微生物多样性分析方法范文

导语：如何才能写好一篇微生物多样性分析方法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

烟草青枯病是烟草的重要病害之一，几乎分布于世界上所有的烤烟种植区，其中热带和亚热带烟区发病尤为严重［1］。在我国，烟草青枯病是危害南方烟区烟叶生产的主要病害，一旦发病往往会造成整株死亡，造成重大经济损失［2-3］。目前，在烟叶生产过程中尽管采用化学药剂防治［4-6］、生物防治［7-9］、合理轮作［8，10-11］、种植抗病品种［12-14］、调整土壤微生物和调整烟苗移栽期等综合措施来防治烟草青枯病［15］，但仍无法有效控制该病的发生。在烟草青枯病生物防治研究方面，目前主要是利用青枯菌的拮抗微生物来防治烟草青枯病，虽然筛选拮抗微生物及其在实验室或温室中拮抗试验效果不错的研究报道较多［16-18］，但是在大田生产上却鲜有应用成功的报道。主要原因之一是植烟土壤是一个复杂的生态系统，耕作层土壤中微生物众多，包含细菌、真菌和病毒等,其微生物的多样性和复杂性对青枯菌的拮抗微生物定殖和扩繁有一定影响。因此，分析烟草青枯病土壤中微生物的群落结构，将有利于拮抗微生物的定殖、扩繁和拮抗作用的发挥。目前，对土壤微生物群落的分析，尤其是快速分析非常困难［19］，随着分子生物学和生物信息学的快速发展以及PCR（PolymeraseChainReaction）技术的日趋成熟，一些建立在PCR技术基础上的分子生物学分析方法如变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE）［20］、末端限制性片段多态性（terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP）和16S保守区域片段文库的构建［21］等技术已经发展起来。这些方法不需要培养、分离和纯化微生物，也不受微生物是否可在实验室培养的限制,解决了传统微生物多样性分析中的一些分离培养方面的问题。本研究利用微生物保守区域片段文库构建，初步分析了烟草青枯病土中细菌、真菌的多样性，旨在为利用青枯病拮抗菌有效防治该病害提供依据。

1材料与方法

1.1材料烟草青枯病土壤取自贵州省烟草科学研究所福泉烟草青枯病病圃。五点混合法采集土壤样品，取土壤表层8~20cm的土层，过0.2mm筛，去除杂质。微生物保守区域片段的扩增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNAMarker、dNTPs、DNA聚合酶、连接酶、克隆载体等试剂购自大连宝生物（TAKARA）有限公司；序列测定由上海生工生物有限公司完成。

1.2方法

1.2.1土壤总DNA的提取和检测采用玻璃珠均质和液氮研磨法相结合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用纯化试剂盒纯化获得DNA。采用琼脂糖凝胶电泳法检测土壤微生物总DNA和PCR扩增产物。

1.2.2PCR扩增与DNA纯化以土壤微生物总DNA为模板，8f，926r；338F，518R为引物对进行PCR扩增。反应体系总体积为25.0μL，其中模板（土壤DNA）1.0μL，正向引物和反向引物（10μmol/μL）各1.0μL，10×PCRBuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）1.0μL，Taq（5U/μL）0.2μL，蒸馏水补体积至25.0μL；反应程序：95℃预变性5min；94℃变性40s，55℃变性50s，72℃延伸1min，32个循环；最后，72℃延伸10min。按照TAKARA公司凝胶回收试剂盒说明书操作，对PCR扩增产物进行回收，用琼脂糖凝胶电泳检测回收产物。

1.2.3微生物多样性初步分析保守区域文库中检测为阳性的单克隆由上海生工生物公司测序。获得的序列信息通过NCBI数据库(ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon网站()进行在线分析和比对。

2结果与分析

2.1烟草青枯病土壤微生物总DNA提取琼脂糖凝胶电泳检测提取纯化后的土壤微生物总DNA，结果显示提取的DNA大小约在2.0~10.0kb范围之间，通过DNA试剂盒的纯化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚类等化合物对PCR反应的影响。2.2烟草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文库构建以纯化的DNA为模板，用细菌特异性8f和926r引物、真菌特异性338F和518R引物，经过PCR扩增，获得与预期片段大小一致的条带，分别在1000bp和300bp左右。分别用8f，926r引物；338F，518R引物扩增的产物构建文库，从文库中随机挑取部分单菌落，用PCR方法检测其携带的片段，部分琼脂糖电泳检测结果如图所示，图1表明随机挑取的大多数单菌落携带有目的条带。阳性克隆的序列的测定由上海生工生物有限公司完成。

2.3烟草青枯病土壤细菌类和真菌类微生物的多样性烟草青枯病土壤中获得的细菌类信息如表2所示，结果显示，土壤中含有假单胞杆菌属类和鞘氨醇杆菌类等丰富细菌类微生物种类，其中包含部分不可培养假单胞杆菌、芽孢菌等细菌，还有部分序列通过比对没有获得相似性比较高的信息。表3结果显示烟草青枯病土壤中真菌类包括黑霉菌，腐质霉属真菌，尖孢镰刀菌及一些不可培养的真菌，其中霉菌类和不可培养的真菌类包括的菌类比较丰富。

篇2

关键词：土壤类型；烟田土壤微生物；根土比；多样性指数

中图分类号：S154 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）01-0056-04

土壤微生物是陆地生态系统中最丰富的物种，相关研究表明，每克农田土壤拥有的基因组量为140～8 800个，相当于400～26 000个不同物种。土壤微生物组成与活性决定了生物地球化学循环、土壤有机质的周转及土壤肥力和质量，也与植物的生产力有关。土壤微生物还可以敏感地指示气候和土壤环境条件的变化，土壤微生物参数可能是最早用于反映土壤质量的指标。土地利用方式、种植制度、农地管理方式及作物种类都会对土壤微生物产生影响[1-3]。Waldrop等[4]在研究森林转换为耕地条件下的土壤微生物群落结构时发现土壤中有机碳和氮下降了50%～55%，微生物量下降了75%，β-葡萄糖苷酶活性下降了54%，微生物特征和种类发生明显的变化。

土壤类型对微生物生长发育有着较大影响。土壤类型不同，土壤微生物种群数量和组成也必然会存在某种程度的差别，这种差异反过来又会对土壤结构以及土壤肥力特别是对烟草的生长产生一定的影响[5]。土壤微生物是土壤中动植物残体分解的主要推动者，在土壤物质转化中具有多种重要作用，与土壤肥力和植物营养有密切关系。因此土壤微生物是反映土壤供肥能力、土壤健康状况的敏感性参数。为此，在湖北省保康县和兴山县选取两种有代表性的土壤类型，研究不同类型土壤中主要微生物类群数量的变化规律，为合理利用土地资源、保证其可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验于2009年5～12月在湖北省保康县和兴山县进行。选取黄棕壤和紫色土两种土壤类型，育苗、肥水管理、病虫害防治及其他田间管理均按照当地农民种植习惯进行。供试烟草品种为K326。

1.2 土壤样品采集

分别于移栽前期（5月12-13日）、旺长期（7月8-9日）及采收期（8月15-16日）取样。采用5点取样法采集5～20 cm根际土和非根际土，用无菌自封袋包装，立即带回实验室。将新鲜土样研磨过2 mm筛存放在4 ℃冰箱中。

1.3 土壤微生物测定

采用稀释平板法测定土壤微生物总数；细菌采用牛肉膏蛋白胨固体培养基；固氮菌采用阿须贝氏琼脂培养基；放线菌采用高氏1号培养基；真菌采用马丁氏（Martin）培养基。结果以每克干土所含微生物数量表示[6]。

1.4 数据分析

根土比（R/S）是指根际土中微生物数量与非根际土中微生物数量的比，其中R表示根际土中微生物数量，S表示非根际土中微生物数量。

微生物数量变化速率是指根际土中微生物数量与移栽前期根际土中微生物数量的比。

生物多样性指数是描述生物类型数和均匀度的一个度量指标，它在一定程度上可反映生物群落中物种的丰富度及其各类型间的分布比例。本研究中土壤微生物菌群多样性指数和土壤微生物菌群的均匀度计算方法如下：

1）土壤微生物菌群多样性指数（Shannon-Wiener指数[7]）：H=-∑Pi×1nPi

2）土壤微生物菌群的均匀度[8]：

R=（-∑Pi×1nPi）/1nS

式中，Pi=Ni/N为某群落中第i个类型的个体数占总个体数的百分比，S为微生物类群数量。

2 结果与分析

2.1 不同类型烟田土壤中微生物数量

由图1至图4可知，在不同土壤类型烟田土壤中4种微生物数量从多到少依次为：细菌、固氮菌、放线菌、真菌。其中，细菌数量最多，占微生物总量的58.77%～82.98%，固氮菌占微生物总量的10.80%～32.75%，放线菌占微生物总量的3.79%～10.39%，真菌数量最少，占微生物总量的0.04%～0.22%。由此可见细菌在烟田土壤微生物中占绝对优势。

在不同生育时期不同土壤类型的烟田土壤中，旺长期细菌数量高于采收期，保康县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为11.740 2×107 cfu/g和11.654 2×107 cfu/g，兴山县黄棕壤和紫色土烟田旺长期土壤中细菌数量分别为29.437 0×107 cfu/g和11.295 9×107 cfu/g。

不同类型的烟田土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土，保康县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.740 2×107 cfu/g和24.033 4×106 cfu/g，保康县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.654 2×107 cfu/g和15.163 0×106 cfu/g；保康县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.250 4×107 cfu/g和34.551 7×106 cfu/g，保康县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为10.302 8×107 cfu/g和31.938 6×106 cfu/g。兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为29.437 0×107 cfu/g和99.007 3×106 cfu/g，兴山县紫色土烟田旺长期土壤中细菌和固氮菌数量分别为11.295 9×107 cfu/g和32.766 6×106 cfu/g；兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为16.694 6×107 cfu/g和66.275 2×106 cfu/g，兴山县紫色土烟田采收期土壤中细菌和固氮菌数量分别为7.679 0×107 cfu/g和23.956 8×106 cfu/g。

2.2 不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率

以移栽前期根际土中微生物数量为参照，不同类型烟田土壤中微生物数量变化速率如图5和图6所示，黄棕壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率都高于1，表明在烟草生长过程中黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量在增加，而紫色土中固氮菌和放线菌的变化速率存在低于1的情况，表明在烟草生长过程中紫色土烟田土壤中固氮菌和放线菌数量存在减少的趋势。

在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。在兴山县黄棕壤烟田旺长期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为6.895 5、4.161 8、2.561 1和1.529 9。

在不同类型烟田土壤中，黄棕壤烟田土壤中细菌变化速率、固氮菌变化速率、放线菌变化速率和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。兴山县黄棕壤烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为3.910 7、2.785 9、2.659 0和2.136 4，兴山县紫色土烟田采收期土壤中，细菌、固氮菌、放线菌和真菌的变化速率分别为1.636 5、1.527 7、1.583 8和1.911 7。

2.3 不同类型烟田根际土中微生物根土比

由图7和图8可知，不同类型土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌根土比都大于1，表明根际土中细菌、固氮菌、放线菌和真菌数量均高于非根际土，表现出明显的根际效应。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中固氮菌根土比高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高，为7.007 1。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，旺长期保康县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为5.958 3和4.820 9，旺长期兴山县黄棕壤和紫色土中4种微生物根土比之和分别为13.852 2和6.742 4。

2.4 不同类型烟田土壤中微生物种群结构变化

细菌与真菌数量的比值（B/F）是表征土壤肥力的一个潜在指标。有资料表明，土壤中细菌密度高，表明土壤肥力水平较高。表1为不同土壤类型烟田土壤中微生物的B/F变化趋势。黄棕壤烟田土壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）高于采收期，兴山县黄棕壤烟田土壤中旺长期和采收期细菌与真菌数量的比值（B/F）分别为26.431 4和11.541 7。不同类型烟田土壤中，黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.431 4。黄棕壤烟田土壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）高于紫色土，表明黄棕壤烟田土壤更适合烟草种植。

2.5 不同土壤类型对土壤微生物多样性指数的影响

土壤微生物菌群多样性指数（H）反映微生物群落的丰富度，用根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比（R/S）衡量烟叶种植对烟田生态系统中微生物多样性指数的影响。从表2可知，黄棕壤根土比大于紫色土。保康县黄棕壤和紫色土根土比分别为0.887 18和0.748 94，兴山县黄棕壤和紫色土根土比分别为1.019 26和0.866 43。

3 小结

对不同类型的烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌进行分离，对不同微生物种群进行数量和多样性分析。结果表明，不同类型烟田根际土壤中，黄棕壤中细菌和固氮菌数量均高于紫色土。在黄棕壤烟田土壤中，细菌变化速率高于固氮菌变化速率，固氮菌变化速率高于放线菌变化速率，放线菌变化速率高于真菌变化速率。黄棕壤烟田土壤中细菌、固氮菌、放线菌和真菌变化速率分别高于紫色土中4种微生物变化速率。黄棕壤中4种微生物根土比之和高于紫色土，兴山县黄棕壤中固氮菌根土比最高。黄棕壤中细菌与真菌数量的比值（B/F）几乎都高于紫色土，兴山县黄棕壤中旺长期细菌与真菌数量的比值（B/F）最高，为26.431 4。黄棕壤根际土中微生物菌群多样性指数与非根际土中微生物菌群多样性指数之比高于紫色土。

参考文献：

[1] ZELLES L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterization of microbial communities in soil：A review[J]. Biol Fert Soils，1999，29（11）：111-129.

[2] LARKIN R P， HONEYCUTT C W. Effects of different 3-year cropping systems on soil microbial communities and rhizoctonia diseases of potato[J]. Phytopathology，2006，96（1）：68-79.

[3] YAO H， HE Z， WILSON M J， et al. Microbial biomass and community structure in a sequence of soils with increasing fertility and changing land use[J]. Microb Ecol，2000， 40（3）：223-237.

[4] WALDROP M P，BALSER T C，FIRESTONE M K. Linking microbial community composition to function in a tropical soil[J]. Soil Biol Biochem，2000，32（2）：1837-1864.

[5] 习金根，孙光明，陆新华.不同的施肥方式对剑麻施肥区域土壤微生物类群的影响[J].中国麻业，2005，27（5）：235-239.

篇3

长期大量施用化肥、农药,导致土壤板结,易缺氧,土壤酶活性及微生物多样性降低。近年来,上海都市农业生产发展迅速,尤其是蔬菜生产,在实际生产中,大部分菜农为了片面追求高产而忽视品质,大量使用化肥,特别是氮肥的过量施用现象非常普遍。然而,近年来国家统计数据显示,我国农业资源消耗,包括化肥、农药等的用量增长速率与农业增产量不呈正比,并导致品质下降[14]。相关研究调查显示,这些化肥的利用率仅为35%左右,其余未被利用的大部分都变成了污染源,造成水体、空气和土壤污染等环境问题[58]。为了解决农作物高产与化肥过量施用而引起环境污染之间这一突出矛盾,农业部都市农业(南方)开放重点实验室开展了长期的农田污染源头控制与过程治理的研究工作,并且创新开发出了一种农用功能微生物菌剂。本试验以该微生物菌剂为试验材料,应用于叶菜类菠菜,探讨化肥减量化技术对菠菜营养吸收利用的影响,研究微生物菌剂对菠菜的促生效应,并应用PCR-DGGE(变性凝胶梯度电泳)等现代分子生物学的手段[89],研究化肥减量与微生物菌剂配施处理方式对土壤微生物种群多样性的影响,旨在为从源头控制农业面源污染,保护水源地生态健康,减少化肥用量,推广环保节能的农用混合微生物菌剂提供理论基础和试验参考。

1材料与方法

1.1供试材料与试验设计

供试菠菜品种为河北佳禾种子公司提供的大叶菠菜;供试菌剂由河北省科学院微生物研究所提供的硅酸盐菌剂和上海交通大学农业部都市农业(南方)重点开放实验室分离纯化培养的自生固氮菌液,二者进行混合培养而形成的混合菌液。该混合菌液具有溶磷、解钾及固氮等功能,主要菌株为Paenibacillusmucilaginosus和Bacillussubtilis,有效活菌数大于2×108cfu•mL1。选用直径30cm、高30cm的花盆。试验前每处理每盆等量施用30.55g有机肥,有机肥的有机质含量≥400g•kg1,N、P、K含量≥80g•kg1,含N43.6g•kg1,含水率27.55%,pH7.85,Cd含量7.23mg•kg1,Pb含量78.24mg•kg1,Cr含量116.43mg•kg1,As含量54.23mg•kg1。有机肥与土壤拌匀。本试验共设6个不同处理,每处理设3个重复(见表1)。菠菜定植密度为7株•盆1。试验所用氮肥为尿素,磷肥为过磷酸钙,钾肥为硫酸钾以及上海雨霖牌生物有机肥料。第1季菠菜从2010年11月20日播种开始,到2011年1月24日收割结束;第2季从2011年3月8日到2011年5月5日。供试土壤采自上海交通大学农业与生物学院试验田,土壤类型为褐壤土,试验前土壤理化性质背景指标测定如下:土壤全氮、有效磷、速效钾、有机质含量分别为1.117g•kg1、0.212mg•kg1、125.00mg•kg1、12.40g•kg1,电导率(Ec值)为1.84mS•cm1,pH为7.25。试验期间人工浇水,根据菠菜不同生长期的需要,每1~5d浇水1次。

1.2菠菜测定分析

在第1季菠菜六叶期(2010年12月20日14:00)和营养生长后期(2011年1月24日14:00),每盆随机抽取3株,挑选每株新长出的成熟叶片,使用SPAD-502仪测定叶绿素含量SPAD1和SPAD2。2011年1月14日下午,用OSI-FL叶绿素荧光仪、经暗适应30min后,测定菠菜叶片叶绿素荧光参数,每处理9次重复。2011年1月24日,菠菜收割当天,用紫外分光光度法测定菠菜可食部分硝酸盐含量,每样品3次重复。电子天平计量菠菜收割产量,每盆单独收割测产;菠菜N、P、K含量由上海交通大学分析测试中心测定,其中N使用Elementer公司元素分析仪(EAI)测定,P、K使用离子光谱仪(ICP)分析测定,每个样品3次重复。

1.3土壤样品采集与处理

试验期间,分别在菠菜六叶期(2010年12月20日)和营养生长后期(2011年1月24日)两次采集土样。使用不锈钢取土器采集0~15cm土层,部分土壤放于20℃冰箱冷冻保存,另一部分土壤样品风干后研磨,分别过2mm筛和0.45mm筛,塑料袋封装保存,待测。

1.4土壤微生物分析

1.4.1土壤总DNA的提取、16SrDNAV3区片段PCR扩增

每个样品取0.5g土样提取DNA,本试验采用Omega公司生产的soilDNAKit提取土壤微生物基因组DNA,按试剂盒使用说明的操作步骤进行。将纯化后的基因组DNA作为聚合酶链反应(PCR)的模板。采用微生物16SrDNA基因V3区具有特异性的引物对F341GC和R517,其序列分别为:（略）。GC夹(下划线)的目的是为了防止在DGGE过程中,引物的完全分离的扩增。反应体系为50μL,PCR反应采用降落PCR策略,即:预变性条件为96℃5min,前20个循环为94℃1min,65~55℃1min和72℃3min(其中每个循环后复性温度下降0.5℃),后10个循环为94℃1min,55℃1min和72℃3min,最后在72℃下延伸7min。PCR反应的产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2DGGE和染色

采用DcodeTM突变检测系统(CBS)对16SrDNAV3区扩增产物进行DGGE分析。使用梯度胶制备装置,变性剂浓度从30%到60%(100%的变性剂为7mol•L1的尿素和40%的去离子甲酰胺),聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%;在150V的电压下,上样量为18μL。其运行条件为:0.5×TAE电泳缓冲液,60℃电泳条件下,150V,10h。电泳完毕后,再用去离子水漂洗,固定15min,染色15min,显色10min。在图像处理过程中,对于在DGGE电泳图上是肉眼可见、但被软件忽略掉的一些小条带进行了手动处理,条带的密度由该软件自动算出。

1.4.3指纹图谱的处理与分析

基于PCR-DGGE的基本原理,所扩增的DGGE条带的数量可代表群落DNA序列的丰富度(S),群落DNA序列的多样性可采用Shannon-Weaver指数及其均匀度指数来表示,Shannon-Weaver指数及其均匀度指数计算公式为:（略）。

1.5数据统计分析

采用Excel2003及SPSS13.0进行数据处理及统计分析,用单因素方差分析及邓肯检验(DMRT)对数据进行显著性差异分析。采用Bio-rad公司Quantityone软件的UPGAMA程序进行微生物群落的聚类分析。

2结果与分析

2.1菌剂处理对菠菜生长特性和产量的影响

2.1.1对菠菜营养状态的影响

通过对菠菜叶片叶绿素含量进行测定结果显示(表2),不同施肥处理间差异明显。各处理相比,就两次测定的叶绿素含量的变化,T2、T3、T4、T5处理增幅较大,其中T1增加24.2%,而T5则达到45.6%。最后测定各处理的叶绿素含量差异为:T5>T4>T2>T3>T1>>CK。结果说明,化肥对叶绿素合成量的影响在菠菜生长前期影响更为明显,且常规化肥处理(T1)为最大;而在生长后期,随着微生物菌剂在环境中的定植与适应,在土壤中繁殖量显著提高,活性显著增强,对菠菜的作用逐渐显现,相反,化肥的作用却呈下降趋势,从而导致最终化肥减量20%和40%的处理比完全用化肥的叶绿素含量要高。可见,化肥作为速效性肥料对菠菜生长影响较快,作用时间较短,成本较高;而菌剂与化肥的混施,不但更能提高叶绿素含量,且作用时间长,成本也更低。Fv/Fm指标反映菠菜叶绿素荧光动力学参数,是叶片光合系统II原初光能转换效率,即可变荧光产量与最大荧光产量之比。测定结果显示,相比对照处理,使用菌剂的T2、T3、T4和T5处理的Fv/Fm都有所提高,其中T3达到0.797,比对照提高0.012,处理间差异显著。由此可见,菌剂处理的菠菜在营养生长中的光能转化能力优于不施肥CK。添加微生物菌剂的处理与纯粹使用化肥的T1处理差异不显著。菠菜对化肥及土壤中N、P、K等养分的吸收直接表现为各元素在植株体内的含量。由表2可知,在收割期,各处理间菠菜N含量存在显著差异。以T2和T3最高,T5和T4次之,CK处理最低,且T2处理较CK处理的增幅为100%。由此可见,菌剂处理后,固氮菌提高了植株N含量,也就是提高了N吸收,减少了N损失。菠菜收割后植株P、K含量以T1处理为最低,分别约为35.3g•kg1和56.5g•kg1,且明显低于CK的45.8g•kg1和69.9g•kg1,表明在生长后期,T1处理的菠菜对P、K的吸收较少,土壤中有效磷和速效钾含量低。相比T1处理,T2和T5处理反而有所提高,表明硅酸盐菌的溶磷、解钾作用促进了菠菜对P的吸收利用量,使菠菜P含量较纯化肥处理的T1要高。微生物菌剂的两种菌各自发挥了其主要功能,固氮菌保持了较低氮肥使用条件下的高N含量,硅酸盐菌确保了较低磷肥和钾肥使用条件下的高P、K含量。

2.1.2对菠菜硝酸盐含量的影响

收割后将菠菜全株(包括根、茎、叶)捣碎后测定硝酸盐含量。由表3可知,与不施肥(CK)处理相比,施肥处理对菠菜硝酸盐含量影响较大,使硝酸盐含量显著增加。其中,T1处理的硝酸盐增量最为明显,达到5866.52mg•kg1,T2最小,为4358.23mg•kg1,T3、T4和T5处理在4677.55~5078.25mg•kg1之间。由此可见,T2、T3、T4、T5处理与T1处理相比,硝酸盐含量明显降低。因此,菌剂的配合施用与纯施化肥相比,可以提高菠菜品质,有利于生产有机健康蔬菜。

2.1.3对菠菜产量的影响

根系是植物从土壤获取养分的必要器官,但作为可食用的菠菜,根系重量在菠菜收割期所占总生物量的比重越高(即根生物量比重越高),其可食用部分就相对减少,产量就相对降低。表3表明,固氮溶磷解钾菌剂配合施用后,与不施肥对照相比,根生物量比重有明显降低,由4.36%下降到3.02%,降低约30%,比化肥T1处理的3.54%也有降低。由此说明,功能菌剂的配施不仅促进了菠菜根系的生长,而且提高了养分及光合产物的有机分配,从而提高了菠菜可食部分的生物量比重,提高了菠菜产量,有效提高了菠菜的经济效益。本试验包括两季菠菜,产量计算为两季的总产量。其中,第1季为2010年冬季菠菜,第2季为2011春季菠菜。试验表明,菠菜产量受所施用肥料的影响较大,施肥对菠菜产量提高效果明显。由表3可知,不同处理间每盆菠菜的平均产量差异显著。与CK处理相比,T4处理的产量增加最大,每盆平均产量达到277.73g,产量增加170%;T3、T2、T5和T1处理的增产量依次减少,平均每盆产量分别为267.53g、264.38g、241.62g和220.13g。其中,化肥减量施用的T2、T3、T4和T5处理产量均比常规化肥用量T1处理产量高,达到了化肥减量而不减产甚至增产的效果。由此可见,菌剂可以替代部分化肥,减少农业化肥用量。

2.2菌剂处理对菠菜土壤微生物多样性的影响

2.2.1土壤微生物DGGE指纹图谱分析

对不同处理菠菜栽培土壤微生物16SrDNAV3可变区片断进行DGGE指纹图谱分析的结果(图1a)表明,不同施肥处理下盆栽菠菜土壤的微生物基因区系条带出现较小差别。与CK相比,各处理除T1外,条带亮度略有增加,条带数量无明显差别。从图1b16SrDNAV3区PCR扩增片段DGGE泳道图谱可以看出,多数的明显条带在迁移率上基本一致,说明不同处理间具有大量的共有微生物种群,这主要是存在于试验土壤中的土著微生物。微生物菌剂处理的明亮条带明显在图谱中部多出现1~2个条带,表明混合微生物菌剂与化肥的配施,提高了土壤主要微生物种群基因多样性和数量。由于试验在低温的冬春季进行,土壤微生物本身活性也较低,生长繁殖速率较慢,因而不同施肥制度对微生物种群与数量的影响反映不够明显。

2.2.2土壤微生物DGGE条带图谱的聚类分析

不同施肥处理间的土壤微生物种群相似性表现为DGGE条带聚类分析的相似性系数,相似性系数越高,种群多样性越趋于一致,如图2所示。本试验中,T4和T5处理间的土壤微生物种群相似性最高,达到0.80,被聚为一类,与T1处理的相似性系数为0.76,同时与CK都聚在一个大类;而T2和T3处理又被单独聚在一类,相似性系数为0.70;两个大类间最低相似性系数也达到0.65。一般认为相似值高于0.60的两个群体具有较好的相似性,将6个样品归为一类的相似值达0.65,说明种植1茬菠菜后,不同施肥制度的土壤细菌群落结构相似性程度提高。

2.2.3土壤微生物种群DNA多样性分析

对不同处理土壤的微生物16SrDNA的DGGE条带进行香农威尔多样性指数(Shannon-Wiernerindex)分析,结果见表4。从表4可以看出,丰富度指数以T1处理最低,T3处理最高,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌丰富度指数有所降低,而添加微生物菌剂的则有所提高;而Shannon-Wierner指数在各处理间差异较为明显,与不施肥处理CK相比,常规化肥处理T1的土壤细菌多样性有所降低,而添加微生物菌剂的各处理却有明显提高。该结果表明,常规化肥处理不利于提高土壤微生物种群多样性;相反,在化肥减量情况下,配施有益的微生物菌剂,有利于改善土壤中主要微生物种群结构,提高微生物种群多样性。

3讨论与结论

篇4

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试土壤

供试土壤采自西北农林科技大学试验田,土壤塿类型为土,土壤肥力中等,其主要理化性质为:pH8.32,有机质13.20g•kg1,全氮、全磷、全钾含量分别为0.79g•kg1、0.61g•kg1和11.14g•kg1,碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为61.03mg•kg1、16.67mg•kg1和154.40mg•kg1。土样风干、混合均匀后过筛备用。

1.1.2供试肥料

供试肥料包括尿素、磷酸二氢铵、硫酸钾、有机无机复混肥、生物复混肥。有机肥为将猪粪、小麦秸秆等调节到合适的C/N、pH和含水量后经高温堆制发酵腐熟制作而成,其主要养分含量为N18.6g•kg1、P2O59.0g•kg1、K2O12.2g•kg1。生物复混肥是在有机肥的基础上加入少量的无机肥,无机肥配比为N4%、P2O52%、K2O3%[10],然后将液体芽孢杆菌复合菌剂(固氮菌Azotobacterchroococcum、解磷菌Bacillusmegaterium、解钾菌Bacillusmucilaginous由西北农林科技大学资源环境学院微生物实验室提供,已鉴定各菌株间无拮抗)与蛭石按1∶2混合吸附,均匀掺入上述有机无机复混肥中。有机无机复混肥是添加等量灭菌的蛭石,其中的有机肥、无机肥及其配比均与生物复混肥完全相同。肥料均为自制,配制完成后保存1个月再施用。生物复混肥和有机无机复混肥中氮磷钾含量均为N55.5g•kg1,P2O518.7g•kg1,K2O36.9g•kg1,有机质360.8g•kg1,功能芽孢杆菌总量为0.21×108cfu•g1。

1.1.3供试作物

供试作物为“郑单518”玉米,由西北农林科技大学种子公司提供。

1.2试验设计

试验采用盆栽的方式,于2011年6月在西北农林科技大学资源环境学院玻璃网室中进行。试验设置对照(CK,不施肥)、无机肥(T1)、有机无机复混肥(T2)、生物复混肥(T3)4个处理,4次重复。生物复混肥按0.20g(N)•kg1(土)施入,其他肥料均按生物复混肥中氮磷钾的量等量施用。将肥料与12.5kg土样充分混匀后装盆,浇透水至土壤含水量为田间最大持水量的60%。玉米催芽后直接播种,出齐苗后间苗,每盆保留3棵,并于定苗1d、15d、30d、45d、60d时采集土壤样品,在各个处理4次重复内随机取0~20cm的土壤各100g并置于4℃冰箱,用于分析土壤微生物学特性;取玉米生长60d时的土样在48h内进行土壤微生物群落功能多样性分析。试验设置保护行,试验期间根据实际情况定量浇水,并经常更换盆的位置,不同处理的盆栽管理措施均一致。

1.3测定项目和方法

土壤微生物群落功能多样性分析采用BIOLOGECO测试板进行测定[11]。土壤微生物量碳、氮、磷用氯仿熏蒸提取法测定[1112],采用重铬酸钾外加热法测定提取液中的可溶性碳,采用过硫酸钾氧化法测定提取液中的总氮,采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法测定提取液中的总磷,土壤微生物量碳、氮、磷的换算系数分别为0.38、0.54、0.40。

1.4数据处理

采用微平板培养96h的数据进行数据统计分析,采用AWCD、Shannon指数和丰富度指数来表征土壤微生物群落代谢功能多样性[8,13]。数据经Excel2003处理后,采用SPSS16.0软件进行方差分析和主成分分析,主成分分析采用协方差矩阵为因子提取依据,其他参数选取系统默认值。

2结果与分析

2.1生物复混肥对土壤微生物群落功能多样性的影响

2.1.1土壤微生物群落多样性指数分析

土壤微生物群落功能多样性是土壤微生物群落状态与功能的指标,反映了土壤微生物的生态特征。表1为玉米生长60d时各施肥处理的土壤微生物群落功能多样性指数,从表1可以看出,BIOLOG微平板培养96h时,T3处理AWCD与其他处理间差异显著;微生物群落Shannon指数大小顺序为T3>T1>T2>CK,T3处理与其他处理间差异显著;T3处理土壤微生物群落的丰富度指数高于其他处理。以上结果表明,生物复混肥处理(T3)可以提高土壤微生物群落的功能多样性和种群丰富度,有利于提高土壤生态系统的稳定性。

2.1.2土壤微生物对6类碳源的利用

土壤微生物对不同碳源的利用情况反映了土壤微生物的代谢功能类群。从表2可以看出,玉米生长60d时,T1、T2、T3处理土壤微生物群落利用碳源的显著类型为糖类、羧酸类和氨基酸类,可能是因为这3类碳源是土壤微生物代谢最基本的物质,能够被大多数土壤微生物代谢利用。而对于多聚物类、多酚化合物类和多胺类这3类碳源,T3处理与其他处理间差异显著,表明T3处理的土壤微生物碳代谢群落结构与其他处理有所不同,该处理土壤微生物群落对多酚化合物类的利用明显高于其他处理,可能是土壤中施入的有机肥在微生物作用下,腐殖化过程中多酚类物质有一定积累,进而激活了能够利用多酚类物质的微生物的活性,从而提高了土壤微生物对多酚化合物类物质的代谢与利用。土壤中微生物对多酚类物质的利用显著提高的现象在其他研究中也有出现[14],具体原因还需要进一步研究。

2.1.3土壤微生物群落功能多样性主成分分析

为清晰地了解不同施肥处理对土壤微生物群落代谢能力的影响,利用培养96h后测定的AWCD数据进行主成分分析(PCA)。从表3可以看出,对PC1(第1主成分)贡献大的碳源(特征向量≥0.50)有17种,其中糖类占35%,羧酸类占24%,影响PC1的主要碳源为糖类,其次为羧酸类和氨基酸类;对PC2(第2主成分)贡献最大的碳源糖类占50%,其次为羧酸类(25%),因此,对PC1和PC2起分异作用的主要碳源是糖类和羧酸类。与PC1正相关程度较高的碳源有α-D-乳糖和L-精氨酸,负相关的碳源有D,L-α磷酸甘油和吐温40,不同施肥处理土壤微生物在碳源的利用上既有共同点又有差异,差异可能是由于不同处理土壤微生物群落有所差异,也可能是因为某些碳源是微生物生理代谢途径中的重要物质[15]。从不同施肥处理土壤微生物群落功能多样性的主成分分析可以了解各种处理土壤微生物群落功能的相似状况,结果如图1所示,PC1方差贡献率为27.640%,PC2为19.089%。不同处理土壤微生物群落在碳源的利用能力上存在明显差异,表现在它们在第1、2主成分上得分系数差异明显。CK、T1和T2处理的土壤微生物在PC1上的得分值分布一致,与T3处理区分明显,T3处理土壤微生物在PC1上的得分值均为正值,CK、T1和T2处理土壤微生物在PC1上的得分值基本为负值;T2处理土壤微生物在PC2上的得分值为正值,而CK和T1处理土壤微生物在PC2上的得分值基本上为负值,较难分开。这表明生物复混肥处理的土壤微生物群落代谢结构与其他处理具有明显差异,而无机肥和CK处理土壤微生物群落功能相似。施用生物复混肥能提高土壤微生物对不同碳源的代谢能力,提高土壤微生物群落功能多样性,为土壤提供一个良好的生态环境。

2.2生物复混肥对土壤微生物量碳、氮、磷的影响

土壤微生物生物量是土壤有机库中的活性部分，是存在于土壤微生物体内或残体细胞中可供利用的养分的贮备库,是土壤养分转化的动力和中转站,与土壤中的C、N、P等养分转化和循环过程密切相关,反映土壤微生物活动的强弱和养分转化速率的快慢,从宏观上反映土壤微生物活性的总体状况,是土壤生物质量、土壤肥力变化的灵敏指标。研究表明,不同施肥制度对土壤微生物生物量也有显著影响[1618]。从图2可以看出,土壤微生物量碳、氮、磷的变化规律大体一致,土壤微生物量在玉米整个生长期中大致呈先升高后逐渐平稳的变化趋势,与王艳霞等[19]研究结果相似;且土壤微生物量碳、氮、磷的含量均以生物复混肥处理最高,最高值分别为333.21mg•kg1、53.02mg•kg1和22.20mg•kg1。在土壤微生物量碳变化规律中,生物复混肥处理在玉米生长第30d、45d时较高,并且显著高于其他处理。生物复混肥处理显著提高土壤微生物量碳的主要原因可能是生物复混肥中所添加的功能性微生物菌群施入到土壤中,能够使有益微生物在土壤中形成优势种群,很好地在植物根际成功定殖,发挥其生态功能;另一方面,生物复混肥本身带入的活性有机碳源促进了土壤微生物的繁殖,提高了土壤微生物活性。各处理土壤微生物量氮含量在定苗前期没有明显差异,在玉米生长第30d时显著升高,生物复混肥处理的微生物量氮含量与其他处理相比差异显著。反映出玉米快速生长期时由于根际活动等促进土壤微生物大量繁殖,生物复混肥处理提高了土壤微生物活性,氮素固定同化到微生物体内引起土壤微生物量氮含量升高。土壤微生物量磷的变化规律与土壤微生物量碳、氮不同,玉米生长前期各处理间差异不明显,在玉米生长第15d后生物复混肥处理的土壤微生物量磷显著升高,说明玉米快速生长期间,土壤微生物对土壤中有机态和无机态磷的同化作用加大,以微生物量磷的形式存在,土壤中微生物解磷与固磷作用也与土壤中可降解有机物的数量有关,有机或无机肥料中的磷素对土壤微生物量磷的增加有明显的贡献作用[2022]。本试验土壤微生物量磷的升高趋势比较稳定,与赵兰凤等[23]研究结果相似。

3讨论

不同施肥措施会导致土壤微生物功能多样性的系统变化,形成各自特定的土壤微生物种群,长期施用有机肥可明显增加土壤微生物种群的变异程度[24]。罗希茜等[25]研究稻田土壤微生物群落发现,施用化肥或配施有机肥可使黄泥土土壤微生物的碳源利用率显著高于对照,有利于维持土壤微生物的碳源利用能力。Wei等[26]研究长期不同施肥处理对黑土细菌群落结构和功能的影响,结果表明无机肥处理与有机无机复混肥处理土壤微生物在单一碳源利用率方面没有显著性差异,但在土壤微生物群落结构组成、功能稳定性上有差异,施用化学肥料会降低土壤微生物群落的稳定性,本研究结果与上述研究结果类似。徐华勤等[27]对茶园土壤微生物群落功能多样性的主成分分析表明,糖类和羧酸类物质是区分各处理的主要碳源。本研究主成分分析结果也表明,不同施肥处理土壤微生物功能多样性差异明显,起分异作用的主要碳源是糖类和羧酸类。Garland等[28]研究表明,样本在主成分轴上的分布与微生物对碳源底物的利用能力有关,PC1解释了大部分的变异,生物复混肥处理分布在PC1的正方向,结合生物复混肥处理对6类碳源的利用,进一步证实生物复混肥处理可提高土壤微生物的代谢能力。土壤微生物功能多样性变化不仅受施肥影响,还与土壤养分密切相关,但是这方面的研究还较少。孔维栋等[29]和区余瑞等[30]的研究表明,土壤有机质和全氮含量与土壤微生物功能多样性呈正相关。因此,为了全面表征土壤肥力的微生物指标体系,本研究将从土壤微生物多样性与养分的关系方面进一步探讨生物复混肥的施用效果。土壤微生物量能够快速反映土壤养分含量变化及植物根际活动带来的土壤微生物活性的变化。Masto等[17]认为微生物熵更能够反映出土壤微生物活性和土壤有机碳的动态变化。土壤微生物群落结构的变化可能是导致土壤微生物量变化的首要原因[31]。在本研究中,生物复混肥处理能够提高土壤微生物群落功能多样性,其土壤微生物群落结构也比较稳定,因此,在玉米快速生长期间生物复混肥处理的土壤微生物量显著高于其他处理,具有较大的N、P、K中转代谢库,能够为植株提供更多的有效养分。

篇5

[关键词]微生物 分子生态学 RFLP DGGE Real-Time PCR

[中图分类号] Q938.1 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2015）-2-267-1

0引言

微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。

1微生物分子生态学常用分析方法

1.1寡核苷酸探针检测

该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定DNA序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用DNA制备探针，利用cDNA避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDNA探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。

1.2 DNA-DNA杂交

DNA-DNA杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测DNA序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链DNA解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交DNA，检测其杂交率。由于来源不同的两条DNA单键难以配对重组，DNA杂交率可用于估计序列相似度。

1.3 16SrRNA序列分析

该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRNA基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。

1.4 编码蛋白质基因

该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。

2微生物分子生态学常用技术

2.1限制性片段长度多态性分析（RFLP）

在RFLP分析过程中，以所提取的微生物DNA为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）得微生物16SrRNA序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒DNA来实现克隆文库构建。不同微生物DNA序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。

2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）

DGGE是一种检测DNA突变的电泳技术，根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的DN段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物DNA，而DNA回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。

2.3荧光定量PCR技术（Real-Time PCR）

Real-Time PCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪PCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测PCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。

3结论与展望

微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。

参考文献

[1]杨霞，陈陆，王川庆.16SrRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（2）：55-60.

[2]邓小宽，张新宜，田敏.现代生物技术在分子微生物生态学中的应用[J].国外医药（抗生素分册），2006，27（4）：164-170.

篇6

关键词：生物多样性；多样性功能评价；湿地保护；衡水湖湿地

biodiversity function evaluation of the hengshui lake wetland

zhang xue-zhi

(hengshui bureau for hydrology and water resources survey of hebei province,hengshui 053000,china)

abstract: the hengshui lake wetland,located in the hinterland of north china plain,is a bio-intensive wetland in the north temperate zone,an intersection area for the different migratory birds,and the best habitat in north china plain for many rare and precious birds.according to the survey data of the wetland biodiversity,this study conducted a diversity function evaluation on species diversities and ecosystem diversities in the wetland.according to the wetland biodiversity criteria,the hengshui lake wetland biodiversity is at a general level.biodiversity function evaluation of the wetland we can provide scientific basis for the wetland protection.

key words: biodiversity;diversity function evaluation;wetland protection;the hengshui lake wetland

1 衡水湖湿地属性

按照国际湿地公约的湿地分类［1］，衡水湖湿地主要为湖泊湿地、沼泽湿地、水体沼泽化湿地、盐沼湿地、河流湿地和渠道湿地等。其中湖泊湿地、沼泽湿地是湿地的主体，类型与面积占据主要地位。其他类型湿地居次要地位。此外，还有少量人工湿地如沟渠、养鱼池等。各种类型湿地关系十分密切，它们相互依存，共同构成衡水湖湿地生态系统。任一类型湿地的退化都将对衡水湖湿地的生态与环境功能产生巨大的影响［2-4］。

1.1 生物多样性保护层次

衡水湖具有非常重要的湿地生态服务功能，是北温带野生动植物聚集地和候鸟南北迁徙不同路线的交汇处，这里有植物370种，鸟类286种，鱼类26种，昆虫194种，两栖爬行类17种，哺乳类17种，生物多样性非常丰富。

保护生物多样性和生态系统功能的完整性与保护珍稀动植物有着同等重要的意义。许多物种虽然未被列入国内外各种动植物保护名录，但其或为重点保护珍稀鸟类提供栖息地和繁殖地，或直接（间接）为这些珍稀鸟类提供食物，共同构成适宜的鸟类生境。所以保护这些物种，保护生物多样性对于珍稀鸟类的保护也是至关重要的。同时，保护生物多样性也就是保护湿地这一天然物种基因库，以利于我们子孙后代对物种资源的可持续利用，对人类生存和生活也都具有重要的现实和潜在的意义［5］。

1.2 湿地保护类型

湿地是位于陆生生态系统和水生生态系统之间的过渡性地带，在土壤浸泡在水中的特定环境下，生长着很多湿地的特征植物。湿地广泛分布于世界各地，拥有众多野生动植物资源，是重要的生态系统。很多珍稀水禽的繁殖和迁徙离不开湿地，因此湿地被称为“鸟类的乐园”。湿地强大的生态净化作用，因而又有“地球之肾”的美名。根据《自然保护区类型与级别划分原则》(gb/t 14529-93)，衡水湖国家级自然保护区属于自然生态系统类的湿地类型自然保护区［6］。从生态系统特征上看属于以华北内陆淡水湿地生态系统为主的平原复合湿地生态系统。

2 湿地生物多样性功能评价方法

生物多样性的3个主要层次是物种多样性、基因多样性和生态系统多样性。这是组建生物多样性的3个基本层次。基因多样性代表生物种群之内和种群之间的遗传结构的变异。每一个物种包括由若干个体组成的若干种群。各个种群由于突变、自然选择或其他原因，往往在遗传上不同。因此，某些种群具有在另一些种群中没有的基因突变，或者在一个种群中很稀少的等位基因可能在另一个种群中出现很多。在同一个种群之内也有基因多样性，在一个种群中某些个体常常具有基因突变。生态系统多样性既存在于生态系统之间，也存在于一个生态系统之内。总之，物种多样性是生物多样性最直观的体现，是生物多样性概念的中心。基因多样性是生物多样性的内在形式，一个物种就是一个独特的基因库，可以说每一个物种就是基因多样性的载体；生态系统的多样性是生物多样性的外在形式，保护生物的多样性，最有效的形式是保护生态系统的多样性［7-9］。

作为水陆相兼的生态系统，湿地的独特生境使它同时兼具丰富的陆生与水生动物植物资源，对于保护物种，维持生物多样性具有难以替代的生态价值。湿地生物多样性是所有湿地生物种种内遗传变异和它们生存环境的总称，包括所有不同种类的动物、植物、微生物及其所拥有的基因和它们与环境所组成的生态系统［12］。

物种多样性是群落生物组成结构的重要指标，它不仅可以反映群落组织化水平，而且可以通过结构与功能的关系间接反映群落功能的特征。

在湿地生态系统评价方法的基础上，结合生物多样性的理论和实践，将物种多样性和生物多样性作为一级指标，下设二级、三级亚指标，建立可操作性较强的湿地生物多样性评价指标体系［13］，见表1。

人类威胁程度分值

对资源保护部构成威胁5保护区与未开发生境毗邻5

资源的有效保护受到一定的威胁3保护区周边尚有未开发生境3

资源的有效保护受到较大的威胁1保护区被已开发的区域环绕1

根据湿地生物多样性现状调查结果，对照以上赋值逐项打分，将所得分数累加即得到该湿地生物多样性评价总分值。计算公式为：

r=∑3i=1ai+∑3j=1bj(1)

式中：r-湿地生物多样性总分值；a-物种多样性分值；i-物种多样性评价项目数；b-生态系统多样性分值；j-生物多样性评价项目。

根据r值的高低，将湿地生物多样性划分为5级，见表8。

3 衡水湖生物多样性评价

衡水湖是华北平原上第一个内陆淡水湖国家级自然保护区，同时也是华北平原唯一保持沼泽、水域、滩涂、草甸和森林等完整湿地生态系统的自然保护区［14］。丰富的生物资源是衡水湖的支柱。这里有绿藻、蓝绿藻和硅藻等在内的201种浮游植物、平均密度达到了4 000个/l，浮游动物174种、平均密度达到了4 000个/l；这里有芦苇等挺水植物，藕、睡莲属等漂浮有叶植物，眼子菜属、黑藻属等深水植物；这里有两栖纲、爬行纲、哺乳纲野生动物共30多种。所以，衡水湖被称作“物种基因库”。

根据调查结果，衡水湖湿地有维管植物366种，鸟类286种，分别占河北省物种总数的42.2%和57.2%。维管束植物有国家三级重点保护植物野大豆；鸟类有国家一级重点保护的7种，有黑鹳、东方白鹤、丹顶鹤、白鹤、金雕、白肩雕、大鸨。生物多样性评价结果为：

物种多度：a1=a11+a12=7.5+10=17.5

物种丰度：a2=a21+a22=10+7.5=17.5

物种稀有性：a3=a31+a32=2+4=6

则物种多样性为：

a=∑3i=1ai=17.5+17.5+6=41

衡水湖湿地大多数植物属于世界广布种；在调查的鸟类中，广布种占总数的23.1%，古北种占种数的68.9%，东洋种占8.0%。衡水湖为沼泽芦苇香蒲生态系统，在华北属常见生境类型；生态系统的组成结构简单、类型单一。衡水湖受人类影响因素较多，对湿地内水体、生物等资源影响较大；湿地周围为村镇和农田，没有未被开发的区域。生态系统多样性评价结果如下。

生态系统多样性地区分布：

b1=b11+b12=4+4=8

生态系统多样性生境类型：

b2=b21+b22=2+6=8

生态系统多样性人类威胁评分：

b3=b31+b32=1+1=2

则生态系统多样性为：

b=∑3i=1bi=8+8+2=18

湿地生物多样性评价总分为：

r=∑3i=1ai+∑3j=1bj=41+18=59

按照湿地生物多样性评分标准，衡水湖湿地生物多样性功能进行评价，评价结果为：物种多样性为41分，生物系统多样性为18分，衡水湖湿地生物多样性处于一般水平［15］。从分析结果可以看出，衡水湖湿地物种多样性占优势，而生态系统多样性占劣势，生态环境受人类活动影响因素较大。

4 结论

利用衡水湖生物多样性资料，对衡水湖生物多样性功能进行评价。分别对物种多度、物种丰度和物种稀有性进行分析，计算出物种多样性；对生态系统多样性地区分布、生态系统多样性生境类型和生态系统多样性人类威胁等指标分析，计算出生态系统多样性指标。按照湿地生物多样性评分标准，衡水湖湿地生物多样性处于一般水平。生物多样性是自然生态系统生产和生态服务的基础和源泉。生物多样性可提供多方位的服务。人类历史上大约有3 000种植物被用作食物，估计有75 000种植物可作食用。人类就是依赖这些植物得以繁衍。生物技术是以现有生物多样性为物质基础的工作，在解决粮食短缺、人类健康、维护生物物种和环境等诸多社会经济重大问题中将发挥重要作用，将成为21世纪国民经济的支柱产业。

参考文献：

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篇7

关键词：黄瓜；轮作；大葱；土壤；连作障碍

中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008

研究表明，蔬菜连作会导致生长受阻，抗病能力减弱，产品产量和品质下降[1-2]。连作土壤与轮作土壤相比，理化性质变劣[3]，酶活性降低[4]，微生物数目及种群多样性减少[5]。黄瓜是设施主栽蔬菜，连作障碍已成为制约其高产高效和可持续发展的重要因素。试验发现，大葱轮作可显著减轻黄瓜连作土壤障碍，促进生长，提高产量[6]，对此，前人从根区土壤的理化和生物学特性方面进行了探讨[6-8]。根际是植物与土壤进行物质和能量交换最剧烈的区域，根际土壤的理化和生物学特性与非根际土壤明显不同[9]。本试验以黄瓜连作土壤为对象，比较研究了大葱-黄瓜轮作和黄瓜-黄瓜连作两种栽培模式对后茬黄瓜根际土壤理化和生物学性状的影响，以期探讨大葱轮作减轻黄瓜连作障碍的机理，为制定合理栽培制度提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。土壤类型为棕壤，属砂壤土，土壤理化性状为pH 值6.19，EC值 825 μS·cm-1，碱解氮238.0 mg·kg-1，有效磷151.2 mg·kg-1，速效钾131.2mg·kg-1。

供试黄瓜（Cucumis sativus L.）品种‘新津11号’，大葱（Allium fistulosum L.）品种‘元藏大葱’。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计 试验于2011年8月—2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理：大葱-黄瓜轮作（T），黄瓜-黄瓜连作（CK）。每处理30盆，随机排放。花盆直径30 cm，高25 cm，内装连作土壤10 kg。装盆前向土壤中均匀混入复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10 g，生育期不再追肥。黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株，12月20日拉秧。

后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，6月20日拉秧。

分别于5月15日、5月25日、6月5日取样。每处理随机取5盆，利用雷娟利等[10]方法获得根际土样，混合均匀，研磨过2 mm筛，一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分风干后过1 mm筛，用于土壤酶和理化指标分析。

1.2.2 测定方法

（1）土壤理化性状。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便携式pH计测定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便携式电导率仪测定；碱解氮采用碱解扩散法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定[11]。

（2）土壤微生物数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养；放线菌采用改良高氏1号培养基培养（每1 000 mL培养基中加入3%重铬酸钾3.3 mL）；真菌采用马丁氏培养基培养（每1 000 mL培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3 mL，1%链霉素3 mL）。微生物数量均采用系列稀释法计数[12]。

（3） 土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定[13]。

1.2.3 数据统计与分析 采用DPS软件对数据进行方差分析及最小显著差异性检验。

2 结果与分析

2.1 不同种植模式对黄瓜根际土壤EC值和pH值的影响

伴随生育期推进，黄瓜根际土壤EC值不断降低，生育初期轮作黄瓜的根际土壤EC值大于连作黄瓜，但定植40 d后，EC值开始低于连作黄瓜（图1）。连作和轮作黄瓜根际土壤pH值缓慢升高，轮作黄瓜上升幅度大于连作黄瓜，6月5日轮作黄瓜的根际土壤pH值高于连作黄瓜土壤。

2.2 不同种植模式对黄瓜根际土壤养分含量的影响

由图2可以看出，根际土中速效氮含量呈先升高后降低趋势，有效磷和速效钾含量则持续降低。生育初期，轮作黄瓜根际土壤中的速效氮、有效磷、速效钾含量高于连作土壤，尽管有效磷含量未达显著差异水平，说明前茬大葱吸收的养分较少。随着植株生长，轮作黄瓜根际土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于连作土壤，速效氮与连作土壤无显著差异，速效钾含量却始终较高。

2.3 不同种植模式对黄瓜根际土壤酶活性的影响

脲酶是土壤中主要的水解酶之一，与土壤中尿素的水解密切相关，其酶促产物氨是植物氮源之一；磷酸酶可加速有机磷的脱磷速度，对土壤磷素的有效性具有重要作用，其活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标；过氧化氢酶促过氧化氢的分解，有利于防止它对生物体的毒害作用，其活性则可以反应土壤中氧化过程的强度[13]。根际土壤中3种酶活性均随黄瓜生长不断升高，但轮作黄瓜根际土壤酶活性始终高于连作土壤（图3），6月5日轮作土壤中脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性分别是轮作土壤的1.24，1.11，1.27倍，说明轮作有利于提高后茬黄瓜根际土壤酶活性。

2.4 不同种植模式对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响

从图4可以看出，随着黄瓜的生长，根际土中细菌、真菌和放线菌数目均不断增加，其中，细菌在土壤微生物群落中占绝对优势。根际土壤中细菌、放线菌和真菌数初期差异不大，后期轮作黄瓜根际土壤中细菌、放线菌数目显著高于连作黄瓜，真菌数则显著低于连作黄瓜。轮作黄瓜根际土壤中真菌数占微生物总量的比例低于连作黄瓜，6月5日土壤真菌所占比例分别为0.28%和0.54%。

3 讨 论

设施连作障碍的一个重要原因是土壤酸化、次生盐渍化和养分失衡[14]。合理轮作可以降低土壤盐分积累，在一定程度上避免次生盐渍化的发生[15]。与连作相比，轮作黄瓜的根际土壤EC值降低速度较大，最后低于连作黄瓜根际土壤，可能与轮作植株生长势较强，吸收土壤中养分较多有关。王柳[16]发现，在不施肥或只施底肥情况下，黄瓜根区土壤pH值总体呈上升趋势。本试验中，伴随黄瓜生育，连作和轮作黄瓜根际土壤pH值均呈升高趋势，可能与只施用了底肥有关。

轮作黄瓜根际土壤中速效氮、有效磷和速效钾含量前期较高，说明前茬大葱吸收养分数量少于黄瓜。伴随生育进程，黄瓜根际土壤中养分含量快速降低，轮作黄瓜根际有效磷含量低于连作黄瓜，可能因为轮作黄瓜生长旺盛，对磷的吸收较多，同时磷在土壤中移动性较差[17]有关。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活动使速效氮在根际发生了富集。钦绳武等[18] 对氮素在根际迁移规律的研究中发现，氮素在旱作根际土壤中会出现富集现象。

土壤酶直接参与土壤中物质的转化及养分的释放和固定过程， 与土壤肥力状况密切相关[19]。本试验中，大葱轮作模式下土壤酶活性明显高于黄瓜连作土壤。吴焕涛等[6]也得出相似的结论。土壤酶活性升高是轮作减轻连作障碍的原因之一。

土壤微生物群落结构的多样与稳定不仅可提高土壤微生态的稳定性，也可提高土壤的缓冲能力[20]。本研究结果表明，轮作黄瓜根际土壤中可培养细菌及放线菌数目均高于连作黄瓜，可培养真菌数目则低于连作黄瓜，与杨凤娟[8]、吴凤芝[21]研究结果一致，表明轮作可以改变土壤微生物群落结构，改善土壤的微生态环境。

本试验结果表明，大葱轮作后的黄瓜根际土壤理化及生物学性状得到明显改善，可作为防控设施黄瓜连作障碍的一种有效种植模式。

参考文献：

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篇8

关键词: A - A - O工艺，变性梯度凝胶电泳，浓度，硝化细菌的结构

Abstract: The experimental use of PCR-DGGE technology to study the impact of the DO concentration of Nitrifying Bacteria in the structure of the AAO process, provide a reliable basis for system optimization.

Keyword: A-A-O process; DGGE; DO Concentration; Nitrifying Bacteria in structure

中图分类号： U664.9+2 文献标识码：A 文章编号：

1引言

大中城市污水处理厂多采用生物方法处理城市生活污水及工业废水，该法最主要优点是处理效果好，费用低。处理工艺中起主要作用的是生物反应段,活性污泥是生物处理功能主体，通过对活性污泥中微生物群落结构多样性分析对于在节约能源的前提下提高污水处理效率具有重要意义。

研究活性污泥中微生物多样性开始采用PCR-DGGE技术，并取得了较好结果。实验结合A-A-O工艺,研究好氧反应器内DO浓度改变时，相应硝化细菌群落结构变化情况。

2材料和方法

2.1关于A-A-O的设置

装置工艺参数如下：进水流量:30L/d;在三个反应池中水力停留时间：1.5h、1.5h、6 h；总回流比:300%；SRT:15天；装置启动和运行稳定共120天。好氧反应区DO平均浓度值为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5mg/L。

2.2 基因组DNA提取采用SDS裂解法。

2.3 PCR扩增

2.3.1实验所用引物

AOB菌群所用引物为CTO189fAB/CTO189fC∕CTO653r亚硝化螺菌

所用引物为 P338f∕Ntspa0685硝化杆菌所用引物为 P338f∕Nb1000f

2.3.2 PCR反应体系及反应条件

. PCR反应体系组成: Taq聚合酶0.4μL,10×反应缓冲液5μL，4×dNTP 1μL,引物2μL,模板DNA 1μL,最后加双蒸水至体积50μL。扩增程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5 min，重复步骤35次，72℃后延伸8min。

2.4 变性梯度凝胶电泳

2.4.1琼脂糖凝胶、凝胶板的制备及PCR的加样

称琼脂糖，放入锥形瓶中，再加入缓冲液，置微波炉加热至完全溶化取出摇匀，待冷却后，加入EB。 将冷却琼脂糖凝胶，倒入制胶板内，待凝胶凝固后加入缓冲液。取样品及缓冲液混合后打入胶板孔。

2.4.2电泳及观察

电泳电压为170V，结束后，放入凝胶成像系统内拍照。

3实验结果与分析

DO对A-A-O工艺硝化菌群群落结构影响

(1)DO浓度对AOB群落结构影响

DGGE分离结果如图3-5所示，得到共有8种AOB细菌，条带标为AOB1-AOB8。有三条条带（AOB2、AOB4、AOB6）一直比较稳定而且亮度比其他条带强，所对应菌种为AOB优势菌种。条带AOB7随DO浓度降低而逐渐减弱，当DO浓度为1.5mg/L时消失。AOB3在浓度为4.5、3.5、2.5mg/L使出现，而AOB5仅在DO浓度为2.5、3.5mg/L时出现。AOB1仅在DO浓度为0.5mg/L时出现。AOB8在浓度高时条带较弱，而浓度较低时条带才变强。

从图3-6可以得到L1和L2的相似性为1，表明DO浓度为4.5、 3.5mg/L时，AOB群落稳定，几乎没有任何变化。L1和L2与L3的相似性为0.92， L4与L5的相似性为0.89，可见群落结构相对较稳定。从图3-7，可以看到随DO浓度降低，AOB菌群香侬多样性指数也降低，但不是很明显。表明AOB菌群没有出现优势群落明显减少，可见DO浓度降低对AOB菌群代谢活性影响较小。

(2)DO浓度对Nitrospira群落结构影响

图3-5、3-8、3-11为不同DO浓度对AOB、Nitrospira、Nitrobacter群落结构影响

DGGE分离结果如图3-8所示，可得到共有11种菌，条带标为Np1-Np11。从图可以看出DO浓度对Nitrospira群落结构影响比较大，且DO浓度较高时，物种相对比较丰富，而随DO浓度降低，Nitrospira菌群优势群落逐渐变得单一，其中Np5为该菌群优势菌种。DO浓度大于等于2.5mg/L时，Np4、Np7、Np10能够在系统中保持一定数量。

从图3-9可以得到L1-L3泳道和L4-L5泳道的内部相似性比较高，但是2组之间确存在较大差别，表明在一定DO浓度范围内Nitrospira群落结构

较稳定，但在DO浓度在4.5-2.5mg/L和2.5-0.5mg/L时各DO浓度段优势菌群存在差异较大。相似性最高的是L4与L5，相似性达88.9%，相似性最低的是L4与L3，相似性低至18.2%，说明Nitrospira群落发生明显群落交替现象，DO浓度对其影响巨大〔1〕。

图3-6、3-9、3-12为不同DO浓度条件下AOB、Nitrospira、Nitrobacter菌群DNA相似性树状图

Nitrospira菌群香侬多样性指数如图3-10所示，表明当DO浓度处于

4.5-3.5mg/L时，达到最大值0.8，表明在DO浓度较高情况下，活性

污泥中Nitrospira菌群种类丰富。随DO浓度降低，香侬多样性指数逐

渐减小至0.4左右。说明低DO浓度对Nitrospira菌群有明显抑制作用。

(3)DO浓度对Nitrobacter群落结构的影响

Nitrobacter群落DGGE分离结果如图3-11所示，可以得到Nitrobacter

共有9种，条带标为Nb1-Nb9。还可以看出DO浓度对Nitrobacter群落

图3-7、3-10、3-13分别为AOB、Nitrospira、Nitrobacter的香侬多样性指数

结构具有很大影响。但是优势菌群条带Nb7、Nb8和Nb9在各种浓度条件下同样比较稳定而且亮度比其他条带强。DO浓度降低时，Nitrobacter群落结构丰富度也随之下降。Nb1在DO浓度为2.5mg/L和4.5mg/L时出现，Nb3和Nb5仅在DO浓度为3.5mg/L时出现，Nb4和Nb6仅在DO浓度为4.5mg/L时出现。

图3-12可以得出，L3-L5泳道相似性高达85%以上，而其与L1和L2相似性却在70%以下。可见在DO浓度降低的过程中，发生了明显的群落交替现象。从图3-11可以看出，此时除了优势菌群Nb7、Nb8和Nb9外，没有其他菌种。图3-13可以看出，DO浓度为0.5mg/L-4.5mg/L范围内，Nitrobacter菌群香侬多样性指数范围为0.6-0.8。可见低DO浓度对Nitrobacter菌群结构也存在抑制作用。且当DO浓度小于2.5mg/L时，Nitrobacter香侬多样性指数高于Nitrospira，此时Nitrobacter占NOB主导地位。

4结论

本实验研究 DO浓度对A-A-O系统硝化功能菌群落多样性的影响，得出结论：（1）实验利用PCR—DGGE 技术分析了DO浓度改变的情况下硝化细菌群落结构变化情况，可判别在脱氮过程中起到主要作用的硝化功能菌。（2）DO浓度降低过程中，AOB菌群香侬多样性指数降低，但不是很明显。可见DO浓度降低情况下对AOB菌群代谢活性影响较小。Nitrospira菌群在DO浓度大于等于2.5mg/L时，菌群种类丰富，随DO浓度降低，香侬多样性指数逐渐减小。说明低DO浓度对Nitrospira菌群有明显抑制作用。当DO浓度低于2.5mg/L时，Nitrobacter细菌香侬多样性指数高于Nitrospira，可见此时Nitrobacter菌占NOB主导地位，当DO浓度大于等于2.5mg/L时，两者香侬多样性指数差别不大，一起承担系统硝化作用。

篇9

关键词 喀斯特；贵州；白三叶；同一花序；形态多样性

中图分类号 S651 文献标识码 A 文章编号 1000-2537（2016）05-0038-06

Abstract By observing the shape index of 19 wild Trifolium repens， we compared the morphological diversity of the same inflorescence at different altitudes. Our results imply that the morphological diversity of 19 wild Trifolium repens on the same inflorescence at different altitudes has a markedly difference. The total coefficient variation of all above indices obeys the following order： leaf area>above-ground biomass>stolon length>growing point>height >leaf length>leaf width> growth habit>V shape stripe. Between different altitudes in Trifolium repens form shape in the group have difference degrees of variations. The clustering analysis found little correlation with the altitude origin.

Key words Karst region； Guizhou； Trifolium repens； the same inflorescence； morphological diversity

基因漂移、遗传漂变、遗传瓶颈、自然选择和地方适应性等因素，可以通过在不同时空尺度上的动态变化来影响并改变生物适应性和多样化的进程[1].目前，花粉污染、基因漂移等问题已经在实验中得到普遍证实，而大部分研究只是针对一些基础性工作，如花粉传播因素、基因漂移距离、杂交亲和性等[2-5].空间分离群体之间的隔离和基因流动的程度决定了遗传差异、生殖隔离和物种形成的潜在能力.遗传漂变和自然选择都会使群体之间的差异增加，而基因流的作用会使群体之间的差异减小[5].研究同一花序水平上植物形态多样性，可以减少以上因素的影响，使其表型性状与其生态适应性的研究更趋于一致.

白三叶（Trifolium repens L.）是多年生草本优质牧草，属异化授粉植物，广泛分布于世界各地，在农牧业中地位重要.贵州是中国发育最典型的喀斯特地貌之一，不仅地势起伏大、切割强、相对高度常达到300～700 m，且喀斯特广泛发育，地貌类型较复杂.其次，贵州具有高原峡谷地貌结构特征，导致水土资源分布不平衡，形成了多种特殊的生态位.白三叶在长期的演化过程中，不断向着适应其生境的方向进化.本研究收集贵州省境内19份白三叶种质为试验材料，比较其不同海拔高度居群间和同一花序水平上的多样性，为下一步选育优质高效白三叶新品种提供指导.

1 材料和方法

1.1 贵州地理与气候

试验在贵州贵阳市贵州牧草推广站温室大棚内进行，种子收集于贵州省不同海拔区域.贵州全省大部分地区气候温和，四季分明.全省平均气温的最高值出现在7月，平均22～25 ℃；最低值出现在1月，平均为4～6 ℃；年平均气温为14～19 ℃.全年极端最高气温为34.0～36.0 ℃，极端最低气温为-6.0～-9.0 ℃.常年雨量充沛，时空分布不均.全省各地多年平均年降水量大部分地区为1 100～1 300 mm，最大值接近1 600 mm，最小值约为850 mm.一年中的大多数雨量集中在夏季.全省大部分地区年日照1 200～1 600 h，气候特点是垂直方向差异较大，立体气候明显.

1.2 材料收集

2013年5～8月在全省范围内采集野生白三叶种子，有效样本19份，见表1.

1.3 栽培与观测

1.3.1 温室栽培 2014年9月20日在贵州省牧草推广站温室大棚播种.从19份材料中各选取一个果实饱满的花序，将来自同一花序的种子播入有32个小格的育苗培养盘，孔穴大小60 mm×60 mm.每小格播2粒种子，覆土1 cm，浇水.培养基质为m（石英砂）∶m（细土）∶m（腐殖质）=3∶4∶3混合而成，高压灭菌冷却后装盘.待长出小苗后留选长势较好的一株苗用于观察研究.

1.3.2 施肥和管理 每隔3个月施复合肥1次，每次施用量0.03 kg/m2，苗期施尿素1次，使用量折合0.012 kg/m2，及时除杂草，适时浇水.

1.3.3 测量指标 2015年5月1日，参照《牧草种质资源描述规范和数据标准》[6]及前人研究方法观测V型斑纹、叶面积、株高、中叶宽、中叶长、匍匐茎长度、生长点个数及地上生物量等指标.为便于分析，将非量化性状特征进行标准化赋值.海拔：1=1 000 m以下，2=1 000～1 500 m，3=1 500～2 000 m，4=2 000 m以上；有无V型斑：有斑=1，无斑=2；生长习性：1=直立生长，2=匍匐分枝生长，3=匍匐不分枝生长.

1.4 数据分析

用Excel和SPSS 16.0对试验数据进行统计，分析不同海拔高度区域白三叶种内、同一花序水平上各个性状的差异程度.各形态变异性以变异系数CV表示，CV（%）=100×S/M（S为标准差，M为平均值）.用Person相关系数分析各个性状之间的相关性，并对各个指标标准化后用算术平均法（UPGMA）聚类分析.

2 结果与分析

2.1 白三叶形态学分析

2.1.1 同一花序白三叶形态学性状差异分析 同一花序水平上和不同种群间白三叶形态存在较大差异（表2）.总变异系数大于300%的有7个居群，其中W16总变异系数最大，高达429.74%，其次是W12，W1，W9，W6，W3，W10；最小的是W7，总变异系数为236.9%.各指标总变异系数从大到小为中叶面积、地上生物量、匍匐茎长度、生长点数、株高、中叶长、中叶宽、生长习性、有无“V”斑.株高变异系数最大的是W10和W18，分别为37.93%和37.51%，W2最小，只有12.63%.地上生物量变异系数最大的是W3和W1，分别为98.48%和81.67%，W14和W7的最小，为38.31%和38.55%.匍匐茎长度的变异范围为30.95%～65.75%，变异系数最大和最小分别是W7和W3.中叶宽的变异范围主要为10.89%～32.11%，只有居群W8的变异系数高达60.61%.中叶长的变异范围为13.33%～32.77%，变异系数最大的为W16，最小为W7.中叶面积的总变异系数比其他指标大，其中W16，W12，W3和W6的变异系数均大于100%，最小的是W11，只有30.33%.生长习性的变异范围为0～35.33%，其中W14，W18和W19的变异系数均为0，即这几个居群都是匍匐分枝生长.有无“V”形斑中只有W1，W5，W11，W13和W19发生了变异，其余居群全都有“V”斑.生长点个数最大变异是W1，为64.09%，其次是W16，W9，W12和W10，最小的是W2，仅为0.75%.

2.1.2 不同海拔高度白三叶形态学数量性状分析 不同海拔区域白三叶形态形状居群间存在显著差异，见表3.总体上，随着海拔的提升，白三叶植株越来越高，生长点数越来越多，地上生物量也越来越大；而匍匐茎长度、中叶宽、中叶长和中叶面积则随着海拔的提升而增大，高于2 000 m的区域则有所减小.在低于1 000 m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，高达102.87%，其次是地上生物量、中叶面积，最小的是中叶宽，仅为25.49%.在1 000～1 500 m区域，变异范围为21.43%～80.46%，最大的为匍匐茎长度，其次是地上生物量、生长点个数、中叶面积，最小的是中叶宽.在1 500～2 000 m区域，变异范围是21.29%～49.62%，其中变异最大的为地上生物量，其次是中叶面积，中叶宽变异最小.在大于2 000 m的区域，匍匐茎长度的变异系数最大，为61.37%，其次是地上生物量、中叶面积、株高，最小为中叶长，仅为23.21%.

2.2 形态学形状相关性分析

白三叶的株高与地上生物量、匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积、生长习性及生长点数呈极显著相关性（见表4），与有无“V”形斑和海拔高度无显著相关；地上生物量与匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积及生长习性呈极显著相关，与海拔高度呈显著相关；匍匐茎长度与生长点数极显著相关；中叶宽与中叶长、中叶面积、生长习性及生长点数呈极显著相关；中叶长与中叶面积、生长点数及生长习性呈极显著相关；中叶面积与生长习性及生长点数极显著相关；生长习性与生长点数呈极显著相关；生长点数与海拔呈极显著相关性.即随海拔的提高，地上生物量也随之增大，生长习性有由直立生长到匍匐分枝到匍匐不分枝生长的趋势.

2.3 基于白三叶形态性状的聚类分析

根据贵州野生白三叶的形态鉴定数据进行聚类分析，在欧氏距离为14.5截距处，可将19份白三叶划分为3个聚类（图1），3个聚类性状平均值见表5.第Ⅰ类包括8份材料，平均株高最矮，地上生物量、匍匐茎长度、中叶宽、中叶长、中叶面积和生长点数的平均值最小，只有少数无“V”形斑点；第Ⅱ类包括10份材料，其生长点数最多，其余性状指标的平均值介于第Ⅰ、Ⅲ类之间，少数无“V”形斑点，大多是匍匐分枝生长；第Ⅲ类只有材料7（汇川区董公市镇，987 m）独自成一类，除匍匐茎长度最短外，生长点数介于第Ⅰ、Ⅱ类之间，全部有“V”形斑点，均匍匐分枝生长，其余形状指标的平均值均大于第Ⅰ、Ⅱ类.由此可知，聚类分组与海拔高度没有明显的关系.

3 讨论与结论

3.1 岩溶地区不同海拔野生白三叶同一花序形态多样性

种质资源是生物遗传变异和生物多样性遗传的物质基础，运用形态学标记研究植物外部形态，受基因及所处生态环境的共同影响.目前，关于开花植物花序内变异原因的研究有很多[7]，有研究证明，对不同生态环境下的同种植物的形态学研究，可以了解环境对基因表达的影响[8]，而不同海拔区域带来的环境差异会使各类昆虫的活动受到限制或促进，导致不同海拔地区访花者种类和访问比例的差异[9].在同一花序水平上研究不同海拔区域白三叶表型特征，既可以减少基因漂移、花粉污染等外部影响，还可了解由海拔带来的环境差异对其形态的影响，为下一步研究工作提供更精密的数据.本研究结果显示，贵州19份野生白三叶同一花序水平上总变异系数大于300%的有7个居群，其中W16总变异系数最大，无论是居群内还是居群间贵州白三叶形态差异都比新疆[10]白三叶的大；各指标中总变异系数为最大的是中叶面积，其次是地上生物量、匍匐茎长度、生长点数、株高，说明其可塑性较大.贵州因地势起伏较大，生境复杂，蕴藏着丰富的野生植物资源，例如钟理[11]发现贵州野生匐剪股颖各形态学性状均存在较大的变异，形态遗传变异多产生于居群内.本研究材料采集地间海拔跨度较大，小气候类型多样，生境差异明显，为适应不同的生境，白三叶在长期的进化过程中，形态性状也随之改变.

3.2 岩溶地区同一花序野生白三叶的多样性与育种

在育种工作中，借助部分表型性状及其组合，可实现对白三叶目标性状的有效选择.本研究中不同海拔区域甚至同一花序白三叶栽培群体内都存在较丰富的遗传变异，可塑性较大，可为优良类型的选择提供材料.目前，对白三叶形态农艺性状已有较多研究，但主要集中在居群间和居群内水平上[10，12-13]，在花序水平上的研究还未见报道.目前分子生物学技术已成为植物育种研究的有效工具，如李润芳[14]运用细胞学方法和SRAP分子标记技术对8种三叶草的种质资源遗传多样性进行了初步评价，张婧源[15]对来自30个国家的70份野生白三叶从表型性状、SRAP分子标记和SSR分子标记上进行了不同产地白三叶种质资源遗传多样性研究.在花序水平上研究其形态多样性，通过人工选育成的优良品种经济性状整齐、遗传基因稳定.因此，对白三叶进行优良品种选育，最终建立良种繁育体系成为获得质量稳定、可控优质白三叶的必经之路.

3.3 岩溶地区贵州野生白三叶的利用价值和开发前景

贵州地处我国云贵高原，属长江、珠江上游地区，是我国典型喀斯特区域之一，地理位置特殊，其生态环境的优劣将直接影响整个长江、珠江流域的生态环境安全.目前，对喀斯特地区生态系统植物恢复多集中在森林生态系统的恢复研究[16]，对喀斯特山地草地相关研究还比较少[17].对贵州野生白三叶种质资源进行研究，揭示喀斯特地区白三叶种质资源丰富度、多样性、蕴藏量等特征，可为喀斯特石漠化地区草地植被恢复提供支持.本研究通过统计分析白三叶同一花序水平上形态多样性，发现其可塑性较大，在育种工作中可利用差异较大的材料W16和W12作为亲本培育优质高效品种.还可利用白三叶进行矿山植被修复，有研究发现其能同时富集污染土壤中的铜、镉、铅，且富集量大[18]，是很好的矿山修复植被之一.此外，白三叶还是重要的优质豆科牧草之一，影响当地农牧业发展.因此，下一步将全面系统地调查和收集贵州、四川、广西、新疆及云南等地区野生白三叶种质资源，增加其多样性，为充分发挥白三叶资源的生态和经济效益提供支持.

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篇10

关键词：湖泊湿地；湿地保护；湿地修复；研究进展

中图分类号：S157：TV213.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2017）05-0151-08

Research Progress on Protection and Restoration of Urban Wetlands

Yan Xiong，Wei Xianliang，Wei Qianhe，Wang Chen，Peng Errui

（College of Hydraulic Engineering，Yunnan Agricultural University， Kunming 650201，China）

AbstractIn this paper， we analyzed the problems faced by lake wetlands， such as water pollution， area shrinkage， biodiversity loss， serious biological invasion， single research method， ambiguous direction， lagging education， imperfect legal system and management chaos. Start from the functionality of lake wetlands， eight major principles concerning lake wetlands protection and restoration were put forward. In addition， the research progress of wetland restoration both at home and abroad was also summarized from three aspects of physical measures， chemical measures and biological measures. In the end， we raised the overall framework of lake wetlands protection and overall planning， focusing on integration with eco-hydraulics， market operation mechanism and other protective countermeasures. With the purpose to promote the research on lake wetlands， and the overall development of the subject of wetlands protection and restoration， the future was expected from ecology monitoring， system regulation， degradation diagnosis， evaluation mechanism， scientific planning， deepening research， strengthening management and other aspects.

KeywordsLake wetlands； Wetland protection； Wetland restoration； Research progress

《竦毓约》中的湿地定义：“陆地上所有的水体、湿地内水深超过6 m的水域和低潮时水深不超过6 m的海滨”[1]。照此定义，湿地应包括湖泊、沼泽、水库、池塘、水田、蓄滞洪区、湿草甸、河流河口三角洲以及低潮时水深浅于6 m的海域部位，其中湖泊湿地包括永久性淡水湖、咸水湖、内陆盐湖和季节性淡水湖、咸水湖[2]。

湖泊湿地作为一种重要的自然资源，发挥着供水、灌溉、调洪、养殖、畜牧、航运、旅游、维护生物和遗传多样性、降解污染、净化水质和控制侵蚀等多种功能，在维持区域生态平衡和促进区域社会经济发展中发挥着重要作用[3]。然而近20年来，人们在开发利用湖泊资源的过程中，忽视了对湖泊的有效保护和管理，致使出现了以下新情况：湖泊湿地的水体污染加剧、富营养化严重；生物入侵严重、多样性下降；大规模围垦种植、面积萎缩等，这些现象使湖泊湿地生态系统逐渐丧失其功能，造成了严重的环境问题。因此，采取积极有效的措施，促进湖泊湿地生态环境保护与生态功能恢复，已是当务之急。

从19世纪起国外学者就开始了对湖泊湿地的保护与修复研究工作，而我国在2006年也制定了《全国湿地保护工程规划》，明确了湿地保护工作的指导原则、任务目标、建设布局和重点工程，但湖泊湿地的保护和修复工作在上述规划中并没有被突出强调，也没有引起相关专家学者的足够重视。

1湖泊湿地面临的主要问题

通过归纳前人的一些研究成果，本研究对湖泊湿地生态系统有了相对比较全面的功能界定，其最主要的功能在于其生态功能和社会功能（见表1）。

近几十年来，人们对湖泊湿地功能缺乏了解，保护意识淡薄，在短期利益驱动下，违背自然规律，不合理开发，使湿地功能受到严重干扰和破坏。

1.1水质污染，富营养化日趋严重

虽然国家对保护环境逐年重视，环境治理力度也不断增加，但是治理速度远远跟不上水体污染的步伐。2014年我国污废水排放总量达716.2亿吨[8]，在监测的28个重点湖泊中，满足Ⅱ类水质要求的只有1个，而其中滇池、巢湖和太湖等均处于不同程度富营养化状态[9]。陈小锋等[10]对中国典型湖泊的富营养化情况进行调研，表明近30年是我国湖泊富营养化的高速发展阶段。

1.2面积萎缩，生态功能衰退

湖泊湿地面积萎缩，导致湿地生态系统的调蓄洪水、水体净化等各项功能逐渐丧失。近30年来，我国面积大于1.0 km2的新生湖泊有60个，但原面积大于1.0 km2的湖泊却消失了243个[11]。2000―2010年全国最大面积超过1 000 km2的湖泊共有12个，但其中6个在萎缩，鄱阳湖萎缩速率最快，为54.76 km2/a[12]，其中东北地区，湖泊面积由12 234.02 km2锐减至11 307.58 km2[13]。

1.3生物多样性下降，资源锐减

湖泊湿地中水陆交错的自然生态系统，是各种动植物的栖息地，然而人类对湖泊湿地的无序开发，造成生境和物种群落多样性下降、生物资源退化，尤其是造成珍稀动物资源面临濒危和灭绝的危险。例如：1998―2003年期间，洪泽湖底栖生物原有76种，减至50种，鱼类减少29种；鸟类原有194种，减至146种，其中Ⅱ类重点保护鸟类减少14种[14]。鄱阳湖由于围垦和排水开垦等原因，鱼类、越冬候鸟等生物的生境大量减少，导致生物多样性严重破坏[15]。

1.4生物入侵严重

在湖泊湿地生态系统中，盲目引进外来物种，致使本地物种濒危的现象，已成为21世纪全球性环境问题[16]。例如，在水生生态系统中，最为突出的入侵物种有凤眼莲[17]和水花生[18]，目前它们已经对湿地和水生生态系统造成了极大危害，特别是滇池湿地受凤眼莲之害，治理难度大。在陆生生态系统中，紫茎泽兰[19]、豚草[20]和大米草[21]的入侵，严重影响了当地物种的生长，其中大米草在东南沿海局部地区对当地生物多样性造成破坏。薇甘菊[22]在浙江、广东大面积入侵农田，暴发成灾。另一方面，引进外来鱼类对土著鱼类也造成危害[23]。综上所述，随意引入外来物种，其后果在短期内是不可预见的。

1.5研究手段较单一，研究方向不清晰

目前大部分湿地恢复研究主要围绕局部湿地格局恢复和调整的模式，缺乏对流域尺度格局与水生态过程的系统研究[24]，很难建立对湿地进行整体性水生态过程恢复和调控的机制。另一方面，N、P和COD主要源于生活污水、工业废水、农田施肥和水产养殖业及畜牧业等[25，26]；而在没有做到控源截污的前提下，只是片面强调通过采用生态恢复措施来净化湖泊湿地水环境[27]，竟然一度成为湖泊富营养化治理的主流方向。

1.6宣传教育滞后，法制体系不完善，管理混乱

目前我国湿地合理利用与保护的宣传、教育工作严重滞后于现阶段资源保护形势和经济发展的要求，且其强度和辐射范围均不够，人们对湿地的保护意识和对湿地价值的全面认识尚有所欠缺[28]。此外，目前我国没有专门针对湖泊湿地规范利用与保护的法律、法规。已有的相关法律、法规中有关湖泊湿地规范利用和保护的条款较为分散、不成体系、不够全面，并且各法条间相互交叉、重复的情况并存，很难发挥其实质效能[29]。最后，湖泊湿地开发利用及保护管理牵涉面广、涉及部门多，尚未完全形成良好的内部协调机制，且管理手段和方法滞后[30]。

2湖泊湿地保护与修复的研究进展

2.1湿地修复原则

①生态效益与经济效益相统一原则。即湖泊湿地的效益是综合性的[31，32]。目前国外的生态功能―经济效益综合评价缺乏定量方法，采取描述或D形表示两种形式，我国董哲仁等[33]提出经济效益和生态功能综合评价矩阵方法，建立了一种数学表达方法，实现湖泊湿地功能和效益综合评价的定量化；②风险最小和效益最优原则[34]。在湖泊湿地修复规划中权衡方案，对被恢复湖泊湿地进行全面的综合分析、论证，在考虑生态、经济、社会效益最大化的同时，兼顾风险和投资；③整体性原则。湖泊湿地恢复不仅应促进退化湿地构成要素的原位恢复，还应重视恢复湿地所处集水区域内的横向水文联系、与所处流域上下游之间的纵向水文联系以及地下水和地表水系统的垂直方向的水文联系；④地域性原则。制定湖泊湿地修复计划前，应全面掌握湿地类型、气候条件、地理条件、经济基础等修复区的相关信息。充分分析修复计划对湖泊区域经济和生态价值的影响，突出地域性特征，最大可能维持地带性植被，减少对当地生物群落的破坏；还需尊重当地传统乡土文明，保护自然生态环境的成分，维持地域性的生态平衡[35]；⑤稳定性原则。保护和修复湖泊湿地应重视系统内部各组成要素之间和系统环境之间的协调及统一程度、生物群落的组成、群落功能和结构的完整；⑥可行性原则。在湖泊湿地保护与恢复工程实施前，应考虑项目的环境可行性和经济可行性；⑦优先性和稀缺性原则。湖泊湿地保护与修复项目需突出针对性，应优先保护濒临灭绝物种的生物栖息和地稀缺湿地[36]；⑧景观和美学原则。李春晖等[37]人将水质、生态和景观定为湿地修复的三大目标，阐明恢复湿地景观和添增美学效果的重要性。

2.2修复技术与进展

总结国内外湖泊湿地修复的研究成果，湖泊湿地修复技术可分为物理措施、化学措施和生物措施三大类共13种（见表2），且这些技术已在国内外湖泊湿地修复工程中得到广泛应用。

2.2.1物理措施刘华丽等[38]分别从外源污染、沉水植物、作业区域和深度3个方面，研究了对沉积物疏浚技术效果的关键影响因素；张杰等[39]基于DEM和土地利用土地覆盖的适宜性分析为湿地恢复提供了理论依据；张修峰等[40]通过使用STELLA软件，构建了三湿地水体TP变化生态模型并成功的进行了模拟研究，结果表明对底泥不同程度的疏浚，会影响对水质改善效果；万玉文[41]通过采用柱形管槽静态的模拟塘堰湿地，模拟了不同水深处理下的底泥氮磷释放对上覆水水质的影响，结果表明水流的扰动会导致底泥中磷的释放加速；夏红霞等[42]利用页岩空心砖构建自动增氧型湿地系统，增强了系统内部供氧能力和湿地系统的除氮能力；潘继征等[43]研发了人工增氧复合型湿地工艺，其对不同水力负荷和污染负荷都展现出了较强的缓冲调节能力和很高的净化效果 ；黄等[44]利用遥感技术对湿地恢复及生态调水进行实时动态监测，及时掌握宏观地表下的快速变化，也为长期的区域生态效应评价提供技术支持；董张玉等[45]结合GIS/RS，对湿地恢复潜力从地貌条件、河流及道路密度、景观结构因子、湿度指数、耕地生产力五方面进行空间分析，明确了东北地区湿地修复的优先、次优先区域，并利用景观指数、作物生产与湿地协调发展指数验证恢复效果。国外学者也做了相关研究，Kowalski等[46]通过采用便携式围堰技术，恢复了伊利湖湖滨湿地挺水植被；Tian等[47]在密西西比―俄亥俄―密苏里河盆地进行湿地水文恢复，其中的“牛轭”设计，有效降低了水体中可溶性活性磷、硝态氮、总磷和总氮的含量；Zedler[48]对有关湿地恢复理论做了全面的总结，认为湿地恢复应遵循生态位理论、岛屿生物地理学理论、种群理论和营养级理论；Malson等[49]通过田间和温室试验，利用苔藓配子体片段进行湿地恢复。

2.2.2化学措施黄洁慧等[50]提出采用“径流雨水汇集、渗流、预处理+河水造流生化预处理+主湖造流生化+构建全湖生物多样性”的全生态组合技术，应用于湖泊中；郑骏宇等[51]采用化学强化―复合人工湿地组合工艺，对湿地的大量颗粒悬浮物和水体中的COD、BOD5和TP的去除效果明显；徐轶等[52]针对海新河污染特点，采用絮凝沉淀结合人工湿地技术进行修复，效果良好；张帅等[53]探讨了生物水处理系统和加载絮凝沉淀技术相结合的研究方法；李晓威等[54]通过试验确定了最佳絮凝效果时间，并且推算出絮凝剂与泥浆绝对浓度的函数关系，以及泥浆与絮凝剂的最佳配比。按照得出的函数关系配比絮凝剂，可以缩短絮凝时间，提高脱水和施工效率。李星等[55]通过研究复合除藻剂，表明了其对藻类具有很好的去除效果；刘爱民等[56]研究了链霉菌WH63的抑藻效应，效果明显；周全等[57]研究了藻存量削减和磷营养控制两种方法，均能在水华形成的早期对小型富营养化水体蓝藻水华起到阻遏作用；李静会等[58]通过进行化学除藻剂治理蓝藻水华的试验研究，结果表明，除藻剂除抑蓝藻效果显著；王正兴等[59]利用国外新型除藻剂―去藻247，研究滇池水藻类污染的治理，并通过线性回归方程来拟合水体中叶绿素a和总磷的相关性。

2.2.3生物措施吴国旭等[60]研究表明，生物接触氧化工艺可以实现降解有机物，并利用类似曝气池的曝气方法提供氧气，同时起到混合搅拌的效果；李少华等[61]采用调水补水、生物调控等技术对沧州湿地水环境修复；李静[62]提出水解酸化―人工湿地处理技术；马秋莎等[63]通过利用长链烷烃的微生物降解作用，对湿地进行研究；邓志强等[64]通过植物刈割、水生动物强化法、优势植物筛选、微生物强化技术等途径，解决了人工浮床技术净化能力差和适用范围有限的缺陷；朱鸣鹤等[65]通过研究潮滩植物中翅碱蓬对重金属累计效应，发现铜、锌、铅、镉4种重金属在不同潮滩中均有明显的累计效应；王曙光等[66]用真菌生产生物菌肥，不仅能增加农作物产量，还减少了面源污染对湿地水体的污染；吴迪等[67]在上海青浦大莲湖湿地修复示范工程中，采用改变土地利用模式、水系改造和植被配置等技术，使湿地生境结构和生物多样性组成都分得到改善；张明祥等[68]根据研究区的水文条件、土地利用现状、海拔和受威胁程度的不同，通过研究结果可知在黄河郑州段的二滩、嫩滩和部分老滩区域均可以采用溪流型、蓄水型、多塘型湿地恢复模式；董凯凯等[69]在黄河三角洲芦苇湿地，通过比较退化区与淡水恢复区的土壤pH值、盐分、全氮、铵态氮、硝态氮、有机碳的含量变化，阐明了湿地恢复对土壤碳氮含量的影响；王国栋等[70]采用温室萌发法，对天然湿地、不同开垦年限湿地种子库的规模和结构进行了研究，详细地阐述了湿地种子库的特征及其在植被恢复中的潜力；中国科学院通过研究固定化增殖氮循环细菌群SBR法，对富营养化湖泊进行水质净化，实现总氮量和COD下降了75%，氨氮量下降了91.5%[71]。黄磊等[72]研究了空心菜和菖蒲等植物在净化微污染潜流人工湿地中对N、P的不同去除效果；Tuncsiper[73]对水平潜流式、自由水表流式、表面流式的人工湿地进行研究，发现此三种形式的湿地系统对NH4+-N的平均去除率为49%～52%，其中表面流式湿地系统的平均去除率为58%，水平潜流式人工湿地对TP的平均去除率为60%，效果明显。

2.3湖泊湿地保护对策研究

2.3.1制定湖泊湿地保护总体框架，明确功能定位，分类型、分层次保护根据湖泊湿地所处范围内的自然环境特点和社会经济层次，制定湖泊湿地保护目标和总体框架，确定不同区域、类型湖泊湿地保护的路径和侧重点；在此基础上，明确湖泊湿地的功能定位及其保护对象、目标和范围，继而整治与其功能定位不相符且不合理的开发行为，逐步恢复其被破坏功能，保证其生态功能的完整性和系统健康；划分重要开发利用区、缓冲区、保护区等，分层次进行有效保护，从而引导和规范湖泊湿地资源的可持续利用，并且维护和提升湖泊湿地的主导功能。

2.3.2从流域整体性角度，进行全面湿地修复规划湖泊往往与池塘、渠道、河流等部分组成复杂的湿地水生态系统，各部分间互相影响，相互制约[88]。因此，对湖泊湿地修复规划，应从流域的层面上进行整体性考量[3，89]。近10年来，国际上学者突出湿地生态系统整体恢复和调控思想，从大尺度上考虑毗邻集水区域和湖泊湿地所处整个流域的生态系统结构和功能完整性[90]。长江中游的“重建江湖联系，恢复湿地生命网络” 和鄱阳湖的“山江湖”等示范项目，即是在流域尺度上的湿地保护与修复的研究[91]；“莱茵河行动计划”湿地修复项目就是以流域尺度为出发点，进行水生态过程和水环境修复，取得显著效果[92]。Hermoso等[93]研究表明湿地恢复过程中，地下水深度变化对土壤和植被类型影响很大，湿地恢复除应强调流域之间连接性的修复外，还应考虑到地下水与地表水之间的水文联系。

2.3.3湖泊湿地修护侧重与生态水工结合20世纪90年代开始，美国在南佛罗里达大沼泽区域的湿地恢复项目，应用生态水工学，将人工直线型重新恢复曲线型河道，减缓了区域内雨季水体的排泄速率，实现了大沼泽竦厣态需水补给[94]。日韩等国提出“与自然亲近工程”的修复理念，如采用新型生态材料建造人工岛，为动物提供栖息地[95]。在湖泊湿地修复工程中，结合生态水工学原理，在一定程度上保持其原有自然生态水文过程，在满足安全的条件下，改善湿地的生态功能，采用有益于湿地生态系统及生物多样性保护的施工规范和标准，作为湖泊湿地修复重要思路之一[96]。

2.3.4完善湖泊湿地修复市场运作机制美国20世纪90年代基于“无净损失”湿地恢复与保护政策发展了“湿地银行”等湿地恢复市场机制[97]。“湿地银行”商业化的市场运作模式，使土地开发与湿地保护形成一种良性互动；美国密西西比河流域湿地恢复提出一种“氮农业”的运作模式，鼓励农民恢复建立湿地以降低输入海湾的氮负荷，其中政府向个人提供补贴，用于恢复可储蓄洪水的湿地，且建立了“氮农业”交易市场，促进各方参与交易，最后评估得到去除1吨氮的湿地相当于2 500美元的补贴价值[90]。该市场机制在减轻农业从业者对政府补助依赖的同时，还减少了这些区域的农业非点源污染，及增强了防洪安全。

3研究展望

3.1加强湖泊湿地生态系统监测与调控

结合3S技术，收集其生态特征的变化指标，建立信息数据库，及时动态掌握其环境状况，针对性的采取科学的保护与修复措施，实施调控。

3.2建立湖泊湿地退化诊断与评价机制

研究湖泊湿地结构和功能的退化过程，探求其驱动因子和关键过程，辨析湖泊湿地退化机制和模式。将实体模型与数值模拟相结合，剖析水循环过程对湿地演变的作用机制，模拟湖泊湿地生态系统的结构、特征、规模对人类活动的响应，建立湖泊湿地评价机制。

3.3科学规划，恢复河湖连通性

基于河湖水系在水文和水环境等方面的复杂性，目前对河湖水系连通及其区域系统间相互影响还缺乏充分认识，迫切需要针对自然因素和人类活动因素造成的连通性削弱或中断问题以及河湖水系间连通性方面的战略需求，开展河湖水系间生态连通规划关键技术研究，在基础理论、工程体系、仿真平台及效果评估等方面创新研究，构建河湖湿地水系间生B连通规划技术体系。

3.4建立湖泊湿地生态经济的可持续管理模式

可持续管理模式具体措施如下：加强湿地旅游管理；加大宣传教育力度，普及湿地及其保护的知识、法律法规，强化民众的湿地生态忧患和保护意识；进行湿地立法，及完善地方法律法规，使湿地保护或开发利用进入有序和法制状态；制定湖泊湿地经济发展规划时，突出生态经济可持续发展。

3.5加强国际交流与合作，深化湿地科学研究

加强湿地的基础和应用技术研究，及时掌握国内外湿地修复学术动态，总结并推广开发利用及保护的成功经验；扩大合作领域，建立国际交流机制，开展多课题、多学科综合研究。

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