微生物的多样性范文

导语：如何才能写好一篇微生物的多样性，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

（保山中医院高等专科学校，保山 678000）

（Baoshan College of Tranditional Chinese Medicine，Baoshan 678000，China）

摘要： SARS之后，中央空调系统可能成为传染病的一种空气传播渠道引起公众和政府的重视，而其独特的设计结构亦为滋生各种微生物提供环境，所以加强对中央空调系统的卫生评价和卫生管理对于传染病防控非常重要。本文阐述了保山地区疾病预防中心开展在进行中央空调系统卫生状况调查的同时开展其微生物多样性研究的意义。

Abstract： After SARS, that central air conditioning system may became an air spread channel of infectious diseases caused attention of public and government, and its unique design structure also provides environment for breeding various microorganism, so it is very important for infectious diseases control to strengthen the health evaluation and health management of the central air conditioning system. This paper expounds the meaning of microorganisms diversity research while investigating the hygienic condition of central air conditioning system in disease prevention center in Baoshan.

关键词 ： 中央空调；微生物；多样性

Key words： central air conditioning；microorganisms；diversity

中图分类号：R122.1 文献标识码：A

文章编号：1006-4311（2015）02-0297-02

公共场所是人群密集场所，其卫生状况与人体健康密切相关。中央空调现在广泛应用于写字楼、宾馆、医院等公共场所，通过对室内空气的温度、湿度风速等微小气候进行有效调节，给人们的工作、学习和生活提供了舒适的环境，同时如果空调通风系统在设计、安装或者运行管理等的过程中存在不合理的地方，很容易滋生室内的空气污染物，并且已经成为了一种主要的建筑物室内空气污染。空调系统对人体健康构成的最大危害就是空调系统引发的传染性疾病，其中“军团病（Legionettosis）”是最具代表性的，曾在世界上很多国家引起50多起爆发流行；“不良建筑综合症（Sick Building Sgndrome，SBS）”是空调系统污染造成人体健康危害范围最广的，因此，全世界都很关注中央空调系统的卫生问题。

我国政府和公众在2003年发生“SARS”后一直非常重视中央空调系统的卫生问题。卫生部首先在2003年8月颁布了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》，之后又在2006年2月颁布了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》等四项规章制度，并于2006年3月1日起开始实施，不仅规范了空调系统卫生技术要求，也加强了空调系统卫生评价规范与卫生管理

在这一系列的卫生法规和标准的支持下，各地的疾病预防中心都开展了相应的工作[1]，对当地公共场所的中央空调进行了卫生状况的调查,调查结果根据相关规定列出细菌总数、真菌总数和检出嗜肺军团菌、b-溶血性链球菌的情况，其中无一报告在进行微生物检验时，通过培养获得的细菌和真菌具体有哪些种类及其数量分部。但是，建筑物内的真菌孢芽、毒素的刺激能够引发的病症包括眼球和喉咙的发痒、充血以及头痛、呼吸困难，甚至哮喘等其他严重的疾病。有研究[2]表明，真菌是已与供暖、通风和空调（HVAC）系统的污染相关的生物，它还可能导致生活在该环境下的人得传染疾病。Somers等实验发现吸入污染空气颗粒的小鼠发生基因突变，这为空气中的真菌可能导致肺癌提供了间接证据。室内空气生物污染不仅危害人体的呼吸系统和免疫系统，Anyanwu的研究证明产毒真菌的长时间暴露可能影响到儿童神经生理功能，上述研究部分揭示产毒真菌可能对人体神经系统的健康也存在威胁，许多细菌的细胞成分（如内毒素、β-葡聚糖）也是重要的病原，Huttunen[3]等研究发现，室内空气中的细菌都显著的诱导鼠巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α、细胞白细胞介素-6的产生。而这些文献中提到的微生物没有在相关的检测法规中作为需要检测的对象出现。

所以仅仅调查和报告规定的细菌、真菌数量，只关注法规中提到的致病菌检出情况就对一家公关场所中央空调的卫生状况进行评价是不够全面的。

中央空调中的绝大多数微生物主要来源与空气微生物，极少部分特别是条件致病菌或者病原微生物来源与入住的宾客或者工作人员。空气微生物主要来源于土壤、水体表面、人体以及生产活动等。其组成浓度不稳定，种类多样[4]。空气微生物的种类随调查地理位置、调查季节的变化而有所不同。王春华[5]对东莞市5个不同的公共场所进行空气微生物监测，细菌和真菌含量的季节更迭而变化。细菌以革兰阳性菌为主，其中芽孢杆菌和葡萄球菌占多数；真菌以青霉和曲霉为主。而中央空调的微生物多样性调查结果尚无报道。

大多数空调系统在晚上停止新风进入后，整个风道内的湿度可达80甚至100，这样一个特殊条件，为滋生各类微生物提供了适宜的生存繁殖环境，条件致病菌甚至是致病微生物都有可能在这样的条件下得以生存。保山属低纬山地亚热带季风气候，气候类型的多样化，生物种类繁多，微生物种类也很丰富，但其空气微生物多样性尚无相应研究报道。曾有新闻报道，二战期间，日军在保山县境内发动的细菌战，曾引起霍乱、鼠疫、炭疽的爆发，这些都给保山的疾病预防和控制带来了挑战。对于人群集中的公共场所，容易引发、传播传染性疾病的空调系统的卫生状况调查和其中微生物多样性的调查、研究都是刻不容缓的。所以结合本地的地理气候、生态环境等因素，调查、研究哪些种类的微生物能够在公共场所的中央空调中生存、繁殖或者是以孢子、芽孢等形式留存在中央空调中，中央空调中的微生物哪些可能是致病菌，哪些是可能条件致病菌，哪些仅仅是与空气中的背景微生物。

检测室内空气微生物，传统的方法是利用生物粒子重力随机沉降到培养皿上的暴皿沉降法，这种方法虽简单容易操作，但因为是一个被动捕获的过程，所以结果波动很大，准确度和重复性都较差。对于中央空调的微生物采样，现在更多采用为主动抽取空气的撞击式采样器，在计算微生物总数和对其进行形态学鉴定的同时测定其粒子大小分布规律。

传统的培养计数法只能培养可培养的微生物，而不能在培养基上生长或有其他生长需求的微生物就不能获得。另外，在进行可培养微生物鉴定时费时费力而且不够准确，所以现在有生物发光法、免疫法等新方法引入到微生物多样性的检测中，其中分子生物学的方法具有宽阔的应用前景。

中央空调微生物多样性的研究不仅可以为制定更加全面的卫生标准提供微生物学的依据，还可以在空调系统样品采集的方法、微生物种类的卫生标准、中央空调清洁的方法、频率和注意事项、易感人群的感控提示等方面并提出微生物学的建议和意见。

参考文献：

[1]张志诚，余淑苑，王秀英，等.22家酒店40套空调系统卫生状况调查[J].中国公共卫生管理，2008，24（1）：88-90.

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篇2

【关键词】生物多样性 人口 生境的破碎化 环境污染 物种入侵

【中图分类号】Q9 【文献标识码】A 【文章编号】1674－4810（2011）22－0175－02

1992年，联合国在巴西召开了环境与发展政府首脑会议，通过了《21世纪议程》，签署了《生物多样性公约》、《气候变化框架条约》等，并达成了共识――走可持续发展的道路，从此生物多样性受到人们的广泛关注。

生物物种的灭绝是自然过程，但是灭绝的速度和方式，由于人类活动对地球的影响而大大加速。有学者估计，自1600年以来，人类已导致75%的物种灭绝。

Reidh和Miller估计（1989年），鸟、兽两类，1600～1700年间大约每10年灭绝一种；而1850～1950年期间，上升到大约每两年灭绝一种。1600年以来的灭绝，古生物家称为地质史上的第六次大灭绝，它大约是已往地质年代“自然”灭绝的100～1000倍。而加速的原因主要是由人类活动的加剧而引起的。

由此看来，地球的生物多样性正在受到越来越严重的破坏。现就此进行简单分析。

一 人口迅猛增加

社会经济发展稳定后，人口的数量就不断增长。在生产力落后时，人口的数量受到自然因素，如旱灾、虫灾、火灾、水灾、地震等的控制；另外，人类自身制造的灾难如战争、贫困也使得人口数量得以控制。但是，现代科学技术的进步使人的数量与寿命都延长了。

19世纪工业革命后，人口的增加就成了全球的主流，在经济发展中国家最为明显。1830年全球人口只有10亿，1930年达到20亿，2000年达到了60亿。

中国在1790年的人口约3亿，1860年约4亿，1970年8亿，到2000年就超过了13亿人口。

人口增加后，必须扩大耕地面积，满足吃的需求，这样就对自然生态系统及生存其中的生物物种产生了最直接的威胁。

由于人口增长过快，加上等政策错误，我国形成了大量的退化生态系统。目前，我国境内水土流失面积约为180万平方公里，占国土面积的19%，其中黄土高原地区约80%地方水土流失。

北方沙漠、戈壁、沙漠化土地面积为149万平方公里，占国土面积的16%，1987年已沙漠化土地20万平方公里，潜在沙漠化土地13万平方公里

目前有5900万亩农田和7400万亩草场受到沙漠化威胁。草原退缩面积13亿亩，每年以2000万亩增加。每年使用农药防治面积23亿亩，劣质化肥污染农田2500万亩。

二 生态环境的破碎化

生物多样性减少最重要的原因是生态系统在自然或人为干扰下偏离的自然状态，生境破碎，生物失去家园。

地球上许多生态系统的生物多样性及其生境的损失，表现在面积剧烈减少，被改变或被破坏。湿地是被人类开发最剧烈的系统之一。新西兰有90%的湿地从欧洲殖民以来已经损失。美国从1492年以来，几乎100%的自然草地已损失，欧洲的温带森林已经大部分被破坏。利用人造卫星技术可以监测全球森林的损失，估计是170000km2/a（1981～1990年之间）。

从生态系统多样性丧失对人类社会的影响而言，今以我国1998年长江洪水危害根源为例，长江上中游森林破坏造成的水土流失和下游湖泊、湿地的围垦和开发导致调节洪水能力的减弱，无疑是其中的两大重要原因，它们都与生态系统多样的丧失有密切的关系。这个例子也说明，要深入了解生物多样性丧失的危害性，其关键是科学地理解生物多样性的各种生态系统功能及其变化机理。

与自然系统相比，退化的生态系统种类组成变化、群落或系统结构改变，生物多样性减少，生物生产力降低，土壤和微环境恶化，生物间相互关系改变。

Daily（1995）对造成生态系统退化和生物多样性减少的人类活动进行了排序：过度开发（直接破坏和环境污染等）占35%，毁林占30%，农业活动占28%，过度收获薪材占6%，生物工业占1%。其中前三项人类活动占93%，而这些破坏最直观的结果是造成了物种生境的破碎化，栖息地环境的岛屿化。

生物多样性减少的程度取决于生态系统的结构或过程受干扰的程度，例如，人类对植物获取资源过程的干扰（如过度灌溉影响植物的水分循环，超量施肥影响生物地球化学循环）要比对生产者或消费者的直接干扰产生的负效应要大。

一般而言，在生态系统组成成分尚未完全破坏前排除干扰，生态系统的退化会停止并开始恢复（例如少量砍伐后森林的恢复），生物多样性可能会增加；但在生态系统的功能过程被破坏后排除干扰，生态系统的退化很难停止，而且还有可能会加剧（例如火烧山地后的林地恢复）。

三 环境污染

随着人类的发展，环境污染也逐渐加剧。环境污染会影响生态系统各个层次的结构、功能和动态，进而导致生态系统退化。环境污染对生物多样性的影响目前有两个基本观点：一是由于生物对突然发生的污染在适应上可能存在很大的局限性，故生物多样性会丧失；二是污染会改变生物原有的进化和适应模式，生物多样性可能会向着污染主导的条件下发展，从而偏离其自然或常规轨道。环境污染会导致生物多样性在遗传、种群和生态系统三个层次上降低。

第一，在遗传层次上的影响。虽然污染会导致生物的抵抗并与之相适应，但最终会导致遗传多样性减少。这是因为在污染条件下，种群的敏感性个体消失，这些个体具有特质性的遗传变异因此而消失，进而导致整个种群的遗传多样性水平降低；污染引起种群的规模减小，由于随机的遗传漂变的增加，可能降低种群的遗传多样性水平；污染引起种群数量减小，以至于达到了种群的遗传学阀值，即使种群最后恢复到原来的种群大小时，遗传变异的来源也大大降低。

第二，在种群水平上的影响。物种是以种群的形式存在的，最近研究表明，当种群以复合种群的形式存在时，由于某处的污染会导致该亚种群消失，而且由于生境的污染，该地方明显不适合另一亚种群入侵和定居。此外，由于各物种种群对污染的抵抗力不同，有些种群会消失，而有些种群会存活，但最终的结果是当地物种丰富度会减少。

第三，在生态系统层次上的影响。污染会影响生态系统的结构、功能和动态。严重污染还可能具有趋同性，即将不同的生态系统类型最终变成基本没有生物的死亡区。一般的污染会改变生态系统的结构，导致功能的改变。值得注意的是，重金属或有机物污染在生态系统中经食物链作用，会有放大效应，最终影响到人类的健康。

四 外来物种入侵

外来物种的入侵从字面上理解是增加了一个地区的生物多样性，事实上，历史上那些无害的生物也是通过人的努力而扩大分布范围的，一些驯化的作物或动物已经成人类的朋友，如我们食物中的马铃薯、西红柿、芝麻、南瓜、白薯、芹菜等；树木中的洋槐、英国梧桐、火炬树；动物饲料中的苜蓿；动物中的红鳟鱼、海湾扇贝等，这些物种进入到异国他乡带来的利益是大于危害的。

然而，对于生态平衡和生物多样性来讲，生物的入侵毕竟是一个扰乱生态平衡的过程，因为，任何地区的生态平衡和生物多样性都是经过几十亿年演化的结果，这种平衡一旦打乱，就会失去控制而造成危害。

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关键词：土壤微生物；高通量测序；生物多样性

中图分类号：S154.37文献标识码：A文章编号：16749944（2013）08020303

1引言

土壤是一个非常复杂的生态环境体系，土壤微生物学作为微生物学的一个分支，一直在研究之中。土壤微生物是土壤的重要组成部分，是生态系统中重要的消费者和分解者，其群落结构多样性及变化在一定程度上反映了土壤的质量和稳定性。土壤微生物多样性是指微生物生命的丰富性及在遗传、种类、生态系统层次上的变化，同时反映微生物群落的稳定性。许多研究已经证实， 通过传统的DNA分离方法测定出来的土壤微生物只占到环境微生物的0.1%～10%[1， 2]。传统的土壤微生物研究方法如微生物平板培养法、Biolog鉴定系统法、生物标记法等[3]往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，无法详细描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。随着科学技术的发展，传统的Sanger技术的弊端也日益体现，一方面是因为该方法费时，且一次的反应数有限，另一方面是该技术基于酶法测序，成本较高。随着微生物研究技术的迅速发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学研究专家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法[4]，高通量测序技术也随之诞生，慢慢应用到科研之中。

2土壤微生物研究方法

2.1微生物平板培养法

传统的土壤生态系统中微生物群落多样性及结构分析大多是将微生物进行分离培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局限于从固体培养基上分离微生物。这种方法只能培养出极少量的微生物类群，大约占0.1%～10%，无法对绝大多数土壤微生物的分类和群落结构进行深入研究。因此这种培养法局限性比较大，只能应用于特殊微生物的研究[5]。

2.2BIOLOG鉴定系统

BIOLOG系统是Garland于1991年建立起来的一套用于研究土壤微生物群落结构和功能多样性方法。细胞的维持和生长需要能量、碳源和多种无机离子，底物利用是群落中微生物存活和竞争的关键。因此可以根据微生物对碳源利用的方式来鉴定微生物的群落结构。碳数利用法通常用BIOLOG盘来实现。BIOLOG测试盘内有96个小孔，除了一个小孔为对照不含碳源外，其余都含不同的碳源。试验中将碳源和指示剂一起放入平板小孔内，然后将稀释后的细胞悬液接种到各个小孔中，由于微生物利用碳源引起指示剂变化，以此来检测和判断不同土壤微生物群落结构[6]。

2.3分子生物学技术测序方法

在过去的20多年里，分子生物学技术尤其16S rDNA技术已经广泛应用于鉴定未知菌类的研究中。20世纪80年代以来，逐步建立起了以分子系统发育分析为基础的现代微生物分子生态学的研究方法，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术（FISH）、基因芯片（Microarry）、磷脂脂肪酸图谱分析（ Phospholipid fatty acid， PLFA）、稳定同位素探针（Stable Isotope Probing， SIP）、PCR-DGGE/TGGE等[7]，使得研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进行研究。

但是这些技术只能在科或属水平上分析土壤微生物的群落结构，不能更细致更详细地对土壤微生物进行分析研究。随着科学技术的发展，相继出现了第一代、第二代、第三代高通量测序技术，使得研究人员能在种的水平上对土壤微生物进行研究和分析。

2.4 454高通量测序方法

高通量测序技术[8]是传统测序一次革命性的改变，一次可以对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，在有些文献中也称其为下一代测序技术（next generation sequencing），可见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序。

近年来，以16S rRNA/DNA为基础的分子生物学技术已成为普遍接受的方法。研究表明，400～600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计[9]，因此454高通量测序的方法因其读长（400～500bp）长和准确性高的特点大量用于微生物多样性的研究。

因此通过高通量测序法来确定土壤微生物群落结构，从而可以在种的水平上将土壤微生物的群落结构分析出来，然后就可以对土壤微生物的多样性进行分析。并可以对土壤微生物和盐生植被的相互照应关系进行分析研究。

3454高通量测序在土壤微生物研究中的应用

3.1研究土壤微生物的物种多样性

研究微生物物种多样性主要从微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数目及其比例来描述某个地区某段深度土壤中微生物的多样性，然后根据此地区土壤微生物物种的多样性来探究全球范围内土壤微生物的物种多样性。通过高通量测序测得土壤中土壤微生物的各种菌类组成，以此来研究某个地区土壤中微生物的物种多样性。

3.2研究土壤微生物的功能多样性

研究土壤微生物功能多样性主要从各种微生物的活性及它们的相互作用产生的功能、底物代谢能力及与N、P、K等营养元素在土壤中相互转化的功能等。通过将高通量测序得到的土壤微生物的群落结构及组成和实验测定土壤的几种理化性质及转化过程来了解土壤微生物的功能。

通过实验测得土壤的碱解氮、有效磷、活性有机质、腐殖质理化性质，可以分析地区土壤微生物的功能多样性，以此来探究全球范围内土壤微生物乃至整个微生物的功能多样性。

3.3研究环境的突然变化对土壤微生物菌群的影响

环境的突然改变会导致微生物群落的结构和功能发生变化。近几年来随着全球变暖，土壤微生物的群落结构可能发生了变化，地震、泥石流等自然灾害也会对土壤微生物的群落构成产生影响。Zachary等以重水稳定同位素探测技术（H218O-SIP）鉴定与土壤增湿相关的细菌。先对土壤增湿前土壤微生物进行测定，得到土壤微生物各种组成，然后将土壤增湿后，对土壤中16S rRNA进行高通量测序，发现Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria和Gammaproteobacteria的相对比例升高，而Chloroflexi和Deltaproteobacteria的比例则降低。作者通过控制土壤湿度的动态变化，对微生物菌群的结构发生变化进行研究，划分生态类群。除此之外，温度的骤变也会对土壤微生物菌群产生巨大的影响。

4454高通量测序技术存在的问题及发

展前景到目前为止，大量的研究者应用454测序技术对多种环境样品的微生物多样性进行了深入研究，这些研究大大增长了人类对微生物的存在和种类的认识。针对不同的研究对象，454测序技术不仅为研究提供了大量数据，证实研究对象所含微生物具有较高的多样性，而且还建立了一种研究复杂生态系统里的微生物多样性方法。但由于该技术刚刚起步，所以存在一些待解决的问题。首先，随着核酸序列数量上的跨越式累积，生物信息学分析将面临巨大的挑战。另外，海量数据的深入挖掘工作会发现用传统生物学理论难以解释的生命规律，对传统理论的颠覆和新理论的提出与建立将成为不可避免的工作。

虽然存在许多不足，但454测序技术仍以其强大的测序能力渗透到生命科学研究的方方面面，包括那些此前无法用测序来解决的领域。在微生物领域，凭借着 454测序技术各方面的优势，终究会成为未来研究环境基因组的主导测序技术，同时，随着454技术的不断完善，该技术将为微生物生态学研究注入新的动力，成为微生物生态学研究新的亮点，大大加速微生物生态学的发展，增长人类对微生物生态学的认识，为人类探索广袤的微生物资源提供无限遐想。参考文献：

[1]Amann RI， Ludwig W， Schleifer KH. Phylogeneticidentification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiol. Rev.， 1995， 59 （1）： 143～ 169.

[2]Brock TD. The study of microorganisms in situ： progress and problems[J]. Symp. Soc. Gene Microbiol.， 1987， 41：1～17.

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篇4

（贵阳职业技术学院，贵阳 550081）

摘要：采用T-RFLP法实验研究贵州省特有药用植物根际丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多样性。结果表明： 4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。植物种类不同，对应的AMF群落多样性有较大差异，证明了宿主植物对根际微生物群落结构多样性的影响；同时，有机质、pH和速效磷对根际AMF群落多样性影响较大。

关键词 ：丛枝菌根真菌；贵州特有药用植物；群落多样性

中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）17-0219-02

作者简介：封晔（1981-），女，陕西绥德人，贵阳职业技术学院讲师，研究方向为微生物应用。

0 引言

贵州特有药用植物是指目前在贵州省境内发现有分布并具有药用价值，但是在贵州以外的其它地区都没有分布的物种，其代表种类有：银背叶党参、梵净山小檗、梵净山蒲儿根、梵净山冠唇花、梵净山火绒草、梵净山紫苑、短茎羊藿等[1]。

菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有着重要的生态作用，它可以与世界上大多数的维管植物根系形成互惠共生体。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最广泛的一类。研究表明，AMF因其能扩大植物根系吸收面积、加快养分运输速率、分泌活化物质、提高光合速率等直接和间接作用，改善宿主植物的矿质营养，增加植物中的碳积累，进而促进植物生长[2]。

目前对药用植物AMF的研究主要集中在菌根多样性或接种菌根真菌对植物的影响。李品明等对重庆市13种中药材植物的AMF物种多样性进行了研究，结果表明，从中药材植物根际土壤中分离出了10种菌根真菌，隶属三个科[3]。王森等以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料，从4种植物根际共鉴定AMF 27种[4]。在国内因药用植物种质资源丰富，宿主范围十分广泛，目前已经对上百种药用植物进行了研究。

长久以来，中药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，甚至濒临灭绝，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。本课题主要是通过对贵州特有药用植物根际土壤采集和分析，研究药用植物根际AMF种质资源及多样性，以期为充分发掘和利用AMF资源，筛选AMF优势菌，利用菌根生物技术提高药用植物产量、品质和扩大人工栽培区提供材料和依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

采样地位于贵州东南部茂兰保护区及织金县牛场镇。本区处于温暖湿润的中亚热带气候区，区域内有雷公山和月亮山，分布着适宜常绿栎林及热带常绿阔叶林生长的红壤和红黄壤，海拔最高处为2178．8m，最低处137m。区域内有中草药资源十分丰富。

1.2 样品采集

2014年10月在贵州省茂兰保护区及织金县牛场镇采集铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、太子参（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根际土。每株按东西南北4个方位，除去5cm厚的表层土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取带有细根的根系，用塑胶袋存放根系和根际土样品。经检测，土样基本性质如表1所示。

1.3 AMF的形态观察及其侵染能力的检测

采用Philips和Haymay染色方法进行观察和计算。

1.4 分子生物学方法分析样品多样性

1.4.1 总DNA的提取和纯化

采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤总DNA。

1.4.2 PCR扩增

采用由大连宝生物公司合成的引物AM1 和NS31扩增18SrDNA施测。反应体系为20ml.PCR扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检验。

1.4.3 群落多样性分析

采用T-RFLP方法分析样品，以图谱中每一个限制性片段（T-RF） 为一个OTU，测定OTU数目即为物种丰富度指数（S），峰高值低于100荧光单位的峰不计入分析范畴。根据丰富度指数（S）和相对峰高值（Pi）测定均匀度指数（E） 和Shannon多样性指数（H）。

相对峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N

均匀度指数（E）：E＝H/lnS

Shannon指数（H）：H＝－∑PilnPi

式中，N为该样品所有累计峰高，ni为第i个T-RF峰值。

1.5 数据分析

用表3中的实验数据代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）软件系统进行汇总和分析。

2 结果与分析

2.1 根际AMF的形态及其侵染率

从表2中可见，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四种植物中铁皮石斛的菌根侵染率最高，丹参最低。对比采样环境可以看出，侵染率与土壤性质有一定相关性。其中pH越高侵染率越高；侵染率与速效磷和速效钾呈反比。

2.2 群落多样性

2.2.1 样品总DNA提取和基因的扩增结果

从土壤中提取出的总DNA粗提样品中有大量黑褐色杂质，基因组片段大小为20 kb，用1%琼脂糖电泳检测，条带明亮齐整，这说明所得到的微生物总DNA比较完整。扩增的18 SrDNA基因片段长度为550 bp。

2.2.2 群落多样性指数

表3可见，4个样品的根际AMF多样性存在明显的差异。其中，丰富度指数和Shannon指数最高的是黄连，最低的是太子参，表明植物种类的差异对根际AMF群落多样性有影响。

3 结论和讨论

根际微生物活性及群落结构的变化是评价土壤生态系统的重要指示因子，通过观察其变化能够发现植物和土壤质量[6]。本研究表明，4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。由于植物种类的不同，AMF群落多样性也存在很大的差异。由此可见，宿主植物也会影响根际微生物群落结构多样性。但Oehl具有不同意见，他认为土壤类型和土地利用模式决定了AMF的群落结构[8]。

对于根际微生物来说，很多的环境因子都对其群落多样性影响很大，如有机质、pH和速效磷等，这是因为土壤微生物中的养分越高，营养物质就越多，这有利于其活性的增加。卜洪震等发现使用肥料后可以促进土壤微生物的活性，并且不同施肥处理对土壤微生物量碳和微生物多样性有着重要影响[7]。本研究中速效磷是影响AMF群落多样性的一个主要因素。而从O’Donnell 等[8]学者的研究成果来看，土壤pH值也是一个重要的土壤微生物群落多样性影响因子。徐辉[9]在现有研究成果的基础上展开进一步研究，发现速效磷也直接影响刺槐和沙棘根际AMF侵染率。在自然环境中随着环境因子的变化，土壤微生物群落的形成和变化也会随之调整，这说明土壤微生物的生长和环境因子有着直接关系。通过研究土壤微生物群落动态变化，也就为了解生态系统的土壤健康状况和植被发育阶段提供了可能。

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篇5

[关键词] 黄连；土壤；微生物；酶

黄连Coptis chinensis Franch属毛茛科多年生草本植物，具有清热燥湿，泻火解毒之功效，广泛用于肠道感染，对肺结核、猩红热、急性扁桃腺炎和呼吸道感染等也有一定疗效，是传统的大宗道地中药材[1-2]。在黄连种植过程中，通过茎叶淋溶，根系分泌和植物残体腐解等多种途径向土壤中释放小檗碱（berberine）、黄连碱（coptisine）、巴马汀（palmatine）、药根碱（jatrorrhizine）、甲基黄连碱（worenine）和表小檗碱（epiberberine）、小檗红碱（berberrubine）等化感物质[3]。其中，以小檗碱的分泌量最高，可达总分泌物的80%以上[4]。种植黄连后的土壤必须间隔2～3年才能再次种植，连作障碍极其严重。

相对于棉花-小麦-棉花轮作，棉花连作使土壤微生物种群数减少36.5%，种群结构改变，多样性指数显著降低[5]；在牧草地和种植芒果的土壤中，微生物碳氮量和标记性磷脂脂肪酸总量显著高于菜地，各磷脂脂肪酸的含量也因种植作物不同而异[6]；集约化农业生产降低土壤有机质，微生物种群减少，合理轮作能提供丰富多样的有机质，满足不同微生物的营养需要，微生物活性与种群数显著高于单一种植[7]；在黄花蒿种植过程中，所释放的青蒿素对土壤某些细菌产生抑制作用，土壤微生物的多样性降低，种群结构改变[8]；在种植丹参的根际土壤中，氨化细菌、固氮细菌、有机/无机磷细菌等显著减少，但亚硝化细菌、硝化细菌、反硝化细菌等微生物种群显著增加。因此可见，种植植物对土壤微生物产生深刻影响。

目前，关于黄连根系分泌物对土壤微生物影响的研究甚少，导致对其连作障碍的成因认识不足。此外，微生物是土壤酶的重要来源，其活性及种群对土壤酶产生潜在影响，而土壤酶催化土壤生物化学反应，如氧化还原、有机质降解、硝化与反硝化、腐殖质合成等，故微生物活性、种群与土壤功能密切相关[8]。作者利用不同浓度的黄连须根浸提液，通过培养试验研究了它们对土壤微生物及酶活性的影响，为揭示黄连连作障碍发生机制积累了资料。

1 材料与方法

1.1 供试样品 供试土壤为西南大学农场的中性紫色土，质地中壤、pH 6.68、有机质20.03 g・kg-1、全氮3.32 g・kg-1、有效磷16.43 mg・kg-1、速效钾119.8 mg・kg-1。采集0～20 cm耕作层，拣去杂物，风干，过1 mm 筛，取250 g土壤于500 mL塑料杯中备用。

供试黄连须根（fibrous root extracts of Coptis chinensis，REC）购自重庆市石柱县黄连有限公司，小檗碱50.20 mg・g-1，（80±1） ℃烘干，粉碎过2 mm筛。准确称取20.00 g，加1 L蒸馏水37 ℃浸泡72 h后抽滤，滤液用去离子水定容至1 L备用。

1.2 试验设计 考虑到1 g・L-1黄连根茎浸提液可抑制幼苗生长[4]，试验分别在供试土壤中加入0，6.25，9.375，12.5，25 mL黄连须根浸提液，即土壤中的黄连须根浸提液质量分数为0，500，750，1 000，2 000 mg・kg-1，相当于小檗碱质量分数为0，25，37.5，50，100 mg・kg-1，混合均匀。然后，加水至土壤最大田间持水量（24.29%）的（70±2）%，（25±1） ℃培养10 d。

1.3 测定项目 利用稀释平板分离计数法测定土壤中的细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）、真菌（马丁氏培养基）、放线菌（高氏一号培养基），自生固氮菌（Ashby无氮培养基）、磷细菌（磷酸钙+植酸培养基）、钾细菌（铝土矿培养基）、氨化细菌（蛋白胨琼脂培养基）和硝化细菌数量（改良Stephenson培养基B）[9-11]，并通过形态和生理生化反应等对自生固氮菌、磷细菌、钾细菌、氨化细菌和硝化细菌数进行鉴定确认，包括革兰氏和芽孢染色、好氧性测定，氧化酶、过氧化氢酶、MR和VP反应，葡萄糖氧化、甘露醇和乳糖发酵，脲素、淀粉和明胶分解，以及 H2S 和吲哚产生、柠檬酸盐、铵盐、硝酸盐、磷酸盐利用等[12]。

土壤微生物生物量采用氯仿熏蒸，0.5 mol・L-1 K2SO4 提取，提取液中的微生物碳和氮分别用K2Cr2O7氧化法和凯氏定氮法测定[13]。微生物磷脂脂肪酸（phosphor lipid fatty acids，简称PLFAs）的命名、提取和分析参照Frostegard和Kourtev方法[12]。将从土壤中提取并干燥的PLFAs溶解于正己烷中， 利用气相色谱（Hewlett-Packard 6890）测定， 载气为氦气， 补偿气体为氮气，助燃气体为空气， 流量分别为20～30，30，300 mL・min-1， 初始温度为70 ℃，保持1 min后，以20 ℃・min-1增加到150 ℃，再以5 ℃・min-1升至250 ℃，最后以10 ℃・min-1升至300 ℃。每个样品运行总时间31～32 min。依次采用3，5-二硝基水杨酸比色法、NH4+释放量和TTC比色法测定土壤转化酶、脲酶和脱氢酶活性[14]。

1.4 数据处理 用土壤PLFAs含量计算土壤微生物的种群特征值，包括多样性指数、均匀度指数和优势度指数等。Shannom-Wiener多样性指数H的计算公式为H =-∑Piln Pi，其中Pi= Ni/N， Ni为i PLFAs含量，N类微生物的PLFAs总量；Pielou均匀度指数J的计算公式为J =-∑PilnPi/lnS，S为PLFAs总含量；Simpson优势度指数D的计算公式为D = 1-∑Pi2 [15]。

用Excel 2003对试验数据进行基本计算，SPSS 19.0进行统计分析，显著水平设置为P

2 结果与分析

2.1 土壤细菌、真菌、放线菌数量 随着REC浓度的上升，土壤中的细菌、放线菌数量逐渐降低，而真菌则逐渐增加。当REC达到2 000 mg・kg-1时，细菌数量约比对照减少62.07%，放线菌数量约比对照减少65.90%，真菌数量却增加了约390.91%（表1）。

2.2 土壤磷细菌、钾细菌、自生固氮菌、氨化细菌和硝化细菌数量 土壤中加入REC后，随着浓度上升，土壤中的磷细菌、钾细菌、自生固氮菌、氨化细菌和硝化细菌的数量逐渐降低。在REC质量分数达到2 000 mg・kg-1时，它们的数量降低了62.50%～93.65%（表2）。

2.3 土壤微生物量碳、氮 土壤微生物量碳、氮的变化趋势同土壤微生物数量，即随着REC浓度提高，土壤微生物量碳、氮降低。当REC质量分数达到2 000 mg・kg-1时，土壤微生物碳减少了57.48%；土壤微生物氮减少了71.63%。其中，微生物氮的降幅显著大于微生物量碳，故微生物量碳氮比随REC浓度提高而降低（图1）。

2.4 微生物磷脂脂肪酸（PLFAs） 在REC 0，1 000，2 000 mg・kg-1的土壤中，分别检测出25，22，18种标记性PLFAs，包括代表细菌的11～19碳PLFAs，代表放线菌的10 Me 17：0和10 Me18：0，代表真菌的18：1ω9c，18：2 ω6，9，18：1ω9t，以及代表线虫的20：0（表3）。

从PLFAs总量看，对照最高，REC 1 000 mg kg-1土壤次之，2 000 mg・kg-1土壤最低，分别为1 260.3，1 091.6，971.4 μg・kg-1。在加入REC的土壤中，代表G+细菌的PLFAs降低了69.76%～82.61%，代表G-细菌的PLFAs降低了28.83%～51.86%，代表细菌的PLFAs总量降低了24.33～44.69%，代表线虫的PLFAs降低了38.22%～77.83%，代表真菌的PLFAs提高了25.91%～40.24%。

此外，REC处理土壤显著降低i-15：0，α-15：0，i-16：0，i-17：0，2-OH 10：0，2-OH 12：0，3-OH 12：0，Cy17：0，Cy19：0，11：0，14：0，15：0，20：0等PLFAs含量，但显著提高2-OH 14：0；13：0；18：2ω6，9；18：1ω9c；18：1ω9t等PLFAs含量，其余PLFAs变化不显著。在不同浓度REC处理的土壤中，真菌与细菌PLFAs的比值依次为0.355（REC 0 mg・kg-1），0.606（REC 1 000 mg・kg-1），0.900（REC 2 000 mg・kg-1），即真菌/细菌随REC浓度提高而增加。

2.5 微生物群落特征 利用PLFAs计算获得的植烟土壤微生物种群特征值，其中，多样性指数和均匀度指数对照最高，随着REC浓度加高，多样性指数和均匀度指数降低。但是优势度指数无显著变化（表4）。

2.6 土壤酶活性 REC对土壤酶活性的影响表现出多样性。随REC浓度增加，转化酶活性提高，当REC达到2 000 mg・L-1时，其活性比对照提高了21.07%；脲酶活性降低，当REC达到2 000 mg・L-1时，其活性比对照降低了26.47%；高低浓度的REC对脱氢酶活性无显著影响，变化在1.71～1.74 μg・g-1・d-1（图2）。

3 讨论

黄连属于多年生草本植物，从播种到收获一般需要3～5年，根茎入药，须根生长旺盛。在长期的生长过程中，根系分泌和须根死亡使大量的内含物进入土壤，可能对土壤理化和生物学性质产生持续深刻的影响。

众所周知，多样性指数表示生物群落中的物种多寡，数值愈大表示群落中的物种越丰富；优势度指数越大，生物群落内物种分异度越高[16]。一般而言，在稳定良好的生态环境中，生物种群丰富，多样性指数和均匀度指数较高，优势种群较多，分异度降低；反之亦然[17-18] 。在加入REC的土壤中，微生物多样性指数和均匀度指数降低，说明土壤环境不佳，不适合微生物的繁殖生长，种群减少，密度降低。因此，从微生物生态学的角度看，加入REC恶化了土壤生态环境。

在加入REC的土壤中，微生物碳氮量显著降低，说明土壤微生物生长繁殖总体上受到抑制。其中，细菌数量降低62.07%（培养计数），PLFAs从25种减少至18种，说明REC抑制土壤细菌生长繁殖，使细菌数量降低，种群减少。医学研究也表明，黄连中的有效成分――小檗碱的抗菌谱较广，对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、苏云金杆菌、幽门螺旋杆菌、滕黄微球菌、溶血性链球菌、霍乱弧菌、脑膜炎球菌、志贺痢疾杆菌、伤寒杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用，低浓度时抑菌，高浓度时杀菌 [19]。结构分析发现，小檗碱立体结构与四环素类和喹诺酮类结构叠合较好，提示小檗碱可能通过抑制细菌白体30S亚基或DNA回旋酶A产生抑菌作用。其中，小檗碱的季铵结构是抗菌活性所必须的结构，C2C3位的亚甲二氧基能增强抗菌活性[20]。但是，在加入REC的土壤中，真菌数量（培养计数）、生物量（以PLFAs计）显著提高，但细菌/真菌显著降低，说明在土壤细菌生长繁殖受到抑制的情况下，打破了微生物群落之间的生态平衡，真菌可能获得了生态优势而大量繁殖生长，改变了土壤微生物群落的种群结构。值得注意的是，在土壤真菌中，植物的病原真菌比例显著高于细菌和放线菌，REC提高土壤真菌数量可能增加病原菌相对量，可能是黄连后续作物大量发生真菌病害原因之一[21]。

磷钾细菌、自生固氮菌、氨化细菌和硝化细菌参与土壤磷钾活化和氮素转化，与土壤氮、磷、钾“三要素”的生物有效性密切相关[22]。试验表明，REC显著降低这些有益微生物的数量，故不利于固（供）氮、溶磷、解钾。此外，多数自生固氮菌、磷细菌和钾细菌属于根际促生细菌，能分泌生长活性物质，如生长素、细胞分裂素、玉米素等，促进植物生长[22]。因此，REC抑制这些有益微生物的生长繁殖不仅直接减少土壤养分供应，而且间接影响植物生长发育。土壤微生物是土壤酶的主要来源，催化土壤中的各种生物化学反应[23]。其中，脱氢酶参与土壤中的氧化还原反应，可总体上指示微生物活性[24]；转化酶参与蔗糖水解，关系到土壤有机质降解[25]；脲酶与土壤氮素的生物有效性密切相关[25]。在加入REC的土壤中，脱氢酶活性无显著变化，转化酶活性提高，脲酶活性降低，说明REC对土壤酶活性的影响表现出多样性。据报道，植物根系分泌物可改变土壤硝酸还原酶、吲哚乙酸氧化酶、多酚氧化酶等多种酶的活性，影响相关生物化学反应[4]。微生物种群不同，所分泌的土壤酶也不一样[26]。因此，土壤酶活性表现出多样性变化实际上反应了微生物不同种群对REC的敏感性不一样。REC对土壤酶活性产生的不同影响可能妨碍土壤生物化学反应的有序，使土壤中的物质能量转化处于混乱状态，造成土壤功能失调。

总之，REC显著降低土壤细菌数量、生物量和种群，包括磷钾细菌、自生固氮菌、氨化细菌和硝化细菌等多种有益微生物，但提高真菌数量；微生物群落多样性指数和均匀度指数降低，土壤生态环境恶化；REC对土壤酶活性的影响表现出多样性，可能破坏土壤生物化学反应的有序，造成土壤功能失调。

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Effect of fibrous root extract of Coptis chinensis on soil

microbes and enzyme activities

LI Yang-bo， HE Lin-wei ， ZHANG Wei， WU Ye-kuan， YUAN Ling， HUANG Jian-guo*

（College of Natural Resources and Environment， Southwest University， Chongqing 400716， China）

[Abstract] Coptis chinensis is widely used as Chinese medicine herbs and serious soil problems occur after continual cultivation of this medicinal plant. In the preset experiment， fibrous root extract of C. chinensis （REC） was added into soil to study the effect of REC on microbes and enzyme activity in soil. The results showed that both bacteria and actinomycetes decreased by about 2 times in contrast to fungi，which increased by about 3 folds. Phosphorus bacteria， potassium bacteria， azotobacter， ammonia bacteria， and nitrifying bacteria were also reduced significantly by REC， suggesting the inhibition of nitrogen biofixation and supply， mobilization of phosphorus and potassium， ad plant growth promotion as REC added into soil. There were multiple influences of REC on soil enzyme activities. Invertase activity was stimulated， while urease was inhibited and dehydrogenase unchanged by REC， indicating the interference of biochemical reactions in soil. In addition， type and total content of phosphorus lipid fatty acids （PLFAs）， the signature of microbes， decreased while the ratio of bacterium to fungus PLFAs increased as REC increased in soil， which suggested that fungi increased relatively with bacteria decreased thereby leading to easy occurrence of crop fungus diseases following cultivation of C. chinensis. The decrease in diversity and evenness indexes of microbial community in soil by REC indicated soil ecosystem deterioration and reduction of microbial groups and densities in soil. Therefore， allelopathic chemicals released from the roots of C. chinensis could change microbial community structure and resulted in serious soil problems by continual cropping of this medicinal plant.

篇6

关键词:宏基因组;不可培养微生物;筛选系统

中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3

0 引言

Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别。伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。

1 宏基因组的研究

1.1 DNA的分离

环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA 的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA。尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。

选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。

1.2 系统发生和宏基因组的分析

DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16S rRNA文库。这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16S rRNA基因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16S rRNA基因。序列分析还表明任何基因组中的16S rRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组。因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。

在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息。比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析。在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析。以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。

处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16S rRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平。van der Lelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在这些基因中,16S rRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平。

近年来,以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。

复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片。一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望。Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义。

直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行。在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。

1.3 筛选宏基因组表达文库

另外一种方法是通过构建和筛选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛选。直接筛选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的筛选系统,或者大量的可用的筛选的阵列。可以通过富集基因的方法来筛选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达筛选(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一种高通量的SIGEX筛选方法,他们将目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克隆。宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FACS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克隆。再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来筛选克隆子。这种筛选体系的机理是:分解代谢相关的基因能够在特定代谢物的作用下被诱导表达。

1.4 通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物

要大量精确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的相互作用。尽管“环境基因组”能够提供大量的信息,但对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Proteorhodpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibacter ubique证明了获取可培养单菌落的作用。Proteorhodpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Proteorhodpsin基因。通过培养Pelagibacter ubique,我们就有可能将Proteorhodpsin与固定的种类联系起来。

许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测序已经为我们提供了大量的信息并了解这些微生物在环境中的作用。

经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描述了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Koepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物能够在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法或者培养基适用于分离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出能够降解淀粉但生长缓慢的微生物。

在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地分离出来可以降低微生物群落的复杂性。Miteva和Brenchley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。

2 结语

要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更便宜更快捷的测序方法,环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它能够针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进行完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速发展的基础上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。

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篇7

如果有人向你提出这个奇怪的问题，你也许会不假思索地回答：人类就是人呀！然而生物学家会告诉你，我们人类，就是人与寄存在人体躯壳内的大量微生物共生的一个小小的生态系统。

通过基因测序研究人体微生物

早在300多年前，显微镜被发明后不久，科学家已观察到人体内存在微生物。然而，由于检测、分析技术等的限制，人们无法大规模地获取人体微生物群的构成、功能等详细信息，更无法进一步了解这些数量庞大的微生物群与人体是如何相互作用的。

从人类基因组的破译开始，人们才真正对这些微生物有了比较深入的了解。2000年6月26日，当美国总统克林顿与英国首相布莱尔共同宣布人类基因组计划工作草图完成时，整个世界都为之轰动。围绕着破译“生命密码”的研究，引起公众的广泛关注和讨论。很多人曾认为，只要读懂人类基因组代表的“生命密码”，人类的所有健康问题将会迎刃而解。然而，越来越多的科学家发现，人体除受自身基因的调控外，还受到人身上大量的共生细菌的影响。

2007年底，美国国立卫生研究院正式启动为期5年的“人类微生物组计划”，共投入经费1.4亿美元。该计划是继“人类基因组计划”完成之后一项规模更大的DNA测序计划，也被称为“人类第二基因组计划”。其目标是探索研究人类微生物组的可行性。通过绘制人体不同器官中微生物元基因组图谱（包括细菌、病毒等微生物），解析微生物群结构变化对人类健康的影响。同时，为其他科学研究提供信息和技术支持。我国作为参与者也一直积极推动初期研究工作。

欧盟也有类似的研究项目，例如，作为人类元基因组第七框架项目的子项目，人类肠道宏基因组计划就主要研究人类肠道中的所有微生物群落，进而了解人肠道中细菌的物种分布，最终为后续研究肠道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提供非常重要的理论依据。中国深圳华大基因研究院承担了该计划中的200多个欧洲人肠道微生物样品的测序及后续生物信息分析工作。

这一系列研究项目正在揭开人体微生物神秘的面纱。例如，研究发现肠道菌群结构的改变与失衡除了会导致肠道疾病外，还与糖尿病、肥胖等很多慢性全身性代谢性疾病有密切关系，甚至还与癌症有关。微生物甚至还影响着机体免疫系统的发育成熟。越来越多的研究提示，人类健康与人体微生物息息相关，随着人体与微生物之间的关系不断得到阐明，人们对于人体本身的认识、对于健康和疾病的认识以及医疗模式都有可能随之发生根本的改变。

研究发现微生物与人体健康息息相关

2010年3月4日，欧盟于2008年1月1日启动的人类肠道宏基因组计划的研究小组公布阶段性重大成果，引起世界的关注。该项研究成果收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本，采用了新一代大规模高通量的测序技术进行深度测序，产出近6千亿的碱基序列。经过序列组装和基因注释分析，从中获得330万个非冗余的人体肠道宏基因组的参考基因，大概是人自身基因的150倍。这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。从这个基因集中可以估计人肠道中存在1000种至1150种细菌，平均每个人体内含有约160种优势菌种，并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。也就是说，我们每个活着的人体内都有大约100万亿个微生物细胞，总重量约1.5千克。微生物细胞的数量是人体细胞的10倍，在人体的独特基因中占99.9%。它们的构成在很大程度上决定着人体的运转以及机能正常或失常。

美国人类微生物组计划在2012年集中公布了第一批研究数据，来自多个国家的超过200名科研人员报道了他们5年来的研究成果。他们分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。他们发现，来自牙齿和粪便的微生物样本其类型和遗传多样性是最强的;来自皮肤和脸颊内侧样本的多样性次之;而来自阴道样本的多样性是最低的。

科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如，印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。例如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6个月至9个月的时间来获得第一组600～700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。

同时，人体微生物还与免疫系统有着密切的关系。2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成，如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有可能出现自身免疫性疾病等病态变化。研究者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自身免疫性疾病症状的新方法。同期《科学》的另一项研究也提示，在生命早期接触微生物可以减少哮喘或炎症性肠病等疾病的发生。

人类肠道菌群与肥胖

随着科学家们研究的深入，我们对人类体内的微生物，尤其是肠道内的菌群，有了更多的了解。人类的消化系统实际上是一个复杂的生态系统，成百上千种细菌在那里开展各种活动，比如，让未消化的碳水化合物发酵、提供维生素，等等。它们还能调节你身体储存的脂肪量。

不过，并非每个人都有同样的肠道菌群。而且，有趣的是，菌群的组成与肥胖有关。当然，这种关系可能很简单，胖人的饮食不同，所以，他们的肠道菌群也不同。

2013年《科学》杂志发表的一项研究表明，这种因果关系也有可能颠倒过来。研究人员从一些双胞胎小鼠身上取出细菌，双胞胎中有一只肥胖，另外一只不胖。然后，他们将细菌移植到不同的小鼠身上。接受了肥胖双胞胎菌群的小鼠体重增加了，其他小鼠则不然。这些小鼠的进食没有增加：是它们的新陈代谢变化导致了体重增加，即使摄入的热量不变。

那么，是什么决定了你的肠道菌群呢？有可能是抗生素、环境毒素或食品的加工方式。《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究表明，肥胖似乎能在社交网络中“传染”，让朋友和邻居感染上肥胖。我们以前一直认为，那是物以类聚、人以群分的结果―这也确实是部分原因。不过，会不会是肠道菌群也可以在非常亲密的人之间传播，所以，肥胖或许真的可以传染？

生物因素和行为因素之间往往存在相互作用，比如流感的传播就跟我们是否勤洗手关系巨大。同样地，这项对细菌的研究也发现，只有当小鼠的饮食中含有大量饱和脂肪时，“肥胖肠道菌群”才会起到作用。

最有趣的大概是，改变生物因素甚至可以改变人的欲求。一些生物学家推测，我们的肠道细菌其实驱动了我们对某些不健康食品的渴求。所以，重视生物因素并不等于淡化行为因素，而是意味着从更多的维度理解它。

我们身上的微生物正在发生变化

关于人类和与人类共存的微生物，正在发生一些值得我们忧虑的变化。就像全世界的生态系统一样，人类微生物菌群正在失去它们的多样性，以至于可能会损害它们所寄居的主体的健康。

纽约大学医学院传染病专家、 人类微生物组计划负责人马丁・J・布拉泽博士在过去30多年间，一直研究细菌在疾病中发挥的作用。除传染病外，他的研究范围还囊括了自体免疫疾病，以及其他在世界范围内急剧增加的疾病。

布拉泽在他的新书《消失的微生物》中表示，微生物组多样性的减少导致我们更容易感染严重且通常都是慢性的疾病―从过敏、乳糜泻到一型糖尿病和肥胖症。布拉泽及其他人认为，这主要是由抗生素造成的。

布拉泽表示，抗生素很早就开始对微生物多样性产生破坏。普通的美国儿童在出生的头两年要接受大约3个疗程的抗生素，在接下来的8年里，要再进行8个疗程。很短疗程的抗生素治疗就能致使人体的微生物环境发生长期转变，比如，被广泛使用的阿奇霉素。

抗生素并不是破坏平衡的唯一因素。布拉泽接受采访时表示，近几十年，选择剖腹产的人激增，剖腹产促使婴儿内脏中的微生物来自母亲的皮肤，而不是产道。

微生物组的变化能够改变婴儿的新陈代谢和免疫系统。最近，研究人员查阅了15项共涉及16.3796万个分娩案例的研究，结果发现，与顺产的婴儿相比，剖腹产婴儿成人后超重的几率要高26%，肥胖的风险要高22%。研究人员发现，人的胎盘有自己的微生物组，这个微生物组可能也有助于婴儿的内脏健康，减少由剖腹产引发的微生物损耗。

其他研究发现了正常体重者与肥胖者肠道中微生物的主要差异。虽然这些研究不能说明最先出现的是那个问题―体重问题或微生物组的变化，但研究说明，肥胖的老鼠体内存在能够更好地从食物中吸取热量的肠道菌群。与肥胖相关的进一步证据来自农场里的动物。在美国出售的抗生素中，大约有3/4都用在牲畜身上。这些抗生素改变了动物的微生物菌群，加快了它们的生长速度。布拉泽说，当我们把用于牲畜的抗生素用在老鼠身上时，它们的新陈代谢就会发生改变，并促使它们的体脂增加。

更严重的是，如今有越来越多严重的功能失调都与人类内脏的微生物平衡被破坏有关。其中，有多种功能失调在发达国家中变得越来越常见，如克隆氏症、溃疡性结肠炎和乳糜泻胃肠疾病等;心血管疾病;非酒精性脂肪肝;慢性反流症等消化失调问题;多发性硬化和风湿性关节炎等自体免疫性疾病以及哮喘和过敏。

有些研究人员甚至推断，内脏微生物菌群失调是造成乳糜泻的原因，所以，甚至连没患这种病的人对无麸质食物的需求也会激增。乳糜泻旧称非热带脂肪泻，又称乳糜腹泻、麦胶引起的肠病（简称麦胶肠病）。乳糜泻是一种具有遗传性的发生于小肠的自身免疫性疾病，从婴儿到各年龄段的人都会罹患。乳糜泻的症状包括慢性腹泻，生长迟滞（儿童）和疲劳，但有些人症状不明显。在北美、北欧、澳大利亚发病率较高，我国国内很少见。

布拉泽和其他研究人员，还有来自瑞士和德国的一组研究人员也认为，哮喘患病率的大幅上升与“幽门螺杆菌从西方社会快速消失有关”。众所周知，幽门螺杆菌是一种长期寄存在人类胃里的细菌性病原体。曾几何时，几乎每个人体内都有这种细菌，欧洲研究者已经证明，它能防止老鼠出现过敏性哮喘的症状。在人生命的早期阶段，幽门螺杆菌的存在能促使血液中产生T细胞。布拉泽表示，压制过敏反应就需要这种细胞。他的研究表明，虽然有些类型的幽门螺杆菌与消化性溃疡和胃癌有关，但其他类型则具有保护作用。布拉泽和同事的研究进一步表明，胃部的幽门螺杆菌能够防止胃食管返流疾病、巴雷特氏食管（食管下端有不正常的柱状上皮覆盖，称之为巴雷特氏食管。普遍认为是后天获得的，并与反流性食管炎密切相关，并有发生腺癌的可能）和食道癌。

研究者不是总能说明肠道菌群紊乱会在人们生病之前还是之后出现。不过，对实验室动物的研究往往表明，菌群紊乱会发生在生病之前。

篇8

【关键词】人工湿地；微生物；种群特征；人工调控

人工湿地是一种集环境效益、经济效益及社会效益于一体的污水处理技术。该技术是通过人工建造、模拟自然湿地的综合性生态体系，利用人造生态系统中的物理、化学和生物的协同作用来实现对污水的净化。在湿地系统中，微生物群落是去除有机物和脱氮除磷的主要承担者，越来越多的证据表明，微生物是人工湿地处理污水过程的重要指标。因此，探索和研究湿地系统中微生物的种群特性，对了解人工湿地的去污机理以及研究微生物群落的人工调控技术具有重要意义。

1.湿地微生物种群研究现状

1.1湿地微生物多样性分析

微生物多样性的研究主要是通过对湿地微生物的分离、鉴定来进行的。在人工湿地系统中，以细菌数量为最多，其次为放线菌，真菌数量最少。细菌又包括好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌、硝化细菌、反硝化细菌及磷细菌等。夏宏生等研究发现，氨化细菌是除氮的优势菌群，随着人工湿地的运行，其数量逐渐增加；硝化细菌属于好氧细菌，随着人工湿地的连续运行数量有所下降；反硝化细菌受外界气温影响较大，随着气温的逐渐升高，其细菌数量逐渐上升。魏成等认为，混合种植植物模式的人工湿地系统可获得较高的根际微生物功能多样性，从而提高湿地系统净化效率及其稳定性。蒋玲燕等研究表明，植物对微生物多样性的作用要优于填料；而多种植物系统与多种填料系统在有机物降解和营养物去除方面均比单一植物与单一填料系统有优势，从而表现出更高的去污效率。

1.2湿地微生物群落分布特征

微生物群落结构，即微生物不同类群的相对丰度，可通过各微生物类群的特征脂肪酸的相对含量表征。吴振斌认为，湿地基质中好氧原核微生物为优势类群，其次为革兰氏阳性细菌及其他厌氧细菌，真核微生物所占比例最低。Zhou等人的研究发现，湿地基质表层的细菌与真菌的数量显著高于其下层的数量，随着系统的垂直高度不断加深，真菌的数量逐渐减少。张政等人采用潜流水平湿地系统进行研究时发现，沿水流方向细菌、亚硝酸菌总数的总体趋势是递减的，即前部多于中后部；在垂直方向上，上层的微生物数量多于下层。

1.3湿地微生物酶及其活性研究

湿地系统中酶的活性是微生物功能的一种体现，其活性高低直接影响着污水的净化效果。李智等测定了人工湿地酶活性，发现人工湿地基质中酶活性下行池大于上行池，基质上层磷酸酶、脲酶和蛋白酶的活性显著大于中下层基质；不同时间的基质酶活性不同。何起利等研究发现，湿地中的氧化酶活性表现为表层高于中下层；而硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等活性变化趋势则相反；同时，多酚氧化酶、过氧化氢酶、脱氢酶等氧化酶活性也与氧化还原电位存在显著正相关，而与下行流池的硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶等还原酶类存在显著负相关关系。吴振斌等认为，不同月份、不同深度湿地基质酶活性不相同；不同湿地类型其酶活性也不相同；脲酶活性与湿地系统凯氏氮的去除率之间存在显著相关性。综上所述，人工湿地中各种酶活性会受到空间、污染负荷、污染物类型等因素的影响，因此可通过改变人工湿地的外部条件来调控胞外酶使其达到最佳的处理污水的状态。

2.湿地微生物调控技术研究进展

湿地微生物调控是指在研究湿地微生物的种群特征及酶活性的基础上，通过控制影响微生物分布及活性的各种因素（如温度、碳源、溶解氧等），以达到提高人工湿地处理污水效率的一种技术。通过人工调控强化湿地微生物对污染物的降解能力对人工湿地的高效运行十分重要。

2.1水温

温度变化不仅影响湿地系统中微生物的代谢速率，而且还影响到其他重要环境因子，这些因子往往会影响到微生物群落的结构和功能。有报道称，当温度在10℃左右时，硝化速率比较稳定；但低于10℃，人工湿地系统处理效果会明显降低；当温度在5℃以下时，反硝化过程就很难发生；而若温度过高，在30℃以上时，硝化与反硝化过程均会受到抑制。湿地系统中微生物的种类和数量会随季节的改变而变化，一般情况下，夏秋季数量最高，冬季最少。雒维国等对湿地植物采用多层PVC透气薄膜进行保温，可增加湿地系统温度，从而提高了COD、TN和TP的去除率。

2.2碳源

微生物的新陈代谢过程受碳源影响较大，可以说碳源代谢功能是湿地微生物活性的重要表征，也是影响生物脱氮过程的关键因素。对于低碳氮比污水，则需要在湿地系统中补充碳源，为反硝化过程提供充分的电子供体，强化湿地脱氮功能。赵联芳等在用葡萄糖调节进水C/N达到8时，TN去除率由未补充碳源之前（C/N=2）的55%升高到89%。佘丽华等指出，向人工湿地系统中投加葡萄糖作为外加碳源提高系统的反硝化能力要优于羧甲基纤维素；对于处理量为60L・d1的复合垂直流人工湿地最佳的葡萄糖投加量为1.5g；在进水前4h投加碳源要优于进水时加入碳源。魏星等认为，补充植物秸秆后，可以解除由于有机碳源不足产生的硝态氮、亚硝态氮积累，提高总氮的去除效率。

2.3 pH值

一般认为，当pH值在7.0～8.0时，有利于好氧和厌氧微生物对含氮有机物的氨化作用的发生，此时亚硝化细菌和硝化细菌活动增强，硝化作用占主导地位；pH>8.0时，氨氮的挥发作用占主导地位；pH

2.4溶解氧

有研究表明，当水中DO0.2mg/L时，反硝化作用受到抑制。在除磷过程中，厌氧条件通常与湿地中磷的释放有关，而好氧条件与湿地中磷浓度的降低有关。陶敏等的研究表明，氧调控下微生物群落向基质纵深发展，微生物量明显增加；表征微生物活性的PLFAs总不饱和度水平显著升高。

3.结语与展望

微生物群落是人工湿地污水净化的主要承担者，在污染物的去除过程中发挥着重要作用。然而目前对湿地微生物种群特性及其调控技术方面的研究仍相对较少，因此，根据目前的人工湿地微生物种群研究现状，笔者认为今后可重点开展如下研究：（1）筛选、驯化人工湿地功能微生物，特别是针对重金属污水、油田废水、养殖废水等特殊污水中功能微生物的开发与利用以强化体系的净化能力。（2）通过液态、固态培养基交替培养纯化，驯化出在低温条件下仍能保持较强活性的耐冷硝化菌株，使硝化过程在冬天较低温度条件下仍可正常进行，从而提高湿地在低温条件下的脱氮效果。总之，加强湿地微生物群落特征和调控技术研究，既能为湿地生态技术奠定微生物学的理论基础，同时有利于指导人工湿地的设计、运行和管理，这对于今后湿地污水净化技术的发展和创新有着十分重要的意义。

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篇9

研究方法

本研究通过实地观测获得环境监测数据,并综合运用生态学、经济学理论方法,对“绿色南京”林业工程新增林的主要生态功能及价值进行研究分析,结合现有数据,选取适宜的评价指标构建评价指标体系,确定评价方法,定量分析和评估“绿色南京”林业工程建设10年来新增林的碳氧平衡、水土保持、净化空气、生物多样性保护、森林游憩等主要生态服务经济价值。

1调查与测定方法

1.1空气质量2012年6月22~24日先后测定南京化学工业园区和扬子石化周边的六合葛塘和平庄山庄组（样点Ⅰ）、六合葛塘新华路（样点Ⅱ）和六合长芦河东社区（样点Ⅲ）3个样点的杨树林SO2、NO2、总悬浮颗粒物（TSP）、空气微生物的含量,同时测定相应的无林地对照区域。每天分为3个时段测定,分别为08:00、12:00、17:00,计算日平均值。SO2、NO2和TSP的测定参考文献的方法进行,空气微生物的测定参考文献的方法。

1.2小气候观测2012年7月9~12日,分别测量长江防护林（杨树林和柳树林）和高速公路边杨树林及其相应的无林地对照区的气温,天气情况为多云、无风或微风。每样点从10:00到17:00每小时测量1次。测定时干湿球温度计距离地面150cm,直接测定环境气温,用湿球温度与干球温度相比求得空气相对湿度。采用TES-1352A声级计测定噪音情况,用通风干湿仪、QDF-3型热球式电风速仪、地温表等仪器测定被测样地内和对照样地的气温、地温（0、5、10、15、20cm）、相对湿度、平均风速。

1.3生物多样性测定林下生物多样性主要包括林下植物和动物。选择“绿色南京”建设典型样地,每个样地设16个样方（重复）,样方内记录林木的胸径、高度、冠幅,并调查、测定林下植被的种类和生物量。林下动物（昆虫、蜘蛛等）主要采用扫网法、陷阱法、每株调查法、直接捕捉计数法等方法,野外采集,室内鉴定分析;土壤生物多样性主要包括地表凋落物中的节肢动物、土壤线虫、土壤原生动物和土壤微生物,通过野外采集、室内鉴定分析;鸟类生物多样性主要通过实地调查的形式来完成,在一定的时间和一定的范围内观测鸟的种类和数量,定性和定量相结合。

2生态价值计算方法

2.1碳氧平衡价值“绿色南京”工程主要栽种的为杨树、广玉兰、香樟、雪松等,且大多在2003~2006年栽种。以杨树为例，通过野外调查发现2012年8月杨树胸径大多在20cm左右,树干高6m左右,密度500棵/hm2,目前新增林地面积约55000hm2。经计算得出,截至2011年新增林的木材总蓄积量为197万m3。根据木材蓄积量计算固碳释氧的总量,最后根据碳税法和工业制氧价格分别计算固碳和释放氧气的经济效益。

2.2吸收SO2价值《中国生物多样性经济价值评估》显示,针叶林对SO2的吸收能力为215.6kg/hm2、阔叶林为88.65kg/hm2,由于“绿色南京”新增林绝大部分为阔叶林,因此新增林对SO2的吸收能力按照100kg/hm2计算。在我国SO2的治理费用为0.6元/kg。吸收SO2的价值=0.6元/kg×100kg/hm2×林地面积（hm2）

2.3吸收NO2价值当氮氧化物的发生量为106.7万t时,林木的吸收量为6.0kg/hm2,可能的吸收率为3.5%。吸收NO2的价格采用中国大气污染物筹资型排污收费标准的平均值（1.34元/kg）。吸收NO2价值=1.34元/kg×6.0kg/hm2×森林面积（hm2）

2.4滞尘价值一般而言,阔叶林的滞尘能力为10.11t/hm2,针叶林为33.2t/hm2。由于“绿色南京”林业工程新增林大部分为杨树等阔叶树,因此滞尘能力为10.11t/hm2。阻滞降尘的价格采用燃煤炉窑大气污染物排污收费的平均值,即0.56元/kg。滞尘价值=0.56元/kg×10.11t/hm2×阔叶林面积（hm2）

2.5降噪价值根据防护林对交通噪音的降噪效果,采用替代法,对林地降噪的生态经济价值进行估算。即按照目前市场上隔音板价格及隔音效果,换算出减弱噪音的单价是50元/（dB•m）,其中m是隔音板的长度,换算成等效减噪林带,计算公式为:降噪价值（W）=林带长度（L）×植被减弱噪音单位价格（C）×减弱噪音分贝。

2.6净化空气微生物价值V0=aTq（1/K-1）式中:V0为森林净化空气微生物的价值;a为净化空气微生物价值占森林总生态价值的比例系数（通过调查评价和专家评议为15%）;T为森林立木价格（树干为800元/m3）;q为林木蓄积量;K为森林直接实物性使用价值占森林有形和无形总价值的比例系数,一般按10%计算。

2.7涵养水源价值采用降水储存量估算模型计算涵养水源价值,森林截留的降水量占总降水量的50%,水的成本为1元/t。涵养水源价值=年平均降水量（1200mm）×森林面积×50%×水价（1元/t）

2.8固土保肥价值J=k•S•g•d式中：J为固土效能经济评价值（元）,即防止泥土流失的效益值;k为挖取泥沙费用（1.5元/t）;S为森林总面积（hm2）;g为进入河道或水库中的泥沙占总泥沙流失量的比值（1/2）;d为有林地比无林地减少的侵蚀量（0.003685t/m3）。保肥效益仅计算N、P、K3种主要养分的损失量,将土壤中纯N、P、K分别换算成尿素、过磷酸钙和氯化钾的量。采用公式I=d×S×∑P1P2P3计算。式中:I为森林保肥效益值（元）;d为有林地比无林地减少的侵蚀量（0.003685t/m3）;S为森林总面积（59237hm2）;P1为林区土壤中N、P、K含量,分别为0.090%、0.054%、1.55%,N、P、K的含量通过野外不同林地种类的土壤采样,室内分析计算得来;P2表示纯N、P、K折成化肥（尿素、过磷酸钙、氯化钾）的比例,分别为60/28、506/62、75.5/39;P3为各类化肥在当地的销售价,尿素、过磷酸钙、氯化钾平均价格分别为1800元/t、460元/t和2200元/t。

2.9生物多样性保护价值采用生物多样性指数计算森林生态系统保护生物多样性的功能。森林对生物物种资源的保护价值采用U=S•A计算。式中:U为生物多样性保护价值;S为单位面积森林年生物物种资源保护价值,根据Shan-non-Wiener指数（H′）得出“绿色南京”林业工程新增林中,经济林单位面积的生物多样性保护价值为6000元/hm2,其他林地平均为3万元/hm2;A为林地面积（hm2）。

结果与分析

1碳氧平衡作用树木作为生态系统中的生产者,在吸收CO2的同时释放O2,给人们带来了巨大的效益,是城市森林的最基本的生态服务。采用碳税法（即向大气排放CO2的税费）计算固定CO2的经济价值,固定CO2率即CO2340元/t。根据活立木的蓄积量计算出2011年吸收CO2的量为202万t其经济价值为9.87亿元。采用工业制氧价格（400元/t）来计算植物释放O2的经济价值。根据活立木的蓄积量计算出2011年释放的O2量为149万t其经济价值为6.95亿元。最后得出2011年“,绿色南京”工程碳氧平衡的经济价值为16.82亿元。然后根据每年的林木蓄积量计算出“绿色南京”林业工程实施10年新增林的碳氧平衡的总价值为42.73亿元。#p#分页标题#e#

2对空气质量的影响

2.1吸收空气中SO2、NO2和TSP由表1可见,3个样点林地内的空气SO2浓度均低于林地外,林地内和林地外的空气SO2浓度均在0.01~0.02mg/m3之间,均达到国家一级标准（≤0.05mg/m3）。与SO2一样,3个样点林地内的NO2的浓度均低于林地外,且林地内和林地外的空气NO2浓度均达到国家一级标准（≤0.08mg/m3）。3个样点林地内的TSP含量分别为0.16、0.18、0.11mg/m3,均低于林地外,3个区域的杨树林滞尘率分别为28%、36%、15%。提示林地可以减少空气中的SO2、NO2和TSP含量,改善空气质量。通过前面的方法计算出“:绿色南京”林业工程实施10年新增林吸收SO2、氮氧化物和滞尘价值分别为25.63亿元、7400万元和27.95亿元。

2.2净化空气微生物3个样点林地内外的细菌、真菌和放线菌含量均处于清洁到微污染的范围内。空气微生物中均以细菌含量最高,范围为40%~90%。植物可以通过其本身滞尘、防风和吸附等作用减少空气中的微生物数量,但本研究结果得出林地内的空气微生物含量要高于林地外,这是由于夏季林地内湿度较大,有利于空气中微生物的生长繁殖,导致林地内空气微生物含量的增加。若林地卫生状况较差,如垃圾堆积等,则很有可能增加空气中微生物的含量,因而要加强对林地的管理,保证林地清洁、卫生的空气环境。而林地外的空气干燥,温度较高,紫外线强,不利于微生物的繁殖。通过计算,得出“绿色南京”林业工程实施10年新增林净化空气微生物作用产生的经济价值为81.29亿元。

2.3降噪作用由表2可见,机场高速的景观绿化及防护林带具有十分显著的降噪效果。距离机场高速越远,噪音值越小。机场高速防护林外侧噪音指标,全部达到国家标准允许范围。根据防护林对交通噪音的降噪效果,计算出“绿色南京”林业工程实施10年新增林的降噪总价值为16.26亿元。

对小气候环境的影响

1降温增湿以机场高速边的林地内外对比情况来说明林地的小气候效应。对8年林龄的杨树林观测表明,夏季白天防护林有较为明显的降温效果,观测时段内平均温度降低1~2℃,其中12:00~16:00时近2℃。同样,防护林还可以降低地温,地表温度降低幅度最大,高达15~30℃,其他深度（5、10、15、20cm）平均降幅为3~5℃。此外,防护林可以提高相对湿度10%~30%。长江防护林的杨树林和柳树林的观测结果趋势和高速公路防护林相近。

2降低风速由图1可见,防护林对降低风速有显著作用,平均降低风速约1m/s。

生物多样性保护价值

1植物多样性“绿色南京”林业工程建设的新增林地在保护生物多样性方面的作用非常明显。造林后自然演替的林地物种丰富度比人为干扰的林地高,种群结构更复杂。经过6~8年的演替,已经或正在形成新的群落结构,由于林地的生长发育,林地的郁闭度增加,林下阳光辐射减少,林下植被的总类和生物量与2005年的调查相比有所下降,但同时也有新的木本植物生长,进一步优化了林地的群落结构。人工林栽后自然演替的最初回归的乡土木本植物有构树、桑、楝树、乌桕、榆、野蔷薇、白杜、柘树、泡桐等,还包括归化种刺槐、枫杨等。

2鸟类和其他动物多样性鸟类以白鹭、野鸡、鸥类、椋鸟、燕子、喜鹊、麻雀等较为常见。哺乳类野生动物主要有野兔和野猪。

3土壤生物多样性3个样点林地内共有节肢动物27目,总体个数1309,真螨目在各林地均占到了所有节肢动物总量的70%左右。此外,鞘翅目、弹尾目、双翅目、等足目、寄螨目、等翅目、膜翅目、半翅目、双翅目幼虫、鳞翅目幼虫也较多,占整体数量的1%~5%,为林地的常见类群。土壤线虫平均密度为3.21头/g干土,其中植食线虫和食细菌线虫为优势种群,密度最大;土壤原生动物的平均密度为6103头/g干土,其中鞭毛虫比例最大（70%~90%）,其次为变形虫,而纤毛虫比例最小（1%~5%）;与无林地相比,林地改变了土壤的微生物群落结构。经计算“,绿色南京”林业工程新增林的生物多样性总价值为71.11亿元。

4涵养水源和固土保肥价值涵养水源是林地的重要生态功能之一,属于非消耗性的利用价值。林地被称为“绿色的海洋”“看不见的水库”。林地通过林冠截留、枯枝落叶层和其他植被对地面的保护,能大大削弱雨水对地面的侵蚀,提高地表的吸水性能,减小地表径流对土壤的冲刷,从而保护土壤,减少土壤侵蚀,达到固土保肥作用。通过计算得出“,绿色南京”林业工程新增林地涵养水源和固土保肥经济价值分别为29.64亿元和12.75亿元。

5森林游憩价值森林游憩价值是森林多重价值的重要组成部分,也是森林经营的重要目标之一。森林为人类提供美丽的自然风景和旅游景观,与人类的生活、居住、娱乐等休戚相关。根据南京市林业局已有的统计数据,再结合实际情况,最终按照每个公园和森林农庄年收益分别为700万元和50万元计算“,绿色南京”林业工程主要新增公园和森林农庄的年均收益共计4.31亿元,因此“绿色南京”林业工程实施10年来的总收入为43.10亿元。

6生态效益价值总体评价由表3可见,2002~2012年“绿色南京”林业工程新增森林的生态效益总价值为351.15亿元,平均35亿元/年。其中,净化空气微生物价值最大,为81.29亿元,占生态服务总价值的23.15%;其次是生物多样性保护价值,为71.11亿元,占生态服务总价值的20.25%;森林游憩、碳氧平衡价值也较大,分别占生态服务总价值的12.26和12.17%;生物多样性保护价值和碳氧平衡价值占了生态服务总价值的近50%。但不同的研究所得出的结果相差很大,胡海胜研究得出森林游憩价值最大,占总价值的65%左右;邓燔（2007）认为森林生物多样性保护价值最大,占了整体总价值的42%。这与不同森林的主要生态服务重点不同有关,例如,高速公路边森林的生态服务主要以降噪为主,森林公园的生态服务主要以休闲游憩为主;其次还与不同的研究者所采用的评估方法不同有关。

篇10

关键词：转植酸酶玉米；根际微生物；秸秆还田；多样性

中图分类号：S154.38文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）03-0071-05

植酸酶（phytase）是一种新型的、可作为动物饲料添加剂的重要酶制剂，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，具有特殊的空间结构，能够分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。研究表明植酸酶可以降解玉米、大豆中含有的植酸磷，释放可被动物利用的无机磷，提高饲料中磷的利用率，减少饲料中磷酸氢钙的添加量，降低饲料成本；植酸酶还能提高动物的生产性能，减轻因动物高磷粪便所导致的环境水域的磷污染[1]。

近年来随着转基因玉米的迅速发展，转植酸酶玉米已步入商品化生产领域，其安全性问题日益受到重视[2]。目前，国内外学者对转植酸酶基因玉米的安全性检测主要集中在食品安全性方面，虽然转植酸酶玉米表达的植酸酶本身对动物及人体不会产生危害，但是转基因植物中抗性标记及外源基因的引入会产生基因水平的转移和突变[3]。转植酸酶玉米种植过程中，植酸酶可通过根系分泌物、秸秆还田、残茬分解以及花粉飘落等进入土壤生态系统并积累和富集，可能会影响土壤微生物群体的组成和结构，还可能改变土壤的微生物多样性[5，6]。因此，研究转植酸酶玉米对土壤微生物群落及多样性的影响对转植酸酶玉米的生态风险评价有着极为重要的意义。

目前，国内外大部分转植酸酶玉米的研究多局限于温室内或人工培养条件下，在自然条件下研究较少。而土壤是复杂的基质，不同地域的土壤生态环境有可能对试验结果产生不同的影响，因此温室内或人工培养条件难以真实地反映转植酸酶玉米与根际微生物之间的关系。本试验主要在大田自然条件下进行，研究转植酸酶玉米对土壤根际可培养微生物和细菌生理群多样性影响，有助于直观地表现土壤微生态系统中的群落结构和稳定性，以及从群落角度科学评价转植酸酶基因玉米种植的土壤生态风险，以及为转植酸酶玉米土壤生态安全风险评价提供参考。

1 材料与方法1.1 试验材料

玉米品种为转植酸酶玉米奥瑞金（品种为10TPY005），非转植酸酶亲本玉米（蠡玉35）及郑单958作为对照。1.2 试验设计

田间试验位于东平试验田内，土壤为褐土，有机质含量22.09 g/kg ，碱解氮含量32.44 mg/kg，速效磷含量9.82 mg/kg，速效钾含量90.56 mg/kg，pH为8.3。试验设转植酸酶玉米（奥瑞金）、非转植酸酶玉米（蠡玉35）和空白对照（郑单958）3个处理，随机区组设计，除空白对照外重复3次，小区面积15 m×15 m，株距20 cm，行距60 cm。玉米生育过程中不施肥不喷洒农药，其他按常规管理。

玉米于2011年7月10日播种， 10月22日收获。期间在玉米苗期（7月21日）、拔节期（8月17日）、喇叭口期（8月25日）、抽雄期（8月31日）、抽丝期（9月7日）、乳熟期（10月17日）采用五点取样法，分别取样，每小区取接近玉米根际土样5个，取样深度15 cm左右，轻轻去除2 cm表层土，将剩下的土放入灭菌封口袋中做好标记，带回实验室，-4℃冰箱保存备用。