经济纠纷起诉书范文

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篇1

SymbolmA@ g/L范围内与体系荧光强度呈线性关系，相关系数R为0.9998，检出限为0.08

SymbolmA@ g/L，回收率为90%～100%；与国标方法及速测方法比对分析，检测结果均无显著性差异。

关键词 β环糊精；黄曲霉毒素B1；荧光增强；三元络合物

1 引 言

黄曲霉毒素B1（AFB1）于 1993年被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，对人类健康危害极大。我国相关的限量标准已经过多次修订（20

SymbolmA@ g/kg），但是相对于国际上所制定的限量标准（WHO/FAO规定为15

SymbolmA@ g/kg，EU规定为2

SymbolmA@ g/kg[1]），仍然明显偏高[2]，因此亟需研究AFB1衍生试剂,以提高检测灵敏度。目前,常用的强氧化剂有三氟乙酸和卤族元素及衍生物等，但存在需加热、稳定性差、试剂有腐蚀性，保存寿命短等不足，研究安全而稳定的新型荧光增强剂，提高光学系统灵敏度，成为研究黄曲霉毒素检测技术的重要发展方向。

βCD是超分子化学最重要的主体[3]，利用βCD及其衍生物和多类客体分子形成超分子体系过程荧光强度发生变化的特性，将其作为荧光增敏试剂的研究和应用越来越多[4～9]，但在食品安全高灵敏度检测技术的开发领域，缺乏利用βCDs三元络合反应进行荧光增强作用的探索与研究[10]。本实验对βCDsMAFB1三元体系进行了研究，通过超分子包络作用研究AFB1荧光增强效应。实验表明，βCDsM可作为AFB1的新型高效荧光增强剂。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F2500荧光分光光度仪（日本日立公司）； UV2450紫外分光光度计（日本岛津公司）；NYARTI型AFB1定量荧光速测仪（华夏科创有限公司）。

AFB1（1 g/L甲醇溶液，美国Sigma公司）;甲醇（色谱纯，天津四友公司）；β环糊精（βCD）、2,4二甲基β环糊精（DMβCD）、羟丙基β环糊精（HPβCD）、羟乙基β环糊精（HEβCD）、甲基β环糊精（MβCD）、葡萄糖基β环糊精（分析纯，山东新大精细化工有限公司）；HgCl2（分析纯，贵州铜仁汞试剂公司）；NaCl， FeCl3， MgCl2和CaCl2（分析纯，成都市科龙化工有限公司）。

2.2 实验方法

取1 mL混合均匀的AFB1样液（溶剂中甲醇比例均为50%）于1.0 cm石英比色杯，进行荧光激发与发射光谱的扫描，仪器狭缝均为5 nm。

取特定浓度AFB1标准品溶液，加入适量HgCl2和βCDs溶液（为调整甲醇/水比例，加入适量甲醇和水），混合均匀，用1.0 cm石英比色杯测量最佳激发与发射波长处荧光强度，狭缝均为5 nm。

移取适量AFB1标准液于试管中，依次加入1000倍体积的甲醇，200

SymbolmA@ L 0.01 mol/L HgCl，800

SymbolmA@ L 0.01 mol/L βCD（即最终溶剂中甲醇比例为50%），充分振荡，同时做试剂空白，绘制工作曲线。

提取与净化：参照GB/T 189792003[12]。在净化后的甲醇洗脱液中加入200

SymbolmA@ L HgCl2，混匀后加入800

SymbolmA@ L 0.01 mol/L βCD溶液，混匀，于荧光光度计中读取荧光值，带入标准曲线计算其浓度。

2.3 AFB1IAC速测方法

准确称取5.00 g样品，加入15 mL 70%甲醇（含4% NaCl）；50 ℃水浴超声提取3 min，漩涡振荡；抽滤，收集滤液4 mL，加入2 mL石油醚，振荡混匀后萃取；取下层溶液3 mL，加入8 mL纯水，混合液过0.45

SymbolmA@ m双层滤膜；滤液全部上免疫亲和微柱纯化（1.5 mL/min），以7 mL水洗涤，1 mL甲醇洗脱，收集洗脱液；加入1 mL纯水混匀，移入比色皿，在速测仪中测定荧光本底值；加入200

SymbolmA@ L荧光增强剂，混匀，于速测仪中测定AFB1含量。

3 结果与讨论

3.1 金属离子对AFB1荧光的影响

按照2.2节的方法，对400

SymbolmA@ g/L AFB1进行光谱扫描，确定AFB1荧光增强体系的最大激发波长为365 nm，最大发射波长为432 nm。

某些金属离子，尤其是Hg2＋，能够与AFB1形成金属螯合物，可大幅提高AFB1荧光强度。本实验结合前期工作，进一步考察了不同金属离子（浓度相同）对三元络合反应的影响。Fe3＋有猝灭作用，Hg2＋对AFB1体系荧光增强效果明显优于其它金属离子。这可能是由于Hg属于过渡金属元素，易形成配位数为6的配合物，其几何构型通常是相当于6个配位原子占据八面体或变形八面体的角顶，增强了配合物AFB1Hg2＋共轭平面，加大了刚性结构[3]。实验表明，此配合物与βCD形成了三元超分子包络物，荧光强度大大增加。

3.2 βCDs种类对βCDHgAFB1体系荧光的影响

不同βCDs衍生物对AFB1均有荧光增强作用，葡萄糖基βCD荧光增强幅度相对较小。其原因可能是其余4种衍生物均属于环糊精醚衍生物，仅葡萄糖基βCD属于单支链环糊精，取代基分子较大，对客体分子进入空腔造成了一定程度的阻碍。除葡萄糖基βCD外，βCD对其余4种衍生物的荧光增强值无显著性差异（p＞0.05），且βCD成本较其衍生物更为低廉，约为其它βCDs价格的1/10，更适宜作为新型荧光增强剂。

3.3 AFB1HgβCD体系的光谱特性

对各体系荧光光谱特性进行比较（图1），βCDHg2＋甲醇/水溶液在365/432 nm处无荧光产生。AFB1HgCl2βCD， AFB1βCD， AFB1Hg2＋反应体系的

[TS（][HT5”SS] 图1 体系的激发和发射光谱

Fig．1 Excitation and emission spectra of systems（20

SymbolmA@ g/L aflatoxin B（AFB1））

1. HgCD; 2. AFB; 3. AFB1Hg; 4. AFB1CD; 5. AFB1HgCD.[HT][TS）]

最大激发波长基本未移动，说明基态分子结构均没有发生变化。AFB1HgCl2βCD， AFB1Hg2＋的最大发射波长发生了相同的变化（432 nm到440 nm），说明AFB1与 Hg2＋很可能发生了配位反应，形成的AFB1Hg2＋螯合物作为客体分子被包合在βCD空腔内。同时，三元络合物的增强程度很大，没有其它峰干扰，可以有效提高检测的灵敏度和选择性。分析反应前后体系荧光强度增加的可能原因为：βCD空腔为AFB1的生色团提供了一个非极性环境，使其处于去水化状态，对增进量子效应从而增强荧光强度提供了有利的条件；当AFB1包合进βCD分子的空腔后，βCD腔的构造保护了AFB1的荧光单级态分子免于外部猝灭；由于增加了疏水性AFB1在水中的溶解度，使得荧光强度增加。

将各体系紫外吸收光谱进行比较（图2），在AFB1中加入Hg2＋后，最大吸收波长发生了明显的蓝移（364 nm到374 nm），表明AFB1和Hg2＋之间存在着某种相互作用，该作用可能与AFB1和Hg2＋形成金属螯合物有关。在AFB1Hg2＋中加入CD后，最大吸收波长未发生变化（仍为374 nm），但吸光度增加。可以推测，AFB1Hg2＋螯合物作为客体分子进入βCD空腔内，形成了稳定的复合体，AFB1的共轭程度增加，从而增强了荧光强度。

3.4 荧光增强效应的影响因素

3.4.1 溶剂中甲醇比例 AFB1易溶于有机溶剂，在水中溶解度极低，在水相中易发生荧光猝灭作用；而βCD溶于水，并能够增加AFB1在水相中的溶解度。在分析过程中，选择适当的甲醇/水比例，能够更好地达到增强荧光的效果。当甲醇/水的体积比为1∶1和5∶3时，反应时间短，反应稳定，荧光增强值高，且无显著性差异（p＞0.05），考虑到检测成本，选择甲醇/水（1∶1, V/V）。对反应时间进行了考察，混匀后即可测定，48 h内保持稳定，表明形成的三元络合物稳定。

3.4.2 反应摩尔比 当HgCl2， βCD与AFB1摩尔比均大于300:1时，反应完全, 且浓度升高对反应没有影响。AFB1污染具有不均匀性，有高浓度含量样品检测，因此要确保Hg2＋过量，使测定准确快速稳定。通过计算最终确定加入200

SymbolmA@ L 0.01 mol/L HgCl2溶液。包合反应是可逆反应，体系中反应物浓度高有利于化学反应，因此确定0.01 mol/L βCD加入量为800

SymbolmA@ L。

3.4.3 衍生方法 采用两种衍生方法：①先加入HgCl2，混匀后再加入βCD；②先加入βCD，混匀后再加入HgCl2。分别测定体系的荧光强度，结果表明，按照方法①进行衍生能够达到更好的荧光增强效果。推测原因为AFB1与Hg2＋先形成配位体，再被βCD包合于空腔内形成三元络合物。若按照方法②进行衍生，βCD空腔的构造保护了AFB1的荧光单级态分子免于从外部猝灭，从而不能与HgCl2完全螯合，未螯合的AFB1仅能形成AFB1βCD二元包合物或形成部分AFB1βCDHg三元包合物，因此不能

[FQ（8。22，Y－WZ][HT5”SS][HJ*4]表1 不同荧光增强剂对AFB1荧光增强比较

References

1 EU.No165/2010

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Studies and Application of Fluorescence of Aflatoxin B1 Enhanced by

Synergetic Effect of βCyclodextin and its Derivatives and Metalions

ZHANG Min1, ZHANG Yuhao1，2, MA Liang*1，2

1（College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716）

2（Food Engineering andTechnology Research Center of Chongqing, Chongqing 400716）

Abstract Fluorescence enhancement of AFB1 by system of βCDM was studied by fluorescence spectrophotometry. In system of βCDHg, fluorescence intensity of AFB1 was markedly enhanced. When ratio of methanol in solvent was 50%, reaction molar ratio of βCD and HgCl2 with AFB1 were both more than 300∶1, the fluorescence enhancement could achieve the maximum16 times, significantly higher than various derivation reported and in National standard. βCDHg was used as new fluorescence enhancement agent to replace traditional derivation, in order to improve the detection sensitivity. And a high sensitivity and rapid determination of AFB1 was established. The fluorescence intensity was linearly related to the AFB1 concentration in the range of 0.1－40

SymbolmA@ g/L with a correlation coefficient of 0.9998. The detection limit was 0.08

SymbolmA@ g/kg. The recovery was between 90－100% by spiking 10

SymbolmA@ g/kg of AFB1 in samples. There are no significant differences between the new method and national standard method, as well as fast method.