微生物组学研究范文

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关键词:宏基因组;不可培养微生物;筛选系统

中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3

0 引言

Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别。伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。

1 宏基因组的研究

1.1 DNA的分离

环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA 的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA。尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。

选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。

1.2 系统发生和宏基因组的分析

DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16S rRNA文库。这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16S rRNA基因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16S rRNA基因。序列分析还表明任何基因组中的16S rRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组。因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。

在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息。比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析。在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析。以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。

处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16S rRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平。van der Lelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在这些基因中,16S rRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平。

近年来,以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。

复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片。一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望。Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义。

直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行。在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。

1.3 筛选宏基因组表达文库

另外一种方法是通过构建和筛选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛选。直接筛选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的筛选系统,或者大量的可用的筛选的阵列。可以通过富集基因的方法来筛选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达筛选(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一种高通量的SIGEX筛选方法,他们将目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克隆。宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FACS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克隆。再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来筛选克隆子。这种筛选体系的机理是:分解代谢相关的基因能够在特定代谢物的作用下被诱导表达。

1.4 通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物

要大量精确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的相互作用。尽管“环境基因组”能够提供大量的信息,但对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Proteorhodpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibacter ubique证明了获取可培养单菌落的作用。Proteorhodpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Proteorhodpsin基因。通过培养Pelagibacter ubique,我们就有可能将Proteorhodpsin与固定的种类联系起来。

许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测序已经为我们提供了大量的信息并了解这些微生物在环境中的作用。

经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描述了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Koepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物能够在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法或者培养基适用于分离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出能够降解淀粉但生长缓慢的微生物。

在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地分离出来可以降低微生物群落的复杂性。Miteva和Brenchley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。

2 结语

要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更便宜更快捷的测序方法,环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它能够针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进行完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速发展的基础上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。

参考文献

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篇2

关键词： 维吾尔族预科生 英语教学 语言迁移

1.引言

少数民族预科教育是高等教育的一个特殊层次，也是高等教育的重要组成部分。在预科学习阶段，英语是预科学生的必修课，大多数学生没有英语基础，需要在两年时间内使他们具备相当于大学英语二级水平的词汇、语法等基础知识，为进入本科阶段大学英语的学习打好基础。新疆少数民族预科生主要包括维吾尔族、哈萨克族、柯尔克孜族、乌兹别克族等多个少数民族，其中维吾尔族学生占大多数。我以维吾尔族预科生为主要研究对象，结合多年预科汉语、英语教学的经验，从少数民族学生实际出发，以语言迁移理论为研究路线，着重考查母语和汉语的语言迁移对三语习得的影响，以丰富第三语言习得理论，为我国少数民族预科英语教学提供参考。

2.迁移理论概述

语言迁移是一个复杂的语言学和心理学现象，它是指在外语学习过程中学习者由于不熟悉目的语的语法规则而自觉或不自觉地运用母语的规则处理目的语信息的现象。语言迁移有两种：正迁移（positive transfer）和负迁移（negative transfer），亦称为干扰（interference）。实际调查证明，初级阶段的学生比中级阶段的学生在外语学习过程中较多地依赖于语言迁移。当母语的某些特征同目的语相似或完全一致时，往往出现正迁移；当母语与目的语的某些特点相悖时，学习者若借助母语的一些规则作为拐棍，则会产生负迁移现象。正迁移有利于外语学习，负迁移则阻碍外语学习。

维吾尔族预科生（以下简称预科生）在外语学习时，与汉族学生相比差异明显，预科生的特殊性在于大多数学生都是在掌握了母语及汉语之后才开始学习英语的，因此英语学习对于他们来说是双语情境下的三语习得过程。预科生在学习英语时受到母语影响，还有来自作为第二语言的汉语的影响，以及作为目标语的英语的相互影响。因此，这三者是如何相互发生语言迁移并影响预科学生英语学习进程的是不可避免的重要问题。

第二语言习得研究人们在课堂内或课堂外学母语以外的语言的方式。“第二”不是语言习得顺序上的第二，而是指母语之后。因此，“第二语言”指在母语之后已经习得或正在习得的所有非母语语言。三语习得主要分析至少两种非第一语言间的影响及其对习得目的语的影响。Cenoz等学者认为此观点也可用来区分二语习得和三语习得。第二语言学习者有两个潜在的相互影响的系统（L1?圮L2），而二语习得主要集中于母语迁移，忽略了另一个可能的迁移方向：二语迁移。三语习得考虑了另外两个双向关系。

（1）L3影响L1并被L1影响（L1?圮L3）；

（2）L2与L3也存在跨语言影响（L2?圮L3）。

语际语迁移是三语习得的另一个区别性特征。Cenoz指出二语习得与三语习得的主要不同点在于以下方面。

（1）语言习得顺序；

（2）社会语言学因素；

（3）相关的心理语言学过程。

引起跨语言影响的因素很多。其制约因素有：语言类型、学习者主观意识的语言距离（心理语言类型）、语言接触的时间长短、学习者的年龄和语言熟练程度、语言地位、年龄、语言学习的顺序等。Ringbom在进行了一系列三语习得的研究后认为：词语在词条类似的语言之间的借用十分频繁。William等人做的关于一语（英语）和二语（德语）在三语（瑞典语）学习中的作用，他们发现一语和二语在三语习得中的作用不尽相同，一语起的是纠错作用，二语起的是工具作用，但日后这两种作用都会被三语所取代。

3.语言迁移对维吾尔族预科生将英语作为第三语言学习的影响

3.1在语音层面的语言迁移

从语言谱系上看，维、汉、英三种语言属于不同的三个语系。维语属于阿尔泰语系，汉语属于汉藏语系，是一种表意文字，属于孤立语，没有词形变化，依靠词序和虚词表达语法关系。英语则属于印欧语系，是一种拼音文字，是一种屈折语，用丰富的词形变化表示语法关系。在对维吾尔族学生进行英语教学时，如果能通过对英、汉、维语的相似之处尤其是语音方面的相似之处进行对比研究，那么将有利于“正迁移”作用的发挥，进而将对学生的英语教学起到积极的促进作用，能够增强学生的学习积极性。

在维吾尔语词汇中有相当一部分借词是以音译的形式借入的，主要以名词为主，尤其是自然科学、工程等领域的词汇非常典型，例如system，plan，statistic，physics，engineer，doctor，computer，democracy，等等，这些词汇与维吾尔语中对应的词汇的发音和拼写非常相似。这些单词在语音和词义方面为预科生提供了很大的正迁移。然而同样的因素随着语音学习的深入有可能会为他们带来负迁移，由于维吾尔语中字母和音素是一致的，只要学会了字母和读音，就可以进行拼写和阅读，而英语字母与音素不是所有都一致，单词的拼写有一定的规则或无规则可循，同一个字母在同一个单词中发不同的音。

在初学阶段，预科生容易混淆单词的拼写和音标，还会套用母语的方法直接拼写单词。例如，学生会把英语单词中的元音写成汉语的元音。预科生还容易在拼读和拼写英语单词时混淆擦辅音［s］，［z］，［?夼］，［?奁］。如学生将thought，that，these等含有摩擦音的词误拼为sought，zat，zese，在拼读这些单词时也很自然地读成［s］，［z］。这类错误出现的主要原因是维语中没有齿间音［?夼］，［?奁］而有和摩擦音［s］、［z］发音相似的音。由此可见，产生这种错误的原因是受维吾尔母语负迁移的影响。

此外，预科生常按维吾尔语重音发音习惯读英语单词，如将football读成［fut?b?蘅l］，engineer读成［?end?廾?藜nir］等，这是因为维吾尔语虽然没有声调，但也有重音。维吾尔语中的双音节，多音节词的重音大多在最后一个音节上，这是大多数预科生在初学时发音掌握不好的原因。这些因素导致的语言负迁移在一定程度上会影响预科生在初学语音时的积极性并影响以后的学习进程。

3.2词汇层面上语言迁移

在维吾尔语中有一些与英语基本对等的词。在两种语言中，这些词在语音形式和表示的词汇意义上相近或对等。这类词主要是一些已有通用的术语、名词，如：machine，engineer，professor，visa，coffee，computer，等等，上述词大多是维吾尔语中的借词，其词义相同，发音也基本相同。因此，对维吾尔族学生来说，这一类词汇比较容易掌握。如果教师在英语词汇教学中有目的地将两种语言中的基本对应词加以对比，其教学效果就是明显的。作为第二语言的习得者，学生在学习时往往会将当前的二语习得任务与以前掌握的母语词语进行比较。从语言教学的角度来看，两种语言的共性对学生的学习、记忆英语的单词会产生的影响是积极的，具有正迁移的作用，但同时可能会造成一定的负迁移，因为词义和读音的相似会让一些学生忽略其拼写上的差异。如对machine一词，基本上维吾尔族学生都会准确清楚地读出这一单词，但是拼写的时候大多数会将其写成mashine。这也是由于维吾尔语音和拼写一致造成的，而这种特性会对英语语音及词汇拼写层面产生负迁移，从而表现出语音的准确性与其书写方面的书写不太一致。

英语人称代词和其他代词分门别类，不同的代词指代不同且要求接不同的谓语，使用有其严格的规定。例如：

My brother is a doctor.He works in the People’s Hospita1．

这句话中部分预科生会把he写成she：

My brother is a doctor.She works in the People’s Hospita1.

这是因为在英语中单数第三人称代词包括：he，she，it，him，her，使用时有着严格的区别，维吾尔语则不同，它的所有第三人称单数均用同一个词，这给预科生的英语学习增加了难度，因此，以he或him代替所有单数第三人称代词或者he，she，it三者混用这类错误在初学阶段很常见，由此产生指代偏误和主谓不一致的错误，影响了表达与理解。

3.3语法层面的语言迁移

汉语与英语虽然属于不同的语系，然而这两种语言间的基本语序结构一致，即主语+谓语+宾语（SVO）。预科生在学习英语过程中，在母语与英语之间语序不同而产生语言负迁移的情况时，如在通过对比发现汉语语序与英语相似时，就可以根据自己已掌握的汉语知识将因母语造成的负迁移转化为有益的正迁移。例如：

从基本语序来看，汉语与英语的否定结构比较相似，否定都置于谓语动词之前，维吾尔语的否定则附加在谓语动词之后。在英语基本语序上的学习上，汉语起到的正迁移作用相对明显。此外，英语介词是学习者难掌握的词类之一，名词、形容词、动词在具体使用时几乎都程度不同地要与介词相搭配，甚至同一个词搭配不同的介词表达的意义也不尽相同，这对预科生来说更加困难。因为在维吾尔语中根本没有介词这一词类，英语中介词的意义在维语中主要是凭借格或者后置词的形式表达的。所以，预科生在英语学习中经常出现因不会使用介词而造成介词遗漏或误用的语法错误。

4.结语

通过对维吾尔族预科生母语和汉语在英语学习中产生的语言迁移现象进行对比分析，可以看出语言迁移在外语学习中发生的作用是不可避免的。在教学中，既要重视母语在英语学习中的迁移作用，又不能忽视第二语言在三语学习中的迁移作用。教师必须分析他们犯错误是英语语言本身的困难造成的，还是汉语或维语的干扰造成的。尤其要注意给学生提供英语与汉语和维吾尔语在语音、语法和词汇三个层面上的同异对比分析， 这对于学生克服汉语和维吾尔语对英语学习的干扰会有很大的帮助。

在少数民族学生初学英语阶段，由母语及汉语的影响产生的语言迁移对学生学习英语的兴趣和态度起着重要作用。因此，教师应根据少数民族学生的双语学习背景，从不同方面引导学生正确认识双语迁移对三语学习的影响。引导学生利用已获得的双语知识和经验，使用对比分析的方法对所学内容不懂之处，用母语、汉语进行比较，对其中相似点加以分析和利用，积极促进正迁移的发生，及时改进教学方法，提高预科英语教学质量。

参考文献：

［1］Cenoz，J.HufeisenB.，Jessner，U.eds.Cross-lingual Influence in Third Language Acquisition：Psycholinguistic Perspectives［M］.Cleverland：Multilingual Matters，2001:285-288.

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［5］Taylor，B.Adult language learning strategies and their pedagogical implications［J］.TESOL Quarterly，1975：391-399.

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【关键词】生物信息学 宏基因组 高通量测序

宏基因组（Metagenome）是1998年由Handelsman等人正式提出，定义为特定生物环境中全部微生物遗传物质的总和。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的遗传物质DNA，利用第二代测序技术，得到高通量宏基因组数据，并结合微生物基因组学的研究成果，分析环境样品所包含的全部微生物的群落组成及其结构功能。高通量宏基因组数据在基础微生物学、水体、土壤、农业、医学研究等领域都显示出了重要价值[1]。

1宏基因组学研究方法

宏基因组学的研究方法主要有：环境样本的采集、宏基因组DNA的提取，高通量测序、所得序列的比对检索分析，以及进一步进行微生物物种结构和功能分析。其中，提取DNA要尽可能地提取出样品中所以微生物的基因且保持基因片段的完整，目前的提取方法主要有直接裂解法和细胞提取法。随着第二代测序技术的发展，宏基因组数据呈现出序列短小、通量巨大的特点，一方面蕴含更为丰富的环境微生物遗传物质信息，极大拓展了微生物学研究与应用领域，另一方面也为分析处理带来前所未有的挑战。

2宏基因组学的应用

在短短几年内，高通量宏基因组数据研究已渗透到各个领域，包括基础微生物学、海洋学、土壤学、医学等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术、农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值[2]。

2.1基础微生物学研究

宏基因组为基础微生物学研究打开了新局面，得以快速准确地探测新基因、发现新物种（如未知病原体等）以及准确认识微生物群落的物种构成及其功能结构。由于自然界中大多数微生物物种及其生物量是未知的，其中大量微生物采样困难、培养效率低下，这极大限制了传统微生物学的研究与发展，而高通量宏基因组数据的产生则突破了这一束缚。通过分析高通量宏基因组数据，包括序列比对、De Novo组装、GO分析等等技术，无需经过提纯培养，就能探测新基因、新物种，为微生物环境工程、疾病诊断治疗奠定基础。

2.2海洋学和土壤学研究

海洋和土壤中包含大量微生物，它们与生态环境关系密切。目前通过采用土壤、海水等环境样品，获取高通量宏基因组数据，探测其中微生物的组成及功能分布，能够对导致生态环境变化的因素有更深入的认识。如利用来自海洋石油污染区的微生物高通量宏基因组数据，分析其微生物相对丰度，可以有效探测石油降解细菌及其生态关系网，为污染治理提供新思路。利用来自豆类植物附近土壤测取的宏基因组数据，分析其中固氮菌含量及其关联因素，有助于设计提高豆类产量种植模式。高通量宏基因组数据为认识复杂的微生物群落构成及其功能提供了可能，且必将在研究生物多样性和微生物环境工程中发挥重要作用[3]。

2.3医学研究领域

高通量宏基因组数据在现代医药学中扮演着极其重要的角色，一方面通过疾病样本的宏基因组分析，可以确定病原体或致病基因及其与其他因素之间的关联，为疾病治疗提供可能；另一方面利用宏基因组数据筛选在医药业中具有重要应用价值的基因及其产物，促进医药发展。如利用取自不同牙周炎病况病人口腔高通量宏基因组数据，分析处理得到各样本微生物相对丰度数据，比较不同牙周炎病况下的微生物整体分布情况，揭示出牙周炎与口腔微生物群落的生物多样性和关联网络之间有显著联系。

3结语

随着高通量测序技术的迅猛发展，宏基因组分析已经成为探索自然环境中微生物物种和功能组成的重要手段之一，是研究微生物群落的利器。宏基因组分析手段无需经过复杂严苛的实验室培养过程，直接利用第二代高通量测序技术，快速产生成千上万的自然微生物DNA序列的短读片。但是高通量宏基因组数据也给研究带来挑战。它呈现出序列短小、通量巨大的特点。此外，高通量测序技术的准确率低于传统测序技术，亟需完善的概率统计模型和有效的算法实现[4]。

在应用前景方面，随着组合生物合成技术和纳米技术迅速发展，可以考虑将宏基因组学技术与之结合，利用纳米技术人工合成由宏基因组学的方法探测所得新兴基因，促进天然活性产物的开发及挖掘，进一步促进微生物工程的发展。

参考文献：

[1]许忠能著.生物信息学[M].北京： 清华大学出版社，2009.

[2]贺纪正，张丽梅，沈菊培 等.宏基因组学的研究现状和发展趋势[J].环境科学学报，2008，28（2）： 209-218.

篇4

关键词 微生物 高三复习 生物学教学

中图分类号 G633.91 文献标志码 B

1 引言

浙科版高中生物学涉及到动物学、植物学、细胞学、遗传学、微生物学、分子生物学和生态学等学科的内容，关于微生物的有关内容在教材中的分布则比较分散，导致学生对微生物学内容的学科结构没有形成完整的认识，缺乏对微生物学知识的完整把握，因此教师很有必要对“微生物学”相关内容进行梳理和整合，帮助学生获得微生物学的学科结构和知识体系，从而提高复习的针对性和有效性。

2 让学生通过小组合作，梳理出微生物学内容

教师将学生分成几个小组，让学生阅读教材，找出必修一、必修二和必修三中有关微生物的内容。然后各小组呈现成果，教师将小组总结梳理的结果以表格的形式呈现出来，再由各小组补充完善（表1）。

3 整合内容，确定研究维度

让学生以小组讨论的形式，对表格中涉及到的内容进行维度划分。要确定研究维度，学生必须对微生物内容进行梳理和提炼，有助于他们统领微生物学的全部内容，同时培养归纳和概括能力。教师在此过程中对学生进行方法指导，让学生认识到对某一事物的可以沿着“是什么（本体论）”“为什么（认识论）”“怎么样（方法论）”顺序进行认识。

学生以小组为单位呈现讨论结果，其他小组进行补充修正，最终得到比较全面的维度划分（图1）：（1） 微生物分类及结构；（2） 微生物的代谢；（3） 微生物的增殖；（4） 微生物作为实验材料；（5） 微生物存在的意义。

3 分类处理，各个击破

5个研究维度中，微生物分类及结构、微生物的代谢和微生物的增殖3个维度的内容，通过概念图的形式可以更加清晰的呈现出来。教师先让学生以小组合作的形式进行讨论，总归纳结，然后在黑板上画出概念图，由其他小组评价并完善、补充，最终形成比较完善的概念图。

3.1 微生物分类及结构（图2）

对于微生物的细胞结构，教师主要引导学生分析酵母菌、真菌、霉菌和蓝细菌的结构，从共同点和区别氏个方面分析。学生不难发现，这几种生物都具有细胞壁，但是细胞壁组成存在差异。教师还可以引导学生联系植物的细胞壁一起分析。通过比较，学生对微生物的特有结构更加明晰。

3.2 微生物的代谢（图3）

关于微生物的代谢，教材中对乳酸菌和酵母菌的代谢过程叙述较多，学生能够将这两种微生物的呼吸类型迁移到其他微生物，但是对于不含线粒体的原核生物的需氧呼吸场所存在迷惑。教师可以引导学生阅读课本并做适当解释，从而使学生明确原核生物需氧呼吸的场所是在质膜。学生对于缺乏叶绿体的蓝细菌的光合作用也存在迷惑，教师可以适当拓展：蓝细菌含有叶绿素并具有相应的酶，可以帮助蓝细菌完成光合作用，其光反应的场所就是其含有光合色素的质膜。通过这样的拓展和说明可以消除学生的概念漏洞，丰富其知识背景。

3.3 微生物的增殖（图4）

学生理解“噬菌体侵染细菌的实验”的关键是要理解噬菌体的繁殖过程。因此，教师可以先让学生回忆，然后播放噬菌体繁殖的动画的顺序，帮助学生明确此过程，并让学生思考其他病毒是否也是这样繁殖的，从而引出逆转录病毒。学生通过对比不同病毒的繁殖方式，增加对不同病毒各自特点的认识。

对于逆转录病毒，教师可以呈现HIV病毒在细胞内的繁殖过程的动画，以使学生更加直观地认识到逆转录形成的DNA整合到人类DNA上的过程。这样的基因重组过程可以与肺炎双球菌的转化相联系，教师提供相应的背景材料：S型肺炎双球菌的DNA一条链被水解，另一条进入R型肺炎双球菌，这条单链DNA会与R菌肺炎双球菌核染色体的同源区队配对形成一小段杂合DNA区段，R型肺炎双球菌进行染色体复制，于是杂合区也得到复制，最终R型菌转化出S型肺炎双球菌（实为具有荚膜的R型菌）。然后对学生进行一定的说明和解释。学生对肺炎双球菌的转化一直是知其然不知其所以然，这样的知识缺失对学生思维成长不利。教师通过提供材料的方式，可以让学生明确肺炎双球菌这种自然状态就可以发生基因重组的具体机制，从而帮助学生丰富知识背景，有利于学生更好的理解基因工程，有助于培养学生前后联系的能力。

概念图提供了需要关注的主要方面，教师可以引导学生，在此基础上做进一步的联系和扩展，形成知识间的更为广泛联系，构建起更为复杂的关联。

3.4 微生物作为实验材料

首先，教师要求学生找出微生物作为实验材料的实验：“噬菌体侵染细菌的实验”“肺炎双球菌的转化实验”“烟草花叶病毒的感染和重建实验”“利用大肠杆菌研究DNA复制实验”“探究培养液中酵母菌种群数量的动态变化”。然后，让学生结合每一个具体的实验过程思考并总结：选择微生物作为实验材料的优点有哪些？为什么不选择其他实验材料呢？教师引导学生从繁殖快、操作方便、成本低等角度，总结出选择微生物作为实验材料的优点。

在此基础上，教师还可以进一步拓展：生物学上还有那些常用实验材料？教师引导学生整理、总结生物学中常用实验材料及其对应的实验。这样的关联式延伸可以帮助学生对高中阶段的实验材料形成整体认识，同时使学生认识到实验材料的选择对于生物实验的重要性。

3.5 微生物存在的意义

教师要求学生思考回答微生物存在的意义有哪些，然后提示学生将这些意义进行整理归类，引导学生从3个角度认识微生物存在的意义：物质循环角度；生物多样性的角度；对人类的研究价值角度。

通过角度划分，学生可以更为清晰的明确思考角度，保证知识的整体性认识。

4 反思研究过程

教师引导学生回忆微生物学的整个研究过程，总结如何进行知识的联系和整合，反思自己的研究过程中得失，并通过小组讨论的方式与他人分享。通过这样的反思，学生重新审视自己经历过的研究过程，可以获得更为深刻的认识体验。

5 结束语

充分发挥学生的主动性和创造性是高三复习应然的价值取向，教师应放手让学生去体验自己的学习过程。学科整合式复习可以覆盖微生物学在高中阶段的全部内容，实现了复习的完整性和全面性，并为教师引导学生进行相应知识的拓展提供了更为明确的指向。“整合――拓展”式复习充分调动了学生的积极性、主动性和创造性。在此过程中，学生获得了关于微生物学的整体概念框架，并对以往存在的迷惑的方面在相应的知识拓展中得到了解决，丰富了学生的知识体系，提升了学生分析、综合和概括能力。

参考文献：

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关键词 土壤微生物 分解作用 涂布平板法

中图分类号 G633.91 文献标识码 B

“土壤微生物的分解作用”是人教版高中生物必修内容中的探究实验之一，旨在让学生通过宏观的实验现象了解微观的实验原理，明白微生物在生态系统物质循环中的重要作用。然而由于实验周期长，实验现象较不明显，开展该实验的学校寥寥无几。

1 教材分析与实验条件选择

在人教版“土壤微生物分解作用”的实验中，教材提出了2个参考案例。第一个案例，使用落叶为实验对象，设置灭菌土壤为对照组，对比得出土壤微生物具有分解作用;第二个案例：使用淀粉为实验对象，通过斐林试剂和碘液的显色反应，得出土壤微生物具有分解作用。对比发现，第二个案例实验时间适中，实验现象较为明显;同时复习了斐林试剂的使用方法，较适合开展实验教学。因此，笔者选用第二个案例（土壤微生物对淀粉的分解作用），对“土壤微生物的分解作用”进行实验研究。

温度、淀粉糊浓度和反应时间是影响土壤微生物分解作用的主要因素。笔者选取了15°C、20°C、25°C、30°C和室温等5个温度，2%、4%、6%和8%等4个淀粉糊浓度以及5 d、7 d和9 d等3个反应时间，探究它们对土壤微生物分解作用的影响。

特定土壤的pH是确定值，而pH的变化会影响土壤微生物的分解作用。在确定适宜的温度、淀粉糊浓度和反应时间之后，以pH为变量，继续探究pH对土壤微生物分解作用的影响。

为了使实验结果更具科学性，需要设置对照组。笔者在教材的基础上增加了灭菌土壤浸出液作为第二对照组，排除了土壤浸出液中其他非生物因素的干扰，增加了实验的严谨性。

在教学研究中，有学者使用不同种类的土壤进行实验，以确定哪种土壤微生物的分解能力最强。土壤微生物分解能力的强弱，主要受微生物种类和数量的影响。因此，为了揭示土壤微生物数量对分解作用的影响，笔者根据《微生物实验》的相关内容，采用涂布平板法，对实验的土壤微生物进行计数，初步确定土壤微生物的分解能力。

综上所述，“土壤微生物的分解作用”实验可划分为三个小实验，分别是：（1） 土壤微生物对淀粉分解作用实验;（2） pH对土壤微生物分解作用的影响实验;（3） 土壤微生物计数实验。其中第一个小实验为主实验，第二、第三个小实验为扩展实验。

2 实验设计

2.1 实验器材

实验器具：小烧杯、试管、三角瓶、玻璃棒、pH计、恒温光照培养箱、牛皮纸、纱布。

材料和试剂：土壤、淀粉、斐林试剂、碘液、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、稀HCl、稀NaOH、无菌水。

2.2 实验步骤

2.2.1 土壤微生物对淀粉的分解作用

（1） 土壤浸出液的制备：按照课本介绍的方法制备。

（2） 淀粉糊的制作：分别称取10 g、20 g、30 g和40 g淀粉，溶于500 mL开水中，充分搅拌，制成糊状，得到浓度分别为2%、4%、6%和8%的淀粉糊。

（3） 灭菌：将蒸馏水、部分土壤浸出液、各浓度淀粉糊、实验所用的烧杯和试管等器皿放入灭菌锅中灭菌。

（4） 加样培养：按照课本介绍的方法，在无菌环境中操作加样，并将实验溶液分别放入15°C、20°C、25°C和30°C的培养箱及室温中培养

（5） 显色反应：按照课本介绍的方法取出实验溶液进行显色反应。

2.2.2 pH对土壤微生物分解作用的影响

（1） 土壤浸出液pH的测定和调节：使用北京哈纳HI8424NEW型pH计测出土壤浸出液的原始pH值为8.12;使用稀HCl和稀NaOH溶液，将土壤浸出液的pH上下各调节1.5和3.0个pH单位，选择5.12、6.62、8.12、9.62和11.12等5个pH作为实验pH。

（2） 制作淀粉糊、灭菌、加样、培养与显色反应操作同2.2.1。

2.2.3 土壤微生物的计数（涂布平板法）

计数实验包括配制细菌培养基、倒平板、制备土壤稀释液、涂布和培养等五个步骤，具体操作同《微生物实验》教材。

3 实验结果

3.1 土壤微生物对淀粉的分解作用

实验结果表明，土壤微生物对淀粉的分解作用与温度、淀粉糊浓度和分解作用的时间有关。30°C下，土壤微生物的分解作用最强烈，室温（25°C～30°C）下次之，25°C、20°C和15°C下的分解作用依次减弱。土壤微生物对4%淀粉糊的分解作用最强，其次是2%、6%和8%。随着时间的推移，土壤微生物对淀粉的分解作用逐渐增强;培养的第5 d，已有显色现象;第7 d显色现象显著;第9 d和第7 d的实验现象相差无几。从显色剂的显色效果看，加入斐林试剂的实验现象更直观明显。淀粉被分解后，产生的葡萄糖与斐林试剂作用，生成很明显的砖红色沉淀;加入碘液后，实验溶液依旧变蓝，只是颜色较对照组浅。这说明，一方面斐林试剂的显色效果较显著;另一方面，短时间里淀粉不能被分解殆尽。

3.2 pH对土壤微生物分解作用的影响

pH为8.12的原始土壤浸出液中，微生物对淀粉糊的分解作用结果最明显，出现最多的砖红色沉淀;弱酸（pH6.62）和弱碱（pH9.62）性的土壤浸出液中，微生物对淀粉糊的分解作用结果出现较多的砖红色沉淀，但均少于原始pH的土壤浸出液;强碱性（pH11.12）的土壤浸出液中，微生物对淀粉糊的分解作用结果产生较少的砖红色沉淀;强酸性（pH5.12）的土壤浸出液中，微生物对淀粉糊的分解作用结果产生最少的砖红色沉淀。碘液的显色反应结果并没有明显的差别，说明只有部分淀粉被分解。

3.3 土壤微生物的计数

涂布平板结果显示，土壤浸出液中微生物的含量约为668 889个/mL;根据之前的实验步骤得知，实验土壤浸出液浓度为0.1 g/mL，因此土壤中微生物的含量约为6 688 890个/g（表1）。有教学条件的学校可设计该实验，分析不同土壤微生物具有不同分解作用的原因，让学生更深入地理解和掌握知识，培养学生的科学素养和探究精神。

4 讨论

“土壤微生物的分解作用”实验中，材料易得，操作简单，可以在教学活动中顺利实施。许多学校由于实验时间较长，影响教学安排，而很少开展这一探究活动。但笔者发现，该实验不但可以在短时间内完成，而且能开发出与之相关的教学实验，如pH对土壤微生物分解作用的影响、土壤微生物计数等，这对学生创新思维的培养大有裨益。如果学校教学条件有限，无法顺利开展该实验，可由教师演示或者播放实验录像，以取得一定的教学效果。

在本实验中，笔者并未以土壤类型为实验变量，探究不同土壤中微生物分解作用和微生物数量的异同。但学校在安排教学活动时，可以将学生分组，不同小组以不同的土壤为研究对象开展实验。这样既节约了时间，又可以达到很好的实验效果。

本研究确定的适宜实验条件，可以为广大师生提供参考。各学校也可以借鉴笔者的思路，开展类似实验，并安排不同学生完成不同条件下的实验，最后汇总结果，探讨比较。这不仅能帮助学生培养团队合作精神和创新实践能力，也能激发学生对生物学实验的热情，进一步培养学生对生物学科的兴趣。

参考文献：

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如果有人向你提出这个奇怪的问题，你也许会不假思索地回答：人类就是人呀！然而生物学家会告诉你，我们人类，就是人与寄存在人体躯壳内的大量微生物共生的一个小小的生态系统。

通过基因测序研究人体微生物

早在300多年前，显微镜被发明后不久，科学家已观察到人体内存在微生物。然而，由于检测、分析技术等的限制，人们无法大规模地获取人体微生物群的构成、功能等详细信息，更无法进一步了解这些数量庞大的微生物群与人体是如何相互作用的。

从人类基因组的破译开始，人们才真正对这些微生物有了比较深入的了解。2000年6月26日，当美国总统克林顿与英国首相布莱尔共同宣布人类基因组计划工作草图完成时，整个世界都为之轰动。围绕着破译“生命密码”的研究，引起公众的广泛关注和讨论。很多人曾认为，只要读懂人类基因组代表的“生命密码”，人类的所有健康问题将会迎刃而解。然而，越来越多的科学家发现，人体除受自身基因的调控外，还受到人身上大量的共生细菌的影响。

2007年底，美国国立卫生研究院正式启动为期5年的“人类微生物组计划”，共投入经费1.4亿美元。该计划是继“人类基因组计划”完成之后一项规模更大的DNA测序计划，也被称为“人类第二基因组计划”。其目标是探索研究人类微生物组的可行性。通过绘制人体不同器官中微生物元基因组图谱（包括细菌、病毒等微生物），解析微生物群结构变化对人类健康的影响。同时，为其他科学研究提供信息和技术支持。我国作为参与者也一直积极推动初期研究工作。

欧盟也有类似的研究项目，例如，作为人类元基因组第七框架项目的子项目，人类肠道宏基因组计划就主要研究人类肠道中的所有微生物群落，进而了解人肠道中细菌的物种分布，最终为后续研究肠道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提供非常重要的理论依据。中国深圳华大基因研究院承担了该计划中的200多个欧洲人肠道微生物样品的测序及后续生物信息分析工作。

这一系列研究项目正在揭开人体微生物神秘的面纱。例如，研究发现肠道菌群结构的改变与失衡除了会导致肠道疾病外，还与糖尿病、肥胖等很多慢性全身性代谢性疾病有密切关系，甚至还与癌症有关。微生物甚至还影响着机体免疫系统的发育成熟。越来越多的研究提示，人类健康与人体微生物息息相关，随着人体与微生物之间的关系不断得到阐明，人们对于人体本身的认识、对于健康和疾病的认识以及医疗模式都有可能随之发生根本的改变。

研究发现微生物与人体健康息息相关

2010年3月4日，欧盟于2008年1月1日启动的人类肠道宏基因组计划的研究小组公布阶段性重大成果，引起世界的关注。该项研究成果收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本，采用了新一代大规模高通量的测序技术进行深度测序，产出近6千亿的碱基序列。经过序列组装和基因注释分析，从中获得330万个非冗余的人体肠道宏基因组的参考基因，大概是人自身基因的150倍。这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。从这个基因集中可以估计人肠道中存在1000种至1150种细菌，平均每个人体内含有约160种优势菌种，并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。也就是说，我们每个活着的人体内都有大约100万亿个微生物细胞，总重量约1.5千克。微生物细胞的数量是人体细胞的10倍，在人体的独特基因中占99.9%。它们的构成在很大程度上决定着人体的运转以及机能正常或失常。

美国人类微生物组计划在2012年集中公布了第一批研究数据，来自多个国家的超过200名科研人员报道了他们5年来的研究成果。他们分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。他们发现，来自牙齿和粪便的微生物样本其类型和遗传多样性是最强的;来自皮肤和脸颊内侧样本的多样性次之;而来自阴道样本的多样性是最低的。

科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如，印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。例如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6个月至9个月的时间来获得第一组600～700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。

同时，人体微生物还与免疫系统有着密切的关系。2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成，如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有可能出现自身免疫性疾病等病态变化。研究者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自身免疫性疾病症状的新方法。同期《科学》的另一项研究也提示，在生命早期接触微生物可以减少哮喘或炎症性肠病等疾病的发生。

人类肠道菌群与肥胖

随着科学家们研究的深入，我们对人类体内的微生物，尤其是肠道内的菌群，有了更多的了解。人类的消化系统实际上是一个复杂的生态系统，成百上千种细菌在那里开展各种活动，比如，让未消化的碳水化合物发酵、提供维生素，等等。它们还能调节你身体储存的脂肪量。

不过，并非每个人都有同样的肠道菌群。而且，有趣的是，菌群的组成与肥胖有关。当然，这种关系可能很简单，胖人的饮食不同，所以，他们的肠道菌群也不同。

2013年《科学》杂志发表的一项研究表明，这种因果关系也有可能颠倒过来。研究人员从一些双胞胎小鼠身上取出细菌，双胞胎中有一只肥胖，另外一只不胖。然后，他们将细菌移植到不同的小鼠身上。接受了肥胖双胞胎菌群的小鼠体重增加了，其他小鼠则不然。这些小鼠的进食没有增加：是它们的新陈代谢变化导致了体重增加，即使摄入的热量不变。

那么，是什么决定了你的肠道菌群呢？有可能是抗生素、环境毒素或食品的加工方式。《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究表明，肥胖似乎能在社交网络中“传染”，让朋友和邻居感染上肥胖。我们以前一直认为，那是物以类聚、人以群分的结果―这也确实是部分原因。不过，会不会是肠道菌群也可以在非常亲密的人之间传播，所以，肥胖或许真的可以传染？

生物因素和行为因素之间往往存在相互作用，比如流感的传播就跟我们是否勤洗手关系巨大。同样地，这项对细菌的研究也发现，只有当小鼠的饮食中含有大量饱和脂肪时，“肥胖肠道菌群”才会起到作用。

最有趣的大概是，改变生物因素甚至可以改变人的欲求。一些生物学家推测，我们的肠道细菌其实驱动了我们对某些不健康食品的渴求。所以，重视生物因素并不等于淡化行为因素，而是意味着从更多的维度理解它。

我们身上的微生物正在发生变化

关于人类和与人类共存的微生物，正在发生一些值得我们忧虑的变化。就像全世界的生态系统一样，人类微生物菌群正在失去它们的多样性，以至于可能会损害它们所寄居的主体的健康。

纽约大学医学院传染病专家、 人类微生物组计划负责人马丁・J・布拉泽博士在过去30多年间，一直研究细菌在疾病中发挥的作用。除传染病外，他的研究范围还囊括了自体免疫疾病，以及其他在世界范围内急剧增加的疾病。

布拉泽在他的新书《消失的微生物》中表示，微生物组多样性的减少导致我们更容易感染严重且通常都是慢性的疾病―从过敏、乳糜泻到一型糖尿病和肥胖症。布拉泽及其他人认为，这主要是由抗生素造成的。

布拉泽表示，抗生素很早就开始对微生物多样性产生破坏。普通的美国儿童在出生的头两年要接受大约3个疗程的抗生素，在接下来的8年里，要再进行8个疗程。很短疗程的抗生素治疗就能致使人体的微生物环境发生长期转变，比如，被广泛使用的阿奇霉素。

抗生素并不是破坏平衡的唯一因素。布拉泽接受采访时表示，近几十年，选择剖腹产的人激增，剖腹产促使婴儿内脏中的微生物来自母亲的皮肤，而不是产道。

微生物组的变化能够改变婴儿的新陈代谢和免疫系统。最近，研究人员查阅了15项共涉及16.3796万个分娩案例的研究，结果发现，与顺产的婴儿相比，剖腹产婴儿成人后超重的几率要高26%，肥胖的风险要高22%。研究人员发现，人的胎盘有自己的微生物组，这个微生物组可能也有助于婴儿的内脏健康，减少由剖腹产引发的微生物损耗。

其他研究发现了正常体重者与肥胖者肠道中微生物的主要差异。虽然这些研究不能说明最先出现的是那个问题―体重问题或微生物组的变化，但研究说明，肥胖的老鼠体内存在能够更好地从食物中吸取热量的肠道菌群。与肥胖相关的进一步证据来自农场里的动物。在美国出售的抗生素中，大约有3/4都用在牲畜身上。这些抗生素改变了动物的微生物菌群，加快了它们的生长速度。布拉泽说，当我们把用于牲畜的抗生素用在老鼠身上时，它们的新陈代谢就会发生改变，并促使它们的体脂增加。

更严重的是，如今有越来越多严重的功能失调都与人类内脏的微生物平衡被破坏有关。其中，有多种功能失调在发达国家中变得越来越常见，如克隆氏症、溃疡性结肠炎和乳糜泻胃肠疾病等;心血管疾病;非酒精性脂肪肝;慢性反流症等消化失调问题;多发性硬化和风湿性关节炎等自体免疫性疾病以及哮喘和过敏。

有些研究人员甚至推断，内脏微生物菌群失调是造成乳糜泻的原因，所以，甚至连没患这种病的人对无麸质食物的需求也会激增。乳糜泻旧称非热带脂肪泻，又称乳糜腹泻、麦胶引起的肠病（简称麦胶肠病）。乳糜泻是一种具有遗传性的发生于小肠的自身免疫性疾病，从婴儿到各年龄段的人都会罹患。乳糜泻的症状包括慢性腹泻，生长迟滞（儿童）和疲劳，但有些人症状不明显。在北美、北欧、澳大利亚发病率较高，我国国内很少见。

布拉泽和其他研究人员，还有来自瑞士和德国的一组研究人员也认为，哮喘患病率的大幅上升与“幽门螺杆菌从西方社会快速消失有关”。众所周知，幽门螺杆菌是一种长期寄存在人类胃里的细菌性病原体。曾几何时，几乎每个人体内都有这种细菌，欧洲研究者已经证明，它能防止老鼠出现过敏性哮喘的症状。在人生命的早期阶段，幽门螺杆菌的存在能促使血液中产生T细胞。布拉泽表示，压制过敏反应就需要这种细胞。他的研究表明，虽然有些类型的幽门螺杆菌与消化性溃疡和胃癌有关，但其他类型则具有保护作用。布拉泽和同事的研究进一步表明，胃部的幽门螺杆菌能够防止胃食管返流疾病、巴雷特氏食管（食管下端有不正常的柱状上皮覆盖，称之为巴雷特氏食管。普遍认为是后天获得的，并与反流性食管炎密切相关，并有发生腺癌的可能）和食道癌。

研究者不是总能说明肠道菌群紊乱会在人们生病之前还是之后出现。不过，对实验室动物的研究往往表明，菌群紊乱会发生在生病之前。

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【关键词】 微生物检验；临床应用；质量控制；策略 

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.04.020 

近几年来， 因患有感染疾病而就诊的患儿逐渐增加， 而对患儿给予一定的微生物检验有助于患儿的临床诊断和治疗， 可有效提高质量控制情况[1， 2]。本文对微生物检验在临床应用中的质量控制策略进行相关的研究及探讨， 所研究的相关结果报告如下。 

1 资料与方法 

1. 1 一般资料 选取2013年4月～2015年4月本院所收治的60例腹泻患儿作为研究对象， 按照随机的原则分为对照组和研究组， 每组30例。 住院时间 8～30 d， 平均住院时间（15.78±10.84）d。对照组中男16例， 女14例， 年龄3～10岁， 平均年龄（5.6±3.3）岁；研究组中男17例， 女13例， 年龄2～11岁， 平均年龄（5.5±3.2）岁。两组患儿年龄、性别、住院时间等一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。 

1. 2 方法 对照组腹泻患儿的菌株不进行微生物检验， 医生对本组的腹泻患儿进行大致的观察之后， 结合自身的临床工作经验， 对患儿进行诊断和常规的治疗；对研究组腹泻患儿的菌株先进行微生物检验， 方法为， 检验工作人员进行纯菌种的提取， 使用ID32E肠道菌鉴定试条实施菌株的细菌测试实验， 将测试得到的结果和标准菌株进行一定的对比分析， 使用 ATBG-5肠杆菌药敏条分析实施药敏检验， 并进行一定的对比分析， 使用微生物分析仪进行详细的检测等， 然后根据微生物检验的结果对本组的腹泻患儿实施临床的相应治疗。 

1. 3 疗效判定标准 显效：治疗后， 患儿的临床表现症状均已经消失， 患儿的身体机能逐渐恢复至正常；有效：治疗后， 患儿的临床表现症状得到有效的改善， 但仍需进行一段时间的持续治疗；无效：治疗后， 患儿的临床表现症状没有得到明显的缓解， 或进一步加重。总有效率=（显效+有效）/总例数×100%。 

1. 4 统计学方法 采用spss19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。 

2 结果 

研究组腹泻患儿的治疗总有效率93.33%（显效16例， 有效12例， 无效2例）明显高于对照组76.67%（显效13例， 有效10例， 无效7例）， 差异具有统计学意义（P<0.05）。 

3 讨论 

使用微生物检验法能及时的找出感染的原因， 以便做好医院手术室及病房的相关消毒工作， 并对医院产生的垃圾及废弃物进行有效处理， 切断病原菌的传播途径， 有效控制细菌的传播， 而且， 使用微生物检验法还能对相关的病原菌的耐药性进行了解和掌握， 有效检测所得到患者的肠道及呼吸道的菌群状况， 对易感人群进行有效的预防， 减少感染的发生率。 

微生物检验对于临床感染的质量控制策略主要有：①医院需定期对隔离及消毒的技术给予及时更新， 使用较新的技术实施消毒处理， 在进行医院的相关检验工作时， 需要严格的根据病学的相关资料和原则进行工作， 在完成相关的检验工作之后需要及时的将检验所得到的细菌的耐药性给予公布， 将相关病原菌的记录和统计等工作做好， 对其耐药性的变化进行详细的掌握。②医务工作人员实施微生物的检验工作时， 检验工作人员应先对感染源的相关资料进行搜集， 对医院中的传染源相关信息进行全面的掌握， 并有效保持医院内部环境的卫生等， 减少因环境的原因所引起的细菌滋生情况， 临床检验、诊断、治疗等所应用一次性的用品和医护工作人员的双手均需进行细菌的检测， 并给予有效的消毒和灭菌， 避免发生细菌感染。③检验工作人员需要和患者及患者家属增强沟通与交流， 及时掌握患者的病情变化和发展， 对患者进行及时的微生物检验， 并对具有传染性疾病患者进行隔离， 避免细菌在院内患者、家属、医务人员之间的传播和感染等[3-5]。 

本研究中， 研究组腹泻患儿的治疗总有效率高达93.33%， 要比对照组腹泻患儿的76.67%明显更高（P<0.05）， 可以看出， 对腹泻患儿实施微生物检验确定病菌类型后实施针对性的治疗护理效果较好， 可明显改善患儿的病症， 提高患儿的临床治疗效果， 存在重要临床应用价值。 

总之， 微生物检验在临床应用中具有重要的质量控制作用， 需引起充分的重视和关注。 

参考文献 

[1] 王治国.微生物检验在临床应用中的质量控制.当代医学， 2014， 11（7）：147-148. 

[2] 贡树基， 周伟， 计惠民， 等.微生物检验在临床应用中的质量控制要点探析.中国保健营养（下旬刊）， 2013， 23（7）：4120-4121. 

[3] 贾萍.微生物检验的临床应用与质量控制.现代妇女（理论版）， 2015， 5（1）：313. 

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1微生物指标监测湖泊环境的研究现状

在现阶段的环境评价中微生物指标已经得到广泛的应用。侯春良在唐海湿地生态系统服务功能价值评估和保护研究中表明微生物参与环境的净化,通过微生物的代谢和相互作用调控环境中氮磷浓度,有效降解有机物的浓度[3];丁忠良在黑龙江省湿地生态环境监测指标讨论中,指出微生物的指标包括微生物的种群分布、数量、季节变化、总数、酶类与活性等参数评价湿地的生物多样性具有客观性、实效性,微生物其生长繁殖速度快、适应能力强,所以这样的评估方式更能直观快速的反应湖体的变化[4];杨永兴在研究湖泊的特点时说明在水域变化的过程中有着适应不同变化的微生物群体,伴随这水域环境的变化微生物有这明显的潜育化过程[5]。

2微生物指标在分子水平上的研究

由于自然界中99％的微生物在目前的培养技术下还不能被培养[6],这就极大的限制了人们对微生物种类和数量的认识和了解,但目前分子生物学如16SrDNA技术、变性梯度凝胶电泳技术、宏基因组文库技术等,以及生物信息学应用于极大的促进了人们对于微生物遗传多样性及微生物种群和功能的认知。

PCR-RADP是采用对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片断,操作简便,引物实用性广,对于结果准确性要求比较不高以及亲缘关系近的种属有较高的可信度。SSCP技术基因指纹技术(geneticfingerprinting)是近年来在微生物群落监测中的应用中迅速崛起的用于分析微生物群落的结构、动态等特征的技术,该技术不需要对微生物进行培养。rRNA基因同源分析方法是多种分子生物学技术的组合,它通过对微生物的rRNA进行分析揭示微生物的多样性是微生物分子生态学的重要方法,目前已经取得了大量的成果。

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【关键词】微生物燃料电池，研究，应用

微生物燃料电池（Microbial Fuel Cell，MFC）是一种利用微生物将有机物中的化学能直接转化成电能的装置。其基本工作原理是：在阳极室厌氧环境下，有机物在微生物作用下分解并释放出电子和质子，电子依靠合适的电子传递介体在生物组分和阳极之间进行有效传递，并通过外电路传递到阴极形成电流，而质子通过质子交换膜传递到阴极，氧化剂（一般为氧气）在阴极得到电子被还原与质子结合成水。

一、作用原理

参与传递电子的介体与微生物和阳极之间的作用形式有三种：（1） 微生物将氧化还原反应产生的电子直接传递给溶解在溶液中的介体，介体再将电子传递给电极；（2）介体能进入到微生物体内，参加反应被还原，从微生物体内出来后再将电子传递给电极；（3） 微生物吸附在电极表面，它将反应产生的电子传递给在细胞表面的介体，再通过介体传递给电极。

二、研究目的和意义

目前，我国工业化进程发展迅速。在工业化快速推进过程中，对能源的需求和依赖日益增长。然而，目前支撑着工业和经济发展的化石燃料已经难以为继。因此，发展新能源和可再生能源，减少对国际石油市场的依赖，已经成为我国重要的战略性布局。微生物电池不仅用于产生清洁能源，还能净化污水。污水处理费时费钱还消耗大量能量，基本是个只投入不产出的行业，也是让各国政府头疼的一大难题。因此，又能净化水质，又能发电的微生物燃料电池一旦出现，将有望把污水处理变成一个有利可图的产业。微生物燃料电池（Microbial fuel cell， MFC）是一种以产电微生物为阳极催化剂将有机物中的化学能直接转化为电能的装置，在废水处理和新能源开发领域具有广阔的应用前景。虽然目前已发现很多产电微生物，如希瓦氏菌、地杆菌、克雷伯氏杆菌等，但这些菌种均只能在中性条件下产电。理论上，碱性条件可以抑制甲烷的产生从而有利于电能输出，而且碱性废水是工业废水的重要组成部分。产电微生物如何将有机物代谢产生的电子传递到电极上一直以来是MFC研究的一个重要方向，因此，研究碱性条件下的微生物产电机制对MFC的电能输出与碱性废水的生物处理均有重要意义。中国科学院成都生物研究所应用与环境微生物中心李大平研究员课题组在微生物燃料电池的产电机制研究方面取得突破性进展。他们从污染环境中分离出一株嗜碱性假单胞菌（Pseudomonas alcaliphila），该菌株在碱性条件下能够分解有机物的同时产生电能，最佳pH为9.5。通过研究发现，该菌株在MFC体系中代谢有机物的同时产生吩嗪-1-羧酸介体（phenazine-1-carboxylic acid，PCA），该介体起电子穿梭的作用从而实现电子从有机物到电极的传递过程。

三、研究内容与方法：

1、微生物燃料电池的菌种群落的培养

产电细菌是微生物燃料电池的核心构件。产电细菌的电化学活性直接决定了微生物燃料电池的能量密度。而对于微生物燃料电池中的微生物， 不论是自身具有电化学活性，还是进行种间电子传递，对于它们构成的生物群落的研究刚刚开始。本项目将依托舟山地区得天独厚的自然地理环境和丰富的微生物群落，通过对海底沉积物的选取和以及细菌培养，以期能够发现新型产电细菌，提高海底微生物燃料电池的功率密度， 并研究其产电机理。

2、海洋沉积物微生物燃料电池系统的设计和优化

微生物燃料电池系统主要包括三个要素：阳极，阴极和膜。 由于海洋沉积物燃料电池工作于海水环境中，海水中含有高浓度的盐分，工作环境恶劣，这将对海洋沉积物燃料电池的构件提出了更高的要求。另外，微生物燃料电池的造价也会直接影响微生物燃料电池的实用化进程。在微生物燃料电池的使用中，一般使用氧气做电子受体，碳担载的贵金属纳米粒子（Pt）作为氧还原催化剂并用交换膜将微生物燃料电池的阳极和阴极隔开。贵金属催化剂的使用，提高了微生物燃料电池的成本，并且，海水中的氯离子会对Pt催化剂产生毒化作用，这将会造成微生物燃料电池的效率损失。因此，本项目将设计一种新型的微生物燃料电池系统，采用双极膜作为微生物燃料电池阴极与海水的分隔物，利用水离解产生的氢氧根和氢离子作为传输介质，隔绝海水中氯离子对阴极催化剂的毒化作用这是本项目的技术关键。

四、研究目标与结果

第一部分为对原有燃料电池的改造：本实验室原有燃料电池反应器多个，但是由于微生物燃料电池中微生物为厌氧性细菌，需要将燃料电池原有气室改造为适合微生物生长的密闭培养室。

第二部分为培育和优化产电菌种群落：本项目将分别从小黄蟒岛等具有代表性的岛屿处选出海底沉积物，在燃料电池细菌培养室内培养，启动并测试微生物燃料电池的功率密度，以期能够得到高功率，非硫还原的产电菌种。

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（1.中国海洋大学环境科学与工程学院，山东 青岛 266100；

2.青岛理工大学环境与市政工程学院，山东 青岛 266033）

【摘　要】微生物群落是生态系统中最活跃的结构单位和功能单位，因此了解各种环境中微生物的群落结构有着重要的意义，其研究的技术也一直在进步。高通量测序可以一次获得多条基因序列，使得其在环境微生物学中的研究中倍受青睐。探讨了454高通量测序早在环境微生物学中的应用。

关键词 高通量测序；环境微生物；微生物群落结构

微生物群落是广泛存在于生态系统中的一种结构单位和功能单位，它们是生态系统内较为活泼的一部分。群落中各种不同的种群能以有规律的方式共处，进行相互作用，同时它们具有各自明显的营养和代谢类型。了解微生物群落结构的方法主要有分子生物学的方法、Biolog法以及近年来发展起来的高通量测序技术。

1　高通量测序技术

随着科技的迅猛发展，测序技术也在进步，这些测序技术可以在种的水平上对环境微生物进行分析和研究。出现在上世界70年代的Sanger测序法[1]，成本高测序通量低，成为了其广泛使用的限制因素，但它却是20世纪90年代到本世纪初期一直在使用的测序技术。

人类基因组这样庞大的序列分析工作需要，使得新一代的测序技术也发展了起来。它的特点是价格低通量高，高通量则指的是每次分析都能得到几十万或几百万条DNA的序列。454高通量测序是由454生命科学公司在了2005年开发的，2007年，该公司了GS FLX系统，2008年了它的升级GS FLX Titanium。

现在新测序技术的主要平台主要有[2]：罗氏454公司推出的GS FLX+system测序平台，Illumina公司推出的MiSeq测序平台，和ABI公司的Solid测序平台等。本研究使用的是454高通量测序技术。

454高通量测序原理[3]：它采用的是焦磷酸测序法，是4种酶催化统一体系的酶级联化学发光反应。首先将 PCR 扩增的单链 DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5&acute;-磷酸硫酸腺苷共同孵育。在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光。CCD检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

扩增和测序可以高度保留细菌的遗传特性，是一种很常见的来确定其分类和组成的方法。通过比较现有的数据库，可确定其来自哪个生物的序列，从而确定细菌门类和各自占据的比例。

2　高通量测序技术在环境微生物中的应用

454高通量测序可以得出某个土壤区域或者生物膜中各种菌类组成，从而研究该区域微生物物种多样性；通过测序可以得到微生物的群落结构、组成，再与微生物活性、营养元素的转化等理化性质结合一起分析，来研究微生物的功能多样性。

张彩霞[4]等运用454高通量测序来研究甘肃不同地区的土壤由荒漠变成百年老农田、约30年的农田、约20年的农田、樟子松林等过程中土壤微生物群落结构变化规律及其影响因素，对比对照组的土壤发现，在由天然荒漠土壤转变成为不同利用类型的土地土壤过程中，具有从多变少再变多的趋势。在天然荒漠土壤中，微生物总量的96%以上，在土壤转变的过程中其生长受到了抑制，有4%的微生物在次过程中生长受到了促进。这个结果表明了土壤的微生物群落结构会受到土地利用类型变化的显著影响。

Michaela等[5]人利用高通量测序技术研究了森林凋谢物和土壤中微生物的细菌和真菌群落结构，对28个站点的样品进行分析，发现凋落物和土壤中存在着不同的微生物群落结构。其中，细菌的多样性要比真菌丰富，尤其是在凋谢物中，细菌群落表现出了更高的均匀度。无论是凋谢物还是土壤中的微生物群落结构，都显著受到了树种的影响。

李鑫等[6]运用高通量测序技术分析了盐碱地中，桑树与大豆单作和间作不同种植模式的土壤细菌微生物群落结构差异性。结果显示，间作时土壤的微生物多样性要比单作丰富，即间作使得土壤的微生物群落结构多样性有所提高。同时间作也改变了大豆和桑树的根基微生物群落结构。在盐碱地的种植中，间作不仅可以降低土壤碱性，还使得土壤的群落结构多样性有所提高，植物产量增加。

夏围围等[7]将新一代高通量测序技术与DGGE两种技术结合使用到了研究是新西兰典型草地和森林土壤微生物群落结构上，以16S rRNA基因为标靶, 通过两种技术来分析土壤微生物群落的结构组成和多样性，同时以此来比较两种技术的优缺点。测序分析结果显示，新西兰草地土壤检测到22门，54纲，60目，131科和350属；而DGGE却只检测到6门，9纲，8目，10科，10属，这表明了高通量测序比DGGE能更完整的表达出微生物的群落结构组成。同样的，在森林土壤也显示出了类似的规律。

3　结论

目前，高通量测序技术仍处于发展的初期，但我们可以预见，在未来几年将是第三代测序技术快速发展和三种测序技术的共存的黄金时代。测序成本将继续迅速下降。科学家们在不同的领域将可以花更少的钱测序基因组物种或转录来达到更好的实验结果和获得更多的新的发现。此外，如何分析通过高通量测序产生的大量数据和从这些数据中提取有价值的生物信息将成为未来研究的热点和重点。

参考文献

［1］Sanger F, Nicklen S，Coulson AR. Proceedings of the National Academy of sciences of the United States of America[J].1977,74:5463-5467.

［2］Quail MA,Kozarewa I,Smith F,Scally A,StephensPJ,Durbin R,Swerdlow H,Turner DJ. Nature Methods[J].2008,5:1005-1010.

［3］Meyer M,Stenzel U,Hofreiter M.Nature Protocols[J]. 2008,3:267-278.

［4］张彩霞.新一代高通量测序技术研究土壤微生物群落结构对环境条件的影响[D].南京:南京农业大学,2012.

［5］李鑫.苏打盐碱地桑树/大豆间作的土壤微生物多样性研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2012.

［6］夏围围,贾仲军.高通量测序和DGGE分析土壤微生物群落的技术评价[J].2014,12:1489-1499.