微生物的纯培养步骤范文

导语：如何才能写好一篇微生物的纯培养步骤，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

关键词：啤酒；生产过程；微生物；控制

中图分类号：Q93 文献标识码：A

前言

纯生啤酒的生产过程决定了出产纯生啤酒质量控制的重点就是避免和预防具有危害性的微生物对此污染，也就是要从生产的每个过程入手对一切微生物进行严格控制和预防，以保证啤酒的安全生产。纯生啤酒的无菌是指不会出现真菌和致使啤酒变质的微生物。纯生啤酒采用在低温条件下通过膜滤器来过滤的方式进行生产，这种方式既能够节约低温消毒的热量，又可以避免啤酒在高温条件下进行处理，降低啤酒中微生物的形成，这样就可以保证啤酒中没有其他杂味，口感更佳。

1、纯生啤酒的微生物控制重点

通过采用haccp这种控制手段可以看出纯生生产过程中的主要控制点是有以下四点：

1.1、纯生啤酒的无菌过滤控制

纯生啤酒经过膜过滤的方式来达到杀菌的目的。因为用来过滤的膜滤器存在使用期限和极易被污染、洗涤药物被破坏的因素，会对膜的过滤径口产生一定的影响，为了保证过滤膜的过滤能力，所以在每次使用前或清理过后进行完整的检测来确定此膜滤器是否受到损坏。并且为了更好的确保产品是否无菌的情况，可以在过滤过程中或者过滤之后给产品做一个全面的检测工作。

显然纯生啤酒的无菌控制是不会像普通啤酒那样在最后一项杀菌工作中来把握啤酒的无菌情况。因为在进行多次的过滤酒液后会残留很多的微生物，致使膜滤器不通畅，同时造成过滤后的酒液中会存在一些微生物。所以对无菌的控制应该严格对每一道工艺工程进行控制，提高啤酒的质量标准和加强膜的使用期限。

1.2、瓶盖微生物控制

在生产中，可以通过购置无菌瓶盖或者在瓶盖槽上安置紫外线杀菌系统来确保瓶盖的无菌性。并且还要在一定的时间内对装瓶盖器具、瓶盖运输带以及理盖落盖机进行清洗和除菌，降低微生物的形成可能。

1.3、空瓶微生物控制

如今，在市场上大部分纯生啤酒都是使用玻璃瓶来进行包装的，所以对玻璃瓶进行清理的时候最好是使用有两个端口的洗瓶机器，防止清洗过的空瓶受到二次污染。洗瓶机器在进行最后一次清洗的时候应该使用无菌水来冲洗，以减少瓶中微生物的数目。洗瓶机器也要在一定的时间内进行清洗和更换洗涤液以保证洗涤效果和降低空瓶中微生物的数目。对于运输带要求必须配备防尘罩，并且在一定的时间内进行清洗杀菌。

为了保证空瓶的无菌性，在包装之前可以运用蒸汽对其进行快速除菌。在生产之前以及生产过程中对空瓶和包装后的酒液进行抽样检测。

1.4、灌装环境的微生物控制

灌装环境应该构建百级流层，并且安置空气喷雾除菌设备。地面上最好使用环氧高聚物。灌装机应该具有标准作业程序以及比较热量与能量的装置，在一定的时间里对相关的机器零件进行清理杀菌。并且最好在一定时间内对灌装设施的重点角落进行人工清理，避免出现细菌薄膜导致灌装环境受到破坏。

1.5、人员

无菌室工作人员资格：具用广泛的技术知识，工作负责，对卫生问题有敏锐触觉。公司应定期对工作人员进行食品卫生及微生物基本知识、卫生检查及管理、灌装线的清洁及杀菌措施和紧急应对措施的培训，不断提升员工的素质。工作人员(尤其要强调的是设备维修人员)进出无菌室必须按一定程序换鞋、换无菌服、戴工作帽及手部消毒，无关人员一律不能进入无菌间，以减少外来污染。

1.6、微生物保障体系

成立微生物技术小组，着重对微生物检测技术改进、微生物检测计划和啤酒有害菌危害程度等方面进行研究。同时定期对微生物检验员的日常操作和分析能力进行监督考核，全面提高微生物管理意识和操作技能。

2、纯生啤酒的微生物管理方法

当拥有了良好的生产设施之后，还应该制定一套有效的管理控制方案，使检验出来的结果更加真实、准确、可信，使生产出来的产品能达到微生物的控制标准。

2.1、微生物分析方法的介绍

2.1.1、培养基培养分析法

培养基有很多种类型，不一样的培养基上生长出来的微生物也就不相同。在准备使用培养基进行培养的时候，应该结合微生物的形态特征来考虑怎样去选择，并且还要具备能够使微生物生长的必要条件。假如没有选择合适的培养基，会导致微生物生长迟缓甚至出现不生长的现象，给啤酒质量的分析带来一定的影响。在普通啤酒的检验结果中微生物较为明显，加之培养基的成本不是很昂贵，其检测结果具有一定的可信度，所以在对啤酒微生物的分析检测中还是以培养基分析法为主要方式。

培养基有液态及固态两种形式，前者在进行培养时微生物与营养物质可以大面积的接触，所以生长速度较快，可以通过比色法来计算微生物的数目，但是此过程有些繁琐，采用定性分析法更加实用。而后者培养出的微生物可以通过菌落数的方法来进行计算数目，这种方式采用定量分析法更有效。若与膜过滤的方式相结合还能够强化检验微生物的可信度。

2.1.2、atp分析法

采用atp分析方式得出的结果效率较高，但是因为在操作过程中，相关设备器材的表面也有atp的存在，所以在工作中极易被污染并且工作流程比较复杂，没有足够可靠的检测结果，特别是在检验含有极少微生物的时候，可信度更低。

2.1.3、pcr分析法

最为先进科学的一项分析方式就是pcr分析法，因为水中带金属的离子会给pcr的扩充带来一些影响，所以还不能被运用到检验酒液中是否存有微生物的方式中。但是，可以用于判定几种特殊有害物质的方法中。所以现在最主要的分析方式还是培养基培养分析法，其他的方法主要用于帮助。

2.2、微生物管理

微生物的管理不仅是需要有效的检验方法，最为重要的是需要合理的管理方案。只凭简单的检验分析不能对微生物进行有效的控制，因为检验有一定的延迟性，到检验结果公布的时候，被污染的范围也许已经扩散了，难以分析，并且还要对大量的产品进行再次检测和确认，因此仅靠分析方法不能达到控制微生物的目的。

唯有通过有效地微生物管理方式才能使微生物得到良好的控制。想要进行有效的微生物管理一开始就要明白微生物有关的主要控制点，了解可能产生的原因、检测方式以及曾经形成污染的原因。然后要弄清楚各种微生物的特点，明白在哪些控制点会检验出哪类微生物，会不会对啤酒产生危害，这有利于污染原因的分析和实行有效的控制方法。最后要常去工作现场，检查其卫生状况，观察机器的工作情况，工作人员的操作步骤，对有可能产生的不良影响，及时进行更正。对实际工作进行了解，既能够及时检查出存在的问题，还可以为将来可能产生的污染问题提供解决思路，缩小检查空间，及时发现问题并进行快速处理。

纯生啤酒管理的关键地方就是灌装机，其他的微生物管理可以通过清洗除菌后所获得的数据和机器工作的情况进行测定，但是在灌装机的管理方面因为人工清洗有些复杂，为了方便进行管理，最好是在一定时间内对灌装机的一些重点运作区域进行棉球擦拭形式的微生物分析法，以确定是否要进行清洗杀菌。

3、结束语

要想得到良好的微生物控制，需要相关工作人员积极的配合。只有让他们充分了解微生物对产品严重的危害性，让他们了解所拟定的生产目的同时激励他们观察出问题。由此，才能真正做到有效控制微生物的工作。

参考文献

[1]尹曙光.纯生啤酒罐装过程的微生物控制.啤酒科技[J]，2010（03）.

[2]黄圣榕.纯生啤酒的质量控制.啤酒科技[J]，2011（10）.

篇2

关键词：土壤微生物；多样性；DNA；提取技术

中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06

Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research

XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong

（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）

Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.

Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method

土壤微生物多样性是生物多样性研究的一个重要领域，是指其在遗传、种类、结构与生态功能方面的变化，对指示土壤微生物群落的稳定性，在保持土壤质量和生态系统稳定性等方面具有重要意义[1]，是当今国内外关注和研究的热点问题之一。

长期以来，由于研究方法的限制，传统的分离纯化培养技术仅能获得土壤中微生物总种群数的1%左右，而绝大部分微生物目前还不能获得纯培养[2]，未能获得纯培养的微生物才是土壤微生物的主体，因此，有关微生物多样性研究进展不大。

近年来，随着分子生物学技术的发展和研究手段的更新，基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学研究方法避免了传统分离培养方法的缺点，被广泛应用于土壤微生物群落结构、功能以及动态监测研究[3]。因此作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的、具有代表性的微生物总基因组DNA。关于土壤微生物DNA提取方法的报道很多[4，5]，然而这些方法主要侧重于土壤中的细菌群落，很少关注土壤中真菌群落总基因组DNA的提取方法及其提取效果。另外，细胞裂解不完全、DNA分子吸附在样品基质颗粒的表面、从样品中同时提取了某些重要酶的活性抑制剂、DNA分子的损耗、降解和破坏等因素也影响着土壤微生物DNA提取的质量，因而提取土壤微生物总DNA在研究中尤为重要[6]。本文主要对DNA提取过程中的主要影响因素、现行各方法的优缺点以及存在的问题作一综述。

1 基于DNA方法的土壤微生物多样性研究现状

传统微生物学研究方法主要依赖于纯培养技术和显微镜技术，对土壤微生物多样性的描述与研究存在一定的局限性。20世纪中后期，随着土壤微生物多样性研究向多方面发展，人们尝试着利用分析微生物细胞中某种指示成分，如磷脂脂肪酸（PLFA）来研究土壤微生物的种群组成，但是这些方法的缺陷是无法保证细胞中某种指示成分在土壤中的稳定性，并且如果某种微生物的PLFA是未知的，则该不可培养微生物仍难以鉴别[7，8]。

1980年，Torsvik等[9]首次建立了从土壤样品中直接提取细菌DNA的方法，并于1990年将其成功应用于DNA杂交技术，研究发现1 g土壤中有4 000个以上不同的细菌种类，说明土壤中微生物多样性是极其丰富的。后来研究者发现16S rDNA在原核微生物中普遍存在，并且含有相对保守和可变区域，在不同的个体间16S rDNA基因序列也不会进行基因交换，因此，每一种生物都有自己的独特序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA为基础确定环境样品中的微生物，使人们对大量不可培养微生物群体有了全新的认识。此后，基于16S rDNA基因的指纹图谱分析的现代分子生物学技术得到迅速发展，包括限制性片段长度多态性分析（RFLP）、随机扩增DNA多态性分析（RAPD）、单链构象多态性分析（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，为全面揭示土壤微生物种群结构和遗传多样性提供了重要手段。其总的技术路线：分离微生物基因组DNA，用特异性引物扩增16S rRNA基因片段，再将该PCR扩增产物进行更深一步分析，从而可在种、属的水平上研究不同生境中的微生物种群结构及其动态变化[10]。

2 土壤微生物总DNA的提取

从土壤样品中提取DNA的方法大致可分为2类，即间接提取法和直接提取法。间接提取法首先是对土壤样品进行反复悬浮和离心，去除土壤等杂质，提取土壤微生物细胞，再采用酶裂解细胞提取微生物总DNA。直接裂解法是不去除土壤等杂质，而是通过物理的、化学的、酶解等手段相结合，直接裂解土壤中的微生物细胞，使其释放DNA，再进行提取和纯化。但不论采用何种方法，都存在一定的缺陷，要想提取较完整的DNA需要具备以下几个条件： ①土壤微生物能从土壤中充分释放，尤其是那些紧紧吸附在土壤颗粒，甚至深藏于土壤微穴中的细菌等相对比较难分离的微生物。②对一些比较顽固的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，需要更剧烈的处理，而这又会造成对裂解敏感的细菌DNA折断。③采集土壤样品后应尽快提取DNA，因为土壤在4 ℃储藏几周就会造成大分子DNA的降解。

2.1 间接提取土壤微生物总DNA

Torsvik等[11]最先报道了从土壤中提取微生物DNA的间接法，包括以下4个步骤：①分散土壤；②土壤微生物的提取（分离细胞与土壤）；③土壤微生物的纯化；④细胞裂解及DNA纯化。

2.1.1 土壤分散 土壤微生物一般与土壤颗粒结合，包藏在土壤团聚体内，因此，最大限度地分散土壤是从土壤中分离提取微生物的关键。通常采用物理或化学法，或是二者相结合以达到微生物与土粒分离的目的。常用的物理分散技术是使用玻璃珠与土壤悬液一起振荡，或是使用韦林氏搅拌器（匀浆器、转子混合器）搅拌分散，或是使用超声波分散土壤团聚体等。而化学分散法是通过加入化学分散剂以达到促进微生物与土粒分离的目的。最常用的分散剂为0.2%焦磷酸钠，其他还有Winogradsky盐溶液、Tris缓冲液、生理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得注意的是，为有效地分散土壤，分散剂的种类、浓度、加入量、机械作用（振荡、搅拌和超声波等）的方式、时间以及容器的大小等均应加以考虑。还可以将化学试剂与机械方法结合来悬浮土壤颗粒。研究发现Chelex100就是一种有效的土壤颗粒悬浮剂。各种分散方法分散效果不同，采用何种分散方法效果最佳目前尚无一致结论，而且防止细胞因物理、化学作用导致破裂提前释放DNA很重要，处理不当会使DNA降解。常用分离提取土壤微生物的土壤分散方法列入表1。

2.1.2 土壤微生物的提取 土壤微生物的提取通常采用离心分离法，既要使微生物与土壤颗粒分离，又要保证基本不破坏微生物细胞。由于土壤中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3）远小于土壤矿物质的平均密度（2.6 μg/cm3），因此采用离心或淘选法可使细菌与土壤颗粒得到较好的分离。Hopkins等[17]采用密度逐级离心法分离出60%以上的土壤细菌。此外，也有学者提出用过滤法，即将土壤样品分散处理后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可能含有绝大多数土壤细菌，此过程操作简便，提取液中土壤残留物少，易于纯化。

由于土壤中的真菌、放线菌主要以菌丝的形态与土壤颗粒缠绕在一起以及细胞壁结构的特殊性，从土壤样品中分离提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌相对困难。迄今为止，国内外有关分离提取真菌的研究文献极少，且这些报道方法所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的极少部分。Vilarino等[21]在前人研究的基础上提出了分离土壤真菌的原理：新鲜土壤经分散后，土壤悬浮液中的菌丝可附着在慢速转动的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的土壤真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，采用微波处理菌丝并置于10× TE Buffer中即可得到DNA，建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法，为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。吴敏娜等[23]以传统土壤总DNA提取方法及纯菌DNA提取方法为基础，分别与蜗牛酶、纤维素酶进行组合、优化，得到7种不同的土壤真菌基因组DNA提取方法。分离提取土壤细菌和真菌的流程如图1所示。

2.1.3 土壤微生物的纯化 目前常用两相分离技术对上述土壤微生物提取液进行纯化。两相分离技术最早为德国化学家Albertsson于20世纪50年代所建立，当时主要用于生物大分子的分离。近些年该技术广泛应用于生物化学、细胞生物学和生物工程等领域，是一种分离、纯化生物大分子、细胞、病毒的方法，该技术也逐步发展成为一种温和的生物分离方法，相对于原始的纯化手段具有过程简单、纯化时间较短等特点，应用领域广泛[24]。关于其分离机制目前尚不完全清楚，有人认为其分离的原理主要取决于不同组分的亲水性差异，也有人认为还与不同组分的电荷性质差异有关。当两种互不相溶的聚合物以一定浓度溶于水中时，便可形成体积不同的两相，被分离组分由于其与两相的亲和力不同，分别进入不同相从而达到分离的目的。目前应用最为广泛的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）系统和PEG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）系统。对于不同的两相组分，分离时间不尽相同[25]。Smith等[19]研究了应用两相分离技术从土壤中分离纯化非菌丝体微生物的效果，发现经充分混合静置一定时间后，即可形成上下两层体积比约为4∶1的两相分离系统，其中细菌主要富集在上层PEG相，土壤残存颗粒将进入下层Dextran相，经4次提取纯化，富集在上层PEG相的细菌总量约达加入两相分离系统细菌总量的60%，而上层PEG相中的土壤矿质颗粒总量仅占总加入量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran两相分离技术（A2PP）纯化细菌，测定细菌生物量，研究两相分离技术在土壤微生物研究领域的可应用性，结果表明采用0.1%胆酸钠、钠型离子交换树脂、玻璃珠与土壤一起在4 ℃下振荡2 h，能较好地分散、纯化土壤细菌。研究表明，两相分离技术同样有可能用于分离纯化土壤真菌。

2.2 直接提取土壤微生物总DNA

现今的土壤细菌DNA直接提取法是在Ogram等[27]建立的方法基础上发展起来的，主要包括两个步骤：①原位细胞裂解；②DNA提取和纯化。

2.2.1 原位细胞裂解 直接裂解土壤微生物细胞的方法包括：机械破碎法、化学法、酶解法及3种手段相结合。机械破碎法常用的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震荡法；化学法常用表面活性剂SDS和SarkosyI、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K、链霉蛋白酶等。其中溶菌酶不仅可处理革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种方法相结合对DNA的提取效果较好。王啸波等[28]采用PBS缓冲液洗涤土壤样品，结合SDS裂解微生物细胞的方法，同时提取2种土壤样品的微生物DNA和RNA，结果表明该法提取的核酸不需要进一步处理，其纯度就可以满足后续的分子生物学试验，从而避免了由于纯化导致的核酸量的降低。熊开容等[29]采用冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS方法提取了活性污泥中微生物DNA，结果表明获得的DNA适合于酶解和PCR扩增要求。

值得关注的是，土壤中微生物种类繁多，生理状态不同，革兰氏阳性和阴性细菌以及细菌与真菌的细胞壁结构和组成亦不相同。为了使提取的DNA具有代表性，就必须保证土壤样品中所有微生物细胞裂解释放出核酸，因此必须根据试验的性质、要求选择适当裂解方法。研究表明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌效果不好。张瑞福等[30]采用冻融+溶菌酶+SDS方法提取3种芽孢杆菌（G+）DNA，结果表明经冻融处理的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处理的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处理未对DNA造成大的剪切，提取的DN段还大于23.1 kb。张颖慧等[31]使用优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。使用液氮冻融以及玻璃珠振荡的方法代替了传统的液氮研磨，实验结果表明该方法所需菌体量少，且得到的基因组DNA比用传统的CTAB法得到的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简单，适用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大部分分子生物学基本实验如PCR和DNA的酶切等。

2.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNA提取和纯化方法中，通常采用饱和酚或氯仿和蛋白酶处理，去除DNA样品中的蛋白质和部分RNA，然后对DNA进行抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（PEG）沉淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其他纯化方法有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。

Lamontagne等[32]研究结果表明PVP能够与腐殖酸结合，起到有效去除提取的DNA中腐殖酸杂质、提高DNA纯度的作用。李靖宇等[33]采用氯化钙-SDS-酶法对湿地土壤微生物DNA进行提取，结果表明该方法能高效去除湿地土壤腐殖酸，纯度较高，能直接满足PCR扩增。李钧敏等[34]用含PVPP的缓冲液预洗DNA样品，然后添加CaCl2和牛血清白蛋白可去除其中的腐殖酸，用PEG8000沉淀DNA，可提高DNA质量，并证实这是一种简便有效可直接应用于PCR分析的土壤微生物总DNA的提取方法。蔡刘体等[35]采用 SDS-CTAB法提取烟草病圃土壤微生物总DNA，该方法既可达到裂解效果，还有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA 的质量。吴红萍等[36]采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的土壤微生物DNA进行纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16S rDNA基因引物可扩增到相应的片段。朱立成等[37]采用直接法提取土壤微生物总DNA，然后用Sephadex G-200凝胶离心层析法纯化，可得到纯度较高的DNA。段学军等[38]采用稀释模板及巢式PCR法很好地解决了在DNA提取纯化过程中不能完全去除腐殖质的问题。滕应等[39]将BIO101 Systems公司研制的FastPrep多试管核酸提取系统与相应的Fast DNA SPINKit for Soil试剂盒联用，有效地提取了重金属复合污染的农田土壤微生物总DNA。

没有哪种单一的纯化步骤可以除去所有污染物，故许多研究者已经将几种纯化步骤结合起来以期获得最好的纯化效果。Smalla等[40]将粗提的DNA进行3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾沉淀；③Geneclean纯化。发现经前2步纯化的DNA通过稀释即可部分被限制性酶切和扩增，但如不经稀释而进行限制酶切和扩增，则必需进行最后一步纯化。

2.2.3 直接法和间接法的比较 研究表明，直接法获得的DNA较多，但不易去除抑制剂，间接法提取的DNA只占直接法的1/10，但分离的DNA纯度较高，而且间接法得到的细菌量只占总菌群的25%～50%，直接法提得的DNA却可以超过细菌总DNA的60%。因此，要想获得大量DNA，选择直接法较好，当所需DNA量不大，而且要排除真核或胞外DNA污染时，可用间接提取法。

直接提取对某些特定样品用特定的操作方法能获得较高的提取效率，但是对有些生物量不高的样品则很难得到足够的环境总DNA用于后续操作，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下采用。间接提取在提取效率上远小于直接提取，但用间接提取法所得到的环境总DNA纯度较高，所有样品能直接用于PCR扩增，并且能更好地体现样品中微生物的多样性，适用于有大量样品的情况。

2.3 DNA的纯度和浓度测定

DNA在260 nm处有吸收峰，腐殖酸在230 nm处有吸收峰，计算OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以确定所提DNA中腐殖酸的污染程度。一般情况下OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间为好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸污染越严重。蛋白质在280 nm处有吸收峰，因此OD260/OD280比值经常被用来指示DNA中蛋白质的污染程度，当OD260/OD280比值为1.8～2.2时，DNA较纯，当受蛋白质或其他杂质污染时，OD260/OD280值则较低[41]。此外，还可采用PCR扩增检测DNA的纯化质量，所用扩增引物见文献[42]。

提取的DNA浓度也可根据测定的OD260值计算，根据公式[dsDNA]=50×OD260×稀释倍数，计算DNA的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取DNA的量[43]；还可采用DyNA Quant 200荧光仪对纯化后DNA的浓度进行测定[28]。

3 影响土壤微生物总DNA提取的因子

土壤成分复杂，含有大量的有机及无机等多种生物活性抑制物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可能影响土壤DNA的提取质量，抑制DNA聚合酶的活性从而影响土壤微生物多样性的分析。研究发现，腐殖酸是土壤DNA提取过程中极难去除的污染物，由于它的分子大小和理化性质与DNA相似，过分注重腐殖酸的去除，势必会造成DNA的大量损失，因此腐殖酸的有效去除是土壤DNA提取的难点所在。

各种土壤类型、质地和成分的差异，都会影响土壤微生物DNA的提取效果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法从8种土壤（包括沃土、沙沃土和沙黏土，其中黏土含量为5%～31%不等）中提取DNA，平均获得DNA的量为0.5～26.9 μg/g，并发现获得的DNA量与土壤的有机磷含量有明显的正相关关系。另外，研究也发现，土壤中细菌的裂解效率与其中黏粒的含量呈明显的负相关。土壤中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的顺序为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，其中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径不同的土壤颗粒表面的最大与最小吸附量分别相差389.0和857.0倍，去有机质土壤颗粒对细菌吸附亲和力较含有机质土壤颗粒的大[45]。因此，不同的土壤适合于不同的DNA提取方法，在土壤DNA提取过程中，应针对土壤类别选取合适的提取方法，以便进行后续研究。

4 小结

从土壤微生物群体基因组的角度研究其多样性及功能是可行的方法，并受到广泛的关注[46]。因而越过分离培养的步骤，直接从土壤中获得总DNA以分析土壤微生态群落结构，关键是如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总DNA。土壤本身成分复杂，有许多物质难以预料，对提取较好质量的DNA提出了很高的要求。因此建立一种简单有效的提取方法显得非常重要。

间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的种类和数量较少；直接提取法直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能地释放，能够代表大部分的土壤微生物，但土壤中所含物质种类较复杂，所以提取的DNA质量受到很大的影响，需要进一步纯化，而这些处理往往造成部分DNA的丧失，可能使在土壤中本身存在量较少的种类丧失或检测不到，影响到土壤微生物多样性的分析。最近，Milko等[47]发现一种Taq DNA聚合酶基因突变型可增加对腐殖酸等PCR抑制物的抗性，不需要对基因组DNA进行纯化就可以进行后续的分子生物学分析，因此具有广泛的应用前景。

绝大多数直接提取法提取的DN段长度不会超过23 kb，而DNA的某些用途如宏基因组文库构建，需要大片段的DNA，直接提取法对此几乎无能为力。

在DNA提取产率高即表示其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA直接提取法被认为是较好的方法并被广泛应用[48]。但近年来有研究表明DNA提取的产率高不等同于微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相关研究[49]。这就要求在选择提取方法时不仅要试用直接提取和间接提取这两类方法，而且在每类方法中也要试用不同的处理组合方式，以使后续操作能顺利进行，并得到准确可信的研究结果。

评价一种土壤微生物DNA提取方法是否有效，除了通常要求的提取片段无降解且比较完整外，还需要能够有效去除土壤中大量存在的影响后续实验的物质，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单位样本量中比较彻底地提取出微生物DNA；提取方法应具有普适性，对土壤中大多数微生物能够有效等[50]，且提取的DNA能更好地代表土壤微生物的真实性和异质性。

5 展望

目前，国内外对土壤微生物总DNA提取方法的报道很多，但每一种方法都存在一定的缺陷。因此，从土壤样品中提取DNA还没有通用的最佳方案，需要根据具体的土壤特点、实验室条件和实验目的而定。在提取过程中还要兼顾实验操作是否简便，方法是否经济以及样品量是否充足。另外，将现代分子生物学技术与传统微生物研究方法结合起来，才能更全面地认识和理解土壤微生物群落多样性及其相应的生态功能。

参考文献：

[1] 肖艾和，张洪霞，谭周进，等.土壤微生物多样性研究的DGGE/TGGE技术进展[J].核农学报，2009（4）：721-727.

[2] AMANN R I， LCDWIGW， SCHLEIFER K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews，1995，59（1）：143-169.

[3] PACE N R.A molecular view of microbial diversity and the biosphere[J].Science，1997，276：734-740.

[4] 陈 邦，范代娣，王 琰.土壤微生物DNA提取方法的研究[J].西北大学学报（自然科学版），2009，39（5）：785-788.

[5] DELMONT T O， ROBE P， CLARK I， et al. Metagenomic comparison of direct and indirect soil DNA extraction approaches[J]. Journal of Microbiological Methods， 2011，86（3）：397-400.

[6] 孙海明，朱 梅，郭宇南，等.不同土壤微生物 DNA 提取方法比较[J].北华大学学报（自然科学版），2011（5）：550-552.

[7] SHINPEI YOSHITAKE， MASAKI UCHIDA ， TAKAYUKI NAKATSUBO.Characterization of soil microflora on a successional glacier foreland in the high Arctic on Ellesmere Island， Nunavut， Canada using phospholipids fatty acid analysis[J].Polar Bioscience，2006，19：73-84.

[8] PHILIP W R， MATTHIAS C R， KEVIN P F， et al. Choice of methods for soil microbial community analysis： PLFA maximizes power compared to CLPP and PCR-based approaches[J].Pedobiologia， 2006，50：275-280.

[9] TORSVIK V， GOKSOYR J， DAAE F L. High diversity in DNA of bacteria [J]. App1ied and Environmental Microbio1ogy，1990，56：782-787.

[10] JENNIFER L K， LEE A B， MIRANDA H， et al. Methods of studying soil microbial diversity[J]. Journal of Microbiological Methods，2004，58：169-188.

[11] TORSVIK V L， GOKSOYR J. Determination of bacterial DNA in soil[J]. Soil Biological and Biochemistry，1978，10（1）：7-12.

[12] 芦晓飞，赵志祥，谢丙炎，等.米拉山高寒草甸土壤微生物DNA提取及宏基因组Fosmid文库构建[J].应用与环境生物学报，2009，15（6）：824-829.

[13] 刘宏伟，彭 谦，李沁元，等.高温环境样品总DNA直接和间接提取方法的比较[J].微生物学报，2006，46（6）：1018-1002.

[14] GABOR E M， de VRIES E J， JANSSEN D B. Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods[J].FEMS Microbiol Ecology，2003，44：153-163.

[15] MACDONALD R M. Sampling soil microfloras： Optimization of density gradient centrifugation in percoll to separate microorganisms from soil suspensions[J]. Soil Biological and Biochemistry， 1986，18：407-410.

[16] HERRON P R，WELLINGTON E M H. New method for extraction of streptomycete spores from soil and application to the study of lysogeny in sterile amended and nonsterile soil[J].App1ied and Environmental Microbio1ogy，1990，56：1406-1412.

[17] HOPKINS D W， MACNAUGHTON S J， O’DONNELL A G. A dispersion and differential centrifugation technique for representatively sampling microorganisms from soil[J].Soil Biological and Biochemistry，1990，23：117-225.

[18] TUPIN P E， MAYCROFT K A， ROLANDS C L，et al. An ion-exchange based extraction method for the detection of salmonellas in soil[J]. Applied Bacteriology， 1993，53：860-863.

[19] SMITH N C， STRIBLEY D P. A new approach to direct extraction of microorganism from soil[A]//RITZ K， DIGHTON J， GILLER K E. Beyond the Biomass[M].London： British Society of Soil Science， 1994.

[20] LINDAHL V. Improved soil dispersion procedures for total bacterial counts，extraction of indigenous bacteria and cell survival[J]. Microbiol Methods， 1996，25：279-286.

[21] VILARINO A， ARINEL J， SCHUEPP H. Extraction of vesicular arbuscular mycorrhizal mycelium from sand samples[J].Soil Biology and Biochemistry，1993，25：99-110.

[22] 潘 力，崔 翠，王 斌.一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法[J].微生物学报，2010，37（3）：450-453.

[23] 吴敏娜，张惠文，李新宇，等.提取北方土壤真菌DNA的一种方法[J].生态学杂志，2007，26（4）：611-616.

[24] RAGHAVARAO K S M S， RANGANATHAN T V， SRINIVAS N D. Aqueous two phase extraction——An environmentally benign technique[J]. Clean Technical Environmental Policy， 2003，5：136-141.

[25] 向万胜，吴金水，肖和艾，等.土壤微生物的分离、提取与纯化研究进展[J].应用生态学报，2003，14（3）：453-456.

[26] 李 妍，倪德军，胡红青，等.应用两相分离技术研究红壤微生物组成的探讨[J].土壤学报，2007，44（1）：152-158.

[27] OGRAM A， SAYLER G S， BARKAY T. The extraction and purification of microbial DNA from sediments[J]. Microbiol Methods， 1987，7（2-3）：57-66.

[28] 王啸波，唐玉秋，王金华.环境样品中DNA的分离纯化和文库构建[J].微生物学报，2001，41（2）：133-140.

[29] 熊开容，张智明，张 敏.活性污泥DNA提取方法的研究[J].生物技术，2005，15（4）：43-45.

[30] 张瑞福，崔中利，曹 慧，等.土壤微生物总DNA的提取和纯化[J]. 微生物学报，2003，43（2）：276.

[31] 张颖慧，李明春，魏东盛，等.一种改进的丝状真菌 DNA 提取方法[J]. 微生物学通报，2008，35（3）：466-469.

[32] LAMONTAGNE M G， MICHEL F C， HOLDEN P A， et al. Evaluation of extraction and purification methods for obtaining PCR-amplifiable DNA from compost for microbial community analysis[J]. Journal of Microbiological Methods，2002，49（3）：255-264.

[33] 李靖宇，赵 吉，边 玉，等. 湿地土壤微生物 DNA 提取及其脱腐技术[J]. 微生物学通报，2010，37（8）：1130-1137.

[34] 李钧敏，金则新.一种高效可直接用于PCR分析的土壤总微生物DNA抽提方法[J].应用生态学报，2006，17（11）：2107-2111.

[35] 蔡刘体，胡重怡，罗正友，等. SDS-CTAB法提取烟草病圃土壤微生物总DNA[J]. 江西农业学报，2011，23（2）：119-121.

[36] 吴红萍，郑服丛.不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化[J].广西农业科学，2008，39（1）：21-61.

[37] 朱立成，邹小明，蔡瑞玉.红壤中微生物总DNA的分离与纯化[J].井冈山学院学报（自然科学版），2007，28（12）：5-7.

[38] 段学军，闵 航.镉胁迫下稻田土壤微生物基因多样性的DGGE分子指纹分析[J].环境科学，2004，25（6）：122-126.

[39] 滕 应，骆永明，赵祥伟.重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析[J].土壤学报，2004，41（3）：343-347.

[40] SMALLA K， CRESSWELL N， MENDOCA-HAGLER L C， et al. Rapid DNA extraction protocol from soil for polymerase chain reaction-mediated amplification[J]. J Applied Bacteriology，1993，74：78-85.

[41] YEATES C， GILLINGS M R， DAVISON A D， et al. Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification [J]. Biological Procedures Online，1998，1（1）：40-47.

[42] 张于光，李迪强，王慧敏.用于分子生态学研究的土壤微生物DNA提取方法[J].应用生态学报，2005，16（5）：956-960.

[43] 吴冠芸，潘华珍.生物化学与分子生物学实验常用数据手册[M].北京：科学出版社，1999.249-250.

[44] ZHOU J Z， BRUNS M A， TIEDJE J M. DNA recovery from soils of diverse composition[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，62（2）：316-322.

[45] 蒋代华. 细菌在粘土矿物及土壤颗粒表面的吸附研究[D].武汉：华中农业大学，2009.

[46] TORSVIK V，OVREAS L. Microbial diversity and fuction in soil： from genes to ecosystems[J]. Ecology and Industrial Microbiology，2002，5：240-245.

[47] MILKO B K， LYUBKA I K， ERIKA E V， et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples[J]. Nucleic Acids Research，2009，37（5）：2-14.

[48] HUBER J A， BUTTERFIELD D A， BAROSS J A. Bacterial diversity in a subseafloor habitat following a deep-sea volcanic eruption[J].FEMS Microbiology Ecology，2003，43：393-409.

篇3

【关键词】微生物学；实验教学；教学改革；创新

微生物学是涉及生命科学、食品科学、医学、环境科学等众多领域的一门重要学科。同其它生物学科一样，微生物学也是一门实践性很强的学科，实验技术的发展是微生物学赖以建立和发展的直接基础[1]。因此，在微生物学的教学过程中，实验教学是实现其教学目标所必不可少的重要环节，在创新性人才培养和素质教育中起着至关重要的作用。同时，对于学生而言，掌握好微生物学实验技术既是从事微生物学相关研究的基本保证，也是培养学生缜密思考、细心观察、严格操作的良好习惯的重要途径，更是未来开发和利用微生物资源的重要手段[2]。

1优化实验教学内容，激发学生学习兴趣

传统的微生物学实验多为验证性实验。例如，为帮助学生形象地了解不同类群微生物的细胞形态，先后安排了“细菌形态观察”、“放线菌形态观察”、“霉菌形态观察”和“酵母菌形态观察”4个实验；为了帮助学生认识细菌细胞的特殊构造，又分别安排了“革兰氏染色”、“芽孢染色”、“鞭毛染色”和“荚膜染色”4个实验。这些基础性实验，一方面和教师的理论课教学有相当的重复率，另一方面，各相关实验之间涉及的实验原理也有一定的相似性。因此，学生在实验课的学习过程中会觉得内容简单重复，过于枯燥。为适应教学改革的需要，在保证教学效果的前提下，我们将微生物实验教学内容认真进行了重新规划和调整。

1.1压缩验证性实验内容

验证性实验重点培养的是学生对基础知识的掌握和基本操作技能的训练。在教学改革中，我们依据教学大纲的要求，保留了“显微镜的使用”、“微生物制片与染色技术”、“无菌操作技术”、“微生物生长量的测定”、“培养基的制备与灭菌”和“微生物纯培养技术”六个基础项目，其中每项实验仅挑选一个最具代表性的实验内容为实验课教学所采用。比如，“微生物制片与染色技术”中，选取了重要的“革兰氏染色实验”，而与之相似的“芽孢染色”、“鞭毛染色”、“荚膜染色”内容则调整到理论课教学中展示，这样不仅节约了实验课的教学时间，也能保证教学重点的突出。同时，在验证性实验教学中，教师还鼓励有兴趣的同学参与到实验准备过程中来，增强了学生对微生物实验的全景式了解，调动了学生的学习积极性。

1.2 增加综合性实验和设计性实验内容

实验教学改革要求以学生为本，充分体现学生的主体地位[3]。而综合性实验和设计性实验不仅能很好的发挥学生的主观能动性，还能充分培养他们的创新能力。例如，我校的微生物实验教学中，开设了《水的细菌学检查》、《酸奶中乳酸菌的分离及发酵活性研究》等综合性实验，要求学生4人一组，在教师的指导下共同完成实验材料的准备、实验实施、结果分析和实验报告。综合性实验的开设，帮助学生将分散的理论知识和各项实验技能有机地结合起来解决实际问题，激发了学生对实验课的学习兴趣和热情。在此基础上，进一步开设设计性实验训练学生的科研能力和分析能力。学生在教师的指导下选定实验项目，通过查阅文献、制定方案、准备材料、完成实验，最终得出结论，并提交包含上述内容的实验报告。在设计性实验中，学生完全作为实验的主体，教师仅起到了辅助和指导作用，全面培养了学生收集信息、分析问题、归纳整理和科学思维的能力，为未来的科研之路打下了良好的基础。经过调整，我校微生物学实验教学中验证性实验所占的比例由最初的90%降至50%，综合性和设计性实验则由10%上升至50%，教学内容安排日趋合理。

2引入多媒体授课方式，强化教师教学效果

近年来，生命科学相关的各类课程几乎或多或少都引入了多媒体技术作为重要的教学辅助手段。我校的微生物理论教学也较早采用了多媒体技术，教学效果良好。而实验课教学中多年来仍沿用板书讲解、教师演示这一传统的教学模式。近两年，随着实验教学条件的日趋完善，教学实验室内也配备了多媒体设备，多媒体授课方式的引入，不仅改变了原有的授课形式，也使得教学效果有了明显提高。例如，微生物学“无菌操作技术”实验中，对于重点的无菌接种操作步骤，教师都要面对学生亲自动手示范。由于演示的实验台的空间有限，教师操作时，并不能确保全班每一个学生都能清晰地观察到操作的具体细节，因而学生动手实验时往往还是会出现操作不规范甚至操作错误的现象。采用多媒体教学后，由于可以通过图片、视频等直观地展示并放大实验操作的细节性内容，不但增强了实验操作的演示效果，还能保证学生学习的准确性和实验操作的规范，而这种先进的教学方式，学生也比较乐于接受。

3完善考核评价体系，全面评定学生能力

考核环节是提高实验课教学质量不可或缺的一部分，直接影响学生的学习动力、学习态度和学习效果，没有有效的考核机制，教学改革也可能会流于形式[4]。传统的微生物学实验考核多是单一的以实验报告和平时考勤进行评定，容易造成学生只重视实验报告、忽略实验操作，重视实验数据、忽视实验过程的情况。因此，在教学改革中，我们将实验课总评成绩划分为平时成绩10%（包括实验预习、课堂考勤、动手操作、安全卫生等）、实验报告20%和实验考试70%三个部分。期末的实验考试重点考核学生的动手操作能力，采用抽签的方式让学生随即抽取一项考试内容，在规定的时间内完成实验操作得出实验结果，教师根据学生的实验操作情况和实验结果进行评分。这样的考核机制不但能全面衡量学生的学习效果，而且在平时的课堂实验中学生的动手积极性也普遍提高，明显促进了课堂教学。

参考文献：

[1] 张磊，沈锡辉.改革微生物学实验教学模式 培养创新型人才[J].中国教育技术装备，2012，24：25-26.

[2] 高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物学实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.

篇4

关键词：食品微生物；快速检测技术

中图分类号：R194.2文献标识码：A

众所周知，食品是人类赖以生存和发展的基础，而食品的安全问题的重要性是显而易见的，目前食品的安全已经得到了全社会甚至全世界的广泛关注。食品微生物快速检测技术和传统的检测技术相比具有很多的优点，因此得到了越来越广泛的应用和推广，通过快速检测技术的应用，可以实现对食品中各种微生物的快速检测，避免由于食源性而导致的疾病，保证人类的健康。本文对当前应用的较为广泛的食品微生物快速检测技术进行了分析和探讨，目的是希望用最快及最准确的方法检测食源性致病菌，进而保证人们生命的安全。

1免疫学技术

1.1免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence　technique　）又称荧光抗体技术。它是通过抗原抗体反应的高度特异性，在抗体（或抗原）上加入不影响抗原抗体活性的荧光色素标记，当与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应从而实现对细菌的检测和鉴别的技术。

该技术通常可以按照以下的操作步骤来完成检测。

1.1.1对接受检测的样本中的抗原或者抗体测定出来，使被检验的样本和酶标抗原或者是抗体结合在一起之后，根据相关要求中的步骤使其和固相载体的表面的抗原和抗体发生反应。

1.1.2通过洗涤将位于固相载体表面的抗原抗体分离出来，这时使得接受检测的样本的量和位于固相载体表面的酶量会以一定的比例结合在一起，然后在其中加入一定量的酶反应底物，这时经过催化剂的摧毁作用底物将会变成有色物质，有色产物和接受检测样本物质的多少之间有着密切的关系，这时就可以根据有色物质的颜色深浅来完成对接受检测样本的定量分析。该种检测方法的灵敏度较高，增菌之后样本在达到检出度需要的时间比较短，因此抗原和抗体在很短的时间之内就可以完成结合反应。

1.2酶联免疫吸附技术

该种技术是放射免疫技术和荧光技术的有机结合，酶联免疫吸附技术是固相载体通过对抗原和抗体的吸附并完成免疫酶染色，当底物有颜色显现出来之后然后对定量有色产物的分析进而将接受检测样本中的某些物质的具体含量确定出来。当前主要的分类方法有竞争法、捕获法、间接法以及夹心法。酶联免疫吸附技术具有很多优点，比如可以实现定量分析、适用范围广、反应灵敏准确、简单方便、检测费用低、检测速度高以及分析结果真实可靠等，该种技术可实现对数量较多的样品进行分析，数量可到上千种，正是因为该种技术具有如此之多的优点，在食品检测中得到了十分广泛的应用。

1.3免疫层析技术

免疫层析技术作为一种固相免疫测定技术，它的原理是在膜以便添加的样品在膜的毛细管的作用下朝另外一边移动和层析相似，在发生移动的过程当中某些抗原和抗体完成结合之后被固相化，在移动中除了结合物之外的物质将会被分离出来，根据标记物的颜色深浅来完成被测样本的定量分析。目前应用较为广泛的是胶体金免疫层技术，其就是通过胶体金来进行标记物的试验，具有很多的优点，比如准确、快速、简单以及无污染，可以实现对食品中霍乱弧菌、布氏杆菌、金黄色葡萄糖球菌、沙门氏菌以及大肠杆菌等的检测和鉴定。

1.4免疫磁珠技术

该种技术通过连接抗体的磁珠将增菌液中的目的捕捉出来之后在平板上将获得的目的菌进行观察分析，或亦可通过酶标记或者是荧光抗抗体来完成检测鉴定。目前可以通过该种技术来完成对大肠杆菌0111、0145、0157以及沙门氏菌的检测和鉴定。

2分子生物学

2.1基因芯片技术

基因芯片是生物芯片的一种，也就是DNA微探针阵列。基因芯片技术是通过对微电子技术和分子生物学的应用，使得被标记的基因探针和寡核苷酸点杂交之后，使用相关的检测系统实现对芯片的扫描，进而实现对被测样本中的微生物进行定量分析和鉴定。该种技术在一次试验中可以将接受检验样本中所有的潜在致病原以及其遗传性指标。在施工该种技术的时候，由于芯片检测的结构在很大程度上会受到样点自动识别的影响，因此基因芯片在进行处理数据以及提取信息的时候要确保对图像中所有杂交样点的准确定位。

2.2基因探针技术

该种技术是在一定的条件下使得2条可以实现互补的2条碱基DNA链完成互补之后形成具有稳定性的DNA，其原理是通过对接受检测的样品和DNA探针进行观测，看有没有杂交分子出现，进而实现对被检测样品中是否存在某种微生物的判断，如果有杂交分子出现即就是存在某种微生物，反之就没有。该种技术诞生于20个世纪90年代，该种技术在法国和美国等发达国家的食品微生物检测中已经得到了广泛的应用，加上现在的DNA指纹图谱自动分析系统中实现了对化学发光标志物的引进，可以更加简单方便的对获得的图谱和核酸碱基进行分析对比以实现对视频中微生物的定量分析和鉴定。

3代谢学

3.1阻抗法

阻抗法的原理是微生物在生长时培养基中的碘惰性底物经过代谢成为活性底物，这时培养基中的电导性就会增加以降低培养基中的阻抗，这对培养基中的电阻抗的具体变化情况进行检查分析就会完成对被检测样本微生物的检测鉴定。该种检测方法适用的范围广，在很多领域都得到了广泛的应用，其具有很多优点，比如特异性、高敏感性以及反映快速等。

3.2放射法

该种检测方法是将多种物理和化学诊断方法结合在一起的新的检测技术，其原理是在细菌生长的过程中通过培养基中的盐类底物或者是有碳标记的碳水化合物经过代谢之后产生一氧化碳，这时对产生的一氧化碳量进行测量分析，其量在原有碳水化合物的基础上一氧化碳量有没有增加来实现对被检测样本中的某种微生物细菌进行分析。该种检测方法具有很多优点，比如准确度高、速度快，更重要的是可以实现自动化检测。该种检测技术对各类物品的无菌检测都是非常适用的。

4干片法

该种方法是对微生物学、高分子学以及化学综合应用的检测方法，其原理是通过无毒的高分子材料作为培养基载体进而准确快速的完成对食品中各种微生物的定量分析，该种方法已经成为一种定量的常规方法。该种方法可以保证测定的精确度，对于少量样品的检查无需配置试剂，因此操作起来简单方便、费用低、携带方便而且不会受到时间的限制，除此之外该种方法没有任何废弃物产生，所以不会给环境带来污染，由此可见该种方法具有较强的适用范围，可以在很大程度上减少工作人员的工作量，而且还可以保证检测的质量。

5PCR技术

该种检测技术的原理将目的菌高度保守段的具有特异性的DNA进行大量的复制并对这些DNA进行检测分析，假如在样品汇总有目的菌存在就将有关特异性的DNA复制出来，对具有特异性DNA复制通过聚合酶链反应就是PCR技术。目前PCR技术在食品的微生物检测中已经得到了广泛的应用，而且已经形成了标准化，得到很多权威机构的认可，该种检测技术具有速度快、精度高、污染小、一级自动化程度高等优点，可以实现对单增李斯特菌、大肠杆菌O157、阪崎肠杆菌以及沙门氏菌等1　000多种细菌的检测鉴定。

6直接表面荧光滤膜计数技术

该种检测技术可以直接将被测样本中微生物负荷量测定出来，最开始研究开发该技术是为了对牛奶样品进行检测，当前该种检测方法在肉类制品、乳制品以及饮料等物质的检测中都得到了广泛的应用。该技术通过表面荧光显微镜以及膜技术的使用时限对样本的培养之后通过DEFTT来完成计数。通过该中技术可以对5℃和11℃条件下保存的巴氏杀菌乳的质量进行检测分析，而且完成每一个样品的检测不到半个小时的时间，而且检测需要的费用较少。随着直接表面荧光滤膜计数技术的不断发展，目前可以实现对苹果汁以及蔬菜等的大肠杆菌的检测和鉴定，此技术不但能通过膜过滤实现对食品中微生物的收集并在膜的表面浓缩，而且能通过表面荧光显微镜实现荧光抗体的染色。通过该种方法和别的方法分析的结果是一致的，由此可见该种方法作为李氏杆菌数量测定方法是合理可行的。

7食品微生物快速检测技术的不足

通过以上的分析和评估，不同的食品微生物检测技术都有着自己的优点以及使用范围，很多快速检测技术对于某种食品检测性能会比其他食品更加优良，这主要是因为食品自身的成分导致的，有些食品中的一些成分在使用食品微生物快速检测技术是很麻烦的，需要考虑到很多的因素，食品中的有些成分会直接影响检测的结果，因此要引起重视，以确保检测的准确性。

8结束语

综上所述，由于快速检测技术具有很多的优点，因此越来越多的应用到了食品的微生物检测和鉴定当中，这也在很大程度上促进了快速检测技术的发展和进步。由于每一种检测技术都有一定的适用性，因此不管是企业还是检测鉴定中心，在选择微生物快速检测技术的时候，要结合多种因素进行考虑，要做到以最少的时间和花费实现对食品微生物的快速检测和鉴定。这就需要不断完善科研管理体系，同时要不断提高检测队伍的综合实力，当然还要保证加大科研经费的投入以确保检测鉴定仪器的先进性，并能及时掌握国际的先进信息，以便于及时掌握一些先进的检测鉴定技术，更好的完成对食品微生物的检测和鉴定，以保证人们生命的安全。

参考文献

［1］闫雪，姚卫蓉，钱和．国内外食品微生物快速检测技术应用进展［J］．食品科学，2005（06）．

［2］熊强，史纯珍，刘钊．食品微生物快速检测技术的研究进展［J］．食品与机械，2009（05）．

［3］蔡扬尧，陈永杰．食品微生物快速检测技术应用的探讨［J］．商品与质量：学术观察，2012（04）．

［4］陈庆森，冯永强，黄宝华，魏国祥，庞广昌，胡志和．食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展［J］．食品科学，2003（11）．

［5］陈超敏，陈继道．浅谈食品微生物检测技术的应用［J］．科技与企业．2012（06）．

［6］杨平，杨迎伍，陈伟，王国民，李正国．食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究［J］．西南大学学报（自然科学版），2007（05）．

［7］刘道峰，邓省亮，赖卫华．新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用［J］．食品与机械，2011（06）．

篇5

一、    概念：

1、细胞壁 2、周质空间 3、菌落 4、荚膜 5、芽孢 6、糖被 7、气生菌丝体 8、原生质体

9、营养菌丝体 10、细胞膜 11、间体 12、羧化体 13、核质体 14、鞭毛 15、菌毛 16、隐生态 17、球状体 18、L型细菌 19、肽聚糖 20、溶菌酶 21、磷壁酸 22、伴孢晶体 23、基内菌丝 24、孢子丝 25、支原体 26、衣原体 27、立克次氏体 28、螺旋体 29、螺菌 30、PHB 31、原核微生物

二、    填空：

1、    细菌的形态十分简单，基本上只有-------、---------、----------三大类。

2、    细菌是以----------方式繁殖，并是一种---------性较强的------核微生物。

3、    量度细菌大小的单位是--------，量度其亚细胞结构则用---------作单位。

4、    细胞壁主要由---------构成，有-------和---------等多种功能，通过--------、----------或----------后再在光学显微镜下观察，可证实细胞壁的存在。

5、    原生质体和球状体有几个共同特点，主要是-------，细胞呈-----状，对-------十分敏感。

6、    基质蛋白使外壁层具有------功能，外壁蛋白是一类-------运送蛋白或受体脂蛋白，作用是使细胞壁的--------牢固地连接在由肽聚糖组成的---------上。

7、    细胞膜是-------和--------组成的，通过---------、--------、--------或--------等方法，可以证明细胞膜的存在，细胞膜的基本成分是由--------整齐地排列而成的。

8、    磷脂双分子层通常呈--------态，不同的-------和--------可在磷脂双分子层中作侧向运动。

9、    异染粒功能是---------和----------，并可---------。

10、放线菌是一类呈----------，以----------繁殖的革兰氏-----性细胞。

11、在固体培养基表面，放线菌的细胞有------和-------的分化。

12、细菌革兰氏染色的主要原理是_。影响染色的主要因素是_和_，革兰氏染色后为红色的是_。

13、影响革兰氏染色结果的因素是___，E.coli属于_性菌，染色结果为_色。 Bacillus subtilis属于_性菌，染色结果为_色。

14、微生物胞内酶作用的最适PH多接近_，而细胞质膜上的酶及胞外膜作用的最适PH则接近-------- 。

15、 脂多糖的基本组成为     ，     ，      ，为获得G- 菌原生质体，可通过加入-----剂去除脂多糖。

16、 影响微生物细胞化学组成的因素有       ，    ，       。

17、肽聚糖单体的双糖单位是由一个-------与一个-------通过---------键连接而成的。

18、肽聚糖单体的多肽尾中的四个氨基酸是按--------方式连接而成的。

19、荚膜的主要成分有---------、-----------、----------，尤以--------居多。

20、细菌的芽孢是----------体，而放线菌的孢子是----------体。

21、双糖单位中---------键很容易被---------酶所水解，从而引起细菌因肽聚糖细胞壁的“散架”而死亡。

22、    目前所知的肽聚糖有--------种，肽聚糖的多样性变化主要发生在--------上。

三、    简答题：

1、    革兰氏阳性细菌与阴性细菌结构单体有何差别？

2、    简述一下磷壁酸的主要生理功能。

3、    简述脂多糖的主要生理功能。

4、    细胞膜的功能是什么？

5、    芽孢形成的七个阶段是什么？

6、    革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌的肽聚糖结构有何不同？

7、    细菌芽孢有何特点？

8、    如何理解“菌落特征与菌体细胞结构、生长行为及环境条件有关”？

9、    简述细菌糖被的类型及其对科学研究、生产实践的意义。

10、    芽孢的耐热机制是什么？

11、    荚膜的功能是什么？

12、    细胞壁的功能是什么？

四、    论述题：

1、    试绘出细菌细胞构造的模型图，注明其一般构造和特殊构造，并扼要注明各部分的生理功能。

2、    研究微生物的形态构造有何重要性？试举一例说明之。

3、    试图示革兰氏阳性细菌和阴性细菌的细胞壁构造，并简要说明其特点及成分。

4、    试比较细菌的芽孢与孢囊的异同。

5、    产芽孢的细菌有哪几类？试各举一例。细菌的芽孢有何实践的重要性？

6、    比较G+和G-在一系列生物学特性上的差别。

7、    革兰氏染色中，为什么能把细菌分为G+和G-细菌？什么情况下将会导致实验结果相反？

8、    论述一下革兰氏染色的步骤及其染色机理，有何重要意义？

9、    试根据细菌细胞结构的特点，分析并举例说明为什么它们能在自然界中分布广泛。

10、    如何理解“放线菌是介于细菌与丝状真菌间而更接近细菌的一类微生物”？

11、    如何理解“菌落特征与菌体细胞结构、生长行为及环境条件有关”？

第一章b部分练习题

一、    概念：

1、    假菌丝 2、真菌丝 3、基质 4、微体 5、膜边体 6、子囊果 7、菌丝 8、菌丝体 9、菌丝球 10、芽痕 11、蒂痕 12、单细胞蛋白（SCP） 13、气生菌丝体 14、营养菌丝体

二、    填空题：

1、    酵母菌的细胞壁的外层为----------，内层为----------，其间夹有一层----------。

2、    维持酵母菌细胞壁强度的物质主要是位于---------层的---------成分。

3、    酵母菌细胞壁上含有少量--------和以----状形式分布在芽孢周围的---------。

4、    蜗牛消化酶内含有-------酶、-------酶、-------酶、--------酶、--------酶等30种。

5、    除细胞核外，在酵母的------和------中也含有DNA。

6、    产生掷孢子等无性孢子是在--------细胞上长出的-------上形成的。

7、    营养菌丝体的特化形式有-----------------------------------------------------。

8、    酵母菌是_，其无性繁殖方式是_和_，有性繁殖是_。

9、    霉菌产生的无性孢子有___。

10、    真菌的无性孢子有      ，      ，      ，       ，       等。

11、    真菌的有性孢子有      ，       ，      ，     ，    。

12、    细菌和放线菌利用--------酶去除细胞壁，而真菌利用-------酶去除细胞壁。

三、    简答题：

1、    霉菌一般具有哪五点特点？

2、    简述细胞膜的功能。

3、    简述芽体的形成过程。

4、    霉菌的营养菌丝和气生菌丝有何特点？它们可以分化出哪种特殊构造？

5、    如何获得细菌（G+、G+）、放线菌、酵母菌、霉菌的原生质体？

6、    为什么霉菌菌落的中央边缘、正面与反面在外形、颜色、构造等方面常有明显差别？放线菌、细菌和酵母菌呢？

7、    酵母菌有性繁殖的过程是什么？

8、    霉菌的有性繁殖方式的过程是什么？

9、    霉菌有性繁殖方式的特点是什么？

10、    简述一下酵母菌的生活史。

11、    简述一下霉菌的生活史。

四、    论述题：

1、    试述真菌与人类的关系。

2、    试论述真菌孢子的特点，并说明其实践意义。

3、    试列表比较真菌孢子的种类和各自的特点。

4、    放线菌、酵母菌、细菌和霉菌这四大类微生物有何特点？为何有这些特点？掌握这些知识有何实践意义？

5、    细菌、粘细菌、放线菌、霉菌、酵母在繁殖方式上各有什么特点？

6、    列表比较细菌、放线菌、霉菌、酵母菌细胞结构、群体特征及繁殖方式的异同点。

7、    详细比较一下真核生物和原核生物的异同？

第二章部分的练习题

一、    概念题：

1、    包涵体 2、噬菌斑 3、烈性噬菌体 4、温和噬菌体 5、裂解性生活周期 6、效价 7、溶源性 8、溶源噬菌体 9、溶源菌 10、原噬菌体 11、类病毒 12、拟病毒 13、朊病毒 14、病毒 15、一步生长曲线 16、巴斯德效应

二、    填空题：

1、    病毒粒子的包膜由------和-------组成。

2、    包涵体多数位于-------内，具有-------性；少数位于--------内，具有------性；也有-------和-------内都存在的类型。

3、    螺旋对称病毒的代表是--------，十二面体对称病毒的代表是--------，附和对称的病毒代表是--------。

4、    噬菌体的核酸是以-------居多，而真菌病毒则是----------。

5、    噬菌体的裂解是由于水解细胞膜的-------酶和水解细胞壁的-------酶的作用。

6、    温和噬菌体的存在形式有------、--------和--------。

7、    噬菌体的特点是___，其生长繁殖过程包括_____五个步骤。

8、病毒的主要组成为   和     。具有        ，     ，       ，         等特点。

9、溶原性细菌具有    ，      ，      ，    ，      等特点。

10、一步生长曲线的三个重要特性参数是--------、----------、---------。

三、    简答题：

1、    根据包涵体的特点，可把它们分成哪几种类型？

2、    病毒核酸的类型可从哪几点区分？

3、    噬菌体的吸附作用受哪些内外因素的影响？

4、    简述温和噬菌体的特点。

5、    简述溶源菌有哪些显著的特点。

6、    简述大肠杆菌l噬菌体在作为遗传工程载体时具有哪些优点？

7、    病毒学发展可分几个主要阶段？简述一下各阶段的特点及其代表人物。

8、    噬菌体的外形可分哪几个类型？其相应的核酸属何类型？

9、    病毒的核酸可分为哪几个类型？

10、    简述烈性噬菌体其裂解性的生活史。

11、    测定效价的方法有哪几种？试简述之。

四、    论述题：

1、    试介绍噬菌体在基因工程中的应用。

2、    如何判断发酵罐被噬菌体侵染了？如何预防？怎样处理？

第三章的练习题

一、    概念

1、营养   2、营养物  3、氨基酸自养型微生物  4、氨基酸异养型微生物

5、生长因子  6、培养基  7、天然培养基   8、组合培养基  9、半组合培养基     10、固体培养基   12、液体培养基  13、选择培养基  14、鉴别培养基

15、加富培养基  16、碳源  17、氮源  18、能源  19、水活度

20、自养微生物

二、    填空

1、    生长因子过量合成微生物可作为-------的生产菌。

2、    常用的选择性培养基几乎都同时利用了------和------原理。

3、    营养物质进入细胞的方式有-----、------、-------、-------。

4、    在促进扩散过程中，必须借助于膜上的底物--------的参与。

5、    微生物吸收营养物质的主要机制是--------，由它运送的营养物质主要有-------、-------和--------。

6、    基团移位主要用于运送------、--------、--------、--------、--------和-------。

7、    任何培养基都应具备微生物所需的---------，且其间的-------是合适的，一旦配成，必须-------。

8、    EMB培养基除有鉴别不同菌落的作用外，同时还有抑制--------细菌和选择-------细菌的作用。

9、    最常用的鉴别培养基为----------。

10、最常用的固体培养基凝固剂是----------。

11、微生物的营养类型分为-------、-------、--------、--------、----------。

12、微生物的的六大营养要素有-------------------------------------------。

13、按培养基用途可分为-------、-------、--------、--------、-------。

14、生长因子是___________________________________________，

包括_____，_____，  ________，_____等，以生长因子划分，

微生物的营养类型可分为_______和______两种。

15、    低培养基氧化还原电势Eh，可通过_______，_______，     ___，    等手段。

16、培养时，培养皿倒置是为了_______和________。

17、大肠杆菌的定义是______。在食品中检测大肠菌群的意义是_______。常用________培养基，根据其用途，该培养基属于________培养基。

三、     简答题

1、    选择和设计培养基的方法是什么？

2、    选用培养基的原则是什么？

3、    简述一下如何利用鉴别培养基对大肠杆菌进行检测？

4、    简述营养物质进入细胞方式的异同。

名称    扩散    促进扩散    主动运输

载体

能量

逆浓度运输

有无选择性            有高度的专一性

5、    天然培养基的优、缺点是什么？组合培养基的优、缺点是什么？

6、    根据固体的性质，可把固体培养基分为几种类型？

7、    简述固体培养基在科学研究和生产实践上有哪些用途？

8、    怎样利用选择性培养基，将混合样品中的数量很少的某种微生物鉴别出？

9、    生长因子包括哪几类化合物？是否任何微生物都需要生长因子，如何才能满足微生物对生长因子的需要？

10、活度对微生物的生命活动有何影响？

11、天然、合成、半合成培养基各有哪些应用？

12、试对细菌、放线菌、酵母菌各举一种合成或半合成、天然培养基。

13、列表比较微生物的四大营养类型。

14、绘图并简要说明营养物跨膜运输的四种类型。

15、析下述培养基各组分的作用，依据其功能推测其所属培养基的类 型：

A．麦康开培养液：蛋白胨20g,乳糖10g,牛胆酸盐5g,NaCl 5g,水1000ml,PH7.4  加1%中性红5ml   分装与有发酵管的试管0.7kg/km2灭菌15min，用于肠道杆菌培养。

B.柠檬酸盐培养基：NH4H2PO4  1g，K2HPO4   1g，NaCl  5g，MgSO4  0.2g,柠檬酸钠2g,琼脂  18g，水1000ml，PH6.8   加1%溴麝香草酚兰10ml，1.1Kg/cm2灭菌20分钟，制成斜面，用于细菌利用柠檬酸盐试验。

A                    功能    B                      功能

蛋白胨        NH4H2PO4

乳糖        K2HPO4

NaCl        NaCl、MgSO4、K2HPO4

牛胆酸盐        柠檬酸钠

PH7.4        琼脂

1%中性红        1%溴麝香草酚兰

发酵管        PH6.8

16、叙述微生物的营养物跨膜输送方式。

17、试列表比较单纯扩散、促进扩散、主动运输、基团移位四种不同营养物质运送方式。

比较项目    特意性载体蛋白    运送速度    溶质运送方式    平衡时内外浓度    运送分子    能耗    运送前后溶质分子

单纯扩散

促进扩散

主动运输

基团移位

四、    论述题、

1、    选择性培养基在微生物学工作中有何重要性？试举一例，并分析其中的选择性原理。

2、    鉴别性培养基有何重要性？试以EMB为例分析鉴别性培养基的作用原理。

3、    培养基中各种营养要素的含量一般遵循何种顺序？试言其理。

4、    在设计一种新培养基前为什么要遵循“目的明确”的原则，你能举些实例来说明吗？

5、    试述琼脂平板培养技术的优点及其在解决一系列微生物学问题中起过的重大历史作用。

6、微生物由于个体微小一般都是以其群体形式进行研究或利用，这必然就要涉及到对微生物的培养。能否找到一种培养基，使 所有的微生物都能良好地生长？为什么？

7、试结合微生物学实验课的内容，谈谈在选择、配制和使用培养基时应注意哪些方面的内容。你们在实验中是如何做的？有何体会？

8、试比较营养物质进入微生物细胞的几种方式的基本特点。

9、如何理解“菌落特征与菌体细胞结构、生长行为及环境条件有关”？

10、写出微生物以淀粉为碳源其代谢的一般过程，鉴定其代谢产物有何意义？为什么？

11、为什么霉菌菌落的中央边缘、正面与反面在外形、颜色、构造等方面常有明显差别？放线菌、细菌和酵母菌呢？

12、营养要素与配置培养基的某一营养物是否同一概念？举例说明。

第四章部分的练习题

一、    概念

1、新陈代谢  2、生物氧化  3、呼吸链  4、无氧呼吸  5、发酵  6、操纵子

7、同型乳酸发酵  8、异型乳酸发酵  9、葡萄糖效应  10、诱导酶

11、同功酶  12、变构酶  13、操纵基因  14、结构基因  15、调节基因

16、阻遏  17、回补顺序  18、氧化磷酸化

二、    填空

1、    生物氧化的形式有---------、--------和--------，其过程又可分为------、--------、和--------，功能有-------、-------、和--------。

2、    在真核微生物中，TCA循环的反应在-------内进行，其中的大多数酶定位在------中；在原核微生物（例如，细菌）中，大多数酶都存在在------内。

3、    根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同，可把生物分为氧化区分成-------、--------和-------类型。

4、    在氢或电子传递过程中，通过与------反应发生偶联，就可产生ATP形式的能量。

5、    在硫呼吸过程中，------作为无氧呼吸链的最终氢受体，结果硫还原成-------。

6、    碳酸盐呼吸是一类以-------作为无氧呼吸链的末端氢受体的无氧呼吸。

7、    凡能利用-------为唯一的碳源或能源的微生物，都能证明存在着-------循环，这种循环主要是通过-------酶和---------酶实现的。

8、    反馈抑制的类型有---------和--------。

9、    酶活性调节的类型有---------和-------。

10、    操纵子分为------和------两类。

11、    在谷氨酸发酵生产中，--------的浓度对谷氨酸的积累有着明显的作用。

12、酵母菌生物氧化在____内进行，而细菌生物氧化部位在____。

13、根据微生物生长与氧的关系，可分为_____、______和_____三大类。枯草芽孢杆菌属于_____微生物，肉毒芽孢杆菌属于______微生物，大肠杆菌属于_____微生物。

14、至今发现的进行固氮的微生物均为_____________微生物。固氮的六个必要条件为________，__________，______，_______，_____，________。

15、在发酵工业上，可通过___________________，_________________，__________等方法获得大量有用代谢产物。

16、酵母菌进行乙醇发酵时，将葡萄糖经______途径产生丙酮酸，由丙酮酸生成的乙醛被______成乙醇。

17、微生物胞内酶作用的最适PH多接近________，而细胞质膜上的酶及胞外膜作用的最适PH则接近________。

三、    简答题

1、    HMP途径在微生物生命活动中有何重要意义？

2、    简述ED途径的特点？

3、    经ED途径发酵与传统酵母酒精发酵相比，有哪些优点？

4、    硝酸盐在微生物生命活动中，具有哪些功能？

5、    葡糖异生作用的生物意义是什么？

6、    简述代谢调控在发酵工业中的应用。

7、    试述EMP途径在微生物生命活动中的重要性。

8、    简述TCA循环在微生物产能和发酵生产中的重要性。

9、    组成呼吸链的组分主要有哪几个，它们各有什么作用。

10、    列表比较呼吸、无氧呼吸和发酵的异同点。

11、    列表比较同型和异性发酵的异同点。

12、    固氮过程需要满足哪些条件?

13、    酶活性调节与酶合成调节有何不同？它们间有何联系？

14、    酶的诱导有何特点？意义如何？

15、    列表比较生物氧化与非生物氧化的主要异同点。

16、    绘图并简要说明有氧呼吸典型的呼吸链。

四、    论述题

1、    试图示解释色氨酸的操纵子的末端产物阻遏机制。

2、    试述代谢调控在赖氨酸发酵中的应用。

3、    如何选育抗反馈调节突变株？举例说明它在发酵生产中的应用。

4、    细胞膜缺陷突变株在发酵生产中有何应用，试举例说明之。

5、    通过大肠杆菌乳糖操作子示意图模型及理论，说明葡萄糖效应和二次生长现象。

6、    如何判断发酵罐被噬菌体侵染？如何预防？如何处理？

7、不同营养类型的微生物在不同条件下 产生ATP和还原力的方式与特点。

8、何为初级代谢、次级代谢？试论二者间的关系。

9、当环境中葡萄糖、山梨醇同时存在时，E.coli生长现象并分析其原因。

10、试述生物素对谷氨酸发酵生产的影响，并简述其作用机制。

11、如何使微生物合成比自生所需更多的产物？

12、试图示由EMP途径的中间代谢物——丙酮酸出发的六种发酵类型及其各自的发酵产物。

13、在工业上“发酵”的含义是什么？试以一个具体的工业发酵实例为例，从微生物代谢角度说明其原理。

14、如何运用代谢调控理论使微生物合成比自身需求量更多的有用代谢产物？举例说明。

15、当培养基中葡萄糖和乳糖同时存在时，E.coil的生长现象并分析其原因；

16、试设计选育高纤维素酶高产菌的实验方案，如已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？

第五章部分的练习题

一、    概念题：

1、    同步生长 2、生长速率常数 3、对数期 4、生长限制因子 5、生长产量常数 6、最适温度 7、防腐 8、灭菌 9、繁殖 10、生长曲线 11、代时 12、倍增时间 13、连续培养 14、连续发酵 15、恒浊器 16、恒化器 17、抗生素 18、耐药性 19、选择毒力 20、生长 21、同步培养

二、    填空题：

1、    平板菌落计数法的原理是在-------或-------中吸有合适的培养基，其中还加有--------。

2、    研究单个细菌个体的变化目前常使用的方法是：一是-------，二是---------。

3、    同步培养技术是指设法使群体中的所有细胞尽可能的都处在-------中，然后分析此群体的各种--------特征，从而了解单个细胞所发生的变化。

4、    获得细菌同步生长的方法主要有两类：其一是通过--------；其二是通过----------，它一般可用-------或--------来达到。

5、    营养物的浓度可影响微生物的---------和--------。在---------情况下，营养物的浓度才会影响生长速率，随着营养物浓度的逐渐增高，生长速率--------，而只影响---------。

6、    指数期的微生物因其整个群体的--------较一致，-------的平衡发展和-------的恒定，故可作为代谢、生理等研究的---------。是增殖噬菌体的最适----------。

7、    在稳定期时，细胞开始贮存--------、----------和--------等贮藏物；多数芽孢杆菌在这时开始形成-------；有的微生物在稳定期时还开始合成---------。

8、    稳定期是以生产-------或---------的代谢产物。

9、    在衰亡期，整个群体呈现出-----生长，在这一时期有的微生物因蛋白水解酶活力的增强，就发生----------。

10、    恒化器是一种通过控制某一营养物的-------，使其始终成为-------的条件下达到的连续培养装置。

11、    兼性厌氧型在有氧时靠-------产能；在无氧时借---------或-------产能。

12、    微生物作为一个总体来说，其生长的PH值范围极广，多数真菌是-------，而多数放线菌是--------。

13、    根据生长和O2的关系，大多数酵母属于_，大多数霉菌属于_。

14、    平板菌落计数法结果表达中常用的“clu”的意思是_。

15、    根据微生物生长和氧气的关系，可分为___三大类型。黑曲酶属于_，肉毒梭状芽孢杆菌属于_，酿酒酵母属于_，米曲酶属于_，解脂假丝酵母属于_，酪酸梭状芽孢酵母属于_。

16、    实验室常用的灭菌方法有___等。

17、    与氧有关的微生物类型有--------、----------、---------、----------、---------。

18、    干热灭菌的温度是----------，处理时间为---------。

19、    巴氏灭菌的温度为----------，处理时间为----------。

20、    生长曲线是以-------为横坐标，以-------为纵坐标。

21、    根据----------------的不同，把生长曲线分为----------、----------、----------、----------四个阶段。

三、    简答题：

1、    影响延滞期长短的因素有哪些？

2、    延滞期出现的原因是什么？

3、    简述对数期的特点。

4、    影响指数期微生物增大时间的因素有哪些？

5、    简述稳定期的特点。

6、    稳定期到来的主要原因有哪些？

7、    列表比较恒浊器与恒化器的区别。

8、    连续发酵有哪些优缺点？

9、    影响微生物生长的主要因素有哪些？

10、    防腐主要有哪些措施？

11、    影响加压蒸汽灭菌效果的因素有哪些？

12、    计算微生物的繁殖数时，常用哪些方法？比较它们的优缺点？

13、    如何使微生物达到同步生长？

14、    延滞期的特点是什么？如何缩短延滞期？

15、    影响湿热灭菌效果的主要因素有哪些？

16、    为什么有些物品在灭菌过程中要实施间歇灭菌？

17、    测定微生物的生长量有那些方法？比较优缺点？

18、    从微生物学角度分析低酸性的食品和酸性食品如要长期保存，应分别采取什么温度杀菌？为什么？

19、    试证明：Z=

四、    论述题：

1、    在微生物培养过程中引起PH值改变的原因有哪些？在实践中如何保证微生物能处于较稳定和合适的PH环境中？

2、    在实验室中培养厌氧微生物的主要方法有哪些？其原理如何？哪两类属于培养严格厌氧菌的技术？

3、    试述生产实践中微生物培养装置发展的几个特点？

4、    试比较杀菌（灭菌）、消毒和防腐的异同。

5、    利用加热蒸汽对培养基进行灭菌时常会带来哪些不利的影响？采用哪些对策方可避免？

6、    试比较细菌的生长繁殖与高等动植物的有哪些异同？

7、    结合本章的知识，总结在日常生活中有哪些措施是被用来抑制或杀灭微生物的。

8、    具体说明怎样利用微生物的生长曲线使发酵工业的效率有所提高。

第六章部分的练习题（*）、

一、    概念

1、    遗传型  2、表型  3、变异  4、饰变  5、核基因组  6、质粒

7、单倍体  8、双倍体  9、基因  10、营养缺陷型  11、突变率

12、产量突变率  13、转座因子  14、倒位  15、易位  16、光复合作用

17、暗修复作用  18、定向培育  19、诱变育种  20、基本培养基

21、完全培养基  22、补充培养基  23、原养型  24、转化  25、感受态

26、基因重组  27、转导  28、普遍转导  29、局限转导  30、接合

31、有性杂交  32、准性生殖  33、基因工程  34、染色体畸变  35、转换

36、移码突变  37、点突变  38、颠换  39、诱变剂  40、野生型

41、转染  42、溶原转变  43、流产转导  44、原生质体融合  45、接合子

46、转化子  47、回复突变  48、艾姆斯试验（Ames test）  49、PCR

二、    填空

1、-------和-------是生物体最本质的属性之一。

2、在核酸的结构上，绝大多数微生物的DNA是-------链的，只有少数病毒

的核酸为------链结构的。

3、基因的物质基础的一个具有特定--------的核酸片段。

4、微生物的基因调控系统是由操纵子和---------组成，操作子又包括三种基

因，即----------、-----------和--------------。

5、质粒的分离大致可包括细菌的---------、蛋白质和DAN的----------和设法使染色体DNA与质粒DNA相-------等几种步骤，其中以----------步骤为最重要。

6、经分离后的质粒可用-------、--------或----------来鉴定。

7、同一种质粒由于其构象的不同，其---------也不同，因而可进行分离。

8、能够引起间接置换的诱变剂都是一些---------的类似物。

9、染色体结构上的变化可分为-----和-------两类。

10、转座因子主要有三类，即--------、----------、和-------------。

11、自发突变是指在---------下生物体自然发生的突变。

12、---------对紫外线的敏感性要比嘧啶强得多它的光化产物主要是----------，其中了解较清楚的是-----------的形成和消除。

13、紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成-------结合的---------。

14、在暗修复过程中有四种酶参与，即----------、----------、---------、和---------。

15、一般可通过--------与-----------两种对突变株进行生产性能的测定。

16、感受态因子是一种---------蛋白，这种蛋白质可能是------上的一种组成，它可以催化--------的吸收或降解---------成分，以让细胞表面的DNA受体显露出来；它也可能是一种-------酶。

17、呈--------形式的转化因子其转化频率最高。

18、在--------菌和--------菌中都存在着接合的现象。

19、在F+菌株的细胞中存在着--------态的F因子，在细胞表面还有与F因子数目相当的----------。

20、在F-菌株中不含----------，细胞表面也没有----------。

21、原核微生物的基因重组的方式有--------、---------、--------、--------。

22、-------和-------是除染色体以外的另外两类遗传物质。

23、凡能产生----------的酵母菌和霉菌都能进行有性生殖。

24、真核微生物的基因重组方式有--------和----------。

25、基因工程比其他育种方法更有--------、---------、---------的优点。

26、决定性别的质粒是--------，又称-----------。

27、转导可分为--------和--------。

28、普通性转导可分为-----------和-----------。

29、光复活作用是指____四种情况。

30、染色体畸变是指____四种情况 。

31、影响微生物的抗热性的因素是_____ 。

33、细胞的异常形态有畸形和衰颓形，前者是指由于_而引起的，而后者是指由于_而引起的。

34、在营养缺陷型菌株筛选过程中，常用抗生素法淘汰野生型菌株。其中淘汰野生型菌株细菌加入的抗生素为_，而淘汰酵母菌和霉菌加入的抗生素则为________。

三、    简答题

1、    微生物有哪些独特的生物学特性？

2、    突变有哪几种类型？

3、    简述突变的特点？

4、    平板影印培养法的基本过程是什么？

5、    自发突变可能的机制有哪些？

6、    如何挑选优良的出发菌株？

7、    转化的过程可分为几个阶段？

8、    局限转导有哪些特点？

9、    溶原转变与转导有什么不同？

10、    简述原生质体融合的主要步骤？

11、    准性生殖的主要过程分为几步？

12、    基因工程的基本操作分为几步？

13、    如何获得目的基因？

14、    选择载体时必须满足哪些条件？

15、    诱变育种的基本环节有哪些？整个工作环节的关键是什么？

16、    简述影印培养法在育种工作中的应用？

17、    原生质体融合在育种工作中有何重要性/

18、    什么叫菌种衰退？如何区别衰退、饰变与杂菌污染？

19、    现有的微生物保藏法可分为几类？试列表解之。

20、    列表比较准性生殖与有性生殖的区别。

21、    为什么微生物经紫外线照射后要在暗中培养？

22、    简述一下诱变育种的原则。

23、    目的基因是如何导入受体细胞的？

24、    处于感受态的细菌细胞有何优点？

25、    如要长期保藏低酸性食品和酸性食品，通常分别采用什么t杀菌？           为什么？

26、    什么是影印培养？如何用其来说明基因突变自发性，随机性？

四、    论述题

1、    历史上证明核酸是遗传物质基础的著名实验有哪几个？实验者是谁？工作发表于何时？你能举出其中之一来加以说明吗？

2、    为什么证明核酸是遗传物质基础的三个经典试验都不约而同地选用了微生物作研究对象？

3、    举例说明在微生物的诱变育种工作中，采用高效的筛选方案和方法的重要性。

4、    试用表解法概括一下筛选营养缺陷型菌株的主要步骤和方法。

5、    试述琼脂块培养法的原理、方法及其在育种中的应用。

6、    从野生型和营养缺陷型混合菌液中如何检出营养缺陷型菌株？试介绍四种方法，并说明其共同原理。

7、    基因工程在哪些领域得到应用及其发展前景如何？

8、    试从供体、载体、受体、工具酶和“工程菌”在生产实践上发挥经济效易等方面来讨论微生物在发酵遗传工程中的重要作用。

9、    就方法的简便与否，保藏效果的好坏，保藏对象的范围，保藏的基本原理以及保藏期的长短等方面列表比较几种最常用的菌种保藏法。

10、    使用什么方法可以使个别菌种发生突变？如何选择？自己设计步骤。

11、    设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主  要步骤的基本原理。

12、    试设计一种从自然界中筛选果胶酶产生菌的试验方案，并解释原理；如果果胶酶作为一种食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？

13、    试述微生物菌种保藏的原理和常用方法，你认为对于Escherichia   coli 和Aspergillus niger分别采用什么保藏方法为好？请说明理由；

14、    影响微生物抗热力的因素有哪些？解释D值、Z值以及D值和Z值得关系。

15、    试设计一个试验证明基因突变的自发性和不对应性。

16、    试设计选育高纤维素酶高产菌的实验方案，如已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？

17、    试述微生物菌种保藏的原理。Lactobacillus bulgaricus 和Aspergillus niger若要长期有效的保藏，可分别采用哪些方法？为什么？

18、试用平板影印培养法证明基因突变的自发性和不对应性。

19、设计一种从自然界中筛选酸性蛋白酶产生菌的试验方案，说明其原理；若该酶作为食品工业用酶，如何保证其安全性？

20、    述艾姆氏（Ames）法检测致癌剂的理论依据，一般方法和优点。

21、    为什么在进行诱变处理时，要把成团的微生物细胞或孢子制成充分分散的单细胞或孢子悬液？

22、    设计筛选高温淀粉酶产生菌的方案，指出关键步骤。

23、    菌种保藏的基本原理和冷冻干燥保藏法的过程、原理。在检出缺陷型过程中采用夹层培养法，为什么基本培养基倒成“三明治”？

第七章部分的练习题

一、    概念

1、极端微生物  2、生态  3、区系  4、活性污泥  5、无菌动物  6、纯培养

7、悉生动物  8、硝化作用  9、反硝化作用  10、氨化作用  11、互生

12、共生  13、寄生  14、拮抗  15、捕食  16、生物膜  17、单级生态系统

18、双级生态系统  19、三级生态系统 20、正常菌群

二、    填空题

1、    大肠杆菌的定义是_。在食品中检测大肠菌群的意义是_。常用_培养基，根据其用途，该培养基属于_培养基。

2、活性污泥是指_，用活性污泥处理污水的方法又称_法。

三、    简答题

1、    在生命科学研究对象中，一般可以分成哪十个水平？

2、    从含菌样中筛选菌种一般要通过哪几个环节和方法？

3、    微生物的纯种分离法有何重要性？

4、    微生物生态学的任务是什么？

5、    简述微生物学与人类的关系。

6、    悉生学研究的是什么？

7、    自然界中碳元素是怎样循环的？

8、    自然界中的硫、碳元素是怎样循环的，有哪些主要微生物参与？

9、    用微生物学方法处理污水的基本原理是什么？

10、    活性污泥与生物膜在污水处理中各起着什么作用？

11、    微生物引起的劣化有哪几种？

12、    极端环境下的微生物包括哪几种？

13、    下列食品如变质，主要是有什么  类型的微生物所引起？Why？1〉市售面包2〉充CO2的果汁；

14、    下列食品如果变质，主要是由什么类型的微生物所引起？Why？1〉市售的米粉2〉肉类罐头

15、什么是大肠菌群，测检食品中大肠菌群的意义是什么？常用什么培养基？该培养基中各种成分的主要作用是什么？这是一类什么性质的培养基？

16、引起以下食品变质的微生物类群是什么？为什么？

17、试分析下列现象产生的主要原因是什么？如何防止？

A）    添加有山梨酸钾防腐剂的面包出现中心发粘变质的情况。

B）    经高温高压杀菌的低酸性罐头出现变质，检测发现其中有大量的革兰氏阴性杆菌。

C）    把酿酒酵母接入煮过的糯米中室温发酵，无法制得酒酿。

四、    论述题

1、    为什么说土壤是微生物的“大本营”或是人类最丰富的“菌种资源库”？

2、    试讨论空气、尘埃、微生物与微生物间的关系。

3、    检验引用水的质量时，微生物要把大肠杆菌数作为重要测定指标？我国卫生部门对自来水的总菌量和大肠杆菌量有何规定？

4、    工农业产品为何会发生霉腐、变质？如何预防？能举些实例吗？

5、    为什么说微生物在自然界的氮素循环中起着关键的作用？

6、    试述微生物生态知识与工农业生产的关系。

7、沼气发酵的微生物学原理是什么？试分析沼气发酵在国民经济和环境保护中的重大战略意义。

8、    奶产品经过封口杀菌后，出现部分产品发生变质，是分析是什么原因，如何防止？

9、    什么是微生物的正常菌群？试分析肠道正常菌群和人体的关系。

10、    下述微生物的生态环境如何？设想如何分离。

第八章部分的练习(*)

一、    概念题：

1、    黄原胶 2、一步发酵法 3、两步发酵法 4、葡萄糖氧化酶 5、明胶 6、蛋白酶

二、    填空题：

1、    面包酵母是一种-------细胞的生物，属于--------菌类，学名为-----------。

2、    柠檬酸的发酵微生物是----------，苹果酸的发酵微生物为----------。

3、    谷氨酸的生产菌为--------，其发酵原料为---------质的发酵原料。

4、    黄原胶是由----------菌提取而成的。

三、    简答题：

1、    列表说明微生物在食品制造方面的作用。

2、    微生物在食品制造方面中菌种扩大培养有哪些共同特点？

3、    在双歧杆菌酸奶生产中，常用什么特定的工艺路线？

4、    在酿油生产中对生产原料有什么要求？

5、    简述黄原胶的性质及在食品中的应用情况。

6、    简述啤酒生产的整个工艺过程。

7、    下列食品如变质，主要是有什么类型的微生物所引起？Why？1〉市售面包2〉充CO2的果汁。

8、    简述酿造食醋的三套微生物及其主要菌种。

9、    简述生产酶制剂过程中所需要的条件？

10、    引起以下食品变质的微生物类群是什么？为什么？1）消毒牛奶 2）真空包装的蜜饯产品 3）面粉 4）充CO 不足的碳酸饮料 5）杀菌不足的肉类罐头

11、    设计筛选高温淀粉酶产生菌的方案，指出关键步骤。

四、    论述题：

1、    为什么说食醋生产是多种微生物参与的结果？

2、    近年来生产发酵乳制品时在菌种开发方面有哪些进展？

3、    酵母菌在面包制造过程中，起哪些重要作用？

4、    在发酵生产葡萄酒过程中应注意的问题有哪些？

5、    柠檬酸在食品中的作用有哪些？

6、    说明微生物酶制剂在食品加工制造中的应用情况。

7、    设计一种从自然界中筛选高温淀粉酶产生菌的试验方案，并解释主要步骤的基本原理。

8、    试设计一种从自然界中筛选果胶酶产生菌的试验方案，并解释原理；如果果胶酶作为一种食品工业用酶，则必须考虑其安全性，从那几个方面着手来保证该酶的安全性？

9、    果奶产品经过封口杀菌后，出现部分产品发生变质，是分析是什么原因，如何防止？

10、    试设计选育高纤维素酶高产菌的实验方案，如已知纤维素酶的合成是操纵子的阻遏机制，如何利用这一机理设计有效的筛选方法？

11、    在以消毒奶为原料生产酸奶的过程中，为什么要在尽可能短的时间内达到酸凝？可采取哪些措施？

12、    设计一种从自然界中筛选酸性蛋白酶产生菌的试验方案，说明其原理；若该酶作为食品工业用酶，如何保证其安全性？

13、    试比较啤酒发酵过程与葡萄酒发酵过程的异同。

14、    据你了解，哪些微生物在食品工业中广泛应用？试举一例具体说明。

15、    从微生物角度分析酸奶生产的关键及原因。

16、    试分析下列现象产生的主要原因是什么？如何防止？

1）    添加有山梨酸钾防腐剂的面包出现中心发粘变质的情况。

篇6

关键词：高职高专；生物学；给水排水工程；水处理；教学探讨

微生物个体极小，种类繁多，肉眼无法直接观察，必须借助显微镜才能看清其形态和结构，这就使学生缺乏感性认识，感觉微生物知识杂乱，学习难度比较大，学习效果也不好。水处理生物学课程是高等学校给水排水工程专业指导委员会提出的给排水科学与工程学科新课程体系中10门主干课之一，是给水排水工程专业的必修课，是一门原理性，概念性，实践性强，操作难度大的课程。该课程的理论课程主要包括两大部分，第一部分为微生物学的基础知识，第二部分为微生物在给水排水工程中的应用，是水的生物处理工艺的基础，给水排水专业的学生只有在学好该门课程后才能更好地应用生物法来设计污水和自来水水处理工艺。因此，如何提高水处理生物学的教学质量，取得比较好的教学效果，是从事这门课程教学的教师努力追求的目标，笔者在教学实践过程中有如下探索。

1.合理组织教学内容

该门课程是给排水专业的主干课程《水质工程学》（包括给水和排水）的前导课程，和其他专业生物教学不同的是要紧密围绕“水处理和水质控制”为核心实施教学。所以重点介绍水中存在的病毒、细菌、放线菌、真菌等以及在水质净化中有重要作用的古细菌、原生动物和微型后生动物和水生植物的基本形态和生理特性。在介绍生物对碳元素、氮元素、磷元素等的转化原理时结合具体的污水处理工艺中的脱氮除磷工艺设计要求讲解，使教学内容更具有实际意义，为后续课程教学打下坚实的基础。在介绍微生物生理和营养时，要密切结合在水处理工艺的好氧处理和厌氧处理，介绍呼吸类型和代谢途径。

2.应用实例教学，提高学生学习兴趣

水处理生物学是一门与生活实践、工业应用有密切联系的应用课程，在学习过程中，尤其在讲授应用微生物进行污水处理原理部分内容时，应该带领学生参观污水生物处理工艺，观察活性污泥或生物膜的性状，在参观中给学生讲授污水处理工艺及微生物在其中所起的作用。在讲授大型水生植物治理水环境时，引入一些工程实例，以多媒体的形式展示给学生，这样能使学生带着兴趣深入地理解微生物在处理中的作用。除了教授教材中的基本理论，更要引进工程实践中一些有影响的或与学生生活比较贴近的实例。

3.引导学生研究型学习

《水处理生物学》教学注重学生不仅要对对水中存在的各种微生物形态与结构的观察，更重要的是要求学生掌握独特的研究学习的技能。学生应该在教师指导下的自主性、探索性学习活动。在教学过程中讲解藻类这一章节时，正好是春末夏初，学校里的河流断面中流速缓慢的区域有大量红色的物质出现，学生很好奇这是什么现象形成的，这时候就引导学生取样观察，了解藻类生长的环境条件，藻类的种类和形态特征，加深了学生对水体中藻类的知识的掌握。本学科也是发展中的学科，在生物学领域不断有新技术、新手段产生，比如说新型的微生物菌种在水处理领域的应用，微生物检测的新方法PCR-DGGE，在讲解到相关章节时就可以引导学生通过图书馆、网络等途径了解新技术，新方法。

4.充分利用多媒体教学

进行“水处理生物学”教学时，恰当地运用多媒体技术、合理地设计课件内容，才能制作出高质量的课件；运用多媒体教学，精心组织安排教学过程，才能取得良好的教学效果。微生物形体极微小，看不见，摸不着，为了使学生对微生物有更加感性的认识，提高他们的学习兴趣和学习效果，最好采用多媒体教学。例如，讲微生物大小时，病毒、细菌、酵母、霉菌等通过色彩鲜明的图片展现给他们，收到了很好的效果。在讲述微生物在水处理工程中的应用时，配以城市污水生物处理工艺中活性污泥和生物膜等的图片，使学生对微生物的巨大威力和处理效率大为佩服，学生对所学的知识有比较强的感性认识，同时也使得他们认识到掌握微生物知识在给排水专业学习中的重要性。

5.强化实验教学，强化技能训练

改革实验教学，提高教学质量，是高等教育应长期持的一个重要环节，要通过实验让学生掌握全面的理论识，还要经过足够的能力训练，使其具备适应特定岗位要的综合工作能力。根据教学大纲要求，学生需要通过4个课时的实验课掌握光学显微镜的结构、光学原理及操作与使用方法，掌握水体中主要微生物的检验技能，掌握控制水体微生物生长的方法，以确定水和废水的生物学性质，了解主要的水处理微生物的个体形态和结构特征，掌握从水体中分离和培养微生物的方法和技能。按照这个要求，经过几年的实践和探索，我校制定了完整的实验计划，利用光学显微镜观察酵母菌、霉菌、放线菌、活性污泥中的原生动物、后生动物、菌胶团等的形态，在这个过程中不仅能掌握光学显微镜的操作，还能完成对各种微生物形态的观察。在完成观察任务后，继续对活性污泥中微生物进行纯种分离，接种，培养（任选稀释平板法或平板划线法），培养学生操作技能。在培养36小时后观察培养出来的菌体、菌落，进一步熟悉光学显微镜的操作方法。课时少，但是实验内容比较多，所以实验前就要做好准备工作，做好酵母菌，霉菌样本的纯培养工作，取曝气池新鲜活性污泥样本工作。在实验指导过程中也要依据教学经验，对历届学生实验操作时不太注意或易出错的环节，讲解时着重提出来，并且在他们实验操作过程中时监督检查，如“显微镜的操作和使用”的实中的操作步骤、“无菌操作”实验是否严格无菌操作，提高他们的效率。

以上几点便是笔者在教学过程中的实践与思考，当然关于水处理生物学的教学方法还有很多地方需要深入探讨，也很多需要进一步改革。总的来说，希望经过不断的教改反思，能不断地提高教学质量，培养出适应现代社会发展的合格给水排水工程专业人才。

参考文献

[1]杨文博.优化微生物学教学[J].微生物学通报.1996，（3）.

篇7

【摘要】

目的 利用一株根霉菌对虎杖苷粗提物进行液态发酵，使虎杖苷转化成白藜芦醇。方法采用单因素实验确定氮源种类及添加量，通过正交实验法优化发酵条件。结果在10%虎杖苷粗提物中添加1.5%的尿素作为氮源，采用薄层色谱法（TLC）确定在优化发酵条件下转化时间为26.8 h，通过高效液相色谱法HPLC证明虎杖苷转化为白藜芦醇，转化率95.8%。结论虎杖苷粗提物可以通过微生物发酵得到白藜芦醇。

【关键词】 虎杖苷；白藜芦醇；根霉菌；微生物转化

Abstract:ObjectivePolydatin in Polydatin extraction was transformed to resveratrol in liquid state fermentation by R. nigricans. MethodsThe kind and the append mate of nitrogen source were confirmed by the single factor experiment. The conditions of fermentation were optimized by orthogonal experiment. ResultsCarbamide was the optimum nitrogen source and the append mate was 1.5%. Under the optimized condition the transformation time was 26.8h. It was prooved that Polydatin could be transformed to Resvertrol by high performance liquid chromatography and the transformation rate could reach 95.8%. ConclusionPolydatin in Polydatin extraction can be transformed to resveratrol by microbial transformation.

Key words:Polydatin；Resveratrol；R. nigricans; Microbial trasformation

虎杖为蓼科植物Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根茎，别名苦杖根、活血龙、大虫杖等［1］。其中重要的活性成分为二苯乙烯类的白藜芦醇（Resveratrol）和白藜芦醇苷(Polydatin)，也叫虎杖苷。白藜芦醇是一种活性多酚类物质［2］，具有明显的降低血脂，预防心脑血管疾病以及抗癌等重要作用，是目前世界上一种最新的药用保健活性物质，有望发展成为抗癌新药［3］。目前，该产品国际市场需求量大，具有良好的市场前景。天然白藜芦醇主要以葡萄糖苷（虎杖苷）的形式存在于虎杖中，虎杖中的白藜芦醇含量在0.1%～0.2%左右，虎杖苷的含量在2%左右，虎杖苷的含量明显高于白藜芦醇。理论上，采取化学法能将虎杖苷转化为白藜芦醇，但其工序繁杂并生成大量的异构体，造成分离纯化困难，生产成本非常高，不被认可。目前，生物法是直接利用虎杖进行带渣发酵，通过根霉菌分泌的酶切断白藜芦醇苷的糖苷键，转化得到白藜芦醇（图1）， 该法存在发酵体积庞大、成本高、发酵浓度无法提高等问题［4］。因此本课题利用虎杖苷粗提物进行发酵，可以提高发酵体系中虎杖苷的含量、缩小发酵体积、提高发酵效率，更易于白藜芦醇这种医药中间体的工业化，为生产白藜芦醇提供了一种便捷、有效的方法。

1 器材与方法

1.1 仪器与药品DOINEX高效液相色谱仪；AN0298分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；虎杖（湖北省药材公司）；虎杖苷标准品、白藜芦醇标准品（成都思科华有限责任公司）；其它试剂均为分析纯；无机盐浓缩液：KH2PO4 0.1%， MgSO4 0.05%，(NH4)2SO4 0.1%；虎杖苷粗提物（粉末状，虎杖苷含量14.78%）。

1.2 菌种编号T-34，由四川大学生物资源与生态环境教育部重点实验室提供，从自然界分离筛选得到，经鉴定为一株根霉菌。

1.3 方法

1.3.1 虎杖苷和白藜芦醇的TLC检测方法 虎杖苷和白藜芦醇的TLC法薄层色谱［5］条件，展开剂：醋酸乙酯-丙酮 -醋酸体积比为6∶2∶0.5；显色剂：3 %磷钼酸无水乙醇溶液， 110 ℃显色3 min［5］。

1.3.2 虎杖苷和白藜芦醇的高效液相色谱法HPLC检测方法色谱柱C18柱（4.6 mm×150 mm）， 柱温25 ℃， 流动相甲醇-水为40∶60；流速1 ml/min， 进样量20 μl，检测波长305 nm。根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线，白藜芦醇的回归方程为Y = 1.40×108X +1.21×104，相关系数r=0.999 913，在20～100 μg/ml范围内和峰面积成线性关系；虎杖苷的回归方程为Y=9.61×107X-1.84×105，相关系数为r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范围内和峰面积成线性关系。

1.3.3 氮源的选择

以10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液作为发酵培养基，分别在培养基中添加1%的硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素等氮源，180 r/min，30℃培养，通过检测虎杖苷的完全转化时间确定添加的氮源种类。

1.3.4 氮源加入量的确定

10%虎杖苷粗提物添加1%无机盐浓缩液的发酵培养基中，分别添加0%，1%，1.5%，2%，2.5%的尿素，180 r/min，30℃培养，通过检测虎杖苷的完全转化时间确定尿素的添加量。

1.3.5 发酵条件的优化

以虎杖苷乙醇粗提物回收乙醇后，烘干，制成虎杖苷粗提物粉末，虎杖苷含量14.78%。按10%的加入量加入发酵培养基中，pH自然，121℃灭菌25 min。将菌种T-34以菌丝体形式接入发酵培养基中，添加1%无机盐浓度浓缩液，采用正交实验法优化发酵温度、装液量、接种量、转速等发酵条件。

2 结果与讨论

2.1 发酵条件优化实验

2.1.1 氮源的选择氮为真菌干重的8%～14%，大量的无机和有机含氮化合物都可用来满足微生物对这种元素的需求。不同种类的微生物其氮的代谢途径不尽相同，因此有必要对培养基中添加的氮源进行选择，结果见表1。表1 不同氮源对苷转化时间的影响（略）

从实验结果可知，在选择硝酸铵、氯化铵、大豆粉、酵母膏、硫酸铵、尿素这6种氮源，利用尿素做氮源时，转化时间最短，其它5种均大于38个小时，因此从转化时间上考虑使用尿素作为培养基的氮源物质。

2.1. 2 氮源添加量的确定

微生物的生长及转化都有一个合适的碳氮比，因此在培养基基质中需要提供与此相当的含氮量，结果见表2。表2 氮源添加量对苷转化时间的影响（略）

从实验结果可知，尿素添加量0%～1.5%时，转化时间随氮源的增加而缩短；当氮源添加量为1.5%和2.5%时，转化时间最短，都为30 h。因此，从培养基成本考虑选择添加量为1.5%。

2.1.3 发酵条件的确定通过正交实验法来确定最佳的发酵条件，结果见表3。表3 虎杖苷粗提物液态发酵正交优化实验（略）

通过正交实验法得出虎杖苷粗提物液态发酵的最佳条件为（A3B1C3D3）：培养温度32℃，装液量20%，接种量30%，转速200 r/min，对实验结果分析发现，各因素对发酵影响大小顺序为：培养温度>接种量>装液量>转速。按最佳的发酵条件进行虎杖苷的液态发酵验证实验，经HPLC检测白藜芦醇苷粗提物中的虎杖苷在26.8 h转化95.8%。此结果优于正交表中的9个实验，证明了该工艺的合理性和稳定性。

2.4 产物的鉴定虎杖苷和白藜芦醇标准品混合进样后的HPLC定位，虎杖苷在4.2 min出峰，白藜芦醇在9.0 min出峰。见图2～4。

虎杖苷粗提物在4.2 min处有较大峰值，在9.0 min处有一个小峰出现；对应虎杖苷粗提物转化后在4 min左右没有明显的峰值出现，保留峰值基本消失，在9.0 min处有较大峰值。发酵后的产物与白藜芦醇标准品的出峰时间一致，证明微生物将虎杖苷粗提物中的虎杖苷转化为白藜芦醇。

3 结论

利用微生物转化虎杖苷含量为14.78%的虎杖苷粗提物，在最佳发酵条件：培养温度32℃，装液量20%，接种量30%，转速200 r/min下，经过26.8 h，虎杖苷转化率可达95.8%。证明利用虎杖苷粗提物进行微生物转化的方法是可行的、稳定的，此工艺更符合工业化生产，步骤简单，易于控制，原材料利用率高。 针对白藜芦醇需求量大，且国内亟待解决并值得深入研究的开发命题包括通过先进工艺获得高含量天然白藜芦醇产品，来满足日益增长的国内外对天然白藜芦醇的需求。本研究内容还未见报道，为获得天然白藜芦醇生产提供了一种可行的创新思路。

参考文献

篇8

有限储量的化石燃料在不断减少、能源需求在不断增长以及化石燃料燃烧造成的环境污染和温室效应日益严重，21世纪的能源面临着巨大挑战。思考未来能源的发展方向，积极寻找化石能源的替代品，许多人把眼光投向了可再生能源——氢气。

在对新能源的研究中，清洁、高效、廉价一直是研究者所追求的目标。氢是一种理想的清洁能源，它的热值高，最高达3042cals/m3，热转化率也很高，而且能量密度很高，是普通汽油的3倍，这意味着燃料的自重可减轻2/3。但氢能属于二次能源，在人类生存的地球上，很少有集中的自然氢存在。含氢元素的主要资源有水、化石燃料和生物质[1]。从化石燃料制氢，即以煤、石油及天然气为原料制取氢气是当今制氢的主要方法[2]。化石燃料利用带来的环境污染几乎无法逆转，而且资源有限，作为化工的主要原料已消耗掉大量的矿物资源，如通过重油裂解或天然气蒸汽重整制取氢气来合成氨或甲醇等。水电解制氢的技术已经成熟，但能耗较高，目前生产每立方米的H2 电耗为4.5～5.5kW·h 左右。电作为另一种高品质的二次能源，由一次能源的转化效率本来就很低，因而除了在具有廉价的大规模水力发电和电力过剩的情况以外，电解水制氢的成本相当高。与物理化学方法相比，生物氢气的生产可有效利用生物能源，并可减少有机废弃物对环境的污染以及对化石燃料的使用，具有高效、节能、成本低等诸多优点而备受关注。生物制氢已成为近年来日本、美国等一些发达工业国关注的热点研究领域之一。但正在开发和研究的各种生物制氢技术，仍停留在实验阶段。

污泥作为有机废物产氢近年来备受青睐，污泥产氢，包括直接作为基质产氢以及作为接种物产氢。

2纯污泥产氢研究现状

培养产氢污泥是进行厌氧发酵产氢试验研究的基础和关键。污泥是多种微生物的混合体，既有产氢微生物又有嗜氢微生物。在厌氧发酵过程中，产氢微生物所产生的氢气会迅速为嗜氢微生物所利用。但是一些产氢微生物能形成芽孢，其耐受不利环境条件的能力比普通的微生物强。利用这两类微生物生存条件的差异，通过预处理（如热处理、酸处理和碱处理等）抑制污泥中的耗氢微生物，达到筛选产氢微生物的目的。另外，在污泥发酵过程中污泥水解是限速步骤[3,4]。污泥中的有机物大部分是微生物物质，为细胞壁所包裹，限制了污泥的厌氧消化。通过采用适当的预处理，也可以破坏微生物细胞壁使有机质融出，改变污泥中有机物的可利用性，提高污泥厌氧消化的效率[5-7]。目前常用的预处理方法主要有热水解、化学处理、机械破碎、超声破碎、酶水解等。

陈文花等人[8]研究热处理方式对污泥产氢的影响。结果表明热处理具有很好的融胞效果，经处理后，污泥中可溶蛋白质为原污泥的6.4~8.9倍，溶解性糖浓度为原污泥的1.6~7.9倍。该污泥在最佳条件下，累积产氢量、产氢速率和产氢潜能分别为20.19mL、1.22mL/h和3.7mL/gVS，分别较原污泥提高了14倍，11倍和16倍。热处理污泥厌氧发酵产氢过程有机物的降解主要是蛋白质，其次是糖。

刘常青等人[9]，通过批量试验系统研究了酸性预处理污泥厌氧发酵产氢情况。研究结果表明：酸性预处理不仅对耗氢菌起到抑制作用，也能起到一定的融胞作用，pH=2.0酸性

* 基金项目：福建省科技厅重点项目（2011Y00181）；福建省环保厅重点项目；福建省教委A类项目（JA08043）。

** 通讯联系人：张江山（1946~），男，研究员，主要从事环境生态数学模型研究，E-mail:jszhang@fjnu.省略。

预处理污泥中溶解性糖和溶解性蛋白质的浓度分别为原污泥的3.1和9.9倍。最佳的酸性预处理条件为调整原污泥pH=3.0。此外还系统考察了不同初始pH值对酸性预处理污泥厌氧发酵产氢的影响。研究表明[10]，初始pH为11.0时，甲烷菌受到明显抑制，而产氢菌仍然活跃，总体产氢量最高。

蔡木林[11]等人研究了污泥经碱处理后的产氢潜能。研究结果表明，将污泥经过碱处理或调节较高初始pH值(11.0)的条件下，进行厌氧发酵可以有效抑制产甲烷化过程；碱处理污泥所获得的产氢率比原污泥高出1倍左右，约为16.9mL/g。

肖本益等[12]利用热、碱处理污泥产氢，其中碱处理污泥发酵产氢的最佳起始pH值为11.0，其最大产氢率(H2/VS)为14.4mL/g(VS)。在碱处理污泥的发酵产氢过程中，污泥的pH值变化较小，VFA的产生量和组成受污泥起始pH值的影响，乙酸是污泥发酵过程中产生的VFA的主要成分。Wang等[13]利用灭菌和冻融预处理污泥，产氢量(H2/COD)达到115～211mmol/g。.

谢波等[14]研究了Pseudomonas sp.GL1利用多种预处理（灭菌、微波和超声波）污泥的产氢效果，并对污泥发酵过程中底物性质变化进行探讨。产氢菌Pseudomonas sp.GL1发酵各预处理污泥过程中均只有H2和CO2产生，无CH4。3种不同预处理的污泥在同等条件下发酵，灭菌污泥的产氢效果最佳，氢气含量高达81.45 %，产氢率为30.07mL/g。不同预处理污泥方式对产氢延迟时间有一定的影响：超声波处理污泥产氢延迟时间最短，为3h；灭菌污泥最长，为15h；微波预处理污泥居中，为12h。发酵过程对污泥中营养物质的利用主要是乙酸和丁酸，灭菌污泥发酵产生的VFA只有乙酸和丁酸，各占VFA总量的66.1%和33.9%；微波预处理污泥中，乙酸、丁酸占VFA总量的88.1%和5.3%；超声波预处理污泥中，乙酸、丁酸分别占VFA总量的74.4 %和12.7%。可见乙酸和丁酸均是VFA的主要组成成分，属于丁酸型发酵，但又与碳水化合物(如葡萄糖、糖蜜等)发酵产氢时丁酸为VFA主要成分不同[15,16]。这主要是由于预处理污泥发酵产氢时底物是复杂的混合物，其中含有多种有机物，如蛋白质碳水化合物和脂类。这一结果与Cai等[16]研究一致。

污泥经过各种预处理后有机物质含量有所提高，增加的这部分有机质提高了产氢能力，但还是远远低于其他基质的产氢能力，纯污泥进行厌氧消化在工程上是行不通的。但据大量的研究证明，污泥与其他基质联合后产氢能力大大增强。

3以污泥作为接种物的产氢研究现状

早期生物制氢的研究主要集中在利用纯菌发酵制氢上。利用纯菌产氢，底物和反应器都需要高温消毒灭菌，配制培养基还需要大量昂贵的营养物质；为保证连续流产氢反应器内较高的细菌浓度，通常需要大量的载体和固定剂，而且固定化技术复杂，固定化后的细菌传质阻力增大，对产氢有一定的影响；纯菌在不断产氢过程中，比较容易发生变种，甚至被污染，出现产氢能力逐渐降低，需要定期更换新的细茵，同时需要配套的纯菌的分离、鉴定和扩大培养等设备，生产成本很高。进入20世纪90年代中期，人们逐渐把生物制氢的热点由利用纯菌的厌氧发酵转移到利用混合菌的厌氧发酵上来，其中以污泥作为接种污泥更是成为研究的主流。

一般来说，可用于生物发酵产氢的基质应具备以下几项特点：(1)碳水化合物的含量较高；(2)资源丰富且廉价；(3)具有较高的能量转化率等。目前，生物发酵产氢的研究中所利用的基质非常广泛，主要包括：①单纯的糖类，如葡萄糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖以及麦芽糖，淀粉等；②有机废水，如糖蜜废水、蔗糖生产废水、酿酒废水以及淀粉生产废水等；③有机固体废弃物，如城市固体有机垃圾、餐厨垃圾、柑橘皮、豆腐生产残渣、食品加工的边角料污水厂剩余活性污泥等[17]。

近十年来世界各国对发酵法生物产氢的研究日益增多，研究者对各种具有生物产氢潜力的基质更是进行了大量的研究。

3.1 纯基质的研究概况

目前，对利用纯物质作为产氢基质的研究较多，其目的主要是研究各种产氢菌的特性、最佳产氢条件以及探讨产氢的机理。

Lin等[18]以厌氧的恒化反应器进行连续流产氢实验，细菌为用活性污泥经驯化的厌氧产氢污泥，葡萄糖为实验用底物。实验结果表明：在最佳条件pH 5.7，污泥停留时间(SAT) 0.25d、有机负荷为416 mmol-glucose/L/d时，发酵1mol葡萄糖可产生1.7mol氢气。

Osamu等以葡萄糖为基质，利用混合菌产氢，比产氢率为1.43mol(H2)/mol(葡萄糖) [19]，Fang等2.1mol(H2)/mol(葡萄糖) [20]，樊耀亭等以蔗糖为基质，厌氧活性污泥发酵产氢，其比产氢率为2.23mol(H2)/mol(葡萄糖) [21]。这些研究基质的质量浓度一般在5～30g/L。吴薛明等人以高浓度蔗糖为基质模拟有机废水，通过对活性污泥的梯度驯化，提高活性污泥对高糖溶液的代谢能力与产氢能力。优化后的活性污泥平均产氢速率达到565mLH2·L-1·h-1，比优化前提高了223%，比产氢率为3.04mol(H2)/mol(葡萄糖)，比优化前提高了30%。由此得到的处理高基质浓度的活性污泥，其处理能力为一般水平的2.5倍以上[22]。

3.2 有机废水的研究概况

随着人们对环境的重视以及一次性能源的逐渐减少，各种废弃生物质资源的处理处置逐渐转向资源化，利用富含生物质的废水或固体废弃物的厌氧发酵处理产氢越来越受到重视，并逐渐成为当今生物产氢领域的研究热点。

任南琪课题组[23]采用连续流厌氧发酵法研究了糖蜜废水、淀粉废水与牛奶废水生物制氢。结果表明，糖蜜废水与淀粉废水都是较好的厌氧发酵法生物产氢底物；在3大类有机物中，碳水化合物是目前技术条件下最具有可能性的原材料。在碳水化合物中，溶解性好的糖比溶解性差的淀粉在目前的技术条件下具有生物产氢可行性，而淀粉比溶解性糖更具有产氢前景。不同底物厌氧生物制氢的生态位范围有所不同，对于溶解性好的糖，稳定运行的工程控制参数为pH4.5±0.3，而溶解性较差的淀粉废水为pH4.0±0.2；厌氧发酵产氢的ORP值总体必须低于-220mV，并随着底物的不同而不同，在-220mV～-300mV左右时较好。研究结果表明，牛奶废水不适用于作为CSTR反应器中发酵法生物制氢底物。

Lin等[15]成功地用热处理污泥发酵污泥碱水解物产氢，其氢产率(H2/TCOD)达到117g·kg-1。Ueno等[24]人利用制糖厂废水厌氧发酵产氢，分别获得的产氢速率为198mmol/L·d-1和34mmol/L·d-1。Lay[25]利用人工配制的淀粉废水发酵产氢，以3L的厌氧发酵反应器在控制37℃，pH5.2，HRT为17h，进水负荷6kg淀粉/m·d的优化条件时，最大产氢速率为1600L/m3·d，最大产氢率为1.29L/g淀粉。Yu[26]等人采用3.0 L上流式厌氧反应器处理酿酒废水产氢，分别考察了几个关键运行参数：当温度为55℃，pH5.5，HRT为2h，进水COD为34g/L时，产氢速率最大，为9.33L/gVSS·d，氢气产率为1.37～2.14mol/mol己糖。汤桂兰等人[28]在批式厌氧反应器中，以厌氧消化污泥作为天然产氢菌源，通过养殖场废水的厌氧发酵生产氢气。以上研究都还只停留在实验室小试的探索阶段。

任南琪课题组[27]在小试的基础上完成了发酵糖蜜废水产氢的中试研究，装置总体积为2m3，有效体积为1.48m3。中试结果表明，将运行参数控制在35℃，pH4.0～4.5，HRT为4～6h，ORP为-100～-125 mV，进水碱度300～500mg/L，容积35～55kgCOD/m3·d范围时，反应器最大持续产氢能力可达5.7m3/m3·d，其中去除1kg COD可获得26 mol的产氢量。

3.3 有机废物的研究概况

樊耀亭等人[29]在批式培养实验中以有机废弃物为原料，通过厌氧生物发酵制备生物氢气。以活性污泥为菌种来源，以淀粉为底物，在30L改进的UASB反应器中进行了放大实验，生物气中氢气浓度达40%～51%，CO2浓度为49%～60%，且没有检测到甲烷气体，生物气经碱液吸收后氢气纯度大于97%，持续产氢时间超过120d。

周俊虎等人[30]以厌氧活性污泥为接种物，以麦秆、稻草和滤纸为发酵底料，采用不同的预处理方法去除木质素，并提高纤维素的降解率。利用等量的经过NaOH预处理的麦秆和稻草，经纤维素酶解后在发酵产氢过程中的降解率分别为23.2%和12.5%，总产氢量分别为363.3mL和254.9mL，发酵产气中，氢气浓度分别为23.8%和29.1%。发酵液相中主要产物为乙醇、乙酸和丁酸。

Shin等[31]研究了餐厨垃圾与污水厂污泥混合厌氧发酵产氢效果。将污泥经过热处理后作为接种污泥，当餐厨垃圾与污泥的比例为83:17，挥发性固体的含量达到3.0％时，氢气的产率达到了122.9mL/gCOD，最大比氢气产率为111.2mL/gVSS·h，远超过了其他研究者的成果。对于产氢菌来说，有机氮源如蛋白胨或酵母膏是很好的营养源，而铵盐或尿素则效果不佳，污泥是富含蛋白质的有机废物，在餐厨垃圾中加入污泥能够提高系统的碳氮比，增加了产氢菌的氮源营养物质，因此氢气产量得到大幅度提高。

蒲贵兵等人[32]采用热预处理(80℃，15min)的城市生活垃圾厌氧消化污泥为接种物，考察了不同预处理方法对餐厨垃圾中温(36℃)批式发酵产氢的影响。

4结语

目前，发酵法产氢技术存在的主要问题是氢气产率很低，只有理论氢转化率的20%～30%。而这一转化率只有达到60%～80%的情况下才算是一种经济可行的生物产氢技术。利用废水或固体废弃物的厌氧发酵产氢研究大部分都是实验室研究，工业化应用很少，只有任南琪课题组在小试研究的基础上进行了糖蜜废水发酵制氢的中试研究；固体废弃物产氢的工业化国内鲜有报道，因此在实验室研究的基础上如何尽快实现产氢的工业化是今后的发展方向。

参考文献：

[1] 陈丹之. 氢能[M]. 西安：西安交通大学出版社, 1990.

[2] 赵永丰.氢能——21世纪的一种新能源[J].太阳能，2002(2):20-21.

[3] Eastman J A, Ferguson J F. Solubilization of particulate organic carbon during the acid phase of anaerobic digestion [J].JWPCF,1981,53(3):352-366.

[4] Alvarez J M, Macés, L P. Anaerobic digestion of organicsolid wastes: An overview of research achievements and perspectives[J].Biore Technol, 2000 (74):3-16.

[5] Muller J A. Prospects and problems of sludge pretreatment processes [J].Wat Sci Tech,2001,44(10):121-128.

[6] Wang Q H, Noguch I C, Hara Y, et al. Studies on Anaerobic Digestion Mechanism: Influence of Pretreatment Temperature on Biodegradation of Waste Activated Sludge[J]. Environ Technol,1997,18(10):999-1008.

[7] Antti G, Hanna K, Kirsi K, et al. Ultrasound Assisted Method to Increase Soluble Chemical Oxygen Demand (SCOD) of Sewage Sludge for Digestion [J]. Ultrasonsonochem,2005(12):115-120.

[8] 陈文花.市政污泥厌氧发酵产氢的试验研究[D].福州:福建师范大学, 2007.

[9] 刘常青,赵由才,张江山等.酸性预处理污泥厌氧发酵产氢[J].环境科学学报,2008,28(10):2006-2011.

[10] 刘常青,张江山,牛冬杰等.初始pH对酸处理污泥厌氧发酵产氢的影响[J].环境科学,2008,29(9):2628-2632.

[11] 蔡木林,刘俊新.污泥厌氧发酵产氢的影响因素[J].环境科学, 2005, 26(2): 98-101.

[12] 肖本益,刘俊新.pH值对碱处理污泥厌氧发酵产氢的影响[J].科学通报, 2005, 50(24):2734-2738.

[13] Wang C C, Chang C W, Chu C P, et al. Producing hydrogen from wastewater sludge by Clostridium bifermentans[J].J Biotech, 2003(102): 83-92.

[14] 谢波,郭亮,李小明等.Pseudomonas sp GL1利用不同预处理污泥产氢及其底物变化研究[J].环境科学,2008,29(4):996-1001.

[15] Lin H Y, Tsai Y Y, Wu R H. Study of hydrogen production from the anaerobic digestion of hydrolyzed biological sludge[A].The Twenty-sixth Wastewater Technology Conference,Kanhsiung,Taiwan,2001,21．

[16] Cai M L, Liu J Xin, Yuan S W. Enhanced Biohydrogen Production from Sewage Sludge with Alkaline Pretreatment[J]. Environ Sci Technol, 2004(38): 3195-3202.

[17] 蔡木林,刘俊新.利用废水和固体废弃物中有机质发酵产氢研究进展[J].环境污染治理技术与设备,2004,5(6):1-4.

[18] Lin C Y and Chang R C. Hydrogen production during the ananerobic acidogenic conversion of glucose[J]. J. Chem. Technol. Biotechnol, 1999 (74): 498-500.

[19] Osamu M, Hawkes D, Hawkes F R, et a1.Enhancement of hydrogen production from glucose by nitrogen gas sparging [J].Biore Technol, 2000 (73):59-65.

[20] Fang H H P, Liu H. Effect of pH on hydrogen production from glucose by a mixed culture[J].Biore Technol,2002(82):87-93.

[21] 樊耀亭,李晨林,侯红卫等.天然厌氧微生物发酵生产生物氢气的研究[J].中国环境科学,2002,22(4):370-374.

[22] 吴薛明,申宁.何冰芳.活性污泥处理高浓度基质发酵产氢条件的优化[J].南京工业大学学报,2006,28(3):28-32.

[23] 刘敏,任南琪,丁杰等.糖蜜、淀粉与乳品废水厌氧发酵法生物制氢[J].环境科学,2004,25(5):65-69.

[24] Ueno Y, Otsuka S，Morimoto M. Hydrogen production from industrial wastewater by anaerobic microflora in chemostat culture[J].Ferment Bioeng,1996,82(2):194-197.

[25] Lay J J. Modeling and optimization of anaerobic digested sludge converting starch tohydrogen[J].Biotechno1 Bioeng, 2000,68(3):269-278.

[26] Yu H Q, Zhu Z H, Hu W R, et a1.Hydrogen production from rice winery waste water in an upflow anaerobic reactor by using mixed anaerobic cultures [J]. Int. J. Hydrogen Energy,2002(27):1359-1365.

[27] 汤桂兰,许科峰,王冲等.利用养殖场废水厌氧发酵生物制氢技术研究[J].环境科学,2008,29(6):1621-1625.

[28] 李建政.有机废水发酵法生物制氢技术研究[D].哈尔滨: 哈尔滨建筑大学, 1999.

[29] 樊耀亭,廖新成,卢会杰.有机废弃物氢发酵制备生物氢气的研究[J].环境科学,2003,24(3):132-135.

[30] 周俊虎,戚峰,程军.秸秆发酵产氢的碱性预处理方法研究[J].太阳能学报,2007,28(3):329-333.

篇9

【关键词】森林病虫 虫害 关注

一、虫害的分类

1.有真核生物，植物界引起林木病害的主要是寄生性种子植物，如兔丝子、桑寄生、斛寄生。动物界引起病害的主要是瘿螨类和线虫类，如毛毡病和松材线虫病。

2.原核生物，要是细菌和植原体，比较常见的有树木的根癌病和泡桐丛枝病等。

3.无细胞生物，主要包括病毒和类病毒，它们都是严格的细胞内寄生物，林木的病毒病害如杨树花叶病毒病等，类病毒病害如柑桔裂皮病等。

二、虫害发生的主要条件

病原物与寄主接触后，对寄主进行侵染活动（初侵染病程）。由于初侵染的成功，病原物数量得到扩大，并在适当的条件下传播（气流传播、水传播、昆虫传播以及人为传播）开来，进行不断的再浸染，使病害不断扩展。由于寄主组织死亡或进入休眠，病原物随之进入越冬阶段，病害处于休眠状态。到次年开春时，病原物从其越冬场所经新一轮传播再对寄主植物进行新的侵染。这就是侵染性病害的一个侵染循环。

三、虫害发生的症状

1.植物得病后的不正常表现称为症状。由真菌引起的病害在寄主患病部位表面有明显的粉状物、霉状物或子实体，由细菌、病毒、线虫和真菌等微生物引起的病害在寄主上亦有斑点、丛枝、流胶、腐烂、枯萎等症状。由土壤缺乏某种元素、气候环境条件不适合等非生物因素引起的生物性病害不出现上述症状，受害林分中的林木往往表现均匀一致的叶片边色矮小等症状。由昆虫为害的树木，其叶片上有明显的缺损，枝干有坑道、蛀孔或蛀屑，即使蚜虫、介壳虫、螨类等刺吸性口器造成的褪色、卷叶，也可籍助于手持扩大镜在树上找到虫体。

2.病树林间分布判断：林间病株的分布暗示着相应的各种病因可为诊断提供分析的线索。由生物引起的传染性病害发病初期为点片状，零星分布，健康树和病树混杂存在。由环境条件不适引起的生理性病害在某种树上表现的症状相同，病株在林间成片发生，树木受害均匀一致。此外，必须了解林木的种源、栽培管理过程中的技术环节气候是否反常等情况，以有助于病虫害的诊断。当然，确切的诊断还必须采集标本进行室内分析，通过显微镜镜或解剖镜仔细观察，进行病原或病害名称鉴定，病原物还有进行分离培养和人工接种试验等，才能得出确切的结论。

四、树木病害病原的判断及相应的步骤

1.正确区分侵染性和非侵染性病原，二者在病害的发生发展历史、分布规律、危害症状和是否存在病原物等方面都有显著的差异，必要时可以进行治疗诊断。

2.正确按照症状和传染性等区别不同的病原生物，有时也要借助于一些试验。

3.应用柯赫法则确定具体的病原菌，柯赫法则的步骤是首先从病植物体上分离出与病害有关的微生物并使其在人工培养基上生长，然后进一步纯化培养物，将纯菌种接种到同种健康的植物体并使其发病，观察其是否出现与原病害相同的症状，再从接种发病组织上分离出同种微生物，这些步骤常称人工诱发试验。柯赫法则是证明一种微生物传染性和致病性的最科学的方法，目前有的生物类群由于不能人工培养而暂时无法完成柯赫法则的循环，如病毒、类病毒、植原体和绝对寄生菌物，但可以通过嫁接、传毒等方法证明其致病性，所以也被认为是病原菌。

五、以松材线虫病的危害为例

1.寄主种类多、分布广。松材线虫病寄主种类较多，主要以松树为主，少数亦非松属针叶树。在我国高度感病的松树有黑松、马尾松、琉球松、湿地松、云南松、华南五针松、华山松、红松等，但目前我国大陆自然状况下发病均以黑松和马尾松为主，而这两种松树正是我国重要的造林绿化树种。

2.适生区范围大。我国大部分地区具有适宜松材线虫病发生的气候和寄主条件，尤其新疆的特有气候，更是容易引起这类病虫的寄主。

3.传播蔓延迅速。松材线虫病的传播主要靠媒介昆虫和人为携带罹病木材及其制品来完成。其远距离传播主要是人为携带感病木材及其制品所致，从我国发生情况看，人为传播的现象较为严重。

4.致死速度快、防治难。由于松材线虫和松褐天牛大部分时间均在寄主树干内取食、为害，防治困难。松树一旦感病很难治愈，发病速度快，最快的40多天即可枯死。松林染疫后发病迅速，从染病到毁灭只需 3-5 年时间，因此人们称之为松树的癌症。

六、如何防止虫害对我国森林资源的危害

1.使用农药。在做好相应的安全措施的情况下，首先要对症下药，对于不同的病症配备不同的药物，以相应的时间给树木上药。

2.使用化学农药。理使用农药，注意化学农药种类、剂型的选择，合理轮用，混用，选择高效、低毒、低残毒农药。尽量采用低容量、超低容量喷雾选择适宜防治时机，尽量避免在天敌大量出现期施药。

3.在进入森林等相关生态区时先做自身的消毒和相应的防护措施，避免携带虫害及其它病原体对树木造成不必要的传染。

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关键词：天然木质纤维 五碳糖 生物转化

中图分类号：TS262.2 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2014）06（c）-0044-01

目前，发酵法生产的燃料乙醇是公认的较为理想的清洁新能源转化方式。巴西、美国、欧盟等国家纷纷提高乙醇在燃油中的添加量，提高新的能源在燃料中的组成比例。我国同样面临能源紧缺和能源安全问题，在众多粮食作物的副产品及众多非粮作物中，富含大量的木质纤维产物，而这些木质纤维又是由五、六碳糖构成，因此，如何高效利用农副产品废料、和天然木质纤维原料降解转化生产清洁能源就成了科研工作面对的巨大挑战。

1 木质纤维和五碳糖

木质纤维是大量存在于自然界中的碳水化合物，在木质纤维作物中，纤维素的存在方式是晶体束形式，由半纤维素及木质素复形成的外壳包裹，这种外壳能够保护植物细胞[1]。目前能够人工纯培养的微生物多数能够转化产出乙醇的微生物可以高效利用六碳糖，其中葡萄糖是最容易被利用的碳源，葡萄糖首先由糖酵解途径或ED途径转化为丙酮酸，丙酮酸通过丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶转化成为乙醇。

木质纤维中的五碳糖的转化以木糖转化为主，野生型酿酒酵母无法利用木糖转化生产乙醇，因为其体内因缺少能够将木糖转化为乙醇合成关键中间产物木酮糖的酶系。因此，木糖转化为木酮糖步骤是实现木糖转化乙醇的关键环节。真菌中木糖能够在木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的催化下转化为木酮糖，细菌中木糖能够在木糖异构酶的催化下转化为木酮糖[2]。当木糖在生物体内转化为木酮糖后，木酮糖激酶将木酮糖磷酸化为5-磷酸木酮糖，经过转醛醇酶及转酮醇酶的共同作用，5-磷酸木酮糖将进而被转化为甘油醛-3-磷酸及葡萄糖-6-磷酸，然后转入磷酸戊糖途径经丙酮酸脱羧转化为乙醇[3]。

对现有菌种的改造，目前的研究主要通过两种方法实现：一种是向酵母等高效利用六碳糖的菌种中导入五碳糖代谢途径；第二种是向混合糖利用能力强，但目的产物产量低的菌种中导入增强代谢通路转化的关键基因。

2 五碳糖菌株改造方法

在这里介绍几种目前改造菌株较为常用的技术。在五碳糖转化的研究中，通常使用能够高效生产乙醇的微生物作为菌株改造的目标，包括酵母菌、运动发酵单胞菌这样的菌株，都能以六碳糖作为底物转化生产乙醇，但无法高效利用五碳糖，因此需要导入五碳糖转化通路，构建工程菌株[4]。对于能够转化混合糖的菌株，如大肠杆菌，由于缺少丙酮酸脱羧酶，且乙醇脱氢酶Ⅱ活性低，因此它们转化产出乙醇效率则相对较低。这就需要向菌株中导入增大乙醇产出代谢通路的关键酶。目前，多数以大肠杆菌为研究目标的基因工程改造工作都是以质粒作为基因载体，但质粒的遗传稳定性较差，在保藏过程中经常出现丢失等问题，不易于获得乙醇高产菌株。另外一种常用技术是原生质体融合技术，该技术通过将两个遗传性状不同的细胞融合重组产生一个新细胞，使两亲本株基因融合并产生基因重组并获得新的性状的一种技术[5]。原生质体融合技术可在不同种属间开展，通过不同的生物体细胞融合，达到改造细胞遗传性状的目的，并赋予酵母菌代谢五碳糖的能力。

3 转化产物中的数据获得方法

培养基中葡萄糖含量的测定方法较多，当以葡萄糖作为单一碳源时，发酵液中葡萄糖含量测定方法通常采用3，5-二硝基水杨酸比色法。在碱性条件下，当葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸共热时，葡萄糖被氧化成产生糖酸等化合物，3，5-二硝基水杨酸发生还原反应，产物3-氨基-5-硝基水杨酸呈棕红色。葡萄糖的含量与产物中棕红色物质成比例关系，这时，可在520 nm波长下测棕红色物质吸光值，再根据吸光值标准曲线计算样品中葡萄糖含量。

测定发酵液中木糖含量时，同样利用3，5-二硝基水杨酸比色法。当培养基为葡萄糖与混合糖按比例配置时，可利用葡萄糖试剂盒检测混合糖发酵液中葡萄糖的含量，在采用比色法测定总还原糖吸光度值，绘制比色法的葡萄糖标准曲线，之后对发酵液中葡萄糖含量加以换算，用总还原糖吸光值减去葡萄糖的部分，就可以获得混合糖中的木糖吸光值，然后绘制的木糖的标线，计算出木糖的含量。

发酵液中目的产物含量可以通过多种方法获得，以乙醇为例，乙醇含量可以通过重铬酸钾比色法获得，也可以利用高效液相色谱和气相色谱法获得，同时，目前市场上也有多种试剂盒用来测定发酵液中的乙醇含量[6]。其中，高效液相色谱被广大科研工作者广泛认可。

4 结语

目前很多研究工作的重点为通过对五碳糖菌株的改造，以期望得到具有高效转化五碳糖途径的工程菌株。在这些研究过程中，人们往往只是通过定向基因导入，替代或敲除等技术单纯的改变细胞的某一代谢途径，而无法做到从整体上来调控细胞的代谢平衡。因此，对于目前的研究现状，还有很多工作等待着科研工作者去完成。

参考文献

[1] 许玫英，郭俊，岑英华，等.染料的生物降解研究[J].微生物学通报，2006，33（1）：138-143.

[2] 路鹏，江滔，李国学.木质纤维素乙醇发酵研究中的关键点及解决方案[J].农业工程学报，2006，22（9）：237，240.

[3] 李祖明，李鸿玉，历重先，等.纤维素酶转化木质纤维素生物质生产乙醇的研究进展[J].农业工程技术（新能源产业），2008（2）：28.

[4] 张强，冀伟，王一东.五碳糖和六碳糖共发酵生产酒精菌株选育的研究进展[J].化工进展，2013（1）.