微生物方法学研究范文

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篇1

[关键词]乌芪舒筋通络片；微生物限度；方法学研究；《中国药典》2015年版

[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04

[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method，the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method，and the recovery was between 0.5 and 2，Escherichia coli，Salmonella，Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method，the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method，and the control bacteria can be tested by direct inoculation method，the methods used are feasible，and easier to operate，which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.

[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition

踯问钔络片是根据我院省名中医验方制成的纯中药制剂，具有补肝肾，通络止痛的作用，由细辛、制川乌、制草乌、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走马胎、羚羊角骨、牛膝、黄芪、杜仲、续断、甘草等药味组成[1]。该制剂微生物限度检查法原按《中国药典》2010年版进行方法学验证[2]，随着《中国药典》2015年版的实施，新版微生物限度检查方法变化很大，必须重新进行验证。为此，本研究按《中国药典》2015 年版四部“1105、1106、1107”项下方法[3]，对该制剂的微生物限度检查方法进行了再次验证研究，制订了新的切实可行的微生物限度检查法，替代了旧标准，并应用于该制剂的日常检验，使该制剂的微生物限度检查法提升到新版《中国药典》的水平。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SZX型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；YXQWF32-500卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；LRH-250A生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；CX31生物显微镜（奥林巴斯）；HTY HOMO761匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品）。

1.2 样品

乌芪舒筋通络片（肇庆市中医院，批号：15050401；15051102；15052401）。

1.3 菌种

实验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]，并采用适宜的保藏方法保存，确保试验菌株的生物学特性。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌种均来自于中国食品药品检定研究院。

1.4 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3105210）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：3105120）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：3105054）、麦康凯液体培养基（批号：3105291）、麦康凯琼脂培养基（批号：3105138）、RV沙门增菌液体培养基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：3104852）、三铁塘琼脂培养基（批号：3105052）、肠道菌增菌液体培养基（批号：3105093）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：3104750），均由广东环凯微生物科技有限公司生产，使用前先进行培养基的适用性检查，并且在有效期内使用，培养基的制备按照标示方法进行。

1.5稀释液、冲洗液

pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3105256）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、0.9%无菌氯化钠溶液（自制）。

2 方法与结果

参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[3]进行验证。

2.1 菌液制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 h；分别取各培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制成每毫升含菌数为

2.1.2 白色念珠菌

取白色念珠菌的新鲜培养物接种至100 ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 d，取培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制备成每毫升含菌数

2.1.3黑曲霉

取黑曲霉新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子。再选用适宜的方法将孢子悬液吸至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每毫升含菌数

2.2 供试液的制备

取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基至100 ml，用匀浆仪打碎，混匀，作为1∶10的供试液。量取1∶10的供试液10 ml，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 ml，混匀，作1∶100的供试液。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1 平皿常规法

2.3.1.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶10的供试液5份，每份100 ml，分e加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固，30～35℃中培养≤3 d，计数。

霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10的供试液2份，每份100 ml，分别加入白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，20～25℃中培养≤5 d，计数。

2.3.1.2 供试品对照组 取1∶10的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。

2.3.1.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下方法操作，加入试验菌液并进行微生物回收试验。

2.3.1.4 计算 各菌株的回收率（R）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%[5-6]，依据《中国药典》2015年版四部规定，比值R应为0.5≤R≤2[7-9]（表1）。

2.3.2 平皿稀释法

2.3.2.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶100的供试液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”项下方法操作。

霉菌和酵母菌总数计数：采用平皿常规法R为0.5～2，所以不再进行稀释法研究。

2.3.2.2 供试品对照组 取1∶100的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。

2.3.2.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶100的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液并进行微生物回收试验。

2.3.2.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表2。

2.3.3 薄膜过滤法

2.3.3.1试验组 取1∶10供试液10 ml，滤过，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，分2次冲洗滤膜，在第2次冲洗中加入相应的菌液适量（含菌量≤100 cfu），滤过，取出滤膜，需氧菌检查将膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中，在30～35℃下培养，≤3 d，霉菌和酵母菌检查将膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，在20～25℃下培养≤3 d。

2.3.3.2 供试品对照组 取1∶10供试液10 ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。

2.3.3.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液，同时进行微生物回收试验。

2.3.3.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表3。

由表1～3可知，乌芪舒筋通络片需氧菌总数计数检查采用平皿稀释法、薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数检查采用平皿常规法、薄膜过滤法，R均在0.5～2内，符合《中国药典》2015年版四部微生物学限度检查验证的要求。考虑到实际操作中，平皿常规法、平皿稀释法操作简便，优于操作繁琐的薄膜过滤法，故需氧菌总数计数法可选用培养基稀释法，霉菌和酵母菌总数计数检查选用平皿常规法为最佳方法。

2.4 控制菌适用性试验

2.4.1耐胆盐革兰阴性菌检查验证试验

取1∶10供试液适量，混匀，20～25℃培养2 h，作为预培养供试品。取预培养供试品3份，每份10 ml，分别加入10 ml肠道菌增菌液体培养基，第1份加入1 ml缓冲液作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大肠埃希菌阳性对照组，第3份加入1 ml铜绿假单胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基10 ml，加入10 ml肠道菌增菌液体培养基及1 ml缓冲液，作为阴性对照组。于30～35℃培养24～48 h，划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃下培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表4。

2.4.2大肠埃希菌检查验证试验

取1∶10供试液2份，每份10 ml，分别加入到100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组；另取胰酪大豆胨液体培养基110 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，均于30～35℃中培养18～24 h。

取以上培养物1 ml加入到100 ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48 h。然后划线接种于麦康凯琼脂平板上，在30～35℃下培养18～72 h，观察菌落形态，结果见表5。

2.4.3沙门菌检查验证试验

取1∶10供试液2份，每份100 ml，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml沙门菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基100 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，在30～35℃下培B18～24 h。然后分别取培养物0.1 ml，接种至10 ml RV沙门增菌液体培养基中，在30～35℃下培养18～24 h，取少量RV沙门增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培养基上，在30～35℃下培养18～48 h，用接种针挑选疑似菌落，进行斜面和高层穿刺接种于三糖铁琼脂培养基上，于30～35℃中培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表6。

由表4～6可知，控制菌检查采用直接接种法，即可达到要求。

3讨论

2015年版与2010年版《中国药典》相比[10-11]，微生物计数法适用性试验，从对细菌总数作方法适用性检查，变成对需氧菌总数作方法适用性试验，试验菌株3种变为5种；培养基由胰酪大豆胨琼脂替代营养琼脂，用于检查需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂培养基代替玫瑰红钠培养基，用于检查霉菌与酵母菌，虽然增加了试验的工作量，但却具有良好的广谱性，提高检出率，方法更灵敏[12]。对控制菌的检查，新版删除了大肠菌群的检查，新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查[13]，对含有药材粉末的固体口服给药制剂都必须检查沙门菌，提高了对致病菌控制的要求。

乌芪舒筋通络片处方药味中多种成分含有抗菌活性[14-15]，由实验可知，对需氧菌具有抑制作用，故需氧菌总数计数检查时采用常规平皿法回收率较低，需选用平皿稀释法或薄膜过滤法。

在实际工作中，匀浆仪打碎样品时，经常出现泡沫，往往对验证结果造成影响，待泡沫消除后再加入菌种，基本能消除由操作引起的影响。

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篇2

一、生物实验教学中培养学生思维方法存在的问题

目前中学生物实验中，教师对学生思维方法的培养上存在一些问题。一方面，教师给予学生过多过细的指导，学生缺少探索、自由发展的情境，不利于发展学生的探究能力，更不利于学生应对当今的高考模式；另一方面，学生不能使知识成为解决实际问题的思维方法。在实验课上，常常反映出理论归理论，不能有效地把所学的理论彼此联系，灵活地应用于实验，不能使知识成为一种动态的知识。鉴于以上出现的问题，我们每一个高中生物教师都应该转变思路，重视实验教学中的思维方法与实验设计训练。

二、生物实验教学中学生思维方法与探究能力的培养

1.重视经典实验的教学，让学生学会科学实验的思维方法。大多数的生物概念、原理和规律都是建立在实验基础上的。我们应仔细分析书中的经典实验，比如演示实验（渗透作用实验装置）、模拟实验（基因的分离定律）、验证实验（植物细胞质壁分离和复原实验）、杂交实验（孟德尔豌豆杂交实验）、探究实验（生长素发现实验）等，同时引导学生学习经典实验设计的技巧、科学的研究方法（观察实验——提出问题——作出假设——反复实验——验证实验——形成规律）。严谨的、实事求是的科学态度和持之以恒的科学精神，有助于培养学生建立科学实验的思维方法。例如“孟德尔的基因分离定律研究”成功的原因在于：实验材料选择适当；有科学的实验设计程序（假说—演绎法）；有科学的研究方法（先研究1对相对性状，再研究多对相对性状）及统计方法（观察子代性状分离现象，统计每一种子代数目）等。

2.开放实验室，让学生边动手边领悟实验的各个关键环节。课本中的实验和其他知识点一样是基础知识、基本能力的载体，在最近几年的生物高考题中也有意识地强调这一点。因此，在高三复习中，我们应尽量让学生亲自动手做实验，将《考试说明》中所列的实验从实验目的、原理、方法和操作步骤等方面进行综合分析，掌握相关的操作方法和技能，并能综合运用其解决问题。

例如，2011年江苏高考第10题（题目略）。本题考查的是书本实验的综合，涉及用显微镜观察多种多样的细胞、检测生物组织中的脂肪、观察植物细胞的质壁分离和复原。这道题的关键在于把握题干中的“直接”二字。在光镜下可看到的对象有较大的如液泡；本身有颜色的，如叶绿体；或者经特殊染色的，如染色体、线粒体、脂肪。B项中的花生子叶和C项中的线粒体因未作染色，所以不可见；D项中的紫色洋葱鳞片叶外表皮细胞内体积相对较大的紫色液泡，占据了很大的视野，因而也不易观察到细胞核。要想能正确地解答此类题，教师要引导学生对教材中的基本实验有一个清楚的认识，尝试从实验情境的角度来分析确认相关描述的准确性。如果我们在平时的教学中让学生亲自动手做实验，那学生的解题能力就会大大提高。正如一位专家所讲：“不做学生不知，老师也未必知。”

3.借助实验思维进行试题分析，提高学生解决问题的能力。在平时的教学中，我们引导学生进行题目分析时，一方面要让学生借助实验思维，排除干扰信息，提高解决问题的能力；另一方面让学生借助实验思维，依据实验目的，提高表达能力及归纳、比较、推理等逻辑思维能力。

例如，2011年江苏高考第31题（题目略）。本题中对怎么操作交代得很清楚，为什么要这样操作，还要注意什么问题，则需要考生在本题的情境下作出仔细的分析和推理，学生只有具备较强的思维能力，才能很好地解答本题。2011年江苏卷28、30、31三大题均为实验分析题，有各自的情境，提供信息的渠道丰富，问题的角度也有所不同，但都很强烈地传递了一个信号——重视生物实验思维分析，重视学生实验探究能力的考查。因此，我们在平时的教学中一定要充分意识到实验题的重要性，训练学生解答实验题的思维能力。

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在一所学校里，无论是校园文化建设还是课堂改革，无论是学校规划发展还是学生养成教育，都需要教师的参与，教师的处事态度、工作方法将直接影响到学校工作质量。而长时间单调、繁重的教学生活，或多或少的都会使教师产生职业倦怠，因此，如何激发教师工作的积极性，充分挖掘教师的潜能，就成为每一位学校管理者不得不面对的一个实际问题。

一提到调动教师积极性，很多学校管理者马上会想到通过多发奖金和物质奖品的方法来激发教师的工作热情，这的确是最简单、最直接、最容易被教师接受的一种方法。但是对于义务教育阶段的农村中小学来说，有限的经费维持平时的办公开支还捉襟见肘，根本就拿不出用于奖励教师的“富裕”钱。因此，在农村中小学，我们必须把调动教师积极性的重点放在精神奖励上，让教师发自内心地去爱教、乐教、愿意从教。

一、弘扬主旋律，宣传新的教育政策，对教师们进行正面引导

目前国家的教育理念已经开始改变，例如：从提倡教师像蜡烛一样燃烧自己照亮别人转向鼓励中小学教师发展自我、成名成家；从大规模的合校并点转向区域化、均衡化的教育发展。十八届三中全会更是提出了“立德树人”的教育理念，改变科目的分值设置，改变功利化的教育模式，让教育回归原生态。为了提高教师地位，对教师任职资格制度也进行了改革，提高了获取教师任职资格的门槛，即使师范院校毕业的学生也必须通过国家统一组织的教师资格考试，才能取得教师任职资格证书。此外，教师职称制度也在逐步改革，在中小学教师中已经开始增加正高级职称的名额。管理者可以通过这些正面信息的传达让教师知道国家正在想办法提高教师待遇，引导他们积极地去对待教育工作。

二、学校要建立公平、公正的管理制度，做到规范化办学 学校的管理制度都是为教学工作服务的，涉及学校所有教师的切身利益。因此，在制定管理制度时一定要尊重广大教师的意见。学校管理制度的制定应该分以下几个步骤：1调查研究。制度的制定是为了解决某一方面的问题，不调查不研究就没有发言权，所以第一步就是调查研究、了解实情。2．组织教职工委员会讨论，拿出初稿。3．把初稿分发给教师并征求他们的建议。4．对教师提出的建议进行汇总并提交教职工委员会再次讨论定稿。5．学校大会公布实施。

比如：《沙河五中绩效工资分配方案》就是在教师全员参与的情况下制定的，并且随着学校实情的变化不断进行修改。修改的过程也是透明的，完全是由教师讨论并提出反馈建议，学校再组织教师代表整理建议，并依照大多数教师的建议进行修改。发放绩效工资时，学校严格按照制度执行，对于分配结果教师也都能够欣然接受。．

三、学校管理者要摆正自己的位置，演好自己的角色，提高自身的素质

1．借助榜样的力量。首先，学校管理者要做教师的榜样，要求教师做到的事自己一定要做到、做好。在道德标准、思想作风上，要高标准要求自己，做教师生活中的楷模；在教学工作中，要提高自身的教育教学研究能力，积极主动地参加学校的各项教学活动，做教师工作中的领路人。其次，从我校教师队伍内部找典型、树榜样，比如我们学校的崔然老师课堂教学理念先进，善于创新，在教学改革上常有突破，就可以把她作为课改榜样；陈捧书老师，埋头苦干从不计较工作得失，30年如一日，教学工作从未放松，可以作为师德楷模。身边榜样的力量，更能激发教师的积极性。

2．学会服务于教师。作为学校管理者，不应高高在上，而应多为教师服务，在生活上关心他们，在工作上帮助他们，在业务上指导他们，融入他们中间去，以此调动他们的积极性，营造和谐的工作氛围。

从人性的角度来讲，一直要求教师把全部精力放在工作中也是不现实的，对此，我们大胆提出了“家庭第一，健康第二，工作第三”的口号。让教师看到学校管理者对他们的爱护，当他们真正感受到学校管理者的关心之后，反而会做到“工作第一，健康第二，家庭第三”。我想这也许就是《孙子兵法》上所说的“不战而屈人之兵”的道理吧！

3．学会与教师沟通。教师是小知识分子，普遍爱面子、自尊心强，在与他们沟通时要适时、适地、适度。对于个性特别强的教师，要运用多种渠道进行沟通，要给教师讲明道理：要想获得自尊，就必须自强，要想在工作中做出成就，就必须有勇于献身的精神，有投入才会有收获。不实在、不踏实、不努力、不奋斗、不积极的人永远得不到别人的尊重。

四、规划教师的专业化发展，为教师们树立一个明确的奋斗目标

教师长年在学校里闭门教书，从初一教到初三，又从初三教到初一，视野被固定在一个小范围内，有的教师经过几轮教学小有成就沾沾自喜，停步不前，进而产生职业的倦怠。因此，必须要把老师从自满的“牢笼”中解放出来，要为教师谋划专业发展之路，促使他们不断充实自己、改变自己。

1．给教师一个明确的奋斗目标。学校管理者在规划学校愿景的时候，要帮助每位教师找到自己的发展方向，并制定个人的发展计划。例如：为了让教师认识到自身价值，看到自己的发展潜力，学校每年都要组织一些活动，让教师在活动中展示自我，学会沟通．找回自信。

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2009年10月13日，卫生部了关于印发《临床路径管理指导原则（试行）》的通知，为医保支付套上了规范治疗的“紧箍咒”。卫生部首批制定22个专业112个病种的临床路径，确定23省市110家医院试点。截至2011年底，全国已有3467家医院25503个科室开展临床路径管理，目前开展临床路径管理的医院数量占公立医院总数的46.9%。2012年开始的“三甲医院复评”工作在全国范围内展开，本轮评审的一大突出特点是：涉及质量管理中的临床路径、单病种管理等关键指标，纳入“等级评审一票否决条款”。

“临床路径”指医生、护士及其他专业人员针对某个病种或手术，以循证医学为基础，以提高医疗质量和保障医疗安全为目的，所制定的有严格工作顺序和准确时间要求的程序化、标准化的诊疗计划，以减少康复延迟及资源浪费，使患者获得最佳的医疗护理服务。

这将让处方药推广面临巨大挑战。国内仿制药和中成药如何应对临床路径的实施，创新学术推广策略呢？仿制药推广的重点是提供或解释诊疗方案，包括为患者提供简单的说明书、适应症及用法用量等，为医生提供详细的产品推介、禁忌症、适应症、同类药品比较、用法用量、保存方法、不良事件等，以及诊疗方案、相关疾病诊治指南、用药选择、药品信息、药品搭配与相互作用、相关不良事件的处理、药物经济学知识等。

改变认识拓市场

具体而言，代表可通过分析产品的适应症和参与的临床试验，进一步分析临床试验所涉及的诊疗方案，结合诊疗方案所涉及指南和共识来阐述产品。比如对大环内酯类药物地红霉素的推广，要结合医生对治疗的认识现状和目前国内外指南、共识内容的差距进行分析。

美国传染病学会／美国胸科学会2007年成人社区获得性肺炎（CAP）诊疗指南指出：对于严重CAP患者，至少应该进行血样细胞培养、检测嗜肺军团菌和肺炎链球菌的尿液抗原试验以及痰样本细菌培养。对于气管插管患者，应进行气管内抽吸物检测。对于先前身体健康且无耐药肺炎链球菌感染风险因素患者的治疗方案为：1.一种大环内酯类药物（强力推荐，1级证据），2.多西环素（一般推荐，3级证据）。这一证据充分强调了地红霉素的单药治疗。

当CAP患者有慢性心、肺、肝或肾脏疾病，糖尿病，酗酒，恶性肿瘤，无脾，免疫抑制或使用免疫抑制剂，或者先前3个月内使用抗生素或具有其他肺炎链球菌感染风险，推荐治疗方案：1.一种用于呼吸道感染的氟喹诺酮类（强力推荐，l级证据），2.一种β-内酰胺类+一种大环内酯类（强力推荐，1级证据）。这一证据强调地红霉素的参与治疗。

重点通过如下五个方面与指南结合推广：

1.结合流行病学调查，指出医生目前使用地红霉素不广是因为他们不了解肺炎的致病菌中有非典型微生物。

2.结合指南指出，这些非典型微生物要常规检查。

3.结合指南指出，使用地红霉素为代表的大环内酯类药物可覆盖非典型微生物。

4.结合指南指出，地红霉素为代表的大环内酯类药物可单用，也可和其他药物联合使用，是治疗的基石（联合治疗）。

5.结合指南指出，重症感染的患者在使用超广谱抗生素满疗程后应换用地红霉素、阿洛西林等诱导耐药率少的药物（贯续治疗）。

寻找意外点造市场

通过寻找医生对诊疗指南的盲点，阐述产品对该盲点的覆盖，创造产品新市场。比如对于N-乙酰半胱氨酸产品的推广，结合国外现有指南的思考，我们可以提出如下的推广创新：有呼吸道感染，即有痰，有痰须祛痰，可用N-乙酰半胱氨酸；抗感冒的药物含有对乙酰氨基酚，苯成分过量易中毒，N-乙酰半胱氨酸可解毒；慢性肺炎，肺易纤维化，N-乙酰半胱氨酸可抗纤维化；血管造影、肿瘤增强扫描时使用造影剂易损肾，N-乙酰半胱氨酸可保肾。

新产品先讲效果出众，再讲安全可靠。老产品先讲安全可靠，再讲效果依旧。同样安全、有效，可比比效益多少；效益一样多，比比方便与否。

中成药推广的重点是将产品融入诊疗方案：通过分析产品的药理特性及法定适应症，分析诊疗方案所涉及的共识、指南精神要点，结合诊疗方案阐述产品特点，将产品和指南共识对号入座。

“因病循证医学”应用于中成药的学术推广意义重大。

目前，中药的循证医学多数是在西医框架内进行，缺乏相应的中药循证医学的方法学研究。同时，对疾病缺乏适应症的理解与支持。多数中药使用治则、治法或者中医的证来表述适应症，虽然能给推广带来更多的弹性，但在与化学药物发生药物临床用药竞争时证据级别较低。中成药所进行的临床试验大多属于动物实验或观察性试验，目的集中在验证药物疗效的有效性。

随着循证医学的发展，临床治疗证据以严谨、科学的方法被记录下来，对应最新的循证医学证据级别，我们可以发现，多数中成药的证据级别可能集中在论点、评论与观点，病例报告以及队列研究级别，存在相当数量的医家用药经验、验方、病例集，亦有相当数量的面向药物疗效的临床研究。由于药物的化学特征和药理作用不能轻易更改，只关注药物特征，如适应症、给药方式、疗效、安全性和作用机制等，就无法找出更多说服客户处方的理由，更好地关注竞争，并确定自己的治疗优势。同时，关注临床试验中药物体现出来的特点，还可以增加推广概念，获得更宽敞的视野。

结合指南、共识推广

当然，中成药推广的终极解决之道是组织大规模的临床试验，但是该方法时间长、组织难、花费大，现实的解决之道是结合现有指南、共识精神进行推广，从而改变专家观念，进而改变临床路径。

比如康妇凝胶的推广，结合美国CDC2010年指南和美国阴道镜和宫颈病理学会ASCCP2006年指南，将康妇凝胶各中药成分的药理作用对号入座，符合CDC阴道炎治疗指南和宫颈病变管理指南中以下治疗要求：抗真菌，用于真菌性阴道炎；抗细菌，用于细菌性阴道炎；抗病毒，用于宫颈病毒感染；冰片镇痛作用，可用于宫颈活检镇痛，如医生根据宫颈细胞学管理指南进行宫颈活检，使用康妇凝胶可减少疼痛，促进伤口愈合，有利于指南执行。

篇5

[关键词] 检验师;临床;实验室;桥梁

[中图分类号] R446-4[文献标识码] B [文章编号] 1673-7210(2010)02(a)-137-02

一个高质量的检验结果的产生,有实验室一半的功劳,也有临床医护人员的一半功劳;但是一旦出现问题,究其责任,更多的在于检验医师。随着医学科技和检验设备的更新与发展,检验医师工作已经不只是局限于检验样品本身,而应扩展到检验分析前、分析中、分析后的整个过程,把有限的实验数据转变为高效的诊断信息,更多更直接地参与临床的诊断和治疗。主要表现在这几个方面:

1 注重分析前实验误差

有资料统计,在1997年约有68.2%的检验误差发生在检验前期,而来自于检验中、检验后的误差率分别为13.3%和18.5%。到2007年,又有人对检验误差做了类似统计,结果显示检验前期误差发生率仍高达61.9%。所以,10年间,虽然医学科技不断发展,但检验误差发生率几乎没有改善。60%以上的检验误差在检验还没有开始前就发生了,这也更加说明了检验医师与临床医师之间有必要加强沟通。所谓分析前阶段是指从采集标本前的准备到实验室检测前的一系列处理过程,包括患者准备、真空管的选择、样本采集标记、样本的运送与交接、接到样本后的处理及保存等环节。虽然分析前的工作很重要,却没有引起医生、护士的重视。造成这些误差的主要因素包括采集标本不规范(包括用错抗凝管、护士直接从输液器抽血、标本张冠李戴等)、采集时间不对、标本收集后未及时送检,标本不合格等。尤其体现在细菌培养方面,标本的采集就更加不够规范。正确采集和处理标本是实验室检查获得正确结果的前提,由于标本采集主要由医护人员操作,但是临床医护人员对于微生物标本的采集要求和注意事项不甚了解,比如标本采集前患者应做些什么准备,采集标本应选择什么时机、什么部位,每天采样几次、采集多少以及采集部位如何消毒等一系列问题。其结果可能导致标本采集不合格,使致病菌检出率降低或即使分离出某种细菌,但该菌未必是致病菌。这样的结果非但不能提供病原信息,反而造成误导。所以检验医师有责任对临床医护人员进行这方面的宣传和指导,以引起全体人员对检验标本分析前质量控制重要性的足够重视。当临床医师需要做细菌培养加药敏时,检验医师要向临床医师咨询问清患者的情况,包括临床表现及用药情况等,然后告知医护人员让其指导患者或帮助患者如何正确留取标本,以保证检验结果的准确性。因此,在临床诊疗过程中,检验医师应指导或协助医护人员结合患者自身情况,包括主动询问患者饮食习惯、用药等情况考虑对化验结果产生的影响来对患者化验单做综合分析;同时对检验申请、患者识别、标本采集以及不能即时化验的标本如何保存等整个过程给予指导、培训、答疑和咨询。

2 制订检验项目组合应合理化

在日常工作中,部分医师为了自身利益或对检验项目组合不是充分了解而对患者采取拉网式检查,也已成为我国临床诊疗过程中的普遍现象。如肝功或肾功的检查,一般几个关键指标便能反映问题,但有的医师往往选择“大生化”。这样不但给患者造成经济负担,也造成实验室资源浪费。因此,这就需要检验医师根据不同的检验仪器、设备、项目向临床科室组织开展多种形式的专题座谈,建立和临床医师联合查访机制,多与临床医师沟通协商。经常与临床交流沟通一方面可以根据实验项目的方法学研究及临床意义与临床医师共同制定有效、合理、经济的项目组合、指标“参考范围”、“危机报告值”等;另一方面还可以通过与临床医师的交流和沟通,能够了解临床医师对医学检验工作的建议与意见,积极开展临床医师带来的新实验新项目,这样更加有利于检验科工作的开展,更好地服务于患者。

3 要提供有价值的诊断信息

检验医师与临床医师的沟通越来越被重视。比如CK和CK-MB,在两者升高时,检验医师应该及时与临床沟通,说明此项目会受检验方法的影响造成假阳性;而患者严重创伤后其肌肉损伤也可能造成CK升高,所以判断创伤患者是否有心肌损伤应再结合CK-MB与CK比值,结合临床表现、体征及心电图等检查结果做综合诊断,同时建议动态监测心肌损伤的特异性指标肌钙蛋白,以免漏诊或误诊。再比如做细菌培养及药敏,指导临床正确的标本采集方法,才能保证又快又准确的报告。而现在有的临床医师也越来越依赖药敏结果,尤其是对长期应用抗生素或住在ICU室的患者,我们的化验结果就会更加重要。通过临床医师与检验医师的及时沟通,选择相应的指标监测能使患者得到确诊和有效治疗,并且使诊断过程缩短。因此现在有的临床医师会主动与检验医师联系并商讨抗生素的用法。这也是检验医师是临床与实验室间的桥梁的体现。

由此可以看出,临床医师与检验医师沟通的重要性。近年来,检验仪器实现了半自动化、自动化、微机化。先近的实验技术与仪器不仅提高了实验结果的准确性和精确性,还为临床不断提供许多新的实验指标。然而,如何从临床获得患者资料,病情变化以保证分析后的质量评估,并对临床的诊治工作提出我们的建议;如何将一些先进实验方法、原理、临床意义介绍给医护人员,使之能合理地选择试验、正确地分析试验结果用于诊断和治疗是检验医学的重要内容,这也正是检验医师以后需要加强的重要方面。检验医师已经不只是局限于对送到实验室的标本负责,而应从单纯提供实验数据向提供有价值的诊断信息转变,将自己的专业与临床相结合,做临床与实验室间坚实的桥梁。

[参考文献]

[1]丛玉隆.现代医学实验室管理与实践[M].北京:人民军医出版社,2005.

[2]梁冰,李慧,吴振军.临床检验操作技术系列丛书:微生物学检验分册[M]. 北京:军事医学科学出版社,2006.

[3]康格非,何萍.我国检验医学发展的道路及前景[J].临床检验杂志,1994,23(2):12-13.

[4]李燕平.加强检验医师队伍的培养 促进临床与检验的交流[D].第三届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编,2005.

篇6

[关键词] 生物样品前处理； 研究进展； 展望

生物样品的预处理是药物分析最为关键的一步。通过预处理可以将缀合物（尿）或者结合物释放出来，以便测定药物的总浓度；可以纯化待测组分；可以更好地适应分析方法的灵敏性、专属性等；也能减少杂质对分析仪器的污染，达到提高仪器灵敏度、准确度、精密度等要求。生物样品包括动物组织、植物和微生物等。对于动物组织，先绞碎结缔组织、脂肪等非活性部分，然后选择合适的溶剂进行提取，必要时要破碎细胞。对于植物，要去壳、除脂。而对于微生物生物样品，要及时将菌体与发酵液分开。本文着重阐述一般的生物样品，包括血液、尿液、唾液、粪便以及各种组织，其中最常用的是血浆或血清，因为其可以较好地体现药物浓度和疗效之间的关系。其特点是成分极其复杂，包括基质、内源性物质及代谢产物等等，样品中含有数百种乃至几千种化合物，而要测定的药物浓度却很低， 往往处于ng～pg 级水平，甚至更低。此外，在分析生物样品之前还要经历分离、纯化及浓集，必要时还需对待测组分进行化学改性处理，以使待测物纯度达到仪器使用的基本要求[1]。步骤繁杂，耗时长，回收率不客观。基于以上特点，选择适合的前处理方法是实验的关键环节。

目前，国内外最常见的生物样品前处理方法有以下几种，它们各自的优缺点如下。

1 沉淀蛋白

通过沉淀蛋白质可以使结合的药物释放出来，达到对待测组分提取和纯化的目的，也可以测定药物总浓度。去除蛋白质预防提取过程中蛋白质的发泡，可以减少乳化，另外还可以保护仪器，延长使用寿命。沉淀蛋白是体内药物分析工作的第一步。如应景艳将大鼠的五脏等组织取出后，吸取组织残留的血液然后加入0.9%的生理盐水研浆处理，1万 r・min-1离心10 min后吸取上清液[2] 。一般使用1～3倍体积的甲醇、乙腈、丙酮或乙醇等有机溶剂对蛋白进行沉淀。如果是水溶性的可以用酸类沉淀蛋白。有机溶剂沉淀蛋白的能力大小一般为乙腈>丙酮>乙醇>甲醇，由于乙腈和甲醇对液相和液-质的兼容性好，所以最常用的沉淀蛋白的有机溶剂为乙腈和甲醇[3]，其中乙腈可以提高被测组分的分离度，也能更好地改善峰形。另外，如果用高氯酸，如6%的高氯酸进行沉淀蛋白后，最好不要直接进色谱柱进行分析，应调节合适的pH然后过膜，再进样，以免由于酸性太强损伤柱子。与液液萃取相比，蛋白沉淀操作方便，但可能会稀释样品，降低灵敏度，且样品较脏。

李利群等[4]给大鼠灌胃和尾静脉注射红景天苷，取出血浆后用高氯酸沉淀蛋白，结果在24～150 000 μg・L-1线性关系良好，平均提取回收率为95.99%。

甲醇、乙醇、丙酮等水溶性溶剂能使蛋白质脱水，使得溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而使蛋白质凝聚和沉淀。用这种方法沉淀蛋白时要注意有机溶剂可能会溶解塑料，所以必要时要考察离心所用的容器[5]。另外，质谱的响应值与离子强度有关。生物样品中残存的杂质会导致待测物的离子化强度的改变，生物基质效应还受到动物个体的影响，采用液质联用时注意考察基质效应对样品的影响，采用与基质一致的成分进行标准曲线和质量控制样品的配制以减小差异[6]。

蛋白质是多价的两性电解质，通常在酸性溶液中带正电，在碱性溶液中带负电。电解质处于等电点时，分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。等电点沉淀分离法的基本原理即通过调节溶液的pH，使两性电解质的溶解度下降，从而使蛋白质阳离子形成不溶盐而沉淀。如饱和硫酸铵、硫酸钠等中性盐进行沉淀。当然盐溶液如果加入过多会使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，此时对于色谱分析仪器，要注意柱子容易堵塞的问题。

蛋白质沉淀法操作简单，有较好的重复性，效率也较高，但是对于蛋白结合率较高的成分，会有回收率低的结果产生。此外，去除蛋白质的方法还有加入含锌盐及铜盐的沉淀剂法、酶水解法（如枯草杆菌酶）、加热法，但一般都很少用。

2 液-液提取

液-液提取包括液-液萃取、液-液回提（多次提取）、离子对提取。

液-液萃取（LLE）是在液体混合物中加入与其不相混溶（或稍相混溶）的溶剂，利用组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的，又称溶剂萃取或抽提。由于多数药物是脂溶性的，而生物样品中的内源性物质是水溶性的，因而可以利用液-液萃取法除去大部分杂质，如应用于血浆、尿液、毛发样本的萃取等。实验者在选择溶剂时应注意按照相似相溶的原则；使用与水不互溶如乙醚等溶剂，防止带水溶性杂质；且溶剂纯度AR（分析纯）以上、无毒，沸点要低、易挥发和浓集，不影响紫外检测；还要有很好的化学稳定性。最好不要选择氯仿，易乳化且毒性大。如果被测定组分极性较小，可以选择正己烷等极性相对较弱的溶剂，相反，可以选择二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、石油醚等[7]。

向贞兵等[8]取糖尿病模型大鼠全血加入0.3 mL的0.06 moL・L-1 HCl后，又经过乙酸乙酯和乙腈萃取，成功得到了以溴化苯甲酰噻唑的类似物为导向设计合成的化合物。回收率约80%左右，重复性也良好。Tabernero M J等[9]以25个滥用氯胺酮和安非他明的人的头发为样本，用0.1%聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯冲洗，待干燥后，再用0.01% 甲酸超声4 h。液-质联用检测后，线性范围0.5～25 μg・L-1，检测限为0.1 μg・L-1。

液-液回提（多次提取）对指对于碱、酸性药物，在有机溶剂初次提取后，调节适当的pH，使药物变成离子型，用水把药物回提（反提取）（back extraction）到水相，再调节水相pH，使药物变成分子型，最后用有机溶剂萃取水相中的药物。液-液回提法可以将一些酸、碱性杂质除去，达到净化样品的目的，缺点是提取率低

离子对提取法是指由于一些电离性较强（调pH无效）的药物在水溶液中主要以电离形式存在，很难被提取，此时，通过加入适当的反离子（counter ion）与其形成离子对（大分子复合物），则成为一种伪中性分子，即能从水相进入有机相中，之后可用萃取法提取[10]。常用的反离子有季铵盐R4N+，磺酸盐，苦味酸阴离子；一般常用的恶提取溶剂为卤代烃类，如CH2Cl2。

液-液提取操作简单，应用广泛，但是需要大量使用有机溶剂，有毒，存在乳化现象，也难以实现自动化。此外，一般萃取率都不高。为了防止乳化，可应用较大体积的有机溶剂，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力而破乳，若已发生严重的乳化现象，可将试管置于冰箱中冷冻破乳或者可将试管置于离心机中离心消除乳化[11]。

3 固相萃取

固相萃取（solid phase extraction，SPE）技术广泛用于各种生物样品的处理，和HPLC，GC色谱原理基本相同，即相似相溶。SPE技术操作一般可分为4步：选择SPE柱、装柱、上样、收集样品[12]。柱压可分为： 减压、加压、常压。减压可以降低固定相的用量，缺点包括溶剂易挥发、被测物质易损失。加压主要可以缩短跑样时间。缺点包括：压力大会降低柱子的塔板数，如果压力过大反而会使溶剂流速过快而分离较差。一般常压效率很高，但比较耗时。

3.1 选择固相萃取柱

根据样品量的大小、固定相的保留能力、目标物的理化性质，然后选择合适的萃取柱。为减少成本，实验室一般选择直径-长度1∶5～1∶10，固定相硅胶量-样品量30～40 倍的萃取柱。填料包括阴离子交换填料、阳离子交换填料以及反相填料。这主要依据待测物所带的电荷。如果样品对氧、水敏感且易分解，则可以选择无水氧化柱[13]。

固相萃取装柱包括干法装柱和湿法装柱，但一般都分为3步，即装下筛板，加装填料，装上筛板。第一步装下筛板时要注意把筛板浸泡于水中，用超声或震荡赶掉筛板空隙中的空气，备用。用装柱工具把筛板顶入柱体，再把筛板平推到柱体底部；第二步进行加装填料，将填料和适量的缓冲液加入小烧杯中，制成混悬液。盖上柱体的下盖，用吸管取混悬液加入柱体中，当混悬液体积多于柱体体积时，取掉下盖放掉部分缓冲液，静置使填料沉到柱体底部。第三步装上筛板，保持柱体垂直，用装柱工具把筛板顶入柱体，再把筛板推到填料上表面，盖上盖（注意： 某些应用需要在填料上表面和上筛板之间留适当空隙）。一般若想得到十分均匀紧实的固定床，采用湿法装；如粒度较大可采用干法装柱。

3.2 上样前样品的处理

可以先除蛋白后取上清液，以使药物游离出来，也防止堵塞色谱柱。然后调节pH[14]，可以直接用酸或者碱调节pH后取上清液萃取；也有采用超声后加入水或缓冲液，然后取上清液方法进行萃取的。

3.3 选择合适的洗脱剂

收集洗脱液，然后将洗脱液挥干浓缩后，用流动相复溶，再进行检测。如果样品在硅胶中解析较慢，可以采用氧化铝作为固定相。

注意：如果过柱时产生气泡，一方面考虑选择沸点较高，挥发性较小的溶剂。混合溶剂则需要沸点相似。另外，在装柱子之前，为避免柱子中残留空气，需要加压将其排干。

Horspool等[15]使马盲肠液进入固相萃取柱，然后经磷酸缓冲液洗脱后，结果检测7 种短链脂肪酸乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和乳酸，回收率约为72%～89%。

固相萃取方法安全性高、选择性好、高效性、高自动化程度、低耗性、预处理时间短，上样量少，操作简单而应用广泛[16]。此外，在处理生物样品时，很少引入外源性杂质，也不会产生乳化现象。但是固相萃取成本高，要求的技术高，所用的萃取小柱也容易堵塞。

4 分子印迹技术

分子印迹聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）是一种人工合成的抗体，通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，即利用抗体进行选择性提取和富集目标化合物[17]。

基本原理为目标分子（模板分子）（templatemolecular）和功能单体（funcit ionalmonomer）通过共价键或非共价键作用可逆结合，然后加入交联剂（crosslin ker），聚合形成目标分子被埋在内的刚性的固体颗粒，最后选择合适的溶剂将目标分子从聚合物中洗脱下来，获得的聚合物即为分子印迹聚合物。MIP具有记忆功能，高度的识别性和预定的出峰顺序以保证目标物的富集。总之原理类似于酶-底物的“钥匙一锁”相互作用原理。广泛应用于色谱固定相、固相萃取、模拟酶催化、膜分离和模拟抗体受体等方面。MIP合成方法相对简单，且成本较低，对酸和碱以及有机溶剂的耐受性也较好[18]，见图1。

洗脱方法包括溶液浸泡、索式提取和超声洗脱等。MIP制备中应用的溶剂体系通常为乙腈-水或甲醇-水。常用的分子印迹聚合物合成方法为热聚合法和紫外光照射法。

李魏嶙等[19]基于异丙酚光纤荧光检测系统的改进而把膜分离和异丙酚分子印迹固定相萃取柱结合起来，对异丙酚血样进行处理。本方法的优点是膜分离与分子印迹固相萃取方法的结合实现了对异丙酚的全血样品的在线和快速的处理，并且能对血液起到一定的“保护作用”。

吕斌等[20]先后采用热和紫外光辐射引发2种方法合成了胆固醇的非共价型MIPs，MIPs有效地免疫吸附了血液、蛋黄、牛奶中的胆固醇，其中对血清的效果最好，而效果最差的是蛋黄。

分子印迹聚合物受到模板分子结构的制约而使得分子印迹聚合物的吸附性能扩大，分子印迹的适用范围较窄[21]。

5 固体微萃取技术

固相微萃取技术（SPME）始于20世纪80年代末，该样品前处理技术基于固相萃取，但是不必需要柱填充物和有机溶剂。SPME的萃取主要有2种模式： 直接法（Di-SPME）和顶空法（Hs-SPME）。前者适用于分析难挥发性物质，而后者适用于挥发性、半挥发性物质。固相微萃取的涂层材料主要有以下几种类型：聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）新型聚合物涂层；商品化涂层，包括PDMS/乙烯基苯（divinylben-zene，DVB）、聚乙二醇（carbowax CAR）/PDMS）碳分子筛（carbon molecular sieve，CW）/DVB、CW/模板树脂溶胶-凝胶涂层。近年来还比较关注的涂层是离子液体，与商品纤维相比，其萃取效率更高。在萃取过程中，被分析物在纤维萃取头外部涂渍的固定相涂层和样品中快速分配平衡，完成采样、萃取和浓缩。涂层上吸附的待测物的浓度与样品中待测物浓度成正比，萃取完后可以结合气相色谱-质谱、液相色谱-质谱对样品进行热解析或者液体解析。操作简单，易自动化，环保，也能减少样品低温保存。在生物样品的应用中，活体固相微萃取（in vivo SPME）和基于多孔板技术（multi-well plate technology）的高通量固相微萃取（high-throughput SPME）[22]。

近年来，SPME用于活体采样，如可以对静脉注射给药后的血药及其代谢产物的浓度进行定量。需要注意的是，在动物采样时要求在无菌环境中进行，即SPME装置必须在使用之前进行消毒，这样才可以实现生物相容性，进而有效排斥蛋白，最终萃取出目标小分子分析物。SPME在体内完成提取后，结合液-质联用色谱，即可完成对被测物的定量分析。从采血样到样品分析整个过程，相对传统的液质色谱前处理分析，SPME耗时更短[23] 。

赵舰等[24]用固相微萃取-气相色谱联用分离、分析尿中痕量毒鼠强，监测了1例毒鼠强中毒幼儿尿中毒鼠强含量，在中毒后 3 个月内仍从尿中检出毒鼠强成分。该方法的线性范围为10～500 μg・L-1，最低检出浓度< 10 μg・L-1， RSD

6 微透析技术

微透析技术诞生于20 世纪60 年代，最早用于研究脑脊髓液化学环境，经过近60年的发展，现在广泛应用于实验神经生理学、神经化学[25-27]、体内药物分析[28]等多领域。微透析（microdialysis）技术结合灌流取样和透析的原理，实现了对动物和人的细胞外液、组织、大脑等生理水平的动态微量生化取样，具有活体连续取样、动态定量分析的特点，而且取样量小、组织损伤轻等特点。 可以在麻醉或清醒的生物体上使用。相比SPE和LLE 法，MD操作简单、无溶剂消耗、快速。微透析技术的缺点就是对取出的样品需要进行准确可靠的校正，其主要关系到对回收率的测定。探针回收率是从灌流液中流出的被测组分与标准浓度之百分比。探针回收率将直接影响微透析结果， 而回收率的好坏取决于取样部位的生物学性质、透析膜的物理性质（材料、孔径、长度及几何形状等）、待测物质的相对分子质量、灌流速度、压力、生物体本身的健康条件和生物节律等多方面条件。目前测定回收率的方法包括：零净通量法、内标法、低灌注流速法、外推法、无净流出量变化点、渗出率法等[29-30]。

为了实现从样品的采集、处理、分离到检测完全自动化，近年来，微透析技术逐渐与高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）、液质（LC-MS）等技术联用。

Rong-Hua Ma 等[31]采用微透析与LC-MS 联用技术实时监测了斯皮诺素和斯皮诺素与环孢素A联用时在大鼠脑、血和胆汁中的药代动力学参数，选择性好、灵敏度高，具有合适的线性范围。董文彬等[32]对大鼠静脉注射米诺环素后，进行在体、实时的微创体液取样，即利用微透析进行动态采取血液和脑内的海马CA1区中游离米诺环素，然后直接利用HPLC进样，最后计算米诺环素在大鼠体内血浆蛋白结合率。米诺环素大鼠血浆蛋白结合率为82.08%。Marina M Carrozzo等[33]在老鼠体内植入微探针获得了微量的腺甘酸，运用LC-MS/MS监测了在自由运动的老鼠大脑特定区域的腺甘酸浓度的微小变化，方法灵敏、可靠。

7 磁性固相萃取技术（MSPE）

磁性固相萃取技术（MSPE）基于磁性纳米材料的使用，利用磁性微球或磁性纳米粒子吸附目标物。

磁性微球作用的原理是磁球吸附目标物，然后通过磁分离器进行分离，最后从磁球上把目标物洗脱下来，达到纯化目标产物的目的。具体萃取操作步骤：将含有目标物的液体与磁珠混合发生偶联反应。然后用磁分离器分离磁珠目标物复合体，再清洗复合体表面的杂质，最后通过洗脱使目标物从复合体中分离，从而得到纯化的目标产物。施加磁场的技术包括磁泳分离技术、四极磁场下的磁泳分离技术、微芯片上的磁泳分离技术等[34]。

磁性微球一般由具有超顺磁性无机纳米磁性材料（Fe，Co，Ni及其氧化物等）和高分子2部分组成。磁性微球分为核壳型、混合型、多层型。当磁性的粒径小于某一临界尺寸后，在有外加磁场存在时，表现出较强的磁性；但当外加磁场撤销后，无剩磁，不再表现出磁性。磁性微球具有良好的表面效应和体积效应，选择性和磁响应性很好、物理化学性质稳定并且有一定的生物相容性，表面改性带有多种活性的功能基团，可以专一性地分离生物大分子。

于希[35]利用化学共沉淀方法制备了包覆表面活性剂的 Fe3O4磁性纳米微粒MNPs，利用乳液聚合法聚苯乙烯磁性纳米微粒（MNPs/PSt），结果2种微粒均具备超顺磁性，其中Fe3O4MNPs 的饱和磁化强度为66.81 emu/g，MNPs/PSt 的为 38.82 emu/g 。

MSPE在操作繁琐度和萃取率等方面都有令人满意的结果，例如不必离心和过滤等，而且不存在堵塞柱子的问题。因此广泛应用于药物转运、分离细胞、酶的固定、农残检测等领域中[36]。

8 柱切换技术

柱切换技术是色谱分析中处理复杂样品的方法之一。利用切换阀改变不同的色谱系统，达到在线样品净化、组分富集等目的[37-39]。2个不同液相色谱柱之间的切换称为液相色谱切换法，对生物样品的药物分析特别有用。

随着分析仪器的不断快速发展，便利了生物样品前处理。优化生物样品的处理方法可以直接影响到检测结果的参考价值。生物样品前处理方法的选择应该考虑被测组分的理化性质、存在的大量内源性物质、代谢产物及共存药物等干扰物质、回收率等因素。样品的高通量化、采集样品的无损化、消耗试剂的微量化，分析仪器的完全自动化以及环境的低污染化将是生物样品前处理技术发展的方向。

9 展望

目前，在体内样品的分析方法中，除了上述重点介绍的8种常用方法外，还有化学衍生化法、大孔树脂方法、离子交换树脂法、超临界流体萃取法（SFE）、膜分离法、在线毛细管电泳法等，也有一些技术的结合，如固相萃取技术与超临界流体萃取技术的结合、分子印迹技术与固相萃取技术的结合。这些技术都丰富了生物样品分析的手段。实验者可以根据分析的目的、样品的理化性质、内源物是否有干扰、技术优势等进行样品的预处理方法的选择。然而当前样品前处理技术还很繁琐，尤其在研究天然药物在体内的各方面作用规律的指标时，有时会因为灵敏度不够高等因素而无法做出分析，所以如何才能实现样品分析的超高灵敏化、傻瓜化以及完全自动化将有很长的路要走。

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Research progress of pretreatment of biological samples

FENG Jian-nan， DU Shou-ying*， BAI Jie*， LU Yang， LIU Hui-min

（School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] Suitable pretreatment of biological samples can truly reflect the role of law of the measured components played in the body and will provide experimental evidence for the studies on metabolic process， material basis of efficacy， mechanism of action， pharmacology， toxicology and the others. Biological samples include blood， urine， hair， tears， etc. There are also many samples processing methods， such as the direct protein precipitation， liquid-liquid extraction and solid phase extraction and so on.These methods could be used alone or combined.

篇7

关键词：耕牛；血吸虫病；灭螺；生态综合防治

中图分类号：S852.72 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013），01-0031-04

血吸虫病是日本血吸虫寄生于人和牛、羊、啮齿类及一些野生哺乳动物的门静脉系统的小血管内而产生严重危害的一种人畜共患寄生虫病[1-3]。近年来受多种因素影响，咸宁市部分地方已达到传播控制标准和传播阻断标准的地区出现疫情回升现象。为了解耕牛血吸虫病综合防治的效果，笔者对咸宁市部分地区耕牛血吸虫病流行情况进行了调查，将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择

疫区所有耕牛均为试验动物。

1.2 试验分组与设计

将咸宁市四个地区（咸安、嘉鱼、赤壁和通山）分为2个组。具体分组如下：赤壁因实施耕牛血吸病综合防治项目作为试验组；咸安、嘉鱼、通山按照传统方法进行防治（即：一年一度的血防普查，病牛进行治疗，血检阳性牛扩大化疗）作为对照组。2008年两个组的供试耕牛全部没有采取生态防治措施；2009年试验组实施耕牛血吸病综合防治项目，对照组按传统方法进行防治。

1.3 耕牛血吸虫病农业生态综合防治方法

综合防治项目实施地（赤壁市）是我省尚未控制血吸虫病流行的12个重疫区县（市）之一，疫区人口达到12.4万多人。近年来疫情形势有反复和蔓延之势，得到市委、政府和有关部门的高度重视。2008年9月，赤壁市血吸虫病农业生态综合防治项目得以立项，2008年10月-2009年9月实施。

1.3.1 水改旱项目

水改旱呈矩形田块，农田排水沟渠分为干、支、斗、农、毛沟5级，干沟间距约为1 000～1 500 m；支沟与干沟垂直布置，间距约为400～500 m；斗沟与支沟垂直布置，间距约为200 m；农沟与干沟垂直布置，间距约为100 m；毛沟与农沟垂直布置，间距约为50 m；干沟旁布置3 m宽的田间道路，支沟旁布置2.5 m宽的田间道路，斗沟旁布置2 m宽的生产道路。各小田区的水经排水毛沟、农沟、斗沟、支沟、干沟流到大田区外，通过工程排水实现大田区水改旱工程。

1.3.2 养殖灭螺项目

项目实施地属荒土地，由于长年积水，水草生长茂盛，钉螺繁殖速度快，成为了血吸虫的疫源地，没有农户对其进行开发利用，地面一片荒芜，没有公用设施，有利于建精养鱼塘，实施鱼禽立体养殖，达到蓄水灭螺和养禽灭螺的目的。

1.3.3 家畜圈养项目

水改旱以后，农田耕作实行“以机代牛”，耕牛实行集中圈养。根据各镇、处、场农民居住区布置形式和农民生活习惯的实际，耕牛采取集中圈养和分户圈养。选址后进行挖屋基，建栏舍并种植牧草，家畜的饲养使用秸杆氨化青贮饲料。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 样品的采集 血样采集：血防普查时，每头牛均采耳静脉血，滴在滤纸上，制作血纸；粪样采集：对血检阳性者进行牛粪收集，用尼龙袋集卵孵化法3送3检，发现毛蚴者为阳性感染牛。

1.4.2 耕牛血液检测 采用金标免疫渗透诊断法。将反应板上的孔依次编号，取长条形反应板（10头份/块），用内径约1 mm玻璃毛细管吸血纸浸出液，从标记有1、2号的孔开始点样，玻璃毛细管轻贴膜0.5 s，向上移走玻璃毛细管，依此类推。每次连续点样3～5块反应板，然后先往点样最早的反应板孔中滴加甲液1滴，间隔5～7 s滴加第2孔，即可保证每个点样点的时间达3～4 min可滴加甲液，依次类推；待甲液渗入后每孔滴加乙液1滴，按点样次序滴乙液；待乙液渗入后每孔滴加蒸馏水1滴。结果判定：红色斑点判为阳性（+），粉红色斑点判为可疑（±），黄色或无色斑点判为阴性（-）。血检阳性率=血检阳性头数/样本总数×100﹪。

1.4.3 耕牛粪便检测 采用毛蚴孵化法。取血检阳性牛的新鲜粪便100 g，置500 mL容器内，加水调成糊状，通过40～60目铜筛过滤，收集滤液。将滤液收集于500～1 000 mL的烧杯中，加无菌水，静置20 min，待粪渣和虫卵下沉后，吸去上层液，每隔15 min换清水1次，直到水清澈为止。当水温在15℃以上时，第一次换水后，应改用1%的食盐水洗粪，当水温在18℃以上时，全部洗粪和沉淀用水均应改用1%的食盐水，以抑制毛蚴过早孵出。洗净的含有虫卵的粪便渣，即可用于孵化。将粪便渣倾入500 mL的三角烧瓶内，加入温水（不可用盐水）进行孵化。孵化时外界温度以22～26 ℃为宜，室温在20 ℃以上时，即无需加温。样品进行孵化后，经1、3、5 h各观察1次，检查有无毛蚴在瓶内出现。毛蚴为灰白色，折光性强的棱形小虫，多在距水面下4 cm以内的水中作水平的或略斜向的直线运动。结果判定：有毛蚴者为阳性（+）；无毛蚴者阴性（-）。粪检阳性率=粪检阳性头数/样本总数×100﹪。

1.5 数据的统计分析

所有试验数据均采用SPSS 8.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 耕牛血吸虫病感染情况

通过2008年度耕牛血吸虫病普查工作可见，咸宁市耕牛血吸虫病依然存在。27个疫区乡镇（场、街道）、150个疫点（村、居委会）检查了13 563头牛，其中病牛数达299头，感染率达2.2%。（感染率=病牛数/查病数×100%）。其中嘉鱼、赤壁两县市比较严重，尤

其是赤壁市感染率达到4.4%（表1）。

通过2009年全市秋季血吸虫病普查工作，检测结果表明（表2），2009年咸宁市4个疫区县（区、市）26个疫区乡镇（比2008年少了1个，因该区连续多年没有发现被感染的牛，故不列入疫区乡镇）148个疫区村仍存在不同程度的疫情，疫区存栏牛15 687头，查病15 190头，查检率达96.8%，确诊病牛275头，感染率为1.8%。

赤壁市的柳山湖镇、黄盖湖、车埠镇、赤壁镇通过血吸虫病农业生态综合防治措施实施后，其病牛数大为减少，感染率也大幅降低。而其他未实施生态综合防治措施的乡镇，除新店、余家桥外，蒲圻办、赵李桥、官塘驿3个乡镇耕牛血吸病疫情均出现反弹。2008年血防普查中蒲圻办、赵李桥、官塘驿三个乡镇没有发现病牛，而在2009年的普查中则分别出9头、3头、3头病牛，感染率也在2%以上（表3）。

通过2008、2009年耕牛血吸虫病普查工作可见，咸宁市耕牛血吸虫病依然存在。调查的四个地区中，除通山以外，都存在不同程度耕牛血吸虫的感染。耕牛血吸虫病感染率在0.2﹪～5.0﹪（表4）。2008年与2009年相比较，通过实施综合生态防治措施后，项目实施的地区赤壁的耕牛血检阳性率和粪检阳性率均显著减少（P

3 小结与讨论

3.1 综合防治措施的作用

根据赤壁市柳山湖、黄盖湖、赤壁镇、车埠镇等4个镇实际情况，因地制宜采取综合措施，以实施水改旱，开展养殖灭螺，采取家畜圈养，结合反复查治为主要控制措施。通过水改旱，开挖沟渠，将水田改为旱地，从而改变钉螺孳生的环境，从而达到消灭钉螺的目的；通过养殖来螺，将地势低洼之地，通过开挖鱼塘，先是将有螺草、土埋在塘堤里面，外面覆盖1 m厚的无螺土，可以起到灭螺作用；再是在鱼塘内实施鱼禽立体养殖，达到蓄水灭螺和养禽灭螺的目的；家畜圈养，在14个村共建8 000 m2的牛舍将耕牛圈养，让其与疫区隔离，从而阻断疫情的传播。通过两年的实践，从综合治理前后耕牛感染率显著降低等结果不难看出，综合治理措施不失为控制此类地区耕牛血吸虫病流行的有效措施。农业生态综合防治措施，可以

很好消灭钉螺，保护易感动物，从而阻断血吸虫病疫情的传播，其作用是长期的，不易反复的[4-7]。

3.2 血吸虫病防治的主要困难和疫情回升的原因

吸虫宿主和传播环节多，单一的防病措施很难奏效。对人群和家畜进行同步化疗是控制疫情的重要手段，但反复化疗群众接受程度下降；由于基层动物血防机构不健全、防治经费得不到保障、治疗药品短缺，家畜传染源的查治难以开展，且管理难度大。本研究选择咸宁市为试验区，以实施水改旱，开展养殖灭螺，采取家畜圈养，结合反复查治为主要控制措施。通过两年的实践，从综合治理前后耕牛感染率显著降低等

结果不难看出，综合治理措施不失为控制此类地区耕

牛血吸虫病流行的有效措施。

药物灭螺只是控制感染的应急措施，不能彻底解决钉螺控制问题，而且还会带来环境污染。养殖灭螺和家畜圈养能有效地控制传染源，对减少耕牛血吸虫病流行起到明显作用。自然环境因素复杂，防治难度大。长江流域洪涝灾害频繁，使湖区钉螺扩散加剧。山丘型地区钉螺孳生环境复杂，交通不便，灭螺难度大。此外，南水北调等大型水利工程建设对钉螺扩散和血吸虫病传播也存在潜在的影响。本研究实践表明，依据不同地区的地形地貌，将水改旱、养殖灭螺和家畜圈养等措施与当地情况有效结合，是切实可行的。

血防科学研究不能满足防治工作的需要。血防科学研究滞后于血防工作形势的变化与发展要求，防治技术无突破性进展。急需开发研制高效、低毒、廉价、使用方便的灭螺药物和血吸虫病预防治疗后备药物，加快现场使用方便的血清学诊断方法和快速诊断试剂的研制，加强对可持续发展的血防策略的研究。

3.3 经济与社会效益分析

我国血吸虫病的防治策略的发展经过三个阶段。第一阶段是单一防治措施。如治疗病人、病畜、灭螺、粪管。第二阶段是进过调查研究和反复实践，总结出预防为主的综合措施和因时因地制宜的防治策略。第三阶段是以化疗为主的疾病控制策略[8，9]。以灭螺为主的综合防治措施多年实践证明是有效的，我国水网和山丘型流线区均是采用这一策略控制和阻断血吸虫病传播的[10-16]。本研究中实施的生态综合防治项目也是采用的这一策略，而且与咸宁市的地域面积、地貌特点、经济发展水平和卫生教育水平等相符。

通过实施综合防治措施，有效的控制耕牛血吸虫病的疫情，也保护了人的健康。经过防治措施的实施，经济效益明显。①综合开发水改旱的农田，统一规划，统一种植；②养殖灭螺项目建设的精养鱼池投产使用，为养殖户增加收入；③耕牛死亡率降低，产仔率升高。同时，非常有利于农业水利建设。项目实施当年产生直接经济效益360万元，其中水改旱项目产生经济效益170万元，养殖灭螺项目产生经济效益90万元，家畜圈养项目产生经济效益100万元。社会效益更加广泛：项目实施后，有效地消灭了钉螺，控制了人畜血吸虫病的疫情，改善了当地的农业生产条件，搞高了农作物的产量、品质，增加了农民收入，加快了农村小康建设的步伐。

目前，咸宁市大部分地方防治耕牛血吸虫病的方法是通过一年一度的血防普查：在疫区对耕牛进行血检，血检阳性者再进行粪检，粪检呈阳者确诊为病牛。对病牛进行治疗，对疫区其它牛进行扩大化疗。从2008年度普查的结果来看，用传统的方法进行防治，对于疫情较为严重的地方来说，很难控制疫情蔓延之势，势必要寻找新的防治方法，特别是生物防治法，将两者结合起来。通过农业生态综合防治措施的实施，改善了环境的同时，也很好的达到了灭螺的效果，达到了降低血吸虫病爆发的目的，所以通过环境改变来防治血吸虫病爆发是可行的。

通过对咸宁市2008、2009两年耕牛血吸虫病防治工作的调查研究，赤壁市因实施耕牛血吸虫病的生物综合防治措施，2009年的耕牛血检阳性率和粪检阳性率比2008年均明显减少。故农业生态综合措施项目的实施，有效降低了耕牛血吸虫病的发病率。此法不仅效果好，有利于环境保护，且能长期发挥作用。咸宁市4个疫区，除通山外其他3个县、市、区（咸安、赤壁、加鱼）均属长江中下游地区，且长江在其境内穿过，水网资源发达，地理水纹环境十分相似，耕牛血吸虫病传播途径也十分相似。所以耕牛血吸虫病的生物综合防治措施（水改旱、养殖灭螺、家畜圈养）可在全咸宁市、全湖北省（长江中下游地区）疫区范围推广应用。

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