动物行为学分析范文

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篇1

目的 探讨脑动静脉畸形出血误诊为脑外伤性血肿的原因。方法 回顾性分析6例患者的发病、临床表现、CT及手术治疗。结果 脑动静脉畸形出血与外伤性血肿有时相像，易引起误诊。结论 动静脉畸形出血可合并脑外伤，应注意鉴别。

【关键词】 动静脉畸形破裂；误诊；外伤性血肿

脑动静脉畸形（AVM）是脑血管发育障碍引起脑局部血管数量和结构异常并对正常脑血流量产生影响的先天性疾病［1］。是神经外科常见的血管性疾病，其发病率为0.04%～0.5%，占颅内占位性病变的5%～9％；发生颅内出血的概率为50%～68％［2］。临床表现以畸形血管破裂出血为最常见症状，急性发作时可突发意识丧失合并脑外伤，易误诊为脑外伤。2007年2月至2008年2月笔者在北京解放军总医院学习期间共收治6例，现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料

本组6例均为男性，年龄19～38岁，平均30.5岁。

1.2 临床表现

均有头部外伤昏迷史，均诉头痛，其中冲击伤4例，对冲伤2例，均经头颅CT检查，证实为脑内血肿，其中颞叶5例，枕叶1例，无颅骨骨折。均诊断为脑外伤性血肿。

1.3 治疗方法

全部行血肿清除，去骨瓣减压术。术中均见血管异常增多，为畸形血管团。麻醉诱导降低血压，沿病灶周围电凝表浅的供血动脉，然后游离病变的表浅部分，进而在病变尖端游离，最后分离与病变尖端相连的血管蒂.见到扩张的动脉可使用临时阻断夹，确认是否为主要供血动脉，还是过路动脉，并可以判断血流的方向。病变分离至最后再断引流静脉。术中快速病检报告为畸形血管，确诊为脑动静脉畸形。术中出血800～1200mL，输血600～1000mL。

1.4 结果

本组无死亡病例，术后全部行脑血管数字减影（DSA）检查，评估手术效果，5例未见异常，1例残留，为单支供血，单支引流，行30% NBCA栓塞治愈。术后无癫痫、偏瘫、失语、二便失禁现象。均治愈出院。

2 讨论

2.1 误诊原因

出血是动静脉畸形最常见的首发表现，在所有的AVM相关的出血中，60％为脑实质内的，30％为蛛网膜下腔，10％在脑室内［2］。分析本组误诊原因有以下3点：（1）病史缺失。本组3例无目击者，3例有目击者但无法判断昏迷与外伤的先后，既往无头痛、癫痫等有意义的临床症状，无家族史。提示对受伤机制不明确的脑内血肿要考虑AVM的可能。（2）对受伤作用力与受伤程度缺乏有效评估方法。本组均无颅骨骨折，病灶位于脑实质，脑表面无挫伤灶。（3）本病临床较少见，入院时患者已有明确手术指征，且病情紧急。未仔细阅读CT片，故造成误诊。

2.2 临床特点及诊断

颅内出血是造成动静脉畸形患者死亡的主要原因，其预后与出血部位及出血量密切相关。幕上脑出血量如达到正常脑容积的10％，将危及生命，而幕下血肿更为危险［3］。多突然发病，表现为剧烈头痛、恶心、呕吐、颈项强直、偏瘫及昏迷等高颅压综合征。由于AVM多为静脉型出血，出血量较动脉瘤破裂为少，病死率较低。血管造影仍是目前诊断AVM最可靠的方法。其典型影像表现为动脉期可见粗细不等，扭曲迂回的血管团，有时表现为网状或血窦状，供血动脉多增粗，引流静脉早期显影。由于盗血，病变以外的动脉显影不良，部分较小和（或）自身栓塞的AVM常不显影。脑血管造影可明确AVM部位，畸形血管团的供血动脉及引流静脉，对临床诊断和制定治疗方案有重要价值［4］。对于部分来不及行DSA检查的患者，CT扫描可以定位，明确脑内有无血肿。典型表现为血肿周围的蜿蜒状，弧形凹入或尖角形轻微高密度影等影像可大致判断血管团的位置。增强后病灶边界清晰，不规则，有混杂密度，附近可见粗大的引流静脉［1］。MRI检查可清楚显示畸形血管团，病灶呈低信号或无信号，表现为血管“流空现象”，可明确病灶与周围结构关系。在AVM显示上MRI要优于CT。CTA、MRA、DSA各有优势［5］。

2.3 手术体会与预后

显微手术切除是彻底治疗脑AVM的最好方法之一，目的在于阻断供血动脉，切除畸形血管团，解除盗血，预防出血。（1）术前要充分备血，本组术中出血较多，如单纯补充晶体液致血液稀释，可引发或加重出血。（2）常规准备血管临时阻断夹，以利有效止血。（3）术野出现非喷射性动脉样出血，应按AVM处理。（4）术中要先处理动脉，后处理静脉。切除部分或全部畸形血管团送病理证实。

在出血急性期因血肿的存在，创面不清晰，脑组织肿胀，畸形血管团不易辨认，分离血管团时止血困难，加上急诊手术，可能思想上准备不足。有学者建议二期处理血管团为妥［6］。

另外需要注意高血压脑出血与AVM的区别。对于下列情况可能有AVM存在：(1) 没有明确的高血压病史，尽管发病后血压较高；平时可能有或无头痛，或癫痫病史。（2）有颅内压增高症状甚至意识障碍，但症状发展较高血压脑出血缓慢。（3）年轻患者且出血部位为非典型的高血压脑出血部位。(4) CT显示血肿边界不规则或影像呈混杂密度，有钙化及血肿周围轻度水肿。

参考文献

［1］王忠诚.神经外科学［M］. 武汉：湖北科学技术出版社，1998:633－651.

［2］赵继宗，王硕，隋大立，等. 2086例脑动静脉畸形临床特征［J］. 中华神经外科杂志，2004，3:113-117.

［3］张岩，赵继宗，王硕，等. 脑动静脉畸形颅内出血的急诊手术治疗［J］. 北京医学，2005，27：471－473.

［4］白如林，黄承光，陈左权，等.NBCA血管内栓塞治疗颅内动静脉畸形 ［J］. 介入放射学杂志，2002，11(5): 324-326.

篇2

【摘要】 目的 观察三勒浆抗疲劳液对慢性疲劳大鼠模型的多因素影响作用，为深入探讨其药理学作用的机制奠定基础。方法 采用长时间反复强迫大鼠游泳及束缚四肢（限制大鼠的活动）法，造成慢性疲劳的大鼠模型，悬尾法及力竭游泳法考查模型动物行为学指标，并采用ELISA法测定其细胞因子IL-1b、IL-6及神经递质5-HT。结果 空白对照组动物一般情况、行为学观察及IL-1b、IL-6、5-HT等多项指标与模型组比较差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01），证明模型成立。而三勒浆抗疲劳液具有改善造模大鼠一般情况及行为学指标的作用。同时上调血清中IL-1b及脑组织中5-HT，与模型对照组比较，差异有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。结论 用强迫大鼠游泳（30min/d）及束缚四肢法（3h/d）造模，所形成的慢性疲劳大鼠模型更趋向于因心理应激所形成的机体症状性疲劳模型，三勒浆抗疲劳液对此种慢性疲劳大鼠模型的一般情况、行为学指标均有明显的改善作用，对IL-1b、5-HT的上调，可能为其药理学作用机理。

【关键词】 三勒浆抗疲劳液；慢性疲劳；大鼠模型；实验研究

Using chronic fatigue rat model to investigate the pharmacologic mechanism of Sanajon oral liquid

【Abstract】 Objective To observe the effect of chronic fatigue rat model which influenced by Sanajon oral liquid， to study the pharmacology mechanism. Methods Adopt force rat swim and bondage on four limbs repeatedly ， to cause rat chronic fatigue ; By hanging rat tail and swimming exhaust physical strength approach， to observe rat ethology changes; Utilizing ELISA method， examination cytokine IL-1b， IL-6 and 5-HT.Results Comparing control group with chronic fatigue model group， there have significance difference about rat general condition， ethology changes， IL-1b， IL-6 in serum and 5-HT in brain(P＜0.05 or P＜0.01). At the same time， all of above examination item can be improve by Sanajon oral liquid(P＜0.05 or P＜0.01).Conclusion This kind of chronic fatigue rat model have more psychological stress which induce to psychological fatigue， Sanajon oral liquid can improve model rat’s general condition， ethology changes， IL-1b， IL-6 in serum and 5-HT in brain.

【Key words】 anti-fatigue Sanajon oral liquid;chronic fatigue;rat model;experiment study

三勒浆抗疲劳液为国内抗疲劳产品中的知名品牌，在长期的临床运用中，显示出较好的疗效，为进一步探讨该产品抗慢性疲劳的作用机理，我们进行了动物实验的初步研究。

1 实验材料

1.1 动物 SD大鼠，体重160～180g，雌雄各半，共50只，合格证号：SCXK（川）2004-11，供应单位：成都中医药大学实验动物供应中心。

1.2 供试品 三勒浆抗疲劳液，0.5g生药/ml，30ml/支，红棕色液体，批号：Y20040702，人临床用量及给药途径：30ml/次，1天1次，口服。供应单位：成都三勒浆药业集团四川华美制药有限公司。

1.3 主要实验仪器及试剂

1.3.1 大鼠游泳池 长80cm，宽80cm，高80cm。

1.3.2 板式酶标仪 型号：ZS-2，北京市新风机电技术公司。

1.3.3 台式高速冷冻离心机 型号：TGL―16G，上海安亭科学仪器厂。

1.3.4 大鼠IL-1b ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals，Inc.大连泛邦公司提供。

1.3.5 大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals，Inc.大连泛邦公司提供。

1.3.6 大鼠5-HT ELISA检测试剂盒 批号：TCV5102-BS62031，规格：96T，BPB Biomedicals，Inc.大连泛邦公司提供。

2 实验方法

2.1 动物分组 经检疫合格后，将50只大鼠计算机完全随机分成5组，每组10只，分别为低、中、高三勒浆抗疲劳液组、模型对照组及空白对照组。分笼饲养，每笼动物5只。正式试验前，各组动物适应性饲养7天。

2.2 剂量设置及给药 按体表面积折算，大鼠用量为1.5g生药/kg；以此为低剂量，各组设置如下：低剂量组：1.5g生药/kg；中剂量组：3g生药/kg；高剂量组：6g生药/kg，空白对照组及模型对照组灌服等体积纯水。

2.3 慢性疲劳动物模型的建立 大鼠从第8天起，除空白对照组外，其他各组动物开始接受23天不同的应激性刺激，即单日冷水［(21±1)℃，水深50cm］游泳，每次30min；双日束缚应激［1］，用胶布束缚鼠四肢，每次3h，每天1次。造模同时，给药组动物灌胃对应剂量的供试品连续23天，每天1次，空白对照组灌胃相同体积的生理盐水。

2.4 观察指标

2.4.1 一般情况观察 造模期间，每天观察并记录鼠的饮水量、进食量、体重及鼠毛色泽等一般情况。

2.4.2 动物行为学观察

2.4.2.1 鼠尾悬挂实验 测定情绪反应及体力情况。距大鼠尾端1cm的部分穿过中央钻有直径1cm孔的有机玻璃板，板离地面1 m左右，使大鼠呈倒挂状。悬挂两侧用板隔开动物视线，大鼠为克服不正常的而挣扎活动，但活动一定时间后，出现间断性“不动”，显示“失望”状态。观察6min内的挣扎次数(大鼠由倒挂向上翻转的总次数)及不动时间(大鼠处于完全静止不动状态的总时间)。

2.4.2.2 力竭游泳实验 测定情绪反应及体力情况。游泳时水深为50cm、水温(28±1)℃。游泳前16h大鼠禁食不禁饮。灌胃给药30min后，将标记好的大鼠同时置入游泳池，记录大鼠从入水到游泳至力竭(头部沉入水中10秒中不能浮出水面为力竭标准)的时间。

2.4.3 对细胞因子白细胞介素-1b(IL-1b)、白细胞介素-6(IL-6)及神经递质五羟色胺（5-HT）的影响

2.4.3.1 血清标本的采集 采用腹主动脉采血法，收集大鼠血液4ml，静置2h，3000rpm离心，分离血清，取上清液为待检测样品。按照试剂盒要求检测样品IL-1b、IL-6和5-HT含量，于酶标仪450nm处测OD值，绘制标准曲线，并查出各样品中相应的含量。

2.4.3.2 对血浆、脑组织中5-HT活性的影响 检测标本的采集：各组动物取血后，断头处死，迅速取出下丘脑和垂体组织，电子天平称重后，以1：30（W/V）的比例加入BPS，立即贮存于-20℃冰箱保存，待测。检测时，将脑组织在冰浴条件下匀浆，低温离心机3500rpm离心10min，取上清液进行检测。

按照5-HT试剂盒要求检测，于酶标仪450nm处测OD值，绘制标准曲线，并查出各样品中相应的含量。

2.5 统计学方法 以统计软件SPSS11.0单因素方差分析进行统计学处理。

3 实验结果

3.1 一般情况研究结果 结果见表1～3。笼旁观察，模型组大鼠较其他组动物的活动量明显下降，对外界刺激反应不敏感，迟钝。从大鼠一般情况的数据分析来看，慢性疲劳造模组大鼠在饮水量、饮食量及体重等多方面均有较明显的下降的趋势，其中饮食及体重方面与空白对照组比较差异有显著性；三勒浆抗疲劳液给药组大鼠与模型对照组比较，总体情况有改善的趋势，其中饮水量与模型对照组比较差异有显著性，其他两项指标均值亦明显高于模型对照组，但与模型对照组及空白对照组比较差异无显著性，说明三勒浆抗疲劳液在改善慢性疲劳动物模型的一般情况方面具有一定的作用。

3.2 一般行为学研究

3.2.1 大鼠尾部悬挂试验 结果见表4。从数据分析可以看出慢性疲劳模型组大鼠挣扎次数与空白对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）；与低剂量给药组比较差异有显著性（P＜0.05）；各组与空白对照组比较均差异有非常显著性；从大鼠不动时间的分析数据中可以看出模型大鼠不动时间均值长于其他各组动物，与三勒浆中剂量组比较差异有显著性（P＜0.05），但与空白对照组比较差异无显著性。

3.2.2 大鼠力竭游泳试验 结果见表5。从试验结果分析，未经游泳造模训练的空白组大鼠力竭游泳时间明显短于其他各组（P＜0.01）。给药组大鼠力竭游泳时间均明显长于模型对照组，说明三勒浆抗疲劳液具有对抗慢性疲劳的作用。表1 大鼠各组饮水量变化结果注：Δ造模结束前1天死亡3只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01表2 大鼠各组饮食量变化结果注：Δ造模结束前1天死亡3只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05表3 大鼠各组体重变化结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01表4 大鼠尾部悬挂试验结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，**P＜0.01；与空白对照组比较，P＜0.01表5 大鼠力竭游泳试验结果注：Δ试验测试前死亡2只大鼠。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。中、高剂量组大鼠力竭游泳时间超过5400s(90min)后，未继续记录观察，故均值以大于表示。与模型对照组比较，*P＜0.05；表示与模型对照组比较，**P＜0.01；表示与空白对照组比较，P＜0.01

3.3 大鼠血清IL-1b检测 试验结果见表6。空白对照组及中剂量给药组与模型对照组比较差异有非常显著性（P＜0.01）；高剂量组与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。表6 大鼠血清IL-1b检测结果 注：Δ有1份样品出现溶血。采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，**P＜0.01

3.4 大鼠血清IL-6检测 结果见表7。经统计学分析，空白对照组与模型组比较差异有非常显著性（P＜0.01）。各剂量给药组大鼠血清中IL-6含量有上调的趋势，但与模型对照组比较无统计学意义（P＞0.05）。表7 大鼠血清IL-6检测结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，**P＜0.01

3.5 大鼠血清5-HT检测 结果见表8。经统计学分析，各组间比较无统计学意义（P＞0.05）。表8 大鼠血清5-HT检测结果注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析；各组间差异无显著性

3.6 大鼠下丘脑、垂体5-HT检测 结果见表9。空白对照组、低剂量组及中剂量组与模型组比较，差异有非常显著性（P＜0.01）；高剂量组与模型组比较差异有显著性（P＜0.05）。模型对照组大鼠下丘脑及垂体中5-HT含量明显低于其他各组动物。表9 大鼠垂体、下丘脑中5-HT检测结果 注：采用SPSS11.0 One-way ANOVA-LSD分析。与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01

4 讨论

中医学认为慢性疲劳是一种涉及多脏腑、多系统功能失调的疾病，与气机失调关系密切，其发病多与情志不遂、劳逸、外邪有关［2］。而西医学认为应激是导致或诱发慢性疲劳的重要因素。其中又以长期的慢性应激较急性应激更为多见。本试验造模原理符合中、西医学对慢性疲劳的认识。本次实验，采用大鼠慢性应激（反复应激性刺激维持3周）的方法［1］，拟制造慢性疲劳大鼠模型。通过对大鼠一般情况的观察，造模组与空白对照组之间存在明显的差异：模型动物活动量、饮水量、饮食量及体重明显低于空白对照组，说明慢性应激已影响大鼠的生理机能，符合慢性疲劳大鼠机体整体的变化规律，为慢性疲劳大鼠模型的形成奠定了客观的基础。而大鼠因体重、饮食量的下降也是间接导致动物的体力及抗疲劳能力下降的重要因素之一。三勒浆抗疲劳液给药组大鼠对以上各指标与模型对照组大鼠比较均有一定的改善趋势，提示三勒浆抗疲劳液能改善造模大鼠的机体状况，对抗因慢性应激而造成的机体一般情况的下降。

动物行为学研究中，鼠尾悬挂试验，模型组大鼠表现出明显的疲劳及抑郁状态，其挣扎次数明显低于空白对照组，不动时间也有明显延长的趋势。说明造模组大鼠已处于体力及精神的疲劳状态，对存在的刺激反应程度下降，进而产生一种抑郁状态。而灌胃三勒浆抗疲劳液的造模大鼠，上述各指标均有所改善，有明显对抗慢性疲劳及抑郁状态的作用。力竭游泳试验是考察动物体力一个经典试验，但试验本身受影响的因素较多，特别是动物自身状态直接影响试验结果。本研究过程中，发现所有造模动物在最初的游泳训练中，其游泳能力均相对较弱（多数动物游泳时间不超过20～30min），但经3周时间的训练后，游泳能力显著增强，这也导致未经训练的空白组大鼠在最终的力竭游泳时间的测定过程中，明显低于其他各组，而影响了试验的判断。这种现象可能与伴随大鼠对游泳环境的逐渐熟悉，对水温、训练规律的了解，以及抑郁情绪的强化，入水后大鼠的紧张惊恐情绪及游泳动作幅度（单位时间的体力消耗量）均明显的低于空白对照组，造成与空白对照组的不可比性。但在所有造模大鼠相同的试验条件下，造模组的游泳能力仍不及三勒浆抗疲劳液组（P＜0.05），提示大鼠各剂量组灌胃三勒浆抗疲劳液后，体力均能得到较好的恢复，进一步明确了其抗疲劳的作用。

在大鼠血清IL-1b、IL-6的测定结果中，本次实验条件下，研究结果与有关试验结论有一定的差异［3］，模型对照组血清中IL-1b、IL-6含量均低于空白对照组。张有志［4］在观察柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠多种免疫功能影响时，取脾脏进行淋巴细胞体外培养，以放射免疫法测定淋巴细胞的IL-1b和IL-6分泌水平， 结果IL-1b和IL-6分泌水平降低。孙开宏［5］在观察中小负荷运动对心理应激大鼠血清IL-1b含量的影响时，发现慢性心理应激后，大鼠血清中IL-1b水平显著低于对照组，而经不同强度的运动训练后，IL-1b水平显著升高。说明运动训练可以降低心理应激反应程度。

本次试验采用30min/天游泳和3h/天捆绑的间隔应激性刺激方法，其中游泳主要目的是造成大鼠的体力和精神疲劳，而捆绑主要是给予心理上的应激性疲劳。从本次试验研究似乎可以看出，该种造模方法对大鼠的心理应激反应的表现更为明显，这可能与大鼠在3周的时间内逐渐适应隔天1次的游泳（体力疲劳为主）训练有关。而经灌胃三勒浆抗疲劳液后，大鼠血清IL-1b水平明显升高（中、高剂量组与模型对照组比较差异有显著性）；IL-6血清水平亦有提升趋势。由此可见，促进IL-1b和IL-6在心理应激反应环境条件下的提升，可能成为三勒浆抗疲劳液对抗症状性脑疲劳的一个重要实验研究依据。

在对血清和脑组织5-HT含量测定分析中，发现血清5-HT含量各组间无明显的差异，说明该造模条件下，对血清5-HT的影响不敏感。而对下丘脑及垂体组织匀浆上清液中5-HT含量测定发现模型组5-HT明显低于其他各组。5-HT是调节机体精神活动的一种重要神经递质，该模型5-HT的下降似乎更符合经典的抑郁症发病的5-HT能与肾上腺素（NE）能神经低下学说［6］，与心理应激所造成的机体症状性疲劳相关。而三勒浆抗疲劳液对5-HT的上调作用，似乎再次证明其对症状性脑疲劳的药理学作用。

【参考文献】

1 刘雁峰，王天芳，杨维益，等．慢性疲劳的中医病理机制探讨及实验研究一复合应激因素致慢性疲劳动物模型的研制及其行为学观察．中国中医基础医学杂志，1998，4(增刊)：157.

2 李峰，杨维益，梁嵘，等．从中医学看肝脏调节应激反应的作用．北京中医药大学学报，1998，21(1)：20-22.

3 孟宏，姜亨圭，图娅，等. 电针“四关”穴对慢性应激致慢性疲劳大鼠细胞因子的影响. 中医药学刊，2003，21(9):1525-1527.

4 张有志，聂惠民，胡愉，等. 柴地合方对慢性应激抑郁模型大鼠免疫功能的影响. 中国中医基础医学杂志，2004，10(9)：43-46.

篇3

【关键词】（-）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；自然衰老大鼠；阿尔茨海默病（AD）；抗氧化

阿尔茨海默病（AD）是一个渐进性神经系统退行性疾病，已成为继心血管疾病、癌症、中风之后的第四大死亡原因。其最典型的病理性改变是的神经细胞间出现大量以β-淀粉样肽为核心的老年斑、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结及神经元丢失和胶质增生等。AD的发病机制目前尚未完全阐明，但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强，进一步引起神经细胞凋亡，是导致AD的功能退化和神经变性的基础。AD模型鼠脑中MDA水平较对照组显著升高，高水平的MDA表达经常与神经元纤维缠结及老年斑相伴随出现。并且临床研究表明，阿尔茨海默病患者血清中SOD和GSH-Px活性明显降低，而这两种酶是人体内在抗氧化方面有着重要作用。（-）表没食子儿茶素没食子酸酯是绿茶的一种主要多酚成分，许多研究已经揭示了EGCG的生物活性与其抗氧化特性紧密相关。为探讨观察绿茶提取物（-）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对自然衰老大鼠模型学习记忆障碍的改善作用，并初步探讨其作用机制，本实验选用22～24月龄SD大鼠，应用自然衰老大鼠筛选法制作AD模型，以EGCG灌胃给药进行治疗，利用行为学实验及化学比色法观察EGCG对衰老AD鼠的治疗作用，并进一步探讨其抗氧化的作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备

TU-1810紫外可见分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产品；Morris水迷宫装置购自北京硕林苑生物科技有限公司；生物研究显微镜购自日本尼康科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

EGCG，纯度>95%，购自Sigma公司；超敏SP浓缩（鼠/兔）试剂盒，产品编号KIT-0310，购自北京中杉金桥有限公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L），产品编号ZB-2301，购自北京中杉金桥有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）含量测定试剂盒均购自南京建成生物试剂有限公司。

1.1.3 实验动物模型的分组及给药

将造模成功的AD大鼠按各鼠平均逃避潜伏期的长短排序，根据随机数字表随机分为：模型组、EGCG治疗组，每组11只，共2组；将5～6个月青年大鼠根据随机数字表随机抽取11只，作为对照组。水迷宫测试结束后即开始对入组动物进行灌胃给药，EGCE治疗组按照2mg/Kg.d的剂量灌胃给予EGCG；模型组和对照组给予等量蒸馏水灌胃。各组每天给药1次，连续给药30天

1.2 行为学观察

水迷宫试验：

参照Morris方法进行。从灌胃第24天进行水迷宫实验，实验训练阶段连续进行2天，每天训练2次。第24天开始记录数据，标记为数据表中的第1天，共4天。

1.3 海马内SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的测定

行为学实验结束后，将各组大鼠每组取6只，断头处死，冰上快速取海马，入液氮及-80℃中冻存。检测时将海马加入预冷的生理盐水制成10%的脑匀浆，2000rpm/min离心10min，取上清。脑组织SOD、GSH-PX活性及MDA含量的测定，具体操作均按试剂盒说明进行。

1.4 统计学处理

应用spss16.0版本软件包统计软件，进行数据统计分析。数据以均值加减标准差（■±s）表示。组间比较采用方差分析采用ANOVA、Mauchy’s Test of Sphercity、LSD’s post hoc test进行统计学分析，以P

2 结果分析

在定位巡航试验中，模型组大鼠的寻找平台的潜伏期较对照组大鼠明显延长（P

3 讨论

理想的动物模型的建立是研究AD的基础。迄今为止，建立AD动物模型的方法很多，其中AD自然衰老模型鼠国外一些实验室广泛用于衰老和AD发病机制及药物开发的研究。AD是一种年龄相关疾病，衰老因素在AD发病过程中扮演着重要角色，衰老所特有的病理生理变化及其它病变的影响，是用年轻动物制作的动物模型所不能替代的，选择带有认知和记忆严重缺失的个体，其病理行为表现与老年人和AD患者的认知损害相类似，同时还可出现某些相应的脑组织病理改变。该模型的特点是自然衰老，其神经系统的损害亦属自然发生。由于AD的发病机制未明，目前所用的药物造模和基因敲除造模方法制造的AD模型不能完全代表AD疾病的所有特点，而自然衰老的大鼠是通过一定标准的筛选制造的模型，就如同自然发病的AD患者，能够较全面的代表AD疾病的特点。而且AD本身是一种老年疾病，目前药物造模或基因敲除的老鼠多为青壮年，在神经系统、行为认知方面也许可以模拟AD的特点，但是从总体研究的角度来说，不如自然衰老模型的大鼠更具有代表性。总之，AD衰老模型鼠模型成功的模拟了AD的行为学及病理学改变，可用于AD的药物治疗研究。

篇4

【关键词】神经病理性疼痛；坐骨神经慢性压迫模型；坐骨神经部分损伤模型

【中图分类号】R-332 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0022-01

神经病理性疼痛即通常所指的慢性持续性疼痛，其发病机制目前尚未完全清楚。选择一个较为理想的疼痛模型对该病的基础研究尤为重要，目前常用的周围神经损伤疼痛模型有坐骨神经慢性压迫模型（CCI）和坐骨神经部分损伤模型（PSI）。本实验旨在对两种模型的行为学变化和痛阈变化进行检测对比，为对神经病理性疼痛的研究中的模型选择做参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组与制作

30只SD大鼠（漯河医学高等专科学校实验动物中心），雄性，体重250～300 g，随机分为3个组。

①坐骨神经慢性压迫模型组（CCI组）：10只，制作方法如下[1]：腹腔注射10%水合氯醛（3 ml/kg）麻醉，取俯卧位，聚维酮碘溶液消毒左、右侧大腿皮肤，切开皮肤，钝性分离股二头肌，暴露出坐骨神经干，用非吸收外科缝线环绕神经干分别做4个轻度结扎环，间距1～2 mm，结扎强度以引起小腿肌肉轻度颤动反应为宜，术后用丝线逐层缝合切口。

②坐骨神经部分损伤模型（PSI）：10只，左右肢暴露坐骨神经干以后用玻璃钝性组织分离器将坐骨神经干纵向分开，紧紧结扎1/3～1/2的神经干。其余方法同CCI组。

③假手术组（Sham组）：10只，仅左右肢暴露坐骨神经干不予结扎，其余方法同CCI组。

1.2 疼痛行为学及痛阈测定

用Von Frey纤毛测定大鼠的机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold， MWT）和热痛刺激仪测定大鼠热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency， PWTL）分别评价大鼠机械痛敏和热痛敏。所有各组大鼠均在手术前1 d测定MWT、PWTL值，术后1、3、7、14、28、56 d分别测定MWT、PWTL值，测量前观察添足、咬足等行为。每次测量均在上午进行。（1）MWT测定方法：采用von Frey丝测定双后肢机械痛阈，将大鼠置于金属笼中适应环境30 min，用不同压力纤维丝刺激足底2、3趾间皮肤，每根重复5次，每次间隔5s，直至找到出现50%（10次）抬足反应的纤维丝，其压力值（出现大于5次以上是缩足反应），即为阈值，左右轮流测试，每足测量5次，取平均值。（2）PWTL测量方法：利用鼠爪热辐射刺激测痛仪。大鼠出于自由活动状态，调整好一起刺激强度（R=72），将刺激装置放置在鼠爪下，按操作键，当鼠爪移动时系统自动记录大鼠反应时间，此时间即为大鼠足底PWTL，每足测量5次，时间间隔3～5 min，取平均值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，组内比较采用配对资料t检验，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 行为学观察

三组大鼠术后7天内均出现舔舐伤口行为，CCI组和PSI组大鼠术后出现添足、咬足、垂足、脚趾并拢，屈曲等行为。

2.2 PWTL和MWT值检测

三组术前PWTL和MWT值检测无差异（P >0.05），术后1～28d CCI组和PSI组PWTL和MWT值较Sham组明显降低，其中CCI组更为明显（P 0.05，表1），而PSI组术后56d PWTL和MWT值与Sham组比较仍明显降低（P

3 讨论

神经病理性疼痛给病人造成了极大的痛苦，目前其发病机制尚不完全清楚。理想的疼痛模型对研究该病的发病机制尤为重要。神经病理性疼痛模型可分为中枢神经损伤模型和周围神经损伤模型。中枢神经损伤模型如腰髓损伤等因会导致高位截瘫和坏死[2]目前已经极少应用。周围神经损伤模型针对脊神经如坐骨神经等进行损伤和压迫因可以较大程度的产生持续性疼痛[3]而得到广泛应用。目前常用的周围神经损伤模型有坐骨神经慢性压迫模型（CCI）和坐骨神经部分损伤模型（PSI）。

坐骨神经慢性压迫模型由Bennett和Xie[4]于1988年首次报道，该模型可以较好的模仿临床的肿瘤压迫、神经损伤、重金属中毒等产生的神经病理性疼痛而被广泛应用，且手术方法简单，易于操作。但由于该模型的疼痛效果受打结强度的影响较大，个体之间存在较大差异，为解决这个问题出现了PSI模型。PSI模型由Seltzer首次报道[5]。该模型对部分坐骨神经进行钝性分离并深度结扎，产生持续性的慢性疼痛，可以有效解决个体之间的差异问题，但操作复杂，易于污染，手术创伤较大，不利于大量制作。

本实验旨在对两种模型的疼痛效果进行对比，对疼痛的持续性和痛阈的敏感程度进行对比。实验显示，两种模型均能产生持续有效的疼痛。在持续时间上CCI模型在56d后PWTL和MWT值已基本恢复，与对照组比较无差异，说明疼痛已基本消失，而PSI模型在56d后PWTL和MWT值与对照组比较仍具有统计学差异，说明PSI模型可产生更为持久的疼痛。在对疼痛的敏感程度上，CCI组PWTL和MWT值在术后1～28d比PSI组更低，且较快的达到最低值，说明CCI模型比PSI模型对疼痛更为敏感，可快速达到神经病理性疼痛效果。

总之，CCI模型和PSI模型均可产生持续性的慢性疼痛，CCI模型对疼痛更为敏感，而PSI模型的疼痛持续时间较长，在进行神经病理性疼痛研究时可根据需要选择适当的疼痛模型。

参考文献

[1]王江栓，曹靖，臧卫东等. 胶质纤维酸性蛋白与波形蛋白在大鼠坐骨神经慢性结扎模型中的表达及意义[J].解剖学杂志， 2011， 34（5）：653-698.

[2]刘杨，刘季，王亚方等. 大鼠脊髓挫伤后BDNF表达的实验性研究[J]. 中国法医学杂志，2007， 22（1）：15-18.

[3]周秋雯，徐建国. 慢性疼痛动物模型的研究进展[J]. 医学研究生学报， 2008， 21（6）：638-642.

篇5

【Abstract】 AIM: To study whether the blockade of glutamate NMDA receptors in the ventral tegmental area (VTA) modulates the morphine withdrawal in rats. METHODS: The effects of (+) MK801， microinjected unilaterally into the VTA 30 min before naloxone (2 mg/kg， ip) administration， on the morphine withdrawal were assessed. Morphine dependence developed with increasing morphine injection (ip) and morphine withdrawal was induced by injection (ip) of naloxone (2 mg/kg). Wet dog shakes and GellertHoltzman score were used as the indexes to evaluate the intensity of morphine withdrawal. RESULTS: Unilateral microinjection of MK801 into the VTA significantly reduced the GellertHoltzman score and the incidence of wet dog shakes in morphine withdrawal rats. CONCLUSION: MK801 (2， 5， 10 g/L) unilaterally administered into the VTA significantly reduces the intensity of morphine withdrawal syndrome in dependent rats. These data support that glutamatergic transmission in the VTA and its interactions with dopaminergic neurons in the mesolimbic system play some important roles in opiate withdrawal syndrome. Our findings also suggest a potential use of NMDA antagonists in the therapeutic treatment of opiate abuse.

【Keywords】 MK801; Morphine deperdence; substance withdrawal syndrome; receptors， NmethylDaspartate; Rats; ventral tegmental area

【摘要】 目的： 研究中脑―边缘多巴胺回路腹侧被盖区(VTA)内源性谷氨酸信号转导在吗啡戒断形成中的作用. 方法： 给VTA微注射不同剂量谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801，用行为学方法观察对吗啡戒断大鼠戒断症状的影响. 递增量吗啡ip 7 d建立依赖模型，末次给药1.5 h ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状，以GellertHoltzman Score和湿狗样颤为评价戒断症状程度的指标，进行统计学分析. 结果： （+）MK801（2， 5， 10 g/L）微注射于VTA可明显减弱吗啡戒断大鼠湿狗样颤的发生次数，且能显著降低吗啡戒断鼠的GellertHoltzman Score. 结论： VTA内源性谷氨酸受体及其与中脑―边缘多巴胺能信号转导相互作用，参与吗啡戒断的形成，提示谷氨酸受体拮抗剂可用于吗啡戒断的治疗.

【关键词】 腹侧被盖区；吗啡依赖；物质禁断综合征受体，N甲基D天冬氨酸；MK801；大鼠

0引言

阿片依赖是一种细胞适应性反应，许多脑区参与，中脑―边缘多巴胺回路系其中之一. 研究表明吗啡戒断大鼠腹侧被盖区（VTA）多巴胺神经元直径、数目减小［1］，放电频率及多巴胺释放量降低［2，3］，可见VTA多巴胺神经元功能下调. VTA多巴胺能神经元既接受自身受体D2的调节，又接受谷氨酸能投射. 激动VTA谷氨酸受体可增加伏隔核多巴胺释放和大鼠运动行为［4］，重复给予吗啡等可增加VTA谷氨酸释放和其受体亚基表达，可见VTA谷氨酸受体功能上调. 但该回路谷氨酸受体在吗啡戒断形成中的作用说法不一，因多数研究以全身或脑室内给药方式进行. 我们在吗啡依赖大鼠诱发戒断前，微注射谷氨酸NMDA受体拮抗剂（+）MK801于VTA，观察其对吗啡戒断症状的影响.

1对象和方法

1.1对象

SD雄性大鼠48只，体质量(235±15) g（西安交通大学医学院实验动物中心）. 盐酸纳洛酮，（+）MK801（美国Sigma公司），盐酸吗啡粉剂（青海制药厂，批号：010202），盐酸吗啡针剂（沈阳制药厂，批号：020907）.

1.2方法

1.2.1手术大鼠在戊巴比妥钠麻醉下，行单侧VTA套管埋植手术，套管埋植在距VTA背侧2 mm处，用不锈钢螺钉和牙科水泥固定在颅骨表面，VTA定位为AP -5.3 mm， ML +0.7 mm， DV -7.7 mm，手术过程用电热毯保持大鼠体温在(37±1) ℃，术后大鼠单笼喂养，且前3 d ip青霉素2000 u/d，术后7 d建立吗啡依赖模型.

1.2.2制模按照文献［5］的方法，首次剂量为10 mg/kg，分别在8：00和16：00各ip 1次，以后吗啡剂量每日增加10 mg/kg，连续注射7 d，其中第6，7日剂量维持在50 mg/kg，建成吗啡依赖模型. 末次给药1 h后，经套管VTA给予(+) MK801 (2， 5，10 g/L)或生理盐水0.5 μL， 30 min后ip盐酸纳洛酮（2 mg/kg）诱发戒断症状［6］，并立即放进透明玻璃缸（50 cm×50 cm×60 cm）内观察大鼠戒断症状1 h.

1.2.3实验分组将大鼠随机分为6组，即第1（盐水对照）组，第2（吗啡依赖对照）组，第3（吗啡戒断对照）组，第4［（+）MK801小剂量治疗］组，第5［（+）MK801中剂量治疗］组和第6［（+）MK801大剂量治疗］组. 每组8只.

1.2.4组织再建行为学观察后，60 mg/kg戊巴比妥钠ip麻醉大鼠，经心灌注200 mL生理盐水快速冲洗血液后，用40 g/L多聚甲醛固定液（0.1 mol/L PB配制，pH 7.4）400 mL灌流1 h，灌注后取脑，置入40 g/L多聚甲醛固定液4℃后固定12 h，再移入250 g/L蔗糖溶液固定24 h以上，按Paxinos大鼠立体定位图谱在前囟后4.8～5.8 mm范围内用冰冻切片机连续冠状切片，片厚50 μm，连续取片，收集于100 mL/L的乙醇溶液，5 g/L Cresyl violet染色［6］，确定给药部位.

1.2.5行为学分析参考FernandezEspejo等［7］的行为学定义和评分标准，戒断症状的严重程度用10个指标衡量，将其分为等级症状（依据出现次数的多少得分）和观察症状（出现即得分）2类，并定义不同的分值，① 等级症状： 湿狗样颤1～2次计2分，3次或更多计4分；后腿直立，跳跃或异常姿势1～4次计1分，5～9次计2分，10次及10次以上计3分；体质量丧失一个百分点计1分. ② 观察症状： 腹泻，眼睑下垂或咬牙出现计2分；激惹或出现计3分. 累加各戒断症状的得分，求得GellertHoltzman Score 评分.

统计学处理： GellertHoltzman Score评分以x±sx表示，所得数据采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用单因素方差分析进行各组间比较，应用Post hoc comparisons (NewmanKeuls) 进行均数间两两比较检验；湿狗样震颤发生次数偏态分布，因此以中位数、25百分位数和75百分位数描述，采用Sigma Stat 2.0统计软件进行统计处理，应用KruskalWallis法进行多样本间的秩和检验，应用MannWhitey U法进行两组间比较，以P

2结果

2.1组织再建Fig 1表明了各实验组VTA给药的部位. 其中盐水或(+)MK801注射在VTA范围以外的实验动物，在统计分析时已剔除.

2.2(+)MK801治疗对吗啡戒断大鼠GellertHoltzman Score评分的影响各症状的累计GellertHoltzman Score评分应用单因素方差分析（one way ANOVA）显示6组间的评分差异显著，Post hoc comparisons（NewmanKeuls）检验显示第3组的GellertHoltzman Score评分显著高于其他5组（P

2.3MK801治疗对吗啡戒断大鼠湿狗样颤的影响湿狗样颤系吗啡戒断大鼠的特征性行为，实验过程中第1，2组均未出现. 第3至6组大鼠均有湿狗样颤发生，KruskalWallis法秩和检验显示各组间湿狗样颤发生次数差异显著，进一步应用MannWhitey U方法进行两样本间比较，第3组显著高于其他5组（P

3讨论

VTA是多巴胺神经元的集中区之一，主要起源于A8A10细胞群，该区的多巴胺神经元同时接受抑制性GABA能和兴奋性谷氨酸能纤维投射，前者的输入减弱或后者的输入增加均会导致VTA多巴胺神经元兴奋. 大量研究证实吗啡依赖和戒断的产生与中枢多巴胺能神经元活动密切相关，伏隔核［8］给予D1受体拮抗剂可诱发吗啡依赖大鼠的戒断症状，而全身给予D1受体激动剂可减弱吗啡戒断症状，可见在吗啡戒断时中枢多巴胺能神经元活动减弱. VTA多巴胺神经元主要投射NAcc和mPFC (medial prefrontal cortex)，同时也投射下丘脑和脑干，而下丘脑和mPFC又是自主神经网络的核心，吗啡戒断引起的VTA多巴胺能神经元活动下调进而引起自主神经系统功能加强，表现出戒断行为，因此有人认为多巴胺间接参与吗啡戒断行为的产生［9］；还有人认为吗啡戒断时运动增强直接由VTA多巴胺D2受体引起［10］. 近期的研究表明吗啡戒断大鼠中脑边缘多巴胺回路谷氨酸能神经元活动加强［11，12］，表现为该回路谷氨酸释放量增加，谷氨酸受体亚基GluR1，NMDAR1 表达上调，全身给予AMPA或NMDA受体拮抗剂可减弱吗啡戒断症状，因此认为在吗啡戒断时中脑―边缘多巴胺回路通过谷氨酸能神经元的活动发挥作用.

吗啡依赖模型建立时给予大剂量盐酸吗啡ip，且用2 mg/kg盐酸纳洛酮诱发戒断行为，以大鼠特异和敏感的行为学指标为参数，换算求得GellertHoltzman Score评分，整体衡量吗啡戒断大鼠戒断症状的程度，同时以大鼠敏感而特异的湿狗样颤发生次数为等级症状的代表，进行统计处理. 在实验过程中，吗啡戒断的特异行为如湿狗样颤、跳跃、扭体，在吗啡依赖对照组和盐水对照组均未出现，可见实验所得数据可靠. 另外GellertHoltzman Score评分系GellertHoltzman 于1978年建立的一种经典的阿片类物质躯体戒断评价指标体系. 实验结果表明VTA单侧微注射（+）MK801能明显减弱了吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score 评分和湿狗样颤的发生次数，但(+)MK801这一作用在3个不同剂量组间未表现出显著的差异. VTA微注射（+）MK801拮抗了谷氨酸受体，从而降低VTA区多巴胺能活动，可见VTA内源性谷氨酸受体调节吗啡戒断行为的形成. 总之，微注射（+）MK801（2， 5， 10 g/L）于VTA显著减弱吗啡戒断大鼠的GellertHoltzman Score评分和湿狗样颤的发生次数，表明VTA内源性谷氨酸受体，及其与中脑边缘多巴胺能神经元相互作用参与吗啡戒断形成，同时提示谷氨酸受体拮抗剂（+）MK801具有治疗吗啡戒断和复吸作用.

参考文献

［1］ Spiga S， Serra GP， Puddu MC， et al. Morphine withdrawalinduced abnormalities in the VTA: Confocal laser scanning microscopy ［J］. Eur J Neurosci， 2003;17（3）:605-612.

［2］ Diana M， Pistis M， Muntoni A， et al. Profound decrease of mesolimbic dopaminergic neuronal activity in morphine withdrawal rats ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 1995;272（2）:781-785.

［3］ Shaham Y， Rajabi H， Stewart. Relapse to heroin seeking in rats under opioid maintenance: The effects of stress， heroin priming， and withdrawal ［J］. J Neurosci， 1996;16（5）:1957-1963.

［4］ Swanson CJ， Kalivas PW. Regulation of locomotor activity by metabotropic glutamate receptors in the nucleus accumbens and ventral tegmental area ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2000;292(1):406-414.

［5］ Hou WB， Zeng YM， Duan SM， et al. M2 muscarinic receptor of spinal cord mediated increase of nNOS expression in locus coeruleus during morphine withdrawal ［J］. Acta Pharmacol Sin， 2002;23(8):691-697.

［6］ Xavier B， Pere V， GarciaSavilla JA. Naloxoneprecipitated withdrawal in morphinedependent rats increases the expression of α 2aadrenoceptor mRNA in brain ［J］. Mol Brain Res， 1997;45(1):154-158.

［7］ FernandezEspejo E， Cador M， Stinus L. Ethopharmacological analysis of naloxoneprecipitated morphine withdrawal syndrome in rats: a newlydeveloped “ethoscore”［J］. Psychopharmacology， 1995;122(1):122-130.

［8］ Harris GC， AstonJones G. Involvement of D2 dopamine receptors in the nucleus accumbens in the opiate withdrawal syndrome ［J］. Nature， 1994;371(6493): 155-157.

［9］ Kandel ER， Schwartz JH， Jessell TM. Principles of neural science ［M］. 4th ed. Beijing: Science Publisher， 2001:960-981.

［10］ Druhan JP， Walters CL， AstonJones G. Behavioral activation induced by D(2)like receptor stimulation during opiate withdrawal ［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2000;294 (2):531-538.

篇6

【摘要】 目的：观察吗啡依赖大鼠脑电、心电的改变。方法：用递增法制备吗啡依赖大鼠模型，自然戒断，在清醒状态下用RM6240系列多道生理信号采集处理系统记录脑电和心电。结果：吗啡依赖大鼠HR减慢，戒断后恢复；给药期α(8-14HZ)波较给药前显著增多，δ（1-4HZ）、θ（4-8HZ）、β（14-30HZ）与给药前相比无显著性差异；停药后与给药期相比δ波增加，α、θ波减少，但与给药前比较无统计学意义。β波给药前、给药期、停药后无明显改变。结论：吗啡依赖大鼠的脑电、心电均较给药前明显改变，戒断后的脑电、心电与给药前相比无显著差异。

【关键词】 脑电； 心电； 吗啡依赖

1 前言

20世纪80年代以来，类药物滥用现象在我国呈逐年增加的趋势，已成为影响人们身心健康及家庭、社会安定的一大公害。目前国内外对于药物依赖大鼠动物模型的观察大都以行为学为指标，而客观的量化指标少见报道。本研究以心电、脑电变化为指标，通过信息处理系统进行实时跟踪观察，探讨药物依赖动物模型的客观指标，为药物依赖的基础研究与临床应用提供实验依据。

2 材料与方法

2.1 动物

采用Wistar大鼠，体重120～210g，雌雄不拘，由荆楚理工学院医学院实验动物中心提供。

2.2 仪器与药品

RM6240系列多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂生产)；盐酸吗啡（沈阳制药厂生产）。

2.3 准备

头骨包埋电极：大鼠在乌拉坦麻醉状态下，暴露头骨，在头骨矢状缝左侧，分别距前囟旁2mm，前2mm和旁2mm，后4mm处钻孔，插入0.25mm口腔正畸用不锈钢丝作为记录电极，用502胶与牙托粉固定［1］，撒磺胺粉后缝合伤口。待手术创口完全愈合后进行脑电记录。

四肢用脱毛剂脱毛，采用标准Ⅰ导联记录心电图。

2.4 实验分组与处理

选用120～210g，Wistar大鼠9只，雌雄不拘，随机分为实验组（6只）和对照组（3只）。两组于给药前3天同步记录正常心电、脑电。实验组由腹部皮下注射盐酸吗啡溶液建立吗啡依赖大鼠模型。模型的建立按照每天每公斤体重递增给予不同剂量的吗啡（20、40、60、80、100、120mg/kg），每天2次，共注射6d。对照组注射与实验组同体积的生理盐水，给药/生理盐水后30min同步记录脑电、心电。停药后连续3天记录心电，脑电。

2.5 统计学方法

计算资料以均数±标准差（x±s）表示，组内比较采用配对t检验。

3 结果

3.1 对照组

在生理盐水注射前、注射期及停止注射后心电、脑电均无明显改变。

3.2 实验组

吗啡给药前、给药期、停药后HR的平均值见表1。给药期HR较给药前显著减慢，P

实验组脑电分析的结果见表2。吗啡依赖大鼠给药期α波较给药前增加，P

4 讨论

据文献报道，高浓度吗啡(15～120μmol/L)可使心肌细胞APD 和 ERP 延长，且呈剂量依赖性［2］。本实验在给药过程中HR减慢但与吗啡剂量不呈比例，这可能与吗啡抑制血管运动中枢，释放组胺、CO2蓄积导致血管扩张，引起血压降低，通过降压反射使得心率增加有关［3］。停药戒断后，心率加快，与交感紧张度升高有关，也可能与体内吗啡的浓度逐渐降低有关。

本实验结果表明，吗啡依赖大鼠在发生戒断后，δ波显著增高，这可能与阿片类物质立即停药后导致中脑边缘多巴胺系统的VTA神经元自发放电活动增强有关。而这种自发放电活动的增强，与行为敏感的形成以及戒断的厌恶动机症状有关［4］。另外发生戒断反应时，躯体处于一种生理应激状态［5］也可能是吗啡依赖者δ波增多的原因。戒断后α波减少，可能与吗啡的滥用导致脑血流减少，影响脑血流量的自动调节［6］ ，而已有的脑电生理研究显示，脑血流量是与α波呈正相关而与δ呈负相关［7］。本实验结果也显示，大鼠戒断后δ波显著增高，α波显著减少。

参考文献

1 张莉，赵研君，张益珍，等.大鼠吗啡成瘾脑电图系统初步观察.生物医学工程学杂志，2001，18（3）：441～443.

2 薛冠华，王正义，廖德志，等.不同浓度吗啡对心肌动作电位的作用及其机制.生理学报， 1990，4：19～26.

3 徐叔云，主编.临床药理学.第3版.北京：人民卫生出版社，2005，201.

4 张富强， 周文华， 杨国栋.觅药行为的神经生物学机制. 国外医学精神病学分册， 1998， 25∶ 200～202.

5 吴玲， 郝伟. 阿片类药物成瘾者的免疫改变. 国外医学精神病学分册， 1996， 23∶ 210.

篇7

[关键词] 乌头碱；粪样；代谢组学；核磁共振

[中图分类号] R917 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）05（b）-0018-04

附子（Radix Aconiti Lateralis Preparata）为毛茛科植物乌头（Aconitum Carmichalii Debx.）的子根，其在我国传统中药中被誉为“回阳救逆第一品药”。其药理作用主要包括镇痛、消炎[1-5]、强心、抗心律失常、抗肿瘤、增强免疫力等[6]。但是由于附子治疗窗狭窄，往往在发挥治疗作用的同时伴随有严重的毒副反应，这些常会造成临床上的误用滥用现象。以乌头碱为代表的双酯二萜型乌头类生物碱是附子毒性的主要来源，其毒副作用主要表现为心脏毒性[7-11]与神经毒性[12-13]。

代谢组学是从整体角度研究生物体系受外部刺激而引起的代谢产物的变化规律，现在已经广泛应用于研究药物毒性[14-17]、新药安全性评价[18-19]、疾病诊断[20-22]等领域。粪便代谢物谱也是研究机体应激反应的重要方面，其能客观全面的反映肠道菌群对于食物、疾病及药物代谢的作用[23-25]，为药物研究及疾病诊断提供辅的生物学信息。我们已经对附子、乌头类生物碱对大鼠血浆、尿液的代谢物谱的毒性作用进行了系统的研究[14-16]。本文主要利用核磁共振（NMR）的代谢组学方法检测大鼠粪样代谢物谱，考察乌头碱急性毒性作用时对大鼠肠道菌群的影响，通过多元统计的模式识别及相关性分析，寻找造成机体代谢紊乱的相关潜在差异代谢物，最终对相关代谢通路进行深入研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠15只，体重（201.3±5.4）g，清洁级，军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-（军）2007-004，在动物房代谢笼中12 h昼夜交替适应性饲养1周，动物自由摄食饮水，温度20～23℃，湿度60%左右。随机分为给药组、对照组，给药组10只，对照组5只。

1.2 试剂与仪器

乌头碱（Aconitine，中国药品生物制品检定所）；重水（D2O，美国Norell公司）；2，2，3，3，三甲基甲硅烷基丙酸（TSP，加拿大默克公司）；戊巴比妥钠（国药化学试剂有限公司）；NaH2PO4・2H2O，Na2HPO4・12H2O（国药化学试剂有限公司）。VarianUNITY INOVA 600 MHz超导脉冲傅立叶变换核磁共振谱仪（美国瓦里安公司）；Eppendorf 5024离心机（德国Eppendorf公司）；QL-901涡旋振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验用药品的制备 精密称量8.80 mg乌头碱标准品，添加44 mL去离子水和30 μL 36%～38%的浓盐酸，涡旋振荡，得到浓度为0.2 mg/mL的乌头碱溶液，4℃保存备用。

1.3.2 生物样品的采集 动物适应性结束后，给药组按照2.54 mg/kg的剂量灌胃给予乌头碱，对照组灌胃给予同剂量的饮用水，收集给药6 h后的大鼠粪样。然后腹腔注射戊巴比妥钠（3%，1.5 mL/kg）麻醉大鼠，分离心脏、肝脏及肾脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，并计算脏器系数。最后将生物样品保存在-20℃冰箱中，待用。

1.4 核磁共振数据的采集与预处理

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠行为学观察、体重及脏器系数的变化

2.3 多元统计分析

3 讨论

在实验中，由大鼠的行为学、脏器系数及体重分析可知，乌头碱的摄入直接影响了大鼠心脏、肝脏、肾脏及神经系统的的正常生理功能，进而导致代谢通路及代谢物含量的紊乱，表明乌头碱对于机体具备极强的毒性，这也和之前关于乌头碱毒性的报道吻合[14-16]。

本实验采用的基于核磁共振的代谢组学方法研究了乌头碱对于大鼠粪样中代谢物的影响，客观全面地反映了机体受到应激后的病理生理变化。由大鼠的粪样1H-NMR谱分析可知，α-氨基戊酸、谷氨酸、苯丙氨酸的含量降低，显示乌头碱造成了机体氨基酸代谢的紊乱，在大部分哺乳动物体内，谷氨酸与精氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸等能经过器官间复杂的新陈代谢可以实现相互转换，文中只出现谷氨酸的含量降低，可能是肠道新陈代谢中出现了相关酶及代谢通路的抑制[35]。谷氨酰氨与谷氨酸、γ-氨基丁酸之间的相互转换在维持脑的兴奋（谷氨酸为主）-抑制系统（γ-氨基丁酸为主）平衡方面发挥重要作用[36-37]，谷氨酸含量降低，表明谷氨酰胺向谷氨酸转化的方向出现了障碍，这也与大鼠给药后出现活动量减少，反应迟钝等行为学表现相印证。谷氨酸对于哺乳动物的生长及维持肠道功能也至关重要，这点可能也与实验大鼠的食欲不振有一定的关系。

芳香族氨基酸的酵解通常由肠道中的厌氧菌来完成，其代谢产物为酚和吲哚类化合物，这两类代谢物则分别是致癌辅助剂和结肠癌启动子[38]。实验中出现的苯丙氨酸在乌头碱摄入后的含量急剧降低，可能是大鼠在病理状态下厌氧菌的代谢增强，造成体内毒性物质蓄积，从而使肠道正常的生理功能被破坏。苯丙氨酸也是一些重要的小分子激素合成的前体，其含量的降低，可能会造成肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等激素的功能障碍，进而影响机体正常的新陈代谢[39]。此外，氨基酸含量的降低，也可能是肠道菌群数量受到乌头碱摄入的影响，菌群数量的减少造成了蛋白质降解及氨基酸合成的降低，这在已有的一些报道中得到了证实[40-41]。

肠道菌群不仅参与食物的消化、吸收，而且在维持机体应激状态下的肠道功能正常方面也是至关重要的。因此，粪便代谢组学为本研究提供了有关宿主、饮食及共生的肠道微生物之间相互作用的生物学信息，为相关疾病的诊断提供了辅的工具。

本实验的结果分析表明，乌头碱的摄入不仅造成了大鼠心、肝、肾等脏器损伤，也导致了氨基酸、能量等代谢通路的紊乱，客观全面地反映了乌头碱对于粪便代谢物谱的影响。通过粪便代谢物谱的分析为相关学者认识肠道微生物及其在人体代谢中的特殊作用打开了窗口，也为进一步研究乌头类生物碱及中药毒性提供了新途径、新思路。

[参考文献]

[1] Haibo S，Chongchu Z，Yanzhong L， et al. Anti-inflammatory Effect of Aconitines [J]. China Journal of Chinese Materia Medica，1990，3：022.

[2] Luo B，Kobayashi S，Kimura I，et al. Inhibitory effects on angiogenesis and pouch fluid exudation by aconite alkaloids in adjuvantinduced inflammation of the mouse [J]. Phytotherapy Research，2006，5：231-233.

[3] Murayama M，Mori T，Bando H，et al. Studies on the constituents of Aconitum species. IX. The pharmacological properties of pyro-type aconitine alkaloids， components of processed aconite powder‘Kako-bushi-matsu’： analgesic，antiinflammatory and acute toxic activities[J]. Journal of Ethnopharmacology，1991，35：159-164.

[4] Murayama M，Namiki Y. Pharmacological study of kako-bushi-matsu： analgesic action and acute toxicity. Nihon yakurigaku zasshi[J]. Folia pharmacologica Japonica，1989，94：309.

[5] Wang ZW，Zhang AG，Yuan Q，et al. Pharmacological Study of Musk-Aconite-Earthworm Pill on Anti-inflammatory and Analgesic [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2007：3.

[6] Bossaert BL，Handley U，Marsden U，et al. The effects of Aconitum alkaloids on the central nervous system[J]. Progress in neurobiology， 1998，56：211-235.

[7] Fu M，Wu M，Wang JF，et al. Disruption of the intracellular Ca2+ homeostasis in the cardiac excitation-contraction coupling is a crucial mechanism of arrhythmic toxicity in aconitine-induced cardiomyocytes[J]. Biochemical and biophysical research communications，2007，354：929-936.

[8] Fu M，Li RX，Fan L，et al. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ release channel ryanodine receptor （RyR2） plays a crucial role in aconitine-induced arrhythmias[J]. Biochemical pharmacology，2008，75：2147-2156.

[9] Yoshioka N，Gonmori K，Tagashira A，et al. A case of aconitine poisoning with analysis of aconitine alkaloids by GC/SIM[J]. Forensic science international，1996，81：117-123.

[10] Wada K，Nihira M，Hayakawa H，et al. Effects of long-term administrations of aconitine on electrocardiogram and tissue concentrations of aconitine and its metabolites in mice [J]. Forensic science international， 2005，148：21-29.

[11] Weijters B，Verbunt RJ，Hoogsteen J，et al. Salade malade： malignant ventricular arrhythmias due to an accidental intoxication with Aconitum napellus[J]. Netherlands Heart Journal，2008，16：96-99.

[12] Zhao Y，Bu Q，Zhou Y，et al. Mechanism study of Aconitum-induced neurotoxicity in PC12 cells： Involvement of dopamine release and oxidative damage [J]. Neurotoxicology，2010，31：752-757.

[13] Ameri A. The effects of Aconitum alkaloids on the central nervous system [J]. Progress in neurobiology，1998，56：211-235.

[14] Li L，Sun B，Zhang Q，et al. Metabonomic study on the toxicity of Hei-Shun-Pian， the processed lateral root of Aconitum carmichaelii Debx. （Ranunculaceae） [J]. Journal of Ethnopharmacology，2008，116：561-568.

[15] Sun B，Li L，Wu S，et al. Metabolomic analysis of biofluids from rats treated with Aconitum alkaloids using nuclear magnetic resonance and gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry[J]. Analytical Biochemistry，2009，395：125-133.

[16] Sun B，Wu S，Li L，et al. A metabolomic analysis of the toxicity ofAconitumsp. alkaloids in rats using gas chromatography/mass spectrometry [J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry，2009，23：1221-1228.

[17] Kim TH，Ahn MY，Lim HJ，et al. Evaluation of metabolomic profiling against renal toxicity in Sprague-Dawley rats treated with melamine and cyanuric acid [J]. Archives of Toxicology，2012，1：1-13.

[18] Shi C，Cao AM，Sheng HZ，et al. NMR-spectroscopy-based metabonomic approach to the analysis of Bay41-4109， a novel anti-HBV compound， induced hepatotoxicity in rats[J]. Toxicology letters，2007，173：161-167.

[19] Wang Q，Jiang Y，Wu C，et al. Study of a novel indolin-2-ketone compound Z24 induced hepatotoxicity by NMR-spectroscopy-based metabonomics of rat urine，blood plasma， and liver extracts [J]. Toxicology and applied pharmacology，2006，215：71-82.

[20] Zhang Z，Qiu Y，Hua Y，et al. Serum and urinary metabonomic study of human osteosarcoma[J]. Journal of proteome research，2010，9：4861-4868.

[21] Sun L，Hu W，Liu Q，et al. Metabonomics reveals plasma metabolic changes and inflammatory marker in polycystic ovary syndrome patients [J]. Journal of proteome research，2012，11：2937-2946.

[22] Stephens NS，Siffledeen J，Su X，et al. Urinary NMR metabolomic profiles discriminate inflammatory bowel disease from healthy[J]. Journal of Crohn's and Colitis，2012，7：42-48.

[23] Clayton TA，Baker D，Lindon JC，et al. Pharmacometabonomic identification of a significant host-microbiome metabolic interaction affecting human drug metabolism[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2009，106：14728-14733.

[24] Samuel BS，Shaito A，Motoike T，et al. Effects of the gut microbiota on host adiposity are modulated by the short-chain fatty-acid binding G protein-coupled receptor， Gpr41[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2008，105：16767-16772.

[25] Duncan SH，Belenguer A，Holtrop G，et al. Reduced dietary intake of carbohydrates by obese subjects results in decreased concentrations of butyrate and butyrate-producing bacteria in feces [J]. Applied and environmental microbiology，2007，73：1073-1078.

[26] Savorani F，Tomasi G，Engelsen SB. A versatile tool for the rapid alignment of 1D NMR spectra[J]. Journal of Magnetic Resonance，2010，202：190-202.

[27] Bylesj M，Eriksson D，Sjdin A，et al. Orthogonal projections to latent structures as a strategy for microarray data normalization[J]. BMC bioinformatics，2007，8：207.

[28] Cloarec O，Dumas ME，Trygg J，et al. Evaluation of the orthogonal projection on latent structure model limitations caused by chemical shift variability and improved visualization of biomarker changes in 1H NMR spectroscopic metabonomic studies[J]. Analytical chemistry，2005，77：517-526.

[29] Clayton TA，Lindon JC，Cloarec O，et al. Pharmaco-metabonomic phenotyping and personalized drug treatment [J]. Nature，2006，440：1073-1077.

[30] Shiryaeva L，Antti H，Schrder WP，et al. Pair-wise multicomparison and OPLS analyses of cold-acclimation phases in Siberian spruce [J]. Metabolomics，2012，1：1-8.

[31] Wishart DS，Knox C，Guo AC，et al. HMDB： a knowledgebase for the human metabolome[J]. Nucleic acids research，2009，37：603-610.

[32] Wishart DS，Tzur D，Knox C，et al. HMDB： the human metabolome database [J]. Nucleic acids research，2007，35：521-526.

[33] Saric J，Wang Y，Li J，et al. Species variation in the fecal metabolome gives insight into differential gastrointestinal function [J]. Journal of proteome research，2007，7：352-360.

[34] Wu J，An Y，Yao J，et al. An optimised sample preparation method for NMR-based faecal metabonomic analysis[J]. The Analyst，2010，135：1023.

[35] Wu G，Bazer FW，Davis TA，et al. Important roles for the arginine family of amino acids in swine nutrition and production [J]. Livestock science，2007，112：8-22.

[36] Benítez DP，Miranda CL，Mendoza BR，et al. Prenatal and postnatal contents of amino acid neurotransmitters in mouse parietal cortex [J]. Developmental neuroscience，2003，25：366-374.

[37] Benítez DP，Miranda CL，Pea CZ，et al. Histotypic mouse parietal cortex cultures： excitation/inhibition ratio and ultrastructural analysis [J]. Journal of neuroscience methods，2006，156：64-70.

[38] Nowak A，Libudzisz Z. Influence of phenol，p-cresol and indole on growth and survival of intestinal lactic acid bacteria[J]. Anaerobe，2006，12：80-84.

[39] Wu G. Amino acids： metabolism，functions，and nutrition[J]. Amino acids，2009，37：1-17.

[40] Yap IK，Li JV，Saric J，et al. Metabonomic and microbiological analysis of the dynamic effect of vancomycin-induced gut microbiota modification in the mouse [J]. Journal of proteome research，2008，7：3718-3728.

篇8

【关键词】 螺旋藻；衰老；记忆障碍；改善作用

螺旋藻含有丰富的蛋白质、游离氨基酸、糖、不饱和脂肪酸、多种维生素及微量元素，是一种具有重要经济价值的保健食品。实验发现螺旋藻能够增强自身免疫，延缓衰老〔1〕。而有关螺旋藻对D半乳糖所致衰老小鼠学习记忆障碍有否改善作用，目前还未见报道。本实验通过建立D半乳糖所致衰老小鼠模型，以学习记忆能力、脑组织中的单胺氧化酶（MAO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）活性为指标，观察螺旋藻对衰老小鼠学习记忆障碍有否改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 螺旋藻干粉由广州龙力贸易发展有限公司生产。D半乳糖由上海试剂二厂生产，用蒸馏水配置成30 g/L浓度的溶液待用。MAO和GSHPx试剂盒及蛋白定量测试盒由南京建成生物工程公司生产。

1.2 动物与分组 昆明种健康清洁级雄性小鼠40只，体重28～34 g，由南京医科大学实验动物中心提供。随机分为4组，每组10只，即模型组：每日按照300 mg/kg剂量颈部皮下注射D半乳糖，同时用等量的蒸馏水灌胃；低剂量组：按上述剂量颈部皮下注射D半乳糖，同时用1.5 g/kg剂量的螺旋藻灌胃；高剂量组：按上述剂量颈部皮下注射D半乳糖，同时用3 g/kg剂量的螺旋藻灌胃；对照组：按上述同样剂量的蒸馏水分别颈部皮下注射和灌胃。各组动物正常进食，持续6 w后，对各组动物进行行为学测试以及脑组织生化测定。

1.3 避暗实验 实验装置分明箱和暗箱两部分，两箱之间有一小洞供小鼠通过，箱底部设有铜栅可电击动物。实验时将小鼠背向洞口置于明箱，当小鼠进入暗箱时，用36 V电击3 s，小鼠又会逃至明箱。记录5 min内的错误次数即小鼠进入暗箱的次数，以此作为学习成绩。24 h后再测，以其错误次数和潜伏期(即第一次进入暗箱的时间)作为记忆成绩。

1.4 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫由圆形水槽、有机玻璃平台、摄像系统和电脑分析系统组成。训练时水温保持在25℃左右，将小鼠面向池壁从4个不同象限入水，每只小鼠每日训练4次，小鼠从入水到找到平台所需的时间称为潜伏期。找到后在平台上应保持20 s，如果60 s还未找到，则应将其引导到平台上，潜伏期按60 s计。连续4 d进行定向航行实验，记录第4天每只小鼠潜伏期的平均值。第5天进行空间探索实验，即在撤掉平台时，记录120 s内小鼠穿越平台的次数。

1.5 小鼠脑组织MAO和GSHPx活性的测定 行为测试完成后，将小鼠颈椎拉断处死，迅速断头取脑、称重。按照试剂盒说明书，检测脑组织MAO和GSHPx活性。

1.6 统计学分析 数据用x±s表示，采用SPSS12.0软件对数据进行统计学处理。

2 结果

2.1 避暗实验结果 对照组与模型组相比，无论是学习成绩，还是记忆成绩，都表现出了差异性，具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；除了低剂量组记忆成绩中的潜伏期与模型组相比没有表现出明显差异外，低剂量和高剂量的其余数据都差异明显(P＜0.05)，学习和记忆成绩都好于模型组。见表1。

表1 各组小鼠避暗实验成绩（略）

与模型组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01；下表同

2.2 Morris水迷宫实验成绩 对照组的学习记忆成绩都好于模型组，数据的差异性，具有统计学意义(P＜0.05)；除了低剂量组的穿越次数与模型组相比差异不明显外，低剂量组和高剂量组的其余数据都差异明显，具有统计学意义(P＜0.05)，学习记忆成绩都好于模型组。见表2。

2.3 小鼠脑组织MAO和GSHPx活性的测定结果 模型组的MAO活性高于对照组（P＜0.01）；而低剂量组和高剂量组的MAO活性又低于模型组(P＜0.05)。模型组的GSHPx活性低于对照组(P＜0.05)；而高剂量组的GSHPx活性又高于模型组(P＜0.05)。见表2。

表2 各组小鼠水迷宫实验成绩和脑组织MAO、GSHPx活性（略）

3 讨论

D半乳糖在体内利用过程中，可产生过量的自由基，诱发动物的衰老，引起痴呆样的行为及病理性改变，导致细胞肿胀、代谢紊乱、体内活性氧水平升高、细胞膜脂质受损，以至引起多器官系统功能的衰退〔2〕。本实验的行为检测结果与之一致，即模型组小鼠的学习记忆出现了障碍，同时小鼠的状态也明显下降，表现为:毛色灰暗、稀疏，行动缓慢，步态蹒跚，皮下脂肪减少。但是当补充螺旋藻后，低剂量组和高剂量组的学习记忆能力又不同程度得到恢复，说明螺旋藻可以改善由D半乳糖所导致的学习记忆障碍。

本研究表明，衰老模型组的MAO活性比对照组高，当补充螺旋藻后，治疗组的MAO活性又降低。MAO是动物脑中单胺类递质的氧化分解酶，主要存在于细胞内线粒体外膜上，作用的底物是去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素等单胺类物质。裘月等〔3〕的研究发现，当机体衰老时，动物脑内的MAO活性升高，使递质高度氧化，造成单胺类神经递质的减少；与此同时，MAO在分解多巴胺的过程中，又可以产生 H2O2，H2O2与脑内Fe2＋进一步反应则可产生自由基，从而导致神经细胞的损伤，影响学习记忆功能。由此MAO被认为是衰老的分子标志之一，MAO活性可间接反映生物体的衰老程度，故又称为“衰老相关酶”。模型组的MAO活性升高，说明通过D半乳糖建模成功。当补充螺旋藻后，其中的某种成分通过某种机制又使MAO活性降低。MAO活性被抑制，可导致内源性单胺的蓄积，从而恢复记忆能力〔4〕。另外，衰老模型组的GSHPx活性比对照组低，当补充螺旋藻后，GSHPx 的活性又升高。GSHPx也是机体内清除自由基的重要抗氧化酶之一，可抵抗氧自由基损伤，维持组织、细胞和蛋白质的正常结构与功能。在维持机体氧化还原平衡等方面发挥重要作用，是抗衰老的重要指标〔5〕。

螺旋藻营养丰富，含有18种氨基酸、12种矿物质、8种维生素和多种生物活性物质，其中的某些物质可能通过多种代谢途径，直接或间接影响着与衰老有关的物质〔6～8〕。螺旋藻通过种种途径增强了机体的抗氧化酶活性，减弱了脂质过氧化反应，有效清除了过量的自由基，使脑组织功能有所恢复，进而表现出了对衰老小鼠学习记忆障碍的改善作用。有关螺旋藻改善衰老小鼠学习记忆障碍的机制颇为复杂，究竟哪些物质在发挥作用，经过了怎样的途径，这些问题还都不明了，仍然有待于今后的工作。

参考文献

1 刘玉兰，牟孝硕，崔素玉，等.螺旋藻多糖的抗衰老作用〔J〕.中国药理学通报，1998；14(4)：3623.

2 李文彬，韦 丰，范 明，等.D半乳糖在小鼠上诱导的拟脑老化效应〔J〕.中国药理学与毒理学杂志，1995；9（2）:935.

3 裘 月，杜冠华，张均田.单胺氧化酶及与疾病的关系〔J〕.中国药学杂志，1994；29(10):5968.

4 Brown R，Slva AJ.Molecular and cellular cognition；the unraveling of memory retrieval〔J〕.Cell，2004；117(1):34.

5 Yao D，Shi W，Gou Y，et al.Fatty acidmediated intracellular iron translocation:a synergistic mechanism of oxidative injury〔J〕.Free Radic Biol Med，2005;39(10):138598.

6 崔 旭，李文彬，张炳烈，等.D半乳糖脑老化模型的脂质过氧化机制〔J〕.中国老年学杂志，1998；18(1):3840.

篇9

脑得生总苷是以中国药典2005年版收载的脑得生片（由三七、葛根、川芎、红花、山楂等中药组成，具有活血化瘀，疏通经络，醒脑开窍功能。用于治疗瘀血阻络所致的眩晕、中风等）处方为依据，经大孔树脂吸附纯化提取，分离出来的治疗脑血管疾病的有效部位群，主要含有三七总皂苷、葛根总黄酮等。本实验就脑得生总苷对全脑缺血再灌注损伤和局灶性永久性脑缺血的预防和治疗作用进行了实验性研究，为开展临床试验提供参考。

1 实验材料

1．1 药品：脑得生总苷，由浙江省中医药研究院提供，批号：051201(4g生药／0．2g)；脑得生片，由江西三越药业有限责任公司提供，批号：20050301(0．665g生药／0．3g／片)。其它试剂，水合三氯乙醛(批号：20030227），红四氮唑(TTC，批号：F20050620），均为中国医药集团上海化学试剂公司产品；尼莫地平，由郑州瑞康制药厂提供（批号：20040106）。

1．2 动物：Wistar大鼠，清洁级，雄性，体重200~350g，由浙江省实验动物中心提供，动物质量合格证号为浙实动单项准第2001001号。动物饲养于正压净化通风动物房内，温度25±2℃，湿度50％～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

2 实验方法与结果

2．1 脑得生总苷抗全脑缺血再灌损伤的实验研究：取健康雄性Wistar大鼠，体重200~350g，共50只，随机分成5组，即阴性对照组(0．5％西黄芪胶，5ml／kg体重）、脑得生总苷低剂量组(1g生药／kg体重)、中剂量组(2g生药/kg体重)、高剂量组(4g生药／kg体重)及阳性对照组(脑得生片2g生药／kg体重)。于缺血前一小时灌胃给药，体积为5ml／kg体重。

将动物用12％的水合三氯乙醛腹腔麻醉(360mg／kg体重），在枕后暴露第一颈椎横突孔，用双极电凝对准横突孔电灼凝固双侧椎动脉。然后在颈部作一切口暴露双侧颈动脉，分离后，用1号丝线穿好，缝合伤口。于术后24小时，大鼠清醒时，用带硅胶管的动脉夹将双侧颈动脉夹闭，即造成4根动脉闭塞全脑缺血，取出动脉夹可使血流再通，为再灌流期。实验缺血与再灌时间均为1小时。凡缺血1小时内脑电图未消失的动物一律剔除。观察指标为缺血后脑电图消失时间，再灌后脑电图恢复时间及翻正反射恢复时间。再灌实验完毕，立即断头取脑，于电子天平上称湿重，将大脑置于60℃烘箱内烘干至恒重(从烘干第3日起每天称量并记录一次，直至连续两次重量之差小于1％)，求出各组的脑含水量。

脑含水量=脑湿重-脑干重脑湿重×100％

所有的数据均用x±s表示，统计学分析用t检验。实验结果见表1、表2。

2．2 脑得生总苷对大鼠电凝引起局灶性永久性脑缺血损伤的实验研究：取健康雄性Wistar大鼠，体重200~250g，共60只，随机分成6组，阴性对照组(生理盐水，5ml／kg体重)、脑得生总苷低剂量组(1g生药／kg体重)、中剂量组(2g生药／kg体重)、高剂量组(4g生药／kg体重)及2个阳性对照组(脑得生片2g生药／kg体重、尼莫地平5 mg／kg体重)。于手术后立即灌胃给药，体积为5ml／kg体重。

将动物用12％的水合三氯乙醛腹腔麻醉(350mg／kg体重)，侧卧位固定于手术台上，沿右外耳道与右眼外眦连线的中点垂直于连线切开皮肤约2cm，然后在手术显微镜下沿颞肌中线依次切断颞肌和咬肌，将这些肌肉向两侧分开，暴露颧骨弓。操作时注意保护面神经和腮腺。用咬骨钳除去颧弓，并沿颅骨剪开筋膜，从而暴露出颞前窝。用小牵张器将颧弓和下颌骨之间的距离撑大，暴露鳞状骨的大部分，

然后在颧骨和鳞状骨前联合的前下方约2mm处钻孔，开一约2mm直径的小颅窗。此时透过硬脑膜就可见一条较直且少分支的小血管，即为大脑中动脉(MCA)。它几乎垂直路过嗅束向上而行。在显微镜下用细针刺破硬脑膜，分离血管周围的软脑膜和蛛网膜组织，使之游离。然后用细分针在嗅束与大脑中动脉交界处轻挑起大脑中动脉，电凝烧灼嗅束内1mm至大脑下静脉之间的大脑中动脉。电凝时，为避免电凝不完全所致的出血，尽量将大脑中动脉挑起，使血管内血量减少。另外，为保护周围组织免受烧伤，用湿棉球保护。阻断大脑中动脉后，用小块肌肉组织轻敷于颅窗上，达到止血作用，术后回笼饲养。以上过程均在室温恒定情况下进行，以利于评价脑缺血程度。并于术后清醒时及24小时进行行为学评分，评分采用单盲法，评分方法为：①提鼠尾离开地面约1尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面，如果有左肩内旋，左前肢内收现象发生者，评分为4分，否则为0分；②将动物置平滑地板上分别推左(或右)肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力,正常大鼠双侧阻力明显且对称,如果推右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同，评分为1～3分;③将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢张力明显且对称。而发生左前肢张力下降者，根据下降程度的轻重评为0~3分。根据以上标准打分，满分10分。评分后，断头取脑，将大脑平均冠状分为5片，放于TTC溶液中，37℃温育10～15分钟，染色，梗死区不着色，正常脑组织染成红色。用生理盐水冲洗后数码照相，图像输入电脑。然后分别称量全脑重量和坏死区脑组织重量，计算坏死区部分占全脑重量的百分比，所有的数据的统计学分析用t检验。实验结果见表3。

3 结论

篇10

Suppressive effect of intrathecal administration of diazepam on visceral pain induced by rectal instillation of formalin in rats

【Abstract】 AIM:　 To explore whether diazepam has a suppressive effect on visceral pain at the spinal level. METHODS: By intrathecal drug administration， the effect of diazepam on persistent visceral pain induced by rectal instillation of formalin was studied. RESULTS: Rectal instillation of formalin induced obvious visceral pain responses， which occurred mainly within 0~75 min after the rectal administration of formalin. Intrathecal pretreatment with three doses of diazepam suppressed the visceral pain responses induced by formalin and the analgesic action of diazepam was mainly within 0~60 min after the rectal administration of formalin. CONCLUSION: Intrathecal pretreatment with diazepam suppresses the visceral pain induced by rectal instillation of formalin， which suggests that diazepam exerts some suppressive effect on visceral pain at the spinal level.

【Keywords】 diazepam; visceral pain; formaldehyde; latency

【摘要】 目的： 研究地西泮在脊髓水平对内脏痛有无抑制作用. 方法： 采用鞘内给药的方法观察地西泮对大鼠直肠注入甲醛致持续性内脏痛的抑制作用. 结果： ① 直肠注入甲醛可引起大鼠剧烈的内脏痛反应，疼痛反应主要集中在甲醛刺激大鼠直肠后的75 min内. ② 鞘内预先注入三个剂量的地西泮均可抑制甲醛刺激大鼠直肠诱发的内脏痛，镇痛作用主要集中在甲醛刺激直肠后的0~60 min. 结论： 鞘内注射地西泮可抑制大鼠直肠注入甲醛引起的内脏痛觉，提示地西泮在脊髓水平对内脏痛有抑制作用.

【关键词】　地西泮；内脏痛觉；甲醛；潜伏期

0引言

地西泮（diazepam， valium， 安定）是苯二氮革类的典型代表药物，也是临床上最常用的镇静、催眠及抗焦虑药.以往研究表明，鞘内注入地西泮可抑制躯体痛觉的传入［1］. 但其是否可以作用于脊髓从而抑制内脏痛觉的传入尚无定论.故本实验利用甲醛内脏痛模型，应用鞘内注射地西泮至腰骶膨大的方法探索地西泮在脊髓水平对内脏痛是否有抑制作用.

1材料和方法

1.1材料

雄性Sprague Dawley (SD)大鼠48只，体质量180~220 g（第四军医大学动物实验中心提供），实验前3 d将大鼠置于20~24℃，湿度为50%~60%的环境，保持昼夜节律. 实验时，将大鼠随机分为6组（每组8只）： 直肠对照组： 直肠注入0.5 mL生理盐水；模型组： 直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；鞘内对照组： 鞘内注入10 μL生理盐水，10 min后直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；低剂量实验组：鞘内注入10 μL浓度为0.4 g/L的地西泮，10 min后直肠注入0.5 mL 20 g/L甲醛；中剂量实验组： 鞘内注入地西泮的浓度为1.6 g/L，其余同低剂量实验组；高剂量实验组：鞘内注入地西泮浓度为3.0 g/L，其余同低剂量实验组. 地西泮（针剂）购于西安利君制药股份有限公司.实验过程中，保持温度（20~24℃）、湿度（50%~60%）和周围环境安静，避免不必要刺激的影响.本实验操作严格遵守国际疼痛学会(IASP)制定的《关于使用清醒动物进行疼痛研究的纲要》.

1.2方法

1.2.1鞘内置管术经腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）深度麻醉大鼠后，从C7水平沿背正中线向尾部切开皮肤、皮下组织、肌肉，暴露并去除T4椎板（约1 mm×1 mm），切开硬脊膜，经鞘内向尾部置入内腔充盈7 μL生理盐水的聚乙烯PE8导管（内径0.28 mm，外径0.6 mm，购自日本Natume公司），根据动物大小确定置入导管从入口到腰骶膨大处的长度（大约3～5 cm），经导管注入生理盐水后见硬膜破口处有脑脊液流出证明导管在蛛网膜腔内. 封外口，局部青霉素抗感染.术后单笼饲养3～5 d，观察动物状态良好，无活动障碍，则可进行实验［2］.

1.2.2鞘内给药鞘内置管术未引起大鼠运动障碍和毒性反应. 鞘内对照组和三个实验组的大鼠在实验玻璃箱适应30 min后，乙醚麻醉，用10 μL微量注射器（宁波镇海玻璃仪器厂）将10 μL生理盐水或不同浓度地西泮以0.5 μL/s的速度注入预先置好的聚乙烯PE8导管，后用7 μL生理盐水洗脱，确保地西泮注入到脊髓，封外口. 动物实验完毕后，解剖证实导管内口开口于蛛网膜下腔腰骶膨大处. 局部脊髓无损伤及陈旧性出血，说明本实验结果可靠.

1.2.3内脏疼痛的行为学观察将30 cm×30 cm×30 cm的透明有机玻璃箱置于高于实验台45 cm的玻璃台上，实验前30 min将大鼠置于其中使其适应环境，后用乙醚将其麻醉，在周围裸露皮肤涂抹凡士林（避免甲醛接触肛周皮肤引起躯体痛觉），将直径1.5 mm的圆头细管迅速经插入直肠（鞘内对照组和实验组鞘内生理盐水或地西泮处理10 min后进行此操作），按分组要求分别将0.5 mL生理盐水或0.5 mL 20 g/L甲醛溶液注入大鼠直肠. 以5 min为间隔，观察并记录90 min内大鼠的内脏痛相关行为（viseral pain related behaviors， VPRB）的数目［3］［A： 大鼠舔或轻咬腹部、下肢及会阴周围的皮肤；B： 伸展躯体使其拉长；C： 腹部收缩侧屈身体；D： 全身收缩使背部拱起呈弓形，持续时间 (t)

统计学处理： 用SPSS 11.0软件进行统计学处理. 数据以x±s表示，用重复测量数据的方差分析对不同组的内脏疼痛反应做统计学分析，用Dunnettt法分析第一个内脏痛相关行为的潜伏期. P＜0.05为差异有显著性.

2结果

2.1直肠注入甲醛后诱导的疼痛反应以15 min为间隔，统计大鼠直肠注入不同溶液后90 min内的行为学指标(见表1). 大鼠直肠注入甲醛，可引起了大鼠剧烈的内脏痛觉，疼痛反应主要集中在甲醛刺激直肠后的75 min内，其中，在甲醛刺激直肠后15~30 min，疼痛反应最剧烈.

2.2鞘内给予地西泮抑制大鼠内脏痛觉反应鞘内注射生理盐水对内脏痛觉影响较小(表1). 3个实验组与模型组比较，内脏疼痛反应均明显减弱(P

2.3各组大鼠出现第一个VPRB的潜伏期直肠对照组、模型组、鞘内对照组、低剂量实验组、中剂量实验组、高剂量实验组第一个VPRB的潜伏期分别为(79.2±11.8) s; (22.5±1.4 ) s; (24.1±1.7) s; (47.3±5.3) s; (42.3±3.5) s; (69.2±7.2 ) s. 模型组第一个VPRB的潜伏期较直肠对照组明显缩短（P

3讨论

内脏痛（visceral pain）是一种临床上常见的疼痛现象.目前研究内脏痛的模型较多，但在实验过程中易混杂躯体痛觉的影响. 在本研究中，我们直接将0.5 mL浓度为20 g/L的甲醛溶液通过圆头塑料管注入大鼠直肠，观察并计数内脏痛相关行为发现，直接将甲醛注入直肠后大鼠的内脏痛行为反应较直肠对照组强烈，并且大鼠出现第一个VPRB的潜伏期较直肠对照组也明显缩短，表明直接将甲醛注入大鼠直肠可诱发大鼠的内脏痛觉，并且甲醛诱发的内脏痛觉呈单相，主要集中在甲醛刺激直肠后的75 min内，这不同于将甲醛注入直肠壁致内脏痛所呈现的双相时程［3］. 另外，本研究在直肠注入甲醛之前，将凡士林涂抹在大鼠的周围，避免了躯体痛觉的影响，因此，本研究中甲醛刺激大鼠直肠引起的内脏痛有特异性.

另外，将三种不同剂量的地西泮注入大鼠的蛛网膜下腔，发现鞘内注入地西泮对大鼠的内脏痛觉有抑制作用，主要表现在两个方面： ① 直肠注入甲醛后的75 min内，实验组大鼠的内脏痛反应较模型组明显减弱；② 鞘内注入地西泮后，大鼠出现第一个VPRB的潜伏期较模型组明显延长. 另外，地西泮对内脏痛抑制作用的持续时间与地西泮剂量成依赖关系，即鞘内注入的地西泮剂量越大，其对内脏痛的抑制时间越长.

鞘内地西泮对内脏痛的抑制作用可能与中枢神经系统中的GABA有关.以往的很多证据表明，GABA及其受体在疼痛的调节过程中发挥重要的作用［4］. 另外，骶髓后连合核（sacral dorsal commissualnucleus， SDCN）是位于腰骶膨大处的重要核团［5］，是盆腔内脏伤害性信息感觉传递的中继站［6］，其内分布大量的GABA免疫阳性的神经元、终末以及GABAA受体［5，7-8］. 地西泮作为GABAA受体的配体之一，可作用于GABAA受体，促进GABA与GABAA受体的结合，通过增强Cl-通道开放的频率增强GABA对GABAA受体的作用而显示中枢抑制作用. 在本实验中，鞘内注射地西泮至腰骶膨大，地西泮可能作用于SDCN上的GABAA受体，促进GABA与GABAA受体的结合能力，增强了GABAA受体上Cl-通道开放的频率，进一步抑制了内脏痛觉传入神经元间的突触活动，使内脏痛觉传入过程受阻，因此，鞘内地西泮预处理10 min后将甲醛注入直肠，大鼠的内脏疼痛反应以及出现第一个VPRB的潜伏期较模型组分别减少和延长. 但至于地西泮是否真正可以增强GABA与SDCN上GABAA受体的结合，并无确切报道，有待于进一步探究.

【参考文献】

［1］ Pomeranz B， Nguyen P. Intrathecal diazepam suppresses nociceptive reflexes and potentiates electroacupuncture effects in pentobarbitalanesthetized rats ［J］. Neurosci Lett， 1987，77(3):316-320.

［2］ Lopachin RM， Rudy TA， Yaksh TL， et al. An improved method for chronic catheterization of the rat subarachoid space ［J］. Physiol Behav， 1981，27(3):559-561.

［3］ Miampamba M， Chery Croze S， Detolle Sarbach S， et al. Antinociceptive effects of oral clonidine and S128134 in acute colon inflammation in rats ［J］. Eur J Pharmacol， 1996，308(3):251-259.

［4］ Malcangio M， Bowery NG. GABA and its receptors in the spinal cord ［J］. Trends Pharmacol Sci， 1996，17(12):457-462.

［5］ Lu Y， Jin SX， Xu TL， et al. Expression of cfos protein in substance P receptorlike immunoreactive neurons in responses to noxious stimuli in the urinary bladder: An observation in the lumbosacral cord segments of the rat ［J］. Neurosci Lett， 1995，198(2):139-142.

［6］ Ueyama T， Arakawa H， Mizuno N. Central distribution of efferent and afferent components of the pudendal nerve in rat ［J］. Anat Embryol(Berl)， 1987，177(1):37-49.