。由4个外显子3个内含子组成,转录2.2 kb的mRNA,编码395个氨基酸的蛋白质,分子质量50ku。Cyclin E的合成在G1晚期达高峰,继CyclinD后被活化,然后经与PEST序列有关的蛋白水解或泛素路径降解而迅速下降。因此,CyclinE主要在G1晚期发挥正性调控细胞周期的作用。
Mullerw等研究表明在一大部分早期NSCLC患者中Cyclin E的mRNA水平升高。Geng等研究了87例乳腺癌患者,其中21例有Cyclin E mRNA的高表达,约占24%,雌激素受体阳性及阴性的频率大致相当。一大部分Cyclin E过表达的人乳腺癌同时过表达周期蛋白E mRNA。Payton等发现肺癌和乳腺癌患者原发肿瘤Cyclin E的表达升高。肺神经内分泌癌Cyclin E2信号最强,其次是乳腺浸润性导管癌。雌激素受体缺乏的乳腺肿瘤更容易引起Cyclin E升高,提示Cyclin E可能导致乳腺肿瘤发病机理的解偶联。本组正常皮肤组织cyclin E无表达,皮肤鳞状细胞癌组织cyclin E阳性表达,且在复发肿瘤中及随病理分级升高而升高。表明在皮肤鳞状细胞癌发生的早期,cyclin E阳性表达逐渐增高,但仅为量变,故其阳性表达与病理分型、临床分期、淋巴结转移、颅神经侵犯无关;当其阳性表达增至最高点,由量变发生质变,细胞进入S期,瘤细胞进入无限增殖期。cyclin E阳性表达在鼻咽癌患者中的3年生存率差异有显著性,表明其在判断鼻咽癌预后中有参考价值。
总之,细胞周期调节失控是肿瘤发生发展的重要机制,其中Cyclin E的正调控在此过程中起关键作用。随着对Cyclin E作用机理的深入研究,将为进一步阐明皮肤鳞状细胞癌的发病机制带来曙光,并为皮肤鳞状细胞癌的治疗和预防提供新的靶点。
参考文献
[1] 陈意生.肿瘤分子细胞生物学[M].北京:人民军医出版社,2002
[2] 曲才杰,史同新,林桂铭.p27和细胞周期蛋白E在Bowen病及皮肤鳞状细胞癌中的表达[J].中华皮肤科杂志,2006,53(2):71-72
[3] 郭建华,李玲香.Cyclin E与恶性肿瘤[J].肿瘤研究与临床,2003(1):68-71
[4] 黄剑飞,顾美珍,咸华,等.细胞周期素E、D1与增殖细胞核抗原在肝癌中的表达及临床意义[J].江苏医药,2006(3):212-213
篇3
【关键词】 IgG； 肝癌； 临床病理学指标； 原位杂交； 免疫组织化学
【Abstract】 Objective：To investigate the expression and distribution of IgG in human liver cancer cells and its correlation with clinicopathological factors of hepatocellular carcinoma.Method：Fresh and paraffin-embedded tissues from 60 cases of HCC tumor with the matched normal liver specimens were detected by two-step immunohistochemistry and in situ hybridization for the expression of IgG protein and mRNA respectively. The relationship between cancer-derived IgG expression and 9 clinicopathological factors were analyzed statistically.Result：Signals of IgG protein in hepatocellular carcinoma cancer cells was significantly stronger than that in its corresponding normal tissues （P=0.001）； the over-expression of IgG was negatively correlated with several clinicopathological factors such as tumor differentiation grade and pTNM （r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）， and positively associated with AFP concentration in serum （r=0.336，P=0.009）. However， no correlationship with age， gender， capsular infiltration，tumor size， tumor quantity and recurrence or metastasis of the disease within 1 year was found （P>0.05）. Conclusion：Liver-cancer-derived IgG may has a profound impact on the differentiation and pTNM staging of liver cancer cell， and might be served as a tumour marker to help pathological diagnosis and evaluate the prognosis for patients.
【Key words】 IgG； Liver cancer； Clinical pathological factors； In situ hybridization； Immunohistochemistry
First-author’s address：Weifang Medicial University，Weifang 261053，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.008
近来多项研究证明，乳腺癌、大肠癌、胃癌和肺癌等源于上皮的恶性肿瘤细胞可以产生IgG[1-6]。邱晓彦等[4]最早发现Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤的分化有关；依据肿瘤的分化程度不同，Ig样蛋白的表达水平也不同，即分化程度越高，表达强度越低，并证实该Ig样蛋白为IgG；叶雪等[7]发现在恶性卵巢上皮性癌中IgG的表达强度明显高于正常卵巢，IgG的表达水平与卵巢癌的临床分期和病理分级无相关性；李浩勇等[6]对膀胱癌研究发现：膀胱癌细胞能够表达IgG，其抗体体外对膀胱肿瘤细胞的生长具有一定的抑制作用，且具有促进癌细胞凋亡的效应；Niu等[8]研究了IgG的表达与结直肠癌的生物学指标和临床病理学指标的关系，通过siRNA干扰下调IgG的表达，可以抑制结直肠癌细胞（LOVO细胞）的增殖、克隆形成和侵袭能力，提示肿瘤源性IgG具有促进肿瘤生长，转移的作用。肝癌亦属于上皮性恶性肿瘤，但是目前对于IgG在肝癌组织中的表达与分布情况及其与临床病理学指标的关系的研究尚未有报道。本实验采用免疫组化技术和原位杂交技术检测肝癌组织中IgG的表达情况，进而分析其表达水平和肝细胞肝癌9项临床病理学指标的关系，以期为肝细胞肝癌的诊断、治疗和预后评估提供新的方法和思路。
1 材料与方法
1.1 材料来源 收集潍坊医学院附属医院和潍坊市民医院2010-2012年手术切除的肝癌标本60例，其中男40例，女20例，平均年龄45岁，患者术前均未采取任何治疗措施。所有肝癌病例随访12～18个月。本实验经潍坊医学院伦理委员会批准，并获得患者的书面许可。所有新鲜标本均经4%多聚甲醛/PBS固定，石蜡包埋，连续4 μm厚度切片。
1.2 免疫组化方法 采用PV-9000两步法（试剂盒购自美国Zymed公司）进行免疫组化检测。切片常规脱蜡，入水，枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，经3%过氧化氢37 ℃孵育20 min后，滴加小鼠抗人IgG单克隆抗体（1：1000，购自美国sigma公司），4 ℃湿盒过夜，滴加试剂1（聚合物辅助剂），37 ℃孵育30 min，滴加试剂2（辣根过氧化素）标记二抗，37 ℃孵育30 min。各步骤之间均是PBS冲洗3次，每次5 min。AEC显色，苏木素复染，甘油明胶封片。以手术切除的扁桃体组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 原位杂交方法 切片二甲苯脱蜡，乙醇梯度透明至PBS反复冲洗，酶消化，经预杂交，滴 50μL含探针的杂交液，45 ℃保温，20 h。将切片浸泡于5×SSC（37 ℃）中，后依次经5%甲酰胺2×SSC（37 ℃）清洗15 min。PBS Buffer Ⅰ漂洗一次后，滴加50 μL马血清封闭液，置湿暗盒中室温1 h。后滴加Anti-Dig-Ab（1∶100，购自瑞士roche公司），室温1 h后BufferⅠ、Ⅱ液依次漂洗数次，NBT-BCIP显色。以结肠黏膜下孤立淋巴结作为阳性对照，以IgG正义探针代替反义探针作为阴性对照。
1.4 免疫组织化学结果评分 采用双盲法，由3位病理学教授在400×的显微放大倍数下随机对染色切片独立评分，所得平均分作为最终结果。评分标准如下：（1）阳性细胞数所占比例：小于5%为0，5%～25%为1，25%～50%为2，大于50%为3；（2）染色强度：未着色为0，淡红色或粉红色为1，红色为2，深红色为3。两项测量标准得分之和为0～3分的切片标记为弱染色，阴性；4～6分的切片标记为强染色，阳性。
1.5 统计学处理 采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行处理，计数资料比较采用Pearson 字2及Fisher确切概率法检验分析，评估IgG的表达情况与临床病理学参数（年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤个数、肿瘤分化程度、AFP浓度、pTNM分期、1年内是否复发或转移）之间的相关性。以P
2 结果
2.1 IgG蛋白在肝癌组织的表达及免疫组化检测结果 经免疫组化检测结果显示60例肝癌组织的IgG蛋白阳性率为85.00%（51/60），癌周正常肝组织的阳性率为6.67%（4/60），两者比较差异有统计学意义（P=0.001）。IgG蛋白阳性染色主要定位于肝癌细胞胞浆和胞膜。
2.2 IgG mRNA在肝癌组织的表达及原位杂交结果 IgG mRNA阳性信号位于肝细胞肝癌细胞胞浆，为蓝紫色，呈颗粒状，与免疫组化结果具有良好的一致性，从mRNA水平证实了肝细胞肝癌组织自身具有产生IgG的能力。
2.3 IgG在肝癌组织中的表达和临床病理学指标的关系 IgG的异常高表达与肝细胞肝癌分化程度和pTNM分期呈负相关（r=-0.357，P=0.005；r=-0.296，P=0.021）；与血浆AFP浓度呈正相关（r=0.336，P=0.009）；与年龄、性别、肿瘤包膜完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发与转移无相关性（P>0.05），见表1。
3 讨论
免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）是体内免疫球蛋白家族中含量最高的一种，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。经典免疫学理论认为IgG仅可由B淋巴细胞经成熟分化过程才能够特异性合成并分泌。近年来多项研究发现IgG在其他多种上皮性恶性肿瘤组织和细胞系中也存在异常高表达的现象[1-2，5，7-8]。Niu等[8]最近发现IgG在结直肠癌组织中和CRC细胞中高度表达，而且此高度表达与肿瘤的分期、淋巴结转移和炎性细胞浸润有密切的关系，提示肿瘤源性IgG可能对肿瘤的发生发展有重要影响。有研究显示在肝细胞肝癌患者的血浆中和肝癌细胞系（BCL-7402）中均可检测到IgG的含量异常增高[2，5，9]。但是在肝癌组织中的表达情况未有报道，肝癌细胞所分泌的IgG的功能未知，其表达和癌症的临床病理学指标的关系也有待于研究。
在本项研究中，笔者分别从蛋白质水平和mRNA水平证明了肝癌组织可以产生IgG。IgG在肝癌中的高表达（85.00%）与肿瘤的分化程度和pTNM分期呈负相关，IgG在分化较差（低分化或未分化）或在处于pTNM Ⅲ～Ⅳ期的肝细胞肝癌组织中的表达比在分化较好（中分化或高分化）或在处于pTNM Ⅰ～Ⅱ期的肝细胞肝癌组织中更为明显；IgG的高表达与血浆AFP浓度呈正相关，与年龄、性别、肿瘤包膜的完整性、肿瘤大小、肿瘤个数和一年内是否复发或转移无相关性。实验结果提示肿瘤源性IgG可能与肿瘤生长有关。免疫球蛋白能促进肿瘤生长的现象已有报道，这主要与“抗癌抗体”阻断癌细胞表面的靶表位有关[10-13]。Taylor等[14]在研究卵巢癌中发现异常糖基化的免疫球蛋白分子不能诱导免疫应答。此外，免疫球蛋白重链，T淋巴细胞受体（例如：TCR-a，TCR-b），免疫球蛋白样黏附分子（例如：CD47，CD54）均可在癌细胞中表达[15]。免疫球蛋白抗体和T淋巴细胞受体可启动补体依赖的细胞毒作用，致使癌细胞凋亡。所以免疫蛋白超家族对于肿瘤细胞可能具有自身保护作用，并与癌细胞的增殖有关。邱晓彦等[4]早期研究了3例肝癌组织，其分化程度均为中度，研究结果显示肝癌细胞中Ig蛋白均具有很高的表达量，因此认为在肝癌组织中IgG的表达程度与肿瘤的分化无相关性。而本研究提示IgG在肝癌中的异常表达与肿瘤的分化程度呈负相关。这种差异可能由于样本量大小不同造成。
甲胎蛋白（AFP）是分子量为64 000～70 000道尔顿的一种糖蛋白，主要由肝细胞粗面内质网上的核糖体合成，是胎儿成长发育的重要蛋白，具有保护胚胎不受母体排斥的作用。AFP在出生后立即消失，若再次出现则提示肝癌或生殖胚胎癌，因此AFP是肝癌诊断、治疗和预后判断的重要指标。贾户亮等[16]分析肿瘤数目、大小和pTNM分期不同的肝细胞肝癌的患者血清AFP水平显示，AFP水平的高低与肿瘤的大小、数目和pTNM分期均呈正相关，其中pTNM Ⅰ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期以及pTNM Ⅱ期与pTNM Ⅲ～Ⅳ期肝细胞肝癌患者血清AFP水平具有显著的差异。
本实验结果表明，血清AFP水平较高（>400 μg/L）
的肝细胞肝癌患者组的IgG阳性表达率（92.8%，39/42），比血清AFP水平较低（≤400 μg/L）的肝细胞肝癌患者（66.7%，12/18）组显著增高，与先前文献报道结果一致。尽管血清AFP含量水平对肝癌的早期诊断有重要意义，但是并非所有AFP升高都可以断定为肝癌，而且并非所有血清AFP含量水平正常就能排除肝癌的可能。在肝炎、肝硬化活动灶等疾病中亦可检测到高水平含量的血清AFP，因此仅仅根据血清AFP浓度来对肝细胞肝癌进行早期诊断是不够准确的[17-18]。所以联合肿瘤源性IgG表达水平的检测可提高阳性检出率，降低漏诊率和误诊。
综上所述，在肝癌组织中IgG表达显著增高，IgG的表达水平与肿瘤的分化、分期有着密切的关系。这可为以后的肝癌的早期诊断和分期判断提供了又一重要指标。研究IgG的表达与肿瘤的生长分化的关系，有助于为肿瘤的免疫治疗提供理想的理论依据，但是对于其功能与分子机制的关系有待于进一步研究。
参考文献
[1]汪涣，张叔人，何祖根，等.免疫球蛋白样物质在上皮来源的恶性肿瘤中的表达[J].中国肿瘤临床，2001，28（12）：169-171.
[2]邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内存在免疫球蛋白样物质[J].白求恩医科大学学报，1996，22（5）：572-575.
[3]邱晓彦，杨贵贞.恶性肿瘤细胞内呈现Ig样物质的特性及其基因结构分析[J].中国免疫学杂志，1996，5（12）：296.
[4]邱晓彦，侯春梅，李秀森，等.Ig样蛋白的表达与恶性肿瘤分化及增殖细胞核抗原的相关性分析[J].军事医学科学院院刊，1999，23（1）：16-18.
[5]邱晓彦，侯春梅，李秀森，等.多种肿瘤传代细胞中Ig样物质存在与检测[J].癌症，1999，18（11）：180-181，184.
[6]李浩勇，梁培育，朱孝峰，等.免疫球蛋白G在膀胱癌细胞中的表达及其抗体诱导肿瘤细胞凋亡的研究[J].中国生理病理杂志，2007，23（6）：1068-1073.
[7]叶雪，郭慧方，昌晓红，等.免疫球蛋白IgG在卵巢上皮性癌的表达[J].中国妇产科临床杂志，2007，8（2）：192-194.
[8] Niu N，Zhang J，Huang T，et al.IgG expression in human colorectal cancer and its relationship to cancer cell behaviors [J].Plos One，2012，7（11）：e47 362.
[9] Olubuyide I O，Salimonu L S，Adeniran S O.Soluble immune complexes and immunoglobulin （IgG， IgA and IgM） levels in Nigerians with primary liver cell carcinoma[J].African Journal of Medicine and Medical Sciences，1993，22（4）：57.
[10] Schreiber H，Wu T H，Nachman J，et al.Immunological enhancement of primary tumor development and its prevention[C].Seminars in Cancer Biology，Academic Press，2000，10（5）：351-357.
[11] Prehn R T.Stimulatory effects of immune reactions upon the growths of untransplanted tumors[J].Cancer Research，1994，54（4）：908-914.
[12] Manson L A.Anti-tumor immune responses of the tumor-bearing host： the case for antibody-mediated immunologic enhancement[J].Clinical Immunology and Immunopathology，1994，72（1）：1-8.
[13] Sj?gren H O，Hellstr?m I，Bansal S C，et al.Suggestive evidence that the "blocking antibodies" of tumor-bearing individuals may be antigen-antibody complexes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，1971，68（6）：1372-1375.
[14] Taylor D D，Gercel-Taylor C.Tumor-reactive immunoglobulins in ovarian cancer： diagnostic and therapeutic significance？（review）[J].Oncology Reports，1998，5（6）：1519.
[15] Lee G，Zhu M，Ge B，et al.Widespread expressions of immunoglobulin superfamily proteins in cancer cells[J].Cancer Immunol Immunother，2012，61（1）：89-99.
[16]贾户亮，刑戌健，叶青海.甲胎蛋白在原发性肝癌临床诊断中的应用[J].中国医学科学院学报，2008，30（4）：440-443.
[17]赵恒，廖静，刘瑜.甲胎蛋白与肝癌[J].临床肝胆病杂志，2008，24（5）：385-387.
篇4
[关键词] T细胞共刺激分子；T细胞亚群；胃癌；大肠癌
[中图分类号] R735 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2017）02（a）-0003-03
[Abstract] Objective To discuss and analyze the significance of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups in the expression of gastric carcinoma and colorectal cancer tissues. Methods 41 cases of patients with gastric carcinoma and 39 cases of patients with colorectal cancer treated in our hospital from September 2014 to October 2016 were selected as the research objects and the patients with gastric carcinoma were selected as the group A， while the patients with colorectal cancer were selected as the group B， and 33 cases of healthy persons at the same period were selected as the group C， and the admission persons were tested by the Flow cytometry， and test results of T cell co-stimulatory molecules and their subgroups of the three groups were compared. Results The T cell co-stimulatory molecule CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（25.81±10.55），（28.94±9.28）% vs （0.81±0.97）%]， and T cell CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C[（53.62±13.83），（55.95±10.67）% vs （72.06±7.82）%]，the T cell CD4+CD3+ level in the group A and group B was lower than that in the group C[（29.83±9.72），（33.74±9.03）% vs （38.78±5.07）%]， the T cell CD8+CD28+CD3+ level in the group A and group B was higher than that in the group C， [（1.58±1.98）%，1.92±2.62）% vs（0.04±0.03）%]，the T cell CD8+CD28-CD3+ and CD4/CD8 levels in the group A was lower than that in the group C[（16.07±6.95）， （1.15±0.54）%vs （20.55±6.55），（1.35±0.32）%]， and the T cell CD4+CD25+CD3+ level in the group B was higher than that in the group C[（19.75±6.88）% vs （13.71±3.07）%]， and the difference had statistical significance（P0.05）. Conclusion The T cell number of patients with gastric carcinoma and colorectal cancer obviously decreases， but the expression of CD28 increases， and CD4+T cell number of patients with gastric carcinoma obviously decreases， but the regulatory T cell number of patients with colorectal cancer obviously increases.
[Key words] T cell co-stimulatory molecules； T cell subgroup； Gastric carcinoma； Colorectal cancer
临床上，肿瘤发生、发展同抗肿瘤免疫存在一定的联系，抗肿瘤免疫的机理目前主要有肿瘤细胞免疫逃逸学以及免疫监视学[1-3]。为了探讨和分析T细胞共刺激分子及其亚群在胃癌和大肠癌组织中表达的意义，该次研究方便选择该院于2014年9月―2016年10月期间收治的41例胃癌患者和39例大肠癌患者作为研究主体，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
该次研究选择该院收治的41例胃癌患者和39例大肠癌患者作为研究主体，胃癌患者为甲组，大肠癌患者为乙组，选择同期进行检测的33名健康人作为丙组。其中甲组患者男性为23例，女性为18例；年龄在43～79岁之间，平均为（59.61±3.15）岁。乙组患者男性为22例，女性为17例；年龄在42～78岁之间，平均为（59.31±3.24）岁。丙组中男性为19名，女性为14名；年龄在41～79岁之间，平均为（58.68±3.61）岁。甲乙丙3组上述资料差异无统计学意义（P>0.05），可对比。
1.2 方法
在术前和术后1周对甲乙两组患者进行外周静脉血抽取，抽取量为2 mL，行ETDA3K抗凝。丙组抽取2 mL的外周静脉血抽取，行ETDA3K抗凝，在室温下进行保存，检测要在18 h之内完成。
取100 μL的血样全血分别加入荧光标记的CD3-Pc5、CD4-FITC、CD8-PE、CD25-PE、CD28-FITC单抗和相应同型对照，在室温下行避光孵育，时间为25 min左右，之后加入0.5 mL的溶血剂，作用时间为30 min，加入PBS直到0.5 mL。在混合均匀后通过流式细胞仪进行检测，在检测前行荧光微球矫正，保证机器的误差
1.3 观察指标
观察并记录3组的检测结果。
1.4 统计方法
通过SPSS 20.0统计学软件对此次研究数据进行处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并采用 t 检验，以 P
2 结果
甲乙两组T细胞共刺激分子CD28+CD3+水平高于丙组，甲乙两组T细胞CD3+水平低于丙组，甲乙两组T细胞CD4+CD3+水平低于丙组，甲乙两组T细胞CD8+CD28+CD3+水平高于丙组，甲组T细胞CD8+CD28-CD3+以及CD4/CD8水平低于丙组，乙组T细胞CD4+CD25+CD3+水平高于丙组，差异有统计学意义（P0.05），见表1、表2。
3 讨论
T细胞、巨噬细胞以及NK细胞是机体抗肿瘤免疫主要效应细胞，而CD4+T细胞能调节和活化上述细胞抗肿瘤效应。Ts细胞（CD8+CD28-CD3+）组织抗原的呈递，并可阻断Th细胞功能。T细胞的完全活化是CD28共刺激活化，CD8+CD3-细胞的亚群参与到了肿瘤细胞的免疫反应中，同机体的带瘤状态存在一定关系[4-7]。此次研究结果表明，甲乙两组CD3+、CD4+以及CD8+等T细胞亚群的表达都明显降低，尤其是甲组CD4+降低最为明显，所以无法发挥出正常抗肿瘤的作用；丙组的CD28表达比较微弱，甲乙两组增高明显。甲乙两组的CD4+、CD8+表达升高，差异有统计学意义。甲乙两组的CD8+、CD3-较术前有所增加，但同丙组对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。这同傅冷西等[8]的研究结果： CD28+CD3+表达：胃癌组（25.80±10.56）%，大肠癌组（28.95±9.29）%，均明显高于对照组的（0.82±0.98）%（P
综上所述，在胃癌患者中T细胞亚群的异常表现主要为T细胞共刺激分子（CD28）的无效表达增加，CD4+T细胞的数量明显减少。而大肠癌患者的主要特征为CD4+CD25+T调节细胞数量增多，所以，T细胞亚群是肿瘤治疗效果以及预后判断有效的一个重要检测指标。
[参考文献]
[1] 鲍轶，郭丽.γδT细胞表达共刺激分子及协同信号通路的研究进展[J].中国医学科学院学报，2014，36（2）：223-226.
[2] 王婷，刘翠平，朱然然，等.转染小鼠可诱导共刺激分子配体基因细胞株的构建及其对T细胞体外活化与增殖的促进作用[J].国际免疫学杂志，2013，36（3）：226-230.
[3] 刘芝翠，元慧杰，曾维宏，等.天疱疮患者外周血CD4+T细胞活化状态及其表面共刺激分子的表达[J].中华皮肤科杂志，2014，47（1）：7-10.
[4] 王瑜，丁晓霞，胡孝彬，等.CHB患者CD4+ T细胞ICOS表达及其与干扰素治疗的相互关系[J].中华微生物学和免疫学杂志，2012，32（2）：124-127.
[5] 卢芩，俞婷，张有珍，等.胃癌患者外周血及癌组织中调节性T细胞和Foxp3的表达意义[J].中国老年学杂志，2014，34（18）：5140-5142.
[6] 马俊杰，刘会平，周春祥，等.运用胸腔镜技术探索细支气管肺泡细胞癌中医证型与Th1/Th2关系[J].中国中西医结合杂志，2013，33（8）：1069-1071.
[7] 温鹏强，赵俊山，齐中香，等.急性期川崎病患儿CD4+CD25 highFOXP3+调节性T细胞亚群改变及意义[J].中华风湿病学杂志，2015，19（2）：91-96.
[8] 傅冷西，张声，陈思曾，等.T细胞共刺激分子及其亚群在胃癌和大肠癌组织中表达的意义[J].中国普外基础与临床杂志，2008，15（1）：51-55.
篇5
[关键词] eIF-4E基因;表达;非小细胞肺癌;预后
[中图分类号] R734 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）01（a）-0012-04
Expression of eIF-4E in non-small cell lung cancer and its correlation with prognosis
WANG Binliang LI Xiaobo KONG Yiming ZHANG Rongying
Department of Respiratory Medicine， the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University the First People's Hospital of Taizhou City， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China
[Abstract] Objective To investigate eIF-4E expression in patients with non-small cell lung cancer （NSCLC）， and its correlation with prognosis. Methods Tumor tissues were collected from 60 NSCLC patients who underwent surgical resection from January 2009 to December 2010 in the Affiliated Huangyan Hospital of Wenzhou Medical University， and 30 adjacent normal tissues samples were also collected. The expression level of eIF-4E in NSCLC tissues and adjacent normal tissues were measured by immunohistochemical method. All the NSCLC patients after resection were subject to treatment with elemene plus cisplatin for more than 2 weeks. A systematic follow-up evaluation was also performed to investigate the correlation of eIF-4E expression level with disease-free survival （DFS） and overall survival （OS）. Results The expression rate of eIF-4E in the tumor tissues （80.00%） was significantly higher than that in adjacent normal tissues （33.33%）， the difference was statistically significant （P < 0.01）. The eIF-4E high expression rate of the patient with age≥60 years and clinical stage of Ⅲ-Ⅳ was higher than whose age<60 years and clinical stage ofⅠ-Ⅱ， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level were significantly larger than those of patients with high eIF-4E expression level， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion eIF-4E is highly expressed in NSCLC tissues; the DFS and OS values of patients with low eIF-4E expression level are significantly larger. High eIF-4E expression level may be an independent predictor of poor NSCLC prognosis.
[Key words] eIF-4E gene; Expression; NSCLC; Prognosis
目前，肺癌是发病率和病死率最高的恶性肿瘤，其引起的死亡在各种癌症导致的死亡中居首位，这与其肿瘤细胞侵袭性和转移性的生物学特征密切相关[1]。非小细胞肺癌（non-small cell cancer，NSCLS）约占肺癌的80%，大部分患者发现患有非小细胞肺癌时已属于晚期，因此化疗是治疗非小细胞肺癌的主要方法[2]。真核细胞翻译起始因子-4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF-4E）是相对分子质量25 000、碱基序列>50 kb、包括7个外显子和6个内含子的多肽[3]，在许多肿瘤中过度表达，并且与多种恶性肿瘤的发生、浸润和转移密切相关。eIF-4E在诸如甲状腺癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫颈癌、肺癌、白血病以及胆管癌等恶性肿瘤和肿瘤旁组织中过度表达并与肿瘤的侵袭转移能力呈正相关。eIF-4E基因科是肺癌演进过程中重要的标志物，可指导非小细胞肺癌的生物治疗并为其临床分期和预后判断提供参考价值，在肺癌的复发和转移方面有着重要的意义。本研究EIF4E基因在NSCLC的表达及其与疗效及预后的关系，现将结果报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2009年1月～2010年12月于温州医科大学附属黄岩医院（以下简称“我院”）进行外科手术切除的60例非小细胞肺癌组织样本，同时收集30例癌旁正常组织（距离癌组织大于5 cm以上的组织）作为对照。所有患者术前均未进行过化疗或者靶向治疗。根据2002年美国癌症联合会和国际抗癌联盟制订的TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期33例，根据2002年WHO分类标准，60例非小细胞肺癌组织中鳞癌29例，腺癌31例，低分化36例，中高分化24例。60例非小细胞肺癌组织中男31例，年龄35～83岁，平均（56.47±18.85）岁，女29例，年龄32～86岁，平均（58.75±19.23）岁。30例癌旁正常组织中男18例，年龄34～85岁，平均（58.94±19.62）岁，女12例，年龄33～81岁，平均（55.84±18.52）岁。非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织性别、年龄等基本资料比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院伦理委员会通过，患者均知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 治疗方法 60例患者均在术后接受2～4周期的榄香烯（大连金港制药公司，生产批号：0705131）联合顺铂（山东德州制药厂，生产批号：9050212DC）化疗：榄香烯：125 mg/m2，d1、d8;顺铂;30 mg/m2，d1～d3。药物均静脉滴注给药，所有患者均接受至少2周的化疗，对于耐受良好患者进行3～4周期的化疗。
1.2.2 检测方法 将获得标本制成3 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡后使用苏木精染色和DAB显色（北京中杉金桥生物科技有限公司），脱水后二甲苯透明并以中性树脂封固后置于显微镜下观察。
1.2.3 结果判读方法 以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性。免疫组化标准[5]：每例标本均在400倍视野下选取500～1500个肿瘤细胞进行阳性细胞染色强度的观察并计算阳性细胞的百分数。按阳性细胞染色强度：无着色为0分;黄色为1分;棕黄色为2分;深棕色或棕褐色为3分。按阳性细胞百分数：0%～10%为0分，>10%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～100%为3分。以按阳性细胞染色强度得分和按阳性细胞百分数得分之和为最终结果。0～1分：阴性（-），2～3分：弱阳性（+），4～5分：中阳性（++），6分：强阳性（+++）。-～+为低表达，++～+++为高表达。
1.2.4 预后评价方法 无瘤生存期（DFS）[4]：从开始化疗至转移、复发或死亡之间的时间。总生存时间（OS）[4]：从开始化疗至死亡或者最后1次随访之间的时间，最后1次随访时间为2014年3月20日。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 真核细胞翻译起始因子-4E在癌组织以及正常肺组织中的表达
非小细胞肺癌组织中eIF-4E基因的阳性表达率为80.00%（48/60），显著高于癌旁正常组织的33.33%（10/60），差异有高度统计学意义（χ2=9.38，P < 0.01）。见图1（封四）。
2.2 真核细胞翻译起始因子-4E的表达与患者临床特征的关系
非小细胞肺癌组织中eIF-4E表达与患者的性别、病理类型和分化程度无关（P > 0.05），年龄≥60岁及TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期患者的eIF-4E高表达率明显高于年龄<60岁及分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者，差异均有统计学意义（P < 0.05）。提示IF-4E表达与患者的年龄及临床病理分期有关。见表1。
2.3 真核细胞翻译起始因子-4E的表达与患者的无瘤生存期和总生存时间关系分析
与eIF-4E基因高表达患者比较，eIF-4E基因低表达患者的DFS和OS均延长，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见图2、3。
图2 真核细胞翻译起始因子-4E的表达与患者无瘤生存期的关系
图3 真核细胞翻译起始因子-4E的表达与患者总生存时间的关系
3 讨论
肺癌是发病率和病死率增长最快的恶性肿瘤，目前在世界范围内已成为严重危害人类生命和健康的主要疾病，肺癌的发病率和病死率在男性中均占第一位，在女性中，肺癌的发病率仅次于乳腺癌。肿瘤的形成是一个复杂的多阶段连续过程，受多种因素的影响。目前对肺癌的治疗仍缺乏有效的方法，对于失去手术机会的患者来说药物治疗的有效性紧密关联着其生存质量及生存期。对肺癌的转移机制、预后影响因素和药物对肺癌细胞作用的分子机制的研究可为肺癌的药物治疗提供依据[6]。eIF-4E是真核细胞翻译起始和调控的核心成分，它与mRNA 5'端帽子结构结合，在蛋白质翻译起始过程中发挥重要作用[7]。有研究进展表明eIF-4E是影响肿瘤的生长、侵袭、演进等生物学行为的肿瘤相关因子，在许多肿瘤中过度表达且与多种恶性肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[8]，其过度表达成为肿瘤恶性改变及判断其恶性程度的一个重要分子标志，可为抗肿瘤治疗提供新思路[9-10]。通过反义mRNA介导降低eIF-4E的表达可以抑制癌细胞的肿瘤特性，有研究表明，可以通过降低eIF-4E的表达抑制头颈部恶性肿瘤细胞、肝癌细胞、乳腺癌细胞等多种肿瘤细胞的生长、侵袭[11-13]。榄香烯是在中药姜科植物温莪术的挥发油中提取的有效成分，是由α-榄香烯、β-榄香烯、δ-榄香烯和γ-榄香烯组成的复合物，是临床上一种被广泛应用并取得了治疗效果的广谱抗肿瘤药物，β-榄香烯通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡来实现其在甲状腺癌中的抗肿瘤效果[14]，在临床上其不仅具有较强的抗肿瘤作用，而且可逆转化疗产生的多药耐药性[15]。目前关于eIF-4E基因在非小细胞肺癌细胞内的表达及其与榄香烯联合顺铂治疗非小细胞肺癌的效果与预后关系的研究甚少，明确eIF-4E基因在非小细胞肺癌细胞内的表达及其与榄香烯联合顺铂治疗非小细胞肺癌的效果与预后关系可为非小细胞肺癌的治疗提供依据。
本研究结果显示，eIF-4E基因在非小细胞肺癌组织中呈现高表达，提示eIF-4E基因在非小细胞肺癌的发生发展过程中可能起着重要的作用。eIF-4E的表达与患者的性别、病理类型和分化程度无关。本研究结果亦发现，年龄较大以及分化等级较高的非小细胞肺癌患者的eIF-4E阳性表达水平明显增高，提示非小细胞肺癌患者的eIF-4E基因表达与其年龄和肿瘤分化程度密切相关。榄香烯顺铂联合化疗后eIF-4E低表达患者的DFS和OS均明显延长。eIF-4E低表达患者榄香烯顺铂联合化疗效果较eIF-4E高表达患者明显提高，提示eIF-4E低表达患者对化疗更加敏感，因此eIF-4E的低表达是影响非小细胞肺癌化疗效果的重要因素，eIF-4E基因的高表达可能成为非小细胞肺癌治疗效果及预后不良的预测因子。榄香烯联合顺铂化疗可能通过组织有活性的eIF-4E基因的低表达抑制细胞的增长，导致致癌细胞的自我繁殖受阻，从而控制癌细胞进展及扩展eIF-4E复合物的形成，起到抑制肿瘤形成、发展和转移的目的。eIF-4E基因表达在肺癌治疗效果和预后中的作用可从分子学角度找到肺癌诊断和预后的分子指标。
综上所述，eIF-4E基因在非小细胞肺癌组织存在过表达。榄香烯联合顺铂化疗后eIF-4E低表达患者的DFS和OS均明显延长，因此eIF-4E基因的高表达可能成为非小细胞肺癌治疗效果及预后不良的预测因子。
[参考文献]
[1] 张兰兰.经纤维支气管镜冷冻治疗中、晚期肺癌致气道狭窄的护理[J].护士进修杂志，2011，26（19）：1824-1825.
[2] 赵万，胡铃敏，王铖，等.XRCC1、PARP1和APE1多态性与晚期非小细胞肺癌铂类药物化疗敏感性的关系[J].南京医科大学学报：自然科学版，2011，31（7）：1021-1026.
[3] 孙阳阳，曹友德，刘浩，等.shRNA沉默eIF-4E基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞VEGF-C表达的影响[J].中国肿瘤临床，2011，38（4）：200-203.
[4] 苏彤，赵立军，常文军，等.ERCC1、XPD和BRCA1基因多态与晚期非小细胞肺癌患者铂类药物化疗效果的相关性[J].第二军医大学学报，2010，31（2）：117-122.
[5] 赵美玲，杨海虹.Ⅱb/Ⅲa期非小细胞肺癌患者肿瘤RRM1蛋白的表达意义[J].重庆医科大学学报，2012，37（8）：698-702.
[6] Mathieu KB，Ali H，Fox PS，et al. Radiation dose reduction for CT lung cancer screening using ASIR and MBIR：a phantom study [J]. J Appl Clin Med Phys，2014，15（2）：4515.
[7] Yao CC，Tu YR，Jiang J，et al. β-elemene reverses the drug resistance of lung cancer A549/DDP cells via the mitochondrial apoptosis pathway [J]. Oncol Rep，2014，31（5）：2131-2138.
[8] Martineau Y，Azar R，Müller D，et al. Pancreatic tumours escape from translational control through 4E-BP1 loss [J]. Oncogene，2014，33（11）：2131-2138.
[9] 胡爱侠，孙淼淼，陈奎生，等.乳腺癌组织中mTOR、eIF-4E、4EBPS蛋白的表达及意义[J].中国妇幼保健，2012， 27（31）：4976-4979.
[10] 王晓琳.eIF-4E与肿瘤[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2010， 17（4）：473-477.
[11] Zhao Y，Pang TY，Wang Y，et al. LMP1 stimulates the transcription of eIF-4E to promote the proliferation，migration and invasion of human nasopharyngeal carcinoma [J]. The FEBS Journal，2014，281（13）：3004-3018.
[12] Ma J，Han LZ，Liang H，et al. Celastrol inhibits the HIF-1α pathway by inhibition of mTOR/p70S6K/eIF-4Eand ERK1/2 phosphorylation in human hepatoma cells [J]. Oncology Reports，2014，32（1）：235-242.
[13] Zhou S，Wang GP，Liu C，et al. Eukaryotic initiation factor 4E （eIF-4E） and angiogenesis：prognostic markers for breast cancer [J]. BMC Cancer，2012，6（3）：231-232.
[14] 纪春梅，甄永占，范晓禹，等.赖氨大黄酸与顺铂联合对人肺癌A549细胞系增殖和凋亡的影响[J].基础医学与临床，2014，34（2）：155-159.
篇6
[关键词] 肺肿瘤；化疗；Stathmin；β-tubulin-Ⅲ
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）12-0059-03
2011年肺癌NCCN指南中指出：对于行R0切除的Ⅱ期非小细胞肺癌（NSCLC），术后需行辅助化疗（一类证据），但不同患者对化疗的反应及预后差别很大。这可能与个体的生物学差异有关，因此建立循证医学基础上，以药物基因组学研究为依托的个体化治疗已成为未来NSCLC临床研究的重要方向。目前研究表明，微管基因是许多抗肿瘤药物的作用位点，其中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ表达增高与紫杉醇类药物的敏感性降低相关。那么它们的表达水平与长春碱类药物疗效的关系怎么样呢？国内外的研究结果很不一致，甚至自相矛盾[1]。
因此，本文筛选出73例接受手术且术后病理明确为Ⅱ期NSCLC患者，术后均给予长春瑞滨联合顺铂辅助化疗，并检测肿瘤组织中Stathmin、β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平，随访患者无瘤生存时间（DFS）和总体生存时间（OS），统计学分析蛋白表达水平与患者DFS和OS的关系，探讨Stathmin及β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平与化疗药物疗效的相关性，希望能为个体化治疗方案的制定提供依据。
1 资料与方法
1.1 标本及资料收集
所有标本均从本院标本库中筛选（所有入标本库患者均签定知情同意书，医院伦理委员会讨论通过）。术后病理按照2006年国际抗癌联盟（UICC）TNM分期标准进行分期，共筛选2007年9月～2010年6月经根治性手术切除的Ⅱ期NSCLC患者73例。患者的临床特征：男58例、女15例；年龄≤60岁55例、>60岁18例；肿瘤大小≤3 cm2 2例、>3 cm 51例；无淋巴结转移28例、有淋巴结转移45例；高-中分化53例、低分化20例；腺癌33例、鳞癌36例、其他病理类型4例。
1.2 辅助化疗
患者术后转至化疗科室进行长春瑞滨联合顺铂化疗，顺铂75 mg/m2分3天给予，长春瑞滨25 mg/m2第1、8天，以上方案每3周重复。其中1例患者因骨转移只进行2周期化疗，4例患者第1周期在本院进行，余3个周期化疗当地进行，其余患者均在本院完成4个周期的化疗。
1.3 随访资料（DFS和3年生存率）的收集
均通过电话随访，由指定医生完成，每3个月1次。共随访70例，失访3例，随访率为95.89%。
1.5 结果判断
1.6 统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。采用COX模型进行单因素分析，Kaplan-Meier法绘制生存曲线，并经Log-rank检验。
3讨论
近年来肿瘤的个体化治疗越来越受到从事肿瘤临床和基础研究的学者的重视。NSCLC患者的治疗更是需要这一原则。真正意义的个体化治疗是对每一个肺癌患者“量体裁衣”，根据肿瘤生物学特征和药物基因组学改变进行针对性的治疗。2006年《新英格兰医学杂志》发表了肺癌个体化化疗里程碑式的文章。在该研究中，只有肿瘤ERCC1蛋白低表达者可从辅助化疗中获益[2]。
Stathmin是一种微管不稳定蛋白，在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用对细胞微管系统动力平衡的调节发挥十分重要的作用。通过对几种肺癌细胞的研究表明，微管的聚合状态能够影响其与化疗药物的结合。增加微管的聚合状态能够增加紫杉醇与微管的结合，减少长春碱与微管的结合，从而影响肺癌患者对化疗药物的反应[3]。蒲骁麟等[4]报道：在晚期NSCLC中，免疫组织化学方法测得的Stathmin表达水平与长春瑞滨+顺铂/卡铂（NP）方案的化疗疗效负相关。但我们的研究结果表明，Ⅱ期NSCLC术后标本中Stathmin的蛋白表达与患者预后无关，不能作为患者预后的独立预测因素。其高表达患者与低表达患者相比，DFS和OS均无明显差异。
那么β-tubulin-Ⅲ的表达水平与长春碱类药物疗效的关系怎么样呢？国内外用免疫组化方法检测得到的结果很不一致，甚至相互矛盾。Seve等[5]研究了术后接受NP方案辅助化疗的ⅠB～Ⅱ期NSCLC或者， 发现肿瘤组织中β-tubulin-Ⅲ蛋白高表达者，其无复发生存期和总生存期均优于低表达者。Reiman T探讨了JBR.10等4个临床试验中1149例已切除NSCLC的患者与β-tubulin-Ⅲ蛋白表达之间的关系，发现β-tubulin-Ⅲ蛋白表达水平可以作为预测患者预后的指标，但并不能作为预测化疗疗效的指标[6]。我们的研究结果表明，Ⅱ期NSCLC术后标本中β-tubulin-Ⅲ的蛋白表达与患者预后无关，其高表达患者与低表达患者相比，DFS和OS均无明显差异。
[参考文献]
[1] Seve P，Dumontet C. Class Ⅲ beta tubulin expression in non-small cell lung cancer[J]. Rev Mal Respir，2010，27（4）：383-386.
[2] Olaussen KA，DunantA，FouretP，et al. DNA repair by ER-CC1 in non-small-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J]. N Engl J Med，2006，355（10）：983-991.
[3] Singer S，Malz M，Herpel E，et al. Coordinated expression of stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein-1 increases motility in non-small cell lung cancer[J]. Cancer Res，2009， 69（6）：2234-2243.
[4] 蒲骁麟，王峻，许林，等. β-tubulin-Ⅲ和Stathmin与晚期NSCLC化疗敏感性的关系[J]. 中国肺癌杂志，2009，12（1）：49-53.
[5] Seve P，Lai R，Reiman T，et al. Class Ⅲ beta-tubulin expression and benefit from adjuvant cisplatin/vinorelbine chemotherapy in operable non-small-cell lung cancer：analysis of NCIC JBR.10[J]. Clin Cancer Res，2007，13（3）：994-999.
[6] Reiman T，Lai R，Veillard AS，et al. Cross-validation study of class Ⅲ beta-tubulin as a predictive marker for benefit from adjuvant chemotherapy in resected non-small-cell lung cancer： analysis of four randomized trials[J]. Ann Oncol，2012，23（1）：86-93.
[7] Alli E，Bash Babula J，Yang JM，et al. Effect of stathmin on the sensitivity to antimicrotubule drugs in human breast cancer[J]. Cancer Res，2002，62（23）：6864-6869.
篇7
【中图分类号】R711.74【文献标识码】B文章编号：1004-7484（2012）-05-0786-02宫颈癌发病与很多因素有关。笔者对宫颈癌患者进行辅助检查，以研究TRAIL、Survivin两项指标在宫颈病变患者疾病中的表达和其与细胞凋亡之间的关系，并进行分析，现总结如下：1.对象与方法
1.1对象：收集2007年-2010年北京市顺义区医院74例患者的标本，都为进行阴道镜室活检及手术切除的标本。辅助病理检查均明确诊断，27例患者为宫颈浸润癌设为宫颈癌组。22例患者为CINII-III级设为CIN II-III级组；25例患者为CIN I级设为CIN I级组。并设立对照组进行研究，对照组15例患者为笔者所在医院宫颈正常的患者，其标本为子宫肌瘤手术切除标本。所有宫颈癌患者在手术之前都没有进行化疗、放疗的治疗。RT-PCR方法检测Survivin、TRAIL的表达，采用SPSSll.0统计学软件进行分析。
1.2结果：宫颈癌组的Survivin基因的表达指标l.293±0.438，CIN II-III级组为1.010±0.367，CIN I级组为0.718±0.205，正常宫颈组为0.596±0.229。结果显示正常宫颈组明显低于CIN组，CIN组明显低于宫颈癌组。CIN I级组指标明显低于CINII-III级组，差异明显有统计学意义（P0.05)。CINI级组和正常宫颈组比较无明显差异，无统计学意义(P>0.05)。
宫颈癌组TRAIL基因的表达指标为0.441±0.117，CIN II-III级组为0.536±0.150，CIN I级组为0.675±0.211，正常宫颈组为0.940±0.427。宫颈癌组和CIN II-III级组的指标明显高于正常宫颈组，差异有统计学意义(P
1.3统计学处理：对宫颈癌组织中的各项表达指标进行统计学处理，应用Spearman等级处理，其呈负相关关系表现。相关系数r=-0.541，P
在人体肿瘤的研究中，Survivin基因在此疾病的检查中都有明显表现。其高度表达可让患者的细胞凋亡受到抑制，从而致使患者的细胞出现了增殖异常的表现。这表明此指标和患者发生肿瘤疾病有着很大的关联。笔者应用RT-PCR的方法对患者的标本进行检查，经对比分析显示此指标在早期宫颈癌恶性转化的时候可能会高表达。分析结果还显示其和宫颈癌疾病地发生有很大的关系。
TRAIL指标为肿瘤坏死因子，其本身在正常患者体内为高表达的表现，其在肿瘤患者及胚胎中的表现为低表达或者为没有表达。本组资料显示其在宫颈癌组中的表达指标为最少，这表明患者在发生肿瘤疾病时TRAIL表现为逐渐地丢失。这表明其和疾病的产生和法则有很大的关系。故对其进行研究可能会有新的突破。
篇8
【摘要】
目的： 研究转录产物MALA1的表达水平与早期非小细胞型肺癌(NSCLC)转移之间的关系。方法： 用实时定量PCR分析了MALA1基因在70例NSCLC患者中的表达情况。 结果： 在对Ⅰ期和Ⅱ期NSCLC患者超过5年的随访期中发现，MALA1高表达的患者死亡率超过40 %(12/28)，而MALA1低表达的患者死亡率仅有9 %(2/22) （P=0.01)。说明高表达量的MALA1很可能是早期NSCLC 患者预后不良的一个指标。此外，也发现了MALA1基因与肿瘤组织的转移有关。结论： MALA1的转录水平不仅可以作为预测发生肿瘤转移的高危人群的生物学标记，并有望在今后用于早期NSCLC患者的诊断或治疗中。
【关键词】 转移； 非小细胞型肺癌； MALA1； 表达； 扣除杂交
［Abstract］Objective: To investigate the relationship of the expression level of the transcript MALA1 and the metastasis of early stage nonsmall cell lung cancer(NSCLC).Methods： Expression level of MALA1 was analyzed with real time quantitative PCR in 70 patients of NSCLC.Results： In the study of an over fiveyear followup for stage Ⅰand Ⅱ NSCLC patients.It was found that the death rate was more than 40% in patients with high MALA1 expression， whereas only 9%(2/22) in patients with low MALA1 expression died(P=0.01)， suggesting high expression of MALA1 was potentially predictive for a poor prognosis in early NSCLC.Additionally， it was found that the association of MALA1 gene with metastasis depended on the tumor′s histology.Conclusion： These results demonstrated that MALA1 transcript could be used as a biological marker， which may predict high risk for the development of distant metastasis and could be further helpful in improvement of treatment for earlystage NSCLC patients.
［Key words］ metastasis; nonsmall cell lung carcinoma; MALA1; expression; subtractive hybridization
Bronchogenic carcinoma continues to be the leading cause of cancer death in both men and women ［1］.Nonsmall cell lung carcinoma(NSCLC) accounts for approximately 80% of all bronchogenic carcinomas， with SCLC(small cell lung carcinoma) accounting for the remainder［1］.Survival following treatment of NSCLC is stagerelated， and the patients with earlystage disease have the best chance for curative treatment.Although the patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease undergo surgical resection of primary carcinomas， a considerable number of them will eventually die of metastatic neoplasm， implying a need for reliable indicator not only to predict survival of the patients with early stage NSCLC， but to provide information for the high risk patients who might benefit from additional therapy［2］.
Up to date， while there are some reports about DNA ploidy and DNA deletions， SPF(Sphase fraction)， PCNA(proliferating cell nuclear antigen)， the gene family of erb B， p53 mutation， EGFR and Ki67 antigen and so on as biological indicators of prognosis in most solid tumors， still have been conflicting results in lung cancer studies［3-9］.Recently， applying a subtractive hybridization procedure， we identified a few new genes whose expression levels were significant differences between NSCLC tumors that were cured by surgical resection and the tumors that subsequently metastasized.An approach to find the genes related to metastasis has been made by a cDNA subtractive hybridization［10］.In the present study， we investigated expression level of the identified genes in the subtracted cDNAs by realtime quantitative RTPCR.The results demonstrated that MALA1(Metastasis associated in lung Adenocarcinoma)， the most frequently appeared gene in identification of subtractive cDNA library， was associated with metastasis in the patients with early stage NSCLC.Therefore it is suggested that expression level of MALA1 could be one valuable molecular biological marker to predict survival for patients in early stage NSCLC.
1 Materials and methods
1.1 Tumor specimens and survival data
Tumor samples were obtained from 70 patients with stage Ⅰ to Ⅱ IA NSCLC at the time of initial surgical resection at Muester university hospital in Germany.Pathohistory examination showed no evidence for remaining tumor.RNA isolation and consequently cDNA preparation， characterization of the cohort of NSCLC patients were described previously ［11］.Parts of the surgically resected tumors were immediately shockfrozen and stored at -70℃ until analysis.All specimens were confirmed to contain a high percentage of tumor cells(>70%).Lung tissue without histological evidence of tumor infiltration was isolated from 12 inpiduals to serve as a control.
1.2 cDNA subtractive hybridization
To exclude differences in gene expression independent on the metastatic potential， all the patients in this study were male with more than five years of followup， all the tumors were at stage I and were completely resected by surgery(R0 resection). Histological classification were confirmed to be adenocarcinomas as described ［11］.The cDNA hybridization procedure was described as the method［11］.In brief， cDNA was prepared and amplified using realtime RTPCR in the ABI Prism 7 700 sequence detector(PE Biosystems， Foster City， CA).One gram of total RNA was reverse transcribed using random primers and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase(Promega) following the manufacturer′s protocol.cDNA samples were diluted to 100 μl， and 2.5 μl of cDNA were used for each PCR.PCR amplification of the housekeeping gene glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase was used to confirm the quality of cDNA and standardize the total amount of cDNA between different samples.The primers for amplication of the MALA1 gene were: forwardTGAGAGAAAGGACTACAGA， and reverseCTTCCC GTACTTCTGTCTT.
1.3 Statistical Analysis
Statistical Analysis was carried out with SPSS software system(SPSS for Windows Version 10.0).Difference in gene expression level between metastasizing and nonmetastasizing tumors was analyzed statistically with MannWhitney Utest.Cancerspecific survival curves were plotted using the KaplanMeier method and the logrank test was used to assess the statistic significance of differences between groups.Cox proportional hazards regression analysis was used to define gene expression level with independent predictive value with respect to cancer specific survival.
2 Results
2.1 Cloning of MALA1 gene
Two hundred and twentyfive independent sequences were obtained totally in metastatic cDNA library after subtractive hybridization.Twentysix transcripts were found more than once.The most frequently identified transcript was a so far uncharacterized mRNA derived from chromosome 11q13 by DNA homology comparison in Genbank(Accession number AF203815).To obtain more of the sequence of this transcript， we used 5′ and 3′ Rapid Amplification of cDNA(RACE).The full length of this DNA sequence was 737 base pairs.Database searches revealed that this sequence had before been identified only as an EST(Expression sequence terminal).The sequence of the transcript is shown in Fig.1， in which the longest open reading frame for peptides of 52 amino acids(aa) was predicted in both directions.However， it is currently unclear whether this sequence codes for a peptide in vivo.We have named this RNA MALA1.To confirm the reliability of MALA1 expression， this transcript was analyzed in the pooled samples as well as in the subtracted libraries(metastasis minus nonmetastasis and nonmetastasis minus metastasis).These analyses demonstrated for MALA1 an about 3fold higher expression in the pooled sample from metastasizing tumors compared to the nonmetastasizing tumors.
2.2 Expression analysis of MALA 1 gene in patients
The issue of the association of MALA1 gene with metastasis was specific for certain histological subtypes or stages of disease was analyzed.When only stage Ⅰ and Ⅱ patients were included into the analyses， expression levels of MALA1(P=0.017) was significantly higher in metastasizing tumors， and another one was EIF4A1(Eukaryotic translation initiation factor A1)(P=0.031).Also， further analyses indicated that the association of MALA1 gene with metastasis was highly specific for histological subtypes.Twentysix tumors were histologically classified as adenocarcinomas.For three out of five genes(MALA1， EIF4A1， NPCRP) that we identified by our screening method， expressed in metastatic adenocarcinomas was several folds higher than in nonmetastatic adenocarcinomas.Interestingly， no significant differences in gene expression were found for squamous cell carcinomas(n=34).For large cell carcinomas(n=10) mixed results were obtained: whereas some of the genes were clearly enriched in metastasizing tumors(MALA1， EIF4A1， MDM2)， others were clearly not(NPCRP).These data provided evidence that the association of the identified genes with metastasis depended on the tumor′s histology.The relative expression of MALA1 in three types of lung carcinoma was shown in Fig.2.
To evaluate the relationship of the identified metastasisassociated transcripts and survival， all samples were classified for couples of gene as high or low expressers.High or low expression was determined according to the expression level of the samples with regard to median expression of all 70 samples ［11］.KaplanMeier plots indicated that high expression level of MALA1 was associated with significantly worse survival of patients with stage Ⅰ and Ⅱ disease(Fig.3).High expression of MALA1 was highly predictive for a poor prognosis in early disease.Indeed， only 2/22(9%) of low expressing stage Ⅰ and Ⅱ disease patients died during a fiveyear follow up period but more than 40%(12/28) of patients with high levels of MALA1 ultimately died.When a stepwise Cox regression analysis was performed for stage Ⅰ and Ⅱ patients， high levels of MALA1(P=0.02) emerged as independent prognostic parameters for patient survival(Fig.4).
3 Discussion
We identified genes that might be associated with metastasis of NSCLC.The direct comparison of subsequently metastasizing primary tumors with nonmetastasizing primary tumors could offer important advantages.Firstly， it avoided changes in gene expression and metastasis due to the different environments of tumor; secondly， for clinical patient management， the knowledge of differences between metastasizing and nonmetastasizing primary tumors can lead to better prognosis prediction and ultimately to risk adapted therapeutic strategies［12］.Several unknown genes were identified in our study.One of these， a novel transcript on chromosome 11q13， was the most frequently found transcript.To determine the 5′and 3′ends of the sequence we used 5′and 3′ RACE techniques and obtained a 737 base pair fragment that potentially encodes for a 52 amino acid peptide.This transcript was named as MALA1.Currently， it is unclear whether this sequence has peptidecoding potential in vivo， or whether its expression is merely an epiphenomenon for processes on 11q13 that are associated with the metastasisbearing potential of NSCLC tumors.The region 11q13 has been known to be relevant for tumorigenesis and metastasis ［13-15］， there were some important genes， such as CCND1(cyclin D1) and MEN1(Multiple endocrine neoplasia 1) located in this region as well.However， in most cases， 11q13 mutation was associated with lung carcinoma.It might hint that MALA1 in the region of 11q13 was translocated to a new area and affected other genes expression in that area.Nevertheless， even if MALA1 is nonfunctional， it bears strong prognostic potential in early stage NSCLC.
Tumors of patients were grouped for each gene in high vs.low expressing ones based on the expression of tumor in comparison to the median expression of all patients.Kaplan Meier survival plots are shown for patients with adenocarcinoma or squamous cell carcinoma and stage Ⅰ or Ⅱ disease.The logrank test was used to calculate statistical significance
Recently， Clark et al.［16］ published microarray data derived from a melanoma metastasis model.The thymosin β4 gene， identified by them， was also cloned by our strategy.Therefore， we tested to test whether the two other main genes identified by them were associated with metastasis in NSCLC.Thymosin β4 proved to be associated with metastasis and prognosis in our patient group， whereas no significant differences were found for either Rho C or fibronectin.These findings provided another strong hint that the stage and cell type specific gene expression profiles were associated with metastasis.
参考文献
［1］Lloyd C， Silvestri GA.Mediastinal staging of nonsmallcell lung cancer［J］.Cancer Control， 2001， 8(4): 311-317.
［2］Walker S.Updates in nonsmall cell lung cancer ［J］.Clin J Oncol Nurs， 2008， 12(4):587-596.
［3］Anguiano A， Potti A.Genomic signatures inpidualize therapeutic decisions in nonsmallcell lung cancer ［J］.Expert Rev Mol Diagn， 2007， 7(6):837-844.
［4］Sung HJ， Cho JY.Biomarkers for the lung cancer diagnosis and their advances in proteomics ［J］.BMB Rep， 2008， 41(9):615-625.
［5］Schneider J.Tumor markers in detection of lung cancer ［J］.Adv Clinic Chem， 2006， 42:1-41.［6］ Costa DB， Nguyen KS， Cho BC， et al.Effects of erlotinib in EGFR mutated nonsmall cell lung cancers with resistance to gefitinib ［J］.Clin Cancer Res， 2008， 14(21):7060-7067.
［7］Pujol JL， Simony J， Jolimoy G， et al.Hypodiploidy， Ki67 growth fraction and prognosis of surgically resected lung cancers［J］.Br J Cancer， 1996， 74(6): 964-970.
［8］Dacic S.EGFR assays in lung cancer［J］.Adv Anat Pathol，2008，15(4):241-247.
［9］Yendamuri S， Vaporciyan AA， Zaidi T， et al.3p22.1 and 10q22.3 deletions detected by fluorescene in situ hybridization(FISH): a potential new tool for early detection of nonsmall cell lung Cancer(NSCLC)［J］.J Thorac Oncol， 2008， 3(9):979-984.
［10］Ji P， Diederichs S， Wang W， et al.MALAT1， a novel noncoding RNA， and thymosin beta4 predict metastasis and survival in earlystage nonsmall cell lung cancer［J］.Oncogene， 2003， 22(39):6087-6097.
［11］MüllerTidow C， Metzger R， Kügler K， et al.Cyclin E is the only cyclindependent kinase 2associated cyclin that predicts metastasis and survival in early stage nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Res， 2001， 61(2): 647-653.
［12］Ridley A. Molecular switches in metastasis［J］.Nature， 2000， 406(6795): 466-467.
［13］van Asseldonk M， Schepens M， de Bruijn D， et al.Construction of a 350kb sequenceready 11q13 cosmid contig encompassing the markers D11S4933 and D11S546: mapping of 11 genes and 3 tumorassociated translocation breakpoints［J］.Genomics， 2000， 66(1): 35-42.
［14］Rasio D， Negrini M， Manenti G， et al.Loss of heterozygosity at chromosome 11q in lung adenocarcinoma: identification of three independent regions［J］.Cancer Res， 1995， 55(18): 3988-3991.
篇9
[关键词] 肺癌; Beclin1; p53; p16
[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)07-26-02
Expression of Beclinl,p53 and p16 in Different Stages of Lung Cancer
LI Xiaoyan1 WANG Guiqin2
1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University,Fenyang 032200,China;2.Teaching and Research Section of Microbiology and Immunology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] ObjectiveTo investigate expression of Beclinl,p53 and p16 in lung cancer tissue of different stages and provide reliable data for early diagnosis of lung cancer and the assessment of its m alignant degree. MethodsWe selected 50 patients with lung cancer from Shanxi Fengyang Hospital between Jan.2009 and Dec.2009. The expression levels of tissue Beclinl,p53 and p16 in different stages of lung cancer were detected and the analysis of variance and LSD-t test were used for their expression and their corresponding stage. ResultsThere were significant differences in the expression levels of Beclinl,p53 and p16 in different stages. ConclusionThe expression levels of Beclin1,p53 and p16 in the tissue of lung cancer in different clinical stages are different. With the increase in staging of lung cancer,the p53 expression level is increased,the p16 expression level is down-regulated and the Beclin1 expression level is decreased.
[Key words]Lung cancer; Beclin1; p53; p16
肺癌是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。多数患者在确诊时已失去根治的机会,早期发现和诊断肺癌及其恶性度的评估对其治疗和预后都有重要意义。肺癌早期诊断与恶性度评估分子标志物的筛选是临床肿瘤工作者亟待解决的课题[1,2]。
自噬现象是一种高度保守的细胞行为,存于所有的物种。研究表明Beclin1是唯一发现的哺乳动物的自噬基因,是自噬的执行者;又是一类新的抑癌基因,只有在双等位染色体都表达时才发挥抑癌作用。Beclin1基因的缺失性突变导致自发性肿瘤发生率提高。Beclin1基因表达异常(减少或缺失)是否为肿瘤细胞早期事件?如果研究结果是肯定的,那么我们可以将其作为早期诊断的指标之一,甚至有可能成为高危人群筛选指标之一。
p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的肿瘤抑制蛋白,在多种恶性肿瘤中有异常表达。正常状态下,其效应分子的基因产物可防止细胞转化癌变,当发生突变时可成为一个直接的肿瘤基因,在细胞恶性转化中起作用,被认为是早期癌标志。p16蛋白是迄今为止发现的第一个直接控制细胞增殖周期的固有蛋白,通过调节Rb蛋白的活性防止细胞过度增殖。p16蛋白的丢失、突变广泛存在于人类恶性肿瘤中,因此p16蛋白既可作为早期诊断癌变的指标,也可用于评估预后。
本文旨在通过分析处于肺癌各个分期的50例肺癌患者的Beclin1、p53、p16的表达情况,探讨Beclin1、p53、p16与肺癌恶性度的关系,从而为临床诊断、治疗肺癌提供依据[3]。
1 资料与方法
1.1 标本与来源
选择2009年1～12月在山西省汾阳医院就诊的肺癌患者,取肺组织50例(每期10例)。入选条件和排除条件如下:(1)手术切除标本。所有标本均经病理学诊断证实,术前均未接受放、化疗。(2)均经病理确诊为肺癌。(3)另取癌旁正常肺组织(至少距癌边缘3cm)。(4)病理排除合并炎性改变等的可能。
1.2 方法
1.2.1 分组方法 依据1997年UICC公布的肺癌TNM分期,同时结合临床、胸部CT、X线检查将入选病例进行分组:按肿瘤分期0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分为5组,各组年龄、性别等控制情况基本匹配。
1.2.2 实验方法 肺癌及相应癌旁手术标本经10%甲醛固定,石蜡包埋连续切片,苏木精-伊红染色,进行组织病理学观察后,采用PV-9000通用型二步法免疫组化法进行Beclin1、p16和p53基因表达水平的检测。
1.2.3 结果判断 定性:光学显微镜观察Beclin1、p16和p53,阳性着色部位分别为细胞浆和细胞核,呈棕黄色,而阴性细胞不着色而显示复染的蓝色。定量:每张切片随机地在200倍显微镜下取5个视野,录入GD-6多媒体彩色病理图像分析系统,测定Beclin1、p53、p16的积分光密度。
1.3 统计学方法
用SPSS10.0软件包对Beclin1、p53、p16的表达情况与其各自对应的分期分别进行方差分析与LSD-t检验。
2 结果
肺癌分期的五组Beclin1、p53、p16的表达情况差别有统计学意义(P
本研究显示:各期肺癌组织中Beclin1、p53、p16表达的高低与肺癌的临床分期有关联;随肺癌分期的增高,p53表达量增高,p16表达量下调,同时Beclin1表达量降低。见图1。
3 讨论
国内外学者对Beclin1的研究大多集中在宫颈癌等生殖系统肿瘤,对其与肺癌的关系研究很少。对于p53、p16及Beclin1的测定方法大多是RT-PCR法、Western blot等,这些方法只能判断阳性病例而不能定量诊断[4,5]。Beclin1与肺癌相关性的研究目前国内报道较少,与肺癌病理分期相关的研究尚未见报道。
本文通过检测不同分期肺癌组织中Beclin1、p53、p16的表达情况,揭示自噬蛋白与凋亡蛋白在肺癌发生发展中的相互作用,研究三者之间及其与肺癌临床病理分期的关系,为早期诊断肺癌提供理论依据。通过研究了解肺癌发生、发展过程中Beclin1、p53、p16的表达情况,通过对肺癌组织中Beclin1、p53和p16表达的定量分析揭示自噬蛋白与凋亡蛋白在肺癌发生发展中的相互作用,为肿瘤早期诊断提供一条新思路。
[参考文献]
[1] Gorski DJ,Chittaranjan S,Pleasance ED,et al. A SAGE approach to discovery of genes involved in autophagic cell death[J]. Curr Biol,2003,13(4):358-362.
[2] Tan EM,Zhang J. Autoantibodies to tumor-associated antigens:reporters from the immune system[J]. Immunol Rev,2008,22(5):328-340.
[3] Gadducci A,Ferdeghini M,Buttitta F,et al. Assessment of the prognostic relevance of serum anti-p53 antibodies in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol,1999,72(3):76-81.
[4] Tang R,Ko MC,Wang JY,et al. Humoral response to p53 in human colorectal tumors:a prospective study of 1,209 patients[J]. Int J Cancer,2001,94(13):859-863.
篇10
关键词： S100A2；喉鳞癌；免疫组织化学方法
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器
1.1.1 资料 收集40例泸州医学院附属医院耳鼻咽喉-头颈外科2005年1月至2007年5月行手术切除后经病理学诊断为喉鳞状细胞癌（lscc）的存档蜡块。所有病例术前均行喉部高分辨率CT检查，均未行放化疗治疗。40例喉鳞癌中，男性39例，女性1例,年龄45～71岁，平均61.8岁；病程2～36个月。将病例按年龄、不同分化程度、有无颈淋巴结转移、TNM分期进行分组。年龄以60岁为界，分为两组；按组织病理学分级分为高分化鳞癌22例，中分化鳞癌10例，低分化鳞癌8例；有淋巴结转移22例，无颈淋巴结转移18例；按1997年国际抗癌协会（UICC）制定的TNM分期， T1～T2期有14例，T3～T4期有26例;将40例同期手术切除经病理证实无肿瘤浸润的癌旁喉黏膜标本作为对照组。
1.1.2 主要实验试剂 兔抗人多克隆S100A2抗体（购于sigma公司），SP免疫组化试剂盒、DAB显色盒购于（北京中杉生物技术有限公司）。
1.1.3 主要实验仪器 轮转式切片机（Leica-RM2035 产于德国），OLYMPUS显微镜（BX-50，日本），CS2002-1恒温干燥箱孵育盒 （重庆四达实验仪器厂），SAYYO低温冰箱-20℃(MDF-330.产于日本），病理图像分析处理系统(GD-8,中国)。
1.2 实验方法 所有样本经10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4μm。免疫组化染色按试剂盒说明进行，组织切片经脱蜡、水化、微波处理，进行抗原修复，阻断内过氧化物酶30 min ，PBS 冲洗3 次，每次3min，非特异性血清封闭30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，抗原一抗4℃孵育过夜，PBS 冲洗3 次，每次3 min，二抗孵育30 min，PBS 冲洗3 次，每次3 min，DAB 显色，苏木素复染细胞核，脱水，透明，封片，镜检及摄像。采用预实验反复多次证实均呈阳性的组织切片为阳性对照，空白对照以PBS代替一抗。
1.3 结果判断及资料整理 S100A2阳性结果判定：细胞核或核与胞浆染成黄色或棕黄色或弥漫的棕黄色为阳性细胞；每张切片选择典型部位，随意选5个不同高倍视野(400×)计数，以平均数做最后判定。根据阳性细胞数占视野中总细胞数比例进行判定：阳性细胞数≤10％为阴性结果，阳性细胞数≥ 11%，为阳性结果。切片均经2位病理医生盲法独立计数阅片,两者不一致时重新计数。最后根据免疫组化染色编号，对应的病理号及住院号整理检测结果。
1.4 统计学处理 所得实验数据通过SPSS14.0软件进行统计学分析，检验水准а=0.05。计数资料采用χ2检验对结果进行统计学处理，比较其差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
60例标本全部进入结果分析，S100A2蛋白经免疫组化染色后于细胞核或细胞核与细胞质，出现棕黄色或黄色颗粒为阳性表现。