动物行为学的研究范文
时间：2024-02-07 18:07:05
导语：如何才能写好一篇动物行为学的研究，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。
篇1
关键词：导课 实验 思维 成功 兴趣
我校是一个小县城的三类学校，学生基础普遍不好，在遭受中考的挫败后，学习动力严重不足，如何将他们重新拉回课堂，恢复他们的自信，重新投入到紧张的高中学习生活当中，这是最为紧迫的问题。
成功教育理论让我受到启发，高中物理课堂教学中学生在课堂上的“冷场”、“局外人”现象正是由于缺少成功的体验，缺少参与的热情。因此高中物理课堂要寻找学生感兴趣的话题，站在学生的生活经验上，激发他们的兴趣，让每一个学生体验到畅所欲言带来的乐趣与成就感。
一、运用新颖的导课方法，引发学生的学习兴趣
运用小魔术、小实验、讲故事、说新闻、看图片、幻灯片及多媒体等手段，引导学生从情景中进入角色。
[案例1]大气压强――小魔术引入
一进入课堂老师手拿着一个碗问学生，谁能够用手掌把碗吸引住而不往下掉呢？学生都摇头表示不能，此时，老师右手拿碗（事先把碗底弄湿），往左手手掌心上用力压一下，排除碗底里面的空气，慢慢地转动左手手掌，使手掌心朝下，然后松开右手，看到了碗被左手掌心吸住了而不往下掉。学生惊叹之余，再引出大气压强，学生兴趣倍增。
[案例2]惯性――小实验引入
在引入惯性新课时，老师可用这样一个实验来引入。在一个盛有半杯水的烧杯口上放一块硬塑料片，塑料片上放一个鸡蛋，用不锈钢尺（相当于弹片）与塑料片垂直后拉开，问学生，“放手后，鸡蛋会怎样？”此时学生的注意力都集中到了鸡蛋上，有的说鸡蛋会随塑料片飞出来，有的说不会。这时，老师把变弯的钢尺一松手，“啪”的一声，塑料片飞出去了，只见鸡蛋稳稳当当地落在水中，学生紧张而专注地目睹了这一切，此时，再问“为什么呢？”学生注意力高度集中，兴趣盎然。
[案例3]磁现象――故事引入
在讲授磁现象这一节时，可以用讲故事的方式引入。秦始皇在建阿房宫时，为了防止刺客进入宫内，在进宫大门的两边放置两块大磁石。此时问：你们知道为什么吗？课堂上顿时活跃起来。
[案例4]乐音三特征――视频引入
在引入乐音三特征这一节时，首先让学生观看《交响乐音乐会》录象片段，让学生感受到乐音的高低起伏（音调），轻重大小（响度），和不同乐器声音的差别（音色）。这样的视频引入，把平淡的文字表达演化为生动直观的形象，把抽象的知识演化为具体的可以感受到的东西，能迅速抓住学生的眼球，使学生产生浓厚的兴趣。
导入新课时提出一些日常生活中常见的物理现象，引起学生的好奇心，从而引发学生的学习兴趣。例如：讲压强时问：为什么我们坐在沙发上比坐在子上舒服一些？磨刀不误砍柴工的物理道理是什么？在讲摩擦起电时问：油罐车为什么拖一条尾巴――铁链？冬季晚间脱毛衣时往往看到火星闪烁？在讲影响浮力大小的因素时问：为什么生饺子或元宵沉在水底，煮熟后浮在水面之上？
二、新、奇、悬、趣、迷的实验，使学生见之生趣
众所周知，物理学是一门以实验为基础的科学，对于中学生来说，新、奇、悬、趣、迷的实验，会使他们感到新鲜和好奇，可以给他们带来饶有兴趣的乐趣，在此基础上，才能使他们有效地掌握物理基础知识，使之逐步取得探索物理知识的主动权，掌握学习方法，培养自学能力。
[案例1]学习“功”这一章时，对功、功率、机械效率三个概念容易混淆，为了解决这一难题，可以设计一堂比赛形式的实验课，比比谁做的功最多，谁的功率最大，谁的机械效率最高。每个同学都抱五块砖以最快的速度从一楼跑上四楼，设计方案，测出自己做的功，功率、机械效率。然后集体讨论评选出四个“全班之最”。上楼最快的，做功最多的，功率最大的，机械效率最高的，四项冠军分别由四位同学获取。这一结果把学生的思维集中到了同一个焦点上，为什么做功最多的，功率不是最大？机械效率也不是最高？为什么上楼最快的，做功却不是最多？通过这样生动有趣的实验课，把本来混淆不清的概念变得简单易懂，把理论知识转变成了亲眼所见的事实，使学生在欢快的“游戏”中，学到实在的知识。
[案例2] 例如讲“热传递”时，演示“开水煮活鱼而鱼不死”，吸引学生的注意力。在“惯性、惯性定律”教学中，装满水的杯子，当水杯突然向左运动，杯内的水会从杯口溢出来吗？杯内的水是向什么方向溢出的？为什么会发生这种现象？教师在讲台前认真演示，请同学回答现象，这样引入新课，也能激发学生学新知识的欲望。除演示实验作为引子外，还可以讲述物理学史的内容，来开阔学生眼界，了解物理学家及其思想工作、方法，来增强物理教学的魅力；而讲述一些有趣味的小故事，也能吸引学生的注意力，引起学生兴趣。
[案例3]给学生适时讲授有趣味的故事是满足学生学习兴趣的一种补偿方式。例如在讲到玻意耳――-马略特定律的时候，介绍定律的来历以及不同国家对定律的不同称呼可以吸引学生的注意力，为进一步学习创造良好的氛围。当讲到历史上曾有一位学者叫赫曼，为了验证天电（闪电）与它电是否是同种电，竟被雷电击死在实验台上时，课堂一片寂静。当讲到秦始皇在建阿房宫时用磁石来防刺客时，课堂上又是一片活跃气氛。
[案例4]举例寓趣，置疑设趣，习题融趣，在课堂教学中，教师可以适时地穿插一些日常生活中富有趣味性的例子，来说明物理原理。例如讲授“声音可否在固体中传播”时，举例：“伏地听声”的故事，人可以伏在荒野的地上听到远处的马蹄声。在进行液化教学时，举例：夏天从冰箱里拿出来的鸡蛋会“出汗”，用此来说明液化原理，就可以活跃课堂气氛，激发学生学习的兴趣。在课堂教学中，“设疑”也是教学中一个重要手段，它可以开发学生思路，激发学生探索知识的兴趣，使其主动去学。正因为如此，教师不仅善于释疑，以激发学生的好奇心，引发学生的注意力，唤起学生学习物理知识的兴趣。例如：鸡蛋握在手心中不容易捏破，而放在桌上，只要一个手指往下一按，就压破？为什么热粥要一面搅拌，一面吹气，才使稀饭凉得快？象这类设差别，既贴近生活，又能激发学生的好奇心，引起兴趣。
三、努力提供“成功的机会”，增强学生学习兴趣
不论是教师的讲授，还是实验，都应努力创造一种有利于学生独立思考的情景，始终将学生置于探索者、发现者的位置，在条件许可的情况下应尽可能将物理课移到实验室去上，演示实验尽可能让学生参与，让学生切身体会到成功的乐趣。
篇2
比较行为学是比较医学的一个分支，是一门多学科、多层次相交叉的边缘性、综合性学科，通过本门课程的学习，可以提高学生对人类行为的更深层次的理解和认识，并通过研究动物模型的行为内涵，建立可以评价的行为研究方法与人类行为内涵的比较，进而为人类行为研究提供基础。比较行为学研究的主要内容包括行为的遗传学倾向、行为的生理基础、动物行为特点和研究方法、自发和社会行为研究方法、认知行为研究方法、摄食行为研究方法、阿尔茨海默病动物模型及研究方法、帕金森病动物模型及行为研究方法等。本课程不仅可以开阔学生的视野，增加对生物体行为的了解，也可以为学生进一步学习基础医学课程奠定基础。
2教学概况
吉林医药学院面向本科各专业开设了比较行为学选修课，内容涉及行为的遗传学基础、啮齿动物的行为生理学、动物行为特征及研究方法、啮齿动物的自发与社会行为研究、认知行为研究方法、摄食行为模型与研究方法、运动行为研究方法、跑台与动物模型运动研究、阿尔茨海默病动物模型及行为分析、精神疾病动物模型及相关行为学研究、帕金森病动物模型和行为研究方法等。选修课和必修课的性质不同，且学生多凭兴趣选取，所以在教学方法上可更加灵活多样，教学中采用多媒体结合视频的教学形式，且二者占用学时相同，因而更为生动地展现了相关行为学案例，同时教学中结合了课堂讨论、课后作业、课前提问等方式，不仅使学生加深理解，又激发了学生的学习兴趣，给学生更加深刻的学习氛围，开阔视野，达到很好的教学效果。课程考核采用作业和平时成绩相结合的方式进行。讲完相应的知识点，让学生根据知识点查阅资料，围绕知识点书写相关课题的近几年研究成果，完成作业，回收率达到100%。平时成绩主要考察学生平时课堂表现。课程结束后，对课程学习情况等进行问卷调查，了解学生对课程的学习情况以及意见和建议，不断完善课程教学。
3问卷调查
在课程结束时，对选修本课程的各专业学生进行问卷调查，范围包括2013级临床医学、医学检验、医学影像、护理学、预防医学、药学等本科各专业共124名学生，几乎涵盖了所有医学相关专业；调查内容主要包括选修该课程的原因、课程中印象深刻的内容、期望学习的内容等，期望通过调查能够了解学生选修这门课程的真正原因、在修习这门课程中的收获以及对这门课程更高的期望等，从而探讨这门课程在医学相关专业开设的重要性和必要性。发放124份问卷调查表，收回有效问卷117份，有效回收率为94%，调查主要项目内容及结果如下。
1）关于选择比较行为学课程原因的调查。结果显示，66%的学生是因为对这门课程感兴趣，因好奇而选修的学生占19%，只有5%的学生仅为修学分而选择该门课程，其他原因占10%。结果表明，多数学生（85%）在选择这门课程的时候是以兴趣爱好为主，说明医学相关专业学生对这门课程感兴趣或者好奇的程度非常高，也间接反映出在医学相关专业开设这门课程的重要性。
2）关于对印象深刻内容的调查。结果显示，学生对动物行为特征和人类相关疾病等方面的内容印象较为深刻，分别占到64%和36%，其他（表观遗传学等）占4%。提示多数学生对行为学方面的知识以及人类相关疾病方面的学习兴趣和效果较好，这些都是学生平时感兴趣但没有机会深入学习的内容，因而在课程结束后对相关内容印象非常深刻。
3）关于对期望学习的内容调查。结果显示，多数学生期望更多地了解人与人以及人与动物方面行为比较的内容（分别占21%、15%），说明学生在选修这门课程后，期望了解更多相关知识，这也反映出这门课程对学生的意义。从问卷调查结果中发现，医学相关专业的学生对比较行为学课程感兴趣程度非常高，一部分学生对这门课程不了解，因为好奇选择这门课程，更多的学生对这门课程是充满兴趣的，期望了解相关知识。而经过课程学习后，多数学生对课程内容掌握较好，尤其是关于动物行为和人类相关疾病方面的内容印象更为深刻，这些内容一方面是与生活和专业密切相关的，如自闭症、帕金森等人类相关疾病，另一方面学生对动物行为感兴趣程度很高，因此，学过之后印象极为深刻。而且多数学生对比较行为学课程内容提出一些新的要求和期望，也表明学生在学习过后，不仅了解和掌握了这门课程相关内容，而且期望学习更多，体现出很强的求知欲，而这种兴趣和求知欲正是学生在医学课程学习中最为缺乏的，也是医学教学改革中期望激发的。随着基础医学发展进步，各学科的知识不断扩张，学科之间的相互交叉不断衍生大量边缘学科和综合学科。比较行为学作为一门多学科、多层次相交叉的边缘性、综合性学科，与行为学、解剖学、遗传学、生理学、药理学、病理生理学、医学机能学、临床医学等有很深的关联性，能将基础医学教学中的很多学科联系在一起，从而加深学生对基础医学各学科的学习欲望，这正是这门课程开设的重要作用。
4意义
比较行为学与医学专业学生的基础课和专业课的学习关系密切，通过比较行为学的学习，可以帮助学生更加深层次地理解医学课程。如行为与遗传学密切关联，比较行为学可以帮助学生了解基因如何影响和控制行为；行为学与解剖学及生理学相关，每一个物种都会不断接受来自环境的各种刺激，为了生存和繁衍，必须具有可接受各种信息的感受器，还需靠效应器和内分泌系统对外界刺激做出适当的反应，通过比较行为学的学习，可以加深对解剖结构及相应生理学知识的理解；行为学与药理学、病理生理学及医学机能学有关联性，比较行为学研究中常用的各种动物模型，包括学习记忆相关的疾病动物模型如瞬膜条件反射模型、创伤性脑损伤动物模型、脑缺血模型、老年痴呆模型、帕金森病动物模型制备等，这些都需要药理学、病理生理学及医学机能学知识为支撑。在模型制备的基础上，还可以引导学生学习一些机能学实验，如研究学习记忆行为学的迷宫（Morris水迷宫、T型迷宫、放射状或辐射状迷宫、Barnes迷宫、高架十字迷宫）、场景性和提示性恐惧条件反射、被动和主动回避实验、物体识别实验、条件性厌食症、瞬膜条件反射、嗅觉任务实验及种群识别等实验。为适应21世纪医学科学和卫生事业发展的要求，很多高校陆续开展以器官系统为中心的课程教改模式，比较行为学作为各学科交叉的综合性学科，有利于基础与临床学科内容之间的结合，有利于提高基础医学课程之间的内在关联，有利于学生丰富知识与提高能力。
5结语
篇3
论文关键词:动物生物学动物行为学教学效果
论文摘要:动物生物学是生物科学和生物技术专业基础课程，知识点多、范围广、发展快，但教材内容相对陈旧，成为动物学教学过程顺利实施和提高学生学习动物学课程兴趣的阻碍，为此，本课程组以动物的系统进化为基础，在讲解动物形态学知识的前提下适当补充动物行为学的知识，既拓宽了动物学的内容，又培养了学生的学习兴趣，收到良好的效果。
《动物生物学》是生物学专业基础课程，学生对该课程的感性认识和学习效果直接影响着后续相关课程的学习。动物生物学涉及的范围广、内容新、发展快，使该门课程教学的难度很大。同时，近几年我国高校着力进行课程改革，不断压缩传统学科的教学时数和教学内容，增加了一些新兴交叉学科课程，使原本内容多课时少的动物生物学教学面临新问题。
当前，动物生物学教学中，教学内容陈旧，仍以形态、结构、分类等传统内容为主，而生理、行为、进化等现代动物学内容少。动物之所以能够引起公众的格外关注而且走进我们的生活，主要在于它们具有千变万化的行为，大熊猫的憨态、金丝猴的敏捷、藏羚羊的轻灵等有趣行为本身就是公众茶余饭后的重要谈资。因此，必须摒弃过去那种单纯的介绍动物形态和结构的“静态”教学方式，而需要以一种“动态”的思维来组织教学，使学生了解和掌握动物真实的生活状态。
为此，河南科技大学动物科技学院动物学课程组在教学过程中，在博采众长的基础上制作了《动物生物学》课件，并在教学过程中不断改进与完善，有针对性地补充动物行为方面的相关内容，在讲授重点章节时通过提供影像资料等丰富教学内容，以增加教学的直观性与趣味性，从而提高教学效果。例如，我们结合学科进展和自己的科研，将诸如蚂蚁的通讯、鱼类的洄游、青蛙的鸣叫、鸟类的繁殖、灵长类的表情等有趣的行为学知识融合到相关章节的教学中，发现学生的学习兴趣高涨，课堂气氛空前活跃。
1 数字
比如，雌舞毒蛾分泌的信息素可把远在400m以外的雄蛾吸引到自己身边来。若将雌性松叶蜂关在笼中置于田间，可招来多达11000只雄性松叶蜂。
原核生物和多数原生生物是通过细胞的直接分裂而实现个体数量的增加，也有的物种通过出芽方式(如水螅)产生新的个体，为什么性和有性生活时如此普遍呢？性的产生对整个生物进化进程的影响是极其深远的，从而导致了有性生殖的出现。大概在6.0亿年前的新元古代晚期，可能就已经出现了性的分化，从而导致有性生殖的产生。动物的求偶行为是指伴随着性活动和作为性活动前奏的所有行为表现，是动物有性生殖过程中的重要行为。求偶行为的表现形式极其多样，复杂的过程可以持续几个小时甚至几天。这种行为非常引人注目，原因在于它常常涉及一些奇特的动作。雄性滑北螈的求偶行为是很独特的，为了使求偶过程最终能够达到受精的目的，雌螈必须捡起雄螈排放在池底的精包。当两性相遇时，雄性一般会排出2、3个精包甚至更多。在雄螈求偶期间，雌螈捡拾精包的积极性是逐渐增加的。因此，其捡拾第三个精包的概率比捡拾第一个精包的概率大很多。因此，数字反映了动物行为的过程或者特点，对于准确地理解动物行为的生物学意义具有非常客观和直接的帮助。
2 听觉
动物体结构十分精巧和复杂，其形态、结构与功能高度统一，这是理解动物生物学知识和原理，发挥动物生物学作为生命科学基础课程作用的关键所在。比如两栖类动物，根据鸣囊的数量有单鸣囊和双鸣囊之分。因此，鸣叫便成了一种发挥重要通讯功能的方式。
蛙类在繁殖季节发出各种鸣叫，进行种内通讯。一般都是雄蛙发出鸣叫，雌蛙根据鸣声判断雄蛙的优异程度。部分种类的雌蛙也能发出鸣叫。崔建国等的研究发现，峨眉弹琴蛙在时，雄性从背部抱住雌性并做前后摩擦运动，以刺激雌蛙排卵。一旦雄蛙停止运动，雌蛙立即发出刺激鸣叫直到雄蛙重新摩擦运动。有趣的是，如果研究者用手阻止雄蛙的运动，雌蛙就一直鸣叫。除此之外，在野外和室内回放这种刺激鸣叫还导致雄性间的竞争甚至打斗行为。繁殖期的雄性弹琴蛙在池塘边缘打洞筑巢，并将洞口用落叶覆盖作为“婚房”。雄蛙在洞内鸣叫吸引雌蛙前来产卵。最有意思的是，当雌蛙来到“婚房”附近，雌雄互相无法看见，这时雌蛙发出刺激鸣叫。雄蛙听到后就会出洞迎接雌蛙，一起返回“婚房”共度良宵。 转贴于
3 视觉
视觉是动物进化过程中发展出来的一种极其中的通讯方式。我们在解释眼球结构的演变过程中，也适当补充关于视觉的行为学实例。
视觉信号具有一定的作用距离，它有确定的方向性并可被光感受器感受。常见的例子有，雄性三刺鱼常常不分青红皂白地攻击小块红色物体，由于红色是雄三刺鱼的标志色。在繁殖季节，雄性孔雀冒着生命危险张开色彩美丽又硕大无比的尾羽以吸引雌性与之等等，这些内容的补充既丰富了学生的知识，又加深其对“动物结构适应于其机能”的理解，把各类群动物执行相应功能的形态结构以系统比较的方式加以说明，从进化的角度比较不同动物相应的器官结构，阐明结构与功能的有机统一，为后续知识的学习和融会贯通做了良好的铺垫。
4 化学通讯
近年来，大量新理论和新成果不断涌现，这就要求教师必须敏锐把握学科发展前沿并及时充实到教学内容中，使学生认识到动物学不是停滞不前的而是一门不断发展的学科。
在动物界，化学通讯是非常普遍也是非常重要的一种通讯方式。动物的很多分泌物是针对同种个体或其他物种的。英国《皇家学会学报B》近日在线发表中科院动物所肖永红等从北京幽灵蛛首次鉴定出首个雄性蜘蛛信息素的研究结果。他们发现(Z)-9-二十三烯是北京幽灵蛛的求偶期雄蛛特有的化合物成分，能够刺激成熟雌蛛步足跗节的化学感受器产生电位反应。行为试验结果显示该物质对期雌蛛没有吸引性，不会激发期雌蛛的捕猎行为，但暴露于该物质环境的雌成蛛与对照组相比更易于与寻偶雄蛛，其配对雄蛛的求偶时间显著缩短。信息素通讯很可能对生活于黑暗环境中的洞穴蜘蛛的生殖行为有及其重要的调节作用，并通过种间特有的信息素保证种间生殖隔离，信息素的分化也可能是蜘蛛物种分化与物种形成的机制之一。
近年来，大量的新知识、新理论、新成果不断涌现，这就要求教师必须敏锐把握动物生物学的另一方面，即只有与人类生产或生活密切相关的知识，才是学生感兴趣的知识，也才能使该课程为社会科学发展发挥更大作用。因此，我们在主要描述动物的形态、结构、分类等知识点的基础上，适当扩充动物行为学的内容，增加了动物生物学的知识点，提高动物生物学教学的趣味性，收到了良好的效果。
参考文献
篇4
【关键词】 脑缺血;脑损伤;动物模型;大鼠
[ABSTRACT] Objective: To investigate the application of three kinds of cerebral ischemiareperfusion animal model according to the degree of injury. Methods:The bilateral common carotid artery occlusion(BCCO)， cerebral middle cerebral artery occlusion (MCAO) by stringfastening method， global ischemia(GI) by fourartery occlusion were used to establish cerebral ischemiareperfusion animal model. The degree of brain injury was evaluated through the expression of MAP2 in hippocampal CA1 region and the Morris water maze. Results: The result of the expression of MAP2 indicated the injury of GI group was the most severe， and the damage of BCCO group was the most mild.Compared with the normal group，the behavior change of reperfusion was the significant in the MCAO and GI groups. Conclusion:The three animal models should be applied in different researches. The BCCO model could be used in prevention of mild ischemia. The MCAO model could be used in the change of cerebral function and the drug evaluation. The GI model could be used in recovery after cerebral ischemia.
[KEY WORDS] Cerebral ischemia; Cerebral injury; Animal ; Rat
脑血管疾病是世界上严重危害人类健康的三大疾病之一， 发病率已达到104. 53/10万。缺血性脑血管疾病( ICVD ) 发病率有逐年增高趋势， 死亡率可达56. 6%～80% ， 即使存活， 也留有严重的后遗症影响生活质量。因此， 建立合适的动物脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对之进行研究， 是深入研究其病变发生、发展和预后的基础，也是当前神经科学的热门课题之一。
大鼠具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、品种品系相对标准、良好的种内纯合性等特点，目前大多利用大鼠建立脑缺血再灌模型，但是对各种模型的制作效果未见文献报道。本文采用双侧颈总动脉阻断再灌模型(BCCO)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(MCAO)、四血管法全脑缺血再灌模型(GI)等3种常用的局灶性脑缺血再灌动物模型，观察不同脑损伤情况下的形态学改变，并评价其行为学，旨在探讨不同模型的适应性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性Wistar大鼠，6月龄，体重(200±50) g，经Morris水迷宫筛选后，分为正常对照组(Normal)，双侧颈总动脉结扎20 min再灌注组(BCCO)，线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型组(MCAO)，四血管法全脑缺血再灌模型组(GI)，每组6只。
1.2 Morris水迷宫测试
Morris水迷宫测试程序采用定位航行试验：每天4次，共3 d，均在10:00am～5:00pm之间完成。将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，计时动物自入水至找到平台时间为潜伏期，同时观察搜索站台的轨迹。记录大鼠后8次测试的潜伏期，以平均潜伏期的90%区间作为筛选学习记忆功能正常大鼠的标准。
1.3 动物模型制备
BCCO模型：大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露颈总动脉(common carotidartery， CCA)，颈内动脉(internal carotid artery， ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)，分离双侧颈总动脉约1 cm，用动脉夹夹闭20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
MCAO模型：参照Longa等[1]和罗勇等[2]报道的方法，采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性永久性脑缺血模型。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露右侧CCA、ICA和ECA，探查ECA在颈部发出第1分支(甲状颈干)处，在其远心端约0.2 cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度不少于0.5 cm;结扎并切断ECA与ICA之间的交通支。用动脉夹暂时阻断CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 残端作一纵行小切口，用直径约0.2 mm的尼龙线，烧灼头端使其成为直径约为0.25 mm的线栓，将线栓从右侧ECA残端插入ICA;轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45度水平向外的夹角，移去夹闭ICA的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内。从CCA分叉处送入ICA约1.9～2.1 cm时通常可遇阻力，大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，据此作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志。栓塞成功后，用丝线结扎ECA残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口。缺血20 min后，将栓线抽至颈内动脉起始部恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
GI模型：参考Pulsinelli方法，采用改良的四血管夹闭方法制备四血管阻塞全脑缺血模型[3，4]。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露CCA和与之伴行的神经，钝性分离出CCA，用棉线环CCA成1cm的线环。两侧线环相互交叉埋于皮下，缝合切口。大鼠转移到立体定位仪上， 俯卧。头向下倾斜30 度固定。剪去头颈部的毛， 消毒。在枕骨下沿背正中切口，分离肌肉， 找到第1颈椎后弓上的横突孔， 用电凝针插入2～3 mm，灼断孔中的椎动脉， 使之永久性阻塞。电凝完毕， 缝合切口，大鼠放回饲养笼中， 让其自然苏醒， 禁食过夜， 自由饮水。以上手术24 h 后， 大鼠在清醒状态下仰卧固定， 重新打开颈部切口， 用动脉夹夹闭双侧颈总动脉， 使大鼠脑部供血完全阻断， 大鼠挣扎数秒后于30～60 s 内昏迷， 解除固定， 可见大鼠四肢上举， 翻正反射消失， 痛觉反应消失， 双侧瞳孔散大， 眼球呈灰白色， 身体可呈角弓反张。缺血20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
1.4 组织制备
用2%戊巴比妥钠(0.12 mL/50 g体重)腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，灌注固定后取脑，后固定2～4 h后，分别置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至标本沉底。冰冻切片机作连续冠状切片，取海马和齿状回互包平面，片厚30μm，用小鼠抗MAP2单克隆抗体作ABC免疫组织化学染色，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。
1.5 统计学处理
用HPIAS高清晰度彩色病理图像测量系统测定海马CA1区神经元胞浆MAP2反应产物的OD值，并减去同一张切片的背底OD值，即矫正的OD值(COD值)，每例标本检测3张切片，每张切片检测3个视野。实验数据用SPSS 13.0统计软件分析，采用单因素方差分析比较样本均数。
2 结果
2.1 水迷宫检测
正常大鼠定位航行试验潜伏期稳定，在5 s左右可找到平台。BCCO组大鼠搜索策略以直线式搜索策略为主，其潜伏期与正常组比较略有增加，且波动较大，但是无统计学意义(P >0.05)。MCAO组和GI组均有潜伏期增加，与正常对照组有统计学意义(P
2.2 海马MAP2免疫组织化学染色
正常组海马CA1区MAP2主要在神经元树突表达，突起平滑而且完整(图1A);而核周质弱表达。BCCO组可观察到海马CA1区神经元树突MAP2的表达增加，突起断裂不完整，粗细不一致(图1B);GI组突起表达更加紊乱，可观察到螺旋样变(图1C);MCAO组突起表达有断裂，不完整(图1D)。统计分析表明，MAP2表达COD值在各组之间差异有显著性(F=354.906，P
3 讨论
缺血性脑血管病的实验动物模型是研究缺血性脑损伤和脑保护必不可少的工具，有关大鼠局灶性脑缺血再灌注模型已建立多种方法。De Reuck等[5]的研究提示，脑血管储备功能的下降导致全脑代谢储备消耗是血管性痴呆发生的可能机制;动物空间记忆能力下降，是由于血管结扎导致局部脑血流下降而影响与学习记忆有关的结构。孙莉等[6]采用双侧颈总动脉结扎模型发现，结扎导致实验动物水迷宫测试成绩下降，并且这种下降随结扎天数的延长而加大。赵宪林等[7]用这种方法结扎时间长达4月，结果发现30只结扎鼠中有25只痴呆鼠，呈轻、中度痴呆分别是9只、13只。本实验也表明，在双侧颈总动脉结扎再灌后，形态学和行为学方面有所改变。
大鼠全脑缺血再灌注模型，它的解剖学基础在于大鼠腹侧的脊髓动脉有一定向脑干的返支，四血管闭塞期间可以维持脑干的血液供应，使得大鼠在一定时间内能够存活下来。由于全脑缺血对大鼠的脑组织损伤严重，而再灌注，不仅没有使损伤的脑组织得以恢复，反而由于细胞内Ca2+超载、一氧化氮以及氧自由基等作用使损伤程度进一步加深[8]。本实验也证实全脑缺血后引起脑形态学和学习记忆能力的严重损伤，是研究血管性痴呆的良好模型。
大鼠中动脉(MCA)阻塞为临床上缺血性脑血管病的多发部位，故MCA阻断模型被广泛应用于脑梗塞的研究。其中，血管内直接插线闭塞法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型具有不开颅、损伤小、操作简便、不需特殊设备、缺血区部位较恒定、可准确控制缺血和再灌注时间、易控制局部条件、全身影响小等优点，被广泛用于脑缺血/再灌注的研究中。目前对该模型有较多的研究，刘亢丁等[9]认为该模型大鼠体重应控制在250～300 g ;马常升等[10]发现，当大鼠体重为190～239 g 时，宜选择插线的直径为0.185 mm ，体重为239～300 g 时，插线直径宜为0.200 mm;徐佳等[11]研究模型栓线插入的深度认为，要得到成动的模型栓线插入深度最少要达到1. 65 cm。与全脑缺血模型相比， MCAO模型可形成特定部位的脑梗死并进行再灌注， 对全身影响较小， 与人脑梗死的发病情况更相似， 所以目前应用更为广泛。其中， 栓线法因其缺血部位恒定、能准确控制缺血后再灌注时间等优点， 适用于脑缺血及再灌注多方面的研究。
通过对各组再灌后的行为学检测，分析发现3组之间行为学有明显区别，对于在行为学的基础上结合MAP2染色来评价脑缺血再灌注模型的脑损伤程度。观察发现，不同模型缺血坏死程度不同，结合行为学评分我们认为，不同的缺血再灌模型的应用范围应有所侧重，不同的脑缺血模型的应用不同，双侧缺血模型可用于轻微缺血的预防，线栓法应用于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价，全脑缺血再灌注动物模型是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型，对于慢性脑缺血、脑缺血的药物及一些特殊领域的研究具有较高的价值。
各种脑缺血动物模型的制备方法各有优缺点，研究者应根据实验目的及研究方向做出相应的选择。目前， 脑缺血动物模型的研究在制备方法、实验条件的控制等方面都取得了很大进展， 而且转基因小鼠的出现， 超声、MR、MRA、介入等新技术的发展及其在模型制备中的应用， 在很大程度上促进了脑缺血模型的研究。但还有很多问题尚待解决， 如怎样更好地控制脑梗死灶的部位和范围， 更准确地控制缺血和再灌注时间等。脑缺血动物模型的日趋完善， 将为人们更深刻认识ICVD 发病机制， 研究新的治疗对策等提供更准确的信息。
参考文献
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7 赵宪林，李东培，方秀斌，等.血管性痴呆大鼠海马神经元超微结构的研究[J].解剖科学进展，2000，6(2):161163.
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9 刘亢丁，苏志强，李毅平，等. 实验性局灶性脑缺血再灌注动物模型的改进及评价[J].中风与神经疾病杂志，1997，14(2):8789.
篇5
嗨―
叫我艾利克斯！
鹦鹉学舌是它的本能反应吗？鹦鹉有自己的思维吗？灰鹦鹉艾利克斯（Alex）是吉尼斯世界纪录中记载的最有智慧的鸟儿，它拥有相当于五岁小孩的智商。在主人艾琳・裴伯博士的指导下，它在打翻咖啡时会说“对不起”，会发号施令来管理实验室里的其他鹦鹉，会数数，也能分辨物体的形状和颜色。它可以用简单的短语和标签来表达自己的意思。在2007年9月去世前，它对主人说的最后一句话是： “See you tomorrow。You be good， I love you 。（明天见。你保重，我爱你。）”有关它的研究打破了人们通常认为的“鹦鹉只会不假思索地学舌”的看法。
最近动物界里掀起了一股“走进科学”的热潮，不少动物“科学志愿者”都跃跃欲试，准备大显身手。纵观历史长河，动物帮助人类完成了一个又一个科学实验，在人类认识世界、改造世界的过程中，功劳可是大大的哟。
嗡―
眼睛会变色！
说起果蝇，你可先别忙着嗤之以鼻，它可是当代遗传学的一大功臣。美国科学家摩尔根通过研究红眼与白眼的果蝇相结合所产生的下一代，发现了遗传第三定律，为色盲的研究提供了有力依据，对人类遗传学的进步做出了巨大贡献。
嘘―鸽子也迷信！
心理学家斯金纳曾经做过这样一个实验：他把8只鸽子放到一个每隔15秒就能自动分发食物的箱子里，在这15秒的间隙中，他什么也不做，就观察鸽子的反应。几天之后，有趣的事情发生了。有6只鸽子已经在等待的过程中形成了各自不同的习惯，有的总是逆时针转圈，有的总是用头撞箱子。它们的行为其实和能不能吃到食物没什么因果关系，可它们却一直这样做，好像只有这样做才能有食物吃。斯金纳以“迷信”的鸽子为例，从心理学上阐述了人类的迷信行为，是人类行为学研究的一大突破。
篇6
【摘要】
目的 观察天麻钩藤饮对帕金森病(PD)大鼠神经行为学及氧化应激的影响。方法 采用6羟基多巴胺(6OHDA)注射于脑右侧黑质造成单侧PD损毁模型，并用中药天麻钩藤饮（浓度为5.13 g/ml）进行治疗，共给药14 d。同时设立正常对照组、假手术组，观察各组大鼠神经行为学的变化，同时运用化学比色法测定大鼠中脑黑质、纹状体部位活性氧、谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的活性。结果 神经行为学方面，模型组大鼠治疗前后旋转圈数无显著差异；天麻钩藤饮组大鼠旋转圈数较模型组显著减少（P＜0.05），且治疗前后比较差异显著（P＜0.05）；模型组活性氧、MDA明显升高，GSH、GSHPx、SOD明显降低，与正常对照组、假手术组比较，差异显著（P＜0.05或P＜0.01）；而天麻钩藤饮对其均有明显的改善作用（P＜0.05）。结论 天麻钩藤饮可以明显改善PD大鼠的神经行为学变化，并可以提高机体的抗氧化和清除自由基的能力。
【关键词】 天麻钩藤饮；帕金森病；神经行为学；氧化应激；大鼠
【Abstract】 Objective To observe effect of tianma gouteng drink on the behavioural and oxidation stress response of Parkinson’s disease (PD) rat.Methods Rats were pided into normal control， sham operation， model， and treatment groups (6 rats in each group). PD rats were produced by injection of 6OHDA stereotaxically into the right side of the mesencephic ventral tegmental area (VTA ) and substantia nigra pars compacta (SNc) and treated with tianma gouteng drink (5.13 g/ml) for 14 days. Behavioural changes and the activity of reactive oxygen species (ROS)， glutathione (GSH)， glutathione peroxidase (GSHPx)， superoxidase dismutase (SOD)， malonaldehyde (MDA) of the substantia nigra and corpus striatum of the PD rats were observed. Results There was no significant difference in rotation behaviour between before and after treatment in model group (P＞0.05). Compared to model group， the rotation behaviour was significantly decreased in treatment group， and there was significant difference between before and after treatment in treatment group (P＜0.05). Compared with the normal control and sham operation groups， ROS and MDA contents were obviously increased and GSH， GSHPx and SOD contents were obviously reduced in model group (P＜0.05). However， the above indicators were improved in treatment group (P＜0.05). Conclusions Tianma gouteng drink can significantly improve the neurological behavior， and enhance antioxidation ability and eliminate free radicals of PD rats.
【Key words】 Tianma gouteng drink；Parkinson’s disease；Neurological behavior； Oxidation stress；Rat
帕金森病(PD)是以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势异常为主要临床特征的慢性神经系统变性疾病。随着人口老龄化的日趋明显，本病的发病率有上升趋势。已有研究表明，氧化应激反应和自由基损害在PD等神经变性疾病中起重要作用〔1，2〕，PD患者机体处于氧化应激状态〔3〕。因此，通过提高机体的抗氧化能力和清除自由基的能力来治疗PD日益受到大家的重视。研究发现，中医药不仅对本病具有较好的疗效，而且与西药合用可以提高临床疗效，同时可降低化学合成药物的副作用〔4〕。本研究所用的天麻钩藤饮是临床治疗PD的常用方剂，本实验观察了天麻钩藤饮对PD大鼠神经行为学及氧化应激反应的影响，旨在从氧化应激方面揭示天麻钩藤饮治疗PD的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物
SD大鼠，45只，SPF级，雄性，体重180～200 g(3月龄)，由上海中医药大学实验动物中心提供。许可证号：SYXK（沪）20040005。
1.1.2 药品、试剂和仪器
药品：盐酸氯胺酮（上海中西药业股份有限公司产品，批号：000602，0.05 g/ml）；庆大霉素(上海第一制药厂产品，批号：001250，0.3 g/支）；天麻钩藤饮（天麻9 g，钩藤12 g，石决明18 g，山栀9 g，黄芩9 g，川牛膝12 g，杜仲9 g，桑寄生9 g，夜交藤9 g，砂茯神9 g，益母草9 g，浓度为5.13 g/ml），按既定工艺煎煮成汤药，由上海雷允上药材有限公司代加工。试剂：6羟基多巴胺（6OHDA）为美国Sigma公司；阿扑吗啡（APO）为美国Sigma公司产品；抗坏血酸为美国Sigma公司产品；活性氧、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。仪器：TOW3A型大鼠脑立体定位仪为广东汕头市教育医学仪器厂产品；微量进样器（5 μl）为上海第三分析仪器厂生产；离心机为上海中科DL50RC型；XW80A旋涡混合器为上海医科大学仪器厂制造；电热恒温水温箱（HH·W21·600）为上海跃进医疗器械厂生产；721型分光光度计为上海第三分析仪器厂制造。
1.2 方法
1.2.1 模型制备〔5〕
术前按常规进行行为学测试，确认无异常旋转行为后，用盐酸氯胺酮（80 mg/kg）腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民〔6〕等著大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μl微量进样器将6OHDA(溶于含维生素C的生理盐水中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针)，每孔3 μl，注射速度为1 μl/min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。假手术组只注射含维生素C的等量生理盐水，其余条件与造模手术相同。正常对照组只固定大鼠，不进行任何处理。造模手术10 d以后，腹腔注射APO（0.5 mg/kg）诱发大鼠向健侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，以旋转圈数平均每分钟超过7次者为合格的PD模型〔7〕。
1.2.2 分组干预
将造模成功的12只大鼠按旋转圈数随机分为2组，分别为PD模型组、天麻钩藤饮组；其他纳入正常对照组、假手术组，共计4组，每组6只。对PD模型组、假手术组和正常对照组用生理盐水灌胃（2 ml/只），天麻钩藤饮组灌胃天麻钩藤饮（5.13 g/ml，2 ml/只），各组动物正常摄食、饮水，共14 d。
1.2.3 神经行为学检测
实验结束后，以腹腔注射APO（0.5 mg/kg）诱发大鼠向健侧旋转，观察并记录开始旋转至30 min内的旋转圈数。旋转行为即以左侧后肢为支点原地旋转，头尾相接，身体成环状。
1.2.4 氧化应激指标检测
大鼠行为学测试完毕后，立即断头取脑，小心分离黑质，制备脑组织匀浆液。按南京建成生物工程研究所试剂盒说明书步骤进行氧自由基检测。
1.3 统计学处理
所有资料均用x±s表示，采用SPSS13.0版软件进行齐性检验并做t检验、方差分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠旋转圈数比较
正常对照组、假手术组大鼠未见旋转行为。模型组、天麻钩藤饮组大鼠注射APO后0.5～5 min时，均出现旋转行为。模型组治疗前旋转圈数为(252.67±33.91)，治疗后为(254.78±38.27)，两者差异无显著性（P＞0.05）；天麻钩藤饮组治疗前旋转圈数为(250.30±26.76)，治疗后为(222.00±34.98)，治疗前后差异显著（P＜0.05），与模型组比较，天麻钩藤饮组的旋转圈数亦明显减少（P＜0.05）。
2.2 各组大鼠氧化应激反应比较
模型组活性氧、MDA明显升高，与正常对照组、假手术组差异显著（P＜0.05或P＜0.01），GSH、GSHPx、SOD明显降低，与正常对照组、假手术组比较差异显著（P＜0.01）。天麻钩藤饮组与模型组比较，活性氧、GSH、GSHPx、SOD、MDA差异显著（P＜0.05），见表1。表1 各组大鼠氧化应激反应的变化(略)
3 讨 论
在PD大鼠的行为学评价上，各方面研究试图找到更客观的指标〔8〕，但迄今APO诱发旋转试验依然〔9〕是目前主要的评价指标。APO是一种D2受体激动剂，存在于多巴胺能神经元的突触后膜。当PD动物模型的毁损侧多巴胺能神经元减少时，在受体调节机制下，同侧D2受体出现上调，受体密度增加，敏感性增强，出现去神经超敏感现象，故当用APO激动D2受体时，产生了比健侧更强的DA活性，因而表现为向健侧的旋转。本研究结果发现，模型组大鼠治疗前后旋转圈数比较，差异无显著性意义，表明模型稳定、可靠，而天麻钩藤饮组大鼠旋转圈数较模型组显著减少，且治疗后旋转圈数较治疗前亦显著减少，说明天麻钩藤饮对PD大鼠的旋转行为有很好的改善作用。
已有足够的证据表明，氧化应激反应和自由基损害在PD等神经变性疾病中起重要作用〔1，2〕，而PD病人机体处于氧化应激状态〔3〕，PD病人中脑黑质内存在铁离子浓度升高、线粒体功能下降、抗氧化保护系统如SOD、GSH等功能异常，导致氧化应激反应增强，氧自由基产生过多，引起蛋白质、脂质过氧化损害和断裂，导致神经元发生凋亡。本研究提示PD大鼠的氧化反应被激活，处于氧化应激状态，与文献报道一致〔10〕。6OHDA具有与其他儿茶酚胺类物质相似的结构，可与高亲和力的儿茶酚胺转运系统结合进入黑质、纹状体多巴胺能神经元相应的神经元内，在MAOB作用下产生H2O2，再由H2O2在金属铁、铜的转换作用下生成OH，直接引起氧化应激反应。GSHPx可特异催化GSH对H2O2的还原反应，对细胞结构和功能的完整具有重要的保护作用，GSHPx活力的高低直接反映了机体清除自由基的能力〔11〕。SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，它能清除超氧阴离子和自由基而保护细胞免受损伤，其活力高低间接反映了机体清除氧自由基的能力〔12，13〕。但SOD对氧自由基的清除能力总是有限的，如果氧自由基的产生超过清除能力，氧自由基就会对机体造成危害。机体产生的氧自由基能攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，产生脂质过氧化物，如MDA、羟基、羰基等而引起细胞死亡，故MDA可反映体内脂质过氧化的程度，从而间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。与模型组相比，天麻钩藤饮组活性氧、MDA明显降低，GSH、GSHPx、SOD明显升高。提示天麻钩藤饮可以提高机体的抗氧化能力和清除自由基的能力。
天麻钩藤饮出自胡光慈所著《杂病证治新义》，具有平肝熄风、清热安神、补益肝肾之功效，主治肝阳上亢、肝风内动之证。已有的研究表明，PD病机以肝肾阴虚，虚风内动为主〔14〕。现代中药药理研究表明，天麻钩藤饮可提高高血压病患者血浆SOD活性，降低MDA含量〔15〕，天麻可明显提高SOD的活性，降低MDA含量〔16〕，所以我们认为天麻钩藤饮可能是通过局部治疗和整体调节作用，达到了对PD患者自由基的清除作用，从而使机体免受自由基的损害。
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14 王文武，何建成.帕金森病的中医文献研究〔J〕.新中医，2008;40（1）:11820.
篇7
本书分为3个部分。第1部分为机器人学中的行为层次结构。介绍了如何通过设计一个机器人来处理行为分层结构问题。该过程涉及部分仿生技术，该阶段最主要的贡献是建立了很实用的智能技术产品。本章节重点介绍了行为层次结构中很重要但是常常被忽略的两个特征，即它对于探究行为的影响以及促使复杂领域规划成本的降低。本章还给出了4个分层增强学习的例子来说明行为层次结构在探究及表征研究中的关键作用。通过学习给出的实例，我们有效验证了行为分层在人工以及现实世界中至关重要的作用。
第2部分为动物行为学中的层次结构。介绍了用于理解真实世界中动物行为的层次结构计算模型。该模型在一定程度上解答了科学研究中关于动物智能行为分层的疑问。本部分着重探讨了动物行为学中如下的研究热点：1.模块化的多臂控制模型。包括电机控制中的可计算问题、感官冗余、大脑的模块化和层次结构、模块化和层次化模型；2.电机控制中的泛化与干扰问题。包括程序记忆的巩固、生物系统中的干扰和泛化、多任务学习等；3.一个累积学习机器人的模型框架。内容包括条件约束、感官运动映射模型、构造映射模型、进化行为训练，最后阐述了目前所面临的研究挑战等；4.分布式自适应控制架构中的知识层次积累。包括分布式自适应控制描述、活性和环境控制系统的互补作用、空间信息集成等。
第3部分为动物脑层次结构。介绍了动物脑层次结构相关的计算模型，从而为未来的智能机器人解决实际问题奠定了一定的基础。本部分涵盖如下内容：1.智能计算假说。包括线程的特点及其局限性、皮质层次结构、基底核层次结构、大脑皮层结构整合；2.分层强化学习和任务分解。包括分层增强学习、潜在的神经机制、识别有效子目标等；3.大脑中分层运动功能的神经网络模型。包括构造运动功能的分层动态模型、调制高层次运动程序、学习运动序列以及分层建模未来所面临的挑战。
篇8
【关键词】 抑郁症;归脾汤/药效学;雌二醇(E2);皮质酮;海马;大鼠
抑郁症是常见的情感障碍，女性多发。目前认为海马损伤是抑郁症发病的重要环节。众多研究发现皮质醇是引起海马损伤的主要因素，雌激素则能够保护海马，因此对于女性患者来说，维持正常的皮质醇和雌激素分泌具有重要意义。临床实践表明，归脾汤治疗抑郁症效果明显［12］，但其作用机制尚不清楚。本实验主要从内分泌方面研究归脾汤对海马形态学的影响，初步探讨其抗抑郁机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物的选取和分组 健康Wistar雌性大鼠，清洁级，体重(220±20) g，由中国医科大学实验动物中心提供。经适应性饲养1周后，选择体重和行为学评分相近的40只大鼠，随机分为空白组、抑郁症模型组(模型组)、抑郁症模型＋对照组和抑郁症模型＋归脾汤组(中药组)，每组10只， 每笼5只饲养。室温20℃-25℃，湿度40%-50%。
1.2 抑郁症模型的建立 除对照组，其余3组动物均复制慢性不可预见性应激模型［3］：大鼠在21 d内每天接受一种刺激，包括电击足底(36 V交流电，5 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、摇晃(1 min)、夹尾(1 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)等，每种刺激使用3-4次。
1.3 给药方法 空白组不给药;模型组只施加灌胃动作但不给药；对照组灌服2 mL生理盐水；中药组灌服归脾汤。归脾汤组成：白术30 g，茯苓30 g，黄芪30 g，龙眼肉30 g，酸枣仁30 g，人参15 g，木香15 g，甘草8 g，当归3 g，远志3 g，购于辽宁中医药大学附属医院药局。按常规方法煎煮，浓缩至2 g/mL，4℃冰箱保存备用。根据临床成人用量折算成大鼠灌胃剂量，每天给药1 mL/100g，于每次刺激前0.5 h灌服，共给药21 d。
1.4 大鼠体重和行为学检测 于实验的第1天和第22天的9点开始，采用GS671电子秤(大连星海生物有限公司)按动物序号进行测量体重。之后可采用openfield法检测行为学得分，计数3 min内大鼠的水平活动得分和垂直活动得分。检测过程中保证时间、光照、温度及环境噪音的一致性。
1.5 大鼠血清皮质酮、E2、FSH、LH水平检测 在实验的第22天，1.4任务完成后，大鼠经20%乌拉坦(0.4 mL/100 g)麻醉，腹主动脉取血2 mL，离心取血清，低温冷藏备用。采用放免法检测血清皮质酮、雌激素浓度，此项工作由总医院内分泌实验室协助完成。
1.6 海马形态学观察 1.5后每组取5只大鼠，升主动脉注射生理盐水清洗脑组织后，立即断头取双侧海马，置于10%甲醛中固定，石蜡切片，HE染色，光镜下观察海马CA3区神经元形态的变化。此项工作于辽宁中医药大学病理实验室完成。再取5只大鼠，经升主动脉150 mL生理盐水快速冲去血液后，再快速灌入4℃2.5%戊二醛固定液。取双侧海马，修块，置于戊二醛中固定2 h，PBS反复清洗后，再经1%锇酸固定2 h，双蒸水冲洗，梯度乙醇脱水，临界点干燥，离子溅射真空渡膜，扫描电镜下观察并拍照。此项工作由辽宁中医药大学电镜室完成。
1.7 数据处理 数据以(±s)形式表示，采用SPSS 10.0统计软件处理，统计方法采用ANOVA法、单因素方差分析和两两比较。
2 结果
2.1 各组大鼠体重的变化 见表1。表1 各组大鼠体重变化表1显示，第22天模型组和对照组大鼠体重较空白组显著下降(P＜0.05)，中药组则变化不大。
2.2 各组大鼠的行为学得分 见表2。
表2 各组大鼠行为学得分(n=10，次/3 min)
组 别水平垂直第1天第22天第1天第22天空白组49.3±9.046.2±8.711.6±3.411.1±3.0模型组50.4±9.030.3±9.211.3±3.24.9±2.1对照组50.3±7.527.3±7.811.8±3.35.1±2.4中药组51.1±7.649.6±8.711.4±3.111.0±2.7
注：与空白组比较，P＜0.05
由表2可见，同组大鼠第1天和第22天比较，空白组和中药组无明显差异，模型组和对照组得分则显著减少。
2.3 各组大鼠血清皮质酮、E2、FSH和LH水平 见表3。
表3 各组大鼠血清皮质酮浓度、E2、FSH、LH含量的比较(n=10，pg/μL)组 别皮质酮E2FSHLH空白组16.1±2.824.50±8.430.17±0.050.08±0.03模型组29.5±3.17.93±3.000.37±0.100.19±0.03对照组30.4±4.111.08±3.290.35±0.110.18±0.01中药组17.4±2.919.67±5.770.21±0.080.10±0.02
注：与空白组比较，P＜0.05
2.4 各组大鼠海马CA3区神经元的组织学
2.4.1 光镜观察 空白组CA3区有大量致密锥体细胞，排列整齐，细胞完整，边缘清晰。模型组和对照组可见细胞层次减少，细胞层紊乱、稀疏、中断，大量细胞坏死。中药组神经元形态与空白组基本接近。
2.4.2 电镜观察 空白组细胞器丰富，轮廓清晰，细胞核呈圆形，核膜清晰光滑完整，核染色质分布均匀。模型组和对照组细胞器减少，线粒体空泡化，细胞核变小，不规则，且核膜增厚，核周电子密度降低。中药组与空白组基本相同。
3 讨论
抑郁症的发生机制尚不清楚，可能与慢性应激刺激导致的海马结构损伤有关，如长期不良处境及生活事件可作为慢性应激刺激，持续激活下丘脑－腺垂体－肾上腺皮质轴，导致糖皮质激素水平持续升高，从而损伤海马结构。而女性在月经周期或更年期，体内雌激素水平处于明显的波动状态［67］，影响了雌激素的神经元保护作用，如再有负性情绪或生活事件，则海马结构极易受损，出现抑郁情绪，甚至发展为抑郁症的可能性将明显增加［89］。因此对女性来说，维持正常的糖皮质激素和雌激素分泌是防治抑郁症的重要环节。临床实践观察到，女性抑郁症患者血清中E2含量明显降低，FSH、LH含量显著升高，采用雌—孕激素序贯疗法可明显改善患者的临床症状［1011］，但雌激素的副作用限制了该疗法的广泛开展。近年来，采用中医药方法治疗抑郁症取得了较好疗效，且副作用小，但其作用机制尚不十分清楚。
本实验复制了雌性大鼠的抑郁症模型，观察到模型组和对照组大鼠体重和行为学评分均明显下降，而中药组大鼠无明显变化，说明归脾汤具有抗抑郁作用。进一步观察相关激素水平时，检测到模型组和对照组大鼠的皮质酮、FSH和LH水平较高，E2较低，说明抑郁模型大鼠的相关激素分泌异常，而这两组大鼠的海马组织也出现明显损伤，说明抑郁状态下皮质酮增加、E2降低和海马损伤存在一致性。与此相对照，中药组大鼠的上述激素分泌和海马组织学与空白组基本一致，说明归脾汤能够维持皮质酮和E2正常分泌，保护海马，这可能是其抗抑郁机制之一。
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篇9
Effect of electroacupuncture applied at acupoint on neurogenesis in hippocampal dentate gyrus and behavior of rats with lithiumpilocarpine induced status epilepticus
WANG JinCun，HUANG YuanGui，WEN XiaoNi，WANG WeiDong，XIA Feng，WANG XiaoMu，YANG Fang，WU SongDi
Department of Neurology， Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xian 710033， China
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of electroacupuncture applied at Baihui acupoint on the behavior and electroencephalogram of the rats with lithiumpilocarpine induced status epilepticus (SE) and provide some experimental basis for treating the seizures with acupoint stimulation. METHODS: Adult male SD rats were subjected to lithiumpilocarpine induced SE model. By using bromodeoxyuridine (BrdU) labeling method and immunohistochemistry， we compared the proliferation rate of neural precursor cells in the dentate gyrus between the intervention group and the control group at 7， 14 and 42 d after SE. The alteration of behaviors was observed. RESULTS: Electroacupuncture applied at Baihui acupoint significantly increased the number of BrdU labeled cells in the dentate gyrus 7 and 14 d after SE was induced (P0.05). Spontaneous recurrent seizures（SRSs） happened less in the intervention group (42 d after epileptic seizure) than in control groups（P
【Keywords】 electroacupuncture stimulation; Baihui acupoint; neurogenesis; epilepsy; lithiumpilocarpine
【摘要】 目的：观察电针刺激百会穴对锂匹罗卡品诱导致痫大鼠海马齿状回神经发生及行为的影响，为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据. 方法：选用锂匹罗卡品诱导致痫成年大鼠模型，采用BrdU标记分裂细胞及免疫组织化学方法比较致痫后7，14，42 d时电针刺激穴位干预致痫组大鼠与相应对照组大鼠之间海马齿状回神经前体细胞的增殖速度，并同时观察动物行为学改变. 结果：电针穴位刺激后，明显促进了大鼠致痫后7 d，14 d时齿状回的神经发生水平，BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加（P
【关键词】 电针刺激; 百会穴; 神经发生; 癫痫; 锂匹罗卡品
0引言
近年来有关成年脑组织神经发生的研究发现，缺血、缺氧、外伤、癫痫等许多原因所致的脑损伤均可诱导成年海马齿状回神经元再生的增加，成年哺乳动物脑内神经元再生相关机制的研究已成为神经科学领域内的一个最激动人心的课题［1-3］. 国内、外相关研究结果表明癫痫后的海马齿状回的神经发生即神经可朔性的改变与癫痫的发生和发作密切相关，而祖国传统医学的理论和实践也显示穴位刺激具有明显的抑制癫痫发生与发作的作用［4-5］. 因此，在目前我们对穴位刺激治疗癫痫基础研究领域尚缺乏深入实验研究的前提下，探讨电针穴位刺激是否会对海马齿状回神经发生产生影响无疑是一个值得我们关注的内容. 本研究中，我们选用锂匹罗卡品诱导致痫大鼠模型，对致痫大鼠电针刺激百会穴后海马齿状回的神经发生和行为学改变进行了初步观察和研究，旨在为进一步揭示穴位刺激治疗癫痫的机制提供基本的实验依据.
1材料和方法
1.1材料成年雄性SD大鼠，由第四军医大学动物实验中心提供，体质量200～250 g. 饲养于12～12 h光暗环境，给予标准饮食. 选取SE发作程度依据Ono J分级标准Ⅳ级（含Ⅳ级）以上存活大鼠随机分为电针穴位刺激干预组（n=12）， 电针刺激对照干预组（n=12），各干预组大鼠又分别随机分为致痫后7，14，42 d 3个时间组（每个时间点4只大鼠）. 参考相关文献［6-8］锂匹罗卡品癫痫模型制作予造模大鼠腹腔注射氯化锂（3 meq/kg，中国医药集团上海试剂公司），18 h后腹腔注射盐酸匹罗卡品（30 mg/kg，Sigma公司），所有注射匹罗卡品大鼠均于数分钟内出现强直阵孪性发作癫痫持续状态（SE），60 min后腹腔注射地西泮注射液（4 mg/kg）终止发作，以降低死亡率.
1.2方法
1.2.1分组电针穴位刺激干预、BrdU给药方法及脑片标本制备 电针穴位刺激组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会穴）和电针刺激对照组大鼠（电针刺激致痫大鼠百会穴相临的非穴位处）均采用G6805型电针治疗仪于致痫后第2日开始进行电针刺激干预，共刺激3 d. 电针刺激参数为：频率为50 Hz，电流强度20 mA，时间20 min， 2次/d. 不同时间点各组大鼠于相应时间点前1 d以BrdU 50 mg/kg （Boehringer Mannheim）腹腔注射给药2次，2 h间隔/次，24 h后予戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 麻醉，经升主动脉灌注生理盐水100 mL，40 g/L多聚甲醛液（pH 7.4）500 mL后，断头取脑，将脑组织置入40 g/L多聚甲醛后固定过夜，200 g/L蔗糖4℃沉底，选择海马部位应用冰冻切片机冠状位连续切片，每隔150 μm取脑片1张，脑片厚30 μm，收集于0.01 mol/L KPBS中.
1.2.2免疫细胞化学参考有关文献［9］对脑片进行染色，具体步骤如下：取切片入500 g/L甲酰胺（Sigma）/2×SSC中65℃ 2 h，2×SSC漂洗后，入2 mmol/L HCl中37℃ 30 min， 0.01 mol/L硼酸液中和10 min，浸入含0.3 g/L Triton X100的0.01 mol/L KPBS 30 min，之后入小鼠抗BrdU抗体（1∶1000，Sigma） 4℃孵育48 h，再依次入生物素化的羊抗小鼠IgG (1∶500， Sigma)室温2 h、生物素卵白素HRP复合物（1:500， Sigma）室温2 h，最后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法呈色. 然后常规贴片、干燥、脱水、透明、封片. 光镜观察. 对照染色用血清稀释液代替第一抗体.
1.2.3行为学观察记录各致痫大鼠首次发作的行为学改变、首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和持续时间，以及静默期的长短. 此后，每天观察动物的行为学变化4 h，记录存活42 d大鼠静默期后出现的Ono J分级标准［10］Ⅰ～Ⅲ级的自发反复发作（SRSs）次数. 同时在400倍光镜下观察各干预组不同时间点大鼠齿状回颗粒细胞层（GCL）、亚颗粒增生带（SGZ，GCL与门区之间约2个细胞体厚的一层［11］）及门区BrdU阳性细胞数并进行比较，每只大鼠随机选取4~5个非连续的脑片进行计数.统计学处理： 实验结果以x±s表示，使用SPSS 11.0软件包行方差分析， P
2结果
2.1行为学改变匹罗卡品注射后5 min大鼠开始出现烦躁不安、跑动、凝视、站立、点头、咀嚼样动作、湿狗样抖动等表现. 约30 min左右出现面肌抽动、前肢震颤、姿势失衡、跌倒，继之发生全身强直阵挛抽搐，持续1~2 min. 发作间期动物呈疲劳状态. 注射地西泮后，大鼠逐渐停止癫痫发作，经过5～20 d的静默期后，进入慢性期的各干预组致痫大鼠均观察到Ono J分级标准Ⅰ～Ⅲ级的自发反复发作（SRSs）. 各干预组致痫大鼠首次癫痫发作平均潜伏期、注射地西泮前强直阵孪发作次数和平均持续时间无显著性差异（表1，P＞0.05）. 电针穴位刺激干预组大鼠(存活42 d大鼠)平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠（表1，P
转贴于
表1各干预组致痫大鼠癫痫行为学改变比较(略)
2.2大鼠海马齿状回神经发生的形态学特点致大鼠海马齿状回亚颗粒增生带和颗粒细胞层内可见BrdU阳性细胞分布，高倍镜（≥400）下观察常可见6~8个以上BrdU标记阳性细胞“丛集”在一起，但这些细胞细胞核形态往往不规则. 而呈单个或两个相邻的阳性细胞，则细胞核形态相对比较规则（图1）.
2.3致痫大鼠齿状回神经发生水平的影响各组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞主要分布在SGZ，齿状回颗粒细胞层与门区BrdU免疫阳性细胞均较少. 电针穴位刺激后，明显促进了大鼠致痫后7，14 d时齿状回的神经发生水平，BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加（P
B：单个或两个分布的BrdU免疫阳性细胞. 箭头所示为BrdU免疫阳性细胞.
图1大鼠致痫后齿状回亚颗粒增生带BrdU免疫阳性细胞分布模式×400
图2大鼠致痫后电针穴位刺激对不同时间点齿状回BrdU免疫阳性细胞数目的影响
3讨论
众所周知，在祖国传统医学的漫长发展过程中积累了大量理论和实践经验的针灸穴位治疗癫痫是一种非药物性的抗痫治疗手段，其疗效在众多的国内外学者中已达成共识，其具有的安全、简便易行且副作用小的特点更是为大家广泛接受. 但是由于对针灸穴位刺激治疗癫痫的基础研究领域目前尚缺乏深入的实验研究，使得针灸穴位治疗癫痫的工作在临床推广和提高其疗效上受到了极大的限制. 近年来，人们应用BrdU标记细胞分裂的方法，发现在小鼠、大鼠、兔、豚鼠、鸟、猴及人脑中均有神经发生现象，只不过这些发生现象仅局限于脑内某些特定区域，如海马齿状回亚颗粒增生带(subgranular proliferative zone， SGZ)和前脑脑室下带(subventricular zone， SVZ)等. 在某些生理刺激和包括癫痫发作在内病理状态下，这些部位的神经发生水平明显增高，并且国内、外一些相关研究结果也表明癫痫后的海马齿状回的神经发生即神经可朔性的改变可能与癫痫发作的易感性密切相关. 由于海马是与癫痫发作有关的重要解剖学结构，并且针灸穴位刺激所产生的调节脑内乙酰胆碱(Ach)，内啡肽(ED)，5羟色胺(5HT)等中枢介质，以及可以使兴奋性氨基酸的含量下降， 抑制性氨基酸水平相对或绝对升高等广泛生理学效应均参与了癫痫后海马齿状回神经发生的过程［4］. 因此，我们有理由相信穴位电刺激治疗癫痫有可能最终是通过影响脑内与癫痫发作有关的解剖学部位神经发生即可塑性变化而发挥疗效的.由于以往我们进行的实验研究结果已经显示了电针刺激百会穴对改善致痫大鼠脑电图和行为学表现的作用，证实它的抑痫效果. 因此，本研究中我们重点观察了电针刺激百会穴对致痫大鼠海马齿状回神经发生水平的影响. 结果显示所有实验大鼠注射匹罗卡品后均出现癫痫发作，其行为学改变大致相同，大鼠停止癫痫发作经过5～20 d后进入慢性自发反复发作期，在此期间电针穴位刺激干预组大鼠平均每周SRSs次数明显少于电针刺激对照组和无刺激对照组大鼠. 形态学观察发现各干预组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞主要分布在SGZ，齿状回颗粒细胞层与门区BrdU免疫阳性细胞均较少. 电针穴位刺激干预组大鼠致痫后7 d， 14 d时齿状回BrdU免疫阳性细胞数目较相应对照组明显增加，而致痫后第42日时两干预组大鼠齿状回BrdU免疫阳性细胞数目无显著性差异. 这一结果表明电针刺激百会穴可促进癫痫后海马齿状回神经发生水平的改变，即电针刺激百会穴在一定的程度上参与了癫痫后海马的神经可塑性变化. 而相对于致痫后第42日时两干预组大鼠齿状回神经发生水平无显著性差异这一现象，我们认为它的出现可能与进入慢性期后对照干预致痫大鼠SRSs次数明显多于电针穴位刺激治疗干预大鼠有关，是这种多次的自发反复发作对齿状回神经发生的影响干扰了结果，还是电针穴位刺激治疗的时效性导致这一现象，我们尚不清楚.根据以往的研究结果，我们知道癫痫后海马的神经可塑性改变除了神经发生以外，还包括了苔藓纤维出芽以及突触重建等多种组织结构的变化，所有的这些可塑性的改变都有可能导致局部异常放电神经元的功能和结构的长期改变，从而参与纠正清楚中枢神经系统中业已形成的异常放电的错误行为印迹的过程，进而影响癫痫的进程和结局［12-13］，但从另一个层面来讲局部神经元的功能和结构的长期改变又可导致新的异常放电形成，增强易感性. 总之，致痫后海马局部神经可塑性的改变是一个异常复杂的过程，据包括我们实验在内的实验结果可以初步认定电针穴位刺激治疗癫痫的解剖学基础可能与海马部位存在的神经发生有着密切的联系，但它们之间的关联性还有待我们进一步探索.
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篇10
[关键词] 钩吻素子；焦虑；高架十字迷宫；群居接触试验；别孕烯醇酮；皮质酮
[中图分类号] R964 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）09（b）-0008-05
[Abstract] Objective To study the anxiolytic effects of koumine administrated repeatedly on isolated rats and to explore its mechanism. Methods Each Wistar rat was housed in individual cage for 18 days， and at day 12， the rat was subcutaneously administrated of 0.5 or 1.5 mg/kg koumine once a day， lasting for 7 days. At the day 17 of individually housing （the sixth day of administration）， the elevated plus-maze was used to observe the anxiolytic-like behaviors of rats. And at the final day of individually housing （the seventh day of administration）， the behaviors of rats were measured by the locomotor activity test and social interaction test subsequently. After the animal behavioral tests， the concentrations of plasma adrenocorticotropic hormone （ACTH） and corticosterone， and the levels of progesterone and allopregnanolone in hippocampus of rats were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Repeated administration of koumine for 6 days significantly increased activities of isolated rats in the open arms of elevated plus-maze， indicating the anxiolytic effect of koumine. After administration for 7 days， rats did not alter their locomotor activity， but the paired rats in 1.5 mg/kg koumine treatment group increased the contact number and contact time comparing with the model group， further demonstrating the effectiveness of koumine against anxiety. Comparing with the model group， 1.5 mg/kg koumine treatment reduced the concentration of plasma corticosterone （P < 0.05）， and 0.5， 1.5 mg/kg of koumine treatment significantly increased the level of allopregnanolone in hippocampus of rats （P < 0.05）. The concentration of plasma ACTH and the level of progesterone in each group were not altered. Conclusion Repeated administration of koumine can increase the anxiolytic-like behaviors of isolated rats， its anxiolytic mechanism may be related to the mediation of allopregnanolone in hippocampus and the inhibition of abnormal activity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis.
[Key words] Koumine； Anxiety； Elevated plus-maze； Social interaction test； Allopregnanolone； Corticosterone
钩吻素子为马钱科植物钩吻（Gelsemium elegans Benth.）生物碱单体中含量最高的有效成分[1]。本课题组前期工作发现，钩吻素子具有一定的抗焦虑作用[2-3]。但焦虑症在临床中是由多种病症所构成，其中包括广泛性焦虑症、社交恐惧障碍和惊恐障碍等，因此临床前的抗焦虑药研发需要更多的焦虑动物模型加以佐证[4]。为此，本研究通过高架十字迷宫和群居接触试验等动物行为学的方法，观察钩吻素子连续给药对大鼠的抗焦虑疗效，并在此基础上探讨其抗焦虑作用机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
钩吻素子由福建医科大学药学院对闽产野生钩吻（G. elegans）采用高速逆流色谱等技术中分离纯化获得（纯度99%）[5]；地西泮注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号1201301）；生理盐水（福州海王福药制药有限公司，中国，批号：150401B21）。钩吻素子和地西泮均用生理盐水配制或稀释到相应浓度的溶液进行给药。大鼠高架十字迷宫（EPM）和旷场试验箱（上海移数信息科技有限公司，中国）；动物视频行为分析系统（Smart V2.5，Panlab公司，西班牙）。大鼠促肾上腺皮质激素（ACTH）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（Phoenix制药公司，美国）；大鼠皮质酮（CORT）和孕酮（PROG）ELISA试剂盒（Enzo公司，美国）；大鼠别孕烯醇酮（ALLO）ELISA试剂盒（Arbor assays公司，美国）。
1.2 动物
SPF级Wistar雄性大鼠64只，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证编号：SCXK（京）2012-0001；合格证号：11400700116711]。动物饲养于屏障环境设施中，刚购进的动物检疫5 d后进行正式试验，检疫期间动物饲养盒的规格为465 mm×300 mm×190 mm，每盒5只，人工照明，明暗各12 h，室温20～26℃，湿度40%～70%。本研究实验动物的使用及处置方法符合动物福利的要求，实验开展前经过福建医科大学实验动物伦理委员会的审查批准。
1.3 方法
1.3.1 动物分组和给药处理 大鼠检疫结束后，随机分为模型组、钩吻素子0.5 mg/kg治疗组、钩吻素子1.5 mg/kg治疗组和阳性对照组（地西泮1 mg/kg），独笼饲养18 d（动物饲养盒的规格为300 mm×250 mm×170 mm），保证在群居接触试验前每只受试大鼠均未与其他大鼠接触，以建立大鼠孤立模型。在独笼饲养的第12天，大鼠按上述给药剂量以0.2 mL/100 g体重颈背部连续给药7 d，模型组动物给予等体积的生理盐水，阳性对照组则在第1～6天给予等体积生理盐水，第7天给予地西泮。动物在每天早上给药1次，各组于第6、7天给药1 h后分别进行EPM、自主活动和社会交往试验，试验安排见图1。行为学测试于每日8：00～14：00之间进行。
1.3.2 EPM 在造模第17天（即连续给药第6天），挑选同一组体重相似的2只动物进行配对，配对大鼠体重相差不超过15 g。每个配对组选择1只动物进行EPM，其中阳性对照组动物未给予地西泮，其数据归入模型组中。测试时，将大鼠置于EPM中央区，头朝闭臂，通过计算机分析记录其在5 min内的总路程、平均速度，以及在开臂区的路程比例、进入次数比例和停留时间比例。总路程和平均速度作为评价动物自主活动的指标；开臂区路程比例、进入次数比例和停留时间比例则是作为动物焦虑样行为的指标，开臂区的活动性增加则提示动物呈现抗焦虑样的行为变化。
1.3.3 自主活动试验 在造模第18天（给药第7天），各组动物给药后首先在旷场试验箱进行5 min的自主活动试验。测验时，将大鼠置于旷场试验箱（50 cm×50 cm）的角落里，通过计算机记录动物的总路程和平均速度，以反映动物的自主活动情况。
1.3.4 群居接触试验 在自主活动试验结束后，每组配对的、首次接触的大鼠分别置于旷场试验箱对角线两端的两个角落里，通过摄像机拍摄下两只动物在10 min内的活动情况。采取单盲的方式采集试验数据：由一名熟练而未被告知动物分组和处理情况的实验员，通过录像回放记录配对动物的接触次数和接触时间。本次群居接触的定义是两只大鼠之间的主动接触，包括互相靠近、触碰、跟随、嗅、爬上、下钻或围绕转圈等。而动物之间出现背靠背和攻击等被动性接触，则不列入到本次的接触行为。接触次数和时间的增加提示动物呈现抗焦虑样的行为变化。在以上EPM、自主活动试验和群居接触试验中，每次测试结束均对行为学仪器进行清洗，保证清洁无异味，避免影响下一只动物的测试结果。
1.3.5 血浆ACTH和CORT测定 动物行为学测试完成后，随机选取5只动物行20 mg/kg乌拉坦腹腔注射麻醉，以含肝素钠的真空管于大鼠下腔腹主动脉收集血液，在4℃下4000 r/min离心15 min，分离血浆，于-80℃保存待测。各组动物血浆中的ACTH和CORT浓度根据各自的ELISA试剂盒说明书进行检测。ACTH和CORT测试方法的最小可测量浓度分别为40、32 pg/mL，组间和组内的变异系数均小于10%。
1.3.6 大脑海马PROG和ALLO测定 采集血液完成的动物放血安乐死，并迅速取出大脑海马，全过程在冰上操作。每100毫克海马组织加入含1% PMSF的PBS 1 mL，冰上匀浆15 min以上，在4℃下 3000 r/min离心30 min，取上清液，于-80℃保存待测。各组动物海马组织中的PROG和ALLO含量根据各自的ELISA试剂盒说明书进行测定。PROG和ALLO测试方法的最小可测量浓度分别为15.62、391 pg/mL，组间和组内的变异系数均小于10%。
1.4 统计学方法
应用SPSS statistic 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）进行统计，随后通过LSD检验进行组间比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 钩吻素子对大鼠高架十字迷宫试验的影响
大鼠高架十字迷宫试验结果显示，各组动物在高架十字迷宫中运动的总路程和平均速度比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。与模型组比较，钩吻素子1.5 mg/kg治疗组大鼠在开臂区的路程比例、开臂区进入次数比例和开臂区停留时间比例均有显著提高（P < 0.01）；钩吻素子0.5 mg/kg治疗组大鼠开臂区进入次数比例亦显著高于模型组（P < 0.05）。见图2。
2.2 钩吻素子连续给药对大鼠自主活动的影响
大鼠在旷场试验箱中的自主活动结果显示，各组动物在旷场试验箱中运动的总路程和平均速度比较差异均无统计学意义（P > 0.05）。见图3。
2.3 钩吻素子连续给药对大鼠群居接触试验的影响
与模型组比较，钩吻素子1.5 mg/kg治疗组配对大鼠接触次数和接触时间显著提高（P < 0.01、P < 0.05）；阳性对照组配对大鼠的接触次数和接触时间亦显著高于模型组（P < 0.05、P < 0.01），提示实验系统的可靠性。见图4。
2.4 钩吻素子连续给药对大鼠血浆中ACTH和CORT水平的影响
各组动物血浆中的ACTH水平比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图5a。与模型组比较，钩吻素子1.5 mg/kg治疗组和阳性对照组大鼠血浆中的CORT水平显著下降（P < 0.05、P < 0.01），见图5b。
2.5 钩吻素子连续给药对大鼠海马中PROG和ALLO含量的影响
各组动物海马中的PROG含量比较差异无统计学意义（P > 0.05），见图6a。与模型组比较，钩吻素子0.5、1.5 mg/kg治疗组大鼠海马中的ALLO含量显著上升（P < 0.01），阳性对照组则未见改变，见图6b。
3 讨论
大鼠单独饲养的孤立方式是一种快速有效的应激作用，通过这种应激能提高动物的焦虑水平[6-7]。EPM是利用啮齿类动物对新异环境和高悬开臂的探究和恐惧的矛盾冲突状态，通过它们在开臂区探索行为变化，评价其焦虑状态[8]。群居接触试验则是通过配对孤养大鼠彼此渴望接触，但对陌生环境产生恐惧，而形成矛盾冲突状态，利用它们的接触情况反映其焦虑状态[6]。这些经典的焦虑模型被神经精神药理学研究广泛采用。旷场的自主活动试验则是用于评价动物的整体运动情况。一般来说，只有在受试药不影响动物自主活动性的情况下，产生抗焦虑样行为，才可认为该药具备抗焦虑作用[2，6]。本研究通过EPM、自主活动试验和群居接触试验，提示钩吻素子连续皮下给药超过6 d，即可增强孤立大鼠的抗焦虑样行为，且未影响其自主活动情况，进一步证明了钩吻素子的抗焦虑作用。
PROG和ALLO为脑内重要的神经甾体，它们与焦虑症的发病机制和治疗密切相关[9-10]。其中，ALLO能激动焦虑动物的GABAA受体，使之产生抗焦虑样行为的改变[11]。临床上也发现患有恐慌症的患者体内的ALLO水平显著下降[12]。本课题组前期研究发现，钩吻素子的镇痛作用与其提高脊髓ALLO水平有关[13-14]，能够抑制神经甾体合成的士的宁能呈浓度依赖性地拮抗钩吻素子的抗焦虑作用[2]。焦虑症的发病部位主要涉及海马、蓝斑、杏仁核、边缘叶、额叶皮质、下丘脑和网状结构等脑区，其中海马与焦虑症的行为表现关系密切[15]。同时，有文献报道海马富含转位蛋白（TSPO，18 kDa），并能表达各种合成神经甾体如ALLO所需的酶[16]。海马微量注射TSPO激动剂能产生与ALLO合成、增强GABAA受体功能密切相关的抗焦虑作用[17]。本研究发现钩吻素子连续给药能提高孤立大鼠海马的ALLO的含量，但对PROG含量则无影响。由此提示了钩吻素子的抗焦虑作用与大脑海马的ALLO含量密切相关。这与本课题之前报道的结果一致[18]。此外，阳性药地西泮未能改变大鼠海马中PROG和ALLO的含量。
本研究还发现，钩吻素子连续给药能有效降低孤立大鼠血中的CORT水平，但对ACTH则无影响。应激状态下产生的焦虑情绪与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的关系密切[19]。应激反应可激活下丘脑室释放促肾上腺皮质激素释放激素（CRH），进而使垂体释放ACTH，ACTH经血液达到肾上腺皮质，并促进其释放糖皮质激素，即CORT或皮质醇[20]。因此，应激状态下机体循环系统中的CORT水平与焦虑情绪密切相关。在慢性应激状态下，CORT水平持续增加，则会引起大脑海马损伤[21]。还有研究发现，遭受早期母婴分离应激的大鼠在给予ALLO后，能有效抑制焦虑样行为，并能调节应激对肾上腺皮质分泌反应、保护糖皮质激素负反馈效应，以及改变下丘脑CRH和海马糖皮质激素受体的转录水平，提示增加体内的ALLO可有效抑制应激引起的HPA轴活性失调[22]。结合以上证据与本次研究结果可以看出，钩吻素子的抗焦虑作用可能通过调节海马的ALLO含量，从而抑制HPA轴的异常活化，降低血液中的CORT水平，最终抑制焦虑行为的发生。另外值得一提的是，阳性药地西泮也能降低孤立大鼠血浆中的CORT水平，但并不能改变其海马中的神经甾体含量，提示钩吻素子与地西泮的抗焦虑作用机制可能存在差异。
综上所述，本研究结果提示，钩吻素子连续给药能增加孤立大鼠的抗焦虑样行为，其抗焦虑作用可能与调节大鼠海马的ALLO含量和抑制HPA轴的异常活动有关。
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