免疫学分析法范文

导语：如何才能写好一篇免疫学分析法，这就需要搜集整理更多的资料和文献，欢迎阅读由公务员之家整理的十篇范文，供你借鉴。

篇1

化学发光免疫分析包括三大类型: 即标记化学发光物质的化学发光免疫分析、 标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析和标记酶的化学发光酶联免疫分析。化学发光免疫分析技术可测定内分泌激素、 肿瘤标志物、 血药浓度、 传染病和心血管疾病标志物、 贫血及过敏原等项目［1］。目前对运动员血清睾酮的检测， 大多采用放射免疫法， 由于其自动化程度低， 不适用于快速检测， 又有放射污染。美国Beckman．Coulter公司和法国Pasture研究院合作生产的Access全自动微粒子化学发光免疫分析仪， 其方法学具有高灵敏性、 高精确性、 高稳定性等特点， 无需对样本进行测前处理， 简便的自动化操作， 全程仅需15～20 min， 且无放射污染。本室引进Access免疫分析系统对运动员血清T进行定量测定， 现对该方法的临床应用评价如下。

1 材料和方法

1.1 检测对象 无锡市体育管理中心运动员122人， 年龄≥15岁， 其中男64人， 女58人。对照组为来我院正常体检的中学生， 男、 女各30人。采运动员清晨静脉血2 mL， 分离血清后进行检测。

1.2 材料 血清睾酮的检测采用Access磁微粒化学发光免疫分析系统。Access免疫分析系统及配套的T试剂盒， 冲洗缓冲液， 碱性液， 酸性液， 定标液， 基质液(Substrste)， 反应杯(RV管)由BeckmanCoulter公司提供。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线 分别取0、 1.7、 5.2、 13.9、 27.8、 55.5 nmol/L T标准液， 在Access免疫分析系统中执行自动定标程序。以2次测定结果的均值， 进行数学逻辑处理， 绘制标准曲线。

1.3.2 统计学分析 两组间数据采用t检验。

2 结果

2.1 精密度测试 取低、 中、 高值的混合血清分别重复测定20次， 计算变异系数CV， 反映批内精密度。每天对不同浓度的质控血清测定1次， 连续20 d， 评价批间精密度。低、 中、 高值批内CV分别为4.1、 2.7、 1.6; 批间CV 分别为4.4、 3.2、 2.6。

2.2 血清睾酮检测结果及统计分析 运动员血清睾酮检测结果显示， 男女运动员与各自相同性别正常人对照组之间无统计学意义（P>0.05）。 表1 运动员血清睾酮检测

3 讨论

Access免疫分析通过在RV管中加入包被单克隆抗体的磁性微粒、 血清样品、 碱性磷酸酶(ALP)标记的抗原， 经37℃孵育后， 形成竞争法抗原抗体结合成的复合物。再加入底物 AMPDD(一种金刚基二螺［4， 4］二氧乙烷的磷酸脂)发光剂。AMPDD经ALP水解， 生成一种不稳定的阴离子， 该阴离子分解时持续发光， 且与ALP量成正比， 通过测定相对发光单位(relative light unit， RLU)定量检测血清中物质的浓度［2］。

对运动员血清T检测结果表明， CV％值较小， 说明仪器重复性较好， 测定结果稳定。 T的测定浓度范围在0～55.5 nmol/L之间， 能够满足运动员正常测试的需要。自动化的Access免疫分析系统， 既具有化学发光检测的高灵敏度， 又具有免疫分析的高特异性， 准确性、 稳定性， 能够快速及时的为运动员训练监控提供可靠的依据。另外， 它是用化学试剂来标记抗原或抗体， 避免了因使用放射性核素而带来的对人体和环境的危害。

但由于试剂成本的原因， Access免疫分析系统仍未广泛应用于临床。随着临床需求的进一步扩展， 高灵敏度、 宽线性Access免疫分析系统的将得到广泛应用。

参考文献

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[关键词]梅毒；血清学检验；CMIA；GICA

流行病学调查显示梅毒是我国二类传染病报告中排名第三的传染性疾病，梅毒螺旋体是梅毒的病原体。性传播是梅毒的主要传播途径，占所有传播途径的95%，大量存在于皮肤黏膜损害表面，也见于唾液、乳汁、、尿液中。未经治疗的病人在感染1年内最具传染性，随病期延长，传染性越来越小，病期超过4年者，通过性接触无传染性。目前，对于梅毒的诊断主要依据病史、临床症状和血清学诊断联合判断，该方法耗时长、操作复杂，给梅毒的诊断和治疗带来极大的不便。目前，梅毒的血清学检测主要是由TPPA、ELISA和TRUST等检测方法。TPPA是目前临床公认的梅毒检测金标准，然而该方法操作繁琐且依赖肉眼判断实验结果，对检测者的实验技术和经验有较高的要求。ELISA和TRUST法各有优劣但均无法替代TPPA。CMIA是一种新型的TP抗体检测试验，有报道称其具有良好的准确性和特异性。GICA是在酶联免疫吸附、单克隆抗体技术、乳胶凝集试验和胶体金技术的基础上发展出的新技术，具有灵敏、方便等优势。因此，本研究拟探讨CMIA和GICA的优劣，为改善梅毒的诊断提供数据支持。

1.材料与方法

1.1材料

收集我院2014年1月至2015年1月皮肤与性病科送检血清样本1500例，其中男性1047例，女性453例，年龄16～89岁，平均（36.8±8.2）岁。排除：（1）已接受抗梅毒治疗、免疫治疗患者；（2）拒绝入组患者。本研究已经医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂

采用美国贝克曼公司设计生产的全自动微粒子化学发光仪DxI-800及其配套试剂、定标液和质控品（批号：224751）。TPPA和GICA试剂盒、酶标仪和指示板由美国罗氏公司提供（批号：20140510）。

1.3方法

空腹采血3mL，离心得到血清后分别采用TPPA、GICA、CMIA法进行检测，操作严格依据试剂盒说明书进行。GICA法使用TPl5、TPl7、TP44.5和TP47的金颗粒分别加入阳性对照和阴性对照及样品中，反应0.5h后清洗并在全自动微粒子化学发光仪中进行检测，记录各孔的发光强度。CMIA法从测试到结果判读均由仪器全自动完成，以S/CO>1.0为梅毒检验阳性。TPPA以反应孔中细胞沉积在孔中央呈光滑纽扣状为阴性，反应孔出现凝集呈不规则沉积为阳性。当滴度≥1：80时判读为阳性，对于弱阳性标本需重复测定2次，复检2次全为阴性时判读为阴性，否则结果判读为阳性。

1.4统计学方法

采用SPSS19.0软件分析，检测结果采用配对四格表计算敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值，两种方法间比较采用X2检验。

2.结果

采用TPPA检测法对1500例血液样本进行梅毒检测，检出阳性样本182例、阴性样本1318例，阳性率12.1%。

2.1两种方法检测结果比较

在阳性样本中CMIA法检测结果优于GICA法（P0.05）。见表1。

2.2两种检测方法实验特性比较

CMIA的灵敏性和阴性预测值优于GICA法（P

3.讨论

在梅毒螺旋体初次感染人体后会进入潜伏期，潜伏期的梅毒感染临床症状不显著，诊断存在困难，而在进入潜伏期2～4周后便会产生特异性的抗梅毒螺旋体抗体，因此针对这些抗体进行检测有助于梅毒的早期诊断和治疗。同时，梅毒发病率的上升也对临床输血工作造成了严重的威胁。目前，国内医院或实验室主要使用非特异性梅毒螺旋体检测方法进行，检测如性病研究实验室实验（VDRL）和快速血浆反应素环状卡片实验（RPR）等。

CMIA检测梅毒的原理是将重组的梅毒螺旋体抗原（Tpnl5、17和47）包裹并与检验稀释液混合后加入样本，若血样中存在梅毒螺旋体抗体，则会结合在抗原包被粒子上，加入预触发液和触发液后，测的化学发光反应无的相对单位，进而检测梅毒螺旋体感染情况。张东梅等比较了CMIA法与TPPA法测定梅毒感染的效果证实，两种检测方法具有极高的一致性，但认为在CMIA法S/CO值为1.0～4.0时需进一步复检。

GICA法是一种结合了色谱层析和免疫反应两种技术优势的体外诊断技术。通过高纯度的梅毒螺旋体抗原高选择性结合样品中的抗体，并通过色谱层析的方式分离，仅需一次上样不需要任何仪器设备辅助就能高效准确的测定样本中抗体含量。磁性微粒因为具有超顺磁性因此分离简单且具有较大的单位表面积，因此反应灵敏。张鹏比较了GICA和ELISA技术在梅毒检测中的效果证实GICA与ELISA和TPPA检测法结果差异均无统计学意义，但该方法操作更为简便。杨璐对GICA法进行评估后认为该检测方法具有很高的灵敏度和特异性且简单易行，具有较高的应用价值。

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【关键词】化学发光免疫法；放射免疫法；AFP；分析性能；实验方法

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.01.672文章编号：1004-7484（2014）-01-0556-02

化学发光免疫分析是一种新型的标记免疫分析技术，是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫分析等分析方法之后的新一代标记免疫分析技术，是将免疫测定与化学发光相结合的新型技术。整个过程均在全封闭的反应体系中进行，且能够全自动操作，仪器具有反应迅速，灵敏度高，检测限低等优点，总的来说包括抗原抗体特异性结合与化学发光两部分过程[1]。甲胎蛋白（AFP）是原是胚胎的肝细胞，婴儿两个月便逐渐消失，但近些年发现AFP在部分成人体内出现，并发现它是原发性肝癌最灵敏，也是最特异的肿瘤标志物。为了进一步考察该仪器对AFP生物检测限和AFP功能灵敏度的测量，我院参照IUPAC（国际纯粹和应用化学联合会）的规定评价方案，现将60例临床送检血清标本的临床资料进行报道如下：

1材料与实验方法

1.1应用材料与仪器检测样选用我院2013年1月至2013年3月的60例临床送检血清标本。

仪器采用美国Bayer Centaur 240全自动化学发光仪，并配套相关检测试液（包括标记的抗原抗体、含磁性的固相颗粒、稀释液、AFP清洗液、发光试剂等），均采用拜耳公司提供的试剂。放射免疫法采用上海产的γ计数仪（SN-682 型），并配套运用 AFP 试剂盒（中国原子能科学研究所研制）。

1.2方法检测时运用AFP稀释液作为空白样品，取一新鲜的血清作为试样，做重复性实验，记录每次检测的浓度值和光强度值。核实两者的精密度、灵敏度与检出限等，数据处理采用线性回归处理。

1.3统计学方法根据SPSS13.0软件对提供的数据进行统计学的分析，计量资料为t检验，对所有统计结果采用均数±标准差（χ±s）的形式表示，运用软件进行处理（检验水准α=0.05，双侧检验）作为统计学的评定标准具有统计学的差异。

2结果

2.1线性试验以AFP稀释液作为空白试剂，再根据要求将标准溶液稀释成不同浓度的溶液，放射免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb为标准浓度测定标准曲线，化学发光免疫法取5ppb、10ppb、50ppb、200ppb、400ppb、800ppb为标准浓度测定标准曲线，结果两组数据均有较好的线性关系。

2.2重复性试验取一新鲜的血清作为试样，两种方法均进样10次，查看两者的重复性差别，两组仪器均能满足RSD

2.3相关性试验采用2.2中的方法用上述两种检测法对受检血清标本进行适当定量分析。结果显示，两种方法无显著差异（P>0.05），且相关系数r=0.995，回归方程为y=-1.059+0.921x，两组方法所得数据的相关性良好。

2.4回收率试验取混合血清后，再加不同浓度的标准定值血清，用两组方法分别对其进行平均回归率实验，实验得出，放射免疫法的回收率为91.2-108.1%，化学发光免疫法的回收率为92.0-107.8%。化学发光免疫法略优于放射免疫法。

2.5检出限以每次做的空白RLUs为基值，以该空白的RLUs值的3倍作为样品中具有的AFP量，或称本法的检测低限。分别对两种方法进行检出限测量，得出化学发光免疫法的检出限为0.95ppb，放射免疫法的检出限为5ppb。化学免疫法在检出限上明显优于放射免疫法[2]。

2.6精密度试验取三个梯度浓度（分为低、中、高三个梯度）的试剂分别进行精密度实验，并运用两种方法进行整理对比，见表1。

3讨论

化学发光免疫技术作为一种新型的分析技术，既具有运用发光检测时的高度敏感性，也同时具有免疫分析时的高度特异性。其原理为将激发态分子回到基态时所释放而产生的发光现象，再运用化学发光系统来为抗原抗体的结合反应做指示系统，从而进行定量检测抗原或抗体的浓度方法，是一种直接的运用发光剂标记抗体的免疫分析方法。由于运用丫啶酯发光剂的优点可以很好的减少非特异性干扰，反应较为简单且迅速，反应灵敏度高，据有关资料显示，该发光剂也很稳定（有效期可长达1年以上）。

放射免疫法是目前临床上较为常用的分析方法，其原理是放射性标记的抗原和非标记抗原全部同时与限量的特异性抗体进行竞争性可逆的结合反应，反应的灵敏度较低，标记物的有效期也较短（一般只有1个月左右）。从工作人员角度来说，也会对他们的身体健康带来很多负面影响。从以上的结论可以看出，两种方法的检测结果无显著性差异，且相关性较好。但从检出限、灵敏度、精密度等方面进行比较，化学发光免疫法就明显优于放射免疫法，而且其试剂稳定性高、毒性小，对环境无过大污染，方便、易操作且安全。

本实验采用的全自动化学发光仪可以很好地对血清标本进行很好地采样，处理和检测，基本上能够达到样品随到随测，检测迅速，很快可以得到检测结果，大大缩短了检测所用的时间，能满足临床上的检验需求[3]。从上述数据可以确认，该方法的检测结果均可以达到临床运用水平，又基于其高度特异性、灵敏度高、重复性好等优势，值得临床进一步广泛应用。

参考文献

[1]张红祥.化学发光免疫法与放射免疫法检测血清AFP临床分析[J].中国现代药学应用，2010，4（7）：41-42.

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关键词：甲状腺疾病;化学发光免疫技术;应用;效果

甲状腺疾病为常见临床疾病，常通过检测患者甲状腺球蛋白进行诊断。传统检测方法为放射免疫技术、血凝法等，但检测效果不甚理想。化学发光免疫技术具有稳定性高、灵敏度高和操作方便等优点，标本用量较少，且标记物易得[1]。现搜集2013年7月―2014年7月我院接诊的甲状腺疾病45例、甲状腺肿瘤45例、甲亢45例患者，对其化学发光免疫技术的应用效果进行总结性分析，并将分析结果报告如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 将2013年7月―2014年7月我院接诊的甲状腺疾病45例患者作为甲组，平均年龄是（29.32±10.25）岁，男患者和女患者分别是23例、22例;将甲状腺肿瘤45例患者作为乙组，平均年龄是（29.39±10.25）岁，男患者和女患者分别是24例、21例;将甲亢45例患者作为丙组，平均年龄是（29.48±10.22）岁，男患者和女患者分别是25例、20例;将同期正常体检人群45例作为丁组，平均年龄是（30.07±1.12）岁，男性和女性分别是22例、23例。甲组、乙组、丙组和丁组的一般临床资料相比，无明显差异，无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法 在受检者空腹情况下采3ml血，抗凝剂选择肝素钠，通过放射免疫技术对血浆甲状腺球蛋白进行检测;后选择化学发光免疫全自动分析仪检测。比较甲组、乙组、丙组和丁组假阴性、假阳性和检测浓度。对比不同检测方法的符合率、特异性及灵敏度。

1.3 统计学分析 对本文所得实验数据均采用SPSS 13.0统计学软件进行检验，所得计量资料采用t检验，所得计数资料采用χ2检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 假阴性及假阳性结果 与放射免疫技术相比，四组经化学发光免疫技术检测假阴性及假阳性率较低，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组检测结果比较情况见表一。

表一 四组假阴性及假阳性结果对比

2.2 甲状腺球蛋白检测浓度 与放射免疫技术相比，经化学发光免疫技术检测的甲状腺球蛋白浓度较高，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组不同检测方法甲状腺球蛋白浓度比较情况见表二。

表二 四组不同检测方法甲状腺球蛋白浓度对比

2.3 符合率、特异性及灵敏度 与放射免疫技术相比，四组化学发光免疫技术检测符合率、特异性及灵敏度较高，有明显差异，有统计学意义（P<0.05）。四组不同检测方法符合率、特异性及灵敏度比较情况见表三。

表三 四组不同检测方法符合率、特异性及灵敏度对比

3 讨论

放射免疫技术假阴性率及假阳性率较大，试剂有效期较短，且具有一定放射性，限制临床应用。该技术又分为发光反应和免疫反应，在抗原或抗体上标记化学发光剂，将其与待测标本抗体或抗原经特异性反应相互结合，产生复合物，通过磁场对结合态、游离态进行分离，加入发光底物或氧化剂，促使物质氧化，产生激发态中间体，跃迁至基态，发射光子，经发光强度检测进行定性检测和定量检测[2]。该技术主要适用于肿瘤标志物分析、心脏疾病标记物测定、激素分析等。甲状腺疾病患者的甲状腺功能主要依靠检测甲状腺球蛋白判断，因此，必须加强对患者甲状腺球蛋白的定量检测[3]。在本文研究中，对甲组、乙组、丙组和丁组分别进行放射免疫技术及化学发光免疫技术检测，结果显示，甲组经放射免疫假阴性率为8.89%，经化学发光免疫假阴性率为2.22%;乙组分别为11.11%、2.22%;丙组分别为6.67%、0%;丁组假阳性率分别是4.44%、2.22%，表明化学发光免疫技术可有效检测甲状腺疾病，假阴性率及假阳性率较低。甲组、乙组、丙组和丁组经不同方法检测甲状腺球蛋白，化学发光免疫技术检测浓度均高于放射免疫技术，表明化学发光免疫技术对有效检测甲状腺球蛋白具有重要作用。化学发光免疫技术检测符合率、特异性及灵敏度均高于放射免疫检测，表明化学发光免疫技术具有较高的检测特异性及灵敏度，符合率较高。

综上认为，化学发光免疫技术在临床上应用价值较大，能为临床诊断甲状腺疾病提供有力依据，应予以推广。

参考文献：

[1] 李晓霞.化学发光免疫分析[J].延安大学学报（医学科学版）.2012，16（17）：50-51.

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【关键词】 造血干细胞 CD117+细胞 免疫磁珠分离法 小鼠 近交BALBC

造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞，并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。CKit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

BALB/C小鼠，(20±1)g，雌雄随机，10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。

1.2 试剂和仪器

BSA购自杭州四季青生物工程材料研究所，荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自Miltenyi Biotec公司，流式细胞仪(FACS Calibur)购自BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠骨髓细胞收集

颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2 mmol/L EDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1 ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1 500 r/min离心10 min，小心去除上清液，加入5 ml缓冲液混匀，进行细胞计数。

1.3.2 MACs分离CD117细胞

1.3.2.1 小鼠系别细胞去除 用缓冲液按40 μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育10 min。加入缓冲液30 μl/107个细胞，20 μl抗生物素微珠，混匀，4～8 ℃孵育15 min。加入5 ml缓冲液洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液。

1.3.2.2 磁性标记和分选CD117细胞 将分选后得到的细胞用缓冲液按80 μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20 μl/107个细胞，混匀，4～8 ℃孵育15 min，缓冲液1 ml/107个细胞洗涤细胞，1 500 r/min离心10 min，完全去除上清，用500 μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1 500 μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1 ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。

1.3.3 流式细胞仪分析

将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100 μl缓冲液，10 μl CD117抗体混匀，4 ℃黑暗中孵育10 min，加入1 000 μl缓冲液1 500 r/min离心10 min，完全去除上清液，加入500 μl缓冲液混匀，送流式细胞分析，设阴性对照和空白对照。

1.3.4 细胞染色计数

0.4% 台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定: 0.4% 台盼蓝染色1 min，计算活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。

1.4 统计学处理

用SPSS 11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P

2 结果

2.1 骨髓细胞的收集

从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。

2.2 MACS分选造血干细胞

1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个造血干细胞。

2.3 流式细胞仪分析结果

免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)% ，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P

3 讨论

骨髓内主要有两类干细胞群体，即造血干细胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和间充质干细胞(MSCs)。HSCs是卵黄囊、胎肝和骨髓中比例极小的细胞群， 成年小鼠HSCs占整个骨髓细胞的0.01%～0.05% [4]，具有自我更新的能力， 能维持宿主终生造血功能和分化，生成血液中的各种成熟细胞[5]，获取高度均一的HSCs是开展细胞生物学特性等各项研究的基础。

CD117干细胞因子受体是具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，广泛分布于HSCs群中，60%～75%的CD34+造血干细胞同时表达CD117，其配体——干细胞因子(SCF，)在HSCs的生存和增埴、分化中起着重要作用。研究发现CD34+CD117+比CD34+CD117-细胞具有更高的集落形成能力，而 CD117可高频率表达于多能干细胞表面，对HSCs的分化具有重要作用，是小鼠HSCs的重要标志[6]。CD117也存在于肥大细胞和急性髓样白血病细胞表面[7]。

细胞分离或纯化的目的是收获高纯度保持原有活性的单一细胞群，并最大限度地减少靶细胞的丢失。免疫磁珠是一种包被有单克隆抗体的磁性微粒， 它可特异性地与靶物质(细胞、蛋白质、DNA 和细菌等) 结合， 使之具有磁顺应性， 继而在外加磁场的作用下被滞留， 从而与其他成分分离， 达到富集纯化的目的[8，9]。MACS 根据最终选留物质的不同可分为阳性选择(留取与磁珠结合的阳性物质) 和阴性选择(留取不与磁珠结合的阴性物质)。本实验采用免疫磁珠(MACS) 阳性选择法分选HSCs，从1只小鼠股骨、胫骨可收集（1.1±0.3）×105个HSCs，先进行系别细胞去除的阴性分选，去除成熟造血细胞（T细胞、B细胞、单核细胞或巨噬细胞、粒细胞、红系细胞及其定向前体细胞），细胞与一系列生物素化的抗系别抗原抗体和抗生物素磁珠共同孵育，磁性标记后去除系别细胞，这种标记过程保留了系别标志阴性的细胞，可根据CD117的表达对这些细胞做进一步的磁珠阳性分选。磁珠体积极小，不会对细胞造成机械性压力，孵育时间短，操作过程快，磁性抗体和磁性标记物间的反应可在几分钟内完成，从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。

根据HSCs表达或不表达某些细胞表面分子，采用相应的荧光素标记抗体进行免疫染色，根据阳性、阴性选择原理，应用流式细胞仪分选获得具有某些细胞表面特征的细胞。本实验采用流式细胞仪分析计数，免疫磁珠纯化前小鼠骨髓CD117阳性细胞为(41.56±18.77)%，经免疫磁珠纯化后CD117阳性细胞百分比为(88.68±4.74)%，表明MACS是一种安全、有效并实用的分选HSCs CD117的方法，省时、简便、纯度高。

参考文献

[1]姚恒美，陈浩明，黄璐，等.小鼠造血干细胞的分离、培养及重组慢病毒载体介导的离体hFⅨ基因表达[J].复旦学报(自然科学版)，2005（4）：503-506.

[2]Clotilde Castaldo， Franca Di Meglio， Daria Nurzynska，et al. CD117-positive cells in adult human heart are localized in the subepicardium， and their activation Is associated with laminin-1 and 6 Integrin expression[J]. Stem Cells，2008(26)：1723 - 1731.

[3]裴雪涛.干细胞生物学[M].北京:科学出版社，2003:27-29，107-114.

[4]Lemieux M E， Rebel V I， Landsdorp P， et al.Characterization and purification of a primitive hematopoietic cell type in adult mouse marrow capable of lymphomyeloid differentiation in long-term marrow switch culture[J].Blood，1995(86):1339-1347.

[5]Wagers AJ ， Christensen JL ，Weissman IL.Cell fate determ inaton from stem cells[J].Gene Therapy，2002（9）:606-612.

[6]姜亚卓，田普训，丁小明，等.小鼠骨髓CD117+造血干细胞定向分化为未成熟树突状细胞及其鉴定[J].南方医科大学学报，2007（27）：450-453.

[7]董兴高.造血干细胞的研究进展[J].湖北民族学院学报（医学版），2005(22)：47-49.

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关键词 石英毛细管； 甲胎蛋白； 免疫分析； 灰度分析

1 引 言

随着我国医疗卫生事业的快速发展和人们对健康保健的日益重视， 社会对实用性的检测技术需求越来越多， 体外诊断的新方法、新技术已成为生物分析检测的热点和重点研发方向。目前， 低成本、操作简便、小型化的体外诊断方法和装备的研究正受到科研机构和医疗检测市场的广泛关注。

现有的体外诊断产品中， 免疫检测类产品占比很大， 主要采用酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光法、放射免疫法以及胶体金免疫层析法[1～3]。前两者以微孔板为检测载体， 技术较成熟， 但检测时间较长， 一般需要2～3 h； 电化学发光法主要基于磁珠捕获抗原进行检测， 检测速度快， 一般可在30 min内完成， 但检测成本较高， 约为酶联免疫吸附法的3～4倍； 放射性免疫检测灵敏度高， 但对操作环境及操作人员要求很高； 胶体金免疫层析检测速度快， 可实现现场检测， 但难以实现定量分析。近年来， 一些学者报道了基于纳米材料及微流控技术的新型体外免疫诊断方法， 但纳米材料的制备较难控制其稳定性， 真正实现临床应用的并不多见[4，5]。本课题组多年从事毛细管电泳生物医药分析研究， 所用的分离载体是熔融石英毛细管， 其性质稳定， 透光性好， 表面易进行物理、化学修饰， 加工工艺成熟， 成本低廉[6～10]。本实验将熔融石英毛细管用于免疫检测的载体材料， 研究基于灰度值分析的血清中甲胎蛋白的免疫检测方法， 目的是实现基于石英毛细管材料和灰度分析的定量免疫检测。传统的化学发光免疫分析检测器大多采用光电倍增管， 检测区域有限， 分析速度慢， 而以电感耦合器件（CCD）为代表的图像传感器则可以提供更加广泛的检测区域， 具有光电转换效率高、动态线性范围宽、多通道同时分析等优点， 成为未来生物传感器的一个发展方向[11，12]。实验中使用的便携式化学发光成像仪采用制冷CCD， 灵敏度高， 体积小， 仅有0.006 m3， 能够高效捕获化学发光信号， 形成图片。灰度是指黑白图像中点的颜色深度， 灰度分析法具有结果直观， 分析快速等优点， 在生物学、医学、图像识别领域有广泛的用途[13]， 很多体外诊断试剂的检测应用也采用灰度值分析方法[14]。

本研究以熔融石英毛细管为载体， 建立了基于灰度分析的免疫检测方法。以肿瘤标志物甲胎蛋白（AFP）为模型蛋白， 通过双抗体夹心方式进行检测， 与抗体偶联的辣根过氧化物酶（HRP）催化化学发光底物液发光， 产生的光信号通过成像仪转化为图片[12，15，16]， 进行灰度值分析。研究结果表明， 毛细管免疫检测和灰度分析结合， 实际使用的样本量仅为0.8 μL， 而ELISA检测一般需要50 μL， 因此本方法大幅降低了样本使用量。检测过程中仅需石英毛细管、医用注射器等常用耗材， 操作简单， 不依赖大型仪器。所建方法具有普适性， 可用于基于化学发光免疫分析的生物标志物的快速检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂：

便携式化学发光成像仪（国家纳米科学中心研制）； 熔融石英毛细管（北京华阳利民仪器有限公司）； 医用注射器（北京科龙生物医学技术有限公司）； 表面活化剂（美国Anteo Technologies公司）； 磷酸盐缓冲液（PBS）和小牛血清白蛋白（BSA）（德国Merck公司）； AFP捕获抗体、AFP的HRP酶标抗体及AFP标准液（北京科跃中楷生物技术有限公司）； 癌胚抗原（CEA）标准液、前列腺特异性抗原（PSA）标准液、糖类抗原125（CA125）标准液及糖类抗原199（CA199）标准液（北京沫之东生物技术有限公司）； 化学发光底物液（美国Millipore公司）； 实验用水由Millipore纯水仪制备。

2.2 分析方法

2.2.1 实验操作步骤 实验步骤如图1所示：（1）活化毛细管 将毛细管裁剪为10 cm长， 使用医用注射器将表面活化剂注入毛细管， 室温静置30 min， 对毛细管内壁进行活化后， 用水冲洗。（2）固定捕获抗体及封闭 将AFP的捕获抗体按照一定比例用PBS稀释， 将稀释液注入毛细管内部， 室温静置1 h后再用PBS清洗， 将含5% BSA的PBS溶液注入毛细管中， 室温静置30 min进行封闭。（3）注入待测蛋白 将待测蛋白AFP溶液注入到毛细管， 室温孵育30 min后用PBS清洗。（4）注入酶标抗体及化学发光底物液 将稀释为一定浓度的HRP酶标抗体注入毛细管， 室温孵育30 min， PBS冲洗后注入化学发光底物液。

2.2.2 成像分析 将化学发光信号转化为图片形式， 进行成像灰度分析。毛细管置于成像仪中， 选择一定的曝光时间， 检测化学发光信号。毛细管中的化学发光底物在酶标抗体上HRP酶的催化作用下产生的光信号转化为图片。图片上的灰度值表示待测蛋白AFP抗原的浓度。通过ImageJ软件分析图片， Origin 8.0软件处理数据。

3 结果与讨论

3.1 毛细管内径对检测的影响

市售毛细管有多种内径， 考察了不同内径毛细管对检测的影响。毛细管内径不同， 可提供抗体结合的位点面积不同。内径较小的毛细管， 可节省样品， 但内壁表面积较小， 可吸附的捕获抗体的量较小， 因而后续可结合的抗原以及酶标抗体也较少， 故化学发光信号较弱， 灰度低， 不利于灵敏检测。较大内径的毛细管所提供的内壁表面积大， 可吸附的捕获抗体量增加， 可结合的抗原及酶标抗体也增加， 化学发光信号增强。考察了50， 75， 100， 150和200 μm内径的毛细管， 分别检测相同浓度的AFP， 比较其灰度强度。结果表明， 灰度强度所指示的化学发光信号与AFP浓度呈正相关（图2和图3）。灰度照片和灰度强度均显示毛细管内径对AFP检测有明显影响。使用50 μm毛细管， 灰度强度较弱； 内径增加到75 μm， 灰度强度增大； 使用100 μm内径毛细管， 灰度较强且均匀； 当内径大于100 μm时， 信号强度降低， 且在横截面方向上信号分布不均。理论上， 大内径的毛细管可提供的内壁表面积大， 可吸附的捕获抗体量多， 可结合的抗原及酶标抗体也多， 可使信号线性增强， 直至趋于饱和。然而由图2可见， 150 μm内径时信号不均。 可能是由于与拍摄方向相切的内壁上下沿区域光程较长， 出现内壁上下沿信号较强， 中部信号偏弱的现象。灰度信号不均匀不利于准确分析， 且增加了各种试剂和样品用量。因此， 实验选择内径100 μm的毛细管。

3.2 免疫分析的条件优化

3.2.1 捕获抗体浓度 捕获抗体在毛细管内的固定效果很大程度上决定了检测的灵敏度。通常捕获抗体在毛细管内壁的密度越高， 检测灵敏度越高， 但过高浓度的捕获抗体， 会造成过饱和， 浪费抗体试剂。本实验中， 固定AFP浓度和酶标抗体浓度， 对捕获抗体浓度进行优化， 将所购的捕获抗体稀释， 稀释倍数为25， 50， 100， 150， 200， 250和300倍， 比较检测的灰度值。当捕获抗体的稀释倍数为150， 200， 250和300倍时， 随稀释倍数增大， 溶液浓度降低， 灰度值即化学发光信号逐渐减小， 说明溶液中的捕获抗体浓度偏低， 固定到毛细管内壁的捕获抗体量较少， 不能充分结合抗原， 故化学发光值随稀释倍数增大而降低， 灰度值减小； 当稀释倍数为50和25倍时， 捕获抗体的浓度因稀释比例小而保持较高的水平， 但其化学发光信号却与捕获抗体稀释100倍时相当， 并未增强， 说明当捕获抗体稀释倍数为100时， 灰度值即化学发光信号趋于饱和， 增加浓度不再使抗体在毛细管内壁的分布密度增加， 且当稀释倍数为100时， 结合到毛细管内壁上的捕获抗体能够完全结合抗原。因此， 选择稀释100倍为捕获抗体最佳的稀释比例（图4）。

3.2.2 酶标抗体溶度

酶标抗体的浓度也直接影响检测结果。如果酶标抗体浓度偏低， 不能与抗原充分结合， 就会造成实际检测信号值偏低。如果酶标抗体浓度偏高， 虽然反应充分， 但是可能浪费试剂。实验中， 固定捕获抗体稀释倍数和AFP抗原浓度， 对检测抗体浓度进行优化。将所购的酶标抗体稀释， 稀释倍数为100， 150， 200， 250， 300和350倍， 比较不同稀释浓度的灰度值。结果表明， 酶标抗体稀释倍数为250， 300， 350倍时， 随稀释比例增大， 酶标抗体浓度降低， 灰度值即化学发光信号逐渐减小， 说明酶标抗体浓度偏低， 反应不充分； 稀释倍数为150和100倍时， 酶标抗体浓度随稀释比例减小而增大， 但灰度值与稀释倍数200时相比未见增加。说明稀释倍数为200时， 灰度值趋于饱和， 抗原抗体结合较为充分。因此， 酶标抗体最佳的稀释倍数为200倍。

3.2.3 孵育时间

孵育时间是免疫检测的重要参数。如孵育时间过短， 反应进行不充分， 影响检测的灵敏度。若孵育时间过长， 则耗时过长。本实验对孵育时间进行优化。室温下， 将AFP抗原及AFP酶标抗体的孵育时间分别设定为5， 15， 30， 60和90 min， 比较灰度值变化。结果表明， 孵育15 min 的灰度值即化学发光信号比孵育5 min时明显升高， 说明5和15 min的孵育时间偏短， 反应尚不充分； 孵育时间设为30， 60和90 min时， 灰度值没有增加。说明孵育时间为30 min时， 灰度值趋于饱和， 免疫反应较为充分。因此， 选择最佳孵育时间30 min（图5）。

3.2.4 曝光时间优化 曝光时间是化学发光免疫检测的重要参数。曝光时间过长， 会造成高浓度AFP检测信号过饱和； 曝光时间过短， 会造成低浓度AFP检测信号微弱， 都不利于图像分析， 因此有必要对曝光时间进行优化。固定捕获抗体及酶标抗体浓度， 对高浓度（100 ng/mL）和低浓度（3 ng/mL）的AFP分别进行检测， 曝光时间为5， 10， 15， 20 和25 s， 选择同时满足高浓度和低浓度AFP抗原检测的合适曝光时间。当曝光时间为15 s时， 3 ng/mL AFP抗原灰度值较弱， 无法进行图像分析， 增加曝光时间， 灰度值增加。当曝光时间为25 s时， 100 ng/mL AFP抗原灰度值出现过饱和， 不利于分析。因此， 20 s为最佳曝光时间， 能够满足检测需求。

3.3 灰度分析的标准曲线

选择3.1～50 ng/mL浓度范围的AFP样品溶液， 测定其灰度值。 灰度值Y与AFP浓度X的关系为：

Y=

42.9328+53.8242log（X1.5625 ng/mL）2

式中， X的单位为ng/mL。Y与X二者呈现较好的线性关系（图6）， R=0.992。稀释AFP样品， 通过灰度分析， 测定方法的检出限为2.7 ng/mL。

在目前的临床检验中， 只有当AFP浓度超过20 ng/mL时， 该结果才具有一定的临床诊断意义[17，18]。本方法对AFP的检测范围在3.1～50 ng/mL之间， 为进一步临床应用奠定了基础。

3.4 检测特异性

特异性是评价免疫检测的重要指标之一， 通常用交叉反应率表示。实验中， 分别在血清加入中可能存在的干扰物CEA、 PSA、 CA125和CA199， 在最佳条件下测定。结果表明， 交叉反应率均小于0.5%， 说明上述潜在的干扰组分对检测结果影响小， 方法的检测特异性好[19]， 抗干扰能力强。

3.5 检测准确性

评估体外诊断试剂准确性的方法主要有方法学比对和回收实验两种。方法学比对是将两种不同的检测体系所得结果进行比较， 在临床化学文献报道中较为常见[20～22]。将本方法与目前大型医院广泛使用的Roche电化学发光方法进行方法学比对。实际临床样本来源于总医院， 使用采血管收集人全血， 在室温中沉降30 min后， 3000 r/min离心5 min， 收集上层血清， 4℃储存备用。获取的20例血清样本分别采用两种方法进行分析检测， 结果见图7。两种方法的线性回归方程为y=0.148+11095x， R=0.980， 说明两种方法的相关性良好， 本方法具有较高准确性， 能够满足临床检测要求。通过回收实验评价本方法的准确性。选用3份人血清， 在最佳实验条件下测定其AFP浓度， 然后分别向血清中加入AFP标准液， 再次测定其AFP浓度。重复5次， 计算得回收率在96.0%～106.7%之间（表1）， 说明本检测方法的准确性较好[20]。

4 结 论

以熔融石英毛细管为免疫分析载体材料， 通过化学发光成像和灰度分析， 建立了血清甲胎蛋白的定量免疫分析检测方法。本方法可在3.1～50 ng/mL 浓度范围实现甲胎蛋白检测， 覆盖了临床应用的关键浓度， 为本方法的进一步临床应用奠定了基础。基于毛细管为载体的灰度分析免疫检测方法的样本消耗少、载体材料简单、检测成本低廉， 且不依赖大型仪器， 适用化学发光免疫分析， 具有普适性和较好的临床检验应用前景。

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篇7

【关键词】血管紧张素Ⅰ 固相抗体法 放射免疫分析

1引言

采用固相抗体包被聚苯乙烯试管，并对抗体包被条件进行了研究，建立了血管紧张素Ⅰ放射免疫分析法。结果表明在2―8℃下过夜包被，抗体滴度在1：9万 时，制备的包被管用于血管紧张素Ⅰ放射免疫分析，结合达到最大；不同滴度下包被，包被温度和时间对制备的包被管的影响不同；不同的反应时间以及125I―AI和标准品加样量的不同也会对包被管的结合产生影响。血管紧张素Ⅰ包被管法放射免疫分析灵敏度为（42.2Pg/ml）；回收率为（90.3%―102.2%）；批内、批间变异系数分别为（5.1%―9.0%）和（8.3%―10.2%）。

2实验材料

血管紧张素Ⅰ多克隆抗体由原子高科医学二部提供；聚苯乙烯六角试管（mm×mm）为（哪个）塑料厂产品；125I―AI及AI药盒标准品由原子高科医学二部提供；蛋白G填料亲合层析柱由美国进口；牛血清白蛋白（BSA）为上海生物制品厂产品。对照药盒由原子高科股份有限公司生产（国药准字：）。其他试剂均为分析纯。

3实验方法

3.1兔IgG的纯化

采用蛋白―G柱进行亲合层析纯化，纯化后IgG浓度由紫外分光光度法测定。

用包被缓冲液（0.1M PH9.5碳酸缓冲液）将兔IgG配制10μg /ml。混合均匀后250？L /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第一层包被液，各管用500？L洗涤液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第二层（兔二抗）用。

3.2用驴抗兔二抗进行第二层包被

用0.05 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液（含1%BSA）将兔二抗配成合适的浓度后250？L /管包被，然后放2―8℃过夜，弃去包被管中第二层包被液，各管用500？L洗涤液（0.02 mol/L，pH7.4磷酸缓冲液）清洗1次。待包被第三层（兔一抗）用。

3.3不同滴度兔抗（一抗）包被实验

将兔抗用封闭液配制成1：2万，1：4万，1：6万，1：8万，1：9万，1：12万，1：14万，1：16万不同的滴度，分别加250？L于已经包有兔二抗的包被管中，每个滴度做双复管，之后在每管中加入100？L 125I―AI，然后放2―8℃静置过夜；弃去管中溶液，各管用500？L洗涤液清洗3次后测量各管放射性计数，计算其结合率，选择合适的抗体滴度作为工作稀释度。

3.4温度，时间对抗体包被的影响

用封闭液将兔抗（一抗）稀释成不同滴度（1：2万，1：4万， 1：8万，1：9万，1：12万，1：14万），分别在不同温度和时间下包被，实验中抗体加入体积均为250？L，各管均加入100？L 125I―AI，将不同条件下制备的包被管进行放射免疫结合分析，并对结果进行比较。

3.5抗体包被管的制备

每管加250？L兔IgG溶液（10μg /ml），2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次后加入250？L驴抗兔二抗溶液，2―8℃静置过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次后加入250？L兔一抗溶液（1：9万），2―8℃过夜，弃溶液，各管加500？L洗涤液清洗1次，弃溶液，自然晾干，密闭，于2―8℃下保存。

3.6体系反应时间，温度的选择

设计不同的反应条件为37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。

3.7加样量的选择

设计4组不同的加样量为：第一组125I―AI加100？L，标准品加100？L；第二组：125I―AI加100？L，标准品加50？L；第三组125I―AI加50？L，标准品加100？L；第四组125I―AI加50？L，标准品加50？L。

3.8放射免疫分析程序

标准品（或样品、质控血清）100？L和标记物100？L加于包被管中，混匀，然后放2―8℃静置过夜（15―24h），弃溶液，加500？L洗涤液清洗2―3次，测各管放射性计数。

3.9方法学考核

灵敏度：以20个零标准管的计数平均值―2S对应的剂量值表示。准确度：任取一份血浆标本，测定基值后分别加入0pg/ml ，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的标准品，再次测定，计算回收率。精密度：测定批内和批间变异系数（CV%）。健全性：将一份高浓度样品稀释成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分别测定其含量。经回归处理后成一条直线，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。

4结果与讨论

4.1不同滴度的兔抗（一抗）包被实验

不同滴度抗体包被实验结果列于表1，表1结果表明，当抗体滴度为1：16万―1：8万时，随着抗体滴度的减小，包被管的结合率逐步升高；当抗体滴度为1：8万―1：2万时，包被管的结合率没有出现明显升高，基本保持同一水平。所以在不影响放免药盒灵敏度的前提下，选择1：9万作为抗体的工作稀释度，用于包被。（该处可以作图，不列表）

4.2包被时间，包被温度对包被的影响

结果列于表2由表2可知，包被温度和包被时间对包被管免疫结合的影响依赖于包被时加入抗体的浓度。当加入抗体的滴度为1：2万和1：4万时，升高包被温度使包被管的免疫结合增加，而延长包被时间对包被管的免疫结合无显著影响；当加入抗体滴度为1：14万

和1：16万时，升高包被温度包被管的免疫结合显著减少，原因可能是抗体在低浓度时较不稳定，包被过程中较高的温度使抗体的活性损失；当加入抗体滴度为1：8万和1：9万时，包被温度对包被管的免疫结合影响减少，且包被时间从3h延长到24h，包被管的免疫结合有所增加。此结果提示，在较高温度下，采用较大抗体浓度，只需要较短的包被时间，即可获得具有较高免疫结合的抗体包被管。但考虑到实际生产中低成本和包被工艺简便性的需要，在满足免疫分析要求的前提下，选择抗体滴度为1：9万，2―8℃过夜（15―24h）作为包被条件。

4.3体系反应时间、反应温度的选择

结果列于表3，由表3可知，当反应温度在37℃时，延长反应时间从1 h到3 h，免疫分析的最大结合S0%从46.4%增加到59.2%，但是标准曲线的最高浓度点的抑制不好，分别为37℃1 h为16.1%；37℃3 h为14.6%，这可能是反应不充分造成的。而反应温度在2―8℃时，延长反应时间从15―24h，免疫反应的几个指标都比较好，同时也克服了37℃反应曲线抑制不好的问题，所以在考虑实际操作简便，节省时间的需要，在满足免疫分析要求的前提下，选择反应条件为2―8℃过夜。

4.4加样量对免疫分析的影响

结果列于表4由表4可知，当加入标记物的量都是50？L时，加入100？L标准品的包被管的免疫分析主要指标最大结合S0%，曲线的抑制都好于加入50？L标准品的包被管免疫分析主要指标，加50？L标准品的包被管的曲线抑制不好，标准曲线最低浓度点的B/B0%为94.1%，最高浓度点的B/B0%为14.6%。但是考虑到加50？L标记物的各管计数都比较低，还有计数器的效率等问题，所以标记物的加样量就不采用50？L加样。当加入标记物的量都是100？L时，加入100？L标准品的包被管的免疫分析主要指标最大结合S0%，曲线的抑制都很好，并且各管的放射性计数也比较高，各种因素对测量的影响也相对较小。当加入50？L标准品时，标准曲线出现倒勾现象，曲线的最低浓度点B/B0%为101%，出现这种情况就是因为标准曲线的各包被管中加入 的非标记抗原的量不够造成的。所以通过对数据的比较，选择比较合适的加样量为标记物加100？L，标准品加100？L。

4.6方法学鉴定

（1）灵敏度。以20个零标准管计数的平均值-2S对应的剂量值表示，灵敏度为（42.2Pg /ml）pg/ml。

（2）准确度 已知量的一份血浆样品中分别加入4种不同剂量的标准品进行测定，结果列于表5。由表5可知本法回收率为90.3%―102.2%，说明本法准确性较好。

（3）精密度

采用本方法对3份含有不同浓度的人血浆样品重复测定，计算批内、批间变异系数，结果列于表6。由表6可知，批内变异系数为（5.1%―9.0%）；批间变异系数为（8.3%―9.5%）。

（4）健全性（同质性）。将一份较高浓度的血浆样品倍比稀释成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，测定结果列于表7。由表中数据计算其相关方程为：y=1.000 x +0.4673，r=1.000

实验结果表明研制的血管紧张素Ⅰ放射免疫分析法（固相抗体法）的健全性良好。

5结语

（1）采用 固相抗体 包被聚苯乙烯试管的包被条件为：选择抗体滴度为1：9万，2―8℃过夜（15―24h）。在此条件下所得包被管用于血管紧张素Ⅰ放射免疫分析，可达到最大结合。

（2）用该包被管进行血管紧张素Ⅰ放射免疫分析时，其灵敏度为（42.2Pg /ml）；回收率为（90.3%―102.2%）；批内、批间变异系数分别为（5.1%―90%）和（8.3%―10.2%）。

参考文献：

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[3]吕珏.ACI患者血浆ET-1和t-PA、PAI-1水平的相关性分析[J]. 放射免疫学杂志，2010（6）.

篇8

[关键词]　共词分析　专利引文分析　知识关联

[分类号]　G255.53

1　科学―技术知识关联的概念

“科学―技术知识关联”是近年来专利计量学领域的重要研究内容之一，在Scientometrics、World PatentInformation等权威期刊的相关文献中通常被表述为Science Technology Linkage、Science Technology Interac-tion、Science Dependence of Technology。研究科学一技术知识关联的意义在于：通过揭示哪些基础研究学科与哪些技术发明领域之间存在知识关联，预见二者间可能的推动或启示作用，从而为国家创新体系的管理者提供科技资源配置方面的决策参考，以便目标明确地扶持更具产出能力的基础学科，发掘已具备基础储备的未来技术创新领域。

2　揭示科学一技术知识关联的各种途径和方法

目前，揭示科学一技术知识关联的途径多种多样，不同学科都在为此作出各自的贡献。

在科学社会学和技术社会学视野下，研究公共基础研究机构(公共科研院所、研究型大学、国家重点实验室)与企业的合作研发活动，是揭示科学一技术知识关联的有效途径。技术社会学认为，公共基础研究是技术变迁过程的基本要素，它通过提高社会整体创新水平间接推动企业的开发活动。科学社会学的双螺旋理论(Double Helix Model)认为，科学与技术是一对舞者(a pair of dancer)的关系，二者在相互推动下呈螺旋状上升发展。基础研究与技术开发之间的知识交互过程和合作活动是实现技术突破的能量储备过程，是实现技术跃迁的重要前提。文献[1―3]通过统计大学及公共基础研究机构与企业的合作研发活动，揭示了激光、分子生物学等领域的科学一技术知识关联、知识扩散和成果应用情况。

在技术经济学视野下，挖掘基础科研机构和技术开发机构(各类企业)在地理空间分布上所表现出的关联规则，是揭示科学一技术知识关联的又一途径。技术经济学认为，区域经济管理者在制定科技政策时，通常会从有利于本地经济和技术发展的角度出发，利用基础科研对本地技术创新的影响，在同一地域范围内统筹规划创新型企业和基础科研机构，从而构建起两者间知识关联和转移的通道。基于上述技术经济基础，基础科研机构和企业的地理邻近性与两者间的知识关联和转移强度之间通常会表现出明显的相关性。文献[4―6]分别通过研究美国、法国、东欧范围内基础科研机构和创新型企业的地理空间凝聚现象，揭示了对应的科学一技术知识关联和知识转移强度。

在科学计量学和文献计量学视野下，解析科研期刊论文与技术专利文献间的关联关系，也是揭示科学一技术知识关联的另一途径。科学计量学家Verbeek认为，企业创新人员对科研文献的理解、认同和利用是引发科学一技术知识关联和最终造就技术转化的关键环节。Garfield指出，发明不可能来源于魔术或真空，它是发明人对若干已有的概念进行重新组合的知识成果。Narin等认为，几乎所有的科技成果都是在前人工作的基础上发展起来的，知识的关联性在专利引文中有着明显的体现。科研期刊论文与技术专利文献之间的共词关系和引用关系是新知识向技术部门转移的显性表现。

3　利用共词分析法揭示科学一技术知识关联的局限

共词分析法以某一(或一系列)主题检索词(科学概念或技术术语)为“关联点”，分析该词在科研论文和专利说明书中的“共现”情况，从而推理和判断基础科学学科与技术创新领域之间关联关系的方法。共词分析法直观、有效，但同时也存在着明显的问题和局限。

3.1　科学概念与技术术语之间存在部分不对应问题

尽管INSPEC和INPADOCDB等词表能够提供某一科学概念和技术术语的多种词汇表达，但它们不能解决“部分科学概念与技术术语不对应”的基本矛盾。例如：专利说明书中的技术术语thin film(纳米绝缘薄膜)及其同义术语ion sol-gel(离子溶胶凝胶)、polyerys-talline film(硅多晶薄膜)等在科研论文中并没有绝对对应的概念，通常只能被近似地映射为chemical vapordeposition(化学气相沉积)、carbon nanotubes(纳米碳管)、amorphous nitride(无定形氮化膜)等词汇形式。

3.2　同一概念术语在科研论文和技术专利中的表达方式各不相同

科研论文中的化合物名称在专利说明书中往往以分子式、化学键结构式或马库什结构式(Mm-kush strue-ture)表示，例如，pantoprazole作为一种常用的抗溃疡药物的化学名称常出现在科研论文中，但在专利说明书中这一词汇很少出现，取而代之的是其马库什结构式，如图1所示：

3.3　专利技术的核心特征词难以被确定

科研论文由作者给出关键词，指明论文的核心知识概念，但专利说明书中没有“关键词”，发明人没有归结出专利的核心技术特征。目前的共词分析主要依据“词频”和词出现在专利说明书中的“位置”来间接推断某术语是否表达了技术的核心特征。但核心特征词的“词频”的分布阈值和词出现在专利说明书中的什么“位置”能否代表技术的核心特征也还是一个争论性话题，如有人重视“标题”、“摘要”位置，也有人重视“权利要求条款”位置。

3.4　语种差异有时会引发技术术语缺失

例如，中国专利中的中医治疗方法专利和中药配方专利所涉及的人体穴位和草药名称等都没有对应的英语词汇。

目前，上述问题都还没有有效的解决方案，这就局限着共词分析法在揭示科学一技术知识关联方面的效度和信度。

4　利用专利引文揭示科学一技术知识关联的优势

本文所讨论的专利引文主要是指专利说明书所引证的相关科研期刊论文。Jaffe等将“专利引文分析法”(patent citation analysis)定义为：利用各种数学与统计学的方法，对专利引文进行分析并揭示其中存在的数量特征和内在规律的方法。1994年Narin首创了“专利计量学”(Patentbibliometric)并构建了专利计量指标(Science Linkage，sL)，用以度量技术发明与基础研究之间的关联强度。利用专利引文揭示科学一技术知识关联的方法，以专利引文为纽带，通过专利说明书对科研期刊论文的引证映射，揭示对应的基础研究学科与技术创新领域之间的知识关联，其基本原理如图2所示：

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关键词：食品 分析 检验 方法

食品是人类生存不可缺少的物质条件之一，是人类进行一切生命活动的能源。因此，食品品质的好坏直接关系着人们的身体健康。食品分析与检验就是研究和评定食品品质及其变化的一门专业性很强的实验科学。它依据物理、化学、生物化学的一些基本理论和国家食品安全标准。运用现代科学技术和分析手段，对各类食品（包括原料、辅助材料、半成品及成品）的主要成分及其含量和有关工艺参数进行检测，以保证生产出质量合格的产品。

1.感官检验法

感官检验作为食品检验的重要方法之一，具有简便易行、快速灵敏、不需要特殊器材等特点，特别适用于目前还不能用仪器定量评价的某些食品特性的检验，如水果滋味的检验、食品风味的检验以及烟、酒、茶的气味检验等。

依据所使用的感觉器官的不同，感官检验可分为视觉检验、嗅觉检验、味觉检验、触觉检验和听觉检验五种。

感官分析法存在一定缺陷，由于感官分析是以经过培训的评价员的感觉器官作为一种"仪器"来测定食品的质量特性或鉴别产品之间的差异的，因此，判断的准确性与检验者的感觉器官的敏锐程度和实践经验密切相关。同时检验者的主观因素（如健康状况、生活习惯、文化素养、情绪等），以及环境条件（如光线、声响等）都会对鉴定的结果产生一定的影响。另外，感官检验的结果大多数情况下只能用比较性的用词（优良、中、劣等）表示或用文字表述，很难给出食品品质优劣程度的确切数字。

感官检验是与仪器检验并行的重要的检测手段，其重要性不仅在于有些产品的特性目前还不能用仪器检验，只能靠感官，即使能够得到先进的测量仪器，感官检验的重要性也不随之降低，因为感官指标与理化指标是互相补充的，只有仪器分析与感官分析相结合才能得到产品的完整信息。因此，感官检验法是食品重要的分析手段之一。

2.物理分析法

通过对被测食品的某些物理性质（如温度、密度、折射率、旋光度、沸点、透明度等）的测定，可间接求出食品中某种成分的含量，进而判断被检食品的纯度和品质。

物理分析法简便、实用，在实际工作中应用广泛。如密度法可测定糖液的浓度、酒中酒精含量，检验牛奶是否掺水、脱脂等等；折光法可测定果汁、番茄制品、蜂蜜、糖浆等食品的固形物含量，牛乳中乳糖含量等；旋光法可测定饮料中蔗糖含量、谷类食品中淀粉含量等。

3.物理化学分析法

物理化学分析法是通过测量物质的光学性质、电化学性质等物理化学性质来求出被测组分含量的方法。它包括光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法和光电化学分析法等，食品分析与检验中常用的是前三种方法。光学分析法又分为紫外-可见分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分析法等，可用于分析食品中无机元素、碳水化合物、蛋白质、氨基酸、食品添加剂、维生素等成分。电化学分析法又分为电导分析法、电位分析（离子选择电极）法、极谱分析法等。电导分析法可测定糖品灰分和水的纯度等；电位分析法广泛应用于测定pH、无机元素、酸根、食品添加剂等；极谱分析法已应用于测定重金属、维生素、食品添加剂等，这些方法解决了一些食品的前处理和干扰问题。色谱法是近些年迅速发展起来的一种分析技术，极大地丰富了食品分析与检验的内容，解决了许多常规化学分析法不能解决的微量成分分析的难题，为食品分析与检验技术开辟了新途径。色谱法包含许多分支，食品分析与检验中常用的是薄层层析法、气相色谱法和高效液相色谱法，可用于测定有机酸、氨基酸、糖类、维生素、食品添加剂、农药残留量、黄曲霉毒素等。

人们常将物理分析法和物理化学分析法归结为仪器分析法，即指以物质的物理或物理化学性质为基础，利用光电仪器来测定物质含量的方法。仪器分析法具有灵敏、快速、操作简单、易于实现自动化等优点。随着科学技术的发展，仪器分析法已越来越广泛地应用于食品分析与检验中。

4.化学分析法

化学分析法包括定性分析和定量分析两部分。但对于食品分析与检验来说，由于大多数食品的来源及主要成分是已知的，一般不必作定性分析，仅在个别情况下才作定性分析。因^此，最经常的工作是定量分析。化学定量分析法包括重量法和容量法，食品中水分、灰分、脂肪、果胶、纤维等成分的测定，常规方法都是重量法。容量法又包括酸碱滴定法、氧化还原滴定法、配合滴定法和沉淀滴定法四种，其中前两种最常用，如酸度、蛋白质的测定用到酸碱滴定法，还原糖、维生素0的测定用到氧化还原滴定法。

化学分析法是食品分析与检验的基础。即使是现代的仪器分析，也都是用化学方法对样品进行预处理及制备，而且仪器分析的原理大多数也是建立在化学分析的基础上的。为检验仪器分析的准确度和精确度，还需用规定的或推荐的化学分析标准方法作对照，以确定两种方法分析结果的符合程度。因此，化学分析法是食品分析与检验最基本的、最重要的分析方法。食品中大多数成分的分析都可以靠化学分析法完成。

5.生物分析法

目前，应用于食品分析与检验中的生物分析法主要包括微生物分析法与PCR技术的应用等。

微生物分析法是基于某些微生物生长需要特定的物质来进行分析的，方法条件温和，克服了化学分析法和仪器分析法中某些被测成分易分解的弱点，此方法的选择性也高。此法广泛应用于维生素、抗生素残留量、激素等类物质的分析中。聚合酶链式反应是一种分子生物学技术，用于放大特定的DN段，然后采用电泳法或荧光探针检测食品中致病菌或用于转基因食品的检测。

6.生物化学分析法

酶分析法是目前应用得比较多的一种生物化学分析法。

酶分析法是利用酶的反应对物质进行定性、定量的方法。酶是生物催化剂，它具有高效和专一的催化特性，而且可在温和的条件下进行催化。酶作为分析试剂应用于食品分析与检验中，可从复杂的组分中检测某一成分而不受或很少受其他共存成分干扰，具有简便、快速、准确、灵敏等优点。目前已应用于食品中有机酸、糖类、淀粉、维生素等成分的测定。

此外，食品分析方法还包括综合了分子生物学、免疫学、微电子学、微机械学、化学、物理、计算机等多项技术的生物芯片技术等。

参考文献

[1]中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法理化部分（一）.北京：中国版社，2003

[2]中华人民共和国国家标准食品卫生检验方法理化部分（二）.北京：中国版社，2003

[3]高向阳.食品分析与检验.北京：中国计量出版社，2006

篇10

【摘要】 目的 探讨早发冠心病血瘀证、痰浊证面部光电血流容积特征及与一氧化氮(NO)、内皮素(ET)含量的关系。方法 早发冠心病血瘀证36例，痰浊证35例，健康对照组31例，采用GD-3型光电血流容积面诊仪检测光电血流容积参数，硝酸还原酶法测定NO，放射免疫分析法测定ET。结果 血瘀证患者Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb较正常组显著降低(P＜0.01)，痰浊证患者Hb、He、Hf及Hf/Hb较正常组显著降低(P＜0.01)，血瘀证患者与痰浊证患者比较，Hb、Hb/Tab显著降低(P＜0.01)。3组间Hb、ET、NO比较：血瘀证组Hb最小，痰浊证组次之，正常组最高；而ET含量各组间无统计学意义；NO含量血瘀证组低于正常组(P＜0.01)；随着光电血流容积主波幅的增高，ET均数值逐渐下降，NO均数值逐渐上升，低波幅组与高波幅组差异有统计学意义。ET与Hb成负相关，NO则呈正相关关系。结论 心脏功能减退与大动脉顺应性降低是本证基本病理改变之一。血流容积主波幅与NO、ET含量具备相关关系，从而准确反映血管的舒缩状态及体内生物活性物质的变化，三者可作为早发冠心病血瘀证、痰浊证辅助诊断指标之一。

【关键词】 早发冠心病；血瘀证；痰浊证；光电血流容积；一氧化氮；内皮素

Abstract：Objective To research photoelectric facial blood flow volume characteristic of premature coronary heart disease of heart blood stasis syndrome (HBSS) and phlegm syndrome (PS)， and its relation with NO and ET. Methods Patients of premature coronary heart disease of HBSS (36 cases) and PS (35 cases) were selected， with 31 health people as control. The parameter of photoelectric facial blood flow volume was detected with GD-3 photoelectric blood stream plethysm (PBSP) of the facial color-diagnosis. NO was determined by nitrate reductase method and ET was determined by RIA. Results Hb， He， Hf， Hb/Tab and Hf/Hb of HBSS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， He， Hf and Hf/Hb of PS decreased obviously compared with the control (P＜0.01). Hb， Hb/Tab of HBSS decreased obviously compared with PS (P＜0.01). Comparison of Hb， ET， NO among the three groups was as follows：Hb of HBSS was the lowest， followed by PS， the highest was the control. There was no significance in the content of ET among the three groups， the content of NO in HBSS was lower than the control (P＜0.01). With the main volume of PBSP flow increased， ET values gradually declined， NO values gradually rose， there was significantly different between low amplitude group and high amplitude group. ET and Hb correlated negatively， NO and Hb correlated positively. Conclusion It is one of the basic pathological changes of the syndrome that cardiac function and artery compliance reduced. There were correlationship between the main volume of PBSP and content of NO and ET， so the systolic and diastolic blood vessels in the body and the state of bio-active substances can be accurally responsed. All those can be used as the auxiliary diagnostic indexes of premature coronary heart disease HBSS and PS.

Key words：premature coronary heart disease；heart blood stasis syndrome；phlegm syndrome；photoelectric blood stream plethysm；nitrogen monoxide；endothelin

血管内皮细胞释放的主要内分泌因子内皮素(ET)与一氧化氮(NO)是一对具有拮抗效应的血管活性物质。ET是内源性收缩因子中研究最多、且是最强的血管收缩剂之一[1]，而NO作为内皮源性舒张因子[2]，具有极强的舒张血管的作用。在生理情况下，NO/ET水平保持动态平衡；病理情况下，其平衡遭到破坏，导致血管舒缩功能紊乱，血管内皮受损及通透性改变，血液流变学异常，引发痰浊闭塞、瘀阻血络，最终导致冠心病。因此，通过检测早发冠心病血瘀证与痰浊证的光电血流容积指标，探讨其与NO、ET含量的相关性及临床诊断价值，具有重要意义[3]。

1 资料与方法

1.1 观察对象

健康对照组31例，参照WHO确定健康的定义与10项标准[4]，平均年龄(55.07±7.19)岁；其中男11例，女20例，经病史调查、体格检查和必要的理化检查，皆证实为健康人。冠心病血瘀证36例，痰浊证35例，冠心病诊断参照1979年国际心脏病学会和WHO临床命名标准化联合专题报告[5]及第一届全国内科学术会议心血管病专业组(1980年12月，广州)关于冠心病命名及诊断标准的建议[6]；中医辨证分型标准参照2002年国家中医药管理局医政司胸痹急症组、中国中医药学会内科学会心病专业委员会《中医心病诊断疗效标准与用药规范》[7]。血瘀证患者平均年龄(56.32±7.35)岁，男20例，女16例；痰浊证患者平均年龄(57.24±7.46)岁，男21例，女14例。3组观察对象男性年龄均＜55岁，女性年龄均＜65岁。经病史调查、心电图、实验室相关检查、临床病症舌脉象，均确诊为早发冠心病血瘀证与痰浊证患者。组间性别、年龄比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 检测指标及方法

1.2.1 面部光电血流容积图检测

应用湖南中医药大学中医诊断研究所研制的GD-3型光电血流容积面诊仪，与Pclab生物机能信号采集系统匹配，Pclab系统采用动物心电(mV)、三通道(CH3、压缩比为20)、低通滤波(10 Hz)，记录面颊部光电血流容积图。被检者采取仰卧位，自然放松，用95%的酒精棉球在检测部位脱脂后，将光电换能器探头紧贴检测部位，中等压力，以不漏光为佳。按步骤在计算机Pclab软件中测量波形时间指标(Tag、Tab、Tae、Teg、Tw)、波幅指标(Hb、Hd、He、Hf)，再计算比值指标(Hb/Tab、Hd/Hb、He/Hb、Hf/Hb等)[8]。

1.2.2 血浆一氧化氮和内皮素测定

采用北京普尔伟业生物科技有限公司血浆ET放射免疫药盒(放射免疫分析法)测定ET，采用南京建成生物工程研究所NO试剂盒(硝酸还原酶法)测定NO。按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法

检测值用x±s表示，3组间两两比较用单因素方差分析，各因素之间关系用直线相关分析。所有资料用SPSS 14.0版统计软件在计算机上完成。

2 结果

2.1 3组间光电血流容积主波幅、内皮素、一氧化氮的比较

在不同的证型之间，光电血流容积主波幅(Hb)比较差异具有统计学意义，其中血瘀证组波幅最小，痰浊证组次之，正常组最高；而ET含量变化各组间无统计学意义，NO含量血瘀证组低于正常组，二者差异有统计学意义，血瘀证组与痰浊证组比较差异无统计学意义。见表1。表1 3组间ET、NO含量与光电血流容积Hb的比较(略)注：与血瘀证比较，*P＜0.01；与痰浊证比较，#P＜0.01；与正常组

比较，P＜0.01

2.2 不同光电血流容积主波幅组内皮素和一氧化氮含量的变化

在不考虑证的前提下，根据光电容积主波幅的高低将其分为6组(A、B、C、D、E、F组)，可以看出，随着光电血流容积主波幅的增高，ET均数值逐渐下降，NO均数值逐渐上升，低波幅组与高波幅组差异有统计学意义。NO的变化与ET相反，各组间差异有统计学意义。见表2。表2 不同光电血流容积主波幅组内ET和NO含量的变化(略)注：与A组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与B组比较，#P＜0.05；

与C组比较，P＜0.05；与D组比较，P＜0.05

2.3 面部光电血流容积波幅与比值指标的比较

血瘀证患者与正常组比较，Hb、He、Hf、Hb/Tab、Hf/Hb均有显著降低(P＜0.01)；痰浊证患者与正常组比较，Hb、He、Hf及Hf/Hb均有显著降低(P＜0.01)；血瘀证患者与痰浊证患者比较，Hb、Hb/Tab有显著降低(P＜0.01)。见表3。表3 早发冠心病患者及健康人面部光电血流容积指标比较(略)注：与血瘀证比较，*P＜0.01；与正常组比较，#P＜0.01

3 讨论

NO和ET是由血管内皮细胞合成、释放的一对血管舒缩因子。ET是已知的最有力的内源性血管收缩因子，主要由血管内皮产生的一种作用强烈且持久的血管收缩肽，过量释放可引起冠状动脉痉挛，促进心肌收缩，加重心肌缺血和心肌再灌注损伤[9-12]。NO是血管内皮细胞分泌的作用极强的舒血管因子，是维持血管舒张的主要来源，具有舒张血管平滑肌的作用，并对抗内皮源性收缩因子。NO为ET的生理拮抗剂， 持续基础释放对维持心血管系统恒定的舒张、调节冠状动脉基本张力、保持心肌血流灌注有着重要作用[13]。正常情况下，机体中NO和ET都有少量分泌，以维持机体正常需要，二者含量相对稳定，达到一种平衡状态。但缺血后，由于血块对血管的刺激、血管内压增高及炎症反应，使内皮素mRNA表达增加，内皮素合成及释放增加，引起动脉的强烈收缩，进而使局部脑组织缺血缺氧，导致脑缺血，尤其是侧枝循环不良的组织；而由内皮素引发的白细胞粘附血管壁以及其激活的炎性因子均可加强脑血管痉挛、组织缺血，并且损伤组织细胞及内皮细胞，使得内皮源性NO合成减少或者拮抗了其舒张作用；另一方面，红细胞裂解释放出的氧合血红蛋白可使NO灭活，ET/NO之间的平衡被打破，从而破坏了正常的血管舒张功能。Sakowitz[12]认为，血管痉挛与可利用的NO减少以及继发的血管收缩因子和血管舒张因子失衡有关。

在本研究中，将血瘀证组、痰浊证组和正常组进行比较时，我们发现光电血流容积主波幅在这3组中差异有统计学意义，其中在血瘀证组波幅最低，痰浊证组次之，而正常组最高[14]。这与中医理论中有形之邪或有形的病理产物阻塞脉络，气血运行不畅而致痰阻血瘀，脉来不畅的理论相一致。同时，NO血瘀证组的含量明显低于正常组，而痰浊证组与血瘀证组及正常组无差异，ET各组间无差异，考虑为光电血流容积主波幅能够敏感、及时、直接地反映血流容积的变化，侧重于血管功能的反应，而作为血管扩张的物质基础的NO和ET则反应没有那么敏感。说明光电血流容积主波幅能够及时反映血流的变化，敏感于生物活性物质的释放，能为临床及科研提供及时的资料。

在按光电血流容积主波幅的高低对NO及ET进行观察，我们发现，随着光电血流容积主波幅的增加，NO值逐渐增加，与之呈正相关；而ET值逐渐下降，与光电血流容积主波幅呈负相关，并且在高波幅组和低波幅组差异有统计学意义。说明随着NO/ET值逐渐增大，血管舒张功能加强而处于扩张状态，血流容积增大，所以光电容积主波幅增高。可见，光电血流容积主波幅的变化与NO及ET的变化关联性很好，可以准确反映血管的扩张状态及血管扩张时体内生物活性物质的变化，为科研及临床提供可靠的证据。

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